Детоксифицированный tnf и способ получения

008254 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к области терапевтической иммунотерапии, и в частности к области активной иммунотерапии, нацеленной на отрицательно регулирующие аутологичные ("собственные") белки и другие слабоиммуногенные антигены. Таким образом, данное изобретение обеспечивает новые и улучшенные иммуногенные детоксифицированные варианты фактора некроза опухолей альфа (TNF), а также необходимый инструмент для получения таких вариантов. Кроме того, данное изобретение относится к способам иммунотерапии, а также к композициям, применимым в таких способах. Уровень техники Использование активной иммунотерапии ("вакцинации") в качестве средства лечения или ослабления заболевания привлекает все большее внимание на протяжении последних двух десятилетий. Следует отметить, что использование активной иммунотерапии как средства разрушения толерантности к аутологичным белкам, которые каким-либо образом связаны с патологическим (или иным образом нежелательным) физиологическиим состоянием, было известно с конца 70-х годов, когда были опубликованы первые эксперименты с вакцинами против фертильности. Вакцины против аутологичных антигенов получали традиционно путем "иммуногенизации" релевантного аутологичного белка, например путем химического связывания ("конъюгации") с большим чужеродным и иммуногенным белком-носителем (см. US 4161519) или путем получения слитых конструкций между этим аутологичным белком и чужеродным белком-носителем (см. WO 86/07383). В таких конструкциях часть-носитель этой иммуногенной молекулы ответственна за обеспечение эпитопов для Т-хелперных лимфоцитов ("ТH-эпитопов"), которые позволяют нарушить аутотолерантность. Более позднее исследование показало, что, хотя такие стратегии, действительно, могут обеспечить нарушение толерантности против аутологичных белков, при этом возникает ряд проблем. Наиболее важным является тот факт, что в иммунной реакции, которая индуцируется во времени, будут доминировать антитела, направленные против части-носителя иммуногена, в то время как реактивность против аутологичного белка часто уменьшается, т.е. возникает эффект, который особенно ярко выражен, когда этот носитель служил ранее в качестве иммуногена, - этот феномен известен как супрессия носителя (см., например, Kaliyaperumal et al., 1995, Eur. J. Immunol. 15, 3375-3380). Однако при использовании терапевтической вакцинации обычно необходимо проводить реиммунизацию несколько раз в год и поддерживать эту обработку в течение ряда лет, и это также приводит к ситуации, когда иммунная реакция против части-носителя будет все более доминировать за счет иммунной реакции против аутологичной молекулы. Дополнительными проблемами, возникающими при использовании технологии гаптен-носитель для разрушения аутотолерантности, являются негативные стерические эффекты, проявляемые носителем на часть аутологичного белка в таких конструкциях: ряд доступных В-клеточных эпитопов, которые сходны с конформационными картинами, наблюдаемыми в нативном аутологичном белке, часто уменьшается вследствие простого экранирования или маскирования эпитопов или вследствие конформационных изменений, индуцируемых собственной частью этого иммуногена. Наконец, очень часто бывает трудно охарактеризовать молекулу гаптен-носитель достаточно подробно. В публикации WO 95/05849 обеспечено усовершенствование вышеупомянутых стратегий с использованием гаптен-носителя. Было продемонстрировано, что аутологичные белки, в которых встроен в виде замены всего лишь один-единственный чужеродный ТH-эпитоп, способны разрушать толерантность в отношении аутологичного белка. Все усилия были направлены на сохранение третичной структуры аутологичного белка для гарантии того, что максимальное количество аутологичных эпитопов В-клеток будет сохранено в этом иммуногене, несмотря на введение чужеродного ТH-элемента. Эта стратегия оказалась, в общем, чрезвычайно успешной ввиду того, что индуцированные антитела имеют широкий спектр,а также высокую аффинность и что иммунная реакция возникает раньше и имеет более высокий титр,чем это происходит при иммунизации традиционной конструкцией с носителем. В WO 00/20027 обеспечено расширение вышеуказанного принципа. Было обнаружено, что введение единственных ТH-эпитопов в кодирующую последовательность для аутологичных белков может индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), которые реагируют специфически с клетками, экспрессирующими данный аутологичный белок. Технология WO 00/20027 обеспечила также комбинированную терапию, в которой индуцируются как антитела, так и CTL, - в этих вариантах иммуногены все еще необходимы для сохранения существенной фракции В-клеточных эпитопов. Фактор некроза опухолей (TNF, TNF, кахектин, TNFSF2) является сильным паракринным и эндокринным медиатором воспалительных и иммунных функций. TNF является цитотоксическим для многих клеток, особенно в комбинации с гамма-интерфероном. TNF был впервые