Способы идентификации средств, модулирующих активность аспартилпротеазы asp2 человека

009216 Область техники Настоящее изобретение относится к болезни Альцгеймера, APP, амилоидному бета-пептиду и аспарагилпротеазам человека, а также к способу идентификации агентов, модулирующих активность этих полипептидов. Предпосылки изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) вызывает прогрессирующую деменцию, сопровождающуюся образованием амилоидных бляшек, нейрофибриллярных сплетений, глиозом и потерей нейронов. Эта болезнь имеет генетическую и спорадическую формы, причем обе формы характеризуются практически одинаковым клиническим течением и патологическими признаками. В настоящее время обнаружены три гена,которые в результате мутации вызывают аутосомную доминантную форму болезни Альцгеймера. Эти гены кодируют предшественник амилоидного белка (APP) и два родственных белка, презенилин-1 (PS1) и презенилин-2 (PS2), которые, как следует из их названия, являются родственными в структурном и функциональном отношении. Мутации в любом из этих трех генов усиливают протеолитический процессинг APP по внутриклеточному пути, что ведет к образованию амилодного бета-пептида или А-пептида(который в описании настоящего изобретения иногда обозначается как Абета), состоящего из 40-42 аминокислот, который является основным компонентом амилоидной бляшки, возникающей при болезни Альцгеймера. Нарушение равновесия внутриклеточных путей в сторону протеолитического процессинга является главным фактором патофизиологии болезни Альцгеймера. В случае образования бляшек, мутации в APP, PS1 или PS2 значительно влияют на протеолитический процессинг APP, в результате чего увеличивается образование A 1-42, формы A-пептида, которая, по-видимому, является исключительно амилоидогенной и играет важную роль в развитии болезни Альцгеймера. Размер различных форм APP изменяется от 695 до 770 аминокислот, расположенных на поверхности клетки, и APP имеет один Сконцевой трансмембранный домен. Абета-пептид возникает из области APP, расположенной рядом с трансмембранным доменом и включающей часть этого домена. Процессинг APP на сайте -секретазы обычно вызывает расщепление средней области последовательности A, прилежащей к мембране, и высвобождение растворимого внеклеточного домена APP с поверхности клетки. В результате такого процессинга APP -секретазой образуется растворимый АРР-, что является нормальным процессом, который, как считают, не имеет отношения к болезни Альцгеймера. Патологический процессинг APP на сайтах - и -секретазы приводит к совершенно другому результату, в отличие от процессинга на -сайте. Последовательный процессинг на сайтах - и -секретазы вызывает высвобождение А-пептида, который, по-видимому, имеет очень важное значение для патогенеза болезни Альцгеймера. Процессинг на сайтах - и -секретазы может происходить как в эндоплазматическом ретикулюме (в нейронах), так и в эндосомном/лизосомном пути после повторной интернализацииAPP на поверхности клетки (во всех клетках). Несмотря на интенсивные попытки в течение более 10 лет идентифицировать ферменты, ответственные за процессинг APP на сайтахи , с целью получения Апептида, до настоящего времени эти протеазы не были известны. Авторы изобретения впервые идентифицировали и исследовали фермент -секретазу. В настоящем описании изобретения рассмотрены некоторые известные и некоторые новые аспарагиновые протеазы, которые могут действовать как протеазы-секретазы, и впервые объяснена роль этих протеаз в болезни Альцгеймера. Авторы изобретения обнаружили области в этих протеазах, ответственные за выполнение их уникальной функции, и впервые описали их субстрат. В описании изобретения впервые описан экспрессированный, выделенный, очищенный активный белок такого типа, методы анализа с использованием этого белка, а также способы идентификации и создания полезной линии клеток и ингибиторов. Краткое изложение существа изобретения Далее приведено описание нескольких вариантов гена Asp2 и пептида. Настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному полинуклеотиду нуклеиновых кислот, кодирующему протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета -секретазой, который содержит два или более наборов специальных нуклеиновых кислот, разделенных нуклеиновыми кислотами, кодирующими положения примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, где первый набор специальных нуклеиновых кислот состоит из нуклеиновых кислот,кодирующих пептид DTG, причем первая нуклеиновая кислота первого специального набора нуклеиновых кислот является первой специальной нуклеиновой кислотой, и второй набор нуклеиновых кислот кодирует пептид DSG или DTG, причем последняя нуклеиновая кислота второго набора нуклеиновых кислот является последней специальной нуклеиновой кислотой, при условии, что нуклеиновые кислоты,представленные последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5, не включены. В одном из вариантов осуществления два набора нуклеиновых кислот разделены нуклеиновыми кислотами, кодирующими положения примерно 125-222 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. В конкретном варианте осуществления два набора разделены нуклеиновыми кислотами, которые кодируют положения примерно 150-172 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. Еще в одном конкретном варианте осуществления два набора разделены нуклеиновыми кислотами, которые кодируют положения примерно 172 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. Характерный полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID NO: 3. Еще-1 009216 в одном варианте осуществления два набора нуклеиновых кислот разделены нуклеиновыми кислотами,кодирующими положения примерно 150-196 аминокислот. Еще в одном варианте осуществления два набора нуклеотидов разделены нуклеиновыми кислотами, кодирующими примерно 196 аминокислот. Характерный полинуклеотид содержит два набора нуклеиновых кислот, которые разделены такими же последовательностями нуклеиновых кислот, как последовательности, которые разделяют аналогичный набор специальных нуклеиновых кислот последовательности SEQ ID NO: 5. В частном варианте осуществления два набора нуклеиновых кислот разделены нуклеиновыми кислотами, кодирующими примерно 150-190 аминокислот. Еще в одном варианте осуществления два набора нуклеотидов разделены нуклеиновыми кислотами, кодирующими примерно 190 аминокислот. Еще в одном варианте осуществления два набора нуклеотидов разделены такими же последовательностями нуклеиновых кислот, которые разделяют аналогичный набор специальных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления первая нуклеиновая кислота первого конкретного набора аминокислот, то есть первая специальная нуклеиновая кислота, функционально связана с любым кодоном, в котором нуклеиновые кислоты кодируют любой пептид, включая 1-10000 аминокислот. В другом варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с полимерами нуклеиновых кислот, кодирующими любой пептид, выбранный из группы, состоящей из любых репортерных белков или белков,облегчающих очистку. Еще в одном варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с полимерами нуклеиновых кислот, кодирующими любой пептид, выбранный из группы, состоящей из тяжелой цепи иммуноглобулина, мальтозасвязывающего белка, глутатион-Sтрансферазы, зеленого флуоресцирующего белка и убихитина. Еще в одном варианте осуществления последняя нуклеиновая кислота второго набора специальных аминокислот, то есть последняя специальная нуклеиновая кислота, функционально связана с полимерами нуклеиновых кислот, кодирующими любой пептид, содержащий любые 1-10000 аминокислот. В одном из вариантов осуществления последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с любым кодоном, связанным с полимерами нуклеиновых кислот, кодирующими любой пептид, выбранный из группы, состоящей из любых репортерных белков или белков, облегчающих очистку. Еще в одном варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с полимерами нуклеиновых кислот, кодирующими любой пептид, выбранный из группы, состоящей из тяжелой цепи иммуноглобулина, мальтозасвязывающего белка, глутатион-S-трансферазы, зеленого флуоресцирующего белка и убихитина. Настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному полинуклеотиду нуклеиновых кислот, кодирующему протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который содержит два или более наборов специальных нуклеиновых кислот, разделенных нуклеиновыми кислотами, кодирующими положения примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных нуклеиновых кислот состоит из нуклеиновых кислот, кодирующих DTG, причем первая нуклеиновая кислота первого специального набора нуклеиновых кислот является первой специальной нуклеиновой кислотой, и второй набор нуклеиновых кислот кодирует DSG или DTG, причем последняя нуклеиновая кислота второго набора специальных нуклеиновых кислот является последней специальной нуклеиновой кислотой, первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число аминокислот от 0 до 81, и каждый из этих кодонов может кодировать любую аминокислоту. В одном из вариантов осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число аминокислот от 64 до 77, и каждый кодон может кодировать любую аминокислоту. В частном варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими 71 аминокислоту. Например, первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с 71 аминокислотами и первая из этих 71 аминокислот является аминокислотой T. Еще в одном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательностям Asp1 или Asp2, описанным здесь. Еще в одном варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число аминокислот, от 40 до 54, и каждый кодон может кодировать любую аминокислоту. В частном варианте осуществления первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими 47 аминокислот. Например, первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с 47 кодонами и первая из этих 47 аминокислот является аминокислотой E, например полинуклеотид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична SEQ ID NO: 29, описанной в примере 10, или всей полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 29, описанной в примере 10. Еще в одном связанном аспекте изобретение относится к выделенному или очищенному полинуклеотиду нуклеиновых кислот, кодирующему протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который содержит два или более наборов специальных нуклеиновых кислот, разделенных нуклеиновыми кислотами, кодирующими положения примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных нуклеиновых кислот содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие пептид DTG, причем первая нуклеиновая кислота первого специального набора нуклеиновых кислот является первой специальной нуклеиновой кислотой, и второй-2 009216 набор нуклеиновых кислот кодирует пептид DSG или DTG, причем последняя нуклеиновая кислота второго набора специальных нуклеиновых кислот, то есть последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число из 50-170 кодонов. Еще в одном варианте осуществления последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, содержащими 100-170 кодонов. В частном варианте осуществления последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, содержащими 142-163 кодона. Еще в одном варианте осуществления последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, содержащими примерно 142 кодона. Например, полинуклеотид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична SEQ ID NO: 21,описанной в примере 9, или SEQ ID NO: 29, описанной в примере 10, или полноразмерной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 21, описанной в примере 9, или SEQ ID NO: 29, описанной в примере 10. В одном из вариантов последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, содержащими примерно 163 кодона. Еще в одном варианте последняя специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, содержащими примерно 170 кодонов. Еще в одном варианте осуществления второй набор специальных нуклеиновых кислот кодирует пептид DSG и первый набор нуклеиновых кислот необязательно функционально связан с меткой очистки пептида. Например, полинуклеотид нуклеиновых кислот функционально связан с меткой очистки пептида, состоящей из шести остатков гистидина. Еще в одном варианте осуществления первый набор специальных нуклеиновых кислот относится к одному полинуклеотиду, а второй набор специальных нуклеиновых кислот относится ко второму полинуклеотиду, причем как первый, так и второй полинуклеотиды имеют по крайней мере 50 кодонов. В одном из вариантов осуществления первый набор специальных нуклеиновых кислот относится к одному полинуклеотиду, а второй набор специальных нуклеиновых кислот относится ко второму полинуклеотиду, причем как первый, так и второй полинуклеотиды имеют по крайней мере 50 кодонов и оба указанных полинуклеотида находятся в одном растворе. В связанном аспекте изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид, описанный выше, и к клетке или линии клеток, содержащей полинуклеотид, описанный выше. Еще в одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному или очищенному пептиду или белку, содержащему аминокислотный полимер, то есть протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который имеет два или более наборов специальных аминокислот,разделенных положениями примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из пептида DTG, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой,и второй набор аминокислот выбирают из пептида, включающего DSG или DTG, причем последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой при условии, что в объем этого изобретения не входят протеазы, приведенные в SEQ ID NO: 2 и SEQ IDNO: 6. В одном из вариантов осуществления два набора аминокислот разделены положениями примерно 125-222 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. В частном варианте осуществления два набора аминокислот разделены примерно 150-172 аминокислотами. Еще в одном варианте осуществления два набора аминокислот разделены примерно 172 аминокислотами. Например, полипептид представляет собой протеазу, описанную в SEQ ID NO: 4. Еще в одном варианте осуществления два набора аминокислот разделены примерно 150-196 аминокислотами. В одном из вариантов два набора аминокислот разделены примерно 196 аминокислотами. В одном из вариантов два набора аминокислот разделены такими же аминокислотными последовательностями, которые разделяют аналогичный набор специальных аминокислот в SEQ ID NO: 6. В частном варианте осуществления два набора аминокислот разделены примерно 150-190 аминокислотами. Еще в одном варианте осуществления два набора нуклеотидов разделены примерно 190 аминокислотами. Например, два набора нуклеотидов разделены такими же аминокислотными последовательностями, которые разделяют аналогичный набор специальных аминокислот в SEQ ID NO: 2. В одно из вариантов осуществления первая аминокислота первого специального набора аминокислот, то есть первая специальная аминокислота, функционально связана с любым пептидом, включающим 1-10000 аминокислот. В другом варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с любым пептидом, выбранным из группы, состоящей из любых репортерных белков или белков, облегчающих очистку. В одном из вариантов осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с любым пептидом, выбираемым из группы, состоящей из тяжелой цепи иммуноглобулина, мальтозасвязывающего белка, глутатион-S-трансферазы, зеленого флуоресцирующего белка и убихитина. Еще в одном варианте осуществления последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот, то есть последняя специальная аминокислота, функционально связана с любым пептидом, включающим 1-10000 любых аминокислот. В качестве неограничивающего примера последняя специальная аминокислота функционально связана с любым пептидом, выбранным из группы, состоящей из любых репортерных белков или белков, облегчающих очистку. В частном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с любым пептидом, выбираемым из группы, состоящей из тяжелой цепи иммуноглобулина, мальтозасвязывающего белка, глутатион-S-трансферазы, зеленого флуоресцирующего белка и убихитина.-3 009216 Изобретение относится к любому выделенному или очищенному пептиду или белку, содержащему аминокислотный полипептид, кодирующий протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который содержит два или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот DTG, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой D, и второй набор аминокислот представляет собой DSG или DTG, причем последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой G и первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими любое число положений из 0-81 аминокислоты, в которых могут находиться любые аминокислоты. В одном из вариантов осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, имеющим положения примерно 64-77 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. В конкретном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 71 аминокислоты. Еще в одном частном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с 71 аминокислотой и первая из этих 71 аминокислоты является аминокислотой T. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности аспартилпротеазы, описанной в настоящем описании. Еще в одном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с любым числом аминокислот, от 40 до 54, в которых могут находиться любые аминокислоты. В частном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими пептид, состоящий из 47 аминокислот. Еще в одном конкретном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 47 аминокислот, причем первая из этих 47 аминокислот является аминокислотой E. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3, описанной в примере 10, или полноразмерной полипептидной последовательности SEQ ID NO: 30, описанной в примере 10. Еще в одном связанном аспекте любой выделенный или очищенный аминокислотный полипептид представляет собой протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который содержит два или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот, кодирующих DTG, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой D, и второй набор аминокислот представляет собой DSG или DTG, причем последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой G, которая функционально связана с любым числом из 50-170 аминокислот, которые могут быть любыми аминокислотами. В частном варианте осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 100-170 аминокислот. Еще в одном варианте осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 142-163 аминокислот. В одном из конкретных вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 142 аминокислот. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична SEQ ID NO: 22, описанной в примере 9, или SEQID NO: 30, описанной в примере 10. В одном из конкретных вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 163 аминокислот. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична SEQ IDNO: 22, описанной в примере 9, или SEQ ID NO: 30, описанной в примере 10, или полноразмерной последовательности SEQ ID NO: 22, описанной в примере 9, или последовательности SEQ ID NO: 30, описанной в примере 10. В одном из вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 170 аминокислот. В частном варианте осуществления второй набор специальных аминокислот включает пептид, имеющий аминокислотную последовательность DSG. Необязательно, аминокислотный полипептид функционально связан с меткой очистки пептида, например с меткой очистки пептида, состоящей из шести остатков гистидина. В одном из вариантов осуществления первый набор специальных аминокислот относится к одному полипептиду и второй набор специальных аминокислот относится ко второму полипептиду, причем как первый, так и второй полипептиды имеют по крайней мере 50 аминокислот, которые могут быть любыми аминокислотами. В другом варианте осуществления первый набор специальных аминокислот относится к одному полипептиду и второй набор специальных аминокислот относится ко второму полипептиду, причем как первый, так и второй полипептиды имеют по крайней мере 50 аминокислот и оба указанных полипептида находятся в одном сосуде. Изобретение также относится к вектору, содержащему полипептид, описанный в настоящем описании. Изобретение, кроме того, относится к клетке или линии клеток, содержащей полинуклеотид,описанный в настоящем описании. Изобретение также относится к способу получения любых полинуклеотидов, векторов или клеток, описанных здесь, и к процессу получения полипептидов, описанных здесь. Любой выделенный или очищенный пептид или белок включает аминокислотный полипептид, кодирующий протеазу, способную расщеплять сайт расщепления APP бета-секретазой, который содержит два-4 009216 или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100-300 аминокислот,в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот DTG, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой D, и второй набор аминокислот представляет собой DSG илиDTG, последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой G и первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими положения любого числа из 0-81 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. Настоящее изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, включающим положения примерно 30-77 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. Изобретение также относится к аминокислотному полипептиду, описанному здесь, где первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 35, 47, 71 или 77 аминокислот. Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная аминокислота функционально связана с соответствующими пептидами SEQID NO: 3, состоящими из 35, 47, 71 или 77 аминокислот, при отсчете от аминокислот в первой специальной последовательности DTG в направлении N-конца SEQ ID NO: 3. Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании,включающему последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в SEQ ID NO: 4, то есть идентична части последовательностей в SEQ ID NO: 4, включая все последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении N-конца до 71, 47, 35 аминокислот включительно перед первыми специальными аминокислотами (примеры 10 и 11). Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании,включающему полный пептид из 71 аминокислоты, где первая аминокислота является T и вторая аминокислота является Q. Также изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному здесь, где полинуклеотид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в SEQ ID NO: 3, то есть идентична последовательностям в SEQ ID NO: 3,включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направленииN-конца до 71 аминокислоты включительно, см. пример 10, начиная от сайта DTG и включая нуклеотиды из этого кода для 71 аминокислоты. Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, который содержит полную последовательность, идентичную соответствующим аминокислотам вSEQ ID NO: 3, то есть идентичную последовательностям в SEQ ID NO: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении N-конца до 71 аминокислоты включительно (см. пример 10), начиная от сайта DTG и включая нуклеотиды из этого кода для 71 аминокислоты. Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число из 30-54 аминокислот, где каждый кодон может кодировать любую аминокислоту. Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании,в котором первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с 47 кодонами, где первая из этих 35 или 47 аминокислот является аминокислотой E или G. Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании,включающему последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в SEQ ID NO: 3, то есть идентична этой части последовательностей в SEQ ID NO: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении N-конца до 35 или 47 аминокислот включительно (см. пример 11 для 47 аминокислот, начиная от сайта DTG и включая нуклеотиды из этого кода для предыдущих 35 или 47 аминокислот до сайта DTG). Полинуклеотид нуклеиновых кислот по настоящему изобретению идентичен соответствующим аминокислотам в SEQ IDNO: 3, то есть идентичен последовательностям в SEQ ID NO: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении N-конца до 35 или 47 аминокислот включительно, см. пример 11 для 47 аминокислот, начиная от сайта DTG и включая нуклеотиды из этого кода для предыдущих 35 или 47 аминокислот до сайта DTG. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает полинуклеотид, кодирующий полипептидHu-Asp и имеющий нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, выбираемой из группы, состоящей из:(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид Hu-Asp, выбираемый из группы, состоящей из Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) и Hu-Asp2(b), где указанные полипептиды Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b) имеют соответственно полную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6; и(b) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности по п.(а). Изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой указанный полипептид Hu-Asp является Hu-Asp1 и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательностьSEQ ID NO: 1; и к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой указанный полипептид Hu-Asp являетсяHu-Asp2(а) и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательность SEQ IDNO: 3; и к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид Hu-Asp, который является HuAsp2(b) и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, который гибридизирует в строгих условиях с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, описанную выше. Изобретение также относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании. Необязательно, вектор по п.97 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с промотором для экспрессии полипептида Hu-Asp,такого как Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) или Hu-Asp2(b). Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину,содержащей вектор, описанный выше. Изобретение относится к способу получения полипептида Hu-Asp,предусматривающему культивирование клетки-хозяина, описанной выше, и выделение указанного полипептида Hu-Asp. Изобретение относится к выделенному полипептиду Hu-Asp1, содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, к выделенному полипептиду Hu-Asp2(a), содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности,включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, к выделенному полипептиду Hu-Asp2(a),содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Изобретение также относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с полипептидом Hu-Asp, описанным здесь. Далее приведено несколько способов анализа этого фермента. Изобретение относится к способу идентификации клетки, предназначенный для скрининга ингибиторов активности -секретазы, который включает:i) сбор клеток или супернатанта с идентифицируемых клеток;ii) измерение продуцирования требуемого пептида, который выбирают из группы, состоящей из Сконцевого пептида APP или растворимого APP;iii) отбор клеток, продуцирующих требуемый пептид. В одном из вариантов осуществления собирают клетки и требуемый пептид определяют как С-концевой пептид APP, полученный в результате расщепления -секретазой. В другом варианте осуществления, собирают супернатант и требуемый пептид представляет собой растворимый С-концевой APP, полученный в результате расщепления -секретазой. В одном из вариантов осуществления клетки содержат любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные выше, и было показано, что клетки могут расщеплеплять сайт -секретазы любого пептида со следующей структурой Р 2, P1, P1', Р 2' , где Р 2 обозначает K или N, P1 обозначает M или L, P1' обозначает D и Р 2' обозначает А. Еще в одном варианте осуществления Р 2 обозначает K и P1 обозначает M или Р 2 обозначает N и P1 обозначает L. Изобретение относится к любой бактериальной клетке, содержащей любые нуклеиновые кислоты или пептиды, описанные в настоящем описании, например к бактериальной клетке, такой как E. coli. Изобретение также отнсоится к любой эукариотической клетке, содержащей любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании. Настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании. Эти клетки насекомых включают в себя sf9 и High 5. Изобретение также относится к клеткам млекопитающих, содержащим любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные здесь. Примеры клеток млекопитающих могут быть выбраны из группы,состоящей из человека, грызуна, лагоморфа и примата. Характерная клетка человека может быть выбрана из группы, состоящей из HEK293 и IMR32. Характерной клеткой примата может быть клетка COS-7. Клетка грызуна может быть выбрана из клеток CHO-K1, Neuro-2A и 3 Т 3. Изобретение также относится к дрожжевой клетке или клетке птицы, содержащей любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании. Изобретение относится к изоформе APP, в которой две последние аминокислоты карбоксильного конца являются остатками лизина. Изоформой является любой полипептид APP, включая варианты APP(в том числе мутации) и фрагменты APP, существующие в организме человека, которые аналогичны описанным в патенте США 57 6684 6, столбец 7, строки 45-67, включенном в это описание изобретения в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления изоформа APP включает изоформу, известную как АРР 695, модифицированную так, что две ее последние аминокислоты имеют два остатка лизина аналогично двум ее последним аминокислотам карбоксильного конца. Например, изоформа APP включает SEQ ID NO: 16 или вариант изоформы APP включает SEQ ID NO: 18 или 20. Изобретение также относится к любой линии эукариотических клеток, содержащих нуклеиновые кислоты, кодируемые модифицированной изоформой APP, или полипептидам, содержащим модифицированные изоформы APP. Линией клеток может быть любая линия клеток млекопитающего (HEK293, Neuro2a). Изобретение также относится к способу идентификации ингибиторов фермента, расщепляющего сайт APP, расщепляемый бета-секретазой, в котором предусмотрено:a) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, в которых фермент вызывает процессинг APP и высвобождение амилоидного бета-пептида в среду, а также вызывает накопление фрагментовb) подвергание культивируемых клеток воздействию испытуемого соединения и специфическое определение способности испытуемого соединения ингибировать функцию этого фермента, измеряя количество амилоидного бета-пептида, высвобождаемого в среду, или количество фрагментов CTF99 APP в клеточных лизатах; с) идентификацию испытуемых соединений, уменьшающих количество растворимого амилоидного бета-пептида в культуральной среде и уменьшающих количество фрагментов CTF99 APP в клеточных лизатах, в качестве ингибиторов Asp2. В характерном варианте осуществления культивируемыми клетками являются клетки линии человека, грызуна или насекомого. Также в рамках настоящего изобретения предусмотрена линия клеток человека или грызуна, которая характеризуется активностью -секретазы, вызывающей процессинг APP с высвобождением амилоидного бета-пептида в культуральную среду и накоплением CTF99 в клеточных лизатах. Также среди рассматриваемых исследуемых соединений находятся антисмысловые олигомеры,направленные на фермент, обладающий активностью -секретазы, уменьшающие высвобождение растворимого амилоидного бета-пептида в культуральную среду и накопление CTF99 в клеточных лизатах. Способ идентификации агента, уменьшающего активность полипептида Hu-Asp, выбираемого из группы, включающей Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b), включает:a) определение активности указанного полипептида Hu-Asp в присутствии и в отсутствие испытуемого агента иb) сравнение активности указанного полипептида Hu-Asp, определенной в присутствии и в отсутствие указанного испытуемого агента; при этом более низкая активность в присутствии или в отсутствие указанного испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент уменьшает активность указанного полипептидаHu-Asp. Далее описаны нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, векторы, клетки, линии клеток и анализы. Настоящее изобретение представляет выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотид, кодирующие полипептид, выбираемый из группы, включающей аспарагилпротеазы человека, в частности аспарагилпротеазу человека 1 (Hu-Asp1) и два альтернативных сплайсированных варианта аспарагилпротеазы человека 2 (Hu-Asp2), именуемых здесь Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b). В используемом здесь значении все ссылки на "Hu-Asp" относятся ко всем Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b). Кроме того, в используемом здесь значении все ссылки на "Hu-Asp2" относятся как к Hu-Asp2(а), так и к HuAsp2(b). Hu-Asp1 наиболее широко экспрессирована в тканях поджелудочной и предстательной железы,в то время как Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b) наиболее широко экспрессированы в тканях поджелудочной железы и головного мозга. Изобретение также представляет выделенные полипептиды Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b), а также их фрагменты, обладающие активностью аспарагилпротеазы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты включают полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из остатков 1-1554 SEQ ID NO: 1, кодирующих Hu-Asp1, остатков 1-1503 SEQ ID NO: 3, кодирующихHu-Asp2(а), и остатков 1-1428 SEQ ID NO: 5, кодирующих Hu-Asp2(b). Другим объектом этого изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, гибридизирующий в строгих условиях с полинуклеотидом, кодирующим Hu-Asp1, Hu-Asp2(a), Hu-Asp2(b) или их фрагменты. В европейской патентной заявке EP 0848062 описан полипептид, именуемый "Asp1", который характеризуется значительной гомологией с Hu-Asp1, и в международной заявке WO 98/22597 описан полипептид, именуемый "Asp2", который характеризуется значительной гомологией с Hu-Asp2(a). Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению, к клеткам-хозяевам, в которые вводят такие векторы, и к методам рекомбинантных ДНК для получения полипептида Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) или Hu-Asp2(b), которые включают культивирование вышеописанной клетки-хозяина и выделение требуемого полипептида. Другим объектом этого изобретения являются выделенные полипептиды Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) иHu-Asp2(b), а также их фрагменты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b) имеют аминокислотную последовательность, приведенную соответственно в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Настоящее изобретение относится также к активным формам Hu-Asp2, способам получения таких активных форм, способам получения растворимых форм, способам измерения активности Hu-Asp2 и субстратам для расщепления Hu-Asp2. Изобретение относится также к антисмысловым олигомерам, нацеленным на транскрипты мРНК Hu-Asp1, HuAsp2(а) и Hu-Asp2(b), и к применению таких антисмысловых реагентов для уменьшения такой мРНК и последующего получения соответствующего полипептида. Это изобретение относится также к выделенным антителам, как поликлональным, так и моноклональным, которые специфически связываются с любыми полипептидами Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b) по изобретению. Изобретение относится также к способу идентификации агента, модулирующего активность любогоHu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b). B этом изобретении описаны способы испытания таких агентов при-7 009216 помощи бесклеточных анализов, к которым добавляют полипептид Hu-Asp2, а также способы испытания таких агентов в клетках человека или других млекопитающих, в которых присутствует Hu-Asp2. Краткое описание последовательностей Последовательность ID NO: 1 - Asp1 человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 2 - Asp1 человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 3 - Asp2(а) человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 4 - Asp2(а) человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 5 - Asp2(b) человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 6 - Asp2(b) человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 7 - Asp2(а) мыши, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 8 - Asp2(а) мыши, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 9 - АРР 695 человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 10 - АРР 695 человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 11 - APP695-Sw человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 12 - APP695-Sw человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 13 - APP695-VF человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 14 - APP695-VF человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 15 - АРР 695-KK человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 16 - АРР 695-KK человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 17 - APP695-Sw-KK человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 18 - APP695-Sw-KK человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 19 - APP695-VF-KK человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 20 - APP695-VF-KK человека, предполагаемая аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 21 - T7-пре-Asp2(a)TM человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 22 - T7-пре-Asp2(a)TM человека, аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 23 - T7-Caspase-пре-Asp2(a)TM человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 24 - T7-Caspase-пре-Asp2(a)TM человека, аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 25 - пре-Asp2(a)TM человека (нижний GC), нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 26 - пре-Asp2(a)TM человека (нижний GC), аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 27 - T7-Caspase-Caspase-8 расщепление-пре-Asp2(a)TM человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 28 - T7-Caspase-Caspase-8 