Новый сцинтилляционный анализ близкого расстояния для изучения связывающих аминогликозид молекул (abm)

1 Настоящее изобретение относится к новым способам, анализам и наборам, предназначенным для идентификации и/или количественной оценки молекул, связывающих аминогликозиды(АВМ), ферментов, модифицирующих такие молекулы, или соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментами или аминогликозидами. Предпосылки к созданию изобретения Новые разработки в области методов высокомасштабного скрининга расширили область применений, и в настоящее время большой выбор материалов, форматов, способов иммобилизации и систем определения сделали доступными как анализы в растворе, так и анализы на основе клеток (Sundberg, 2000). Для осуществления новых аналитических методов и для скрининга соединений исследователи часто применяют твердую подложку (в виде планшетов, трубок и шариков), на которой иммобилизуют реагент, который затем участвует в одной или более реакциях, в результате которых на самой подложке или в реакционном растворе возникает измеряемый сигнал. Стадия иммобилизации позволяет упростить разделение между различными реакциями и/или реагентами и может также привести к усилению сигнала. Такой эффект может быть получен,например, посредством насыщения твердой подложки молекулами сцинтиллятора, которые,возбужденные радиацией, испускаемой иммобилизованными молекулами, увеличивают или изменяют последовательно сигнал, произведенный только меченой группой (Meza, 2000). В настоящее время получен целый ряд композиций, основанных на неорганических или органических полимерах, которые способствуют эффективной иммобилизации многочисленных лигандов, а также насыщению сцинтиллятором, что позволяет облегчить разделение и/или чувствительное определение, такое как сцинтилляция и специфическая относительно длины волны флуоресценция или абсорбция. Наряду с твердофазным способом, основанным на указанных свойствах, сцинтилляционный анализ близкого расстояния (SPA) широко применяли ко многим биологическим анализам, включающим использование меченных радиоактивным изотопом молекул, подобных субстратам ферментов, антителам, белкам или ДНК. Методика основана на наблюдении того факта, что -лучи, испускаемые молекулами,меченными слабыми радиоизотопами (такими,как 3 Н, 125I, 33 Р, 35S), проходят весьма ограниченное расстояние в водной среде до того момента, как энергия излучения начинает рассеиваться. Уровень испусканий можно регистрировать с большой чувствительностью, если молекулы, меченные радиоизотопами, находятся близко от твердой подложки, содержащей сцинтиллятор (такой, как 2,5-дифенилоксазол), тем самым, вызывая специфическое испускание. 2 Молекулы, меченные радиоактивным изотопом,остающиеся свободными в растворе, не определяются, так как они слишком далеко находятся от сцинтилляционной твердой фазы. Такая подложка, на которой иммобилизован лиганд,обычно представляет собой полимер (полистирол, поливинилтолуол или полимеры на основе иттрия) и может быть произведена в виде микросфер (европейский патент ЕР 154734, патент США 4271139) или 96-/384-луночных микропланшетов (европейский патент ЕР 576090). Шарики для анализа SPA, покрытые многочисленными биологически значимыми лигандами, являются коммерчески доступными (Amersham). Например, шарики для анализа SPA позволяют определять с большой чувствительностью антитела, меченные радиоактивным изотопом, при использовании иммобилизованного белка А, или меченные радиоактивным изотопом слитые с GST (глутатион-Sтрансфераза) белки при использовании иммобилизованного глутатиона, или биотинилированные, фосфорилированные радиоактивным фосфором киназы при использовании иммобилизованного стрептавидина. Другой, коммерчески доступный способ, основанный на SPA (FlashPlate, NEN Life Science Products) делает возможным применение полистироловых микропланшетов, где лунки покрывают слоем основанного на полистироле сцинтиллятора. Однако на предыдущем уровне техники не исследовали возможность иммобилизации аминогликозидов для разработки анализов, основанных на SPA. Аминогликозиды являются гидрофильными многозарядными соединениями, родственными углеводам, чья скелетная структура состоит из кольца аминоциклитола, насыщенного заместителями амином и гидроксилом в специфических положениях. Аминогликозиды проявляют высокую гибкость, высокую растворимость в воде и относительную нерастворимость в липидах вследствие наличия основных чрезвычайно полярных групп (Zembower et al.,1998). Аминогликозиды могут быть разделены на структурные типы на основании положения их гликозидных связей, а также на основании присутствия 2-дезоксистрептаминовой группы и ее замещений. Определенные соединения, которые часто рассматривают как аминогликозиды, фактически не содержат аминосахаров, таким образом, для описания указанной целой группы молекул ввели термин аминоциклитол вместо менее точного названия аминогликозид, которое является общепринятым и используется впредь только для упрощенности. Аминогликозиды, подобные неомицину,дибекацину, гентамицину, тобрамицину, канамицину, амикацину и стрептомицину, хорошо известны в отношении их антибиотических свойств. Указанные молекулы проявляют спо 3 собность связывать in vivo и in vitro ряд биологических лигандов. На уровне клеточных мембран аминогликозиды связывают полифосфоинозитиды, отрицательно заряженные фосфолипиды, которые составляют минорный компонент мембранных бислоев, нарушая проницаемость и другие биохимические свойства клеточной стенки (Mingeot-Leclercq et al., 1992). Как было показано, на внутриклеточном уровне растущее число структур нуклеиновых кислот, в частности РНК, связано с аминогликозидами и модулируется аминогликозидами. Примерами РНК-мишеней, узнаваемых и изменяемых аминогликозидами, являются рибосомальные РНК, РНК-аптамеры, рибозимы и другие некодирующие последовательности РНК(Walter et al., 1999; Schroeder et al., 2000). Аминогликозиды могут быть модифицированы с помощью бактериальных ферментов, что обеспечивает организмам, которые вырабатывают указанные ферменты, устойчивость вследствие сниженной антибактериальной способности измененных молекул (Llano-Sotelo et al., 2002). Исследователи изучали специфичность взаимодействия между аминогликозидами и фосфоинозитидами на структурном уровне и выявили участие как гидрофобных, так и гидрофильных взаимодействий, которые определяют также токсическое действие по отношению к клеткам внутреннего уха и почек у пациентов (Schacht, 1986). С конца 70-х годов стало известно, что неомицин, подобно другим антибиотикам того же семейства, эффективно связывается с фосфоинозитидами. Такое взаимодействие использовали для экстракции и очистки полифосфоинозитидов из неочищенных экстрактов путем аффинной хроматографии на подложке, на которой иммобилизуют неомицин (Schacht, 1978). Иммобилизацию аминогликозидов осуществляли на твердых фазах, подобных сефарозе (международная публикация WO 90/08584, японский патент JP 61976418), полистироловым микротитрационным планшетам (Sachetelli et al., 1998) или медицинским устройствам (европейский патент ЕР 372130). Другими применениями, основанными на таком принципе, являются избирательное разделение и