Аналог аутологичного а&beta или арр животного и способы его применения

008762 Область изобретения Данное изобретение относится к улучшению терапии и профилактики болезни Альцгеймера (БА) и других заболеваний, характеризующихся отложением амилоида, например характеризующихся отложениями амилоида в центральной нервной системе (ЦНС). Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способ супрессии (нежелательных) отложений амилоида путем обеспечения возможности продуцирования антител против соответствующего белка или его компонентов у субъектов, имеющих риск или страдающих заболеваниями, патология которых включает в себя отложение амилоида. Данное изобретение обеспечивает также способы получения полипептидов, применимых в данном способе, а также сами модифицированные полипептиды. Данное изобретение обеспечивает также фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие эти модифицированные полипептиды, а также векторы, включающие в себя эти фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации аналогов депонированных полипептидов, которые применимы в способе данного изобретения, а также композиции, содержащие модифицированные полипептиды или содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды. Предпосылки изобретения Амилоидоз представляет собой внеклеточное отложение нерастворимых белковых фибрилл, приводящее к разрушению ткани и заболеванию (Pepys, 1966; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Эти фибриллы образуются, когда нормально растворимые белки и пептиды аномальным образом ассоциируются друг с другом (Kelly, 1997). Амилоид ассоциирован с серьезными заболеваниями, в том числе системным амилоидозом, БА,диабетом взрослых, болезнью Паркинсона, болезнью Хангтингтона, лобно-височной деменцией и связанными с прионами трансмиссивными энцефалопатиями (куру и болезнью Крейтцфельдта-Якоба у человека и скрепи (почесухой) и BSE у овец и крупного рогатого скота соответственно), и образование амилоидных бляшек, например, в случае болезни Альцгеймера, по-видимому, тесно связано с прогрессированием этого заболевания у человека. На моделях животных было показано, что сверхэкспрессия или экспрессия, обнаруживаемых в отложениях модифицированных форм белков, наподобие -амилоидного белка, индуцирует различные симптомы заболевания, например симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера. Не существует специального лечения отложений амилоида, и эти заболевания являются обычно фатальными. Субъединицы амилоидных фибрилл могут быть белками дикого типа, вариантными или укороченными белками, и сходные фибриллы могут быть образованы in vitro из олигопептидов и денатурированных белков (Bradbury et al., I960; Filshie et al., 1964; Burke and Rougvie, 1972). Природа полипептидного компонента фибрилл определяет характер амилоидоза. Несмотря на большие различия в размере, природной структуре и функции амилоидных белков, все амилоидные фибриллы имеют неопределенную длину, являются неразветвленными, имеют в диаметре 70-120 и проявляют характерное окрашивание Конго красным (Pepys, 1996). Они являются типичной поперечной -складчатой структурой (Pauling andCorey, 1951), в которой полипептидная цепь организована в -складки. Хотя амилоидные белки имеют очень различные структуры-предшественники, они все могут подвергаться структурной конверсии, возможно, по сходному пути, в неправильно упакованную форму, которая является элементом структуры протофиламента -складчатой спирали. Этот отчетливо выраженный волокнистый характер привел к тому, что амилоидоз называли фибриллезом (Glenner, 1980a,b), а фибриллярный белок БА был назван -белком прежде, чем была выяснена его вторичная структура (Glenner and Wong, 1984). Характеристическая поперечная дифрактограмма вместе с фибриллярным видом и свойствами окрашивания являются в настоящее время общепринятыми диагностическими отличительными признаками амилоида и предполагается, что эти фибриллы, хотя они и образованы из совершенно различных белков-предшественников, имеют общее структурное сходство и составляют структурное суперсемейство, независимо от природы их белковпредшественников (Sunde M., Serpel L.C., Bartlan M., Fraser Р.Е., Pepys M.B., Blake CCFJ Mol. Biol. 1997,Oct. 31; 273 (3): 729-739). Одним из наиболее широко распространенных и хорошо известных заболеваний, где отложения амилоида в центральной нервной системе, как предполагается, играют центральную роль в прогрессировании этого заболевания, является болезнь Альцгеймера (БА). БА Болезнь Альцгеймера (БА) является необратимым прогрессирующим нарушением головного мозга,которое происходит постепенно и приводит к потере памяти, поведенческим изменениям и изменениям личности и ухудшению умственных способностей. Эти утраты связаны с гибелью клеток головного мозга и разрушением связей между ними. Ход этого заболевания, как и скорость его прогрессирования,варьирует от пациента к пациенту. В среднем, пациенты с БА живут в течение 8-10 лет после установления диагноза, хотя это заболевание может длиться и до 20 лет. БА прогрессирует в виде стадий, от ранней, небольшой забывчивости, до тяжелой потери умственной функции. Эта потеря умственной функции известна как деменция (приобретенное слабоумие). У-1 008762 большинства людей с БА симптомы появляются впервые после возраста 60 лет, но нередкими являются и более ранние проявления. Самые ранние симптомы часто включают в себя потерю памяти на недавние события, ошибочное суждение и изменения личности. Часто люди в начальных стадиях БА думают менее ясно и забывают имена знакомых людей и названия обычных объектов. Позднее в данном заболевании они могут забыть, как выполнять даже простые задачи. В конце концов, люди с БА утрачивают полностью способность логического мышления и становятся зависимыми от других людей в повседневном уходе. В конце концов, заболевание становится настолько ослабляющим, что пациенты становятся прикованными к постели, и у них могут развиваться другие болезни и инфекции. Наиболее часто люди с БА умирают от пневмонии. Хотя риск развития БА увеличивается с возрастом, БА и симптомы деменции не являются частью нормального старения. БА и другие связанные со слабоумием нарушения обусловлены заболеваниями,которые влияют на головной мозг. При нормальном старении нервные клетки в головном мозге в больших количествах не утрачиваются. В противоположность этому, при БА нарушаются три ключевых процесса: коммуникация, метаболизм и восстановление нервных клеток. Это разрушение в конечном счете заставляет многие нервные клетки прекращать функционирование, утрачивать связи с другими нервными клетками и умирать. Сначала при БА разрушаются нейроны в частях головного мозга, которые контролируют память, в частности, в гиппокампе и родственных структурах. Поскольку нервные клетки в гиппокампе перестают правильно функционировать, отказывает кратковременная память, и часто способность человека исполнять простые и знакомые задачи начинает ухудшаться. БА атакует также кору головного мозга, в частности, области, ответственные за язык и рассуждение. В конечном счете, вовлекаются многие другие области головного мозга, все эти зоны головного мозга атрофируются (сморщиваются), и пациент с БА становится прикованным к постели, с недержанием, полностью беспомощный и не реагирующий на внешний мир (источник National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Влияние БА БА является наиболее частой причиной деменции (слабоумия) среди людей в возрасте 65 или более лет. Она представляет собой основную проблему здравоохранения вследствие ее огромного влияния на индивидуумов, семьи, систему медико-санитарной помощи и общество в целом. Ученые оценивают приблизительно, что до 4 млн людей страдают в настоящее время от этого заболевания, и частота случаев БА удваивается каждые 5 лет после возраста 65 лет. Приблизительно также подсчитано, что около 360000 новых случаев (появлений) будут возникать каждый год, хотя это число будет увеличиваться по мере старения популяции (Brookmeyer et al., 1998). БА налагает тяжелое экономическое бремя на общество. В недавнем исследовании в Соединенных Штатах было подсчитано, что ежегодный расход по уходу за одним пациентом с БА составляет 18408 долларов для пациента со слабо развитой БА, 30096 долларов для пациента с умеренной БА и 36132 доллара для пациента с тяжелой БА. Подсчитано, что ежегодные национальные расходы по уходу за пациентами с БА в Соединенных Штатах составляют более 50 биллионов долларов (Leon et al., 1998). Приблизительно 4 млн американцев имеют возраст 85 или более лет, а в большинстве индустриально развитых стран эта возрастная группа является одной из наиболее быстро растущих частей населения. Приблизительно подсчитано, что эта группа будет насчитывать почти 8,5 млн к 2030 г. в США; некоторые эксперты, исследующие тенденции популяции, предполагают, что это число может быть даже более высоким. Поскольку все больше и больше людей живут дольше, число людей, пораженных болезнями старения, в том числе БА, будет продолжать расти. Например, некоторые исследования показывают, что почти половина всех людей в возрасте 85 и более лет имеют какую-нибудь форму деменции (NationalInstitute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Основные характеристики БА Наличие двух аномальных структур в головном мозге являются отличительным признаком БА: амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (NFT). Бляшки являются плотными, в значительной степени нерастворимыми отложениями белка и клеточного материала снаружи и вокруг нейронов головного мозга. Клубки являются нерастворимыми скрученными волокнами, которые накапливаются внутри нейронов. Существует два типа БА: семейная БА (FAD), которая носит явно наследственный характер, и спорадическая БА, где не обнаруживается явного характера наследования. Вследствие различий в возрасте проявления БА дополнительно описана как ранняя (встречающаяся у людей моложе 65 лет) или поздняя(встречающаяся у людей 65 лет или старше). Ранняя БА является редкой (приблизительно 10% случаев) и обычно поражает людей в возрасте 30-60 лет. Некоторые формы ранней БА являются наследуемыми и повторяются в семьях. Ранняя БА часто прогрессирует быстрее, чем более обычная поздняя форма. Все семейные болезни Альцгеймера (FAD), известные до сих пор, имеют раннее проявление, и в настоящее время известно, что 50% случаев FAD вызваны дефектами в трех генах, расположенных на трех различных хромосомах. Имеются мутации в гене АРР на хромосоме 21; мутации в гене на хромосоме 14, называемом пресенилином 1; и мутации в гене на хромосоме 1, называемом пресенилином 2. Однако пока еще нет данных о том, что какая-либо из этих мутаций играет главную роль в более обычной-2 008762 спорадической, или несемейной, форме поздней БА (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Амилоидные бляшки При БА амилоидные бляшки развиваются сначала в областях головного мозга, используемых для памяти и других когнитивных функций. Они состоят в значительной степени из нерастворимых отложений бета-амилоида (далее называемого А) - белкового фрагмента более крупного белка, называемого белком-предшественником амилоида (АРР, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2), смешанного с частями нейронов и с клетками, не являющимися нервными клетками,такими как микроглии и астроциты. Неизвестно, составляют ли сами амилоидные бляшки основную причину БА или они являются побочными продуктами процесса БА. Определенно, изменения в белке АРР могут вызывать БА, как показано при наследуемой форме БА, вызываемой мутациями в гене АРР, и образование бляшек А, по-видимому, тесно связано с прогрессированием данного заболевания у человека (Lippa C.F. et al., 1998). АРР АРР является одним из многих белков, которые связаны с клеточными мембранами. После его образования АРР становится погруженным в мембрану нервной клетки, частично внутри и частично снаружи этой клетки. Недавние исследования с использованием трансгенных мышей показывают, что АРР,по-видимому, играет важную роль в росте и выживании нейронов. Например, определенные формы и количества АРР могут защищать нейроны против как кратковременного, так и долгосрочного повреждения и могут делать поврежденные нейроны более способными к собственной репарации и помогать частям нейронов расти после повреждения головного мозга. Хотя АРР погружен в клеточную мембрану, протеазы действуют на конкретные сайты в АРР, расщепляя его на белковые фрагменты. Одна протеаза помогает расщеплять АРР с образованием А, а другая протеаза расщепляет АРР в середине амилоидного фрагмента, так что А не может образоваться. Образовавшийся А имеет две различные длины, более короткий А из 40 (или 41) аминокислот, который являются относительно растворимым и агрегирует медленно, и слегка более длинный липкий А из 42 аминокислот, который быстро образует нерастворимые клубки. При образовании А еще неизвестно точно, как он перемещается через нервные клетки или вокруг нервных клеток. В конечных стадиях этого процесса "липкий" А агрегирует в длинные филаменты снаружи клетки, вместе с фрагментами мертвых или умирающих нейронов и микроглиями и астроцитами, образует бляшки, которые являются отличительным признаком БА, в ткани головного мозга. Существуют некоторые данные о том, что мутации в АРР делают более вероятным, что А будет вырезаться из предшественника АРР, что вызывает образование либо большего количества общего А,либо относительно большего количества "липкой" формы. Вероятно также, что мутации в генах пресенилина могут способствовать дегенерации нейронов по меньшей мере двумя путями: путем модификации образования А или путем запуска гибели клеток более прямым путем. Другие исследователи предполагают, что мутированные пресенилины 1 и 2 могут участвовать в ускорении темпа апоптоза. Следует ожидать, что по мере прогрессирования заболевания будет образовываться все больше и больше бляшек, заполняя все более и более областей головного мозга. В исследованиях предполагается,что возможно в одно и то же время происходит агрегация и дезагрегация А по типу динамического равновесия. Это дает надежду на то, что может существовать возможность разрушения бляшек даже после их образования (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Считается, что А является токсичным для нейронов. В исследованиях на культуре ткани исследователи наблюдали увеличение гибели нейронов гиппокампа, сконструированных для сверхэкспрессии мутированных форм АРР человека, в сравнении с нейронами, сверхэкспрессирующими нормальный АРР человека (Luo et al., 1999). Кроме того, в моделях на животных было продемонстрировано, что сверхэкспрессия или экспрессия модифицированных форм белка А индуцирует симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера (Hsiao K. et al., 1998). Если исходить из того, что повышенное образование А, его агрегация в бляшки и полученная в результате нейротоксичность могут приводить к БА, представляет терапевтический интерес исследование условий, при которых агрегация в бляшки может быть ослаблена или даже блокирована. Пресенилины Мутации в пресенилине-1 (S-180) ответственны почти за 50% всех случаев ранней семейной БА(FAD). Были идентифицированы около 30 мутаций, которые приводят к появлению БА. Начало БА варьирует в зависимости от мутаций. Мутации в пресенилине-2 ответственны за гораздо меньшую часть случаев FAD, но все же являются значимым фактором. Неизвестно, участвуют ли пресенилины в спорадической несемейной БА. Функция пресенилинов неизвестна, но они, по-видимому, участвуют в процессинге АРР до А-42 (более длинной, более липкой формы этого пептида, SEQ ID NO:2, остатки 673-714), так как пациенты с БА с мутациями пресенилина имеют повышенные уровни этого пептида. Неясно, играют-3 008762 ли пресенилины роль в индукции выработки NFT. Некоторые данные предполагают, что пресенилины могут также играть более прямую роль в дегенерации нейронов и гибели нейронов. Пресенилин-1 находится в хромосоме 14, тогда как пресенилин-2 сцеплен с хромосомой 1. Если человек получает мутированную версию хотя бы одного их этих генов, почти определенно, что у него или у нее будет развиваться раннее начало БА. Есть некоторая неопределенность в том, является ли пресенилин идентичным гипотетической гамма-секретазе, участвующей в процессинге АРР (Naruse et al., 1998). Аполипопротеин Е Аполипопротеин Е обычно связан с холестерином, но также обнаруживается в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА. Хотя кажется, что аллели 1-3 не принимают участия в БА, имеется значимая корреляция между присутствием аллеля АРOЕ-е 4 и развитием поздней БА (Strittmatter et al., 1993). Однако он является фактором риска, а не прямой причиной, как мутации пресенилина и АРР, и не ограничивается семейной БА. Пути, в которых белок АРOЕ-е 4 способствует увеличению вероятности развития БА, точно не выяснены, но одна возможная теория заключается в том, что он облегчает накопление А и это способствует снижению возраста появления БА, или присутствие или отсутствие конкретных аллелей АРОЕ может влиять на способ, при помощи которого нейроны отвечают на повреждение (Buttini et al., 1999). Было показано, что Аро А 1 также является амилоидогенным. Интактный аро А 1 может сам образовывать амилоидоподобные фибриллы in vitro, которые являются положительными при окрашивании красителем Конго красным (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T., Golabek A.A., Kida E.,Wisniewski K.E., Frangione B.). Несколько противоречивы результаты, указывающие на существование положительного действия аллеля АРOЕ-е 4 в снижении симптомов потери умственной способности, в сравнении с другими