расщепление-пре-Asp2(a)TM человека, аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 29 - Asp2(a)TM человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 30 - Asp2(a)TM человека, аминокислотная последовательность. Последовательность ID NO: 31 - Asp2(a)TM(His)6 человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ID NO: 32 - Asp2(a)TM(His)6 человека, аминокислотная последовательность. Последовательности ID NO: 33-46 описаны ниже в разделе "Подробное описание изобретения". Краткое описание чертежей Фиг. 1. На фиг. 1 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) Asp1 человека. Фиг. 2. На фиг. 2 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 5) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) Asp2(b) человека. Фиг. 3. На фиг. 3 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) Asp2(а) человека. Фиг. 4. На фиг. 4 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 7) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) Asp2(а) мыши. Фиг. 5. На фиг. 5 показан сравнительный анализ по программе BestFit предполагаемых аминокислотных последовательностей Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) человека и Asp2(а) (SEQ ID NO: 8) мыши. Фиг. 6. На фиг. 6 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 21) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 22) T7-пре-Asp2(a)TM человека. Фиг. 7. На фиг. 7 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 23) и предполагаемая-8 009216 аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 24) Т 7-каспаз-пре-Asp2(а)ТМ человека. Фиг. 8. На фиг. 8 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 25) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 26) пре-Asp2(a)TM человека (нижний GC). Фиг. 9. Вестерн-блот, показывающий уменьшение продуцирования CTF99 клетками HEK125.3,трансфецированными антисмысловыми олигомерами, нацеленными на Hu-Asp2 Mrna. Фиг. 10. Вестерн-блот, показывающий, что увеличение продуцирования CTF99 в клетках Neuro-2a мыши, котрансфецированных APP-KK с Hu-Asp2 и без Hu-Asp2, наблюдается только в клетках, котрансфецированных Hu-Asp2. Дальнейшее увеличение продуцирования CTF99 в клетках, котрансфецированныхAPP-Sw-KK с Hu-Asp2 и без Hu-Asp2, наблюдается только в клетках, котрансфецированных Hu-Asp2. Фиг. 11. На фиг. 11 показана предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 30)Asp2(a)TM человека. Фиг. 12. На фиг. 12 показана предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 30)Asp2(a)TM(His)6 человека. Подробное описание изобретения Далее дано определение нескольких терминов, используемых в этом описании изобретения, причем большинство используемых терминов имеют обычное значение, известное специалистам в этой области. Термин "-амилоидный пептид" означает любой пептид, получаемый в результате расщепленияAPP бета-секретазой. Этот термин относится к пептидам, состоящим из 39, 40, 41, 42 и 43 аминокислот,которые расположены от сайта расщепления -секретазой и включают 39, 40, 41, 42 и 43 аминокислоты. В определение -амилоидного пептида входят также последовательности 1-6, SEQ ID NO: 1-6, описанные в патенте США 575034 9, выданном 12 мая 1998 г. (включен в это описание изобретения в качестве ссылки). Рассматриваемый здесь фрагмент расщепления -секретазой именуется CTF-99 и расположен от сайта расщепления -секретазой до карбоксильного конца APP. Термин "изоформа APP" означает любой полипептид APP, включая варианты APP (в том числе мутации) и фрагменты APP, имеющиеся в организме человека, аналогичные описанным в патенте США 5766846,столбец 7, строки 45-67, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки (см. ниже). Термин "предшественник -амилоидного белка (APP)" в используемом здесь значении означает полипептид, кодируемый геном того же названия, локализованным в организме человека на длинном плече хромосомы 21, и включающий "AP", именуемый здесь "-амилоидный белок" (см. выше) в своей карбоксильной трети. APP является гликозилированным, одномембранным соединяющим белком, экспрессированным в целом ряде клеток во многих тканях млекопитающего. Примерами специфических изотипов APP, обнаруженных у человека, являются полипептид, состоящий из 695 аминокислот, описанныйKang et al. (1987) Nature 325: 733-736, который назван "нормальным" APP; полипептид, состоящий из 751 аминокислоты, описанный Ponte et al. (1988) Nature 331: 525-527 and Tanzi et al. (1988) Nature 331: 528530; и полипептид, состоящий из 770 аминокислот, описанный Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530-532. Примерами специфических вариантов APP являются точковая мутация, которая может быть различной в обоих положениях, и фенотип (для ознакомления с известной вариантной мутацией см. Hardy (1992) NatureGenet. 1: 233-234). Все приведенные материалы включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Термин "фрагменты APP" в используемом здесь значении означает любые фрагменты APP кроме тех, которые состоят только из AP или фрагментов AP. То есть фрагменты APP включают дополнительные аминокислотные последовательности APP помимо тех, которые образуют интактный 3AP или фрагмент AP. Термин "любая аминокислота" означает аминокислоты, выбираемые из нижеследующего списка,сопровождаемого трехбуквенными и однобуквенными аббревиатурами: алании, Ala, A; аргинин, Arg, R; аспарагин, Asn, N; аспарагиновая кислота, Asp, D; цистеин, Cys, C; глутамин, Gln, Q; глутаминовая кислота, Glu, E; глицин, Gly, G; гистидин, His, H; изолейцин, Ile, I; лейцин, Leu, L; лизин, Lys, K; метионин,Met, M; фенилаланин, Phe, F; пролин, Pro, P; серии, Ser, S; треонин, Thr, T; триптофан, Trp, W; тирозин,Tyr, Y; валин, Val, V; аспарагиновая кислота или аспарагин, Asx, B; глутаминовая кислота или глутамин,Glx, Z; любая аминокислота, Хаа, X. Настоящее изобретение относится к методу поиска в базе данных по структуре гена простого мотива активного сайта, характерного для аспарагилпротеаз. Эукариотические аспарагилпротеазы, такие как пепсин и ренин, имеют двухдоменную структуру цепи, при укладке которой два остатка аспарагила располагаются рядом друг с другом на активном сайте. Они образуют короткий трипептидный мотив DTG или более редко DSG. Большая часть аспарагилпротеаз существуют в виде профермента, для активации которого необходимо расщепить его N-конец. Мотив активного сайта DTG или DSG находится примерно около остатка 65-70 в проферменте (проренин, пепсиноген) и примерно около остатка 25-30 в активном ферменте после расщепления N-концевого продомена. Ограниченная длина мотива активного сайта затрудняет его поиск в коллекциях меток коротких экспрессированных последовательностей (EST) для получения новых аспарагилпротеаз. Последовательности EST обычно имеют, в среднем, 250 нуклеотидов или меньше и таким образом кодируют остатки 80-90 аминокислот или меньше. Такая последовательность должна быть очень короткой, чтобы можно было соединять элементы двух активных сайтов. Предпочтительным методом является поиск в базах данных гипотетических или собранных последова-9 009216 тельностей, кодирующих белок. Настоящее изобретение относится к компьютерному методу идентификации предполагаемых аспарагилпротеаз в базах данных белковых последовательностей. Этот метод использован для идентификации семи предполагаемых последовательностей аспарагилпротеазы в геномеCaenorhabditis elegans. Эти последовательности затем были использованы для идентификации путем выявления гомологии между Hu-Asp1 и двумя альтернативными сплайсированными вариантами Hu-Asp2,именуемыми здесь Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b). Основным объектом этого изобретения является получение новых данных о процессинге APP. Патогенный процессинг предшественника амилоидного белка (APP) по пути образования A требует последовательного действия двух протеаз, именуемых -секретазой и -секретазой. Расщепление APP секретазой и -секретазой вызывает образование соответственно N-конца и C-конца А-пептида. Поскольку избыточное продуцирование A-пептида, в частности A1-42, ведет к возникновению болезни Альцгеймера, то ингибиторы -секретазы и/или -секретазы могут оказаться полезными для лечения болезни Альцгеймера. Несмотря на важное значение -секретазы и -секретазы в патогенном процессингеAPP, до сих пор не была изучена молекулярная структура этих ферментов. То есть не было известно,какие ферменты необходимы для расщепления по сайту расщепления -секретазы или -секретазы. Сами эти сайты были известны, поскольку были известны APP и пептид A1-42 (см. патенты США 5766846 и 5837672, которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки за исключением определения"растворимые" пептиды). Но не было известно, какой фермент участвует в образовании пептида A1-42. Настоящее изобретение относится к определению молекулярной структуры нескольких новых аспарагилпротеаз человека, причем одна из них, именуемая Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b), подробно рассмотрена в этом описании изобретения. Предшествующие формы Asp1 и Asp2 описаны в EP 0848062 A1 и EP 0855444 А 2,авторы изобретения David Powel et al., право на патент принадлежит компании Smith Kline BeechamCorp. (включены в это описание изобретения в качестве ссылки). В этом описании изобретения рассмотрены старые и новые формы Hu-Asp2. Они впервые экспрессированы в активной форме, описаны их субстраты и выявлены их специфические особенности. Если раньше для расщепления сайта -секретазы были необходимые клетки или клеточные экстракты, то теперь при выполнении анализов, которые также рассмотрены в этом описании изобретения, можно использовать очищенный белок. На основании результатов (1) экспериментов по обработке антисмысловыми олигомерами, (2) экспериментов по временной трансфекции и (3) биохимических экспериментов с использованием очищенной рекомбинантной HuAsp2 авторы этого изобретения продемонстрировали, что Hu-Asp2 является -секретазой, участвующей в процессинге APP. Несмотря на то, что была обнаружена нуклеотидная и предполагаемая аминокислотная последовательность Hu-Asp2(а) (см. EP 0848062 А 2 и EP 0855444 А 2), не было выполнено функциональное исследование этого фермента. Авторы этого изобретения всесторонне описывают фермент Hu-Asp2 и объясняют, почему он существенен и необходим для образования пептида A1-42 и, по-видимому, представляет собой существенный фактор в возникновении болезни Альцгеймера. В другом варианте осуществления изобретения описан также новый сплайсированный вариант HuAsp2, именуемый Hu-Asp2(b), который ранее не был исследован. Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из аспарагилпротеазы 1 человека (Hu-Asp1) и двух альтернативных сплайсированных вариантов аспарагилпротеазы человека 2 (Hu-Asp2), именуемых здесь Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b). В используемом здесь значении все определения "Hu-Asp2" относятся как к Hu-Asp2(а), так и к Hu-Asp2(b). Hu-Asp1 наиболее широко экспрессирована в тканях поджелудочной и предстательной железы, в то время как Hu-Asp2(а) и HuAsp2(b) наиболее широко экспрессированы в тканях поджелудочной железы и головного мозга. Это изобретение относится также к выделенным полипептидам Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) и Hu-Asp2(b), а также к их фрагментам, которые обладают активностью аспарагилпротеазы. Предполагаемые аминокислотные последовательности Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b) обладают значительной гомологией с ранее идентифицированными аспарагилпротеазами млекопитающих, такими как пепсиноген А, пепсиноген В, катепсин D, катепсин E и ренин. P.В. Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 52(Suppl. 210 5-22 (1992. Эти ферменты характеризуются наличием двух мотивов последовательностейDTG/DSG. Описанные здесь полипептиды Hu-Asp1 и Hu-Asp2 обладают также исключительно высокой гомологией с консенсусными мотивами ProSite для аспарагилпротеаз, полученных из базы данных SwissProt. Нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1554 SEQ ID NO: 1, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей Hu-Asp1, нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1503 SEQ ID NO: 3, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей HuAsp2(а), и нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1428 SEQ ID NO: 5, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей Hu-Asp2(b). Выделение и секвенирование ДНК, кодирующей Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b), описано ниже в примерах 1 и 2. Как указано в примерах 1 и 2, для получения нуклеотидной последовательности Hu-Asp1, HuAsp2(а) и Hu-Asp2(b) использованы автоматические методы секвенирования. Нуклеотидные последовательности Hu-Asp по настоящему изобретению получены для обеих цепей ДНК и, предположительно,- 10009216 совпадают на 100%. Однако, как известно в этой области, нуклеотидная последовательность, полученная при помощи таких автоматических методов, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, полученные автоматическими методами, идентичны действительной нуклеотидной последовательности данной молекулы нуклеиновой кислоты обычно по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%-99,9%. Действительная последовательность может быть определена с большей степенью точности при помощи ручных методов секвенирования, которые хорошо известны в этой области. Ошибка в последовательности, ведущая к инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов, может вызвать сдвиг рамки считывания в процессе трансляции, так что предполагаемая аминокислотная последовательность будет отличаться от последовательности, созданной из действительной нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, начиная с точки мутации. ДНК HuAsp по настоящему изобретению включает кДНК, химически синтезированную ДНК, ДНК, выделенную с помощью ПЦР, геномную ДНК и их комбинации. Геномную ДНК Hu-Asp можно получить путем скрининга геномной библиотеки с использованием описанной здесь кДНК Hu-Asp2 при помощи методов, известных в этой области, или с использованием олигонуклеотидов, выбираемых из последовательности Hu-Asp2, которые служат в качестве затравка для полимеразной цепной реакции (PCR). В объем настоящего изобретения входит также РНК, транскрибированная из ДНК Hu-Asp. Вследствие вырожденности генетического кода две последовательности ДНК могут отличаться друг от друга и при этом кодировать одинаковые аминокислотные последовательности. Таким образом,настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим полинуклеотидную последовательность, кодирующую любые полипептиды Hu-Asp по этому изобретению, причем указанная полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид Hu-Asp, имеющий полную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или их фрагменты. Это изобретение относится также к очищенным полипептидам Hu-Asp, как рекомбинантным, так и нерекомбинантным. Важнейшей особенностью этого изобретения является то, что оно относится к способам получения полипептидов Hu-Asp2 в активной форме. Эти способы включают получение полипептидов Hu-Asp2 и их вариантов в бактериальных клетках, клетках насекомого и клетках млекопитающего,а также в формах, которые позволяют секретировать полипептид Hu-Asp2 из бактериальных клеток и клеток насекомого или млекопитающего в культуральную среду, а также к получению вариантов полипептида Hu-Asp2, содержащих аминокислотные метки, облегчающие последующую очистку. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Hu-Asp2 превращают в протеолитически активную форму или в трансформированных клетках, или после очистки и расщепления второй протеазой в бесклеточной системе, причем такие активные формы полипептида Hu-Asp2 начинаются Nконцевой последовательностью TQHGIR (SEQ ID NO: 56) или ETDEEP (SEQ ID NO: 57). В объем этого изобретения входят также варианты и производные, в том числе фрагменты белков Hu-Asp, имеющие нативные аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 2, 4 и 6, которые сохраняют биологическую активность Hu-Asp. Специалисты в этой области могут легко определить, обладает ли вариант, производное или фрагмент белка Hu-Asp активностью Hu-Asp, подвергая указанный вариант,производное или фрагмент стандартному анализу на аспарагилпротеазу. В объем этого изобретения входят фрагменты Hu-Asp, имеющие домен активного сайта аминокислотной последовательности DTG,фрагменты, имеющие домен активного сайта аминокислотной последовательности DSG, фрагменты, содержащие обе последовательности активного сайта DTG и DSG, фрагменты, в которых увеличено пространство, занимаемое последовательностями активного сайта DTG и DSG, и фрагменты, в которых указанное пространство укорочено. Кроме того, в объем этого изобретения входят фрагменты Hu-Asp, в которых удален трансмембранный домен, что позволяет получить Hu-Asp2 в растворимой форме. В другом варианте осуществления изобретения две половины Hu-Asp2, каждая из которых содержит одну последовательность активного сайта DTG или DSG, можно получить отдельно в виде рекомбинантных полипептидов и затем соединить их в растворе, в котором они восстанавливаются в виде активной протеазы. Варианты Hu-Asp можно получить, например, мутацией нативных нуклеотидных последовательностей, кодирующих Hu-Asp. Вариант Hu-Asp в используемом здесь значении представляет собой полипептид, по существу, гомологичный нативному полипептиду Hu-Asp, но имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от такой же последовательности в нативном Hu-Asp благодаря наличию одной или нескольких делеций, инсерций или замен в аминокислотной последовательности. Вариант аминокислотной или нуклеотидной последовательности предпочтительно идентичен нативной последовательности Hu-Asp по крайней мере на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95%. Таким образом, вариант нуклеотидной последовательности, который содержит, например, пять точковых мутаций на каждые сто нуклеотидов по сравнению с геном нативной Hu-Asp, будет на 95% идентичен нативному белку. Процентное значение идентичности последовательности, определяемой также термином "гомология", между нативной и вариантной последовательностью Hu-Asp можно определить, например, сравнивая две последовательности при помощи компьютерных программ,обычно используемых для этой цели, таких как программа Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix, Genetics Conputer Group, University Research Park, Madison, Wisconsin), в которой использован алгоритм Смита и Уотермена (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981.- 11009216 Нативную аминокислотную последовательность можно изменить любыми известными методами. Например, мутации в определенных местах можно произвести при помощи хорошо известных методов,такие как олигонуклеотиднаправленный мутагенез, который описан Walder et al. (Gene 42: 133 (1986;Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981 и в патентах США 4518584 и 4737462. Варианты Hu-Asp, входящие в объем этого изобретения, могут содержать консервативно замещенные последовательности, т.