агрегация липосом, содержащих полифосфоинозитиды (Riaz et al.,1989; Van Bambeke et al., 1995), или определение полифосфоинозитидов в клеточной мембране и внутриклеточных везикулах (Arbuzova etal., 2000). Кроме того, известно, что аминогликозиды, меченные флуоресцентным индикатором,используют в скрининге РНК-связывающих соединений (международная публикация WO 96/35811). Композиции, способствующие всасыванию аминогликозидного антибиотика и содержащие фосфоинозитидполифосфат или производное и меченый полиамин, подобный 4 аминогликозидам, известны из предыдущего уровня техники (международная публикацияWO 00/18949). Указанные композиции были описаны как композиции, способствующие визуализации всасывания и локализации аминогликозидов, скринингу соединений, которые снижают до минимума цитотоксичность аминогликозидных антибиотиков по отношению к клеткам млекопитающих, для мониторинга потока кальция в клетку и для скрининга агонистов и антагонистов белков, в частности киназ,взаимодействующих с фосфоинозитидами. Аминогликозиды или фосфоинозитиды могут быть ковалентно связаны с флуоресцентным соединением. Способность аминогликозидов к связыванию позволяет обезвредить бактерии путем ингибирования синтеза белка, снижения точности трансляции информационной РНК и разрушения целостности бактериальной клеточной мембраны. Таким образом, взаимодействие аминогликозидов с биологическими лигандами приводит к значительным физиологическим эффектам, и поэтому способы идентификации и/или количественной оценки молекул, связывающих аминогликозиды (АВМ), ферментов, модифицирующих такие молекулы, и соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментами или аминогликозидами, находят многочисленные важные применения, особенно если они применимы для высокомасштабного формата. Примером может служить физиологический механизм, основанный на фосфорилировании фосфоинозитидов клеточной мембраны,который может быть изучен путем использования взаимодействия между аминогликозидами и биологическими лигандами. Фосфоинозитиды имеют основную структуру, названную фосфатидилинозитом, состоящую из диацилглицерина, связанного фосфодиэфирной связью с головной группой инозитом по 1-положению. Ацильные цепи диацилглицерина (обычно стеарил-арахидодил) находятся во внутреннем листе липидного бислоя плазматической мембраны. Головная группа инозит, которая находится в цитозоле, также может быть фосфорилирована в положениях 3', 4', 5' или любых их комбинациях с помощью ферментов,названных фосфоинозитидкиназами (PIK), которые проявляют специфичность по отношению к одному из положений в кольце инозита. Такие различные фосфорилированнные формы обладают высокоспецифическими свойствами. В частности, фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) образуют семейство наиболее распространенных экспрессируемых ферментов, которые, участвуя в фосфорилировании кольца инозита, входящего в состав фосфатидилинозита мембранных липидов, в 3'-положении и последующем образовании фосфолипидных вторичных мессенджеров, играют ключевую роль в регуляции мно 5 гих клеточных процессов (таких, как подвижность, пролиферация, дифференцировка, апоптоз, транспорт через мембрану и метаболизм углеводов), представляющих один из основных путей внутриклеточной сигнальной трансдукции (патент США 6017763; Leevers et al., 1999;Comer and Parent, 2002; Simonsen et al., 2001). К настоящему времени восемь киназ PI3K млекопитающих было идентифицировано, и они были разделены на три основных класса (I, II иIII) на основе гомологии последовательностей,структуры, партнеров по связыванию, способа активации и сродства к субстрату in vitro. В структуре всех киназ PI3K имеется домен, расположенный у С-конца фермента, представляющий собой "стержнеподобную" спиральную область, и С 2-домен, который, как известно,связывает фосфолипиды. N-Конец фермента,где, как полагают, происходят взаимодействия с адаптерными субъединицами и другими белками, является весьма вариабельным. Также было идентифицировано множество других ферментов, чьи каталитические домены очень похожи на домены киназ PI3K, подобно фосфоинозитид-4-киназам (PI4K), ДНК-зависимым протеинкиназам и mTOR киназе. Даже, если другие фосфатидилинозиты,имеющие доступную для фосфорилирования 3 группу, могут быть модифицированы посредством киназ PI3K, основным клеточным субстратом является фосфатидилинозит-(4,5)-бисфосфат (также обозначенный, как PtdIns (4,5)Р 2,PIP2 или РI(4, 5)Р 2). При активации киназы PI3K некоторыми агонистами рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), факторами роста или воспалительными цитокинами, РI(4, 5)Р 2 превращается в фосфатидилинозит (3,4,5)-трифосфат(также обозначенный, как РI(3, 4, 5)Р 3, PtdIns (3,4,5) Р 3 или PIP3). Указанная последняя молекула была охарактеризована in vivo как вторичный мессенджер, ответственный за целый каскад реакций передачи сигнала, включая фосфорилирование и активацию нескольких последующих эффекторов киназы PI3K. Кроме того, несколько белков, содержащих Pleckstrin-гомологичные(РН) или Phox-гомологичные (РХ) домены и требующие мембранной ассоциации для осуществления их функции, взаимодействуют непосредственно с клеточной мембраной путем связывания с фосфоинозитидами с широким диапазоном специфичности и сродства по отношению к различным фосфорилированным формам (Xuet al., 2001). Четыре киназы PI3K класса I (, ,иизоформы) были описаны у человека и других млекопитающих в связи с различными или перекрывающимися клеточными функциями, и они представляют собой киназы PI3K, наилучшим образом охарактеризованные как на структурном, так и функциональном уровне. КиназыPI3K, PI3K и PI3K экспрессируются в значительном количестве типов клеток и активируются при взаимодействии, через (SH2-домен)содержащие адаптерные молекулы, с тирозинкиназным рецептором фактора роста и другими внутриклеточными фосфотирозин-содержащими белками. В противоположность, киназа Р 13K экспрессируется только в гематопоэтических клетках (особенно, в лейкоцитах), и она является единственной изоформой, которая, как было показано, отвечает через адаптерную молекулу не содержащую SH2-домен, на рецепторы, связанные с G-белком, посредством взаимодействия с -субъединицами G-белка и последующей активации. Интересно, что у мышей, у которых отсутствует киназа РI3K, наблюдается среди других фенотипов четкий дефект миграции лейкоцитов, и они менее чувствительны к септическому шоку, что свидетельствует о роли киназы РI3K в клеточной миграции (Hirsch etal., 2000). Функциональная специализация изоформ киназы PI3K свидетельствует о том, что избирательное по отношению к изоформе ингибирование с допустимыми побочными эффектами могло бы быть полезным и терапевтически полезным при многих состояниях. Киназа РI3K оказывается привлекательным кандидатом в качестве мишени лекарственного средства для лечения воспалительных процессов, включая миграцию лейкоцитов, а также опухолевых заболеваний и других заболеваний с воспалительным или иммунным компонентом. Две молекулы были изучены, главным образом, как ингибиторы киназ PI3K: вортманнин(Wortmannin), ранее известный как ингибитор дыхательной активности (Arcaro and Wymann,1993) и LY294002 (Powis et al., 1994). Хотя вортманнин и LY294002 широко используются с целью исследования биологических функций активации киназ PI3K на клеточном уровне в экспресс-анализах, указанные соединения имеют специфические свойства, ограничивающие их фармацевтический потенциал. Как вортманнин, так и LY294002 проявляют плохую избирательность, так как различные киназы класса I ингибируются при сравнимых концентрациях(Stein and Waterfield, 2000). Кроме того, вортманнин необратимо связывает АТРсвязывающий участок киназы РI3K при наномолярных концентрациях, но указанное соединение является совершенно нестабильной молекулой, в то время как LY294002 конкурентно связывает АТР-связывающий участок киназы РI3K при микромолярных концентрациях, но молекула данного соединения плохо растворяется. Исследователями был проведен ряд химических модификаций вортманнина и LY294002,и только некоторые из них привели к получению молекул, которые оказались значительно более мощными по действию, чем родительское соединение (Creemer et al., 1996). 