аллелями (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41). Нейрофибриллярные клубки Этот второй отличительный признак БА состоит из аномальных скоплений скрученных нитей, обнаруживаемых в нервных клетках. Главным компонентом клубков является одна форма белка, называемая тау . В центральной нервной системе тау-белки являются наиболее известными из-за их способности связывать микротрубочки и способствовать стабилизации микротрубочек, которые являются одним из компонентов внутренней поддерживающей структуры или скелета клетки. Однако в случае БА таубелок изменяется химически и этот измененный тау не может более стабилизировать микротрубочки,вызывая их дезинтеграцию. Этот коллапс транспортной системы может сначала приводить к дисфункции коммуникации между нервными клетками, а позднее может приводить к гибели нейронов. При БА химически измененный тау скручивается в парные спиральные филаменты - две нити тау,которые скручены одна вокруг другой. Эти филаменты являются основным веществом, обнаруживаемым в нейрофибриллярных клубках. В одном из недавних исследований были обнаружены нейрофибриллярные изменения менее чем у 6% нейронов в конкретной части гиппокампа в здоровом головном мозге,более чем 43% этих нейронов у людей, которые умерли от легкой БА, и в 71% нейронов у людей, которые умерли от тяжелой БА. При исследовании потери нейронов было обнаружено сходное прогрессирование. Данные этого типа подтверждают идею о том, что образование клубков и потеря нейронов прогрессируют вместе на протяжении развития БА (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer'sDisease, 1999). Таупатии и клубки Несколько нейродегенеративных заболеваний, отличных от БА, характеризуются тау-агрегацией в нерастворимые филаменты в нейронах и глии, приводящей к дисфункции и смерти. Совсем недавно несколько групп исследователей, которые изучали семьи с различными наследственными деменциями, отличными от БА, обнаружили первые мутации в гене тау на хромосоме 17 (Clark et al., 1998; Hutton et al.,1998; Poorkaj et al., 1998; Spillantini et al., 1998). В этих семьях мутации в гене тау вызывают гибель нервных клеток и деменцию. Эти нарушения, которые имеют некоторые общие признаки с БА, но отличаются в некоторых важных аспектах, совокупно называют лобно-височной деменцией и паркинсонизмом,связанными с хромосомой 17 (FTDP-17). Они являются заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, некоторые формы бокового амиотрофического склероза (ALS), кортикобазальная дегенерация, прогрессирующий супрануклеарный паралич и болезнь Пика, и все они характеризуются аномальной агрегацией тау-белка. Другие БА-подобные неврологические заболевания Существуют важные параллели между БА и другими неврологическими заболеваниями, в том числе вызываемыми прионами заболеваниями (такими как куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба и бычий губчатый энцефалит), болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона и лобно-височной деменцией. При всех этих заболеваниях происходит отложение аномальных белков в головном мозге. БА и прионовые заболевания вызывают деменцию и смерть, и оба эти заболевания связаны с образованием нерастворимых амилоидных фибрилл, но из мембранных белков, которые отличаются друг от друга.-4 008762 Ученые, изучающие болезнь Паркинсона, второе наиболее распространенное нейродегенеративное нарушение после БА, обнаружили первый ген, сцепленный с этим заболеванием. Этот ген кодирует белок, названный синуклеином, который, интригующим образом, обнаружен также в амилоидных бляшках головного мозга пациентов с БА (Lavedan С., 1998, Genome Res. 8(9): 871-80). Исследователи обнаружили также, что генетические дефекты при болезни Хантингтона, другом прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, которое вызывет деменцию, заставляют белок Хантингтона образовывать нерастворимые фибриллы, очень сходные с А-фибриллами БА и белковыми фибриллами прионового заболевания (Scherzinger E., et al., 1999, PNAS U.S.A. 86(8):4604-9). Ученые обнаружили также новый ген, который при мутировании является ответственным за семейную Британскую деменцию (FBD), редкую наследственную болезнь, которая вызывает тяжелые нарушения движения и прогрессирующую деменцию, сходную с наблюдаемой при БА. При биохимическом анализе амилоидных фибрилл, обнаруженных в бляшках FBD, был обнаружен уникальный пептид, названный ABri (Vidal et al., 1999). Мутация в конкретной точке вдоль этого гена приводит к продуцированию более длинного, чем нормальный, Bri-белка. Пептид ABri, который вырезается из мутированного конца этого Bri-белка, откладывается в виде амилоидных фибрилл. Считают, что эти бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которые характеризуют FBD. Иммунизация с использованием А Иммунная система будет нормально участвовать в клиренсе чужеродных белка и белковых частиц в организме, но отложения, связанные с вышеуказанными заболеваниями, состоят в основном из собственных белков, что делает роль иммунной системы в контроле этих заболеваний менее очевидной. Кроме того, отложения локализованы в компартменте (ЦНС), в норме отделенном от иммунной системы,причем оба факта предполагают, что любая вакцина или иммунотерапевтический подход были бы безуспешными. Тем не менее, ученые недавно пытались иммунизировать мышей вакциной, составленной из гетерологичного А человека и вещества, которое, как известно, возбуждает иммунную систему (Schenk etal., 1999 и WO 99/27944). Эту вакцину испытывали в частичной модели БА трансгенной мыши с мутированным геном АРР человека, встроенным в ДНК мыши. Мыши, по мере роста, продуцировали модифицированный белок АРР и развитые амилоидные бляшки. Эту мышиную модель использовали для испытания того, действует ли вакцинация против модифицированного трансгенного АРР человека на процесс накопления бляшек. В первом эксперименте одной группе трансгенных мышей инъецировали ежемесячно вакцину, начиная с 6-недельного возраста и заканчивая в 11-месячном. Вторая группа трансгенных мышей не получала инъекций и служила в качестве контрольной группы. В 13-месячном возрасте мыши в контрольной группе имели бляшки, охватывающие 2-6% их головного мозга. В противоположность этому, иммунизированные мыши бляшек практически не имели. Во втором эксперименте исследователи начинали инъекции в 11 месяцев, когда уже развивалось некоторое количество бляшек. При прошествии 7-месячного периода у контрольных трансгенных мышей наблюдали 17-кратное увеличение количества бляшек в головном мозге, тогда как у мышей, которые получали вакцину, наблюдалось 99%-ное уменьшение в сравнении с 18-месячными контрольными трансгенными мышами. У некоторых мышей, некоторая часть предсуществующих отложений в виде бляшек, по-видимому, в результате такой обработки удалялась. Было обнаружено, что другое связанное с бляшками повреждение, такое как воспаление и аномальные процессы в нервных клетках, ослаблялись в результате иммунизации. Таким образом, выше описано предварительное исследование на мышах, и ученым нужно определить, к примеру, остаются ли вакцинированные мыши здоровыми в других отношениях и остается ли память этих вакцинированных животных нормальной. Кроме того, поскольку мышиная модель не является полным воспроизведением БА (у животных не развиваются нейрофибриллярные клубки и у них не наблюдается гибель многих нейронов), необходимы дополнительные исследования для определения того, воспроизводится ли у человека такая же реакция, как у мышей, или она отличается от мышиной. Другим предметом рассмотрения является то, что этот способ, возможно, "лечит" амилоидное отложение, но не может остановить развитие деменции. Технические вопросы также представляют собой основные проблемы. Например, мало вероятно,что можно, с использованием этой технологии, создать вакцину, которая позволит людям индуцировать антитела против их собственных (аутологичных) белков. Так, потребуется разрешить многочисленные проблемы безопасности и эффективности, прежде чем можно будет рассматривать вопрос об испытаниях на человеке. Так, в работе Schenk et al. показано, что если бы было возможно генерировать сильную иммунную реакцию в отношении аутологичных белков в белковых отложениях в центральной нервной системе,таких как бляшки, образуемые при БА, то можно как предупреждать образование этих отложений, так и возможно также осуществлять клиренс образованных бляшек.-5 008762 Цель изобретения Целью данного изобретения является обеспечение новой терапии против состояний, отличающихся отложением амилоида, таких как БА. Следующей целью данного изобретения является развитие аутовакцины (вакцины против аутологичных белков) против амилоида, чтобы получить новый способ лечения БА и других патологических нарушений, включающих в себя отложение амилоида. Сущность изобретения Здесь описано применение технологии аутовакцинации для генерирования сильных иммунных ответов против в ином случае неиммуногенных аутологичных белков, включенных в связанные с патологией амилоидные отложения. Посредством этого, генерируют сильную иммунную реакцию против амилоида, против одного или нескольких компонентов, включенных в эти отложения, или против одного или нескольких белков, ответственных за образование амилоида. Описано также приготовление таких вакцин для предупреждения, возможного лечения или ослабления симптомов таких заболеваниий, связанных с отложениями амилоидов. Таким образом, в его самом широком и наиболее общем объеме, данное изобретение относится к способу супресси in vivo амилоида у животного, в том числе человека, причем этот способ предусматривает осуществление представления (презентации) иммунной системе этого животного иммунологически эффективного количества по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида или его субпоследовательности, которые были приготовлены таким образом, что иммунизация животного амилоидогенным полипептидом или его субпоследовательностью индуцирует продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, и/или по меньшей мере одного аналога амилоида, причем в амилоидогенный полипептид введена модификация, что в результате приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против амилоидогенного полипептида. Таким образом, в данное изобретение включено применение: 1) природно встречающихся антигенов и их фрагментов, приготовленных таким образом, что они запускают иммунную реакцию, а также 2) аналогов таких природно встречающихся антигенов, причем эти аналоги способны индуцировать перекрестно-реактивные иммунные реакции. Данное изобретение относится также к аналогам амилоидогенных полипептидов, а также к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим их субпопуляцию. Иммуногенные композиции, содержащие эти аналоги или эти фрагменты нуклеиновых кислот, являются частью данного изобретения. Данное изобретение относится также к способу идентификации иммуногенно эффективных аналогов амилоидогенных полипептидов, а также к способу получения композиции, содержащей эти аналоги. Подпись к чертежу На чертеже представлено схематическое изображение вариантов аутовакцины (Autovac), полученных из белка-предшественника амилоида с целью генерирования реакций в виде антител против Абелка А-43 (или С-100). АРР показан схематически в верхней части фигуры, а остальные схематические конструкции показывают, что модельные эпитопы Р 2 и Р 30 заменены или встроены в различные укороченные формы АРР. На этой фигуре черным обозначена сигнальная последовательность АРР, двусторонняя поперечная штриховка соответствует внеклеточной части АРР, темными вертикальными штрихами обозначен трансмембранный домен АРР, светлыми вертикальными штрихами обозначен внутриклеточный домен АРР, грубой поперечной штриховкой обозначен эпитоп Р 30, а тонкое поперечное штрихование указывает на эпитоп Р 2. Обведенным сплошной линией блоком показан А-42/43, а обведенным сплошной линией блоком и обведенным сплошной линией и пунктирной линией блоком вместе показан С-100. "Abeta" означает А. Подробное описание изобретения Определения. Далее будут определены и подробно объяснены ряд терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения, для прояснения размеров и границ данного изобретения. Термины амилоид и амилоидный белок, которые используются здесь взаимозаменяемо, означают класс белковых неразветвленных фибрилл неопределенной длины. Амилоидные фибриллы характерно окрашиваются Конго красным и имеют общую поперечную -структуру, в которой полипептидная цепь организована в виде -складок. Амилоид обычно происходит из амилоидогенных белков, которые имеют различные структуры предшественников, но которые могут все подвергаться структурному превращению в неправильно уложенную форму, которая является элементом структуры -складчатого спирального протофиламента. Обычно диаметр амилоидных фибрилл варьирует примерно междуоколо 70 и 120 . Термин амилоидогенный белок предназначен для обозначения полипептида, который участвует в образовании амилоидных отложений, является либо частью отложений как таковых, либо частью биосинтетического пути, приводящего к образованию этих отложений. Таким образом, примерами амилоидогенных белков являются АРР и А, но также и белки, участвующие в метаболизме этих белков, могут быть амилоидогенными белками. Ряд амилоидогенных полипептидов обсуждается подробно ниже. Амилоидный полипептид предназначен здесь для обозначения полипептидов, содержащих ами-6 008762 нокислотную последовательность обсуждаемых выше амилоидогенных белков, полученных у человека или других животных (или их укороченных форм, имеющих существенное количество общих Вклеточных эпитопов с интактным амилоидогенным белком), амилоидогенный полипептид может, следовательно, содержать, например, существенные части предшественника амилоидогенного полипептида (в случае А одним из возможных амилоидных полипептидов мог бы быть АРР). Негликозилированные формы амилоидогенных полипептидов, которые получают в прокариотической системе, также охватываются данным термином, как и формы, имеющие варьирующие картины гликозилирования вследствие применения, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем не млекопитающих. Однако следует отметить, что когда применяется термин амилоидогенный полипептид, подразумевается, что рассматриваемый полипептид является обычно неиммуногенным при представлении его подлежащему обработке животному. Другими словами, амилоидогенный полипептид является аутологичным белком или является аналогом такого аутологичного белка, который в норме не будет индуцировать иммунную ответную реакцию против амилоидогенного белка рассматриваемого животного. Аналог амилоидогенного полипептида означает амилоидогенный полипептид, который был подвергнут изменениям в своей первичной структуре. Такое изменение может, например, быть в виде слияния амилоидного полипептида с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре,включающее в себя исключительно С- и/или N-добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида. Этот термин относится также к дериватизованным амилоидогенный молекулам(см. обсуждение ниже модификаций амилоидогенных полипептидов). В случае, когда амилоидогенный полипептид является амилоидом или его предшественником, этот аналог может быть сконструирован таким образом, что он менее способен или даже неспособен индуцировать антитела против нормального белка-предшественника (белков-предшественников) амилоида, для исключения посредством этого нежелательного взаимодействия с (физиологически нормальной) неагрегированной формой этого полипептида, являющегося предшественником амилоидного белка. Следует отметить, что применение в качестве вакцины у человека ксеноаналога (например, собачьего или свиного аналога) амилоидогенного полипептида человека может рассматриваться для получения желаемого иммунитета против амилоидогенного полипептида. Такое применение ксеноаналога для иммунизации также рассматривается как часть данного изобретения. Термин полипептид предназначен в данном контексте для обозначения как коротких пептидов с 2-10 аминокислотными остатками, олигопептидов с 11-100 аминокислотными остатками и полипептидов с более чем 100 аминокислотными остатками. Кроме того, этот термин также предназначен для включения белков, т.е. функциональных биомолекул, содержащих по меньшей мере один полипептид; при наличии по меньшей мере двух полипептидов они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связанными. Полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными, и/или липидизированными, и/или содержат простетические группы. Термин Т-лимфоцит и Т-клетка будут использоваться взаимозаменяемо для обозначения лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточно-опосредованные иммунные реакции, а также за хелперную активность в гуморальной иммунной реакции. Подобным образом, термины В-лимфоцит и В-клетка будут использоваться взаимозаменяемо в отношении продуцирующих антитела лимфоцитов. Термин субпоследовательность означает любой отрезок последовательности по меньшей мере из 3 аминокислот или, соответственно, по меньшей мере 3 нуклеотидов, полученный непосредственно из природно встречающейся аминокислотной последовательности амилоида или последовательности нуклеиновой кислоты амилоида соответственно. Термин "животное" в данном контексте обычно означает вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Homo sapiens, Canis domesticus и т.