Способ введения пептида тимозин &alpha 1

008536 Предпосылки создания изобретения Область изобретения Настоящее изобретение относится к способу введения пептида тимозин 1. Описание предпосылок создания изобретения Тимозин 1 (иногда упоминаемый как ТА 1) представляет собой состоящий из 28 аминокислот пептид тимуса с иммуномодулирующими свойствами, гомологичный природному продукту, исходно выделенному из тимозиновой фракции 5-вилочковой железы теленка. Его биологические эффекты включают усиление функции Т-лимфоцитов и включают модуляцию интерлейкина-2 (IL-2), стимуляцию продукции -интерферона, индукцию Т-лимфоцитов, активности природных киллеров (NK-клеток) и стимуляцию тимопоэза. Показано также, что тимозин 1 по верхнему типу регулирует экспрессию главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I. Тимозин 1 ранее предлагался для применения при некоторых видах терапии рака, гепатита В и С,вируса иммунодефицита человека (HIV) и т.д., например, путем подкожной инъекции дважды в неделю. В этой области техники остается необходимость для разработки улучшенных способов введения тимозина 1. Краткое содержание изобретения В соответствии с настоящим изобретением способ введения пептида тимозин 1 (TA1) пациенту,нуждающемуся в иммунной стимуляции, включает введение пептида ТА 1 пациенту таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА 1 у пациента в течение периода лечения, составляющего по меньшей мере 6 ч. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение основано на том факте, что поддерживающие иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА 1 у пациента в кровеносной системе в период лечения обеспечивают существенное улучшение иммуностимулирующего эффекта пептида ТА 1. Изобретение применимо к пептидам ТА 1, включая существующий в природе ТА 1, а также синтетический ТА 1 и рекомбинантный ТА 1, имеющий аминокислотную последовательность природного ТА 1,аминокислотную последовательность, в значительной степени подобную ему, или сокращенную форму его последовательности, и их биологически активные аналоги, содержащие замещенную, удаленную,удлиненную, замененную или иным образом модифицированную последовательности, которые обладают биологической активностью, в значительной степени подобную активности ТА 1, например родственный ТА 1 пептид, имеющий достаточную аминокислотную гомологию с ТА 1, так что он функционирует в основном таким же способом и в значительной степени с такой же активностью, как ТА 1. Из-за того, что время полусуществования в плазме подкожно инъецированного ТА 1 составляет всего лишь около 2 ч, то в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения пептид TА 1, такой как ТА 1, вводят пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида TА 1 в кровеносной системе пациента в течение значительно более длительного периода лечения. Хотя намного более длительные периоды лечения предусматриваются в соответствии с настоящим изобретением, варианты воплощения по изобретению включают, по существу, непрерывное поддержание иммуностимулирующего эффективного количества пептида ТА 1 в кровеносной системе пациента в течение периодов лечения по меньшей мере около 6, 10, 12 ч и дольше. В других вариантах воплощения изобретения продолжительность лечения составляет по меньшей мере примерно сутки и даже некоторое количество дней, например неделю или дольше. Однако предусматривается, что варианты лечения, как они описаны выше, при которых иммуностимулирующие эффективные количества пептида TА 1, по существу, непрерывно поддерживающиеся у пациента в кровеносной системе, могут прерываться периодами без лечения, имеющими такую же или различную продолжительности. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения в течение периода лечения пациенту проводят непрерывное вливание пептида ТА 1, например, путем внутривенного вливания таким образом,чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА 1 в кровеносной системе пациента. Вливание может осуществляться любыми подходящими способами, такими как с помощью мининасоса. Альтернативно инъекционный режим пептида ТА 1 может устанавливаться таким образом, чтобы,по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА 1 в кровеносной системе пациента. Соответствующие инъекционные режимы могут включать вливание каждые1, 2, 4, 6 и т.