Фармацевтическая композиция, обладающая повышенной иммуностимулирующей активностью, способ ее получения и использования

008703 Настоящее изобретение фармацевтической композиции, содержащей конъюгат пептида тимозина 1 (ТА 1) с полиэтиленгликолем. Описание предпосылок создания изобретения Тимозин 1 представляет собой состоящий из 28 аминокислот пептид тимуса с иммуномодулирующими свойствами, гомологичный природному продукту, исходно выделенному из тимозиновой фракции 5 вилочковой железы теленка. Его биологические эффекты включают увеличение функций Тлимфоцитов и включают модуляцию интерлейкина-2 (IL-2), стимуляцию продукции -интерферона, индукцию Т-лимфоцитов, активность природных киллеров (NK-клеток) и стимуляцию тимопоэза. Показано также, что тимозин 1 регулирует экспрессию главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I. Остается необходимость в данной области техники в усовершенствовании композиций, содержащих ТА 1 и родственные пептиды. Краткое содержание изобретения Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением включает физиологически активный конъюгат, содержащий пептид тимозин 1 (ТА 1), конъюгированный с веществом, которое увеличивает период полусуществования пептида ТА 1 в сыворотке пациента, когда упомянутый конъюгат вводят пациенту. Вещество может быть по сути неантигенным полимером. Согласно способу по изобретению по сути неантигенный полимер конъюгируют с пептидом ТА 1. Иммуностимулирующее эффективное количество композиции по настоящему изобретению вводят пациентам, нуждающимся в стимуляции иммунитета. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение применимо к пептидам ТА 1, включая существующий в природе ТА 1, а также синтетический ТА 1 и рекомбинантный ТА 1, имеющий аминокислотную последовательность природного ТА 1, аминокислотную последовательность, в значительной степени подобную ему, или сокращенную форму его последовательности, и их биологически активные аналоги, содержащие замещенную,удаленную, удлиненную, замененную или иным образом модифицированную последовательности, которые обладают биологической активностью, в значительной степени подобной активности ТА 1, например, пептид ТА 1, имеющий достаточную аминокислотную гомологию с ТА 1, так что он функционирует в основном таким же способом и в значительной степени с такой же активностью, как ТА 1. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением включает физиологически активный конъюгат, содержащий пептид ТА 1, конъюгированный с веществом, которое увеличивает период полураспада пептида ТА 1 в сыворотке пациента, когда упомянутый конъюгат вводят пациенту. Вещество может быть по сути неантигенным полимером. Соответствующие полимеры будут иметь молекулярную массу в диапазоне примерно 200-300000, предпочтительно в диапазоне примерно 1000100000, более предпочтительно в диапазоне примерно 5000-35000 и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 10000-30000, полимеры с молекулярной массой 20000 являются особенно предпочтительными. Включаемые полимерные вещества являются предпочтительно также водорастворимыми при комнатной температуре. Не ограничивающий изобретение перечень таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксида, такие, как полиэтиленгликоль (PEG) или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блочные сополимеры, при условии что растворимость в воде блочных сополимеров поддерживается. Среди по сути неантигенных полимеров рассматриваются моноактивированные полиалкиленоксиды с концевым алкилом (PAOs), такие, как полиэтиленгликоли с концевым монометилом (mPEGs). Кроме mPEG, могут быть также полезными полимеры с концевым (С 1-С 4) алкилом. В качестве альтернативы основанным на РАО полимерам могут быть использованы эффективно неантигенные вещества, такие, как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, основанные на углеводах полимеры и тому подобное. Специалисты в данной области поймут,что приведенный выше перечень является всего лишь иллюстративным и что рассматриваются все полимерные вещества, обладающие свойствами, описанными в контексте. Для целей по настоящему изобретению термин эффективно неантигенный означает все вещества, понимаемые в данной области как нетоксичные и не проявляющие заметного иммуногенного ответа у млекопитающих. Полимер может быть в виде линейной цепи или разветвленной. Полиэтиленгликоль (PEG) является особенно предпочтительным полимером. Полимер может быть конъюгирован с пептидом ТА 1 любым подходящим способом. Типовые способы конъюгации полимеров с пептидами раскрыты в патентах US 4179337, 4766106, 4917888, 5122614 и 6177074, а также в заявке WO 95/13090, все из которых включены в контекст путем цитирования. Тимозин 1 имеет пять отдельных потенциальных сайтов для конъюгации с полимером по аминогруппе, и полимер может быть конъюгирован по одному или нескольким сайтам. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения PEG с молекулярной массой 20000 конъюгируют с N-концом ТА 1 с образованием PEG-ТА 1. Это может быть осуществлено путем твердофазного пептидного синтеза ТА 1 на полимерной подложке в виде шариков, как известно в данной области, с соответствующими защитными-1 008703 группами в боковой цепи. После завершения синтеза ТА 1 защищенный ТА 1 отщепляют от шариков, оставляя на N-конце свободную аминогруппу, которая реагирует с PEG с молекулярной массой 20000. Затем удаляют защитные группы боковой цепи, чтобы образовать конъюгат согласно данному варианту воплощения по изобретению. Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для лечения пациентов,нуждающихся в стимуляции иммунитета. Таковые могут включать пациентов со злокачественными опухолями, гепатитом, включая пациентов, инфицированных вирусом гепатита В или гепатита С, вирусом иммунодефицита человека (HIV) и др. Способ включает введение пациенту иммуностимулирующего эффективного количества физиологически активного конъюгата в соответствии с настоящим изобретением. Выделение, характеристика и применение пептидов ТА 1 описано, например, в патентах US 4079127, 4353821, 4148788 b 4116951. Иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА 1 можно определить с помощью рутинных экспериментов титрования дозы. Было найдено, что ТА 1 безопасен для людей при введении в таких высоких дозах, как 16 мг/кг массы тела/день. Предпочтительные дозы пептида ТА 1 находятся в диапазоне от 0,001 до 10 мг/кг массы тела/день при образцовой дозе, составляющей примерно 0,02 мг/кг массы тела/день. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения иммуностимулирующие эффективные количества являются дозами, которые включают пептид ТА 1 в количестве, находящемся в диапазоне примерно 0,1-10 мг. Предпочтительные дозы включают пептид ТА 1 в количестве, находящемся в диапазоне примерно 1-5 мг. Приведенные выше дозы отражают только количество пептида ТА 1, присутствующего в композиции, а не массу конъюгированного с ним полимера. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения пептид ТА 1 присутствует в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком, как вода для инъекции, солевой раствор в физиологических концентрациях или что-либо подобное. Период полураспада в плазме подкожно инъецированного ТА 1 составляет только около 2 ч. Однако конъюгация полимера с пептидом ТА 1 в соответствии с настоящим изобретением существенно увеличивает период полураспада пептида. В дальнейшем изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не претендуют на то, чтобы быть ограничивающими. Пример 1. Крысы получали инъекцию 5-фторурацила (5-FU), чтобы вызвать угнетение иммунитета,затем были обработаны путем инъекции тимозином 1 (200 мкг/кг) или модифицированным полиэтиленгликолем тимозином 1 [PEG (молекулярная масса 2000)-тимозин 1] (молярный эквивалент 200 мкг/кг тимозина), чтобы определить воздействие на параметры иммунитета. Было найдено, что: (1) восстановление активности NK-клеток (после угнетения, вызванного 5-FU) было больше у животных, получавших инъекцию PEG-тимозин 1, чем только тимозин 1, и (2) восстановление активированных Т-клеток, CD25+, было больше у животных, получавших инъекцию PEG-тимозин 1, чем только тимозин 1. В следующих примерах, которые не претендуют на ограничение изобретения, оценивали непрерывную инфузию ТА 1 на модели противоопухолевой терапии с применением имплантированных хирургическим способом осмотических мининасосов, которые доставляли жидкости с постоянной скоростью потока в течение 5 дней. Крысам давали 5-фторурацил (5-FU), чтобы вызвать угнетение иммунитета, и затем через 8 дней обрабатывали с помощью инъекции или инфузии ТА 1 (самый низкий уровень количества лейкоцитов после введения 5-FU). Группами обработки, по 8 крыс в каждой, были: контрольная(мининасосы с физиологическим раствором); получавшая низкую дозу ТА 1 (0,2 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); получавшая высокую дозу ТА 1 (3,5 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); и получавшая высокую дозу ТА 1 путем инфузии (3,5 мг/кг, инфузированные с помощью мининасосов). Параметры иммунитета определяли относительно базисной лини и через 8 дней после обработки 5-FU (день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки с ТА 1. Пример 2. Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мг/кг 5-фторурацила(5-FU) для подавления иммунитета. Через 8 дней после обработки 5-FU крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (n=8). Контроль (физиологический раствор в мининасосе). Низкая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 0,2 мг/кг (с пустыми мининасосами). Высокая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами). Непрерывная инфузия ТА 1, обеспеченная с помощью мининасоса при 3,5 мг/кг/5 дней. Параметры иммунитета определяли относительно базисной лини и через 8 дней после обработки 5FU (день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки ТА 1. Оценки включали активность природных киллеров (NK-клеток) [лактатдегидрогеназа (LDH), высвобожденная из клеток линии YAC-1 после экспозиции в течение 4 ч с моноядерными клетками периферической крови (РВМС) человека], общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела), общее количество лимфоцитов (CD3+ с помощью проточной цитометрии) и активированные лимфо-2 008703 циты (CD25+/CD3+ с помощью проточной цитометрии). Активность NK-клеток составила 425% относительно базисной линии и была снижена до 92% после 5-FU. Обработка низкой дозой ТА 1 привела к значительному восстановлению активности NKклеток через 12 дней, тогда как при высокой дозе ТА 1 достигалось значительное восстановление всего за 5 дней. Однако непрерывная инфузия ТА 1 была способна удвоить ответ за 5 дней до 324% (по сравнению с 162% для инъецированной высокой дозы, 123% для инъецированной низкой дозы и 111% для контроля). Только у животных, обработанных ТА 1 путем непрерывной инфузии, проявлялось полное восстановление активности NK-клеток до уровней базисной линии. Общее число лейкоцитов, определенное морфологически, снижалось от 145902071 клеток/мм 3 до 2597582 после обработки с 5-FU. Обработка низкой или высокой дозой ТА 1 путем инъекции имела тенденцию скорее к усилению восстановления по сравнению с необработанными животными. Однако непрерывная инфузия ТА 1 обеспечивала статистически значимое и полное восстановление до уровней базисной линии только через 5 дней. Количество активированных лейкоцитов (CD3+/CD25+) снижалось незначительно при обработке 5FU (от 6521 клетка/мм 3 до 3710), однако их уровни резко повышались в дни 12 и 20 после обработки высокой дозой ТА 1 (297136 и 32175 клеток/мм 3 по сравнению с 16670 и 21277 клеток/мм 3, соответственно). Непрерывная инфузия ТА 1 приводила даже к большему повышению, до 422105 и 44673 клетки/мм 3. Пример 3. Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мкг/кг 5-фторурацила(5-FU) для подавления иммунитета. Через 8 дней после обработки 5-FU крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (n=15). Контроль (физиологический раствор в мининасосе). Высокая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами). Непрерывная инфузия ТА 1, обеспеченная с помощью мининасосов при 3,5 мг/кг/5 дней. Параметры иммунитета определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5FU (день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5 и 14 после обработки ТА 1. Оценки включали общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью физических цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела),гранулоциты (проточная цитометрия с использованием меченого флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антикрысиного гранулоцита HIS-48), общее количество лимфоцитов (CD3+ с помощью проточной цитометрии), Т-хелперы (CD4+ с помощью проточной цитометрии), активированные лимфоциты (CD25+/CD3+ с помощью проточной цитометрии) и экспрессию цитокинов в плазме [интерлейкина-2 (IL-2) и интерферона (IFN-) с помощью иммуноферментного анализа ELISA]. После определения в примере 2, что ТА 1, доставляемый непрерывной инфузией, по сравнению с подкожной инъекцией проявляет резкое воздействие на общее число лейкоцитов, представляло интерес определить, какой тип лейкоцитов ответствен за увеличение. По-видимому, гранулоциты являются подгруппой лейкоцитов, которая наиболее подвержена действию ТА 1, доставляемого непрерывной инфузией. Количество гранулоцитов снижалось после 5-FU от 44851116 до 1249432. Обработка с ТА 1 приводила к увеличению до 146522463 в течение 5 дней (по сравнению с 99243218 при инъекции ТА 1 или 69541519 без ТА 1), и данный уровень был еще выше через 14 дней. Интересно, что в данном исследовании было одно животное, которое получало ТА 1 как инъекцией(3,5 мг/кг), так и непрерывной инфузией (еще 3,5 мг/кг). Это животное было не только здоровым и бодрым, без очевидных неблагоприятных явлений, но и измеренные воздействия ТА 1 на параметры иммунитета были даже больше таковых у других животных. Что касается гранулоцитов, это исследуемое животное имело значительно повышенный уровень, 19376 клеток/мм 3 через 5 дней, по сравнению со средним значением 146522463 у других животных, подвергавшихся инфузии. Количество общих лимфоцитов (CD3+) было чрезвычайно повышенным после обработки с 5-FU(от 109041973 клетки/мм 3 до 1740560). Обработка с ТА 1 привела к восстановлению уровней базисной линии, которое проявлялось только через 5 дней, при доставке ТА 1 непрерывной инфузией, но не было заметным до 14 дней в случае инъецированного ТА 1. Животное, которое получало ТА 1 как путем инъекции, так и инфузии, имело уровни лимфоцитов,не намного отличавшиеся от других животных (9765 клеток/мм по сравнению со средним значением 9644961), но процент тех