идентифицирован в 1975 году, и было показано, что он инициирует некроз и регрессию опухоли. Позднее этот антираковый эффект был исследован подробно, но этот способ лечения не имел успеха в качестве раковой терапии,хотя все еще проводятся испытания в отношении рака с использованием TNF. Позднее было обнаружено, что TNF был причиной кахексии, и было показано, что TNF проявляет его действие через опосредованный рецептором процесс. Были идентифицированы два различных рецептора TNF (TNFR55 иTNFR75), которые опосредуют цитотоксические и воспалительные эффекты TNF. TNF индуцирует и-1 008254 поддерживает воспалительные процессы во время хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА), и предполагается, что он играет решающую роль в аллергиях и псориазе. Блокирование сигнала TNF растворимыми рецепторами, рецептор-специфическими ингибиторами, понижающей регуляцией продуцирования TNF или моноклональными антителами против TNF является привлекательными формами терапии для неблагоприятных биологических действий повышающей регуляции и передачи сигнала TNF. Из результатов, полученных при лечении растворимыми рецепторами TNF и моноклональными антителами против TNF, очевидно, что анти-TNF-терапия является успешной в случае нескольких заболеваний, таких как РА и болезнь Крона. Лечение антителами против TNF считается как безопасным, так и эффективным. К настоящему времени два TNF-антагониста, Remicade (Infliximab, Centrocor/JohnsonJohnson) иEnbrel (Etanercept, Immunex), были одобрены для клинического применения.Remicade является химерным мышь-человек моноклональным IgG1-антителом, направленным против растворимого и клеточно-ассоциированного TNF. Remicade блокирует связывание TNF с его эндогенным находящимся на поверхности клетки рецептором TNF. Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) одобрил Remicade в октябре 1998 г. для использования в умеренной-тяжелой или образующей свищи болезни Крона, не поддающейся общепринятым способам терапии. Это показание было расширено для включения вспомогательного использования с метотрексатом при ревматоидном артрите, не поддающемся терапии только метотрексатом, а в июле 2002 г. в поддерживающей терапии при болезни Крона.Enbrel представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточной части TNF-рецептора человека, слитой с Fc-частью IgG1 человека. Enbrel ингибирует активность TNF, функционируя в качестве ловушки TNF-рецептора. FDA одобрил Enbrel для применения при ревматоидном артрите в ноябре 1998 г. Более 350000 пациентов лечили этими антагонистами TNF. Обзор клинической эффективности и информации о безопасности этих агентов выполняют непрерывно, и, хотя инфекционные и другие иммуноассоциированные побочные неблагоприятные явления остаются основной проблемой для антагонистов TNF, при недавней оценке безопасности постмаркетинговых испытаний, проведеннойFDA и СРМР (Комитетом по патентованным медицинским продуктам), установили, что анти-TNFтерапии имеют благоприятный баланс риска-пользы, хотя были необходимы изменения в сопроводительном описании, в том числе изменения в отношении тяжелых инфекций. В сравнении с установленными анти-TNF-терапиями предлагаемая здесь TNF-терапия имеет преимущества вакцинаций в микрограммовых количествах и менее частых инъекций для сохранения высокого титра антител против TNF in vivo в сравнении с обширными инфузиями моноклональных антител. Положительными следствиями являются более низкий риск в отношении побочных эффектов и менее дорогостоящая терапия. Считается также, что природная реакция поликлональных антител будет действовать в качестве более эффективного понижающего регулятора TNF, чем другие aнти-TNF-терапии.TNFa транслируется в виде белка-предшественника из 233 аминокислот и секретируется в виде тримерного трансмембранного белка типа II, который расщепляется специфическими металлопротеазами до тримерного растворимого белка, где каждая идентичная мономерная субъединица состоит из 157 аминокислот (аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 10, остатки 2-158).TNF человека является негликозилированным, тогда как мышиный TNF имеет единственный сайт Nгликозилирования. TNF-мономер имеет молекулярную массу 17 кДа, тогда как тример имеет теоретическую молекулярную массу (MW) 52 кДа, хотя сшитый тример перемещается в виде 43 кДа при электрофорезе в ДСН-ПААГ. TNF содержит два цистеина, которые стабилизируют эту структуру образованием внутримолекулярного дисульфидного мостика. Как N-, так и С-конец TNF являются важными для активности. В частности, С-конец является чувствительным, так как делеция трех, двух аминокислот и даже одной аминокислоты разительно уменьшает растворимость и биоактивность. Важной аминокислотой является Leu157, которая образует стабилизирующий солевой мостик между двумя мономерами в этом тримере. С другой стороны, делеция первых восьми аминокислот увеличивает активность в 1,5-5 раз,тогда как делеция первых девяти аминокислот восстанавливает полноразмерную активность. TNF является