Способ торможения апоптоза

006253 Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной кардиологии, и может быть применено для торможения апоптоза в экспериментальных исследованиях. 1. Известна модель регуляции апоптоза вентрикулярных миоцитов с помощью bcl-2. Считается, чтоbcl-2 действует как антиапоптотический фактор для вентрикулярных миоцитов. Kirshenbaum Lorrie A., de-1997.-96,5, с. 1580-1585. Недостаток модели - использование дорогостоящего оборудования и аденовируса при исследовании, что существенно ограничивает использование метода. 2. Известно, что при введении антагониста фактора активации тромбоцитов уменьшается апоптоз в изолированных, перфузируемых кровью сердцах кроликов (Loucks Eric, Godin David, Walley Keith, Oayumi Karim.//The role of platelet activing factor in cardiac dysfunction and apoptosis during ischemiareperfusion in the ex vivo rabbit heart: Pap.CSCI Reg. Meet. Young Invest. Forum, Vancouver, June 26, 1999.Clin.and Invest. Med.-1999.-22,5, с. 226. Метод основан на том, что антагонист фактора активации тромбоцитов способствует уменьшению апоптоза в изолированных, перфузируемых кровью сердцах кроликов. Недостатком способа является сложность, многостадийность получения модели, при которой фактор активации тромбоцитов уменьшает апоптоз, сложность и высокая стоимость самого метода. 3. Аналогом заявленного решения является развитие экспериментального инфаркта миокарда у крыс при введении антагонистов рецепторов ангиотензинов I и II GR138950 с в дозе 2 мг/кг/день и PD 123319 в дозе 3 мг/кг/день соответственно в течение 4 дней, которые уменьшают частоту апоптоза в зоне инфаркта миокарда (Passier Robert, Cleutjens Jack, Marx Patrick, Smits Jos, Daemen Mat. // Inhibition ofBlood Pressure and cardiovasc. Disease. Hypertension.-1997.-30,4, с. 1001). Недостаток аналога - использование дорогостоящего оборудования и реактивов, что существенно ограничивает использование аналога. 4. Прототипом изобретения по назначению является ослабление апоптоза в сердце in vivo при прерывистой ишемии. Piot Christophe A., Padmanaban Devi, Ursell Philip С., et.al.//Ishemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo. Circulation.-1997.-96,5, с. 1598-1604. Использование прототипа позволяет ослабить апоптоз в сердце при прерывистой ишемии. Недостатком прототипа является активное инструментальное вмешательство, затрудняющее выявление апоптотических повреждений при развитии коронарной недостаточности. Цель изобретения - расширение арсенала способов торможения апоптоза клеток аорты и коронарных сосудов для применения его в экспериментальной кардиологии. Поставленная цель достигается использованием модели коронарной недостаточности, вызванной иммобилизационным стрессом и однократным введением препарата медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг, что тормозит апоптоз в клетках аорты и коронарных сосудов, определяемый с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле. Новое в заявленном решении - использование комбинации модели коронарной недостаточности с помощью иммобилизационного стресса и однократного введения медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг, что вызывает торможение апоптоза клеток в аорте и коронарных сосудах. Пример осуществления способа Опыты поставлены на 60 белых неинбредных крысах-самцах весом 200-250 г в осенне-зимний период. Животные были разделены на 2 группы. 1 группа состояла из 30 крыс, которые были подвергнуты модели коронарной недостаточности с помощью иммобилизационного стресса. 2 группа состояла из 30 крыс, которых подвергали модели коронарной недостаточности, опосредованной иммобилизационным стрессом и, кроме того, однократно внутрибрюшинно вводили препарат медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг. Модель коронарной недостаточности вызывалась с помощью ежедневной 8-часовой иммобилизацией животных в течение 14 суток. После стрессирования в течение 14 суток у животных регистрировали развитие коронарной недостаточности электрокардиографически (II стандартное отведение). На 15-й день животных забивали путем декапитации и извлекались аорта и коронарные сосуды. У каждого животного было отобрано по 2-4 фрагментов от аорты и коронарных сосудов. Выделенные фрагменты