7 Исследователи использовали различные технологии для увеличения масштаба скрининга киназы РI3K или других родственных PI3K киназ, и для идентификации более мощных и специфических ингибиторов. Все указанные методы включают инкубацию киназ с субстратом (обычно, фосфоинозитид), меченным радиоактивным изотопом предшественником ([32 Р]АТР или [-33 Р]АТР) и потенциальным ингибитором, но путь, посредством которого эти основные компоненты добавляют или модифицируют для разработки анализа, может оказывать сильное влияние на масштаб и чувствительность анализа. Предыдущий уровень техники раскрывает различные системы для идентификации соединений, препятствующих проявлению фосфорилирующей активности РI3K-родственных киназ,с помощью антител, специфических к составляющей, конъюгированной с потенциальным ингибитором (международная публикация WO 98/55602), анализа изменений подвижности клеток, подвергаемых действию потенциального ингибитора, (международная публикация WO 99/35283), липидной экстракции в комбинации с хроматографическим разделением (Ward, 2000),непосредственно меченых аминогликозидов(международная публикация WO 00/18949), или тонкослойной хроматографии (Frew et al., 1994). Такие анализы сложны для выполнения, их трудно автоматизировать, и они создают проблемы и требуют значительных затрат из-за радиоактивных отходов. Некоторые методы высокомасштабного скрининга были разработаны с целью изучения ферментов, модифицирующих фосфоинозитиды. Микропланшеты FlashPlate, покрытые [3 Н] РI(4, 5)Р 2, были произведены путем включения указанной молекулы посредством ковалентного присоединения и/или гидрофобного взаимодействия и использованы для исследования фосфолипазы С, фермента, который катализирует гидролиз фосфоглицеридов до диацилглицеринов и фосфорилированных спиртов. С помощью указанного анализа определяют снижение радиоактивности в микропланшете вследствие образования [3 Н]-инозита, который мигрирует в водной фазе и затем выводится (международная публикация WO 99/32655). В качестве альтернативы, фосфоинозитид ковалентно связывали с субстратом-сцинтиллятором с использованием линкерной составляющей, подобной полиэтиленгликолю или сукцинимиду, при этом образуется композиция, используемая для исследования фосфатидилинозиткиназ и для скрининга соединений, ингибирующих указанные ферменты (международная публикация WO 00/00584). Однако не указано, что аминогликозид,покрывающий сцинтилляционные подложки,может быть использован в качестве главного средства для идентификации и/или количест 005092 8 венной оценки молекул, связывающих аминогликозид (АВМ), ферментов, модифицирующих такие молекулы, соединений, модулирующих взаимодействие между ABM и ферментами или аминогликозидами. Краткое описание сущности изобретения В настоящее время показано, что аминогликозиды, иммобилизованные на сцинтилляционной твердой подложке, способствуют эффективной иммобилизации и определению соответствующим образом меченных радиоактивным изотопом групп, добавленных к аминогликозид-связывающей молекуле (АВМ) или отщепляемых от указанной молекулы, путем измерения произведенного сцинтилляционного сигнала близкого расстояния. Таким образом, целью настоящего изобретения является способ идентификации и/или количественной оценки меченных радиоактивным изотопом аминогликозид-связывающих молекул (АВМ) в образце, причем указанный способ включает следующие стадии:b) создание условий для того, чтобы указанный фермент катализировал либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы,имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы,уже имеющейся в АВМ;c) инкубацию образца с одной или более твердых подложек, насыщенных сцинтилляционным соединением и покрытых аминогликозидом; иd) измерение сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного указанной подложкой(ами). В зависимости от условий и/или реагентов,используемых в приготовлении образца, способ может быть применен в разных аспектах, где образцы, приготовленные в таких же условиях,сравнивают путем измерения испускания, произведенного в каждом образце благодаря близости между сцинтилляционной подложкой и меченной радиоактивным изотопом АВМ. В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к анализу для идентификации и/или количественной оценки соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментом, который катализирует добавление меченной радиоактивным изотопом группы, присутствующей в образце, к АВМ, или отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в ABM, путем сравнения сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами), покрытой аминогликозидом,инкубированной с различными образцами, приготовленными согласно стадии (а) и включающими равное количество АВМ, равное количество фермента с одним или более дополнительными соединениями или без них. 9 В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к анализу для идентификации и/или количественной оценки соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и аминогликозидами, путем сравнения сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами), покрытой аминогликозидом,инкубированной с различными образцами, приготовленными согласно стадии (а) и включающими равное количество АВМ, равное количество фермента с одним или более дополнительными соединениями, добавленными до или в течение стадии (с), или без них. В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к анализу для идентификации и/или количественной оценки фермента, способного катализировать добавление меченной радиоактивным изотопом группы,присутствующей в образце, к АВМ, или отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ, путем сравнения сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами), покрытой аминогликозидом, инкубированной с различными образцами, приготовленными согласно стадии (а) и включающими равное количество одной и той же АВМ и различную смесь молекул, возможно, содержащих такой фермент. В другом аспекте настоящее изобретение относится к анализу для идентификации и/или количественной оценки АВМ путем сравнения сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами), покрытой аминогликозидом, инкубированной с различными образцами, приготовленными согласно стадии (а) и включающими равное количество одного и того же фермента и различную смесь молекул, возможно, содержащих АВМ. Ранее описанные анализы могут быть применены для прямого или конкурентного метода исследования путем добавления соединений,которые конкурируют с одним из компонентов,включенных в анализ, или изменяют указанный компонент, такой как молекула АВМ, отличная от АВМ, используемой на стадии (а) и (b), или аминогликозид-модифицирующий фермент. Кроме того, указанные способы делают возможным скрининг образцов в высокомасштабном формате анализа, например, потенциальных ингибиторов фосфоинозитид-3'-киназы с использованием сцинтилляционных шариков, покрытых неомицином. В другом аспекте настоящее изобретение относится к сцинтилляционным твердым подложкам, покрытым аминогликозидом, и к их применению для идентификации и/или количественной оценки меченных радиоактивным изотопом аминогликозид-связывающих молекул в образце. 