д. часов, с тем чтобы непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида тимозин 1 в кровеносной системе пациента в течение периода лечения. Хотя предполагается, что в ходе непрерывной инфузии пептида ТА 1 введение будет существенно более длительным, согласно одному варианту воплощения изобретения непрерывная инфузия пептида ТА 1 составляет продолжительность лечения по меньшей мере 1 ч. Более предпочтительно непрерывная инфузия проводится в течение более длительных периодов времени, по крайней мере примерно 6, 8, 10,12 ч или дольше. В других вариантах воплощения изобретения непрерывная инфузия проводится в тече-1 008536 ние по меньшей мере одного дня и даже некоторого количества дней, как неделя или более. Иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА 1 в основном могут непрерывно поддерживаться в кровеносной системе пациента введением пептида ТА 1 пациенту со скоростью в диапазоне примерно 0,0001-0,1 мг/ч/кг массы тела пациента. Предпочтительные скорости введения находятся в диапазоне примерно 0,0003-0,3 мг/ч/кг массы тела пациента. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения пептид ТА 1 находится в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекций, солевой раствор в физиологических концентрациях или подобное. Изобретение может быть использовано для лечения любого пациента, нуждающегося в иммунной стимуляции, включая онкологических пациентов, инфицированных человеческим вирусом иммунодефицита пациентов и пациентов, страдающих различными формами гепатита, включая гепатит В и гепатит С. Например, изобретение может быть использовано, чтобы способствовать регенерации костного мозга у онкологических больных после химиотерапии. Изобретение может быть особенно полезным при добавлении ТА 1 к химиоиммунотерапии для повышения выживаемости пациентов при меланоме и гепатоцеллюлярной карциноме (НСС) и для уменьшения гематологической токсичности при раке легкого. В следующих примерах, которые не претендуют на то, чтобы быть ограничивающими, непрерывную инфузию ТА 1 оценивали на модели терапии злокачественной опухоли с применением имплантированных хирургическим методом осмотических мининасосов, которые доставляли жидкости с постоянной скоростью потока в течение 5 дней. Крысам давали 5-фторурацил (5-FU), чтобы вызвать подавление иммунитета, и затем с помощью инъекции или инфузии подвергали действию ТА 1 в течение последующих 8 дней (самый низкий уровень счета лейкоцитов после введения 5-FU). Группами обработки, по 8 крыс в каждой, были контрольная (мининасосы с физиологическим раствором); получавшая низкую дозу ТА 1(0,2 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); получавшая высокую дозу ТА 1 (3,5 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); и получавшая высокую дозу ТА 1 путем инфузии (3,5 мг/кг, инфузированные с помощью мининасосов). Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-FU (день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки ТА 1. Пример 1. Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мг/кг 5-фторурацила (5-FU) для подавления иммунитета. Через 8 дней после обработки 5-FU крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (n=8). Контроль (физиологический раствор в мининасосе). Низкая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 0,2 мг/кг (с пустыми мининасосами). Высокая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами). Непрерывная инфузия ТА 1, обеспеченная с помощью мининасосов при 3,5 мг/кг/5 дней. Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-FU(день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки ТА 1. Оценки включали активность природных киллеров (NK-клеток) [лактатдегидрогеназа (LDH), высвобожденная из клеток линии YAC-1 после экспозиции в течение 4 ч с моноядерными клетками периферической крови (РВМС) человека], общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела), общее количество лимфоцитов (CD3+ с помощью проточной цитометрии) и активированные лимфоциты (CD25+/CD3+ с помощью проточной цитометрии). Активность NK-клеток составила 425% относительно базисной линии и была снижена до 92% после 5-FU. Обработка низкой дозой ТА 1 привела к значительному восстановлению активности NKклеток через 12 дней, тогда как при высокой дозе ТА 1 достигалось значительное восстановление всего за 5 дней. Однако непрерывная инфузия ТА 1 была способна удвоить ответ за 5 дней до 324% (по сравнению с 162% для инъецированной высокой дозы, 123% для инъецированной низкой дозы и 111% для контроля). Только у животных, обработанных ТА 1 путем непрерывной инфузии, проявлялось полное восстановление активности NK-клеток до уровней