д., а не только единственное животное. Однако этот термин означает также популяцию животных этих видов, так как существенно, что у всех индивидуумов, иммунизированных в соответствии со способом данного изобретения одним и тем же амилоидогенным полипептидом, распознается, по существу, один и тот же амилоидогенный полипептид, что позволяет иммунизацию этих животных тем же самым иммуногеном (иммуногенами). Если, например, в разных популяциях людей существуют генетические варианты данного амилоидогенного полипептида,может быть необходимым использование различных иммуногенов в этих отличающихся популяциях,чтобы добиться разрушения аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида в каждой популяции оптимальным образом. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что животное в данном контексте является живым существом, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно, чтобы это животное являлось позвоночным животным, таким как млекопитающее. Термин "супрессия амилоида in vivo" означает здесь уменьшение в живом организме общего количества отложенного амилоида соответствующего типа. Супрессия может быть получена посредством нескольких механизмов, из них наиболее простым является простое взаимодействие с амилоидом посредством связывания с антителами для предотвращения ошибочной агрегации. Однако в объем данного изобретения входит также то, что связывание антител приводит к удалению амилоида клетками-7 008762 акцепторами (такими как макрофаги и другие фагоцитарные клетки) и что эти антитела взаимодействуют с другими амилоидогенными полипептидами, которые приводят к образованию амилоида. Выражение "осуществление представленияиммунной системе" означает, что иммунная система животного подвергается иммуногенной стимуляции регулируемым образом. Как будет видно из приведенного ниже описания, такая стимуляция иммунной системы может быть выполнена рядом способов, из которых наиболее важным является вакцинация содержащими полипептид "фармакцинами" (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления имеющегося заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту "фармакцинами". Важным результатом, который должен быть получен, является то, что иммунокомпетентные клетки сталкиваются с антигеном иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата менее важен для идеи, лежащей в основе данного изобретения. Термин "иммуногенно эффективное количество" имеет свое обычное значение в данной области,т.е. количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунную реакцию, которая в значительной мере связывает патогенные агенты, имеющие общие иммуногенные признаки с данным иммуногеном. При использовании выражения, что амилоидогенный полипептид был "модифицирован", имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет скелет амилоидогенного полипептида. Такая модификация может, например, быть дериватизацией (например, алкилированием) определенных аминокислотных остатков в последовательности амилоидогенного полипептида, но, как будет понятно из приведенного ниже описания, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности. При обсуждении "аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида" понятно, что поскольку амилоидогенный полипептид является аутологичным ("своим") белком в подлежащей вакцинации популяции, у нормальных индивидуумов в этой популяции не возникает иммунной реакции против этого амилоидогенного полипептида; хотя и нельзя исключить, что случайные индивидуумы в популяции животных могут быть способными продуцировать антитела против природного амилоидогенного полипептида, например, в виде части аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, животное будет обычно аутотолерантным только в отношении его собственного амилоидогенного полипептида, но нельзя исключить, что аналоги, полученные у других видов животных или у популяции, имеющей отличающийся фенотип, будут также переноситься указанным животным."Чужеродный Т-клеточный эпитоп" (или "чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп") является пептидом, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у видов животных. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными эпитопами в данном изобретении являются"смешанные" эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с существенной фракцией конкретного класса молекул МНС у вида или популяции животного. Известно только очень ограниченное количество таких Т-клеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Смешанные Т-клеточные эпитопы называют также "универсальными" Т-клеточными эпитопами. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными по возможности в большей части популяции животного, может быть необходимым: 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) получить несколько аналогов, где каждый аналог имеет отличающийся встроенный случайный эпитоп. Следует также отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также использование скрытых (криптических) Тклеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые происходят из аутологичного белка и которые проявляют их иммуногенное поведение только в том случае, когда они существуют в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка."Чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита" (чужеродный Тн-эпитоп) является чужеродным Тклеточным эпитопом, который связывается с молекулой МНС Класса II и может быть представлен на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС), связанной с молекулой МНС Класса II. Функциональная часть (био)молекулы означает в данном контексте часть молекулы, которая является ответственной по меньшей мере за одно из биохимических или физиологических действий, проявляемых этой молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за действия, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут служить цели стабилизации или усиления растворимости и, следовательно, могут быть опущены, если эти цели не являются важными в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать некоторые цитокины в качестве модифицирующей части молекулы в амилоидогенном полипептиде (см. подробное обсуждение ниже), и в таком случае, вопрос стабильности может быть не важен, так как связывание с амилоидогенным полипептидом может обеспечивать необходимую стабильность. Термин адъювант имеет его обычное значение в области технологии вакцин, т.е. означает вещество или композицию, которая: 1) сама не способна вызывать специфическую иммунную реакцию против иммуногена вакцины, но которая 2) тем не менее способна усиливать иммунную реакцию против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только адъювантом не обеспечивает иммунную реак-8 008762 цию против иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать или может не индуцировать иммунную реакцию против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунную реакцию против иммуногена, которая является более сильной, чем иммунная реакция, индуцируемая одним иммуногеном. Нацеливание молекулы означает в данном контексте ситуацию, в которой молекула при введении животному будет появляться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться рядом путей, в том числе включением этой молекулы в состав композиции, облегчающей нацеливание, или введением в эту молекулу групп, которые облегчают нацеливание. Эти вопросы будут подробно обсуждаться ниже. Стимуляция иммунной системы означает, что рассматриваемые вещество или композиция проявляют общее, неспецифическое иммуностимулирующее действие. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является увеличенная бдительность иммунной системы, т.е. одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует значимо более эффективную реакцию в сравнении с отдельным использованием данного иммуногена. Предпочтительные варианты супрессии амилоида Предпочтительно амилоидогенный полипептид, используемый в качестве иммуногена в способе данного изобретения, является модифицированной молекулой, в которой по меньшей мере присутствует одно изменение в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида, так как шансы получения общего разрушения аутотолерантности в отношении данного амилоидогенного полипептида в этом случае сильно увеличиваются таким путем - это, например, очевидно из результатов, приведенных здесь в примере 2, где иммунизация А дикого типа сравнивается с иммунизацией вариантной молекулой А. Следует отметить, что применение модифицированной молекулы не исключает возможности использования такого модифицированного амилоидогенного полипептида в композициях, которые дополнительно облегчают разрушение аутотолерантности против амилоидогенного полипептида, например, в композициях, содержащих адъюванты. Было показано (в Dalum I. et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), что потенциально самореактивные В-лимфоциты, узнающие аутологичные белки, физиологически присутствуют у нормальных индивидуумов. Однако для того, чтобы эти В-лимфоциты были индуцированы для фактического продуцирования антител, реактивных с соответствующими аутологичными белками, требуется помощь со стороны продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клеток или Тн-лимфоцитов). Обычно эта помощь не обеспечивается, так как Т-лимфоциты обычно не узнают Т-клеточные эпитопы, полученные из аутологичных белков при презентации антигенпредставляющими клетками (АРС). Однако посредством обеспечения элемента чужеродности в аутологичном белке (т.е. введением иммунологически значимой модификации) Т-клетки, узнающие этот чужеродный элемент, активируются при узнавании этого чужеродного эпитопа на АРС (такой как, первоначально, мононуклеарная клетка). Поликлональные Влимфоциты (которые являются также АРС), способные узнавать аутологичные эпитопы на модифицированном аутологичном белке, также интернализируют этот антиген, и затем представляют его чужеродный Т-клеточный эпитоп (эпитопы), и эти активированные Т-лимфоциты затем обеспечивают помощь цитокинов для данных самореактивных поликлональных В-лимфоцитов. Поскольку антитела, продуцируемые этими поликлональными В-лимфоцитами, являются реактивными в отношении различных эпитопов на модифицированном полипептиде, в том числе тех из них, которые присутствуют также в нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно-реактивное с немодифицированным аутологичным белком. В результате Т-лимфоциты можно заставить действовать так, как если бы популяция поликлональных В-лимфоцитов узнавала полностью чужеродный антиген, тогда как в действительности только встроенный эпитоп (эпитопы) является (являются) чужеродным для данного хозяина. Таким путем индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутологичными антигенами. Несколько путей модификации пептидного аутологичного антигена для достижения разрушения аутотолерантности известны в данной области. Таким образом, согласно данному изобретению модификация может включать в себя следующее: вводят по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп, и/или вводят по меньшей мере только первую часть, которая выполняет нацеливание модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АРС), и/или вводят по меньшей мере только вторую часть, которая стимулирует иммунную систему, и/или вводят по меньшей мере только третью часть, которая оптимизирует представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе. Однако все эти модификации должны проводиться при сохранении существенной фракции исходных эпитопов В-лимфоцитов в амилоидогенном полипептиде, так как посредством этого усиливается-9 008762 узнавание В-лимфоцитами нативной молекулы. В одном предпочтительном варианте вводят ковалентно или нековалентно боковые группы (в виде чужеродных Т-клеточных эпитопов или вышеупомянутых первой, второй или третьей частей молекулы). Это должно означать, что отрезки аминокислотных остатков, происходящие из амилоидогенного полипептида, дериватизируют без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без введения изменений в пептидные связи между индивидуальными аминокислотами в данной цепи. В альтернативном - и предпочтительном - варианте используют замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавку аминокислот (которые могут выполняться рекомбинантными способами или с использованием пептидного синтеза; модификации, которые включают в себя более длинные отрезки аминокислот, могут приводить к образованию слитых полипептидов). Одной особенно предпочтительной версией этого варианта является способ, описанный в WO 95/05849, где описан способ супрессии аутологичных белков путем иммунизации аналогами аутологичных белков, где ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим рядом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, при сохранении в то же самое время в целом третичной структуры аутологичного белка в данном аналоге. Однако для целей данного изобретения достаточно, если модификация (инсерция, добавка, делеция или замена) приводит к образованию чужеродного Т-клеточного эпитопа и в то же самое время сохраняет значительное число В-клеточных эпитопов в амилоидогенном полипептиде. Однако для получения максимальной эффективности индуцируемой иммунной реакции предпочтительно, чтобы вся третичная структура амилоидогенного полипептида сохранялась в модифицированной молекуле. Следующая формула описывает молекулярные конструкции, включенные в общем виде в данное изобретение: где амилоиде 1-амилоидех являются х В-клеточными эпитопами, содержащими субпоследовательности амилоидогенного полипептида, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х равно целому числу 3, n1-nx равны х целым числам 0 (по меньшей мере один из них 1), MOD1-MODx являются х модификациями,вводимыми между сохраненными В-клеточными эпитопами, a s1-sx являются х целыми числами 0 (по меньшей мере один из них 1, если в последовательности амилоидаех не введены боковые группы). Таким образом, при условии общих функциональных ограничений в отношении иммуногенности этих конструкций, данное изобретение делает возможными все типы пермутаций первоначальной последовательности амилоидогенного полипептида и все типы модификаций в ней. Таким образом, в данное изобретение включены модифицированные амилоидогенные полипептиды, полученные опущением частей последовательности амилоидогенного полипептида, которые проявляют неблагоприятные эффекты in vivo,или опущением частей, которые могли бы вызвать нежелательные иммунологические реакции. Предпочтительными версиями конструкций, описанных выше, являются, если это применимо, конструкции, в которых содержащая В-клеточный эпитоп субпоследовательность амилоидного белка не является экспонированной внеклеточно в полипептиде-предшественнике, из которого произведен этот амилоид. При таком выборе амилоидных эпитопов гарантируется, что не вырабатываются антитела, которые могли бы быть реактивными в отношении клеток, продуцирующих предшественник амилоида, и посредством этого иммунная реакция, которая генерируется, становится ограниченной иммунной реакцией против нежелательных амилоидных отложений. Когда это применимо, подобный выбор может быть сделан для других амилоидогенных полипептидов, которые не являются амилоидом. В этих случаях будет, например, легко индуцировать иммунитет против эпитопов амилоидогенного полипептида,которые являются экспонированными во внеклеточной фазе только в том случае, когда они свободны от какого-либо связывания с клетками, из которых они получены. Сохранение существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, который подвергают модификации, как описано здесь, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против амилоидогенного полипептида (например, антисыворотки, полученной у кролика), и после этого применение этой антисывороки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном методе ELISA) против модифицированных белков, которые продуцируются. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в той же самой степени с этой антисывороткой, что и амилоидогенный полипептид, должны рассматриваться как имеющие общую третичную структуру, какую имеет амилоидогенный полипептид,тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность в отношении такой антисыворотки, рассматриваются как имеющие сохраненную существенную фракцию первоначальных эпитопов В-клеток. Альтернативно, может быть приготовлен набор моноклональных антител, реагирующих с отдельными эпитопами на амилоидогенном полипептиде, и использован в качестве тест-панели. Этот подход имеет следующие преимущества: 1) позволяет картировать эпитопы амилоидогенного полипептида и 2)- 10008762 позволяет картировать эпитопы, которые сохраняются в полученных аналогах. Конечно, третий подход мог бы раскрыть трехмерную структуру амилоидогенного полипептида или его биологически активного укороченного фрагмента (см. выше) и сравнить ее с раскрытой трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть выяснена при помощи исследований дифракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии. Дополнительная информация о третичной структуре может быть до некоторой степени получена из исследований кругового дихроизма,которые имеют преимущество, заключающееся в том, что требуется лишь полипептид в чистом виде(тогда как дифракция ренгеновских лучей требует обеспечения кристаллического полипептида, а ЯМР требует обеспечения изотопных вариантов этого полипептида) для получения ценной информации о третичной структуре конкретной молекулы. Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и/или ЯМР являются необходимыми для получения окончательных данных, так как круговой дихроизм обеспечивает лишь косвенное доказательство правильной трехмерной структуры через информацию об элементах вторичной структуры. В одном из предпочтительных вариантов данного изобретения используются множественные представления В-лимфоцитарных эпитопов амилоидогенного полипептида (т.