10 И наконец, настоящее изобретение относится к набору для идентификации и/или количественной оценки аминогликозид-связывающих молекул (АВМ), ферментов, модифицирующих такие молекулы, или соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментами или аминогликозидами, включающему сцинтилляционную твердую подложку,покрытую аминогликозидом. Описание фигур На фиг. 1 схематически изображена реакция, катализируемая киназами PI3K, осуществляемая в образцах. Указанные ферменты связывают и гидролизуют субстрат АТР, при этом образуется ADP и свободная фосфатная группа,которая переносится на 3'-положение кольца инозита фосфатидилинозита (PI), образуя фосфорилированный РI-РI(3)Р. В случае, если АТР действительно находится в виде [33 Р]-АТР, меченная радиоактивным изотопом концевая фосфатная группа переносится на фосфолипид. Реакция in vivo осуществляется с фосфорилированным PI-PI (4, 5)Р 2, что приводит к сигнальной молекуле РI(3, 4, 5)Р 3. На фиг. 2 изображены липидные мицеллы,образованные путем агрегации меченых и немеченых фосфоинозитов. На фиг. 3 схематически изображена реакция взаимодействия между SPA-шариками и мечеными или немечеными молекулами фосфоинозита, где только последние производят определяемое испускание. Даже, если представлена только одна молекула не меченного радиоактивным изотопом фосфорилированного РIРI(3)Р, взаимодействие можно определять также путем взаимодействия шариков с мицеллами,изображенными на фиг. 2. На фиг. 4 изображен график, показывающий образование меченного радиоактивным изотопом фосфорилированного PI-PI(3)P, измеренного с помощью покрытых неомициномSPA-шариков и полученного с использованием различных концентраций [33 Р]-АТР и рекомбинантного слитого белка GST-PI3K. Конечный объем образца составляет 100 мкл. Покрытые неомицином SPA-шарики инкубируют в течение 60 мин после осуществления реакции в течение 45 мин. На фиг. 5 представлен график, изображающий влияние анализируемого объема на образование фосфорилированного PI-PI(3)P, выраженное в виде соотношения фон/сигнал, в отсутствие или присутствии 1 мкМ ингибитора вортманнина. Количество рекомбинантного слитого белка GST-PI3K составляет 25 нг. На фиг. 6 представлен график, изображающий результаты титрования покрытых неомицином SPA-шариков с использованием[33P]-АТР и GST-PI3K и в отсутствие или присутствии ингибитора, вортманнина. Образец содержит 25 нг GST-PI3K в конечном объеме 11 50 мкл. После инкубации при комнатной температуре в течение 45 мин к каждой лунке добавляют увеличивающиеся количества покрытых неомицином SPA-шариков. На фиг. 7 представлен график, показывающий, до какой степени термоинактивация фермента приводит к ингибированию образования фосфорилированного РI-РI(3)Р. 50 мкл реакционной смеси содержат 12,5 нг рекомбинантного слитого белка GST-PI3K, который обрабатывают (или не обрабатывают) при 95 С в течение 5 мин до инкубации с липосомами и в отсутствие или присутствии 5 мкМ ингибитора,вортманнина. На фиг. 8 представлены кривые титрования киназы РI3K, построенные в результате экспериментов с использованием покрытых неомицином SPA-шариков и неспецифических(рапамицин) или специфических (вортманнин,LY29240002) ингибиторов. Увеличивающиеся концентрации вортманнина или LY29240002 добавляют к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 12,5 нг рекомбинантного слитого белкаGST-PI3K и липосомы. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение базируется на знаниях о сродстве аминогликозидов к специфическим классам молекул и на способах, основанных на измерении усиления сигнала в результате близости между изотопами, испускающими-лучи, и подложками, насыщенными сцинтиллятором. Специфичность и прочность опосредованных аминогликозидом взаимодействий способствует идентификации с большой достоверностью сцинтилляционного сигнала близкого расстояния, произведенного между соответственно меченой АВМ и подложкой после того,как анализируемый образец подвергают контактированию со сцинтилляционной твердой подложкой, покрытой аминогликозидом. Основываясь на главных принципах, изобретение может быть применено для осуществления различных аналитических методов и в различных целях, включающих АВМ и ферменты, способные катализировать добавление меченной радиоактивным изотопом группы, имеющейся в образце, к АВМ, или отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ. Способы настоящего изобретения позволяют идентифицировать и/или количественно оценивать меченные радиоактивным изотопом связывающие аминогликозид молекулы (АВМ) в образце и включают следующие стадии:b) создание условий для того, чтобы указанный фермент катализировал либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы,имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление 12 меченной радиоактивным изотопом группы,уже имеющейся в АВМ;c) инкубацию образца с одной или более твердых подложек, насыщенных сцинтиллятором и покрытых аминогликозидом;d) измерение степени испускания, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами). Путем изменения условий и/или реагентов,используемых для приготовления образца на стадии (а), и сравнения различных образцов,настоящее изобретение может быть применено с целью исследования присутствия различных молекул и их активности, как это будет представлено в описании. Аминогликозид-связывающие молекулы(АВМ) означают все соединения, которые, меченные соответствующим образом радиоактивным изотопом, взаимодействуют с любой сцинтилляционной подложкой, покрытой аминогликозидом, со сродством, достаточным для того,чтобы привести к образованию специфического сцинтилляционного сигнала близости. Специфичность данного сигнала может быть определена путем сравнения сигнала, достигнутого при использовании сцинтилляционной подложки с другими типами составляющих, однако существуют два основных класса биологических соединений, которые проявляют сильное сродство по отношению к иммобилизованным аминогликозидам и которые могут быть in vivo и in vitro модифицированы меченной радиоактивным изотопом группой, совместимой со сцинтилляционным анализом близости: нуклеиновые кислоты (в частности, РНК) и фосфолипиды. Молекулы РНК, имеющие различные происхождение и структуру (включая