хорошо изученным белком, и были раскрыты многие внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия, приводящие к образованию тримера и связыванию рецептора. Таким образом, в природе TNF человека (SEQ ID NO: 10, остатки 2-158) существует как в виде димера, так и в виде тримера, но эта молекула в обоих случаях является очень подходящей в качестве мишени-кандидата согласно изобретению. Как в WO 95/05849, так и в WO 98/46642 описан способ вакцинации, который пригоден для понижающей регуляции активности TNF (фактора альфа некроза опухолей), цитокина, участвующего в патологии нескольких заболеваний, таких как диабет типа I, ревматоидный артрит и воспалительная болезнь пищеварительного тракта. В обоих описаниях предполагается сохранение третичной структуры мономерного TNF при конфронтации с иммунной системой. Кроме того, WO 03/042244 (еще не опуб-2 008254 ликованный) описывает ряд общих и специфических вариантов TNF. Даже несмотря на то, что вышеуказанные способы обеспечили очень многообещающие результаты,существуют несколько факторов, которые могут начинать действовать при оценке жизненности вакцинного подхода в борьбе с заболеванием. Одним из этих факторов является уровень экспрессии этого иммуногенного белка. Например, для того, чтобы вакцина нуклеиновой кислоты была функциональной, клетки, трансфицированные in vivo конструкцией, кодирующей "иммуногенизированный" аутологичный белок, должны быть способны экспрессировать этот иммуноген в достаточных количествах, чтобы индуцировать подходящую иммунную реакцию. Кроме того, вакцины на основе полипептидов требуют, чтобы этот иммуногенный белок мог продуцироваться в удовлетворительных количествах в промышленном ферментационном процессе. Однако часто наблюдается, что даже небольшое изменение в аминокислотной последовательности известного белка может иметь драматические последствия в отношении количеств белка,которые могут быть извлечены. Кроме того, стабильность генетически модифицированных белковых последовательностей может быть также меньше оптимальной (как в отношении времени хранения, так и в отношении стабильности in vivo). Кроме того, когда, как это имеет место для TNF, аутологичный белок, который желательно регулировать понижающим образом, является гетерополимером или гомополимером, совсем необязательно,что вариант мономерной единицы этого белка будет способен индуцировать антитела, которые являются достаточно специфическими в отношении конформации, нативной для этого полимерного белка. Наконец, TNF является токсичным веществом, и, к сожалению, наблюдали, что оптимально уложенные иммуногенные варианты TNF сохраняют нативную токсичность TNF, так как эти варианты способны образовывать биологически активные тримеры (или укладываться в виде биологически активных мономеров, которые имитируют эту тримерную структуру). Цель изобретения Целью данного изобретения является обеспечение улучшенных иммуногенных и детоксифицированных аналогов TNF человека, а также обеспечение улучшенных способов индукции гуморального иммунитета против этого белка. Далее, целью данного изобретения является обеспечение улучшенных способов культивирования вариантов растворимого TNF, а также вариантов других белков. Наконец,целью данного изобретения является также обеспечение других способов и критериев, которые применимы при получении или использовании этих улучшенных иммуногенов. Сущность изобретения При крупномасштабном продуцировании рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах часто желательно, чтобы продукт экспрессии стал доступен в виде телецвключения в бактериях. Для этого имеются несколько причин: например, выходы экспрессии обычно значительно более высоки при экспрессии этого белка в виде нерастворимых телец включения, и очистка этого белка также облегчается, так как желаемый продукт экспрессии может быть легко и удобно отделен от растворимого белка из бактериальной ферментации. Однако при экспрессии рекомбинантного белка в виде нерастворимых телец включения часто необходимо подвергать этот продукт экспрессии различным процессам рефолдинга белка для получения его биологически активной формы, но это обычно приемлемо, даже если стадия приводит к некоторой потере общего рекомбинантного белка, который никогда не укладывается в точную биологически активную форму. Однако при получении рекомбинантных иммуногенных вариантов неиммуногенных аутологичных белков, таких как TNF, необходимо вводить ТH-эпитопы, и посредством этого первичная структура этого белкового продукта становится измененной в сравнении с нативным аутологичным белком. Авторы данного изобретения обнаружили, что даже самое слабое изменение делает этот традиционный подход экспрессии телец включения с последующим рефолдингом непрактичным: выходы белка после рефолдинга, который сохранял удовлетворительную фракцию В-клеточных эпитопов в сравнении с нативным аутологичным белком, являются очень часто низкими, и эта проблема увеличивается из-за сложности рассматриваемого белка. Теперь