е. в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида HuAsp заменены другими остатками, не изменяющими вторичную и/или третичную структуру полипептидаHu-Asp. Такие замещения могут включать замену аминокислоты остатком, имеющим аналогичные физико-химические свойства, например замещение одного алифатического остатка (Ile, Val, Leu или Ala) другим или попарную замену основных остатков Lys и Arg, кислотных остатков Glu и Asp, амидных остатков Gln и Asn, гидроксильных остатков Ser и Tyr или ароматических остатков Phe и Tyr. Другая информация, касающаяся выполнения фенотипически молчащих замен аминокислот, приведена в работе Bowieet al., Science 247: 1306-1310 (1990). Другими вариантами Hu-Asp, способными сохранять биологическую активность Hu-Asp, являются такие варианты, в которых замещения аминокислот произведены на участках за пределами функциональных областей белка. Другим объектом этого изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, который гибридизирует в строгих условиях с частью вышеописанных молекул нуклеиновых кислот, например примерно с 15 нуклеотидами, предпочтительно примерно с 20 нуклеотидами, более предпочтительно примерно с 30 нуклеотидами и еще более предпочтительно примерно с 30100 нуклеотидами одной из вышеописанных молекул нуклеиновых кислот. Такие части молекул нуклеиновых кислот, имеющие указанную длину, состоят по крайней мере из 15 смежных нуклеотидов эталонной молекулы нуклеиновой кислоты. Строгие условия гибридизации означают инкубацию примерно при 42 С в течение 2,5 ч в 6-кратном объеме SSC/0,1% SDS и последующую промывку фильтров в однократном объеме SSC при 65C, 0,1% SDS. Рассмотренные в этом описании изобретения фрагменты молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей Hu-Asp, а также полинуклеотиды, способные гибридизировать с такими молекулами нуклеиновой кислоты, можно использовать в качестве зонда или затравок в полимеразной цепной реакции (PCR). Такие зонды можно использовать, например, для обнаружения наличия нуклеиновых кислот Hu-Asp при выполнении анализов in vitro, а также саузерн- и нозерн-блоттинга. При помощи таких зондов можно также идентифицировать типы клеток, экспрессирующих Hu-Asp. Такие методы хорошо известны, и специалист в этой области может легко выбрать зонд требуемой длины для конкретного применения. При осуществлении ПЦР для выделения и амплификации последовательности известными методами используют 5'- и 3'-концевые затравки, соответствующие концам описанной молекулы нуклеиновой кислоты Hu-Asp. Другими полезными фрагментами молекул нуклеиновой кислоты Hu-Asp являются антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды, содержащие одноцепочечную последовательность нуклеиновых кислот,способную связываться с целевой мРНК Hu-Asp (с использованием смысловой цепи) или ДНК Hu-Asp (с использованием антисмысловой цепи). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти антисмысловые олигонуклеотиды Hu-Asp уменьшают длину мРНК Hu-Asp и продуцируют полипептиды Hu-Asp. Другим объектом этого изобретения являются полипептиды Hu-Asp с сопутствующим гликозилированием нативной структуры или без него. Как Hu-Asp1, так и Hu-Asp2 имеют обязательные акцепторные сайты для Asn-связанных сахаров, причем Hu-Asp1 имеет два таких сайта и Hu-Asp2 имеет четыре сайта. Hu-Asp, экспрессированная в экспрессирующих системах дрожжей или млекопитающего (описанных ниже), может быть аналогична нативному полипептиду Hu-Asp или существенно отличаться от него молекулярной массой и параметрами гликозилирования. Экспрессия Hu-Asp в бактериальных экспрессирующих системах позволяет получить негликозилированную Hu-Asp. Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно получают в выделенной форме и предпочтительно очищают. Полипептиды Hu-Asp можно выделить и очистить от тканей, культивируемых клеток или культур рекомбинантных клеток хорошо известными методами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию, лектинную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотную метку вводят в полипептидHu-Asp при помощи генноинженерных методов, хорошо известных специалистам в этой области, которые включают добавление шести аминокислотных остатков гистидина для очистки путем связывания с никелем, иммобилизованным на приемлемой подложке, эпитопами для поликлональных или моноклональных антител, которые включают, но не ограничиваются ими, эпитоп Т 7, myc-эпитоп и эпитоп V5a, и слияния Hu-Asp2 с приемлемыми белковыми партнерами, которые включают, но не ограничиваются ими, глутатион-S-трансферазу или мальтозасвязывающий белок. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти дополнительные аминокислотные последовательности присоединяют к С-концуHu-Asp, но их можно присоединить и к N-концу или в промежуточных положениях полипептида Hu-Asp2. Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим полинуклеотидные молекулы по- 12009216 этому изобретению, а также к клетке-хозяину, трансформированной такими векторами. Любые полинуклеотидные молекулы по этому изобретению можно присоединить к вектору, который обычно содержит селектируемый маркер и точку начала репликации для пролиферации в хозяине. Так как это изобретение относится также к полипептидам Hu-Asp, экспрессированным из вышеописанных полинуклеотидных молекул, желательно использовать векторы, предназначенные для экспрессии Hu-Asp. Векторы содержат ДНК, кодирующую любые выше- или нижеописанные полипептиды Hu-Asp, функционально связанные с приемлемыми транскрипционными или трансляционными регуляторными последовательностями, получаемыми из гена млекопитающего или насекомого, микробного или вирусного гена. Примерами регуляторных последовательностей являются транскрипционные промоторы, операторы, энхансеры, мРНК,рибосомасвязывающие сайты и приемлемые последовательности, которые регулируют транскрипцию и трансляцию. Нуклеотидные последовательности функционально связаны тогда, когда регуляторная последовательность находится в функциональной зависимости от ДНК, кодирующей Hu-Asp. Таким образом, промотор, представляющий собой нуклеотидную последовательность, функционально связан с последовательностью ДНК Hu-Asp, если этот промотор в виде нуклеотидной последовательности управляет транскрипцией последовательности Hu-Asp. Выбор приемлемых векторов, используемых для клонирования полинуклеотидных молекул, кодирующих Hu-Asp, или для экспрессии полипептидов Hu-Asp, несомненно, зависит от клетки-хозяина, в которую переносят вектор, и в приемлемых случаях от клетки-хозяина, в которой должен быть экспрессирован полипептид Hu-Asp. Приемлемыми клетками-хозяевами для экспрессии полипептидов Hu-Asp являются прокариотические, дрожжевые и высшие эукариотические клетки, которые описаны ниже. Полипептиды Hu-Asp, предназначенные для экспрессии в таких клетках-хозяевах, могут быть также слитыми белками, имеющими области из гетерологичных белков. Такие области могут быть введены,например, для обеспечения секреции, улучшенной стабильности или более легкой очистки полипептида. Например, в экспрессирующие векторы можно ввести последовательность, кодирующую соответствующий сигнальный пептид. Последовательность ДНК для сигнального пептида (секреторная лидерная последовательность) может быть слита в рамке считывания с последовательностью Hu-Asp так, что Hu-Asp будет транслироваться как слитый белок, содержащий сигнальный пептид. Сигнальный пептид, который является функционально активным в предполагаемой клетке-хозяине, стимулирует внеклеточную секрецию полипептида Hu-Asp. Сигнальная последовательность предпочтительно отщепляется от полипептида Hu-Asp во время секреции Hu-Asp из клетки. Неограничивающими примерами сигнальных последовательностей, которые можно использовать при осуществлении этого изобретения, являются дрожжевой Iфактор и лидерная последовательность пчелиного мелатина в клетках насекомого sf9. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Hu-Asp является слитым белком, который имеет гетерологичную область, используемую для облегчения очистки этого полипептида. Многие приемлемые пептиды, используемые для этой цели, обеспечивают избирательное связывание слитого белка с партнером связывания. Например, полипептид Hu-Asp можно модифицировать для получения пептида, образующего слитый белок, который специфически связывается с партнером связывания или пептидной меткой. Неограничивающими примерами таких пептидных меток являются метка 6-His, тиоредоксиновая метка, гемаглутининовая метка, GST-метка и метка сигнальной последовательности OmpA. Как должно быть понятно специалистам в этой области, партнер связывания, который распознает и связывается с пептидом, может быть любой молекулой или соединением, включающим ионы металла (например, аффинные колонки с металлом), антитела или их фрагменты и любой белок или пептид, который связывает такой пептид, как метка FLAG. Приемлемыми клетками-хозяевами для экспрессии полипептидов Hu-Asp являются прокариотические,дрожжевые и высшие эукариотические клетки. Приемлемыми прокариотическими клетками-хозяевами,предназначенными для экспрессии Hu-Asp, являются бактерии родов Escherichia, Bacillus и Salmonella, а также члены родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. Для экспрессии, например, в E. coli полипептид Hu-Asp может содержать N-концевой остаток метионина для облегчения экспрессии рекомбинантного полипептида в прокариотическом хозяине. N-концевой Met затем необязательно отщепляют от экспрессированного полипептида Hu-Asp. Для облегчения экспрессии в Escherichia coli можно ввести другие N-концевые аминокислотные остатки, которые включают, но не ограничивают ими, лидерную последовательность Т 7, лидерную последовательность Т 7-каспазы 8, а также другие лидерные последовательности, содержащие метки для очистки, такие как метка 6-His (пример 9). Полипептиды Hu-Asp,экспрессированные в E. coli, можно укоротить, удаляя цитоплазматический конец, трансмембранный домен или область, прилегающую к мембране. Полипептиды Hu-Asp, экспрессированные в E. coli, можно получить в растворимой или нерастворимой форме, которая может быть представлена, а может и не быть представлена тельцами включения. Нерастворимый полипептид можно сделать растворимым при помощи гуанидина-HCl, мочевины или других белковых денатурантов с последующей укладкой цепи в растворимой форме до или после очистки разведением или диализом в приемлемом водном буфере. Если при помощи методов рекомбинантных ДНК получена неактивная проформа Hu-Asp, ее можно сделать активной,отщепляя просегмент второй приемлемой протеазой, такой как протеаза вируса иммунодефицита человека. Экспрессирующие векторы, предназначенные для использования в прокариотических хозяевах,- 13009216 обычно содержат один или более фенотипически селектируемых маркерных генов. Такие гены обычно кодируют, например, белок, который придает устойчивость к антибиотикам или соответствует ауксотрофным требованиям. Целый ряд таких векторов можно приобрести коммерческим путем. Примерами таких векторов являются векторы pSPORT, векторы pGEM (Promega), векторы pPROEX (LTI, Bethesda,MD), векторы Bluescript (Stratagene), векторы рЕТ (Novagen) и векторы pQE (Qiagen).Hu-Asp можно также экспрессировать в дрожжевых клетках-хозяевах из родов, включая Saccharomyces,Pichia и Kluveromyces. Предпочтительными дрожжевыми клетками-хозяевами являются S. cerevisiae и P.pastoris. Дрожжевые векторы часто содержат последовательность начала репликации из дрожжевой плазмиды 2T, автономно реплицирующую последовательность (ARS), промоторную область, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции и селектируемый маркерный ген. Можно также использовать векторы, которые реплицируются как в дрожжевых клетках, так и в E. coli (так называемые шаттл-векторы). Помимо вышеуказанных признаков дрожжевых векторов,шаттл-вектор содержит также последовательности для репликации и селекции в E. coli. Прямую секрецию полипептидов Hu-Asp, экспрессированных в дрожжевых клетках-хозяевах, можно производить путем введения нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерную последовательность дрожжевого I-фактора у 5'-конца нуклеотидной последовательности, кодирующей Hu-Asp. Системы культур клеток-хозяев насекомого можно также использовать для экспрессии полипептидов Hu-Asp. B предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды Hu-Asp экспрессируют с использованием экспрессирующей системы на основе клеток насекомого (см. пример 10). Кроме того, для экспрессии в клетках насекомого можно использовать бакуловирусную экспресирующую систему, описанную Luckow и Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Hu-Asp экспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего. Неограничивающими примерами приемлемых линий клеток млекопитающего являются линия COS-7 клеток почки макаки (Gluzman et al., Cell 23: 175 (1981, линия клеток 293 почки эмбриона человека и клетки яичника китайского хомячка (CHO). Для экспрессии белков Hu-Asp предпочтительно используют клетки яичника китайского хомячка (CHO) (пример 11). Выбор приемлемого экспрессирующего вектора для экспрессии полипептидов Hu-Asp по этому изобретению безусловно зависит от конкретной используемой клетки-хозяина млекопитающего, что должно быть известно специалисту в этой области. Примерами приемлемых экспрессирующих векторов являются pcDNA3 (Invitrogen) и pSVL (Pharmacia Biotech.). Предпочтительным вектором для экспрессии полипептидов Hu-Asp является pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Экспрессирующими векторами для использования в клетках-хозяевах млекопитающего могут быть транскрипционные и трансляционные регулирующие последовательности, полученные из вирусных геномов. Обычно используемыми промоторными и энхансерными последовательностями по настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, последовательности, полученные из цитомегаловируса человека (CMV), аденовируса 2, вируса полиомы и вируса обезьян 40 (SV40). Методы конструирования экспрессирующих векторов млекопитающих описаны, например, в статьях Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983); Cosman et al. (Mol.Immunol. 23: 935 (1986; Cosman et al. (Nature 312: 768 (1984); в EP-A-0367566 и в WO 91/18982. Полипептиды по настоящему изобретению можно также использовать для индуцирования поликлональных и моноклональных антител, которые являются полезными в диагностических анализах для детектирования экспрессии полипептида Hu-Asp. Такие антитела можно получить известными методами. См., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor LaboratoryHu-Asp из 5-20 аминокислот, можно также использовать для продуцирования поликлональных или моноклональных антител после связывания с приемлемыми белками-носителями, которые включают, но не ограничиваются ими, гемацианин блюдечка (KLH), куриный овальбумин или бычий сывороточный альбумин, при использовании разных сшивающих реагентов, включающих карбодиимиды, глутаральдегид или в том случае, если пептид содержит цитеин, N-метилмалеимид. Предпочтительный пептид для иммунизации,полученный после конъюгации с KLH, содержит С-конец Hu-Asp1 или Hu-Asp2, включающий, соответственно, QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK (SEQ ID NO: 50) или LRQQHDDFADDISLLK (SEQ ID NO: 51). Молекулы нуклеиновой кислоты Hu-Asp по настоящему изобретению также пригодны для идентификации хромосом, так как они могут гибридизировать с конкретным местом в хромосоме человека. HuAsp1 локализован в хромосоме 21, в то время как Hu-Asp локализован в хромосоме 11q23.3-24.1. Существует насущная необходимость в идентификации конкретных участков хромосомы, так как в настоящее время имеется мало реагентов, маркирующих хромосомы, на основе фактических данных о последовательностях (полиморфизм повторов), предназначенных для мечения участков хромосомы. После того,как последовательность картирована для точного участка хромосомы, физическое положение этой последовательности в хромосоме можно коррелировать с данными генетической карты. Взаимосвязь между генами и болезнями, установленную благодаря картированию одной и той же области хромосомы, затем можно идентифицировать при помощи анализа связывания, в результате которого определяют совместное наследование физически смежных генов. Является ли ген, имеющий отношение к данной болезни,- 14009216 действительной причиной ее возникновения, можно определить, сравнивая последовательность нуклеиновых кислот у субъектов, страдающих и не страдающих этим заболеванием. В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу анализа функции Hu-Asp, в частности функции Hu-Asp2, который заключается в том, что полипептид Hu-Asp инкубируют в растворе с приемлемым субстратом, который включает, но не ограничивается ими, синтетический пептид, содержащий сайт расщепления APP -секретазой, предпочтительно пептид, имеющий мутацию, обнаруженную у большой группы населения Швеции с наследственной болезнью Альцгеймера, при которой KM заменяется NL, причем такой пептид содержит последовательность SEVNLDAEFR(SEQ ID NO: 54), в растворе с кислотным буфером, предпочтительно в растворе с кислотным буфером,имеющем рН 5,5 (см. пример 12), после чего данный пептид расщепляют, что служит мерой протеолитической активности Hu-Asp, контролируемой при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. В предпочтительных анализах протеолитической активности используют внутренне погашенные субстраты для анализа пептида. Такими приемлемыми субстратами являются пептиды с присоединными к ним флуорофором и гасителем, которыми являются, но не ограничиваются ими, кумарин и динитрофенол, в результате расщепление пептида Hu-Asp вызывает увеличение флуоресценции вследствие физического разделения флуорофора и гасителя. При выполнении предпочтительных колориметрических анализов протеолитической активности Hu-Asp используют другие приемлемые субстраты, которые включают аминокислоты Р 2 и P1, включающие сайт узнавания для расщепления в положении о-нитрофенола,связанного амидной связью, в результате чего расщепление под действием Hu-Asp вызывает увеличение оптической плотности после доведения буфера до щелочного рН. В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу идентификации агента, увеличивающего активность полипептида Hu-Asp, выбираемого из группы, включающей Hu-Asp1, Hu-Asp2(а) и Hu-Asp2(b), который включает:(a) определение активности указанного полипептида Hu-Asp в присутствии и в отсутствие испытуемого агента и(b) сравнение активности указанного полипептида Hu-Asp, определяемой в присутствии указанного испытуемого агента, с активностью указанного полипептида Hu-Asp, определяемой в отсутствие указанного испытуемого агента; при этом более высокая активность полипептида Hu-Asp в присутствии испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент увеличивает активность указанного полипептида. Такие испытания можно выполнять с использованием полипептида Hu-Asp в бесклеточной системе и культивируемых клеток, экспрессирующих Hu-Asp, его варианты или изоформы. В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу идентификации агента, уменьшающего активность полипептида Hu-Asp, выбираемого из