рибозимы,рибосомальные РНК, аптамеры РНК и другие некодирующие РНК), проявляют значительное сродство к одному или более аминогликозидам(Walter et al., 1999; Schroeder et al., 2000). Какойлибо вид РНК не связывается со всеми аминогликозидами с одинаковым сродством и одним и тем же способом. Поэтому, в зависимости от того, будут ли исследовать РНК и/или РНКмодифицирующий фермент (будучи белком или другой РНК), соответствующую РНК включают в образец и соответствующий аминогликозид иммобилизуют на сцинтилляционной подложке. Предыдущий уровень техники показывает несколько примеров специфических комплексов РНК-аминогликозид (Wang et al. 1996; Hamasakiet al. 1998; Cho and Rando, 1999). Взаимодействия фосфолипид-аминогликозид и влияние аминогликозидов на модифицирующие фосфолипид ферменты изучали, и результаты такого исследования использовали в течение многих лет (Schacht, 1986; MingeotLeclercq et al., 1992). Несколько ферментов, способных модифицировать фосфолипиды путем добавления или отщепления химических групп(такие ферменты, как фосфолипидкиназы, фос 13 фатазы и липазы), идентифицировали и их действие связывали с важными биологическими функциями (Leevers et al., 1999; Stein and Waterfield, 2000). Как уже сказано в отношении РНК,в зависимости от того, будут ли исследовать фосфолипид и/или модифицирующий фосфолипид фермент, композиция образца и иммобилизованного аминогликозида может соответственно изменяться. Меченная радиоактивным изотопом группа может быть добавлена к АВМ либо с использованием химического синтеза, либо фермента,который может переносить группу от соответствующего предшественника. Добавление меченной радиоактивным изотопом группы химическим путем может быть подготовительным этапом к приготовлению образца, содержащего фермент, расщепляющий АВМ таким способом,что сцинтилляционный эффект близости уничтожается. Добавление меченной радиоактивным изотопом группы ферментативным путем может быть подготовительным этапом к реакции, описанной в отношении добавления химическим путем, или фактически может быть осуществлено до контактирования образца с сцинтилляционной подложкой, покрытой аминогликозидом. Для настоящего изобретения подходящим является любой изотоп, который может быть включен в химическую группу с образованием меченной радиоактивным изотопом группы,совместимой с молекулой АВМ, ферментом и не препятствующей взаимодействию АВМаминогликозид. После включения меченной радиоактивным изотопом группы в АВМ она должна испускать энергию излучения, активирующую сцинтилляционную подложку при связывании АВМ с иммобилизованным аминогликозидом. Если меченная радиоактивным изотопом группа не включена в АВМ, то она будет слишком удалена от сцинтилляционной подложки, чтобы ее энергия излучения произвела активацию сцинтиллятора. Поэтому, измерение специфического сцинтилляционного сигнала близости может быть осуществлено даже без отделения подложки от образца. Однако можно отделить подложку от образца, используя любой подходящий способ до измерения сцинтилляционного сигнала близости, например, центрифугирование подложек и удаление жидкой фазы. Используя РНК и фосфолипиды в качестве примеров молекул АВМ, подходящим изотопом является 33 Р, который может быть легко включен в качестве радиоактивного изотопа в составе фосфатной группы, например, в [-33 Р] АТР,или в остов нуклеиновой кислоты, или в кольцо инозита. Однако другие изотопы, которые, как известно, вызывают сцинтилляционный эффект близости (такие изотопы, как 3 Н, 125I или 35S),также могут быть использованы для получения меченной радиоактивным изотопом группы. 14 Настоящее изобретение может быть применено с любым типом сцинтилляционной твердой подложки, способствующей эффективной иммобилизации аминогликозидов. Предыдущий уровень техники (европейские патенты ЕР 154734, ЕР 576090, патенты США 4271139,3018178, европейский патент ЕР 556005) и производители (Amersham, NEN) предлагают множество примеров твердых фаз, насыщенных различными сцинтилляционными соединениями, обычно полимерными соединениями (поливинилтолуол, полистирол), представленными в виде шариков или микропланшетов, но любые другие формы могут быть использованы. Как сказано ранее, применение шариков или микропланшетов значительно улучшает масштабность способов согласно изобретению, которые особенно пригодны для проведения параллельного анализа многих образцов (вплоть до нескольких тысяч), подход не выполнимый для ряда ферментов, включающих молекулы АВМ. Способы и реагенты, способствующие эффективной и стабильной иммобилизации аминогликозидов (и вообще аминированных биологических лигандов) на твердой фазе, были раскрыты на предыдущем уровне техники относительно ряда подложек и полимеров (Sachetelli etal., 1998; международная публикация WO 90/08584; европейские патенты ЕР 372130 и ЕР 350407). Обычно указанные способы включают инкубацию аминированного лиганда с твердыми фазами одновременно или после того,как соединение или буфер активирует твердые фазы или аминированный лиганд. За указанной реакцией сочетания затем может последовать другая реакция, в которой непрореагировавшие группы блокируются и/или связывание лиганда стабилизируется. Как описано на предыдущем уровне техники(RNH2, расположенный на аминогликозиде),равновесие устанавливается относительно реакционного продукта, который представляет собой относительно нестабильную иминную составляющую (R'N=CHR). Эта связь может быть стабилизирована путем восстановительного алкилирования иминной составляющей с использованием восстанавливающих реагентов (т.е.,стабилизирующих реагентов), таких как боргидрид натрия или цианоборгидрид натрия, с образованием, таким образом, вторичного амина (R'NH-CH2R). Реакции сочетания и стабилизации обычно осуществляют при рН между 6 и 10 и при температуре, составляющей между 4 и 37 С, и они завершаются в течение 24 ч. Любая другая реакция и любой протокол, приводящие к эффективной ковалентной (или нековалентной) иммобилизации аминогликозидов на сцинтилляционной подложке в процессе всех мани 15 пуляций или реакций, являются подходящими для осуществления способов и применений способов согласно настоящему изобретению. После того, как образцы, содержащие меченные радиоактивным изотопом молекулы АВМ, приготовлены любым из способов, они могут быть подвергнуты контактированию с покрытыми аминогликозидом подложками в течение времени, достаточного для осуществления связывания молекул АВМ с подложкой, и сцинтилляционный сигнал близости может быть измерен для каждого образца согласно способам, описанным на предыдущем уровне техники, и с помощью коммерчески доступных счетчиков (Wallac). Не обязательно, соединения,блокирующие ферментативную реакцию, могут быть добавлены к образцам до их инкубации со сцинтилляционными подложками, но присутствие аминогликозида уже ингибирует многие из указанных реакций. Сравнение между величинами, полученными для различных образцов,должно дать информацию об активности фермента в каждом образце. Однако различные экспериментальные разработки могут быть осуществлены при использовании способов согласно изобретению для характеристики разных типов молекул и получения различной информации в результате