авторами было обнаружено, что конструирование и выполнение экспрессии белковых конструкций, которые продуцируются в виде растворимых белков из бактерий, является превосходным способом получения иммуногенных вариантов аутологичных белков, даже хотя последующие стадии очистки усложняются, поскольку необходимо удалить другие растворимые белки, конечный очищенный и правильно уложенный продукт получают со значительно более высокими выходами, чем при изложенном выше традиционном подходе. И, что очень важно, очищенные белки, полученные при этом типе экспрессии, проявляют беспрецедентную до сих пор способность сохранять В-клеточные эпитопы нативного аутологичного белка, из которого они получены. Вкратце, в соответствии с данным изобретением растворимая экспрессия вариантных белков является превосходным критерием выбора при первоначальном отборе иммуногенных вариантов аутологичного белка, которые являются подходящими для целей вакцинации. Для того, чтобы получить экспрессию растворимого белка таких иммуногенизированных аутоло-3 008254 гичных белков (и других белков, где были введены изменения в первичной последовательности), можно варьировать ряд параметров - мультимерные белки, которые трудно собрать, могут быть получены стабилизацией их структуры на уровне мономеров, но также и получением мономерных миметиков TNFмультимера, а также простые мономерные белки могут быть стабилизированы в соответствии с описаниями, приведенными здесь. Другим важным фактором являются условия ферментации - полученные данные в лаборатории авторов данного изобретения показали, например, что ферментация бактерий при более низких температурах, чем температуры, обычно используемые для получения высоких уровней экспрессии, в значительной степени облегчают продуцирование растворимых форм вариантных белков. Авторы данного изобретения ранее обнаружили, что получение "мономеризованных" или стабилизированных форм TNF может быть обеспечено в отношении иммуногенных молекул, имеющих высокую стабильность, превосходную иммуногенность и желаемые характеристики продуцирования. Данное изобретение направлено на улучшение концепций, где ряд специфических детоксифицирующих мутаций вводятся в варианты таким образом, чтобы сделать их более удобными для пациентов при сохранении их иммуногенности. Помимо этой детоксифицирующей мутации, TNF-варианты согласно изобретению включают в себя ряд вариаций в мономерной структуре TNF, которые являются достаточно недеструктивными, так что они позволяют скорректировать фолдинг TNF-мономеров при одновременном введении по меньшей мере одной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности - эти вариации уже описаны подробно в WO 03/042244. Было обнаружено, что встраивание чужеродного ТH-эпитопа может быть выполнено в одной конкретной петлевой структуре в нативном TNF без негативного воздействия на характеристики экспрессии этого белка или на способность мономера образовывать функциональный димер или тример TNF. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к детоксифицированному, иммуногенному аналогу TNF человека, где этот аналог включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность и дополнительно является: мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в гибкую петлю 3, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует трехмерную структуру мономеров TNF, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором делетирована любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на аминоконце, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в петлю 1 в положении интрона, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в виде части искусственного района "ножки" на N-конце TNF человека, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность таким образом, чтобы стабилизировать структуру мономера путем увеличения гидрофобности границы тримерного взаимодействия, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, в аминокислотной последовательности TNF, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в петле D-E, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность между двумя идентичными субпоследовательностями TNF человека, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором по меньшей мере один солевой мостик в TNF человека усилен или заменен дисульфидным мостиком, и/или мономером TNF человека или мономеризованным аналогом hTNF согласно изобретению, в котором растворимость и/или стабильность в отношении протеолиза усилена введением мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного TNF, причем токсичность уменьшается или элими-4 008254 нируется введением по меньшей мере одной точковой мутации, выбранной из группы, состоящей изY87S, D143N и A145R, причем нумерация аминокислот начинается с N-концевого V в TNF человека. В целом, было обнаружено, что все наиболее подходящие иммуногенные аналоги согласно изобретению являются аналогами, которые являются растворимыми белками уже на той стадии, когда они продуцируются и