группы, включающей(a) определение активности указанного полипептида Hu-Asp в присутствии и в отсутствие испытуемого агента и(b) сравнение активности указанного полипептида Hu-Asp, определяемой в присутствии указанного испытуемого агента, с активностью указанного полипептида Hu-Asp, определяемой в отсутствие указанного испытуемого агента; при этом более низкая активность полипептида Hu-Asp в присутствии испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент снижает активность указанного полипептида. Такие испытания можно выполнять с использованием полипептида Hu-Asp в бесклеточной системе и культивируемых клеток, экспрессирующих Hu-Asp, его варианты или изоформы. В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к новой линии клеток (клетки HEK125.3), используемой для измерения амилоидного -пептида (A), процессированного из предшественника амилоидного белка (APP). Эти клетки являются стабильными трансформантами клеток почки эмбриона человека 293 (HEK293) с бицистронным вектором, полученным из pIRES-EGFP (Clontech) и содержащим модифицированную кДНК APP человека, внутренний сайт вхождения рибосомы внутрь клетки и кДНК усиленного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) во втором цистроне. кДНК APP модифицируют добавлением двух кодонов лизина к карбоксильному концу кодирующей последовательности APP. Это увеличивает процессинг А-пептида из APP человека в 2-4 раза. Этот уровень процессинга А-пептида в 60 раз выше, чем у нетрансформированных клеток HEK293. Клетки HEK125.3 можно использовать для анализа соединений, ингибирующих процессинг А-пептида. Это изобретение относится также к добавлению двух остатков лизина к С-концу других изоформ APP, включая изоформы,состоящие из 751 и 770 аминокислот, изоформы APP, имеющие мутации, обнаруженные в случае болезни Альцгеймера у человека, в том числе шведские мутации KMNL и V717F, к С-концевым фрагментам APP, начинающимся с сайта расщепления -секретазой, к С-концевым фрагментам APP, имеющим сайт расщепления -секретазой, которые функционально связаны с N-концевым сигнальным пептидом для вставки и секреции через мембрану, и к С-концевым фрагментам APP, которые функционально связаны с N-концевым сигнальным пептидом для вставки и секреции через мембрану и репортерной после- 15009216 довательностью, которая включает, но не ограничивается ими, зеленый флуоресцирующий белок или щелочную фосфатазу, так, что расщепление -секретазой вызывает освобождение репортерного белка с поверхности клеток, экспрессирующих полипептид. Существо этого изобретения, изложенное в этом описании изобретения, будет более понятно со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приведены только с целью иллюстрации и не ограничивают объем изобретения. Примеры Пример 1. Разработка алгоритма поиска, пригодного для идентификации аспарагилпротеаз и генов аспарагилпротеазы из C. Elegans в базе данных Wormpep 12. Материалы и методы Классические аспарагилпротеазы, такие как пепсин и ренин, имеют двухдоменную структуру цепи,при укладке которой два остатка аспарагила располагаются рядом с активным сайтом. Они образуют короткий трипептидный элемент DTG или более редко DSG. Мотив DTG или DSG активного сайта находится рядом с остатками 25-30 в ферменте и рядом с остатками 65-70 в проферменте (проренин, пепсиноген). Этот мотив снова появляется около остатков 150-200 в нижней области. Профермент активируется в результате расщепления N-концевого продомена. Эта схема характерна для двухдоменной структуры современных аспарагиловых ферментов, которые, очевидно, образуются вследствие дупликации и дивергенции генов. Таким образом,NH2XD25TGYDY+25TGC где X обозначает начало фермента после N-концевого продомена и Y обозначает центр молекулы, где снова начинается повтор гена. В случае ретровирусных ферментов, таких как ВИЧ-протеаза, они представляют только половину двухдоменных структур хорошо известных ферментов, подобных пепсину, катепсину D, ренину и т.д. Они не имеют просегмента, но из них выделен предшественник полипротеина, содержащий белки вирусаNH2D25TGС 100 Этот "мономер" содержит примерно 100 аминокислот, поэтому он является исключительно бедным по сравнению с другими "димерами" аспарагилпротеаз, которые имеют порядка 330 или около того аминокислот, не считая N-концевого продомена. Ограниченная длина мотива активного сайта эукариотической аспарагилпротеазы затрудняет поиск новых последовательностей в коллекциях EST. Последовательности EST обычно имеют, в среднем, 250 нуклеотидов, и в этом случае крайне затруднительно найти оба мотива активного сайта аспарагилпротеазы. Вместо этого авторы изобретения обратились к геному С. elegans. Установлено, что геном С. elegans имеет примерно 13000 генов. Из них секвенированы примерно 12000, и соответствующая гипотетическая открытая рамка считывания (ORF) помещена в базу данных Wormpep12. Авторы изобретения использовали эту базу данных в качестве основы для сканирования всего генома высшего эукариота с целью обнаружения новых аспарагилпротеаз при помощи алгоритма, специально разработанного для этой цели авторами. Для поиска использовали нижеследующую программу AWK, позволяющую локализовать белки, содержащие два мотива DTG или DSG, которую выполняли 4 раза для выделения всех парных комбинаций этого мотива аспарагила./определяет в качестве разделителя записей для формата FASTA//получает остальную часть записи после первого DTG/ Вышеуказанную программу AWK, загружаемую из ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep, использовали для поиска в базе данных Wormpep12 последовательностей, содержащих по крайней мере два мотива DTG или DSG. При помощи программы AWK каждую запись ограничивали 3000 или меньшим числом символов. Так, записи, состоящие из 35 или большего числа символов, вручную удаляли из базы данных Wormpep12, так как в любом случае маловероятно, что они могут кодировать аспарагилпротеазы. Результаты и выводы База данных Wormpep12 содержит 12178 данных, хотя некоторые из них (10%) представляют альтернативно сплайсированные транскрипты из одного из того же гена. Число генов, кодированных в геноме C. elegans, составляет порядка 13000 генов, поэтому база данных Wormpep12 содержит более 90% генома C. elegans. Эукариотические аспарагилпротеазы имеют двухдоменную структуру, которая, по-видимому, образуется в результате дупликации гена-предшественника. Каждый домен содержит мотив активного сайтаD(S/T)G, расположенный на расстоянии 20-25 аминокислотных остатков в каждом домене. Протеазы ретровирусов (например, ВИЧ-протеаза) или ретротранспозонов являются гомодимерами субъединиц,которые гомологичны одному домену эукариотической аспарагилпротеазы. Программу AWK использовали для поиска в базе данных Wormpep12 белков, в которых элемент D(S/T)G встречается по крайней мере дважды. Было идентифицировано 60 белков с двумя элементами DTG или DSG. Была произведена визуальная проверка для выбора белков, в которых положение доменов аспарагила свидетельствует о том, что двухдоменная структура соответствует вышеописанным критериям. Кроме того, для поиска в базе данных Wormpep12 предполагаемых аспарагилпротеаз были использованы параметры активного сайта эукариотической и вирусной аспарагилпротеазы PROSITE PS0014(1997. В базе данных Wormpep12 был обнаружен перекрывающийся набор последовательностей. Из них семь последовательностей содержали два мотива DTG или DSG и имели параметры активного сайта аспарагилпротеазы PROSITE. Из этих семи последовательностей три были обнаружены в одном космидном клоне (F21F8.3, F21F8.4 и F21F8.7), на основании чего можно предположить, что они представляют собой семейство белков, которые образуются в результате дупликации гена-предшественника. Две другие последовательности ORF, обладающие значительной гомологией с F21F8.3, F21F8.4 и F21F8.7, находятся в том же кластере генов (F21F8.2 и F21F8.6), однако, они содержат только один мотив DTG. Обширный поиск при помощи программы BLAST с использованием этих семи последовательностей в базе данных Wormpep12 не позволил обнаружить дополнительные предполагаемые аспарагилпротеазы в геноме C.elegans, содержащие два повтора элемента DTG или DSG. Поиск при помощи программы BLASTX с использованием каждой последовательности C. elegans в базе данных SWISS-PROT, GenPep и TREMBL позволил обнаружить, что R12H7.2 является ближайшим гомологом известных аспарагилпротеаз млекопитающего и Т 18 Н 9.2 обладает более отдаленным родством, в то время как CEAsp1, F21F8.3, F21F8.4 и F21F8.7 образуют субкластер, который обладает наименьшей гомологией последовательностей с последовательностями млекопитающего. ОбсуждениеAPP, презенилины и р 35, активатор cdk5 подвергаются внутриклеточному протеолитическому процессингу на сайтах, которые соответствуют специфичности субстрата ВИЧ-протеазы. Неправильная регуляция клеточной аспарагилпротеазы с такой же специфичностью субстрата создает объединяющий механизм, определяющий причинную связь между патологией бляшек и сплетений в случае болезни Альцгеймера. Поэтому авторы изобретения пытались идентифицировать новые аспарагилпротеазы человека. Сканирование всего генома в C. elegans позволило обнаружить семь открытых рамок считывания, относящихся к характеристике аспарагилпротеазы. Эти семь аспарагилпротеаз, вероятно, включают полный набор таких протеаз в простом многоклеточном эукариотическом организме. Они включают четыре близкородственные аспарагилпротеазы, уникальные для C. elegans, которые, по-видимому, образуются в результате дупликации гена-предшественника. Были обнаружены три другие предполагаемые аспарагилпротеазы (Т 18 Н 9.2,R12H7.2 и C11D2.2), обладающие гомологией с генными последовательностями млекопитающего. Пример 2. Идентификация новых аспарагилпротеаз человека в базе данных путем установления связи между геномами. Материалы и методы Компьютерный анализ баз данных EST, кДНК и предполагаемых полипептидных последовательностей. Обширный поиск гомологии в базах данных EST с использованием последовательностей CEAsp1,F21F8.3, F21F8.4 и F21F8.7 не позволил обнаружить новые гомологи млекопитающего. В результате поиска при помощи программы TBLASTN с использованием R12H7.2 обнаружена гомология с катепсиномD, катепсином E, пепсиногеном А, пепсиногеном С и ренином, в частности рядом с мотивом DTG на активном сайте, но при этом не были найдены какие-либо дополнительные новые аспарагилпротеазы млекопитающего. Это указывает на то, что геном C. elegans, по-видимому, содержит только одну лизосомную аспарагилпротеазу, представленную в организме млекопитающего семейством генов, образующихся в результате дупликации и последующей модификации гена-предшественника. Поиск при помощи программы TBLASTN с использованием Т 18 Н 9.2, оставшейся последовательности C. elegans, позволил идентифицировать несколько EST, которые образуют набор смежных последовательностей, кодирующих новую аспарагилпротеазу человека (Hu-Asp1). Как описано выше в примере 1, в результате поиска при помощи программы BLASTX с использованием набора смежных последовательностей Hu-Asp1 в базе данных SWISS-PROT установлено, что мотивы активного сайта в последовательности упорядочены в соответствии с активными сайтами других аспарагилпротеаз. Обширный повторный поиск при помощи программы BLASTN в базах данных LifeSeq, LifeSeqFL и в доступных коллекциях EST позволил выявить 102 EST из множества библиотек кДНК, образующих один набор смежных последовательностей. Из 51 последовательности в наборе, обнаруженном в публичных коллекциях EST, был также собран один набор (ТНС 213329) в Институте исследования геномов (TIGR). В аннотации, представленнойTIGR, указано, что сотрудники этого института не нашли каких-либо признаков такого набора в базе данных. Следует отметить, что набор смежных последовательностей, полученный TIGR, представляет собой набор с обратным расположением последовательностей по сравнению с набором LifeSeq, полу- 17009216 ченным авторами этого изобретения. Поиск Hu-Asp1 при помощи программы BLASTN в последовательностях EST крыс и мышей в базе данных ZooSeq позволил выявить одну гомологичную EST в каждой базе данных (соответственно клон Incyte 700311523 и клон IMAGE 313341, GenBank,доступа W10530). Поиск при помощи программы TBLASTN с использованием собранной последовательности ДНКHu-Asp1 в базе данных LifeSeqFL и в доступных базах данных EST позволил идентифицировать вторую родственную последовательность человека (Hu-Asp2), выраженную одной EST (2696295). В результате трансляции этой частичной последовательности кДНК был обнаружен один мотив DTG, обладающий гомологией с элементом активного сайта бычьей аспарагилпротеазы, NM1. Поиск при помощи BLAST наборов смежных последовательностей и сравнительный анализ первичных структур нескольких последовательностей выполняли при помощи программных средств по биоинформатике, предоставленных вместе с базами данных LifeSeq, LifeSeqFL и LifeSeq Assembled фирмой Incyte. Мотивы предполагаемых белков идентифицированы при помощи словаря ProSite (элементы в GCG 9) или базы данных Pfam. Клонирование полноразмерной кДНК Hu-Asp1. Для работы в базах данных LifeSeq и LifeSeq-FL фирмы Incyte использовали открытую рамку считывания гена Т 18 Н 9.2 СЕ C. elegans, при этом была обнаружена одна электронная упорядоченная структура, определяемая как 1863920 СЕ 1. Фирма Incyte предоставила клон 5'-концевых кДНК в наборе 1863920 с полным секвенированием обеих цепей. В результате трансляции открытой рамки считывания,имеющейся в клоне 1863920, обнаружен двойной мотив активного сайта аспарагилпротеазы (DTG/DSG),но 5'-конец был неполным. Остальная часть кодирующей последовательности Hu-Asp1 определена в результате анализа 5'-конца методом Marathon RACE с использованием готовой матричной кДНК плаценты человека Marathon (Clonetech). 3'-концевую антисмысловую олигонуклеотидную затравку, специфическую для 5'-конца клона 1863920, соединяли с 5'-концевой смысловой затравкой, специфической для синтетического адаптора готовой кДНК фирмы Marathon при выполнении PCR. Специфические продукты PCR сразу же секвенировали путем циклического секвенирования и полученную последовательность соединяли с последовательностью клона 1863920 для получения полной кодирующей последовательности Hu-Asp1 (SEQ ID NO: 1). Первичная аминокислотная последовательность Hu-Asp1 (фиг. 1, SEQ ID NO: 2) имеет несколько интересных особенностей. Эта последовательность содержит сигнальный пептид (остатки 1-20 в SEQ IDNO: 2), просегмент и каталитический домен, содержащий две копии элемента активного сайта аспарагилпротеазы (DTG/DSG). Расстояние между первым и вторым мотивами активного сайта составляет около 200 остатков, которые должны соответствовать предполагаемой длине одного домена эукариотической аспарагилпротеазы. Более интересной особенностью является то, что эта последовательность содержит предполагаемый трансмембранный домен (остатки 469-492 в SEQ ID NO: 2) рядом с С-концом,из чего следует, что эта протеаза связана с мембраной. Эта особенность не обнаружена у ни у каких других других аспарагилпротеаз. Клонирование полноразмерной кДНК Hu-Asp2. Как описано выше в примере 1, обширное сканирование генома в базе данных WormPep12 Caenorhabditiselegans с целью обнаружения предполагаемых аспарагилпротеаз и последующий поиск в базах данныхEST человека позволили выявить ортогональный аналог гена С. elegans T18H9.2, определяемый как HuAsp1. Собранный набор смежных последовательностей Hu-Asp1 использовали для поиска параллельных аналогов с использованием программы BLAST в базах данных EST человека, при этом в базе данныхLifeSeqFL было обнаружено одно существенное соответствие (2696295 СЕ 1), характеризующееся примерно 60% общей идентичностью. Аналогичный поиск в базе данных gb105PubEST или в нескольких базах данных человека, предоставленных фирмой TIGR, не позволил идентифицировать подобные клоныEST. Клон кДНК 2696295, идентифицированный в результате однократного анализа последовательностей из библиотеки кДНК матки человека, предоставлен фирмой Incyte с полностью секвенированными обеими цепями. Этот клон содержал неполную открытую рамку считывания, включающую 1266 п.о.,которая кодировала полипептид, состоящий из 422 аминокислот, но не имела инициатора ATG у 5'конца. В результате проверки предполагаемой последовательности выявлены два элемента активного сайта аспарагилпротеазы DTG/DSG, разделенные 194 аминокислотными остатками. Последующие поиски в более поздних выпусках баз данных EST LifeSeq позволили обнаружить дополнительные EST, секвенированные из библиотеки кДНК астроцитов человека (4386993), которые содержали дополнительную 5'-концевую последовательность по сравнению с клоном 2696295. Клон 4386993 предоставлен фирмойIncyte с полностью секвенированными обеими цепями. Сравнительный анализ клонов 4386993 и 2696295 подтвердил, что клон 4386993 имеет открытую рамку считывания из 31 аминокислотного остатка, включая два внутрирамочных кодона инициации трансляции. Несмотря на наличие двух внутрирамочных элементов ATG, вверху от ATG не было обнаружено ни одного внутрирамочного терминирующего кодона, что свидетельствует о том, что клон 4386993 не может быть полноразмерным. Кроме того, сравнительный анализ последовательностей клонов 2696295 и 4386993 позволил выявить вставку из 75 пар оснований в клоне 2696295 по сравнению с клоном 4386993, что указывает на наличие вставки из 25 дополнительных аминокислотных остатков в клоне 2696295. Остальная часть кодирующей последователь- 18009216 ности Hu-Asp2 определена анализом 5'-конца методом Marathon RACE с использованием готовой матричной кДНК из гиппокаппа человека Marathon (Clonetech). 3'-Концевую антисмысловую олигонуклеотидную затравку, специфическую для общей 5'-концевой области клонов 2696295 и 4386993, соединяли с 5'-концевой смысловой затравкой, специфической для синтетического адаптора готовой кДНК Marathon,при выполнении PCR. Специфические продукты PCR сразу же секвенировали путем циклического секвенирования и полученную последовательность соединяли с последовательностью клонов 2696295 и 4386993 для получения полной кодирующей последовательности, соответственно, Hu-Asp2(a) (SEQ IDNO: 3) и Hu-Asp2(b) (SEQ ID NO: 5). Первичные аминокислотные последовательности Hu-Asp2(a) (фиг. 3, SEQ ID NO: 4) и Hu-Asp2(b)(фиг. 2, SEQ ID NO: 6) имеют несколько интересных особенностей. Обе последовательности содержат сигнальный пептид (остатки 1-21 в SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6), просегмент и каталитический домен,содержащий две копии мотива активного сайта аспарагилпротеазы (DTG/DSG). Расстояние между первым и вторым мотивами активного сайта изменяется из-за делеции 25 аминокислотных остатков в HuAsp2(b) и составляет, соответственно, 168 и 194 аминокислотных остатка для Hu-Asp2(b) и Hu-Asp2(a). Более интересной особенностью является то, что обе последовательности имеют предполагаемый трансмембранный домен (остатки 455-477 в SEQ ID NO: 4 и 430-452 в SEQ ID NO: 6) около С-концов, что свидетельствует о том, что эта протеаза связана с мембраной. Эта особенность не обнаружена ни у каких других аспарагилпротеаз, за исключением Hu-Asp1. Пример 3. Молекулярное клонирование кДНК Asp2 мыши и геномной ДНК. Клонирование и исследование кДНК Asp2 мыши Ортологический аналог Hu-Asp2 мыши клонирован с использованием ряда методов, включающих скрининг бибилиотеки кДНК, PCR и геномное клонирование. Исследовано примерно 500000 независимых клонов из библиотеки кДНК головного мозга мышей с использованием 32 Р-меченого зонда кодирующей последовательности, полученного из Hu-Asp2. В положительных репликах анализировали последовательности ДНК, при этом установлено, что самая длинная кДНК имеет полную 3'-концевую нетранслированную область и 47 аминокислот в кодирующей области. Амплификации при помощи PCR той же библиотеки кДНК головного мозга мышей при помощи антисмысловой олигонуклеотидной затравки, специфической для вышеуказанной 5'-концевой последовательности кДНК, и смысловой затравки,специфической для 5'-концевой области последовательности Asp2 человека, с последующим анализом последовательности ДНК позволили получить еще 980 п.