е. формулы I, где присутствует по меньшей мере один В-клеточный эпитоп в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными путями, например путем простого получения слитых полипептидов, содержащих структуру(амилоидогеннный полипептид)m, где m равно целому числу 2, и затем путем введения обсуждаемых здесь модификаций по меньшей мере в одну из последовательностей амилоида. Предпочтительно вводимые модификации включают в себя по меньшей мере одну дупликацию эпитопа В-лимфоцитов и/или введение гаптена. Эти варианты, включающие в себя множественное представление выбранных эпитопов, особенно предпочтительны в ситуациях, когда лишь небольшие части амилоидогенного полипептида применимы в качестве компонентов в вакцинном агенте. Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено введением по меньшей мере одной инсерции, одной добавки, одной делеции или замены аминокислоты. Конечно, нормальной ситуацией будет введение более чем одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции или замены полным Т-клеточным эпитопом), но важной задачей,которая должна быть достигнута, является то, что этот аналог при процессировании антигенпредставляющей клеткой (АРС) будет приводить к появлению такого чужеродного Т-клеточного эпитопа, представленного в контексте молекулы МНС Класса II, на поверхности АРС. Таким образом, если аминокислотная последовательность амилоидогенного полипептида в подходящем положении содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Тн-эпитопе, то введение чужеродного Тн-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот чужеродного эпитопа посредством аминокислотных инсерции, добавок, делеций и замен. Другими словами, введение полного Тн-эпитопа путем инсерции или замены не является обязательным для удовлетворения цели данного изобретения. Предпочтительно число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок равно по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерциям, заменам, добавкам или делециям. Кроме того, предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 150, например было не более 100, не более 90, не более 80 и не более 70. Особенно предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 60, и в частности, это число не должно превышать 50 или даже 40. Более предпочтительно это число не должно быть более 30. Что касается добавок аминокислот, следует отметить, что они, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, часто составляют число более 150. Предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Должно быть понятно, что иммунодоминирование Т-клеточного эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. В применении здесь, иммунодоминирование означает просто эпитопы, которые в вакцинированном животном/популяции индуцируют значимую иммунную реакцию, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме/одной популяции, не обязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже хотя он может быть способным связывать молекулы MHC-II в последнем индивидууме. Таким образом,для целей данного изобретения, иммунодоминантным Т-клеточным эпитопом является Т-клеточный эпитоп, который будет эффективным в обеспечении помощи Т-клеток в случае присутствия его в антигене. Обычно иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы имеют в качестве неотъемлемого признака то, что они будут, по существу, всегда представляться в связанном с молекулой МНС Класса II виде, независимо от полипептида, в котором они присутствуют. Другим важным моментом является вопрос о МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов. Обычно природно встречающиеся Т-клеточные эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с субпопуляцией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев применение одного специфического Т-клеточного эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который яв- 11008762 ляется эффективным только во фракции этой популяции, и в зависимости от размера этой фракции может быть необходимым включать больше Т-клеточных эпитопов в одну и ту же молекулу или альтернативно готовить многокомпонентную вакцину, в которой эти компоненты являются вариантами амилоидогенного полипептида, которые отличаются друг от друга характером введенного Т-клеточного эпитопа. Если МНС-рестрикция используемых Т-клеток является полностью неизвестной (например, в ситуации, где вакцинированное животное имеет слабо определенный состав МНС), фракция этой популяции, включаемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы: где pi означает частоту встречаемости в популяции респондеров на i-тый чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в вакцинной композиции, а n означает общее число чужеродных Т-клеточных эпитопов в этой вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоты встречаемости в популяции 0,8, 0,7 и 0,6 соответственно, будет иметь 1-0,20,30,4=0,976, т.е. 97,6% этой популяции будет статистически формировать МНС-IIопосредованную реакцию на эту вакцину. Приведенная выше формула неприменима в ситуациях, где известна более или менее точная картина МНС-рестрикции пептидов. Если, например, определенный пептид связывает только молекулы МНСII человека, кодируемые HLA-DR-аллелями DR1, DR3, DR5 и DR7, то использование этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы MHC-II, кодируемые HLA-DRаллелями, будет охватывать 100% в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывает только DR3 и DR5, добавление этого пептида вообще не будет увеличивать этот охват. Если основывать расчет реакции популяции только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в вакцине, фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы: где j является суммой частот встречаемости в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к j-тому из 3 известных HLA-локусов (DP, DR и DQ); на практике сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в данной вакцине, а после этого их вносят в списки по типу(DP, DR и DQ), затем индивидуальные частоты встречаемости этих находящихся в различных списках аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, получая посредством этого 1, 2 и 3. Может быть случай, когда величина pi в формуле II превышает соответствующую теоретическую величину рi где j является суммой частот встречаемости в популяции аллельного гаплотипа, кодирующего молекулы МНС, которые связывают Т-клеточный эпитоп с i-тым в данной вакцине и которые принадлежат к jтому из 3 известных HLA-локусов (DP, DR и DQ). Это означает, что в 1-pi этой популяции частота встречаемости респондеров fостаток-i=(pi-pi)/(1-pi). Таким образом, формула III может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу V где термин 1-остаток-i устанавливается на нуль, если он является отрицательным. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все элитопы были гаплотипами, картированными относительно идентичного набора гаплотипов. Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно включить все знание об этих эпитопах, которое является доступным: 1) частоту встречаемости респондеров в популяции относительно каждого эпитопа, 2) данные МНС-рестрикции и 3) частоту встречаемости в популяции релевантных гаплотипов. Существует ряд природно встречающихся смешанных Т-клеточных эпитопов, которые являются активными у большей части индивидуумов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в вакцину, уменьшая посредством этого необходимость в очень большом числе различных аналогов в одной и той же вакцине. Смешанным эпитопом может быть, в соответствии с данным изобретением, природно встречающийся Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитопы из столбнячного токсоида (например, эпитопы Р 2 и Р 30), дифтерийный токсоид, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и антиген CS P. falciparum. На протяжении ряда лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В- 12008762 частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую фракцию молекул HLADR, кодируемых различными аллелялми HLA-DR, и они все являются Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые в соответствии с данным изобретением. См. также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые включены тем самым в качестве ссылки здесь: WO 98/23635 (Frazeral., 1993, Cell 74: 197-203; и Falk K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. В последней ссылке также рассматриваются лиганды HLA-DQ и -DP. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, уместны в качестве природных эпитопов-кандидатов для использования в данном изобретении, как и эпитопы, которые имеют с ними общие мотивы. Альтернативно, этим эпитопом может быть любой синтетический Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую часть молекул МНС Класса II. В этом контексте, пан-DR-эпитопные пептиды ("PADRE"), описанные в WO 95/07707 и в соответствующей статье Alexander J. et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (оба описания включены здесь в качестве ссылки), являются представляющими интерес кандидатами для эпитопов для применения в соответствии с данным изобретением. Следует отметить,что большинство эффективных пептидов PADRE, описанных в этих статьях, несут D-аминокислоты на С- и N-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение прежде всего нацелено на включение подходящих эпитопов в качестве части модифицированного амилоидогенного полипептида, которая должна быть затем отщеплена ферментативно в лизосомном компартменте АРС для возможности презентации в контексте молекулы MHC-II, и, следовательно, нецелесообразно включатьD-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении. Одним особенно предпочтительным пептидом PADRE является пептид, имеющий аминокислотную последовательность AKFVAAWTLKAAA или ее иммунологически эффективную субпоследовательность. Этот эпитоп и другие эпитопы, имеющие то же самое отсутствие МНС-рестрикции, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах, используемых в способе данного изобретения. Такие суперсмешанные эпитопы сделают возможными наиболее простые варианты данного изобретения, в которых только единственный модифицированный амилоидогенный полипептид представляется иммунной системе вакцинированного животного. Как упоминалось выше, модификация амилоидогенного полипептида может также включать в себя введение первой части молекулы, которая нацеливает модифицированный амилоидогенный полипептид на АРС или В-лимфоцит. Например, первой частью молекулы может быть партнер специфического связывания для специфического поверхностного антигена В-лимфоцитов или АРС-специфического поверхностного антигена. Многие такие специфические поверхностные антигены известны в данной области. Например, эта часть молекулы может быть углеводом, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или АРС (например, маннаном или маннозой). Альтернативно, вторая часть молекулы может быть гаптеном. Фрагмент антитела, который специфически узнает поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах, может быть использован в качестве первой части молекулы (поверхностной молекулой может,например, быть FC-рецептор макрофагов и моноцитов, такой как FCRI, или, альтернативно любой другой специфический поверхностный маркер, такой как CD40 или CTLA-4). Следует отметить, что все приводимые в качестве примеров нацеливающие молекулы могут быть использованы в виде части адъюванта, см. ниже. В качестве альтернативы или дополнения к нацеливанию модифицированного амилоидогенного полипептида на определенный тип клеток для получения усиленной иммунной реакции, можно увеличить уровень отвечаемости иммунной системы путем включения вышеуказанной второй части молекулы, которая стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых частей молекулы являются цитокины и белки теплового шока или молекулярные шапероны, а также их эффективные части. Подходящими цитокинами для применения в соответствии с данным изобретением являются цитокины, которые будут обычно также функционировать в качестве адъювантов в вакцинной композиции,т.е., например, интерферон(IFN-), интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 4 (IL-4),интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL-13), интерлейкин 15 (IL-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); альтернативно, функциональная часть молекулы цитокина может быть достаточной в качестве второй части молекулы. В отношении применения таких цитокинов в качестве адъювантных веществ см. обсуждение ниже. Согласно данному изобретению подходящими белками теплового шока или молекулярными шаперонами, используемыми в качестве второй части молекулы, могут быть HSP70, HSP90, HSC70, GRP94(также известный как gp96, см. Wearsch P.A. et al., 1998, Biochemistry 37: 5709-19) и CRT (кальретикулин). Альтернативно, второй частью может быть токсин, такой как листериолицин (LLO), липид А и термолабильный энтеротоксин. Ряд микобактериальных производных, таких как MDP (мурамилдипелтид),CFA (полный адъювант Фрейнда) и диэфиры трегалозы TDM и TDE, также являются представляющими интерес возможностями.- 13008762 Возможность введения также третьей части молекулы, которая усиливает представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе, является важным вариантом данного изобретения. В данной области было показано несколько примеров этого принципа. Например, известно,что якорь пальмитоиллипидирования в белке OspA Borrelia burgdorferi может быть использован таким образом, чтобы обеспечить самоадъювантные полипептиды (см., например, WO 96/40718), по-видимому,липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с центральной частью, состоящей из якорных частей липидирования полипептидов, и остальными частями молекулы, выступающими из нее,что приводит к множественным представлениям антигенных детерминант. Таким образом, применение этого и родственных подходов с использованием различных якорей липидирования (например, миристильной группы, миристильной группы, фарнезильной группы, геранил-геранильной группы, GPI-якоря и N-ацилдиглицеридной группы) являются предпочтительными вариантами данного изобретения, в частности, поскольку обеспечение такого якоря липидирования в рекомбинантно полученном белке является довольно простым и требует лишь применения, например, природно встречающейся сигнальной последовательности в качестве партнера слияния для модифицированного амилоидогенного полипептида. Другой возможностью является применение С 3d-фрагмента фактора комплемента С 3 или самого фактора С 3 (см. Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 и Lou and Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462). Альтернативным вариантом данного изобретения, который также приводит к предпочтительной презентации множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных районов эпитопов амилоидогенного полипептида иммунной системе, является ковалентное связывание амилоидогенного полипептида, его субпоследовательности или вариантов с определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например углеводы, такие как декстран, см., например, Lees A. et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. et al., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, но применимой альтернативой являются также манноза и маннан. Интегральные мембранные белки, например, из Е. coli и других бактерий,также являются применимыми партнерами конъюгации. Обычные молекулы-носители, такие как гемоцианин фиссуреллы (KLH), столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (БСА) также являются предпочтительными и применимыми партнерами конъюгации. Предпочтительные варианты ковалентного связывания амилоидогенного полипептида с полигидроксиполимерами, такими как углеводы, включают в себя применение по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида и по меньшей мере одного чужеродного Т-хелперного эпитопа, которые связывают по отдельности с полигидроксиполимером (т.е. чужеродный Т-хелперный эпитоп и амилоидогенный полипептид не сливают друг с другом, а связывают с полигидроксиполимером, который затем служит в качестве остова-носителя). Опять же, такой вариант является наиболее предпочтительным, когда подходящие несущие В-клеточные эпитопы районы амилоидогенного полипептида состоят из коротких пептидных отрезков, это связано с тем, что такой подход очень удобен для получения множественных представлений выбранных эпитопов в полученном иммуногенном агенте. Особенно предпочтительно, что связывание чужеродного Т-хелперного эпитопа и амилоидогенного(поли)пептида осуществляется посредством амидной связи, которая может расщепляться пептидазой. Эта стратегия имеет такой результат, что АРС будут способны поглощать этот конъюгат и одновременно будут способны процессировать конъюгат и затем представлять чужеродный Т-клеточный эпитоп в контексте МНС Класса II. Одним из способов достижения связывания пептидов (как амилоидогенного полипептида, так и чужеродного эпитопа) является активация подходящего полигидроксиполимера трезильными группами; можно, например, приготовить трезилированные полисахариды, как описано в WO 00/05316 и в патенте США US 5874469 (оба включены в качестве ссылки здесь), и связать их с амилоидогенными пептидами и Т-клеточными эпитопами, полученными посредством способов общепринятого твердофазного пептидного синтеза или синтеза пептидов в жидкой фазе. Полученный продукт состоит из полигидроксиполимерного остова (например, декстранового остова), который имеет прикрепленные к нему их N-концами или другими доступными азотсодержащими частями молекул амилоидогенные полипептиды и чужеродные Т-клеточные эпитопы. Если желательно, можно синтезировать амилоидогенные полипептиды таким образом, чтобы защитить все доступные аминогруппы, кроме одной на N-конце, затем связать полученные защищенные пептиды с трезилированной декстрановой частью и, наконец, удалить защитные группы полученного конъюгата. Конкретный пример этого подхода описан в примерах ниже. Вместо применения водорастворимых полисахаридных молекул, как описано в WO 00/05316 и патенте США US 5874469, равным образом можно использовать поперечносшитые полисахаридные молекулы, получая тем самым состоящий из частиц конъюгат между полипептидами и полисахаридом, считается, что это приводит к улучшенной презентации иммунной системе полипептидов, так как достигаются две задачи, а именно, получение эффекта локального депонирования при инъекции этого конъюгата и получение частиц, которые являются притягательными мишенями для АРС. Подход использования такой состоящей из частиц системы также подробно описан в примерах. Рассмотрениями, лежащими в основе выбранных областей введения модификаций в амилоидогенных полипептидах, являются: а) сохранение известных и прогнозируемых В-клеточных эпитопов, b) со- 14008762 хранение третичной структуры, с) избегание В-клеточных эпитопов, присутствующих на клеткахпродуцентах и т.