базисной линии. Общее число лейкоцитов, определенное морфологически, снижалось от 145902071 клеток/мм 3 до 2597582 после обработки с 5-FU. Обработка низкой или высокой дозой ТА 1 путем инъекции имела тенденцию скорее к усилению восстановления по сравнению с необработанными животными. Однако непрерывная инфузия ТА 1 обеспечивала статистически значимое и полное восстановление до уровней базисной линии только через 5 дней. Количество активированных лейкоцитов (CD3+/CD25+) снижалось незначительно при обработке 5FU (от 6521 клетка/мм 3 до 3710), однако, их уровни резко повышались в дни 12 и 20 после обработки высокой дозой ТА 1 (297136 и 32175 клеток/мм 3 по сравнению с 16670 и 21277 клеток/мм 3 соответственно). Непрерывная инфузия ТА 1 приводила даже к большему повышению, до 422105 и 44673 клетки/мм 3.-2 008536 Пример 2. Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мкг/кг 5-фторурацила (5-FU) для подавления иммунитета. Через 8 дней после обработки 5-FU крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (n=15). Контроль (физиологический раствор в мининасосе). Высокая доза ТА 1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами). Непрерывная инфузия ТА 1, обеспеченная с помощью мининасосов при 3,5 мг/кг/5 дней. Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-FU(день 1 обработки ТА 1), а также в дни 5 и 14 после обработки ТА 1. Оценки включали общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью физических цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела),гранулоциты (проточная цитометрия с использованием меченого флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антикрысиного гранулоцита HIS-48), общее количество лимфоцитов (CD3+ с помощью проточной цитометрии), Т-хелперы (CD4+ с помощью проточной цитометрии), активированные лимфоциты(IL-2) и -интерферона (IFN-) с помощью иммуноферментного анализа ELISA]. После определения в примере 1, что ТА 1, доставляемый непрерывной инфузией, по сравнению с подкожной инъекцией проявляет резкое воздействие на общее число лейкоцитов, представляло интерес определить, какой тип лейкоцитов ответствен за увеличение. По-видимому, гранулоциты являются подгруппой лейкоцитов, которая наиболее подвержена действию ТА 1, доставляемого непрерывной инфузией. Количество гранулоцитов снижалось после 5-FU от 44851116 до 1249432. Обработка с ТА 1 приводила к увеличению до 146522463 в течение 5 дней (по сравнению с 99243218 при инъекции ТА 1 или 69541519 без ТА 1), и данный уровень был еще выше через 14 дней. Интересно, что в данном исследовании было одно животное, которое получало ТА 1 как инъекцией(3,5 мг/кг), так и непрерывной инфузией (еще 3,5 мг/кг). Это животное было не только здоровым и бодрым, без очевидных неблагоприятных явлений, но и измеренные воздействия ТА 1 на иммунные параметры были даже больше таковых у других животных. Что касается гранулоцитов, это исследуемое животное имело значительно повышенный уровень, 19376 клеток/мм 3 через 5 дней, по сравнению со средним значением 146522463 у других животных, подвергавшихся инфузии. Количество общих лимфоцитов (CD3+) было чрезвычайно повышенным после обработки с 5-FU(от 109041973 клетки/мм 3 до 1740560). Обработка с ТА 1 привела к восстановлению уровней базисной линии, которое проявлялось только через 5 дней, когда ТА 1 доставлялся непрерывной инфузией, но не было заметным до 14 дней в случае инъецированного ТА 1. Животное, которое получало ТА 1 как инъекцией, так и инфузией, имело уровни лимфоцитов, не намного отличавшиеся от других животных (9765 клеток/мм 3 по сравнению со средним значением 9644961), но процент тех лимфоцитов, которые оставались активированными, был значительно повышен (от 42889 клеток/мм 3 или 4% лимфоцитов для животных, получавших инфузию ТА 1, до 976 клеток/мм 3 или 10% лимфоцитов для животного, которое получало ТА 1 в высокой дозе инъекцией, сопровождающейся инфузией). Т-хелперы (CD3+/CD4+) были также сниженными при обработке с 5-FU: от 54111084 клеток/мм 3 до 1710449 клеток/мм 3. Эти пониженные уровни Т-клеток не увеличивались без обработки с ТА 1 в течение 14 дней эксперимента. В противоположность результатам, полученным для гранулоцитов, при которых ТА 1, доставленный непрерывной инфузией, превосходил ТА 1, доставленный инъекцией для восстановления количества клеток, доставленного одним из способов ТА 1 было достаточно для возвращения уровней Т-хелперов к базисной линии. Поскольку TА 1, доставляемый или путем инъекции, или