лимфоцитов, которые оставались активированными, был значительно повышен (от 42889 клеток/мм или 4% лимфоцитов для животных, получавших инфузию ТА 1, до 976 клеток/мм 3 или 10% лимфоцитов для животного, которое получало ТА 1 в высокой дозе инъекцией, сопровождающейся инфузией). Т-хелперы (CD3+/CD4+) были также сниженными при обработке с 5-FU: от 54111084 до 1710+449 клеток/мм 3. Эти пониженные уровни Т-клеток не увеличивались без обработки с ТА 1 в течение 14 дней эксперимента. В противоположность результатам, полученным для гранулоцитов,при которых ТА 1, доставленный непрерывной инфузией, превосходил ТА 1, доставленный инъекцией для восстановления количества клеток, доставленного одним из способов ТА 1 было достаточно для воз-3 008703 вращения уровней Т-хелперов к базисной линии. Поскольку ТА 1, доставляемый или путем инъекции, или путем непрерывной инфузии, приводит к увеличению Т-хелперов CD4+, представлялось интересным определить, происходит ли это увеличение из-за воздействия на подгруппу Т-хелперов - на Тh1 или Th2. Прежние данные in vitro и in vivo демонстрировали, что ТА 1 увеличивает подгруппу Тh1 Т-клеток, и в данном исследовании был обнаружен тот же эффект. Доставка ТА 1 непрерывной инфузией приводила даже к большему увеличению в плазме уровня цитокина интерлейкина-2 (IL-2) подгруппы Тh1, чем наблюдалось после подкожной инъекции(427 пг/мл через 14 дней после доставки ТА 1 путем непрерывной инфузии по сравнению с 21 16 пг/мл для инъецированного ТА 1 и 1016 пг/мл для контрольных животных). Обработка с помощью TA1 приводила к увеличению цитокина IL-2 подгруппы Тh1 и делала возможным увеличение другого цитокина подгруппы Тh1 - -интерферона (IFN-). И хотя уровни цитокина являлись низкими, на день 5 после обработки подкожно инъецированный ТА 1 приводил к более высоким уровням IFN- в плазме. На день 14 после обработки животные, получившие ТА 1 путем непрерывной инфузии, имели самые высокие уровни (145 пг/мл по сравнению с 101 пг/мл при инъекции или 88 пг/мл в контроле). Животные, которые получали ТА 1 как инъекцией, так и непрерывной инфузией, имели даже более высокие измеренные уровни обоих цитокинов подгруппы Тh1, особенно IFN-, уровень которого составил 45 пг/мл после 14 дней, по сравнению с 145 пг/мл для других животных. Выводы Поддержание постоянного уровня ТА 1 в кровеносной системе в течение некоторого количества дней повышает измеряемые иммунологические эффекты. Этот дозовый режим приводит к неожиданным положительным воздействиям на гранулоциты, а также к положительным воздействиям на моноциты, проявляемым после инъекции ТА 1. Не наблюдалось никаких неблагоприятных явлений, даже при дозах ТА 1 в 15 раз выше обычных (а у одного животного при дозах в 30 раз выше обычных). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция, обладающая повышенной иммуностимулирующей активностью и включающая физиологически активный конъюгат, содержащий пептид тимозин 1 (TA1), конъюгированный с полиэтиленгликолем, который увеличивает период полураспада пептида ТА 1 в сыворотке пациента при введении упомянутого конъюгата пациенту. 2. Композиция по п.1, где упомянутый полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в интервале примерно 200-300000. 3. Композиция по п.2, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 5000-35000. 4. Композиция по п.3, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 20000. 5. Композиция по п.1, где упомянутый полиэтиленгликоль конъюгирован с N-концевой частью пептида ТА 1. 6. Композиция по п.1, где упомянутый пептид ТА 1 является природным, синтетическим или рекомбинантным ТА 1. 7. Способ получения композиции по п.1, включающий конъюгацию полиэтиленгликоля с пептидом ТА 1. 8. Способ по п.7, где полиэтиленгликоль конъюгируют с N-концевой частью пептида ТА 1. 9. Способ по п.7, где упомянутый полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в интервале примерно 200-300000. 10. Способ по п.9, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 5000-35000. 11. Способ по п.10, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 20000. 12. Способ по п.7, где упомянутый пептид ТА 1 является природным, синтетическим или рекомбинантным ТА 1. 13. Способ лечения пациента, нуждающегося в стимуляции иммунитета, путем введения упомянутому пациенту иммуностимулирующего эффективного количества фармацевтической композиции по п.1. 14. Способ по п.13, где полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в интервале примерно 200300000. 15. Способ по п.14, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 5000-35000. 16. Способ по п.15, где упомянутая молекулярная масса составляет примерно 20000. 17. Способ по п.13, где полиэтиленгликоль конъюгирован с N-концевой частью пептида ТА 1. 18. Способ по п.13, где пептид ТА 1 является природным, синтетическим или рекомбинантным ТА 1. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6