выделяются в растворимой форме из их рекомбинантных клеток-хозяев. Данное изобретение обеспечивает также фрагменты нуклеиновых кислот (например, ДНК-фрагменты),кодирующие такие иммуногенные аналоги, а также векторы, включающие в себя такие ДНК-фрагменты. Данное изобретение обеспечивает также трансформированные клетки, применимые для получения этих аналогов. Данное изобретение относится, далее, к иммуногенным композициям, содержащим аналоги и векторы согласно изобретению. Данное изобретение обеспечивает также способы лечения, в которых понижающим образом регулируются мультимерные белки, и лечения конкретных заболеваний, связанных с конкретными мультимерными белками. Описание фигуры Блок-схема, на которой демонстрируется предварительная обработка продуцирования TNF-белков Е. coli. Представленная рабочая схема используется для оценки относительной эффективности различных условий ферментации при рекомбинантном получении TNF-вариантов согласно изобретению. Подробное описание изобретения Определения Далее будет определен и объяснен подробно ряд терминов, используемых в данном описании и данной формуле изобретения для разъяснения границ и пределов изобретения. Термины "Т-лимфоцит" и "Т-клетка" будут использоваться взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за опосредованные различными клетками иммунные реакции,а также за хелперную активность в гуморальной иммунной реакции. Подобным образом, термины "В-лимфоцит" и "В-клетка" будут использоваться взаимозаменяемо для антителопродуцирующих лимфоцитов."Полимерный белок" определен здесь как белок, который включает в себя по меньшей мере две полипептидные цепи, которые не соединены одна за другой пептидной связью (термин "мультимерный белок" используется взаимозаменяемо с ним). Таким образом, полимерные белки могут быть полимерами, состоящими из нескольких полипептидов, которые удерживаются вместе в полимерной форме посредством дисульфидных связей и/или нековалентного связывания. В этот термин включены также процессируемые пребелки и пробелки, которые после процессинга включают в себя по меньшей мере два свободных С-конца и по меньшей мере два свободных N-конца. Наконец, в этот термин включены также временно существующие комплексы между по меньшей мере двумя полипептидами, которые могут образовывать нестабильную, но несмотря на это биологически активную молекулярную частицу, которая имеет явную трехмерную структуру. Под "иммуногенным аналогом" (или "иммуногенизированным" аналогом или вариантом) здесь подразумевается отдельный полипептид, который включает в себя существенную часть информации последовательности, обнаруживаемой в полном полимерном белке. То есть белок-аналог согласно изобретению включает в себя одну полипептидную цепь, тогда как полимерный белок включает в себя по меньшей мере две полипептидные цепи. Следует отметить, что аналог может являться вариацией структуры мономерной субъединицы полимера, но в этом случае иммуногенный аналог способен образовывать комплексы полимерного белка, которые сходны с нативным полимером."Мономеризованный" аналог или вариант полимерного белка является в данном контексте единственным полипептидом, который включает в себя, в ковалентно связанной форме через пептидную связь,по меньшей мере две полипептидные цепи, обнаруживаемые в полимерном белке в природе, где эти две полипептидные цепи не связаны через пептидную связь."Существенный фрагмент" мономерной единицы мультимерного белка обозначает часть мономерного полипептида, которая составляет по меньшей мере достаточную часть мономерного полипептида для образования домена, который укладывается, по существу, в ту же самую трехмерную конформацию,которая может быть обнаружена в мультимерном белке."TNF-полипептид" обозначает в данном контексте полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность TNF-белков, полученных из людей и других млекопитающих. Негликозилированные формы TNF, которые получают в прокариотических системах, также включены в границы этого термина, как и формы, имеющие варьирующиеся картины гликозилирования вследствие использования, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем немлекопитающих. Однако следует отметить, что при использовании термина "TNF-полипептид" предполагается, что рассматриваемый полипептид является в норме неиммуногенным, когда его презентируют подлежащему лечению животному. Другими словами, TNF-полипептид является аутологичным белком или ксеноаналогом аутологичного белка, который в норме не будет индуцировать иммунную реакцию против TNF рассматриваемого животного."TNF-аналог" является TNF-полипептидом, который был подвергнут изменениям в его первичной структуре и/или который ассоциирован с элементами из других молекулярных частиц. Такое изменение может быть, например, в виде слияния TNF-полипептида с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, исключительно включающее в себя добавления аминокислотных остатков по С- и/или N-концу), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности TNF-полипептида. Этот термин включает в себя также дериватизованные молекулы TNF, см. обсуждение ниже модификаций TNF. Должно быть понятно, что аналоги TNF включают в себя также мономерные варианты, которые содержат существенные части полных мультимерных TNF-белков. Используемая здесь аббревиатура "TNF" означает аминокислотные последовательности зрелогоmTNF, mTNFm или mTNFwt. В случаях, когда ДНК-конструкция включает в себя информацию, кодирующую лидерную последовательность или другой материал, это будет обычно ясно из контекста. Термин "полипептид" обозначает в данном контексте короткие пептиды из 2-10 аминокислотных остатков, олигонуклеотиды из 11-100 аминокислотных остатков и полипептиды из более 100 аминокислотных остатков. Кроме того, этот термин также означает белки, т.е. функциональные биомолекулы, содержащие по меньшей мере один полипептид; причем когда они содержат по меньшей мере два полипептида, они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут не быть ковалентно связанными. Этот полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержат простетические группы. Термин "субпоследовательность" обозначает любую последовательность из по меньшей мере 3 аминокислот или, соответственно, из по меньшей мере 3 нуклеотидов, полученную непосредственно из природной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты TNF, соответственно."Детоксифицирующая мутация" определена в данном контексте как мутация (например, точковая мутация) в аминокислотной последовательности TNF, которая делает полученную молекулу значительно менее токсичной в отношении соответствующей модели животного (или аутологичного хозяина,из которого получена эта аминокислотная последовательность TNF). Однако будет понятно, что эта детоксифицирующая мутация не должна быть мутацией, которая значимо мешает правильному фолдингу молекулы TNF, так как желательно сохранить В-клеточные эпитопы. Термин "животное" обычно обозначает в данном контексте вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Homo sapiens, Canis domesticus и т.д., а не только одно-единственное животное. Однако этот термин обозначает также популяцию таких видов животных, так как важно, что у всех индивидуумов, иммунизированных в соответствии со способом согласно изобретению, все захватывают, по существу, один и тот же TNF, что позволяет производить иммунизацию этих животных одним и тем же иммуногеном (одними и теми же иммуногенами). Если, например, генетические варианты TNF существуют у различных популяций человека, может быть необходимо использование различных иммуногенов в этих различных популяциях для разрушения аутотолерантности против TNF в каждой популяции. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что животное в данном контексте является существом, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно это животное является позвоночным животным, таким как млекопитающее. Под термином "понижающая регуляция" ("отрицательная регуляция") здесь подразумевается снижение биологической активности TNF в живом организме (например, посредством интерференции с взаимодействием между белком TNF и биологически важными партнерами связывания для этой молекулы). Понижающая регуляция может быть получена посредством нескольких механизмов, наиболее простым является простая интерференция с активным сайтом в мультимерном белке посредством связывания антитела. Однако в объеме данного изобретения находится также то, что связывание антитела приводит к удалению мультимерного белка гистиоцитами-макрофагами (такими, как макрофаги и другие фагоцитарные клетки). Выражение "выполнение презентации иммунной системе" обозначает, что иммунная система животного подвергается иммунизации контролируемым образом. Как видно из приведенного ниже описания, такая иммунизация иммунной системы может быть выполнена несколькими путями, наиболее важными из которых являются вакцинация содержащими полипептид "фармакцинами" (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления существующего заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту "фармакцинами". Важный результат, который должен быть достигнут, заключается в том, что иммунокомпетентные клетки в животном конфронтируют с этим антигеном иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата является менее важным для изобретательской идеи, лежащей в основе данного изобретения. Термин "иммунногенно эффективное количество" имеет свое значение в данной области, т.е. это количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунную реакцию, которая значимо связыва-6 008254 ет патогенные агенты, имеющие общие иммунологические признаки с данным иммуногеном. При использовании выражения, что TNF был "модифицирован", здесь имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет каркас аутологичного белка. Такой модификацией может быть, например, дериватизация (например, алкилирование, ацилирование, этерификация и т.