д. Во всяком случае, как обсуждалось выше, довольно легко подвергнуть скринингу набор модифицированных амилоидогенных молекул, все из которых были подвергнуты введению Тклеточного эпитопа в различных положениях. Поскольку наиболее предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя супрессию А человека, следовательно, предпочтительно, чтобы обсуждаемый выше амилоидный полипептид был полипептидом А человека. В этом варианте особенно предпочтительно, чтобы амилоидогенный полипептид человека был модифицирован заменой по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в SEQ ID NO:2 по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины и содержащей Тн-эпитоп. Предпочтительные примеры модифицированных амилоидогенных АРР и А показаны схематически на чертеже с использованием эпитопов Р 2 и Р 30 в качестве примеров. Обоснование таких конструкциий обсуждается подробно в этом примере. Более конкретно, Тн, содержащий (или дополняющий) аминокислотную последовательность, которую вводят в SEQ ID NO:2, может быть введен в положении любой аминокислоты в SEQ ID NO:2. То есть введение возможно после любой из аминокислот 1-770, но предпочтительно после любой из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691,692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в SEQ ID NO:2. Это может комбинироваться с делецией любой из или всех аминокислот 1-671 или любой из или всех аминокислот 715-770. Кроме того, при использовании способа замены, любая из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690,691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712,713 и 714 в SEQ ID NO:2 может быть делетирована в комбинации с этим введением. Приготовление амилоидогенного полипептида и модифицированных амилоидогенных полипептидов При выполнении представления амилоидогенного полипептида или модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе животного посредством его введения животному приготовление этого полипептида соответствует принципам, обычно признаваемым в данной области. Приготовление вакцин, которые содержатпептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как иллюстрируется приведенными в качестве примеров патентами США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые включены здесь в качестве ссылки. Обычно такие вакцины готовят в виде инъекционных материалов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН агенты или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже. Вакцины обычно вводят парентерально, путем инъекции, например подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, подъязычные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные композиции. Для суппозиториев обычные связывающие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые наполнители, как, например, фармацевтически чистый маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером композиции является холерный токсин (он является также возможным партнером конъюгации). Полипептиды могут быть приготовлены в форме вакцины в виде нейтральной или солевой форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами пептида), которые образованы с неорганическими кислотами, такими, например,как хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или с такими органическими кислотами как уксусная,щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами,могут быть также получены из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа (III), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п. Вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от субъекта,- 15008762 проходящего лечение, в том числе, например, способности иммунной системы индивидуума осуществлять иммунную реакцию и степени желаемой защиты. Подходящими диапазонами доз являются дозы порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на одну вакцинацию с предпочтительным диапазоном приблизительно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматриваются даже более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне приблизительно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг, и в частности в диапазоне приблизительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для первоначального введения и бустерных инъекций также являются вариабельными, но обычно предусматривают первоначальное введение с последующими инокуляциями или иными введениями. Способ введения может широко варьироваться. Любые из общепринятых способов введения вакцины являются применимыми. Они включают в себя пероральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, посредством инъекции или т.п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет меняться в соответствии с возрастом лица, которое должно вакцинироваться, и композиции антигена. Некоторые полипептиды данной вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунная реакция усиливается, если вакцина дополнительно содержит адъювантное вещество. Различные способы получения адъювантного действия этой вакцины являются известными. Общие принципы и способы подробно описаны в "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley and Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, а также в "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-30645283-9, включенных здесь в качестве ссылки. Особенно предпочтительно использование адъюванта, который, как можно продемонстрировать,облегчает разрушение аутотолерантности к аутологичным антигенам; действительно, это является существенным в случаях, когда немодифицированный амилоидогенный полипептид используют в качестве активного ингредиента в аутовакцине. Неограничительные примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из иммунонацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллы адъюванта; сапонина; матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикса ISCOM); частицы; DDA; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; -инулина; и инкапсулирующего адъюванта. В общем следует отметить, что приведенное выше описание, относящееся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в аналогах, относится также, при соответствующих изменениях, к их применению в адъюванте вакцины согласно изобретению. Применения адъювантов включают в себя применение таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1% раствора в забуференном солевом растворе,смесей с синтетическими полимерами сахаров (например, Карбопол), применяемых в виде 0,25% раствора, возможными являются агрегирование белка в вакцине путем тепловой обработки при температурах между 70 и 101 С в течение периода 30 с-2 мин соответственно, а также агрегации с использованием сшивающих агентов. Могут также использоваться агрегация посредством повторной активации обработанными пепсином антителами (Fab-фрагментами) с альбумином, смесь с бактериальными клетками,такими как С. parvum, или эндотоксинами, или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Aracel A), или эмульсия с 20% раствором перфторуглерода (Fluosol-DA), используемого в качестве заменителя блока. Смесь с маслами, такими как аквален и IFA, также является предпочтительной. Согласно изобретению DDA (диметилдиоктадециламмонийбромид) является перспективным кандидатом в качестве адъюванта, так же как ДНК и -инулин, но также большой интерес представляют полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины Quillaja, такие как QuilA и QS21, а такжеRIBI. Возможно также применение монофосфориллипида A (MPL), вышеупомянутых С 3 и C3d и мурамилдипептида (МБР). Известно также, что липосомные композиции придают адъювантные свойства, и, следовательно,липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением. Согласно данному изобретению предпочтительными являются также адъюванты типа матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикс ISCOM), в частности, потому, что было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать экспрессию МНС Класса II клетками АРС. Матрикс ISCOM состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из Quillaja saponaria, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция представляет собой то, что называют частицей ISCOM, где сапонин составляет 60-70% (масса/масса), холестерин и фосфолипид 10-15% (масса/масса) и белок 10-15% (масса/масса). Подробности, касающиеся состава и применения иммуностимулирующих комплексов, могут быть,например, найдены в вышеупомянутых руководствах по адъювантам, но также Morein В. et al., 1995,- 16008762(включенных здесь в качестве ссылки) обеспечивают полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов. Другой крайне интересной (и, следовательно, предпочтительной) возможностью получения адъювантного действия является применение способа, описанного в Gosselin et al., 1992 (включенной здесь в качестве ссылки). Вкратце, представление подходящего антигена, такого как антиген согласно изобретению, может быть усилено путем конъюгации этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Fc-рецепторов на моноцитах/макрофагах. Было показано, в частности, что конъюгаты между антигеном и анти- FcRI усиливают иммуногенность для целей вакцинации. Другие возможности включают в себя применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (кроме прочего, цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой, второй и третьей частей в модифицированных версиях амилоидогенных полипептидов. В этой связи, синтетические индукторы цитокинов, такие как поли I:С, также являются возможными вариантами. Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида,полного адъюванта Фрейнда, RIBI и диэфира трегалозы, такого как TDM и TDE. Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда CD40 и антител CD40 или их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, Fabфрагмента и CTLA-4. Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера, такого как латекс, например латексные гранулы. Еще одним интересным способом модуляции иммунной реакции является включение иммуногена(необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в виртуальный лимфатический узел (VLN) (запатентованное медицинское устройство, разработанноеImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (тонкотрубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Путем введения VLN под кожу создается сайт стерильного воспаления с увеличением количества цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АРС быстро отвечают на сигналы опасности, перемещаются в сайт воспаления и накапливаются в пористом матриксе VLN. Было показано, что необходимая доза антигена, требующаяся для осуществления иммунной реакции на антиген, снижается с использованием VLN и что иммунная защита, сообщаемая вакцинацией с использованием VLN, превосходит общепринятую иммунизацию с использованием RIBI в качестве адъюванта. Способ, помимо прочего, описан вкратце у Gelber С. et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogen Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinik, Book of Abstracts, October 12th-15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California". Было показано, что состоящая из микрочастиц композиция во многих случаях увеличивает иммуногенность белковых антигенов и является, следовательно, следующим предпочтительным вариантом данного изобретения. Микрочастицы либо готовят в виде совместных композиций антигенов с полимером,липидом, углеводом или другими молекулами, пригодными для приготовления частиц, либо микрочастицы могут быть гомогенными частицами, состоящими только из самого антигена. Примерами микрочастиц на основе полимеров являются частицы на основе PLGA и PVP (Gupta,R.K. et al. 1998), где полимер и антиген конденсированы в твердую частицу. Частицы на основе липидов могут быть приготовлены в виде мицелл липида (так называемых липосом), заключающих антиген в мицелле (Pietrobon, P.J. 1995). Частицы на основе углеводов обычно готовят из подходящего деградируемого углевода, такого как крахмал или хитозан. Углевод и антиген смешивают и конденсируют в частицы в способе, сходном со способом, используемым для полимерных частиц (Kas H.S. et al. 1997). Частицы, состоящие только из антигена, могут быть приготовлены различными способами распыления и лиофилизации. В частности, для целей данного изобретения пригоден способ с жидкостью в надкритическом состоянии, который используют для получения очень однородных частиц контролируемого размера (York, Р. 1999 and Shekunov, В. et al. 1999). Ожидается, что вакцина должна вводиться 1-6 раз в год, например 1, 3, 3, 4, 6 или 6 раз в год, индивидууму, нуждающемуся в этом. Ранее было показано, что иммунная память, индуцированная применением предпочтительных аутологичных вакцин в соответствии с данным изобретением, не является перманентной, и следовательно, иммунная система нуждается в периодической стимуляции амилоидогенным полипептидом или модифицированными амилоидогенными полипептидами. Вследствие генетической изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать посредством иммунных реакций различной силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина в соответствии с данным изобретением может содержать несколько различных полипептидов, для того чтобы усиливать иммунную реакцию, см. также обсуждение, приведенное выше, касающееся выбора введения чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцина может содержать два или несколько полипептидов, где все эти полипептиды являются такими, как описанные выше.- 17008762 Вакцина может, следовательно, содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных полипептидов. Вакцинация нуклеиновыми кислотами В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе пептидов, технология вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известная как иммунизация нуклеиновыми кислотами, генетическая иммунизация и генная иммунизация) предоставляет ряд привлекательных признаков. Во-первых, в противоположность традиционному подходу к вакцинам, вакцинация нуклеиновыми кислотами не требует ресурсопотребляющего крупномасштабного производства иммуногенного агента(например, в форме ферментации промышленного масштаба микроорганизмов, продуцирующих модифицированные амилоидогенные полипептиды). Кроме того, нет необходимости очистки устройства и схем повторной упаковки (рефолдинга) иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основана на биохимическом аппарате вакцинированного индивидума для продуцирования продукта экспрессии введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что происходит оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, так как, как упоминалось выше, значительная фракция оригинальных В-клеточных эпитопов должна быть сохранена в модифицированной молекуле и так как В-клеточные эпитопы в принципе могут быть составлены частями любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, природные картины гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть очень важны для общей иммуногенности, и это наилучшим образом обеспечивается наличием хозяина, продуцирующего иммуноген. Таким образом, предпочтительный вариант данного изобретения предусматривает осуществление представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей модифицированный амилоидогенный полипептид, в клетки животного и получения посредством этого экспрессии in vivo клетками введенной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот). В этом варианте введенной нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может быть в форме "голой" ДНК, ДНК, приготовленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК,приготовленной в липосомах, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, приготовленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, приготовленной с осаждающими кальций агентами,ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимере, например, вPLGA (см. способ микроинкапсулирования, описанный в WO 98/31398), или в хитине или хитозане, и ДНК, приготовленной с адъювантом. В этом контексте, следует отметить, что практически все соображения, относящиеся к применению адъювантов в традиционной вакцинной композиции, применимы также в отношении композиции ДНК-вакцин. Таким образом, все описания здесь, которые относятся к применению адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, применимы, при соответствующих изменениях, к их использованию в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами. Что касается способов введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, они применимы также для вакцин на основе нуклеиновых кислот данного изобретения, и все обсуждения, приведенные выше, относящиеся к способам введения и схемам введения для полипептидов, применимы, с соответствующими изменениями, к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть удобным образом введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины нуклеиновых кислот могут вводиться с использованием так называемого генного пистолета, и следовательно,также и этот, и эквивалентные варианты введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что применение VLN при введении нуклеиновых кислот дает хорошие результаты, и, следовательно, этот конкретный вариант введения является особенно предпочтительным. Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать районы, кодирующие первую, вторую и/или третью части молекулы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегается то, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента, но это является менее предпочтительным вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии при наличии обоих кодирующих районов, включенных в одну и ту же молекулу. Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против амилоидогенного полипептида, причем эта композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения (см. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант,обсуждаемые выше. При обычных обстоятельствах кодирующую вариант нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора,- 18008762 в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробных обсуждений векторов данного изобретения см. обсуждение ниже. Подробные описания, относящиеся к приготовлению и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, являются также доступными, см.Donelly J.J. et al. 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 и Donelly J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Обе эти работы включены здесь в качестве ссылки. Живые вакцины Третьей альтернативой для выполнения представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе является применение технологии живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами представление иммунной системе выполняют путем введения животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим амилоидогенный полипептид, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим аттенюированным бактериальным штаммом (аттенюированным посредством пассирования или посредством удаления продуктов экспрессии патогена технологией рекомбинантных ДНК), например, Mycobacterium bovis BCG., непатогеннымиStreptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, и т.д. Обзоры, рассматривающие приготовление живых вакцин существующего уровня техники, могут быть найдены, например, в Saliou P.,1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 и Walker P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, обе работы включены здесь в качестве ссылки. В отношении подробностей о фрагментах нуклеиновых кислот и векторах, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже. В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в содержащую невирулентный вирус вакцину,например штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус (вирус оспы). Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному только один раз, но в некоторых случаях может быть необходимым введение этого микроорганизма более одного раза, в течение жизни для поддержания защитного иммунитета. Предполагается даже, что при использовании живой или вирусной вакцин будут применимы схемы иммунизации, аналогичные описанным подробно выше для полипептидной вакцинации. Альтернативно, живую или вирусную вакцинацию комбинируют с предварительной или последующей вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновыми кислотами. Например, можно выполнять первичную вакцинацию живой или вирусной вакциной с последующими бустерными иммунизациями с использованием такого же подхода, как с полипептидом или нуклеиновой кислотой. Микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащей районы, кодирующие первую, вторую или третью части молекулы, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегают того, что аналог или эпитопы продуцируются в виде партнеров слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие первой, и/или второй, и/или третьей частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечивать в качестве продукта экспрессии аналог данного изобретения, и такой вариант является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением. Применение способа данного изобретения в лечении заболеваний Как должно быть понятно из приведенного выше обсуждения, обеспечение способов данного изобретения позволяет осуществлять контроль над заболеваниями, характеризующимися амилодными отложениями. В данном контексте, БА является ключевой мишенью для способа данного изобретения, но также и другие болезни, характеризующиеся отложениями амилоида, являются возможными мишенями. Таким образом, важный вариант способа данного изобретения для супрессии активности амилоида предусматривает лечение, и/или предупреждение, и/или ослабление БА или других заболеваний, характеризующихся отложениями амилоида, причем данный способ предусматривает супрессию данного изобретения до такой степени, чтобы количество амилоида значимо уменьшалось. Особенно предпочтительно, чтобы уменьшение амилоида приводило к инверсии баланса между образованием амилоида и деградацией/удалением амилоида, т.е. чтобы скорость деградации/удаления амилоида была доведена до скорости, превышающей скорость образования амилоида. Посредством тщательной регуляции числа и иммунологического влияния иммунизации индивидуума, нуждающегося в этом, можно будет получить баланс во времени, что приводит к уменьшению амилоидных отложений без избыточных вредных эффектов. Альтернативно, если у индивидуума способ данного изобретения не может удалять или уменьшать существующие отложения амилоида, способ данного изобретения может быть использован для получения клинически значимого уменьшения образования новых амилоидных отложений, с пролонгированием тем самым периода, в течение которого состояние болезни не ухудшается. Можно было бы осуществлять мониторинг скорости отложения амилоида либо путем измерения концентрации амилоида в сыворотке(которая, как считается, находится в равновесии с депонируемым материалом), либо путем применения сканирования с использованием позитронной эмиссионной томографии (PET), см. Small G.W., et al.,1996, Ann N. Y. Acad Sci 802: 70-78. Другие заболевания и состояния, где средства и способы данного изобретения могут быть использованы в лечении или ослаблении заболевания аналогичным образом, были упомянуты выше в Предпосылках изобретения (системный амилоидоз, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, лобно-височная деменция и связанные с прионами трансмиссивные губчатые энцефалопатии) или перечислены ниже в разделе, озаглавленном другие связанные с амилоидом заболевания и белки, ассоциированные с ними. Пептиды, полипептиды и композиции данного изобретения Как будет очевидно из приведенной выше информации, данное изобретение основано на концепции иммунизации индивидуумов против амилоидогенного антигена для получения уменьшенного количества связанных с патологией отложений амилоида. Предпочтительным путем получения такой иммунизации является применение модифицированных версий амилоидогенного полипептида, с получением тем самым молекул, которые не были описаны ранее в данной области. Считается, что модифицированные молекулы, обсуждаемые здесь, являются патентноспособными сами по себе, и, следовательно, важная часть данного изобретения относится к аналогу, который получен из амилоидогенного полипептида животного, в который введена модификация, что приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител, специфически реагирующих с немодифицированным амилоидогенным полипептидом. Предпочтительно, характер этой модификации соответствует типам модификаций, описанных выше при обсуждении различных вариантов способа данного изобретения с использованием модифицированного амилоидогенного полипептида. Таким образом,любое описание, представленное здесь, относится к амилоидогенным молекулам, имеющим отношение к цели описания амилоидогенных аналогов данного изобретения, и любое из таких описаний относится, с соответствующими изменениями, к описанию этих аналогов. Следует отметить, что предпочтительные модифицированные амилоидогенные молекулы содержат модификации, которые приводят к образованию полипептида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 70% с амилоидогенным белком или с его субпоследовательностью длиной по меньшей мере в 10 аминокислот. Более высокая степень идентичности последовательностей является предпочтительной, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%. Идентичность последовательностей белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как(Nref - Ndif)100/Nref, где Ndif означает общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при их сопоставлении и где Nref означает число остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК AGTCAGTC будет на 75% идентична последовательности ААТСААТС (Ndif = 2 и Nref = 8). Данное изобретение относится также к композициям, применимым в использовании на практике способа данного изобретения. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество амилоидогенного полипептида, который является аутологичным белком у животного, причем указанный амилоидогенный полипептид готовят вместе с иммунологически приемлемым адъювантом таким образом, чтобы разрушить аутотолерантность животного в отношении этого амилоидогенного полипептида, причем эта композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент. Другими словами, эта часть данного изобретения относится к композициям природно встречающихся амилоидогенных полипептидов, которые описаны в связи с вариантами способа данного изобретения. Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть изобретения относится к композициям модифицированного амилоидогенного полипептида, по существу, описанного выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей находится в соответствии с тем, что обсуждалось выше при описании композиции модифицированного и немодифицированного амилоидогенного полипептида для применения в способе данного изобретения для супрессии амилоида. Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных генов, включающей в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессию клеткой-хозяином этой последовательности нуклеиновой кислоты, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующую очистку и необязательную дополнительную модификацию, например, повторную упаковку (рефолдинг) или дериватизацию. Более короткие пептиды предпочтительно получают с использованием хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. Однако недавний прогресс в этой технологии дал- 20008762 возможность получения полноразмерных полипептидов и белков при помощи этих способов, и, следовательно, получение более длинных конструкций синтетическими способами находится в рамках данного изобретения. Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению Из приведенного выше описания должно быть понятно, что модифицированные амилоидогенные полипептиды могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных генов, но также при помощи химического синтеза или полухимического синтеза; две последние возможности особенно уместны,когда модификация состоит в связывании белковых носителей (таких как KLH, дифтерийный токсоид,столбнячный токсоид и БСА) и небелковых молекул, таких как углеводные полимеры, и, конечно, также тогда, когда модификация предусматривает добавление боковых цепей или боковых групп к произведенной из амилоидогенного полипептида-пептидной цепи. Для цели технологии рекомбинантных генов и, конечно, также для цели иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный амилоидогенный полипептид, являются важными химическими продуктами. Таким образом, важная часть данного изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует аналог амилоидогенного полипептида, т.е. произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, который либо содержит природную последовательность, к которой был добавлен или в которую был вставлен партнер слияния, либо, предпочтительно, произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, где чужеродный Тклеточный эпитоп был введен посредством инсерции и/или добавки, предпочтительно посредством замены и/или делеции. Фрагментами нуклеиновых кислот согласно изобретению являются либо ДНК-,либо РНК-фрагменты. Фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению обычно должны встраиваться в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению; такие новые векторы также являются частью данного изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов согласно изобретению, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Векторы в зависимости от цели и типа применения могут быть представлены в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но также и голая ДНК, которая экспрессируется только временно в некоторых клетках, является важным вектором. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, делая таким образом возможным получение большого числа копий для целей экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования. В общих чертах вектор согласно изобретению содержит следующие признаки в направлении 5'3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид,делающий возможной секрецию (во внеклеточную фазу или, где это применимо, в периплазму) из мембраны или интеграцию в мембрану фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы этот вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, которые должны использоваться для осуществления экспрессии in vivo у животного (т.е. при применении вектора в ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы вектор был неспособен интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют "голую" ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых является хорошо известным специалистам в данной области. Векторы согласно изобретению используют для трансформации клеток-хозяев для получения модифицированного амилоидогенного полипептида согласно изобретению. Такими трансформированными клетками, которые являются также частью согласно изобретению, могут быть культивируемые клетки или клеточные линии, используемые для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно изобретению или используемые для рекомбинантного получения модифицированных амилоидогенных полипептидов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированными клетками могут быть живые вакцинные штаммы, в которых фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная копия или множественные копии) был встроен таким образом, чтобы производить секрецию из бактериальной мембраны или клеточной стенки или интеграцию в бактериальную мембрану или клеточную стенку модифицированного амилоидогенного полипептида. Предпочтительными трансформированными клетками согласно изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (например, вида Escherichia [например, Е. coli], Bacillus [например, Bacillussubtilis], Salmonella или Mycobacterium [предпочтительно непатогенная, например, М. bovis BCG]),дрожжи (такие как Saccharomyces cerevisiae) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такого как гриб, клетка насекомого, клетка растения или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные у человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты показали большую перспективность применения коммерчески доступной линии клеток Dro- 21008762sophila melanogaster (линии клеток Шнайдера 2 (S2) и векторной системы, доступной из Invitrogen) для рекомбинантного продуцирования полипептидов в лаборатории заявителей, и, следовательно, эта экспрессионная система является особенно предпочтительной. Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительно полезными вариантами согласно изобретению; они могут быть использованы для получения малого масштаба или крупномасштабного получения модифицированного амилоидогенного полипептида или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине. При получении модифицированных молекул согласно изобретению с использованием трансформированных клеток удобно, хотя и совершенно необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо переносился на поверхность трансформированной клетки. После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно создать на ее основе стабильную клеточную линию, которая несет вектор согласно изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный амилоидогенный полипептид. Предпочтительно, когда эта стабильная линия секретирует или несет аналог согласно изобретению, что облегчает его очистку. Обычно плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые были получены из видов, совместимых с клеткой-хозяином, используют в комбинации с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, Е. coli обычно трансформируют с использованием pBR322, плазмиды, полученной из вида Е. coli (см., например, Bolivar et al.,1977). Плазмида pBR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно,обеспечивает легкий способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR, или другая микробная плазмида или фаг, должны содержать также - или должны быть модифицированы, чтобы содержать - промоторы, которые могут быть использованы прокариотическим микроорганизмом для экспрессии. Эти промоторы, наиболее часто используемые в конструировании рекомбинантных ДНК, включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Chang et al., 1978; Itakura et al.,1977; Goeddel et al., 1979) и промоторную систему триптофана (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Хотя эти системы являются наиболее часто используемыми, другие микробные промоторы были обнаружены и использованы, и подробности их нуклеотидных последовательностей были опубликованы, что позволяет специалисту в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами(Siebwenlist et al., 1980). Некоторые гены из прокариот могут быть экспрессированы эффективно в Е. coli от их собственных промоторных последовательностей, что устраняет необходимость добавления другого промотора искусственными способами. Кроме прокариот могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промотор должен быть способен запускать экспрессию. Saccharomyces cerevisiae, или обычные хлебопекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя доступными обычно являются ряд других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces обычно используют, например, плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemperet al., 1980). Эта плазмида уже содержит ген trp1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, не способного расти в триптофане, например, АЕСС No. 44076 или РЕР 4-1 (Jones,1977). Присутствие повреждения trp1 в качестве характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для обнаружения трансформации по росту в отсутствие триптофана. Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Hitzman et al., 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al.,1968; Holland et al., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации связывают с этими генами и также лигируют в экспрессирующий вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации. Другими промоторами, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями выращивания, являются промоторный район для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с азотным метаболизмом, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, точку начала репликации и последовательности терминации, является подходящим. Кроме микроорганизмов, культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов, могут также использоваться в качестве хозяев. В принципе, любая такая культура является работающей, является- 22008762 ли она культурой клеток из позвоночных животных или культурой клеток беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре(культуре ткани) стало рутинной процедурой в последние годы (Tissue Culture, 1973). Примерами таких применимых линий клеток-хозяев являются клетки VERO и HeLa, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и W138, ВНК, CОS-7 293, клетки Spodoptera frugiperda (SF) (коммерчески доступные в виде полных экспрессионных систем из inter alia Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450,U.S.A. и из Invitrogen), и линии клеток MDCK. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является S2, доступная из Invitrogen, РО Box 2312, 9704 СН Groningen, The Netherlands. Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если это необходимо) начало репликации, промотор, расположенный перед экспрессируемым геном, вместе с любыми необходимыми сайтами связывания рибосом, сайтами сплайсинга РНК, сайтом полиаденилирования и последовательностью терминатора транскрипции. Для применения в клетках млекопитающих регуляторные функции на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, Аденовируса 2, и наиболее часто - из обезьяньего вируса 40 (SV40). Ранний и поздний промоторы вируса SV40 являются особенно применимыми, так как оба их можно получить легко из вируса в виде фрагмента, который содержит также начало репликации из вируса SV40 (Fiers et al., 1978). Могут быть также использованы меньшие или большие фрагменты SV40, при условии, что включена последовательность длиной приблизительно 250 п.н., простирающаяся от сайта HindIII в направлении сайта BglI,локализованного в вирусном начале репликации (ориджин). Кроме того, можно также, и часто желательно, использовать промотор или регуляторные последовательности, обычно связанные с желаемой последовательностью гена, при условии, что такие регуляторные последовательности являются совместимыми с системой клеток-хозяев. Начало репликации может быть обеспечено либо конструкцией вектора для включения экзогенного начала репликации, которое, например, может быть получено из SV40 или другого вируса (например,полиомы, аденовируса, VSV, BPV) или может быть обеспечено механизмом репликации хромосом клетки-хозяина. Если вектор интегрируется в хромосому клетки-хозяина, последний механизм часто является достаточным. Идентификация применимых аналогов Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что не все возможные варианты или модификации природно встречающихся амилоидогенных полипептидов будут способны индуцировать антитела у животного, которые являются перекрестно-реактивными с природной формой. Однако трудно создать эффективный стандартный скрининг для модифицированных амилоидогенных молекул,которые удовлетворяют минимальным требованиям для обсуждаемой здесь иммунологической реактивности. Таким образом, другая часть согласно изобретению относится к способу идентификации модифицированного амилоидогенного полипептида, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированным амилоидогенным полипептидом является (неиммуногенный) аутологичный белок, причем этот способ предусматривает получение при помощи пептидного синтеза или способов генной инженерии набора взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов, в которых аминокислоты были добавлены к аминокислотной последовательности, вставлены в аминокислотную последовательность, делетированы из аминокислотной последовательности или заменены в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида вида животного, что приводит к появлению аминокислотных последовательностей в этом наборе, которые содержат Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для данного вида животного, или получение набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих этот набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов,тестирование членов этого набора модифицированных амилоидогеных полипептидов или фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать продуцирование антител животным данного вида против немодифицированного амилоидогенного полипептида, и идентификацию и необязательно выделение члена (членов) набора модифицированных амилоидогенных полипептидов, который (которые) значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у данного вида, или идентификацию и необязательно выделение продуктов экспрессии, кодируемых членами набора фрагментов нуклеиновых кислот, которые значимо индуцируют продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у животного данного вида. В этом контексте, "набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов" является коллекцией неидентичных модифицированных амилоидогенных полипептидов, которые были, например, отобраны на основе обсуждаемых выше критериев (например, в сочетании с исследованиями кругового дихроизма, ЯМР-спектров и/или картин дифракции рентгеновских лучей (порошковых рентгенограмм. Этот набор может состоять лишь из небольшого числа членов, но предполагается, что этот набор может содержать несколько сотен членов.- 23008762 Тестирование членов набора может выполняться в конечном счете in vivo, но может быть применен ряд тестов in vitro, которые сузят число модифицированных молекул, которые будут служить цели согласно изобретению. Поскольку задачей введения чужеродных Т-клеточных эпитопов является поддержание Вклеточного ответа при помощи Т-клеток, необходимым требованием является, что пролиферация Тклеток индуцируется модифицированным амилоидогенным полипептидом. Пролиферация Т-клеток может тестироваться стандартизированными тестами пролиферации in vitro. Вкратце, пробу, обогащенную Т-клетками, получают у субъекта и затем поддерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки контактируют с АРС субъекта, которые предварительно поглощали модифицированную молекулу и процессировали ее для представления ее Т-клеточным эпитопам. Пролиферацию Т-клеток подвергают мониторингу и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетками в культуре, контактированной с АРС, которая процессировала интактный, нативный амилоидогенный полипептид). Альтернативно, пролиферация может быть измерена путем определения концентрации релевантных цитокинов, высвобождаемых Т-клетками в ответ на узнавание или чужеродных Т-клеток. После создания высокой вероятности того, что по меньшей мере один амилоидогенный полипептид набора каждого типа способен индуцировать продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, можно приготовить иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один модифицированный амилоидный полипептид, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированный амилоидогенный полипептид является аутологичным белком, причем этот способ предусматривает смешивание члена(членов) набора, который значимо индуцирует продуцирование антител у вида животного, которые являются реактивными с амилоидогенным полипептидом, с фармацевтически или иммунологически приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или формообразующим агентом (эксципиентом) необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом. Описанные выше аспекты согласно изобретению, относящиеся к наборам полипептидов, удобно использовать с первоначальным приготовлением ряда взаимно отличающихся последовательностей нуклеиновых кислот или векторов согласно изобретению, встраиванием их в подходящие экспрессирующие векторы, трансформацией подходящих клеток-хозяев (или животных-хозяев) этими векторами и выполнением экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот согласно изобретению. Эти стадии могут сопровождаться выделением продуктов экспрессии. Предпочтительно получать последовательности нуклеиновых кислот и/или векторы способами, включающими в себя использование способа молекулярной амплификации, такого как ПЦР, или использование синтеза нуклеиновых кислот. Специфические амилоидогенные мишени Кроме белков, наиболее часто ассоциированных с болезнью Альцгеймера, АРР, АроЕ 4 и Тau, имеется длинный перечень других белков, которые так или иначе были связаны с БА, либо по их прямому присутствию в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА, либо по их очевидной генетической ассоциации с увеличенным риском развития БА. Большинство, если не все, из этих антигенов являются,наряду с обсуждаемыми выше А, АРР, пресенилином и АроЕ, возможными белками-мишенями согласно изобретению. Альфа 1-антихимотрипсин (ACT) является основным компонентом SP, и предполагается, что он играет важную роль в патогенезе повреждений при БА и цереброваскулярном амилоидозе (СА) (Acta neuropathol, 1998, 96: 628-36). Он взаимодействует с А in vitro и стимулирует как образование, так и разрушени фибрилл А-42 (JBC, 1998, 273: 28360-4). Альфа 2-макроглобулин был обнаружен по иммуноокрашиванию в центральных частях бляшек в головном мозге пациентов с БА. Трансмембранный фрагмент из бета-субъединицы был обнаружен в центральных частях бляшек, тогда как растворимый альфа-фрагмент был обнаружен внеклеточно в бляшках. Acta neuropathol, 1998, 96: 628-36 и Brain Res., 1997, 777: 223-227.ABAD (A-пептидсвязывающая алкогольдегидрогеназа) связывается с А в клетке. Она является нейронным ферментом, присутствующим в нормальных клетках, но сверхэкспрессирующимся в нейронах, пораженных БА. А является более токсичным в отношении клеток, которые сверхэкспрессируютAPLP1 и -2 (предшественник амилоида, подобный белку 1 и 2): оба белка принадлежат к белкам суперсемейства гомологов АРР, но не содержат пептидного района А. Тем не менее имеется значимое окрашивание APLP в невритных бляшках. Acta Neuropathol. 1997, 94: 519-524.AMY117 является новым белком, обнаруженным в бляшкоподобных повреждениях в мозге людей с БА, который, по-видимому, имеется в изобилии, широко распространен и является высоко специфическим для этого заболевания. Предполагается, что этот белок, AMY117 может играть критическую роль в развитии и прогрессии БА посредством образования этих бляшек. Интересно, что содержащие AMY117 бляшки не локализуются совместно с бляшками, содержащими А, что определяет новую характерную манифестацию БА,- 24008762 кроме хорошо известных содержащих А бляшек и содержащих Таu клубков. Было обнаружено, чтоAMY117-позитивные бляшки являются обильными в головном мозге в спорадических случаях БА и в головном мозге людей с синдромом Дауна, но редкими или отсутствующими в головном мозге в контроле и в случае других нейродегенеративных заболеваний (Am J Pathol 1997; 151: 69-80). Вах. Моноклональные антитела детектировали Вах в качестве компонента сенильных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Он также сверхэкспрессируется в дистрофических невритах. Acta Neuropathol. 1998, 95: 407-412.Bcl-2 имеет неясную роль. Сверхэкспрессируется в окружающих глиальные клетки бляшках. ActaNeuropathol. 1998, 95: 407-412. Блеомицингидролаза является, возможно, бета-секретазой. Иммунореактивность против блеомицингидролазы была обнаружена в SP в БА (Brain Res. 1999, 830: 200-202). Определенный генотип блеомицингидролазы был ассоциирован с увеличенным риском развития БА в некоторых случаях, тогда как в других случаях не обнаруживали корреляции (Ann Neurol, 1998, 44: 808-811 и Ann Neurol, 1999, 46: 136137).BRI/ABRI. ABRI представляет собой фрагмент в 4 кД предполагаемого трансмембранного белка,кодируемого геном BRI на хромосоме 13, обнаруживаемый в амилоидных бляшках людей с семейной Британской деменцией (FBD). Эти пациенты имеют мутацию в стоп-кодоне гена BRI, которая создает более длинную открытую рамку считывания. Высвобождение 34 карбокси-концевых аминокислот измененного белка генерирует субъединицу амилоида ABRI. Антитела против ABRI узнают как паренхимные, так и сосудистые повреждения в головном мозге пациентов с FBD. ABRI-пептид депонируется в виде амилоидных фибрилл, и предполагается, что образующиеся бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которая характеризует FBD (Vidal, R. et al., 1999, Nature 399). Хромогранин А был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах (Brain Res, 1991, 539: 143-50). Клустерин/apoJ. Этот ген часто выделяется путем дифференциального скрининга в лабораториях различных областей молекулярной биологии, так как он сверхэкспрессируется в многочисленных случаях дегенеративных заболеваний, таких как БА и скрепи (Biochem J 1997 Nov 15; 328(1): 45-50 Michel D.,Chatelain G., North S., Brun G.). Белок, связывающий CRF (высвобождающий кортикопин фактор), связывает пептид CRF из 41 аминокислоты, который является важным регуляторным фактором в стрессовых реакциях в головном мозге. Поскольку большая часть CRF связана CRF-связывающим белком, удаление CRF-связывающего белка могла бы приводить к увеличению уровня свободного CRF, что, как полагают, имеет позитивное действие против БА. Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68: 2053-2060.EDTF (токсичный фактор, полученный из эндотелия). Белок, продуцируемый микрососудами пациентов БА. Он является специфически токсичным в отношении нервных клеток. WO 99/24468. Было показано, что гепарансульфат-протеогликаны локализуются совместно с А в SP. Исследования на крысах показывают, что гепарансульфат-гликозаминогликан необходим для образования амилоидных волокон (Neuron, 1994, 12: 219-234 и Acta neuropathol, 1998, 96: 628-36). Медиаторный белок-2 коллапсиновой реакции человека представляет собой белок 65 кДа, распознаваемый в нейрофибриллярных клубках моноклональным антителом. Включение в клубки может истощать растворимый белок и приводит к аномальному разрастанию невритов, ускоряя тем самым дегенерацию нейронов. JBC, 1998, 273: 9761-8. Хантингтин (белок болезни Хантингтона). В БХ (болезни Хантингтона), белок Хантингтина удлинен на N-конце полиглутамином. Эта форма белка Хантингтина обнаруживается также в NFT в головном мозге пациентов БА и при заболевании Пика (Exp. Neurol, 1998, 150: 213-222).IL-6 связан с нейрофибриллярными изменениями и был обнаружен в центральной части бляшек. Предполагалось, что он является запускающим событием при БА. Он сильно размножается в астроцитах посредством активного пептида 25-35 А. Brain Res., 1997, 777: 223-227 и Behav Brain Res, 1996, 78: 3741. Ассоциированный с лизосомами антиген CD68 узнается антителом КР-1 при NFT и SP. Таким образом, лизосомы могут играть роль в образовании клубков и бляшек. Dement Geriatr Cogn Disord, 1998, 9: 13-19.P21 ras участвует в качестве первой стадии в повышении факторов роста и митогенов, наблюдаемом на ранних стадиях развития БА. Neuroscience, 1999, 91: 1-5.PLC-дельта 1 (изофермент дельта 1 фосфолипазы С) накапливается аномальным образом при NFT и невритах, окружающих центральные части бляшек. Он является внутриклеточным. Alzheimer Dis AssocDisord, 1995, 9: 15-22. Компонент Р сывороточного амилоида (SAP) является компонентом нормальной плазмы, который присутствует во всех типах амилоидных отложений, в том числе амилоидных отложениях при БА (JBC,1995, 270: 26041-4). Он обнаруживается как в SP, так и в NFT. В некоторых исследованиях было показа- 25008762 но, что он усиливает агрегацию А и предотвращает протеолиз фибрилл (Biochera Biophys Res commun,1995, 211: 349v-53 и PNAS, 1995, 92: 4299-4303), тогда как другое исследование указывает на то, что SAP ингибирует образование фибрилл А (JBC, 1995, 270: 26041-4). Синаптофизин был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах. (Brain Res, 1991, 539: 143-50). Синуклеин (альфа-синуклеин или NACP). Не-А бета-компонент