о. кодирующей последовательности. Остальная часть 5'-концевой последовательности Asp2 мыши получена из геномной последовательности (см. ниже). Выделение и анализ последовательности гена Asp2 мыши Последовательность EST мыши, кодирующую часть кДНК Asp2 мыши, идентифицировали в базе данных EST GenBank при помощи программы поиска BLAST и кодирующей последовательности Hu-Asp2 в качестве эталона. Клон g3160898 характеризовался 88% общей идентичностью с указанной последовательностью человека на протяжении 352 п.о. Затем синтезировали пары олигонуклеотидных затравок, специфических для этой области Asp2 мыши, и использовали для амплификации областей гена мыши. Геномную ДНК мыши, полученную из штамма 129/SvJ, амплифицировали, выполняя PCR (25 циклов) с использованием разных наборов затравок, специфических для Asp2 мыши, и продукты анализировали электрофорезом в агарозном геле. При помощи набора затравок Zoo-1 и Zoo-4 амплифицировали фрагмент длиной 750 п.о., который содержал последовательность интрона длиной около 600 п.о., выявленную в результате сравнения с известной последовательностью кДНК. Этот набор затравок затем использовали для скрининга библиотеки ВАС мыши путем выполнения PCR, при этом был выделен один геномный клон и при помощи анализа последовательности ДНК было подтверждено, что этот клон содержит ген Asp2 мыши. В результате секвенирования ДНК этого геномного клона Asp2 методом "дробовика" и сравнения с последовательностями кДНК Hu-Asp2 и частичными последовательностями кДНК мыши была определена полноразмерная последовательность Asp2 мыши (SEQ ID NO: 7). Предполагаемая аминокислотная последовательность Asp2 мыши (SEQ ID NO: 8) характеризуется 96,4% общей идентичностью (алгоритм GCG BestFit) с заменами 18/501 аминокислотного остатка по сравнению с последовательностью человека (фиг. 4). Пример 4. Распределение в тканях экспрессии транскриптов Hu-Asp2. Материалы и методы Распределение в тканях экспрессии Hu-Asp2 определяли при помощи нозерн-блотов множества тканей, предоставленных фирмой Clonetech (Palo Alto, CA). Клон 2696295 фирмы Incyte в векторе pINCY полностью расщепляли EcoRI/NotI и вставку кДНК длиной 1,8 т.п.о. очищали препаративным электрофорезом в агарозном геле. Этот фрагмент метили радиоактивными изотопами до достижения удельной активности 1 х 109 распадов/мин/мкг с использованием произвольной затравки в присутствии [-32PdATP](3000 Ci/ммоль, Amersham. Arlington Heights, IL) и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Найлоновые фильтры, содержащие денатурированную, фракционированную поли-А+ РНК, выделенную из разных тканей человека, гибридизировали с зондом, обеспечивающим 2 х 106 распадов/мин/мл в буфереExpressHyb (Clonetech, Palo Alto, CA) в течение 1 ч при 68C и промывали в соответствии с указаниями производителя. Сигналы гибридизации визуализировали при помощи авторадиографии с использовани- 19009216 ем пленки BioMax XR (Kodak, Rochester, VY) и усилением яркости изображения при -80C. Результаты обсуждения В результате анализа базы данных получена ограниченная информация о распределении в тканях экспрессии транскриптов Hu-Asp2 из-за относительно небольшого числа EST, обнаруженных при помощи вышеописанных способов (5). Чтобы получить дополнительную информацию об экспрессии генаHu-Asp2, выполняли нозерн-блоттинг для определения размеров и количества транскриптов Hu-Asp2. Поли-А+ РНК, выделенную из нескольких периферических тканей и областей головного мозга, помещали на твердую подложку после отделения в денатурирующих условиях и транскрипты Hu-Asp2 визуализировали путем гибридизации в очень строгих условиях с меченой радиоактивными изотопами вставкой из клона 2696295. При помощи зонда кДНК 2696295 был визуализирован набор мигрирующих транскриптов размером 3,0, 4,4 и 8,0 т.п.о., причем два последних транскрипта встречались наиболее часто. Из исследованных тканей транскрипты Hu-Asp2 в наибольшем количестве обнаружены в поджелудочной железе и головном мозге, при этом более низкие, но детектируемые количества присутствовали во всех других изученных тканях, за исключением тимуса и PBL. Наряду с определением относительного содержания транскриптов Hu-Asp2 в головном мозге были также исследованы степени экспрессии на разных участках мозга. Одинаковые уровни транскриптов были обнаружены на всех исследованных участках головного мозга (мозжечок, кора головного мозга, затылочная область, лобная доля, височная доля и путамен), при этом наибольшая концентрация характерна для костного и спинного мозга. Пример 5. Обнаружение транскриптов Hu-Asp1 и Hu-Asp2 в линиях клеток человека при помощи нозерн-блоттинга. Разные линии клеток человека испытывали в отношении их способности продуцировать мРНК HuAsp1 и Hu-Asp2. Клетки почки эмбриона человека (HEK293), клетки зеленой мартышки (Cos-7), клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HELA и линия клеток нейробластомы IMR32 были полученыATCC. Клетки культивировали в среде DME, содержащей 10% FCS, за исключением клеток CHO, которые культивировали в среде -МЕМ/10% FCS при 37 С в 5% СО 2 почти до полного слияния. Промытые монослои клеток (3 х 107) лизировали на планшетах и экстрагировали поли-А+ РНК, используя набор для прямого получения мРНК Qiagen Oligotex. Образцы, содержащие 2 мкг поли-А+ РНК из каждой линии клеток, фракционировали в денатурирующих условиях (обработка глиоксалем), переносили капиллярным путем на твердую подложку из найлоновой мембраны и транскрипты визуализировали гибридизацией с зондами кодирующей последовательности, меченными радиоактивными изотопами (32P), с использованием произвольной затравки, которые выделяли из Hu-Asp1 или Hu-Asp2. Радиоактивные сигналы детектировали на рентгеновской пленке и производили анализ изображения при помощи PhosphorImager. При помощи кДНК-зонда Hu-Asp1 обнаружен аналогичный набор транскриптов (2,6 и 3,5 т.п.о.),которые ранее были детектированы в тканях человека. Относительное содержание, установленное количественным подсчетом радиактивных сигналов, составило Cos-7HEK292=HELAIMR32. При помощи кДНК-зонда Hu-Asp2 обнаружен такой же набор транскриптов, что и в тканях (3,0, 4,4 и 8,0 т.п.о.), при наличии следующего относительного содержания: HEK293Cos-7IMR32HELA. Пример 6. Модификация APP с целью увеличения процессинга А-пептида для выполнения скрининга in vitro. Линии клеток человека, способные процессировать А-пептид из APP, использованы в качестве средства для скрининга ингибиторов - и -секретазы при выполнении клеточных анализов. Продуцирование и высвобождение А-пептида в культуральный супернатант контролируют твердофазным иммуноферментным анализом (EIA). Хотя APP широко экспрессирован в разных тканях и A-пептид процессируют и высвобождают как нейроны, так и другие линии клеток, уровни процессинга эндогенногоAPP являются низкими и могут быть с трудом обнаружены EIA. Процессинг A-пептида можно увеличить,экспрессируя в трансформированных линиях клеток мутации APP, которые усиливают процессинг A-пептида. Авторы этого изобретения установили, что добавление двух остатков лизина к карбоксильному концу АРР 695 еще больше увеличивает процессинг А-пептида. Это позволило создать трансформированную линию клеток, которая высвобождает А-пептид в культуральную среду в значительном количестве 20000 пг/мл. Материалы и методы Материалы. Линия клеток почки эмбриона человека 293 (клетки HEK293) получена в лаборатории. ВекторpIRES-EGFP предоставлен фирмой Clontech. Олигонуклеотиды для мутации при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) приобретены в фирме Genosys. Плазмида, содержащая АРР 695 человека (SEQ IDNO: 9 [нуклеотидная последовательность] и SEQ ID NO: 10 [аминокислотная последовательность]) предоставлена медицинским факультетом северо-западного университета. Эту плазмиду субклонировали вpSK (Stratagene) на сайте Not1 с получением плазмиды pAPP695. Выполнение мутагенеза. Шведскую мутацию (K670N, M671L) вводят в pAPP695 с использованием набора для быстрого мутагенеза Stratagene с целью получения плазмиды pAPP695NL (SEQ ID NO: 11 [нуклеотидная последовательность] иSEQ ID NO: 12 [аминокислотная последовательность]). Чтобы ввести мотив из двух остатков лизина в С-конец АРР 695, используют верхнюю затравку 276 5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTC (SEQ ID NO: 47), соединяющую затравку 274 5'-CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAACSEQ ID NO: 16 [аминокислотная последовательность]). В результате выполнения вышеуказанной операции вводят также сайт рестрикции BstX1, который совместим с сайтом BstX1 в сайте множественного клонирования pIRES-EGFP. Амплификацию PCR выполняют при помощи набора для PCR кДНК ClontechHF Advantage с использованием полимеразной смеси и буферов, предоставленных производителем. Для выполнения связывания при помощи PCR используют соединяющую затравку в количестве 1/20 молярной концентрации фланкирующих затравок. Продукты амплификации PCR очищают с использованием набора для очистки PCR QIAquick (Qiagen). Продукты, полученные в результате расщепления рестрикционными ферментами, разделяют на 0,8% агарозных гелях и вырезанные фрагменты ДНК очищают с использованием набора для экстракции в геле QIAquick (Qiagen). Для повторной сборки модифицированной кДНК APP695-Sw 5'-концевой фрагмент Not1-Bg12 кДНК APP695-Sw и 3'-концевой фрагмент кДНК АРР 695 Bg12-BstX1, полученные при помощи PCR,лигируют в ДНК плазмиды pIRES-EGFP, открытой на сайтах Not1 и BstX1. Лигирования производят в течение 5 мин при комнатной температуре, используя набор для быстрого лигирования ДНК (BoehringerMannheim) и производя трансформацию в компетентных клетках из библиотеки DH5a (GibcoBRL-LifeTechnologies). В бактериальных колониях производят скрининг инсерций, выполняя амплификацию при помощи PCR с использованием затравок 276 и 275. Плазмидную ДНК очищают для трансфекции клеток млекопитающего с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Полученная конструкция названа pMG125.3 (APPSW-KK, SEQ ID NO: 17 [нуклеотидная последовательность] и SEQ IDNO: 18 [аминокислотная последовательность]). Трансфекция клеток млекопитающего. Клетки HEK293, используемые для трансфекции, выращивают до 80% слияния в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS). Котрансфекцию выполняют с использованием LipofactAmine (Gibco-BRL) в 3 мкг ДНК pMG125.3 и 9 мкг ДНКpcDNA3.1 на 10 х 106 клеток. В течение 3 дней после трансфекции клетки пассируют в среде, содержащейG418 в концентрации 400 мкг/мл. Клетки выращивают в течение 3 дней в селективной среде и сортируют на основе их флуоресценции. Клональная селекция клеток 125.3 при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS). Образцы клеток анализируют в проточном цитометре EPICS Elite ESP (Coulter, Hialeah, FL), оснащенном линией возбуждения 488 нм, питание которой обеспечивает аргоновый лазер с воздушным охлаждением. Излучение EGFP измеряют через полосовой фильтр 525 нм и интенсивность флуоресценции определяют по 4-разрядной логарифмической шкале после селекции жизнеспособных клеток с учетом рассеяния света в прямом направлении и под прямым углом. Отдельные зеленые клетки отделяют во всех лунках одного 96-луночного планшета, содержащего питательную среду без G418. По истечении четырехдневного периода выделения к питательной среде добавляют G418 до конечной концентрации 400 мкг/мл. После селекции установлено, что в 32% лунок находятся увеличивающиеся в объеме клоны. Лунки с клонами переносят из 96-луночного планшета на 24-луночный планшет и затем на 6-луночный планшет,причем при каждом пассировании для дальнейшего роста выбирают наиболее быстро растущие колонии. Последняя выбранная линия клеток представляет собой наиболее быстро растущую линию клеток на протяжении последних шести пассирований. Этот клон, обозначенный 125.3, выдерживают в G418 в количестве 400 мкг/мл и через каждые 4 дня переносят в свежую среду. На протяжении 23 пассирований не отмечено уменьшения флуоресценции EGFP при продуцировании А-пептида. Твердофазный иммуноферментный анализ (EIA) А-пептида (двойной иммуносэндвич hA 1-40/42 для ELISA). Супернатанты культур клеток, собранные через 48 ч после трансфекции, анализируют, выполняя стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (EIA) А-пептида. Количество А-пептида человека 1-40 или 1-42 измеряют с использованием моноклонального антитела (mAb) 6E10 (Senetek, St.Louis, MO) и биотинилированной антисыворотки кролика 162 или 164 (New York State Institute for Basic Research,Staten Island, NY) в двойном иммуносэндвиче для ELISA. Иммобилизованное антитело 6 Е 10 является специфическим к эпитопу, имеющемуся в N-концевых аминокислотных остатках 1-16 А-пептида человека (hA). Конъюгированные детектирующие антитела 162 и 164 являются специфическими соответственно к hA 1-40 и 1-42. Этот способ можно кратко охарактеризовать следующим образом: 96-луночный планшет для проведения реакции иммунодиффузии Nunc Maxisorp покрывают 100 мкл/лунку mAb 6E10(5 мкг/мл), разведенного в 0,1M растворе карбонатбикарбонатного буфера, рН 9,6, и инкубируют в течение ночи при 4 С. Планшет трижды промывают 0,01M DPBS (модифицированная среда Дульбекко, содержащая физиологический раствор с фосфатным буфером (0,008M фосфата натрия, 0,002M фосфата калия, 0,14M хлорида натрия, 0,01M хлорида калия, рН 7,4) фирмы Pierce, Rockford, Il) и 0,05% Tween-20(DPBST) и блокируют в течение 60 мин 200 мкл 10% нормальной овечьей сыворотки (Sigma) в 0,01MDPBS во избежание неспецифического связывания. В культуральную среду после промывки планшета добавляют эталоны А-пептида человека 1-40 или 1-42 в количестве 100 мкл/лунку (Bachem, Torrance,CA), разведенные из 1 мг/мл маточного раствора в ДМСО, и образец в количестве 100 мкл/лунку, например кондиционированную среду трансфецированных клеток. Планшет инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение ночи при 4 С. На следующий день после промывки планшета добавляют 100 мкл/лунку биотинилированной антисыворотки кролика 162 1:400 или 164 1:50, разведенной вDPBST+0,5% BSA, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч 15 мин. После выполнения промывки вводят 100 мкл/лунку нейтравидинапероксидазы хрена (Pierce, Rockford, Il), разведенного в отношении 1:10000 в DPBST, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После выполнения последней промывки в качестве субстрата добавляют 100 мкл/лунку дигидрохлорида о-фенилендиамина (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) в буфере, содержащем 50 мМ лимонной кислоты/100 мМ фосфата натрия (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), pH 5,0, и контролируют изменение цвета при 450 нм в кинетическом спектрофотометре для считывания микропланшетов в течение 20 мин при помощи программыSoft max Pro. Все эталоны и образцы исследуют в трех копиях. Образцы, у которых значения оптической плотности соответствуют стандартной кривой, экстраполируют из стандартных кривых при помощи программы Soft max Pro и выражают в пг/мл культуральной среды. Результаты Добавление двух остатков лизина к карбоксильному концу АРР 695 значительно увеличивает процессинг А-пептида в клетках HEK293, о чем свидетельствуют результаты временной экспрессии (табл. 1). Добавление к АРР 695 мотива из двух остатков лизина увеличивает процессинг А-пептида по сравнению с процессингом АРР 695, содержащего шведскую мутацию. Объединение мотива из двух остатков лизина со шведской мутацией увеличивает процессинг еще в 2,8 раза. Котрансфекция клеток HEK293 векторами pMG125.3 и pcDNA3.1 делает возможной двойную селекцию трансформированных клеток, характеризующихся устойчивостью к G418 и высоким уровнем экспрессии EGFP. Благодаря клональной селекции при помощи FACS полученная линия клеток позволяет получить 20000 пг А-пептида на мл культуральной среды после выращивания в течение 36 ч на 24 луночных планшетах. Продуцирование А-пептида в разных условиях выращивания суммировано в табл. 2. Таблица 1 Высвобождение А-пептида в культуральную среду через 48 ч после временной трансфекции клетокHEK293 указанными векторами, содержащими дикий или модифицированный APP Приведенные в таблице значения представляют собой средние значения + стандартное отклонение и-значение для попарного сранения с использованием t-критерия Стьюдента с учетом неравных дисперсий. Таблица 2 Выделение А-пептида из клеток HEK125.3 в разных условиях выращивания Пример 7. Ингибирование антисмысловым олигомером процессинга Абета в клетках HEK125.3. Последовательности Hu-Asp1 и Hu-Asp2 предоставлены фирмой Sequitur, Inc. (Natick, MA) для отбора целевых последовательностей и конструирования химерных антисмысловых олигомеров 2-го поколения патентованным методом (находящийся на рассмотрении патент на имя Sequitur Ver. D3002). Антисмысловые олигомерыS644, S645, S646 и S647 обладают целенаправленным действием противAsp1. Антисмысловые олигомерыS648, S649, S650 и S651 обладают целенаправленным действием против Asp2. Контрольные антисмысловые олигомерыS652, S653, S655 и S674 обладают целенаправленным действием против постороннего гена, и антисмысловые олигомерыS656, S657, S658 иS659 обладают целенаправленным действием против второго постороннего гена. Для трансфекции антисмысловыми олигомерами клетки HEK125.3 выращивают примерно до 50% слияния на 6-луночных планшетах в минимальной поддерживающей среде (MEM), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Исходный раствор олигофектина G (Sequitur Inc., Natick, MA) с концентрацией 2 мг/мл разводят до 50 мкг/мл в бессывороточной MEM. Исходный раствор антисмыслового- 22009216 олигомера с концентрацией 100 мкМ отдельно разводят до 800 нМ в оптимальной MEM (GIBCO-BRL,Grand Island, NY). Разведенные исходные растворы олигофектина G и антисмыслового олигомера смешивают в отношении 1:1 и инкубируют при комнатной температуре. Инкубацию продолжают в течение 15 мин, после чего 10-кратный объем реагента разводят в MEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и после первого удаления старой среды в каждую лунку 6-луночного планшета добавляют 2 мл полученной смеси. После