Лиофилизированная композиция морфогенетического фактора роста кости мр52 человека и способ её получения

1 Настоящее изобретение касается лиофилизированной композиции морфогенетического фактора роста кости МР 52 человека и способа е приготовления. Более конкректно, настоящее изобретение относится к лиофилизированной композиции, содержащей морфогенетический фактор костей МР 52 человека и маннита, и способу ее получения. кДНК морфогенетического фактора кости МР 52 человека была впервые выделена в 1994 году, определена как относящаяся к факторам,связанным с остеогенезом, и классифицирована в суперсемейство TGF- (Biochem. Biophys. Res.Commun., 1994, vol. 204, N 2). Затем совершенствование методов генетической инженерии сделало возможным получение морфогенетического фактора кости МР 52 человека без нарушения его активности по контролю морфогенеза костей (WO 96/33215). Хранение морфогенетического фактора кости МР 52 человека осуществляется в лиофилизированном состоянии. Однако это сопряжено с таким недостатком как снижение объма ("усыхание"), имеющее место в процессе хранения, и слипание порошка,имеющее место в ходе реконституции. С точки зрения преодоления указанных выше недостатков аминокислоты, сахариды или многоатомные спирты используются в отношении BMP-2 - белка, классифицируемого в то же самое суперсемейство TGF-P и характеризующегося свойствами, близкими к таковым у морфогенетического фактора кости МР 52 человека(японский патент-А HEI 6-508777). С учтом этого авторы настоящего изобретения предпринимали попытку применить такие добавки к морфогенетическому фактору кости МР 52 человека, однако указанные выше проблемы разрешить не удалось. Конкретно, слипание в момент реконституции наблюдалось даже тогда, когда к морфогенетическому фактору кости МР 52 человека добавляли перед лиофилизацией нейтральные или основные аминокислоты, такие как аланин, валин или лизин, в количестве от 0,5 до 2,5%. В случае добавления перед лиофилизацией сахаридов, таких как сахароза или декстран,в количестве от 0,5 до 1%, у лиофилизированного продукта наблюдались появление бледной желтовато-зелной окрашенности и усыхание. При добавлении перед лиофилизацией многоатомного спирта, такого как сорбит, в количестве от 0,5 до 1%, в процессе лиофи-лизации происходило растворение морфогенетического фактора кости МР 52 человека, что делало невозможным получение лиофилизированного продукта. Авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования с целью преодоления указанных выше недостатков. В результате было обнаружено, что при добавлении к морфогенетическому фактору кости МР 52 человека маннит перед лиофилизацией ни появления окрашенности, ни усыхания в процессе 2 хранения лиофилизированного продукта не происходит, а в момент реконституции не происходит слипания, что позволило считать настоящее изобретение завершнным. Таким образом, настоящее изобретение представляет собой лиофилизированную композицию морфогенетического фактора кости МР 52 человека, содержащую морфогенетический фактор кости МР 52 человека и маннит. В качестве морфогенетического фактора кости МР 52 человека согласно изобретению предпочтительно использовать морфогенетический фактор кости МР 52 человека (который может в дальнейшем также обозначаться как "rhMP52"),получаемый с применением технологий генетической инженерии, описанных в WO 96/33215. В качестве маннита предпочтительно использовать D-маннит, охарактеризованный Фармакопеей Японии. Предпочтительно смешивать морфогенетический фактор кости МР 52 человека и маннит в весовом отношении 1:5-50. Композиция согласно изобретению может быть приготовлена путм лиофилизации водного раствора морфогенетического фактора кости МР 52 человека и маннита с использованием стандартной процедуры. Более подробно, композиция согласно изобретению образуется путем добавления заранее определяемого количества маннита к водному раствору очищенного морфогенетического фактора кости МР 52 человека, перемешивания, фильтрования полученного в результате водного раствора смеси, помещения фильтрата в стерильную ампулу и проведения лиофилизации. Композиция согласно изобретению вводится пациенту в количестве, эффективном в связи с проводимым лечением, после растворения в дистиллированной воде для инъекций или в слабой кислоте (рН=3), например, в растворе соляной кислоты или лимоннокислом буфере, с последующим применением. Предпочтительное количество маннита,вносимого в композицию согласно изобретению, определяли, исходя из теста на стабильность. Тест на стабильность проводили в соответствии с методом, описанным в инструкции для стандартной процедуры, принятой Фармакопеей Японии XIII, в котором наблюдают и измеряют такие свойства как внешний вид и прозрачность раствора, электро-форетические параметры и содержание воды в момент начала теста и спустя 3 месяца, а также контроль формирования эктопической костной ткани через 6 месяцев. В результате никаких изменений во внешнем виде и прозрачности раствора не было выявлено в начале тестирования и спустя 3 месяца после этого. По данным электрофоретических измерений и определения содержания воды препараты, включающие в себя маннит в описанном выше весовом соотношении, характери 3 зовались стабильностью в начале теста и спустя 3 месяца после этого. Известно, что предпочтительное содержание воды в лиофилизированном продукте в целом составляет 2% или ниже. Исходя из описанных выше результатов, считают, что предпочтительным фармацевтическим продуктом является композиция морфогенетического фактора кости МР 52 человека, включающая маннит в количестве от 5 до 50 мг, а желательно 10 мг, в расчте на 1 мг морфогенетического фактора кости МР 52 человека. Кроме того, формирование эктопической костной ткани под действием каждой лиофилизированной