исследования. Способы согласно изобретению могут быть применены в анализах для идентификации и/или количественной оценки соединений, модулирующих взаимодействие между посуществу чистой молекулой АВМ и либо чистым ферментом, либо, по существу, аминогликозидом. Сравнивая сцинтилляционный сигнал близости, обусловленный покрытыми аминогликозидом сцинтилляционными подложками,различные соединения или смеси соединений(такие как библиотека хроматографической фракции) могут быть охарактеризованы и/или очищены как соединения, проявляющие, например, специфическую ингибирующую активность. В первой группе экспериментальных разработок каждый образец должен содержать равное количество АВМ, фермента, способного переносить меченную радиоактивным изотопом группу на молекулу АВМ, предшественника,содержащего меченную радиоактивным изотопом группу, и одного или более дополнительных соединений, например потенциальных ингибиторов фермента. В качестве альтернативы,равные количества молекулы АВМ, уже меченной радиоактивным изотопом посредством химического или ферментативного способа, смешивают в каждом образце с равными количествами фермента, способного расщеплять меченную радиоактивным изотопом молекулу АВМ таким способом, что меченная радиоактивным изотопом группа отделяется от составляющей,ответственной за взаимодействие с аминоглико 005092 16 зидами, и с одним или более дополнительными соединениями, которые являются потенциальными ингибиторами фермента. Кроме того, в данном случае сравнение с контрольным образцом позволяет идентифицировать и/или количественно оценить ингибирование фермента указанными дополнительными соединениями, используя способы согласно изобретению. Путем сравнения контрольного образца с другими образцами ингибирование фермента указанными дополнительными соединениями можно идентифицировать и/или количественно оценивать способами согласно изобретению как снижение сцинтилляционного сигнала близости,как показывают примеры в случае соединений,ингибирующих катализируемое киназой фосфорилирование специфического положения в фосфолипиде. В качестве альтернативы, такими соединениями могут быть фосфоинозитидсвязывающие белки (Xu et al., 2001). Во второй группе экспериментальных разработок дополнительные соединения, как предполагают, ингибируют взаимодействие между молекулой АВМ и аминогликозидом. При сравнении контрольного образца с образцами, в которые дополнительные соединения добавляют после того, как реакция с участием меченного радиоактивным изотопом соединения завершается (до или в течение стадии (с, уменьшение измеренного уровня сцинтилляционного сигнала близости свидетельствует о том, что соединения влияют на взаимодействие между молекулой АВМ и аминогликозидом, иммобилизованным на сцинтилляционной подложке. Это происходит в случае, если добавляют молекулу АВМ, отличную от той, которую используют на стадии (а) и (b), или аминогликозидмодифицирующий фермент или добавляют аминогликозид-модифицирующий бактериальный фермент (Llano-Sotelo et al., 2002). В другом случае, молекула АВМ или фермент может находиться в действительности в недостаточно очищенном виде, так как они происходят из библиотеки хроматографических фракций. В этом случае, увеличение или уменьшение измеренного сцинтилляционного сигнала близости указывает на то, что отдельная фракция может быть обогащена специфическим ферментом (используя стандартизированную меченную радиоактивным изотопом молекулу АВМ во всех образцах) или специфической АВМ (используя стандартизированный фермент и реакцию с участием меченного радиоактивным изотопом соединения). Все ранее описанные способы могут быть применены в прямом или конкурентном методе путем добавления соединений, которые конкурируют с одним из компонентов, присутствующих в образце, или изменяют его. Такие молекулы могут быть включены в анализ, чтобы проверить их влияние на киназную активность и/или на взаимодействие с аминогликозидами 17 или с целью охарактеризовать и/или количественно оценить указанные молекулы и их свойства. Предыдущие способы могут быть применены при осуществлении скрининга образцов и анализирования в высокомасштабном формате образцов с помощью наборов. Сцинтилляционные твердые подложки, покрытые аминогликозидом, раскрытые в настоящем изобретении,могут быть использованы для идентификации и/или количественной оценки меченной радиоактивным изотопом аминогликозидсвязывающей молекулы в образце и в наборах для идентификации и/или количественной оценки аминогликозид-связывающих молекул,ферментов, модифицирующих такие молекулы,или соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментом или аминогликозидами. Следующие примеры предназначены проиллюстрировать изобретение с помощью покрытых неомицином SPA-шариков (в качестве сцинтилляционных подложек), человеческой рекомбинантной киназы РI3K, слитой с глутатион-S-трансферазой (в качестве фермента),фосфоинозида (в качестве аминогликозидсвязывающей молекулы) и [33 Р] -АТР (в качестве предшественника, несущего меченную радиоактивным изотопом группу) в присутствии или в отсутствие соединений, ингибирующих фермент. Изобретение указывает пути осуществления in vitro анализа ингибиторов киназ PI3K,основанного на SPA-шариках, который является особенно надежным и воспроизводимым в типичном формате для высокомасштабных анализов (96- или 384-луночные титрационные микропланшеты). Настоящее изобретение описано со ссылкой на специфические аспекты, но содержание описания включает все модификации и замены,которые могут быть внесены специалистом в данной области, не выходя за пределы сущности и цели формулы изобретения. Примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие любым путем применимость и полезность раскрытого изобретения. ПРИМЕРЫ 1. Материалы и методы Приготовление покрытых неомицином шариков для SPA-анализа Шарики на основе поливинилтолуола дляSPA-анализа (100 мл суспензии 100 мг/мл; Amersham) центрифугировали при 4400 хg в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осажденные шарики ресуспендировали в 100 мл боратного буфера (рН 8,5). После перемешивания суспензии в вальцовом смесителе в течение 15 мин суспензию центрифугировали при 4400 хg в течение 10 мин и вновь суспендировали в 100 мл боратного буфера, имеющего такой же рН. Затем шарики вновь суспендировали в 100 мл 50 18 мМ сульфата неомицина (рН 8,5). Чашу, содержащую суспензию, покрывали фольгой и инкубировали в течение ночи в вальцовом смесителе при комнатной температуре. Затем суспензию переносили в стеклянные химические стаканы,куда добавляли 150 мг боргидрида натрия, перемешивали в течение дальнейших 3 ч при комнатной температуре и, в конце концов, центрифугировали при 17600 хg в течение 15 мин. После того, как шарики респендировали со 100 мл бидистиллированной воды и центрифугировали при 17600 хg в течение 15 мин три раза и со 100 мл 1%-ного раствора глюкозы далее три раза,шарики ресуспендировали наконец в 50 мл 1%ного раствора глюкозы. Концентрацию шариков в суспензии определяли с использованием гравиметрического анализа и затем концентрацию доводили до 100 мг/мл до того, как разделить суспензию на аликвоты по 500 мг и лиофилизировать. Образцы супернатанта отбирали на