трансфекции клетки выращивают при постоянном присутствии олигофектинаG/антисмыслового олигомера. Для контроля за высвобождением Ab пептида из лунки с культурой периодически удаляют 400 мкл кондиционированной среды и заменяют свежей средой, начиная выполнять эту операцию через 24 ч после трансфекции. Приведенные данные получены из культуральных супернатантов, собранных через 48 ч после трансфекции. Результаты Клетки HEK125.3 по отдельности трансфецируют 16 разными антисмысловыми олигомерами, предоставленными фирмой Sequitur Inc., чтобы определить их влияние на процессинг А-пептида. Только антисмысловые олигомеры, направленные на Asp1 и Asp2, уменьшают процессинг А-пептида в клеткахHEK125.3, причем более эффективное ингибирующее действие направлено против Asp2. Процессинг А-пептида (1-40) и А-пептида (1-42) ингибируется в одинаковой степени. В табл. 3 приведены процентные значения ингибирования, высчитанные по сравнению с нетрансфецированными клетками. Реагенты на основе антисмысловых олигомеров, обеспечивающие более чем 50% ингибирование, отмечены звездочкой. Из всех испытанных реагентов 3 из 4 антисмысловых олигомеров, направленных на Asp1,обеспечивают, в среднем, 52% ингибирование процессинга А-пептида 1-40 и 47% ингибирование процессинга А-пептида 1-42. В случае Asp2 4 из 4 антисмысловых олигомеров характеризуются более чем 50% ингибированием, при этом среднее ингибирование процессинга А-пептида 1-40 составляет 62% и А-пептида 1-42 составляет 60%. Таблица 3 Ингибирование высвобождения А-пептида из клеток HEK125.3, обработанных антисмысловыми олигомерами Пример 8. Демонстрация активности -секретазы Hu-Asp2 в культивируемых клетках. Установлено, что несколько мутаций в APP, происходящих в начале возникновения болезни Альцгеймера, изменяют процессинг А-пептида. Они фланкируют N- и С-концевые сайты расщепления, в результате чего происходит выделение А-пептида из APP. Эти сайты расщепления определяются соответственно как сайты расщепления -секретазой и -секретазой. Расщепление APP на сайте -секретазы вызывает образование С-концевого фрагмента APP, содержащего 99 аминокислот с молекулярной массой 11145 Да. Шведская мутация KMNL, находящаяся вверху рядом с сайтом расщепления секретазой, вызывает общее увеличение продуцирования аминокислотных форм 1-40 и 1-42 А-пептида. Лондонская мутация VF (V717F в изоформе АРР 770) не оказывает значительного влияния на общее продуцирование А-пептида, но, по-видимому, увеличивает процентное содержание более длинной аминокислотной формы 1-42 А-пептида, влияя на выбор сайта расщепления -секретазой во время процессинга APP. Таким образом, авторы этого изобретения поставили целью определить, изменяют ли эти му- 23009216 тации количество и тип А-пептида, продуцируемого культивируемыми клетками, котрансфецированными конструкцией, направляющей экспрессию Hu-Asp2. Были выполнены два эксперимента, которые демонстрируют активность -секретазы Hu-Asp2 в культивируемых клетках. В первом эксперименте клетки HEK125.3 обрабатывали антисмысловыми олигомерами, направленными против транскриптов Hu-Asp2, как описано в примере 7, в результате чего было установлено, что такая обработка уменьшает величину С-концевого фрагмента APP, образованного вследствие расщепления -секретазой (CTF99) (фиг. 9). Это показывает, что Hu-Asp2 прямо или косвенно облегчает процесс расщепления -секретазой. Во втором эксперименте было установлено, что повышенная экспрессия Hu-Asp2 в трансфецированных клетках Neuro2A мыши увеличивает накопление фрагмента, полученного вследствие расщепления -секретазой CTF99 (фиг. 10). Это увеличение особенно хорошо видно, когда для трансфекции использован мутантный клон APP-KK, содержащий мотив из двух остатков лизина у С-конца. Дальнейшее увеличение наблюдается в том случае, когда Hu-Asp2 котрансфецируют вместе с APP-Sw-KK, содержащим шведскую мутацию KMNL. Известно, что шведская мутация увеличивает расщепление APP -секретазой. Вторая серия экспериментов показывает, что Hu-Asp2 облегчает активность -секретазы в экспериментах по котрансфекции клеток почки эмбриона человека HEK293. Котрансфекция Hu-Asp2 вместе с клоном APP-KK значительно увеличивает продуцирование и высвобождение растворимых А-пептидов 1-40 и 1-42 из клеток HEK293. При этом наблюдается значительно большее в пропорциональном отношении высвобождение А-пептида 1-42. Дальнейшее увеличение продуцирования А-пептида 1-42 наблюдается тогда, когда Hu-Asp2 котрансфецируют вместе с клоном APP-VF (SEQ ID NO: 13 [нуклеотидная последовательность] и SEQ ID NO: 14 [аминокислотная последовательность]) или клоном APP-VFKK (SEQ ID NO: 19 [нуклеотидная последовательность] и SEQ ID NO: 20[аминокислотная последовательность], содержащими лондонскую мутацию V717F. Известно, что мутация V717F изменяет специфичность расщепления APP -секретазой так, что увеличивается расщепление на сайте А 42. Таким образом, Asp2 прямо или косвенно облегчает процессинг APP -секретазой на сайте расщепления 42. Материалы Антитела 6 Е 10 и 4G8 предоставлены фирмой Senetek (St. Louis, MO). Антитело 369 получено из лаборатории Пауля Грингарда в Рокфеллеровском университете. Антитело С 8 получено из лаборатории Денниса Селкое в Гарвардском медицинском институте и больницы Brighan and Women's Hospital. Используемые конструкции APP. В экспериментах по трансфекции использованы нижеследующие конструкции APP.APP-Sw АРР 695, содержащий шведскую мутацию KMNL (SEQ ID NO: 11 и NO: 12)APP-VF АРР 695, содержащий лондонскую мутацию VF (SEQ ID NO: 13 и NO: 14)APP695-VF, содержащий С-концевой мотив KK (SEQ ID NO: 19 и NO: 20) Эти конструкции вставляли в вектор pIRES-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA) между сайтами Not1 иBstX1, используя соответствующие линкерные последовательности, вводимые при помощи PCR. Трансфекции клеток HEK293, клеток HEK125.3 и клеток Neuro-2A конструкциями антисмысловых олигомеров или плазмидной ДНК. Клетки почки эмбриона человека HEK293 и клетки Neuro-2a мыши трансфецируют экспрессирующими конструкциями с использованием реагента липофектамина Plus фирмы Gibco/BRL. Клетки высевают на 24-луночные планшеты для культуры ткани с плотностью до 70-80% слияния. Четыре лунки на планшете трансфецируют 2 мкг ДНК (3:1, APP:котрансфектант), 8 мкл реагента Plus и 4 мкл липофектамина в оптимальной минимальной поддерживающей среде (OptiMEM). OptiMEM добавляют до общего объема 1 мл, распределяют по 200 мкл/лунку и инкубируют в течение 3 ч. Особое внимание уделяют сохранению постоянных соотношений двух плазмид, используемых для котрансфекции, а также общего количества ДНК, используемой для трансфекции. Среды для трансфекции заменяют DMEM, 10% FBS, пируватом натрия с антибиотиком/противогрибковым средством и клетки инкубируют в нормальных условиях (37C, 5% СО 2) в течение 48 ч. Кондиционированную среду переносят в полипропиленовые пробирки и хранят при -80C до анализа на содержание А-пептида 1-40 и А-пептида 1-42 при помощи EIA, как это описано в предшествующих примерах. Трансфекцию клеток HEK125.3 антисмысловыми олигомерами производят аналогично описанию в примере 7. Получение клеточных экстрактов, выполнение вестерн-блоттинга. Клетки собирают после их трансфекции плазмидной дНК в течение примерно 60 ч. Сначала клетки переносят с планшета в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют со скоростью 1500 об./мин, чтобы удалить среду. Клеточный осадок 1 раз промывают PBS. Затем клетки лизируют с использованием буфера для лизиса (10 мМ HEPES, рН 7,9, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 1 мМ EGTA, 1 мМ EDTA, 0,1 мМ ванадата натрия и 1% NP-40). Смеси лизированных клеток центрифугируют со скоростью 5000 об./мин и- 24009216 супернатанты хранят при -20C в виде клеточных экстрактов. Равные количества экстрактов из клетокHEK125.3, трансфецированных антисмысловыми олигомерами Asp2, и контрольные образцы осаждают антителом 369, который распознает С-конец APP, и детектируют CTF99 в иммунопреципитате при помощи антитела 6 Е 10. Этот эксперимент повторяют с использованием С 8, второго осаждающего антитела, которое также распознает С-конец APP. Для выполнения вестерн-блоттинга экстрактов из клетокNeuro-2a мыши, котрансфецированных Hu-Asp2 и APP-KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK или APP-VF, равные количества клеточных экстрактов подвергают электрофорезу в градиенте гелей с 4-10% или 10-20% трицина (NOVEX, San Diego, CA). Полимеразный APP и продукт расщепления -секретазой CTF99 определяют при помощи антитела 6 Е 10. Результаты Трансфекция клеток HEK125.3 антисмысловыми олигомерами Asp2-1 или Asp2-2 уменьшает продуцирование продукта расщепления -секретазой CTF по сравнению с клетками, которые аналогичным образом трансфецированы контрольными олигомерами, имеющими обратную последовательность (обратная последовательность Asp2-1 и Asp2-2). B экспериментах по котрансфекции введение Hu-Asp2 в клетки Neuro-2a мыши вместе с конструкцией APP-KK увеличивает образование CTF99. Продуцирование этого продукта еще больше увеличивается в случае экспрессии Hu-Asp2 вместе с APP-Sw-KK, мутантной формой APP, содержащей шведскую мутацию KMNL, которая усиливает процессинг -секретазой. Котрансфекция Hu-Asp2 с APP не оказывает существенного влияния на продуцирование А 40, но увеличивает продуцирование А 42 по сравнению с фоновым значением (табл. 4). Добавление мотива из двух остатков лизина к С-концу APP увеличивает процессинг А-пептида почти в 2 раза, хотя продуцирование А 40 и А 42 остается достаточно низким (соответственно, 352 и 21 пг/мл). Котрансфекция Asp2 с APP-KK еще больше увеличивает продуцирование А 40 и А 42. Продуцирование А 40 под действием Hu-Asp2 увеличивается более чем в 3 раза, в то время как продуцирование А 42 возрастает более чем в 10 раз. Таким образом, котрансфекция Hu-Asp2 с конструкциями APP-KK предпочтительно увеличивает продуцирование А 42. Установлено, что мутация APP V717F увеличивает процессинг -секретазой на сайте расщепления А 42. Котрансфекция Hu-Asp2 с конструкциями APP-VF или APP-VF-KK увеличивает продуцирование А 42 (двухкратное увеличение при использовании APP-VF и четырехкратное увеличение при использовании APP-VF-KK, табл. 4), но оказывает смешанное действие на продуцирование А 40 (незначительное уменьшение при использовании APP-VF и двукратное увеличение при использовании APP-VFKK по сравнению с контрольным образцом, котрансфецированным пкДНК). Таким образом, влияниеAsp2 на продуцирование А 42 в пропорциональном отношении больше, что ведет к увеличению соотношения А 42/общего A. Действительно, соотношение А 42/общего A достигает очень высокого значения, равного 42%, в клетках HEK293, котрансфецированных Hu-Asp2 и APP-VF-KK. Вестерн-блот, показывающий уменьшение продуцирования CTF99 клетками HEK125.3, трансфецированными антисмысловыми олигомерами, направленными на мРНК Hu-Asp2. (справа) Вестерн-блот,показывающий увеличение продуцирования CTF99 в клетках Neuro-2a мыши, котрансфецированных HuAsp2 и APP-KK. Дальнейшее увеличение продуцирования CTF99 имеет место в клетках, котрансфецированных Hu-Asp2 и APP-Sw-KK. Таблица 4 Результаты котрансфекции плазмидной ДНК Hu-Asp2 или пкДНК разными конструкциями APP,содержащими мутацию V717F, модифицирующую процессинг -секретазой Котрансфекция Asp2 значительно увеличивает соотношение А 42/общего A. Приведенные в таблице значения представляют собой количество пептида A (пг/мг). Пример 9. Экспрессия Asp2L человека в бактериальных клетках. Экспрессия рекомбинантного HuAsp2L в E. coli.Hu-Asp2L можно экспрессировать в E. coli после добавления N-концевых последовательностей, таких как метка Т 7 (SEQ ID NO: 21 и NO: 22) или метка Т 7, с последующим введением лидерной последовательности каспазы 8 (SEQ ID NO: 23 и NO: 24). Альтернативно уменьшение числа GC 5'-концевой последовательности при помощи сайтнаправленного мутагенеза можно использовать для увеличения выходаHu-Asp2 (SEQ ID NO: 25 и NO: 26). Кроме того, Asp2 можно сконструировать, используя сайт протеолити- 25009216 ческого расщепления (SEQ ID NO: 27 и NO: 28). Чтобы получить растворимый белок после экспрессии и повторной укладки цепи, желательно удалить трансмембранный домен и цитоплазматический конец или удалить мембранную проксимальную область, трансмембранный домен и цитоплазматический конец. Методы Для слияния кодирующей последовательности Asp2 с модификациями N-концевой последовательности, включающими метку Т 7 (SEQ ID NO: 21 и 22) или лидерную последовательность Т 7-caspase 8(SEQ ID NO: 23 и 24), выполняют PCR с использованием затравок, содержащих соответствующие линкерные последовательности. Эти конструкции клонируют в экспрессирующем векторе pet23a(+)[Novegen], в котором промотор Т 7 направляет экспрессию метки Т 7, предшествующей последовательности сайтов множественного клонирования. Чтобы клонировать последовательности Hu-Asp2 позади лидерной последовательности Т 7 в векторе pet23a+, используют нижеследующие олигонуклеотиды для амплификации выбранной последовательности Hu-Asp2:553=GTGGATCCACCCAGCACGGCATCCGGCTG (SEQ ID NO: 35)554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEQ ID NO:36) которые располагают сайты BamHI и HindIII, фланкирующие, соответственно, 5'- и 3'-концы вставки. Последовательность Asp2 амплифицируют из полноразмерной кДНК Asp2(b), клонированной вpcDNA3.1, с использованием набора для PCR кДНК Advantage-GC [Clontech] в соответствии с инструкциями производителя, производя отжиг и удлинение при 68 С в результате выполнения двухстадийнойPCR на протяжении 25 циклов. Вставку и вектор разрезают BamHI и HindIII, очищают электрофорезом в агарозном геле и лигируют с использованием набора для быстрого лигирования ДНК [Boerhinger Mannheim]. Реакцию лигирования выполняют для трансформации штамма JM109 E. coli (Promega), колонии собирают для очистки плазмиды (Qiagen, Qiaprep minispin) и анализа последовательности ДНК. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-b-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) экспрессирующий вектор переносят в штамм BL21 E. coli (Statagene). Бактериальные культуры выращивают в жидкой средеLB в присутствии ампициллина в концентрации 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности OD600 0,6-1,0, добавляя 1 мМ IPTG, в течение 4 ч при 37 С. Клеточный осадок собирают центрифугированием. Чтобы клонировать последовательности Hu-Asp2 позади метки Т 7 и лидерной последовательности каспазы (SEQ ID NO: 23 и 24), созданную выше конструкцию, содержащую последовательность Т 7-Hu-Asp2(SEQ ID NO: 21 и 22), открывают на сайте BamH, после чего фосфорилированные лидерные олигонуклеотиды caspase 8559=GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCGTGAACAGGACG (SEQ ID NO: 37), 560=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID NO: 38) отжигают и лигируют в векторную ДНК. Свисающий 5'-конец для каждого набора олигонуклеотидов сконструирован таким образом, что он делает возможным лигирование с сайтом BamHI и препятствует последующему расщеплению BamHI. Продукт реакции лигирования трансформируют в JM109, как это описано выше,для анализа экспрессии белка после переноса в штамм BL21 E. coli. Чтобы уменьшить число GC у 5'-конца Asp2, конструируют пару антипараллельных олигонуклеотидов для замены оснований вырожденного кодона в положениях 15 аминокислот от G/C на А/Т (SEQ IDNO: 25 и 26). Новая нуклеотидная последовательность у 5'-конца Asp2 не изменяет кодируемую аминокислоту, поэтому ее выбирают с возможностью оптимизации экспрессии в E. coli. Последовательность смыслового линкера представляет собой 5'-CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCGTCTGCCCCGGGAGACCGACGAAG3' (SEQ ID NO: 39). Последовательность антисмыслового линкера представляет собой 5'-CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCACCACCCAGACCGCTACGCAGGGGCAGCCGGATGCCG3' (SEQ ID NO: 40). Фосфорилированные линкеры отжигают в 0,1M NaCl - 10 мМ Tris, рН 7,4, и лигируют в уникальные сайты Cla I и Sma I вHu-Asp2 в вектор рТАС. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-b-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) бактериальные культуры выращивают в бульоне LB в присутствии ампициллина при 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности OD600 0,6-1,0,добавляя 1 мМ IPTG, в течение 4 ч при 37 С. Клеточный осадок собирают центрифугированием. Чтобы создать вектор, в котором лидерные последовательности можно удалить ограниченным протеолизом с использованием каспазы 8 так, что в результате этого выделяется полипептид Hu-Asp2, начинающийся N-концевой последовательностью GSFV (SEQ ID NO: 27 и 28), выполняют следующую процедуру. Два фосфорилированных олигонуклеотида, содержащих сайт расщепления каспазы 8 IETD, 571=5'GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG (SEQ ID NO: 41) и 572=GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID NO: 42),отжигают и лигируют в вектор рЕТ 23 а+, открытый BamHI. После трансформации в JM109 очищенную векторную ДНК выделяют и ориентацию вставки подтверждают анализом последовательности ДНК. Для амплификации выбранной последовательности Hu-Asp2 используют нижеследующие олигонуклеотиды:573=5'-AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG (SEQ ID NO: 43) и 554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEQ ID NO: 44), которые располагают сайты BamHI и HindIII, фланкирующие, соответственно, 5'- и 3'-концы вставки. Последовательность Asp2 амплифицируют из полноразмерной кДНК Asp2, клонированной в pcDNA3.1, с использованием набора для PCR кДНКAdvantage-GC [Clontech] в соответствии с инструкциями производителя, производя гибридизацию и удлинение при 68C в результате выполнения двухстадийной PCR на протяжении 25 циклов. Вставку и вектор разрезают BamHI и HindIII, очищают электрофорезом в агарозном геле и лигируют с использованием набора для быстрого лигирования ДНК [Boerhinger Mannheim]. Реакцию лигирования выполняют для трансформации штамма JM109 E. coli (Promega), колонии собирают для очистки плазмиды (Qiagen,Qiaprep minispin) и анализа последовательности ДНК. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-b-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) экспрессирующий вектор переносят в штамм BL21 E. coli(Statagene). Бактериальные культуры выращивают в бульоне LB в присутствии ампициллина при 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности OD600 0,6-1,0, добавляя 1 мМIPTG, в течение 4 ч при 37 С. Клеточный осадок собирают центрифугированием. Для облегчения очистки метку 6-His можно ввести в любую из вышеуказанных конструкций после лидерной последовательности Т 7 путем открытия конструкции на сайте BamHI и последующего лигирования с фосфорилированными олигонуклеотидами, подвергшимися отжигу, содержащими последовательность из шести остатков гистидина 565=GATCGCATCATCACCATCACCATG (SEQ ID NO: 45), 566=GATCCATGGTGATGGTGATGATGC (SEQ ID NO: 46). Свисающий 5'-конец для каждого набора олигонуклеотидов сконструирован так, что он делает возможным лигирование в сайт BamHI и препятствует последующему расщеплению BamHI. Получение бактериального осадка 36,34 г бактериального осадка, предназначенного для получения 10,8 л питательной среды, диспергируют в общем объеме, равном 200 мл, и гомогенизируют при помощи 20 мм зонда тканевого гомогенизатора со скоростью 3000-5000 об./мин в 2M KCl, 0,1M Tris, 0,05M EDTA, 1 мМ DTT. Проводимость доводят примерно до 193 MMhos, добавляя воду. К диспергированному осадку добавляют дополнительное количество раствора KCl, доводя общий объем до 500 мл. Эту суспензию гомогенизируют при помощи того же зонда в течение примерно 3 мин со скоростью 5000 об./мин. Затем смесь пропускают через гомогенизатор высокого давления Ранни под давлением 700 атм (10000 фунтов/кв.