композиции морфогенетического фактора кости МР 52 человека, включающей 10,25 и 50 мг маннита, было оценено после 6 месячного хранения. В результате формирование эктопической костной ткани было отмечено для любых композиций, независимо от температуры хранения или количества маннита. На основании описанных выше результатов проведнных тестов считается подтвержднным, что добавление маннита к морфогенетическому фактору кости МР 52 человека перед лиофилизацией не проявляет негативного влияния на морфогенетический фактор кости МР 52 человека: получаемая в результате композиция остатся стабильной на протяжении длительного периода времени. Наилучшие пути реализации изобретения Настоящее изобретение может быть более подробно охaрактеризовано с помощью нижеследующих примеров. Пример 1. Приготовление композицииrhMP52, который был получен с использованием процедуры, описанной в WO 96/33215, добавляли D-маннит (Фармакопея Японии) в количестве 10, 25 и 50 мг, соответственно, и перемешивали. После отфильтровывания полученной в результате смеси через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм порции полученного таким образом фильтрата по 1 мл помещали в ампулы в стерильных условиях. Их подвергали лиофилизации, получая таким образом композицию согласно изобретению в форме фармацевтического продукта. Пример 2. Тест на стабильность композиции rhMP52. Лиофилизированную композицию rhMP52,полученную в примере 1, помещали в прозрачный герметичный пузырк и хранили при температуре 2-8, 25 и 40 С соответственно. Стабильность оценивали спустя три месяца по следующим критериям. Критерии оценки были следующими. Свойства. Внешний вид: композиция, которая сохраняла форму белой лепшки и не изменяла своего цвета, определялась как "не изменившаяся". 4 Прозрачность раствора: раствор, включающий в себя композицию, растворнную в 1 мл дистиллированной воды, предназначенный для проведения инъекций, определяли как "не изменившийся" тогда, когда он был бесцветным, прозрачным и лишнным слипшихся частиц. Электрофорез: чистоту основной полосы рассчитывали по занимаемой ею площади в процентах, определяемой при внесении электрофоретической картинки в снабженный красным фильтром пленочный сканер, позволяющий определять интегральную оптическую плотность (IOD) в процентах для каждой полосы. Содержание воды: содержание воды в композиции измеряли с помощью микроизмерителя воды. В результате, что касается свойств, композиция согласно изобретению осталась не изменившейся по внешнему виду и прозрачности раствора, в то время как слипание было обнаружено в чистом лиофилизированном продуктеrhMP52. При проведении электрофореза для каждой композиции был продемонстрирован хороший уровень стабильности (в %). Результаты измерения содержания воды (в% приведены в таблице 1, которая показывает,что существенные изменения в содержании воды (%) при сравнении композиций отсутствуют. Таблица 1 показывает, что в сравнении с вариантом, включающим в себя только rhMP52, содержание воды в каждой из композиций согласно изобретению оказывается ниже в момент приготовления или после хранения: соответственно, усыхания не происходит. Композиция Только rhMP52 Пример 3. Формирование эктопической костной ткани под контролем rhMP52. По одной ампуле (1 мг на 1 сосуд), содержащей композицию rhMP52, полученную в примере 1, хранили в течение 6 месяцев при 4 и 25 С, соответственно. Затем в ампулу добавляли 1 мл дистиллированной воды с получением раствора, предназначенного для введения с помощью инъекции. Приготовленный таким образом раствор внутримышечно инъецировали мышам линии ICR (Nippon Crea Со. Ltd.) в дозе 20 мкг/ 20 мл. Спустя две недели присутствие или отсутствие формирования эктопической костной ткани анализировали с применением мягкой рентгенографии (n=2). Результаты показаны в таблице 2. Таблица 2 Композиция 4 С 25 С Только rhMP52 наблюдалось ФЭКТ наблюдалось ФЭКТ+ маннит, 10 мг наблюдалось ФЭКТ наблюдалось ФЭКТ+ маннит, 25 мг наблюдалось ФЭКТ наблюдалось ФЭКТ+ маннит, 50 мг наблюдалось ФЭКТ наблюдалось ФЭКТФЭКТ-формирование эктопической костной ткани Промышленное применение Лиофилизированный продукт морфогенетического фактора кости МР 52 человека связан с такими проблемами, как появление цвета или усыхание в процессе хранения или слипание при проведении реконституции. Однако с лиофилизированной композицией согласно изобретению таких проблем не возникает. Морфогенетический фактор кости МР 52 человека в виде лиофилизированной композиции согласно изобретению остатся стабильным и не претерпевает существенных изменений в своей чистоте,содержании воды и контроле формирования эктопической костной ткани после хранения в течение длительного времени. Таким образом,настоящее изобретение применимо в области приготовления фармацевтического продукта. 6 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Лиофилизированная композиция морфогенетического фактора кости МР 52 человека,содержащая смесь морфогенетического фактора кости МР 52 человека с маннитом в весовом соотношении в пределах 1:5-50. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем,что морфогенетический фактор кости МР 52 человека получен с применением технологий генетической инженерии. 3. Способ получения лиофилизированной композиции морфогенетического фактора кости МР 52 человека, заключающийся в добавлении маннита к очищенному раствору морфогенетического фактора кости МР 52 человека в количестве, которое обеспечивает весовое соотношение морфогенетического фактора кости МР 52 человека и маннита в пределах 1:5-50, и последующей лиофилизации полученного смешанного раствора. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что морфогенетический фактор кости МР 52 человека получен с применением технологий генетической инженерии.