Препарат, содержащий гемостатически активный фактор vwf, и способ его получения

006209 Объектом данного изобретения является способ получения препарата, содержащего инактивированный в отношении вирусов гемостатически активный фактор Виллебранда (vWF), из фракции человеческой плазмы, а также препарат, содержащий гемостатически активный vWF, полученный способом согласно изобретению. Болезнью Виллебранда является нарушение свертываемости крови, которое встречается в виде гемофилии А или В, в виде кровотечения в мягкой ткани, особенно в слизистых оболочках. Причиной этого заболевания был признан недостаток так называемого фактора Виллебранда (vWF). Этот фактор до сих пор вводился пациентам посредством препаратов фактора VIII, в которых также содержался vWF,правда, часто лишь неудовлетворительного качества и в неудовлетворительном количестве. Хотя удалось получить фактор vWF с помощью генной инженерии, однако, существует потребность в усовершенствованных способах очистки для получения vWF из донорской крови или плазмы. В заявке ЕР-А-0 934 748 описан высокочистый vWF с содержанием по крайней мере 15% мультимеров vWF, состоящих из 13 или больше протомеров (HMW-VWF мультимеры). Фактор получают с помощью многоступенчатой хроматографической очистки, причем изначально может быть проведена гельфильтрация в режиме разделения групп "group separation mode", включая криоосаждение. Для инактивации вирусов описана, например, обработка растворителем и детергентом, а также тепловая обработка в лиофилизованном состоянии в течение 72 ч при 80 С.(1994), касаются очистки комплекса фактор VIII-vWF. При этом проводится очистка через ионообменник и две независимые стадии для инактивации вирусов. Следует обработка сольвентом/детергентом и пастеризация (10 ч при 63 С) в присутствии стабилизаторов. Хотя фактор VIII посредством пастеризации едва денатурируется (остаточная активность 95%), у фактора vWF изменяются активность и распределение мультимеров (85% остаточного антигена) и наблюдается потеря высокомолекулярных мультимеров. В результате этого получается соотношение антигена vWF к активности 2,2 (активность к антигену=0,5). Заявка US-A-5 714 590 описывает очистку комплекса фактора VIII посредством ионообменной хроматографии. Для этого в качестве материала колонки используют EMD-ТМАЕ-Fractogel, который также используется для гельпроникающей хроматографии. Для инактивации вирусов предложена обработка сольвентом/детергентом. Тепловая обработка не описана. Полученный продукт содержит также vWF,причем приведена только антигенность vWF. Задачей изобретения является разработка нового способа очистки фактора vWF из человеческой плазмы. При этом способ обеспечивать получение vWF улучшенного качества и эффективности. Поставленная задача решается способом получения препарата, содержащего гемостатически активный фактор Виллебранда (vWF) из фракции человеческой плазмы, характеризующимся тем, что, прежде всего, проводят хроматографическую очистку фракции плазмы, содержащей vWF, на анионообменном материале, имеющем анионообменные группы на привитых полимерных структурах (материалыTentakel), накопление очищенной посредством гельпроникающей хроматографии фракции, содержащейvWF, и нагревание препарата для инактивации вирусов. Материалы Tentakel, используемые в способе согласно изобретению, прежде всего, описаны в заявке ЕР-А-0 337 144. Речь идет, предпочтительно, о привитых по диолам фрактогеля (Fractogel) полиакриламидных полимерах Tentakel фирмы Merck,Darmschtadt, Deutschland. На фиг. 1 показана стабильность продукта, полученного согласно изобретению по отношению к продуктам, очищенным посредством аниоонобменной хроматографии. Этот способ неожиданным образом приводит к продукту с высоким содержанием фактора vWF в соотношении к фактору FVIII. Проведение способа согласно изобретению обеспечивает за счет стадии гельпроникающей хроматографии удаление ингибитора интертрипсина, а также других факторов,которые в известных способах