амилоида БА (NAC) идентифицировали биохимически в качестве второго основного компонента в амилоиде, очищенном из ткани головного мозга пациентов БА. NAC, происходящий из предшественника длиной 140 аминокислот, NACP,имеет длину по меньшей мере 35 аминокислот (NAC35), хотя его амино-конец не установлен окончательно. NAC-моноклональное антитело иммуноокрашивает SP в головном мозге БА, но не реагирует сNACP (Biochemistry 34 (32): 10139-10145 (Aug 15 1995) Iwai A., Yoshimoto M., Masliah E., Saitoh T.). NAC самоолигомеризуется в присутствии А. Новые данные указывают на потенциальную роль этой молекулы в синаптическом повреждении и нейротоксичности через образование амилоидоподобных фибрилл и митохондриальную дисфункцию. Brain Pathol 1999 Oct; 9(4): 707-20. FEBS Lett, 1998, 421:73-76. ЧастьNACP имеет высокую гомологию с С-концевым фрагментом амилоида АРР и района прионового белка скрепи (PrPSc). Синуклеин является основным причинным фактором болезни Паркинсона (Chem. Biol,1995, 2: 163-9).TG ускоряет отложение А. Таким образом, считается, что TGF-b1 участвует в инициации или стимуляции образования амилоидных бляшек (Wyss-Coray, 1997, Nature 389). Другие амилоидные заболевания и связанные с ними белки Кроме вышеупомянутых белков, которые потенциально участвуют в БА и заболеваниях, подобных БА (болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, FBD и другие формы деменции), имеется относительно большое число заболеваний, иных, чем БА, где образование амилоида участвует в запуске заболевания или является причиной симптомов данного заболевания. Хотя природа белков, участвующих в этих заболеваниях, варьирует, они имеют одни и те же общие признаки, которые определяют амилоид (см. выше). В следующей таблице дан список ряда этих амилоидных нарушений и вызывающих их белков. Разнообразие амилоидных фибриллярных белков Все эти белки являются, подобно белкам, участвующим в БА, потенциальными мишенями в предлагаемой здесь стратегии иммунизации. Предполагается, что большинство способов иммунизации против амилоидогенных полипептидов должны быть рестриктированы иммунизацией, индуцирующей образование антител, перекрестнореактивных с нативным амилоидогенным полипептидом. Тем не менее, в некоторых случаях будет представлять интерес индукция клеточного иммунитета в форме CTL-реакций против клеток, на которых представлены эпитопы МНС Класса I из амилоидогенных полипептидов, это может оказаться целесообразным в тех случаях, когда уменьшение в числе клеток, продуцирующих амилоидогенные полипептиды, не оказывает серьезного вредного воздействия. В таких случаях, где желательными являются CTL-реакции,предпочтительно использовать способы заявителя PCT/DK99/00525 (соответствует USSN 09/413 186). Описания этих двух документов включены тем самым в качестве ссылки. В следующем далее неограничительном примере авторы сосредоточиваются на развитии аутовакцины на основе А против БА. Однако принципы, изложенные здесь, применимы в равной степени к любому амилоидному белку. Пример 1. Подход аутовакцинации для иммунизации против БА. Тот факт, что белок А мышей "knock out" не вызывает каких-либо аномалий или вредных побочных действий, предполагает, что удаление или снижение количества А будет безопасным, Zheng H.(1996). Опубликованные эксперименты, в которых трансгенных животных иммунизировали против трансгенного белка А человека, предполагает, что, если бы было возможно разрушить аутотолерантность,супрессия А могла бы быть получена с использованием аутореактивных антител. Эти эксперименты дополнительно предполагают, что такая супрессия А потенциально могла бы как предотвращать образование бляшек, так и способствовать выведению уже образованных бляшек А из головного мозга,срав. Schenk et al. (1999). Однако традиционно невозможно индуцировать антитела против аутологичных белков. Таким образом, опубликованные данные не обеспечивают средства для разрушения аутотолерантности в отношении истинных аутологичных белков. Также эти данные не дают информации о том, каким образом гарантировать, что иммунная реакция будет направлена только и преимущественно на отложения А, а не на белок-предшественник А, связанный с клеточной мембраной (АРР), если это считается необходимым. Иммунная реакция, генерируемая с использованием существующей технологии, предпочтительно генерировала бы иммунную реакцию против аутологичных белков нерегулируемым образом,так что может генерироваться нежелательная и избыточная аутореактивность против частей белка А. Таким образом, использование существующих стратегий иммунизации будет, наиболее вероятно, не способно генерировать сильные иммунные реакции против собственных (аутологичных) белков и, следовательно, будет небезопасным вследствие потенциально сильной перекрестной реактивности в отно- 27008762 шении мембраносвязанного АРР, который присутствует на большом числе клеток в ЦНС. Данное изобретение обеспечивает средства эффективного генерирования сильной регулируемой иммунной реакции против истинных аутологичных белков, которые потенциально могли бы образовывать бляшки и вызывать серьезное заболевание в ЦНС или в других компартментах тела. Безопасная и эффективная терапевтическая вакцина, содержащая белок А человека, будет создана с использованием этой технологии для лечения БА. В свете этого, можно понять, что БА, заболевание, которое, как прогнозируется, парализует систему здравоохранения в следующем столетии, могло бы излечиваться, или же описанные вакцины могли бы,по меньшей мере, составлять эффективный терапевтический подход к лечению симптомов и прогрессирования этого заболевания. Этот способ представляет собой совершенно новый иммунологический подход к блокированию отложения амилоида при БА, а также при других неврологических заболеваниях. В следующей таблице показано 35 рассматриваемых конструкций. Все положения, указанные в таблице, даны относительно стартового метионина АРР (первой аминокислоты в SEQ ID NO:2) и включают в себя как начальную, так и конечную аминокислоту, например фрагмент 672-714 включает в себя как аминокислоту 672, так и аминокислоту 714. Начальное и конечное положения для Р 2 и Р 30 указывают, что этот эпитоп заменяет часть фрагмента АРР в указанных положениях (оба положения включены в замену) - в большинстве конструкций, введенные эпитопы заменяют фрагмент длиной с данный эпитоп. Звездочки в таблице имеют следующие значения:) Только одно положение для Р 2 и Р 30 указывает на то, что этот эпитоп был вставлен в данное производное АРР в указанном положении (эпитоп начинается с аминокислоты, С-терминально смежной с указанным положением).) Конструкция 34 содержит три идентичных фрагмента АРР, разделенных Р 30 и Р 2, соответственно.) Конструкция 35 содержит девять идентичных фрагментов АРР, разделенных чередующимися эпитопами Р 30 и Р 2. Конструкции аутовакцины АРР Частью АРР, против которой наиболее интересно генерировать реакцию, является центральный пептид А из 43 аминокислот (А-43, соответствующий SEQ ID NO:2, остаткам 672-714), который является основным компонентом амилоидных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Этот фрагмент АРР является частью всех конструкций, перечисленных выше. Варианты 1 и 2 включают в себя часть АРР против хода транскрипции (слева) от А-43, где помещены модельные эпитопы Р 2 и Р 30. Все варианты 1 и 3-8 содержат фрагмент С-100, который, как было показано, является нейротоксичным, этот фрагмент С-100 соответствует аминокислотным остаткам 714770 SEQ ID NO:2. В вариантах 3-5 эти эпитопы заменяют часть фрагмента С-100, тогда как в вариантах- 28008762 6-8 они были вставлены в С-100. Варианты 9-35 содержат только коровый белок А-43. В вариантах 9-13, Р 2 и Р 30 слиты с каждым концом А-43; в вариантах 14-21 Р 2 и Р 30 заменяют часть А-43; в 22-33 Р 2 и Р 30 вставлены в А-43; 34 содержит три идентичных фрагмента А-43, разделенных Р 30 и Р 2, соответственно; 35 содержит 9 повторов А-43, разделенных чередующимися эпитопами Р 2 и Р 30. См. чертеж и таблицу, приведенную выше, в отношении подробностей. Еще один тип конструкции является особенно предпочтительным. Поскольку одна из задач согласно изобретению связана с тем, чтобы избежать деструкции клеток, продуцирующих АРР, тогда как удаление А является желательным, по-видимому можно получить аутовакцинные конструкции, содержащие только части А, которые не экспонированы во внеклеточной фазе, когда они присутствуют в АРР. Таким образом, такие конструкции должны будут содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп,полученный из аминокислотного фрагмента, определяемого аминокислотами 700-714 в SEQ ID NO:2. Поскольку прогнозируется, что такой короткий полипептидный фрагмент является лишь слабо иммуногенным, предпочтительно, чтобы такая аутовакцинная конструкция состояла из нескольких копий Вклеточного эпитопа, например, в виде конструкции, имеющей структуру, показанную в формуле I в подробном описании согласно изобретению, см. выше. В этой версии формулы I термины амилоиде 1 амилоидех = х В- клеточным эпитопам, содержащим аминокислотные последовательности, происходящие из аминокислот 700-714 SEQ ID NO:2. Предпочтительной альтернативой является описанная подробно выше возможность связывания амилоидогенного (поли)пептида и выбранного чужеродного Тхелперного эпитопа через амидную связь с молекулой полисахаридного носителя, таким путем становятся возможными множественные представления "слабого" эпитопа, составленного аминокислотами 700714 SEQ ID NO:2, а также становится возможным выбор оптимального соотношения между Вклеточными и Т-клеточными эпитопами. Пример 2. Иммунизация трансгенных мышей A и модифицированными белками в соответствии с данным изобретением. Конструирование ДНК, кодирующей hAB43+-34. Ген hAB43+-34 конструировали в несколько стадий. Сначала генерировали ПЦР-фрагмент с праймерами МЕ 801 (SEQ ID NO:10) и МЕ 802 (SEQ IDNO:11) с использованием праймера МЕ 800 (SEQ ID NO:9) в качестве матрицы. МЕ 800 кодирует фрагмент abeta-43 человека с оптимизированными для Е. coli кодонами. МЕ 801 и 802 добавляют подходящие сайты рестрикции к этому фрагменту. ПЦР-фрагмент очищали, расщепляли NcoI и HindIII, снова очищали и клонировали в расщепленный NcoI-HindIII и очищенный экспрессирующий вектор pET28b+ E. coli. Полученная плазмида, кодирующая А-43 дикого типа человека, была названа рАВ 1. В следующей стадии Т-хелперный эпитоп Р 2 добавляют к С-концу этой молекулы. Праймер МЕ 806 (SEQ ID NO:12) содержит последовательность, кодирующую эпитоп Р 2, так что генерируется слияние Р 2 и Abeta-43 посредством этой ПЦР-реакции. Клонирование выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ 178 (SEQ ID NO:8) и МЕ 806 с использованием рАВ 1 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NcoI иHindIII, снова очищали и клонировали в расщепленный NcoI-HindIII и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ 28b+. Полученная плазмида была названа рАВ 2. Аналогичным образом, другую плазмиду делали улавливающей А-43-кодирующую последовательность с другим Т-хелперным эпитопом, Р 30, добавленным к N-концу. Это выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ 105 (SEQ ID NO:7) и МЕ 807 (SEQ ID NO:13) с использованием праймера рАВ 1 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NcoI и HindIII, снова очищали и клонировали в расщепленный NcoI-HindIII и очищенный вектор рЕТ 28b+. Полученная плазмида была названа рАВ 3. В третьей стадии второй повтор А-43 добавляли С-терминально к эпитопу Р 2 плазмиды рАВ 2 при помощи праймера МЕ 809 (SEQ ID NO:14). МЕ 809 в то же самое время создает сайт BamHI непосредственно после повтора А-43. ПЦР-фрагмент получали с праймерами МЕ 178 и МЕ 809 с использованием рАВ 2 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NcoI и HindIII, снова очищали и клонировали в расщепленный NcoI-HindIII и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ 28b+. Полученная плазмида была названа рАВ 4. Наконец, повторяющуюся последовательность эпитоп Р 30-повтор А-43 из рАВ 3 клонировали в плазмиду рАВ 4. Это выполняли получением ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ 811 (SEQ ID NO:16) и МЕ 105 с использованием рАВ 3 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали и использовали в качестве праймера в последующей ПЦР с использованием МЕ 810 (SEQ ID NO:15) с применением рАВ 3 в качестве матрицы. Полученный фрагмент очищали, расщепляли NcoI и HindIII, снова очищали и клонировали в расщепленный NcoI-HindIII и очищенный экспрессирующий вектор рАВ 4. Полученная плазмида рАВ 5 кодирует молекулу hАВ 43+-34. Все ПЦР и процедуры клонирования выполняли, по существу, как описано Sambrook J., Fritsh, E.F.,and Maniatis, Т. 1989 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.- 29008762 Для всех процедур клонирования использовали клетки Е. coli К-12, штамм Тор-10 F' (Stratagene,USA). Вектор pET28b+ покупали у Novagen, USA. Все праймеры синтезировали в DNA Technology,Denmark. Экспрессия и очистка hAB43+-34. Белок hАВ 43+-34, кодируемый рАВ 5, экспрессировали в клетках Е. coli BL21-Gold (Novagen), как описано поставщиками системы pET28b+(Novagen). Экспрессированный белок hАВ 43+-34 очищали до чистоты более 85% промыванием тел включения с последующей катионообменной хроматографией с использованием рабочей станции для очистки BioCad (PerSeptive Biosystems, USA) в присутствии 6 М мочевины. Мочевину после этого удаляли ступенчатым диализом против раствора, содержащего уменьшающиеся количества мочевины. Конечным буфером был 10 мМ Трис, рН 8,5. Исследование иммунизации. Мышей, трансгенных в отношении АРР человека (белкапредшественника А-белка (белка Альцгеймера, использовали для этого исследования. Эти мыши, названные TgRND8+, экспрессируют мутированную форму АРР, что приводит к высокой концентрации А-40 и А-42 в головном мозге мыши (Janus, С. et al.). Мышей (8-10 мышей на одну группу) иммунизировали либо Abeta-42 (SEQ ID NO:2, остатки 673714, синтезированная с использованием стандартной Fmoc-стратегии), либо вариантом hАВ 43+-34 (конструкцией 34 в таблице в примере 1, полученной рекомбинантно) четыре раза в неделю с двухнедельными интервалами. Дозы были 100 мг для А или 50 мг для hAB43+-34. Мышам делали кровопускание в день 43 (после трех инъекций) и после дня 52 (после четырех инъекций) и сыворотки использовали для определения уровня анти-А-42-специфических титров с использованием прямого ELISA А-42. В следующей таблице показаны средние относительные титры aнти-Abeta-42. Как будет видно, титры антител, полученные при иммунизации вариантом hAB43+-34 А, приблизительно в 4 раза и в 7,5 раз выше после 3 и 4 иммунизации, соответственно, чем титры, полученные при использовании неизмененного А-42 в качестве иммуногена. Этот факт представляется, кроме того, перспективным при рассмотрении того факта, что количество варианта, используемого для иммунизации,было только 50% от количества последовательности дикого типа, используемого для иммунизации. Пример 3. Синтез содержащей пептид А-сополимер вакцины с использованием полигидроксиполимера в качестве сшивающего агента. Введение. Традиционная конъюгатная вакцина состоит из (поли)пептида, связанного ковалентно с белком-носителем. Пептид содержит В-клеточный эпитоп (эпитопы), а белок-носитель обеспечивает Тхелперные эпитопы. Однако большая часть белка-носителя обычно будет не относящейся к источнику Тхелперных эпитопов, так как только минорная часть общей последовательности содержит соответствующие Т-хелпэрные эпитопы. Такие эпитопы могут быть определены и синтезированы в виде пептидов,например, из 12-15 аминокислот. Если эти пептиды связаны ковалентно с пептидами, содержащими Вклеточные эпитопы, например, через многовалентный активированный полигидроксиполимер, может быть получена вакцинная молекула, которая содержит только уместные части. Кроме того, можно обеспечить вакцинный конъюгат, который содержит оптимизированное соотношение между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами. Синтез активированного полигидроксиполимера. Полигидроксиполимеры, такие как декстран,крахмал, агароза и т.д., могут быть активированы 2,2,2-трифторэтансульфонилхлоридом (трезилхлоридом), либо посредством гомогенного синтеза (декстран), при растворении в N-метилпирролидиноне(NMP), либо посредством гетерогенного синтеза (крахмал, агароза, сшитый декстран), например, в ацетоне. 225 мл сухого N-метилпирролидинона (NMP) добавляют в сухих условиях к лиофилизированному водорастворимому декстрану (4,5 г, 83 ммоль, клинической чистоты, Mw (сред.) 78000) в круглодонной колбе на 500 мл, снабженной магнитной мешалкой для перемешивания. Колбу помещают в масляную баню на 60 С с перемешиванием при помощи магнитной мешалки. Температуру повышают до 92 С и перемешивают в течение периода 20 мин. Когда декстран растворяется, колбу сразу же вынимают из масляной бани и температуру в бане снижают до 40 С. Колбу снова помещают в масляную баню, все еще при перемешивании магнитной мешалкой, и добавляют по каплям трезилхлорид (2,764 мл, 25 ммоль). Через 15 мин добавляют по каплям сухой пиридин (безводный, 2,020 мл, 25 ммоль). Колбу вынимают из масляной бани и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт (активированный трезилом декстран, TAD) осаждают в 1200 мл холодного этанола (99,9%). Супернатант декантируют и осадок собирают в полипропиленовые пробирки на 50 мл в центрифуге при 2000 об./мин. Осадок растворяют в 50 мл 0,5% уксусной кислоты, диализуют 2 раза против 5000 мл 0,5% уксусной кислоты и лиофилизируют. TAD может храниться в виде лиофилизированного порошка при -20 С. Нерастворимый полигидроксиполимер, такой как агароза или сшитый декстран, может быть акти- 30