стадиях приготовления после инкубации с сульфатом неомицина в течение ночи, фильтровали, и количество имеющегося неомицина оценивали флуорометрически, используя флуоресцентный анализ с флуорескамином (Lorenzen and Kennedy, 1993). Флуорескамин является молекулой,которая в присутствии аминных групп быстро взаимодействует с ними и образует флуоресцентные группы. Стандартную кривую вычерчивали на основании данных, полученных в результате взаимодействия известного количества неомицина (вплоть до 1,5 мг/мл) с флуорескамином, и с помощью данной кривой оценили,что количество неомицина, реально иммобилизованного на шариках, составляет 36 мкг на миллиграмм шариков. Применяемые для иммобилизации с использованием более высокого количества сульфата неомицина (150 мкМ) и/или боратного буфера с более высоким значением рН (рН 10,0),приводили к иммобилизации неомицина в сравнимом количестве (19-127 мкг на миллиграмм шариков). Приготовление человеческой рекомбинантной киназы РI3K Фермент, используемый в образцах, экспрессировали как рекомбинантный слитый белок с глутатион-S-трансферазой (GST; составляющая, которая способствует быстрой и эффективной очистке посредством аффинной хроматографии) с помощью системы Baculovirus/ клетки Sf9 насекомых, как ранее описано (международная публикация WO 96/12024), с единственной разницей в том, что фрагмент кДНК,клонированный в вектор pAcG2T, не содержал сегмента, кодирующего первые 36 аминокислот человеческой киназы РI3K (SWISSPROT Асе.P48736), которая экспрессируется, начиная от изолейцина в положении 37. Экспрессию и очистку рекомбинантного белка осуществляли с 19 помощью стандартных протоколов для GSTслитых белков. Альтернативные формы указанного фермента известны и также могут быть использованы (международные публикации WO 97/40173, WO 96/25488). Приготовление фосфолипидов Даже хотя фосфатидилинозит PI не является PI(4,5)P, молекулой, превращаемой in vivo посредством киназы РI3K в сигнальную молекулуPI(3,4,5)Р, скорость превращения PI в РI(3)Р в большинстве случаев рассматривается как показатель in vitro активности фермента (фиг. 1). Фосфолипидный субстрат приготавливали в виде мицелл, содержащих смесь 100 мкМ фосфатидилинозита (PI; Fluka) и 250 мкМ фосфатидилсерина (PS; Fluka). Фосфолипиды выпаривали досуха в токе азота в трубке из боросиликатного стекла. Затем липиды ресуспендировали в 40 мкМ HEPES-буфере (рН 7,4) посредством вихревого перемешивания в течение 20 мин и затем диспергировали с помощью ультразвука в водяной бане (Branson 2500) в течение 15 мин. Ингибиторы киназы Неспецифические и специфические ингибиторы киназы, исследуемые для проверки достоверности способов, основанных на покрытых неомицином(Wortmannin,LY2924 002, Rapamycin), являются коммерчески доступными (Upstate Biotechnology). 2. Анализ киназы РI3Kу с помощью покрытых неомицином SPA-шариков. Поскольку указанный тип анализов применяют, главным образом, при высокомасштабном скрининге, протокол разрабатывали с тем,чтобы осуществить анализ в стандартных 384-/96-луночных титрационных микропланшетах. В отдельном случае высокомасштабного скрининга соединений, ингибирующих киназу РI3K, образцы содержали человеческий рекомбинантный слитый белок GST-PI3K, фосфолипидные мицеллы, меченный радиоактивным изотопом АТР и, необязательно, соединения,которые проверяют как ингибиторы фермента,причем все указанные компоненты смешивали в соответствующем буфере. Взаимодействие приводило к более или менее значительной меченной радиоактивным изотопом фракции фосфолипидов, агрегированных в мицеллы (фиг. 2). Затем добавляли покрытые неомицином SPAшарики, блокирующие реакцию и взаимодействующие достаточно прочно со всеми фосфолипидами, чтобы иммобилизовать их на поверхности шариков (фиг. 3). Определение уровня сцинтилляционного сигнала близости, произведенного меченным фосфорилированным фосфатидилинозитом PI(3)Р, иммобилизованным на шариках, позволяет оценить активность киназы в различных образцах. В зависимости от размера лунки микропланшета общий объем реакционной смеси мо 005092 20 жет быть приспособлен к указанному размеру. В то время как 96-луночный микропланшет позволяет использовать образцы с объемами, сниженными до 50 мкл, 384-луночный микропланшет позволяет снизить объем образца до 30 мкл. В таблице представлен объем каждого реакционного компонента, который смешивали для получения трех разных конечных объемов (все объемы выражены в микролитрах). Рекомбинантный слитый белок 5 10 человека GST-PI3Ky Фосфолипидные мицеллы 10 10 Буфер для киназы 10 20 Ингибирующее соединение(или вода в контрольной реак- 5 10 ционной смеси Конечный объем 30 50 Фермент растворяли в 40 мМ Hepesбуфере (рН 7,4), 1 мМ DTT (дитиотреитол) и 5%-ном этиленгликоле. Количество фермента,добавленного в каждый образец, очевидно,влияет на количество меченного радиоактивным изотопом субстрата, но обычно оно составляет между 7,5 и 100 нг на образец. Конечная концентрация киназного буферного компонента составляет от 10 до 40 мкМ/200 нанокюри [33 Р]-АТР, 10 мМ МgСl2, 1 мМ DTT, 1 мМ (-глицерофосфат, 100 мкМNaVO4, 0,1% холат натрия, 40 мМ Hepes (рН 7,4). DMSO (диметилсульфоксид) также может присутствовать для улучшения растворимости ингибирующего соединения, но не должен превышать конечной концентрации, составляющей 1%, чтобы избежать ложного ингибиторного действия на киназу. После инкубации при комнатной температуре в течение периода времени, колеблющегося от 45 до 180 мин, и при осторожном перемешивании реакцию останавливают путем добавления 60 мкл (объем образца 30 мкл) или добавления 180 мкл (объем образца 50 или 100 мкл) фосфатно-буферного раствора (PBS), содержащего немеченный 10 мМ АТР (конкурирующий за неспецифическое связывание с все еще присутствующим меченным АТР), 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, соединение, ингибирующее киназу) и 100 мкг (250 мкг для реакционного объема 50 или 100 мкл) покрытых неомицином SPA-шариков из поливинилтолуола. После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре и при осторожном перемешивании покрытые неомицином SPAшарики затем извлекали путем центрифугирования планшетов в течение 5 мин при 1500 хg и удаления супернатанта. Количество радиоактивного фосфорилированного фосфатидилинозита PI(3)Р, образованного в каждой лунке, оценивали количественно с помощью сцинтилля 21 ционного счета в MicroBeta счетчике для планшетов (Wallac). Количество выражали в(число в минуту), принимая во внимание тот факт, что cpm точно соответствует dpm при условии, что бета-счетчик фиксирует со 100%-ной эффективностью реакции распада. В случае,если нельзя гарантировать такую эффективность, исследователи включают в расчеты поправочный коэффициент, где 1 кюри соответствует 2,22x1012 dpm. Для того, чтобы продемонстрировать эффективность способа определения, увеличить масштабность анализа и повысить соотношение сигнал/фон в варианте способа, основанного на микропланшете, проверяли различные условия путем титрования разных исследуемых компонентов. Было найдено, что снижение концентрации 33[ Р]-АТР от 40 до 10 мкм АТР/200 нанокюри приводит к двухкратному увеличению соотношения сигнал/фон, особенно в присутствии меньшего количества киназы (фиг. 4). Как показано путем сравнения счетов, полученных при использовании двух различных количеств киназы, специфический сигнал был пропорционален концентрации фермента. Снижение объемов от 100 до 50 мкл далее улучшало такое соотношение (фиг. 5). Также было продемонстрировано, что покрытые неомицином SPA-шарики способствуют линейному увеличению извлекаемого меченного радиоактивным изотопом субстрата вплоть до 750 мкг шариков на лунку (фиг. 6). Результаты двух последних экспериментов с образцами,в которые добавляли известный ингибитор киназы РI3K, названный вортманнином (UpstateBiotechnology), подтвердили специфичность активности киназы, определенной посредством указанных SPA-шариков. Возможность того,что шарики сами по себе могут неспецифическим образом связывать меченый субстрат, также была исключена, поскольку тепловая обработка при 95 С, которая инактивировала киназу РI3K, полностью доводила сигнал до фоновых уровней (фиг. 7). Достоверность способов согласно изобретению проверяли путем сравнения кривых, построенных для расчета величин IC50, полученных с использованием двух известных ингибиторов киназы PI3K (вортманнина и LY2924002) и в качестве контроля использовали рапамицин,ингибирующий mTOR, другую киназу, следующую далее в пути, который регулируется киназой РI3K. Увеличивающиеся концентрации вортманнина или LY 2924002 добавляли к рекомбинантному слитому белку человека GSTPI3K и к липосомам. Величины IC50 для вортманнина и LY 2924002 (2,6 нм и 2 мкМ концентрация, соответственно) находятся в соответствии с величинами, опубликованными для ука 005092 22 занных ингибиторов (Stein and Waterfield, 2000),в то время как рапамицин не оказывает заслуживающего внимания эффекта (фиг. 8). На указанные величины IC50 не оказывал действия порядок добавления ингибитора и липосом. Величины Km фермента для АТР и для PI также рассчитывали, но они не отличались значительно от величин, измеренных обычными способами. Величины отношения сигнал/фон, Km и IC50 для вортманнина и LY 2924002, рассчитанные с помощью либо 96-луночного микропланшета/50 мкл образца или 384-луночного планшета/30 мкл образца, также не показали существенной разницы. Список литературы:(1998), 10, 95-105. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ идентификации и/или количественной оценки аминогликозидсвязывающих молекул (АВМ), меченных радиоактивным изотопом, в образце, включающий следующие стадии:a) приготовление образца, содержащего по крайней мере молекулу АВМ и фермент;b) создание условий для того, чтобы указанный фермент катализировал либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы,имеющейся в образце, к молекуле АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в молекуле АВМ;c) инкубацию образца с одной или более твердых подложек, насыщенных сцинтилляционным соединением и покрытых аминогликозидом; иd) измерение степени испускания, произведенного сцинтилляционной подложкой(ами). 2. Способ по п.1, по которому образец и подложку(и) разделяют между стадиями (с) и(d). 3. Способ по п.1 или 2, по которому различные образцы, приготовленные согласно стадии (а), содержат равное количество АВМ, равное количество фермента, способного катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы, имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ,и одно или более дополнительных соединений. 4. Способ по п.1 или 2, по которому различные образцы, приготовленные согласно стадии (а), содержат равное количество АВМ, равное количество фермента, способного катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы, имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ, 005092 24 с одним или более дополнительными соединениями, добавленными до или в течение стадии(с), или без таких соединений. 5. Способ по п.1 или 2, по которому различные образцы, приготовленные согласно стадии (а), содержат равное количество АВМ и различные смеси молекул, которые, потенциально содержат фермент, способный катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы, имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ. 6. Способ по п.1 или 2, по которому различные образцы, приготовленные согласно стадии (а), содержат равное количество фермента,способного катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы,имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы,уже имеющейся в АВМ, и различные смеси молекул, потенциально содержащих АВМ. 7. Способ идентификации и/или количественной оценки соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментом, способным катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы,имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы,уже имеющейся в АВМ, по которому сцинтилляционный сигнал близкого расстояния, произведенный подложками, полученными согласно способу по п.3, сравнивают с указанным сигналом контрольного образца. 8. Способ по п.7, по которому соединения являются потенциальными ингибиторами фермента. 9. Способ для идентификации и/или количественной оценки соединений, модулирующих взаимодействие между АВМ и аминогликозидами, по которому сцинтилляционный сигнал близкого расстояния, произведенный подложками, полученными согласно способу по п.4,сравнивают с указанным сигналом контрольного образца. 10. Способ по п.9, по которому указанные соединения представляют собой аминогликозидмодифицирующие бактериальные ферменты. 11. Способ для идентификации и/или количественной оценки фермента, способного катализировать либо добавление меченной радиоактивным изотопом группы, имеющейся в образце, к АВМ, либо отщепление меченной радиоактивным изотопом группы, уже имеющейся в АВМ, по которому сцинтилляционный сигнал близкого расстояния, произведенный подложками, полученными согласно способу по п.5, сравнивают с указанным сигналом контрольного образца. 12. Способ для идентификации и/или количественной оценки АВМ, по которому сцинтилляционный сигнал близкого расстояния,произведенный подложками, полученными со 25 гласно способу по п.6, сравнивают с указанным сигналом контрольного образца. 13. Способ по пп.7-12, по которому добавляют соединение, конкурирующее с одним из компонентов или изменяющее один из компонентов, включенных в анализ. 14. Способ по пп.7-13, по которому сцинтилляционными подложками являются шарики. 15. Способ по пп.7-14, по которому аминогликозидом является неомицин. 16. Способ по пп.7-15, по которому АВМ(аминогликозидсвязывающей молекулой) является моно- или полифосфатированный фосфоинозитид. 17. Способ по пп.7-15, по которому молекулой АВМ является молекула РНК. 18. Способ по п.16, по которому ферментом является фосфоинозитидкиназа. 26 19. Применение сцинтилляционной твердой подложки, покрытой аминогликозидом, для идентификации и/или количественной оценки аминогликозидсвязывающей молекулы, меченной радиоактивным изотопом, в образце. 20. Набор для идентификации и/или количественной оценки в образце аминогликозидсвязывающих молекул, ферментов, модифицирующих указанные молекулы, или соединений,модулирующих взаимодействие между АВМ и ферментами или аминогликозидами, содержащий сцинтилляционную твердую подложку,покрытую аминогликозидом, и меченную радиоактивным изотопом аминогликозидсвязывающую молекулу.