получения могут способствовать ухудшению качества продукта. Посредством последовательности хроматографических стадий согласно изобретению получают препарат vWF,который неожиданно является стабильным. Фракция vWF, полученная способом согласно изобретению,в водном растворе при комнатной температуре неожиданно является стабильной в течение длительного времени (измеряли вплоть до недели), в основном. Препарат согласно изобретению, сверх того, содержитvWF в нативной форме и свободeн от фрагментов. Предпочтительно термостабильный препарат, а также нагретый препарат характеризуется только одним пиком в гель-фильтрационном анализе ВЭЖХ. Прежде всего, термостабильный препарат согласно изобретению может быть нагрет в лиофилизированном состоянии при температуре более 80 С. В следующей форме выполнения способа согласно изобретению препарат нагревают при температуре более 90 С, особенно при 100 С. При этом нагревание согласно изобретению происходит, предпочтительно, в течение по крайней мере от 1 до 5 ч, особенно от 2 до 3 ч. При этом все релевантные к трансфузии вирусы, особенно вирусы, не покрытые липидной оболочкой, как парво-вирусы или вирусы гепатита А, инактивируются. Поразительным образом продукт,-1 006209 полученный согласно изобретению, выдерживает термообработку в этих условиях без существенных потерь активности. Очистка фракции, содержащей vWF, согласно изобретению может дополнительно происходить посредством, по крайней мере, адсорбционной и/или афинной хроматографической обработки. Согласно изобретению также может использоваться фракция, содержащая vWF, которую получают из объединенной человеческой плазмы, и она может быть очищена способом согласно изобретению. Объектом данного изобретения также является препарат, содержащий гемостатически активныйvWF, полученный способом согласно изобретению. Препарат согласно изобретению является свободным от инфекционных вирусов, переносимых кровью, особенно HIV, HBV, HCV, HAV и парво-вирусов. Предпочтительно препарат согласно изобретению содержит фактор vWF в высокомолекулярной форме, который после электрофоретического анализа характеризуется по крайней мере 13-16 мультимерными полосами. Число мультимеров и характер их распределения является мерой сходства препаратаvWF и нативного vWF в плазме. Далее, соотношение кофактора ристомицина как суррогатный маркер активности vWF к антигену vWF составляет для препарата согласно изобретению по крайней мере 0,8. Это представляет собой степень интеграции молекул vWF. Препарат согласно изобретению предпочтительно содержит фактор VIII в нативной форме. Применение комплексов из FVIII и vWF оказалось особенно пригодным для лечения болезни Виллебранда. В дальнейшем удаляют из препарата согласно изобретению следующие протеины: иммуноглобулины, фибриноген, фибронектин, а также ингибитор интертрипсина - до предела ниже иммунохимического обнаружения. Этим, вероятно, обусловлена чрезвычайная стабильность продукта согласно изобретению. Изобретение поясняется следующими примерами. Примеры Около 47 кг осадка, полученного криоосаждением, обрабатывают 15% (в./в.) 2%-ного (в./в.) раствора гидроксида алюминия. После центрифугирования пробу инактивируют в отношении вирусов посредством 0,3% ТnВР/1% Triton x 100. После экстракции масла проводят анионообменную хроматографию наFractogel EMD TMAE (Tentakelgel, Fa Merck, Darmschtadt, Deutschland). Буферные условия следующие: Буфер AM, первая стадия промывания: 120 мМ NaCl, 10 мМ цитрата Na, 120 мМ глицина, 1 мМ CaCl2, рН 6,9-7,1; осмоляльность: 360-400 мосмоль/кг. Буфер ВМ, вторая стадия промывания: 235 мМ NaCl, 10 мМ цитрата Na, 120 мМ глицина, 1 мМ CaCl2, рН 6,9-7,1; осмоляльность: 570-610 мосмоль/кг. Буфер CM, элюирование: 700 мМ NaCl, 10 мМ цитрата Na, 120 мМ глицина, 1 мМ CaCl2, рН 6,9-7,1; осмоляльность: 13801480 мосмоль/кг. Буфер DM, третья стадия промывания: 1,5 М NaCl. Фракции с активностью vWF/FVIII подвергают высокоэффективной хроматографии на FractogelEMD Bio SEC (Gel, Fa. Merck, Darmschtadt, Deutschland). После ультра/диафильтрации готовят препарат со следующим составом: 400 мМ NaCl, 10 мМ цитрата Na, 1 мМ CaCl2, 133 мМ глицина, 1 % сахарозы. Далее следует фильтрация в стерильных условиях. Препарат дозируют и лиофилизируют. Затем происходит термообработка при температуре 100 С. Термообработка продолжается 120 мин. На чертеже показана стабильность продукта, полученного согласно изобретению, по отношению к продуктам, очищенным только анионообменной хроматографией. Продукт согласно изобретению после анионообменной хроматографии обрабатывается посредством высокоэффективной хроматографии. Показано, что при хранении с гепарином или без него в водном растворе при комнатной температуре в течение 7 дней продукт согласно изобретению еще имеет активность 80%, в то время как продукт, не подвергавшийся высокоэффективной хроматографии, имеет активность лишь 20%. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения препарата из фракции человеческой плазмы, содержащего гемостатически активный фактор Виллебранда (vWF), посредствомI) хроматографической очистки фракции плазмы, содержащей vWF, на анионообменном материале,имеющим анионообменные группы на привитых полимерных структурах, накопления фракции, содержащей vWF, отличающийся тем, чтоII) очистка этой фракции происходит посредством гельпроникающей хроматографии для получения очищенного термостабильного препарата, содержащего vWF, иIII) препарат нагревают для инактивации вирусов.-2 006209 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что термостабильный препарат, а также нагретый препарат характеризуется только одним пиком в гель-фильтрационном анализе ВЭЖХ. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что термостабильный препарат нагревают в лиофилизированном состоянии при температуре более 80 С. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что препарат нагревают при температуре более 90 С, предпочтительно при 100 С. 5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что препарат нагревают, по крайней мере, в течение 1-5 ч,предпочтительно 2-3 ч. 6. Способ по пп.1-5, отличающийся тем, что фракцию дополнительно очищают посредством, по крайней мере, адсорбционной и/или афинной хроматографии. 7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что на заключительной стадии очистки протеина проводят очистку посредством гельпроникающей хроматографии. 8. Способ по пп.1-7, отличающийся тем, что очищают фракцию из объединенной человеческой плазмы. 9. Препарат, содержащий гемостатически активный фактор vWF, полученный способом по пп.1-8. 10. Препарат по п.9, отличающийся тем, что препарат свободен от инфекционных вирусов, переносимых кровью, в частности HIV, HBV, HCV, HAV и парво-вирусов. 11. Препарат по п.9 или 10, отличающийся тем, что он содержит высокомолекулярный vWF и после электрофоретического анализа характеризуется по крайней мере 13-16 полосами мультимеров. 12. Препарат по пп.9-11, отличающийся тем, что соотношение активности vWF, измеренной как кофактор ристоцитина, к антигену vWF составляет по крайней мере 0,8. 13. Препарат по пп.9-12, отличающийся тем, что дополнительно он содержит фактор VIII в нативной форме. 14. Препарат по пп.9-13, отличающийся тем, что он содержит иммуноглобулины, фибриноген, фибронектин, а также ингибитор интертрипсина ниже иммунохимического предела обнаружения. 15. Препарат по пп.9-14, отличающийся тем, что он содержит vWF в нативной форме и свободен от фрагментов. Сравнение концентратов FVIII: FVIII ТМАЕ и FVIII ТМАЕ-SEC при хранении в инфузионной емкости при комнатной температуре в присутствии или в отсутствие гепарина Концентраты FVIII растворяли в воде для инъекций или в воде для инъекций, содержащей 5 иммунизирующих единиц гепарина/мл. После перенесения в инфузионную емкость пробы хранили при комнатной температуре. Через определенное время отбирали пробы и определяли активность FVIII:C (хромогенно). Значение FVIII дается в процентном отношении к начальной активности.