помещали в физиологический натрий-фосфатный буфер, замороженные фрагменты сосудов животных гомогенизировали в жидком азоте (-196 С). Гомогенат переносили в лизирующий буфер (0,02 М ЭДТА; 0,02 М трис рН 8,0; 0,16 М NaCl; 0,5% SDS) и добавляли проназу Е до конечной концентрации 2 мкг/мл. Плавно качали в течение 10 мин, обрабатывали равным объемом фенола. Снова плавно качали в течение 10 мин, центрифугировали 15 мин при скорости 5769 G. К надосадочной жидкости добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа (1:1). Плавно качали 10 мин, центрифугировали при скорости 5769 G в течение 10 мин. К надосадочной жидкости добавляли равный объем хлороформа. ДНК осаждали в присутствии 2,5 объемов этилового спирта в концентрации 96%. Осаждение проводили в течение 10 мин при комнатной температуре и 20 мин при температуре -20 С. После осаждения ДНК центрифугированием (15000 G) осадок ДНК промывали 0,5 мл 80% этилового спирта, снова центрифугировали в течение 5 мин при 15000 G. Далее сливали спирт и высушивали осадок на воздухе. ДНК растворяли в воде и-1 006253 помещали на -20 С. С целью выявления апоптоз-специфической фрагментации образцы ДНК, выделенные из фрагментов сосудов, подвергались электрофоретическому разделению в 1,4% агарозном геле. К образцам ДНК добавляли 1 мкл раствора РНК-азы (в концентрации 1 мг/мл). Затем образцы ДНК помещались на водяную баню (37 С) в течение одного часа. Гели заливали в планшету и после полимеризации помещали в электрофоретическую камеру, заполненную трис-ацетатным буфером (1xTAE). Образцы ДНК (3 мкл) смешивали с красителем - бромфеноловым синим (1 мкл) и переносили в кармашки геля. После этого на электроды электрофоретической камеры подавали электрический ток (55 В; 35 А). Электрофорез проводили в течение 3-5 ч. Пример полученных результатов представлен на фиг. 1. В первой группе выявлена апоптозспецифическая фрагментация ДНК сосудов, что показано в образцах 7, 10. Определение длины обнаруженных фрагментов с использованием маркера - Hind III - рестрицированных фрагментов ДНК фага- показало, что кратность длины выявленных фрагментов длине ДНК на нуклеосоме равна 180 пар олигонуклеотидов (п.о.), 360 п.о., 540 п.о., 720 п.о. Обнаруженная ДНК-фрагментация является апоптозной лестницей, что свидетельствует о наличии апоптоза в образцах группы 1. Подобная картина выявлена в 75% фрагментов сосудов животных, подвергнутых только модели коронарной недостаточности, вызванной иммобилизационным стрессом. На фиг. 2 представлена электрофореграмма ДНК из группы 2. При исследовании обнаружено, что во всех образцах ДНК фрагментов сосудов животных 2 группы была не фрагментирована (100% случаев). Это является свидетельством торможения апоптоза клеток аорты и коронарных сосудов у животных, которые подвергались модели коронарной недостаточности с помощью иммобилизационного стресса в комплексе с однократным внутрибрюшинным введением препарата медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мгкг веса. Нами выявлено, что апоптоз-специфическая фрагментация ДНК клеток аорты и сосудов сердца присутствует в 75% случаев в группе животных, подвергнутых только модели коронарной недостаточности, опосредованной иммобилизационным стрессом. Не выявлено ни одного случая апоптозспецифической фрагментации ДНК клеток аорты и коронарных сосудов в группе животных, подвергнутых модели коронарной недостаточности, вызванной иммобилизационным стрессом в комбинации с однократным внутрибрюшинным введением препарата медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг. Таким образом, комплексное воздействие модели коронарной недостаточности, вызванной иммобилизационным стрессом, и однократное введение препарата медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг тормозит апоптотические изменения клеток аорты и коронарных сосудов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ торможения апоптоза клеток аорты и коронарных сосудов, основанный на модели коронарной недостаточности, отличающийся тем, что ежедневный восьмичасовой иммобилизационный стресс в течение 14 дней и однократное введение препарата медроксипрогестерона ацетата в дозе 0,3 мг/кг вызывают торможение программированной клеточной гибели клеток аорты и коронарных сосудов.