дюйм). Во всех случаях осадок подвергают дальнейшей обработке, а растворимую фракцию удаляют. Полученный раствор центрифугируют в течение 1 ч в роторе GSA со скоростью 12500 об./мин. Осадок повторно суспендируют в аналогичном растворе (без DTT), используя тот же самый зонд тканевого гомогенизатора со скоростью 2000 об./мин. После гомогенизации в течение 5 мин со скоростью 3000 об./мин объем доводят до 500 мл, добавляя тот же раствор, и центрифугируют в течение 1 ч со скоростью 12500 об./мин. Осадок вновь суспендируют как и раньше, но теперь конечный объем доводят до 1,5 л, добавляя тот же раствор, после чего его гомогенизируют в течение 5 мин. После центрифугирования с той же скоростью в течение 30 мин эту процедуру повторяют еще раз. Осадок повторно суспендируют примерно в 150 мл холодной воды, собирают осадок из шести центрифужных пробирок, используемых в роторе GSA. Осадок гомогенизируют в течение 5 мин со скоростью 3000 об./мин, объем доводят до 250 мл, добавляя холодную воду, и центрифугируют в течение 30 мин. Масса полученного осадка равна 17,75 г. Краткий обзор Для первоначального получения осадка производят лизис бактериального осадка в растворе KCl с последующим центрифугированием в роторе GSA. Для повторного суспендирования/гомогенизации трижды используют одинаковый раствор. Конечную промывку водой/гомогенизацию выполняют с целью удаления избытка KCl и EDTA. Солюбилизация rHuAsp2L Для солюбилизации rHuAsp2L из вышеописанного осадка используют соотношение, равное 9-10 мл/г осадка. Оттаивают 17,75 г осадка и добавляют 150 мл 8M раствора гидрохлорида гуанидина, 5 мМ Me,0,1% DEA. Полученную смесь титруют до рН 8,6, используя 3M раствор Tris. Сначала осадок повторно суспендируют в растворе гуанидина, производя гомогенизацию 20 мм зондом тканевого гомогенизатора со скоростью 1000 об./мин. Затем смесь перемешивают при 4 С в течение 1 ч и центрифугируют со скоростью 12500 об./мин в течение 1 ч в роторе GSA. Полученный супернатант центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 40000 х градиент в роторе SS-34. Конечный супернатант хранят при -20C, за исключением 50 мл. Аффинная хроматография на иммобилизованном никеле солюбилизованного rHuAsp2L Используют нижеследующие растворы: А) 6M гидрохлорида гуанидина, 0,1M NAP, рН 8,0, 0,01M Tris, 5 мМ ME, 0,5 мМ имидазола; А') 6M мочевины, 20 мМ NAP, рН 6,80, 50 мМ NaCl; В') 6M мочевины, 20 мМ NAP, рН 6,20, 50 мМ NaCl, 12 мМ имидазола; С) 6M мочевины, 20 мМ NAP, рН 6,80, 50 мМ NaCl, 300 мМ имидазола. Примечание. Буферы А' и С' смешивают в соответствующих отношениях, чтобы получить промежуточные концентрации имидазола. 50 мл солюбилизованного вещества смешивают с 50 мл буфера А и добавляют к 100-125 мл QiagenNi-NTA SuperFlow (предварительно уравновешенного буфером А) в колонке 5 х 10 см Bio-Rad econo. Колонку осторожно встряхивают в течение ночи при 4 С в холодном помещении.- 27009216 Стадии выполнения хроматографии 1) Полученное вещество проточно дренируют. 2) Промывают 50 мл буфера А (собирая проточную фракцию). 3) Промывают 250 мл буфера А (промывка 1). 4) Промывают 250 мл буфера А (промывка 2). 5) Промывают 250 мл буфера А'. 6) Промывают 250 мл буфера В'. 7) Промывают 250 мл буфера А'. 8) Элюируют 250 мл 75 мМ имидазола. 9) Элюируют 250 мл 150 мМ имидазола (150-1). 10) Элюируют 250 мл 150 мМ имидазола (150-2). 11) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-1). 12) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-2). 13) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-3). Результаты хроматографииrHuAsp элюируют имидазолом в количестве от 75 до 300 мМ. 75 мМ фракция, а также первая фракция, элюированная 150 мМ имидазола (150-1), содержат загрязняющие белки, которые визуализируют на геле, окрашенном кумассии голубым. Поэтому для экспериментов по повторной укладке цепи используют фракции 150-2 и 300-1, так как они содержат наибольшее количество белка (см. гель, окрашенный кумассии голубым). Эксперименты по повторной укладке цепи rHuAsp2L Эксперимент 1. К 40 мл фракции 150-2 добавляют 1M DTT, 3 М Tris, рН 7,4, и DEA до конечной концентрации, соответственно, равной 6 мМ, 50 мМ и 0,1%. Эту смесь быстро разводят (при перемешивании) 200 мл (4C) холодного раствора 20 мМ NAP, рН 6,8, 150 мМ NaCl. В результате этого разведения получают конечную концентрацию мочевины, равную 1M. Этот раствор остается светлым, даже если его оставляют открытым на воздухе при комнатной температуре или при температуре 4 С. Этот раствор выдерживают открытым на воздухе в течение 4-5 ч при 4 С и диализуют в течение ночи против 20 мМ NAP, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 20% глицерина. Этот способ позволяет эффективно удалить мочевину из раствора без осаждения белка. Эксперимент 2. Некоторое количество элюата 150-2 дважды концентрируют в устройстве Amicon Centriprep, 10000MWCO, и обрабатывают так же, как в эксперименте 1. Это вещество также остается в растворе без какого-либо видимого осаждения. Эксперимент 3. На 89 мл элюата 150-2 поливают 1M DTT, 3M Tris, рН 7,4, и DEA до конечной концентрации, соответственно, равной 6 мМ, 50 мМ и 0,1%. Эту смесь быстро разводят (при перемешивании) 445 мл (4C) холодным раствором 20 мМ NAP, рН 6,8, 150 мМ NaCl. Раствор остается светлым без каких-либо видимых признаков осаждения. Этот раствор доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют MEA до конечной концентрации, равной 0,1 мМ. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Цистамин и CuSO4 добавляют до конечных концентраций, равных, соответственно, 1 мМ и 10 мкМ. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, переносят в холодное помещение с температурой 4 С и медленно встряхивают в течение ночи, оставляя открытым на воздухе. На следующий день раствор (по-прежнему светлый, без каких-либо видимых признаков осаждения) центрифугируют со скоростью 100000 х градиент в течение 1 ч. Собирают супернатанты из нескольких серий экспериментов и основную массу стабилизованного белка диализуют против 20 мМ NAP, рН 7,4,150 мМ NaCl, 20% глицерина. После диализа вещество хранят при -20C. Некоторое количество (примерно 10 мл) раствора белка (в 1M растворе мочевины) отбирают для биохимических анализов и хранят в замороженном виде при -20C. Пример 10. Экспрессия Hu-Asp2 и его производных в клетках насекомого. Экспрессия путем инфецирования бакуловируса. Кодирующую последовательность Hu-Asp2 и несколько производных конструируют для экспрессии в клетках насекомого при помощи PCR. Для получения полноразмерной последовательности 5'концевую смысловую олигонуклеотидную затравку, которая модифицирует сайт инициации трансляции в соответствии с согласованной последовательностью Козака, спаривают с 3'-концевой антисмысловой затравкой, которая имеет природный терминирующий трансляцию кодон в последовательности Hu-Asp2. Матрицу pcDNA3.1(hygto)/Hu-Asp2 амплифицируют при помощи PCR (см. пример 12). Выполняя PCR,конструируют также два производных Hu-Asp2, которые удаляют С-концевой трансмембранный домен(SEQ ID NO: 29 и NO: 30) или трансмембранный домен и вводят метку из шести остатков гистидина в Сконец (SEQ ID NO: 31 и NO: 32). При помощи PCR вышеуказанную 5'-концевую смысловую олигонук- 28009216 леотидную затравку спаривают с 3'-концевой антисмысловой затравкой, которая вводит (1) терминирующий трансляцию кодон после кодона 453 (SEQ ID NO: 3) или (2) метку из шести остатков гистидина с последующим терминирующим трансляцию кодоном, используя в качестве матрицыpcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2L. Bo всех случаях при помощи полимеразных цепных реакций производят амплификацию на протяжении 15 циклов, используя ДНК-полимеразу PwoI (Boehringer-Mannheim) в соответствии с инструкциями поставщика. Продукты реакции полностью расщепляют BamHI и NotI и лигируют с бакуловирусным вектором переноса pVL1393, расщепленным BamHI и NotI (Invitrogen). Часть лигирований используют для превращения компетентных клеток DH5 E. coli, после чего производят отбор клеток при помощи антибиотика на LB-Amp. Плазмидную ДНК получают путем стандартного щелочного лизиса и связывания в CsCl, что дает бакуловирусные векторы переноса pVL1393/Asp2,pVL1393/Asp2TM и pVL1393/Asp2TM(His)6. Для создания рекомбинантных бакуловирусов и инфецирования клеток насекомого sf9 используют стандартные методы. Экспрессия трансфекцией Временную и стабильную экспрессию Hu-Asp2TM и Hu-Asp2TM(His)6 в клетках насекомогоHigh 5 производят, используя экспрессирующий вектор pIZ/V5-His для клеток насекомого. ДНК-вставки из экспрессирующих плазмидных векторов pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2TM и pVL1393/Asp2TM(His)6 вырезают путем двойного расщепления BamHI и NotI и субклонируют в pIZ/V5-His, расщепленномBamHI и NotI, при помощи стандартных методов. Полученные экспрессирующие плазмиды, именуемыеpIZ/Hu-Asp2TM и pIZ/Hu-Asp2TM(His)6, получают так, как описано выше. Для выполнения трансфекции клетки насекомого High 5 культивируют в бессывороточной средеHigh Five, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, при 27 С в герметично закрытых колбах. Трансфекцию выполняют, используя клетки High Five, бессывороточную среду High Five, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и липосомы InsectinPlus (Invitrogen, Carlsbad, CA) при помощи стандартных методов. Для выполнения крупномасштабной временной трансфекции 1,2 х 107 клеток High Five помещают в 150 мм чашку для культуры ткани и оставляют для прикрепления при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Во время прикрепления получают смесь ДНК/липосом, смешивая 6 мл бессывороточной среды, 60 мкг ДНК Asp2TM/pIZ (+/-His) и 120 мкл Insectin Plus, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Среду для чашек Петри удаляют из чашки с клетками, заменяют ее смесью ДНК/липосом и оставляют на 4 ч при комнатной температуре и постоянном покачивании со скоростью 2 об./мин. В чашку добавляют еще 6 мл среды и инкубируют в течение 4 дней при 27 С во влажном термостате. Через 4 дня после трансфекции среду собирают, очищают центрифугированием со скоростью 500 х градиент и анализируют экспрессию Asp2 при помощи вестерн-блоттинга. Для достижения стабильной экспрессии клетки обрабатывают 50 мкг/мл зеоцина и выжившую популяцию используют для получения клональных клеток, производя ограниченное разведение и анализ степени экспрессии, как было описано выше. Очистка Hu-Asp2TM и Hu-Asp2TM(His)6 Удаление трансмембранного сегмента из Hu-Asp2 вызывает секрецию полипептида в культуральную среду. После продуцирования белка путем инфецирования или трансфекции бакуловируса кондиционированную среду собирают, очищают центрифугированием и диализуют против Tris-HCl (pH 8,0). Затем это вещество очищают последовательным выполнением анионообменной хроматографии (TrisHCl, pH 8,0) и катионообменной хроматографии (ацетатный буфер при рН 4,5) с использованием градиентов NaCl. Параметры элюции контролируют (1) вестерн-блоттингом и (2) анализом активности с использованием пептидного субстрата, описанного в примере 12. Для Hu-Asp2TM(His)6 кондиционированную среду диализуют против Tris буфера (рН 8,0) и очищают последовательным выполнением хроматографии на смоле IMAC и анионообменной хроматографии. Анализ последовательности очищенного белка Hu-Asp2TN(His)6 показывает, что произошло отщепление сигнального пептида [TQHGIRLPLR]. Пример 11. Экспрессия Hu-Asp2 в клетках яичника китайского хомячка (CHO). Гетерологичная экспрессия Hu-Asp2L в клетках CHO-K1 Полную кодирующую последовательность Hu-Asp2 клонируют в экспрессирующем вектореpcDNA3.1(+)Hygro для клеток млекопитающего (Invitrogen, Carlsbad, CA), который содержит промежуточный ранний промотор CMV и сигнал полиаденилирования bGH для стимуляции экспрессии. Экспрессирующую плазмиду pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 получают путем щелочного лизиса, связывания в CsCl и полного секвенирования обеих цепей для проверки целостности кодирующей последовательности. Клетки яичника китайского хомячка дикого типа (CHO-K1) получены из ATCC. Эти клетки помещают в монослойные культуры, находящиеся в среде -МЕМ, содержащей 10% FCS, при 37 С в 5% CO2. Клетки CHO-K1 (60% слияние) в двух 100 мм чашках трансфецируют только pcDNA3.1(+)Hygro (контрольная плазмида) или pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2, используя катионную липосому DOTAP в соответствии с рекомендациями поставщика. Клетки обрабатывают смесями плазмидной ДНК/липосом в течение 15 ч, после чего используемую среду заменяют питательной средой, содержащей 500 ед./мл гигромицина В. В случае клеток CHO-K1, трансфецированных pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2, клонируют отдельные клетки, устойчивые к гигромицину В, производя ограниченное разведение. После клональной- 29009216 экспансии отдельных линий клеток экспрессию белка Hu-Asp2 оценивают при помощи вестернблоттинга, используя поликлональную антисыворотку кролика против рекомбинантного Hu-Asp2, полученного экспрессией в E. coli. Почти полностью слитые линии клеток во всех чашках собирают, производя соскоб в PBS, и отделяют клетки центрифугированием. Клеточный осадок повторно суспендируют в холодном буфере для лизиса (25 мМ Tris-HCl (8,0)/5 мМ EDTA), содержащем ингибиторы протеазы, и лизируют клетки ультразвуком. Растворимые и мембранные фракции отделяют центрифугированием(105000 х градиент, 60 мин) и нормализованные количества белка из каждой фракции отделяют при помощи SDS-PAGE. Отделенные полипептиды гибридизируют методом электропереноса с мембранамиPVDF, после чего детектируют белок Hu-Asp2L, используя антисыворотку против Hu-Asp2 кролика(1/1000 разведение), и визуализируют комплексы антиген-антитело, используя щелочную фосфатазу,конъюгированную с антителами козы против кролика (1/2500). Специфический иммунореактивный белок с кажущейся молекулярной массой (Mr) 65 кДа обнаружен в клетках, трансфецированныхpcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2, и не обнаружен в клетках, трансфецированных контрольной плазмидой. Кроме того, полипептид Hu-Asp2 обнаружен только в мембранной фракции при наличии сигнального пептида и сигнального трансмембранного домена в предполагаемой последовательности. На основании этого анализа можно сделать вывод о том, что клон 5 характеризуется наибольшей экспрессией белка HuAsp2, поэтому эти линии продуцирующих клеток размножены с целью получения материала для очистки. Очистка рекомбинантного Hu-Asp2L из клона 5 CHO-K1/Hu-Asp2 Для выполнения типичной очистки в качестве исходного материала используют клеточный осадок клона 5, полученный из 20 150 мм чашек слитых клеток. Клеточный осадок повторно суспендируют в 50 мл холодного буфера для лизиса, как это описано выше. Клетки лизируют гомогенизацией в политроне(2 х 20 с) и лизат центрифугируют со скоростью 338000 х градиент в течение 20 мин. Мембранный осадок повторно суспендируют в 20 мл холодного буфера для лизиса, содержащего 50 мМ -октилглюкозида, с последующим покачиванием при 4 С в течение 1 ч. Экстракт детергента очищают центрифугированием со скоростью 338000 х градиент в течение 20 мин и супернатант собирают для последующего анализа. Экстракт -октилглюкозида вводят в анионообменную колонку Mono Q, которую предварительно уравновешивают 25 мМ Tris-HCl (рН 8,0)/50 мМ -октилглюкозида. После введения образца колонку элюируют линейным градиентом NaCl с возрастающей концентрацией (0-1,0M в течение 30 мин), отдельные фракции анализируют вестерн-блоттингом и определяют активность -секретазы (см. ниже). Фракции, обладающие иммунореактивностью Hu-Asp2L и активностью -секретазы, собирают и диализируют против 25 мМ NaOAc (рН 4,5)/50 мМ -октилглюкозида. После выполнения диализа осажденное вещество удаляют центрифугированием и растворимое вещество хроматографируют на катионообменной колонке MonoS, которую предварительно уравновешивают 25 мМ NaOAc (рН 4,5)/50 мМ -октилглюкозида. Колонку элюируют линейным градиентом NaCl с возрастающей концентрацией (0-1,0M в течение 30 мин), отдельные фракции анализируют вестерн-блоттингом и определяют активность -секретазы. Фракции, обладающие иммунореактивностью Hu-Asp2 и активностью -секретазы, объединяют и при помощи SDS-PAGA/окрашивания кумассии голубым определяют их чистоту, которая составляет 90%. Пример 12. Анализ активности -секретазы Hu-Asp2 с использованием пептидных субстратов. Анализ -секретазы Активность -секретазы определяют в количественном отношении, измеряя степень гидролиза синтетического пептида, содержащего шведскую мутацию APP, при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой(RP-HPLC) и детектирования в ультрафиолетовом свете. Каждая реакционная смесь содержит 50 мМ NaMES (рН 5,5), 1% -октилглюкозида, пептидный субстрат (SEVNLDAEFR, 70 мкМ) и фермент (1-5 мкг белка). Реакционные смеси инкубируют при 37 С в течение разных периодов времени и продукты реакции выделяют при помощи RP-HPLC, используя линейный градиент 0-70 В в течение 30 мин (А=0,1% ТФУ в воде, В=1% ТФУ/10% воды/90% AcCN). Параметры элюции контролируют по оптической плотности при 214 нм. В предварительных экспериментах пики двух продуктов, которые элюировали перед субстратом из интактного пептида, подтвердили наличие последовательности DAEFR и SEVNL при выполнении секвенирования Эдмана и масс-спектрометрии MADLI-TOF. Процентное значение гидролиза пептидного субстрата высчитывают, сравнивая интегрированные площади пиков для двух пептидных продуктов и исходного вещества, полученного при оптической плотности 214 нм. Специфичность реакции расщепления протеазой определяют, выполняя анализ -секретазы в присутствии смеси ингибиторов протеазы (8 мкМ пепстатина А, 10 мкМ лейпептина, 10 мкМ Е 64 и 5 мМ EDTA). При выполнении альтернативного анализа -секретазы используют субстраты с внутренне погашенной флуоресценцией, контролируя активность фермента при помощи флуоресцентной спектроскопии в одном образце или многолуночном формате. Каждая реакционная смесь содержит 50 мМ Na-MES(рН 5,5), пептидный субстрат MCA-EVKMDAEF[K-DNP] (BioSource International) (50 мкМ) и очищенный фермент Hu-Asp2. Эти компоненты уравновешивают при 37 С в течение разных периодов времени и инициируют реакцию, добавляя субстрат. Реакционную смесь осуществляют при 330 нм и контролируют кинетику реакции, измеряя флуоресцентное излучение при 390 нм. Чтобы обнаружить соединения, модулирующие активность Hu-Asp2, испытуемые соединения добавляют во время фазы предварительной