путем непрерывной инфузии, приводил к увеличению Т-хелперов CD4+, представлялось интересным определить, происходит ли это увеличение из-за воздействия на подгруппу Т-хелперов - на Th1 или Th2. Прежние данные in vitro и in vivo демонстрировали, что ТА 1 увеличивает подгруппу Th1 Т-хелперов, и в данном исследовании был обнаружен тот же эффект. Доставка ТА 1 непрерывной инфузией приводила даже к большему увеличению в плазме уровня цитокина интерлейкина-2 (IL-2) подгруппы Th1, чем наблюдалось после подкожной инъекции(427 пг/мл через 14 дней после доставки ТА 1 путем непрерывной инфузии по сравнению с 2116 пг/мл для инъецированного ТА 1 и 1016 пг/мл для контрольных животных). Обработка с помощью TА 1 приводила к увеличению цитокина IL-2 подгруппы Th1 и делала возможным увеличение другого цитокина подгруппы Th1 - -интерферона (IFN-). И хотя уровни цитокина были низкими, на день 5 после обработки подкожно инъецированный ТА 1 приводил к более высоким уровням IFN-y в плазме. На день 14 после обработки животные, получившие ТА 1 путем непрерывной инфузии, имели самые высокие уровни (145 пг/мл по сравнению с 101 пг/мл при инъекции или 88 пг/мл для контроля). Животные, которые получали ТА 1 как инъекцией, так и непрерывной инфузией, имели даже более-3 008536 высокие измеренные уровни обоих цитокинов подгруппы Th1, особенно IFN-, который составил 45 пг/мл после 14 дней, по сравнению с 145 пг/мл для других животных. Выводы Поддержание постоянного уровня ТА 1 в кровеносной системе в течение некоторого количества дней повышает измеряемые иммунологические эффекты. Этот дозовый режим приводит к неожиданным положительным воздействиям на гранулоциты, а также к положительным воздействиям на моноциты, проявляемым после инъекции ТА 1. Не наблюдалось никаких неблагоприятных явлений, даже при дозах ТА 1 в 15 раз выше обычных (а у одного животного при дозах в 30 раз выше обычных). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ введения пептида тимозина 1 (ТА 1) пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции,включающий введение указанному пациенту указанного пептида ТА 1 таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА 1 у пациента в период лечения по меньшей мере около 6 ч. 2. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 8 ч. 3. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 10 ч. 4. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 12 ч. 5. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере примерно 1 день. 6. Способ по п.1, где осуществляют непрерывное введение указанного пептида в течение всего периода лечения. 7. Способ по п.1, где указанный пептид ТА 1 представляет собой природный ТА 1, рекомбинантный ТА 1 или синтетический ТА 1. 8. Способ по п.1, где указанный пептид ТА 1 находится в фармацевтически приемлемом жидком носителе, и его непрерывно вводят указанному пациенту в течение упомянутого периода лечения путем инфузии. 9. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 8 ч. 10. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 10 ч. 11. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 12 ч. 12. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере примерно 1 день. 13. Способ по п.8, где введение осуществляют в течение всего периода лечения. 14. Способ по п.8, где указанный пептид ТА 1 представляет собой природный ТА 1, рекомбинантный ТА 1 или синтетический ТА 1. 15. Способ по п.14, где указанный ТА 1 вводят указанному пациенту со скоростью примерно 0,00010,1 мг/ч/кг массы тела пациента. 16. Способ по п.14, где скорость введения составляет примерно 0,0003-0,03 мг/ч/кг массы тела пациента. 17. Способ введения пептида тимозина 1 (ТА 1) пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции,включающий, по существу, непрерывную инфузию иммуностимулирующего эффективного количества указанного пептида ТА 1 пациенту в течение периода лечения по меньшей мере около 1 ч. 18. Способ по п.17, где указанный пептид ТА 1 представляет собой природный ТА 1, рекомбинантный или синтетический ТА 1, причем осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА 1 указанному пациенту в течение периода лечения по меньшей мере около 6 ч. 19. Способ по п.17, где осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА 1 указанному пациенту в течение периода лечения, составляющего по меньшей мере примерно 1 день. 20. Способ по п.17, где осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА 1 указанному пациенту в течение всего периода лечения.