д.) определенных аминокислотных остатков, но, как будет понятно из описания ниже, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности (или добавления к ней). При обсуждении "аутотолерантности в отношении TNF" понятно, что, поскольку TNF является аутологичным белком в подлежащей вакцинации популяции, нормальные индивидуумы в этой популяции не развивают иммунную реакцию против него; хотя нельзя исключить того, что случайные индивидуумы в популяции животных могут быть способны продуцировать антитела против нативного TNF,например, как часть аутоиммунного нарушения. В любом случае, вид животного обычно обладает аутотолерантностью в отношении только его собственного TNF, но нельзя исключить того, что аналоги,полученные из другого вида животного или из популяции, имеющей отличающийся фенотип, могут также переноситься указанным животным."Чужеродный Т-клеточный эпитоп" (или "чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп") является пептидом, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки в виде животного, - таким образом, является взаимозаменяемым термином. Предпочтительные чужеродные Т-клеточные эпитопы в данном изобретении представляют собой "смешанные" (или "универсальные", или "широкого спектра") эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с существенной долей определенного класса молекул МНС в виде или в популяции животных. Известно только очень ограниченное количество таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Следует отметить,что для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными у как можно большей части популяции животных, может потребоваться 1) инсертирование нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) приготовление нескольких аналогов, в каждый из которых инсертирован отличающийся смешанный эпитоп. Следует отметить также, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также использование криптических (латентных) Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые получены из аутологичного белка и которые проявляют свое иммуногенное поведение только при существовании в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка."Чужеродным Т-хелперным лимфоцитарным эпитопом" (чужеродным ТH-эпитопом) является чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывает молекулу МНС Класса II и может презентироваться на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК), связанной с молекулой МНС Класса II. Таким образом, "связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательностью, которая является гетерологичной относительно мультимерного белка", является связывающий МНС Класса II пептид, который не существует в TNF. Такой пептид, если он является также действительно чужеродным для вида животного, захватывающего этот мультимерный белок, будет чужеродным ТH-эпитопом."Функциональной частью" (био)молекулы является в данном контексте часть молекулы, которая является ответственной по меньшей мере за часть биохимических или физиологических эффектов, проявляемых этой молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за эффекты, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут служить цели стабилизации или увеличения растворимости и, следовательно, могут быть опущены, если эти цели не имеют значения в контексте определенного варианта воплощения данного изобретения. Однако согласно данному изобретению предпочтительно использовать как можно большую часть этой полимерной молекулы, так как фактически было продемонстрировано увеличение стабильности при использовании описанных здесь мономеров. Термин "адъювант" используется здесь в обычном для области вакцинной технологии значении, т.е. как вещество или композиция, которые 1) сами не способны развивать иммунную реакцию против иммуногена вакцины, но которые 2) тем не менее, способны усиливать иммунную реакцию против данного иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только адъювантом не вызывает иммунной реакции против иммуногена, вакцинация иммуногеном может вызвать или может не вызывать иммунную реакцию против этого иммуногена, но комбинирование вакцинации иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунную реакцию против данного иммуногена, которая является более сильной, чем иммунная реакция, индуцированная только иммуногеном."Нацеливание" молекулы в данном контексте означает ситуацию, в которой молекула при введении в животное будет оказываться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связываться с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться несколькими путями, в том числе путем составления данной молекулы в композиции, облегчающие нацеливание, или путем введения в эту молекулу групп, которые облегчают нацеливание. Этот вопрос будет обсуждаться подробно ниже."Стимуляция иммунной системы" означает, что рассматриваемые вещество или композиция прояв-7 008254 ляют общее, неспецифическое иммуностимуляторное действие. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких, как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является повышение "состояния готовности" иммунной системы, что означает, что одновременная или последующая иммунизация иммуногеном индуцирует значимо более эффективную иммунную реакцию в сравнении с отдельным использованием данного иммуногена. Характеристики детоксифицированных иммуногенных аналогов TNF согласно изобретению Очень выгодно, если иммуногенный аналог в соответствии с данным изобретением воспроизводит,в существенных фрагментах, существенную фракцию В-клеточных эпитопов, обнаруживаемых в нативном, биологически активном TNF. Существенной фракцией В-клеточных эпитопов в данном контексте является доля В-клеточных эпитопов, которые антигенно характеризуют TNF в сравнении с другими белками. Предпочтительно эти существенные фрагменты отображают, по существу, все В-клеточные эпитопы, обнаруживаемые в соответствующих мономерах TNF, когда они являются частью полимерного белка, - конечно, может быть необходимо введение минорных изменений в последовательность мономера TNF. Например, как объяснено выше, аминокислотную последовательность из мономерной единицы модифицируют с использованием инсерции, замены, делеции или добавления аминокислот таким образом, чтобы уменьшить токсичность аналога TNF в сравнении с нативным белком, и/или таким образом, чтобы ввести связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность, если нежелательно или неудобно иметь эту последовательность, расположенную в линкере. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения обеспечивается иммуногенный аналог TNF согласно изобретению, где каждая из существенных фракций содержит, по существу, полную аминокислотную последовательность каждой мономерной единицы TNF, либо в виде непрерывной последовательности, либо в виде последовательности, включающей в себя инсерты. То есть лишь незначительные части последовательности мономерной единицы TNF отсутствуют в этом аналоге, например,в случаях, когда такая последовательность не вносит вклад в третичную структуру мономерной единицы или четвертичную структуру TNF. Однако в этом варианте воплощения возможность замены или инсерции в мономере существует до тех пор, пока сохраняется трехмерная структура этого мультимерного белка TNF. Таким образом, особенно выгодно, если иммуногенный аналог TNF является аналогом, в котором аминокислотные последовательности всех мономерных единиц TNF представлены в данном аналоге, и особенно предпочтительно, если этот аналог включает в себя полные аминокислотные последовательности (всех) мономеров, составляющих TNF, либо в виде неразорванных последовательностей,либо в виде последовательностей, включающих в себя инсерты. Таким образом, очевидно, что предпочтительно, чтобы трехмерная структура полного нативного,биологически активного TNF, по существу, сохранялась в аналоге. Демонстрация сохранения существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже трехмерной структуры TNF, которая подвергнута модификации, описанной здесь, может быть получена несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против нативного TNF (например, антисыворотки, полученной в кролике), и после этого использование этой антисыворотки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном ELISA) против модифицированных белков, которые получают. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в такой же степени с этой антисывороткой, что и нативная молекула, должны рассматриваться как имеющие такую же трехмерную структуру, что и нативная молекула, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность с такой антисывороткой, рассматриваются как имеющие сохраненную существенную фракцию исходных В-клеточных эпиопов. Альтернативно, ряд выбранных моноклональных антител, реактивных с отдельными эпитопами на нативном TNF, может быть получен и использован в качестве тест-панели. Этот подход имеет преимущество, заключающееся в том, что он позволяет 1) картировать эпитопы TNF и 2) картировать эпитопы,которые сохранились в полученных аналогах. Конечно, третьим подходом является сравнение установленной трехмерной структуры нативногоTNF с установленной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть разрешена при помощи рентгенографических исследований и ЯМР-спектроскопии. Дополнительную информацию, касающуюся третичной структуры, можно в некоторой степени получить из исследований методом кругового дихроизма, преимущество которого в том, что требуется только полипептид в чистой форме (в то время, как рентгенография требует обеспечения кристаллического полипептида, а ЯМР требует обеспечения изотопических вариантов этого полипептида) для обеспечения полезной информации в отношении третичной структуры конкретной молекулы. Однако, в конечном счете, рентгенография и/или ЯМР являются необходимыми для получения заключительных данных, так как круговой дихроизм может давать только опосредованное доказательство правильной трехмерной структуры через информацию об элементах вторичной структуры. Иммуногенный аналог TNF согласно изобретению может включать в себя пептидный линкер, ко-8 008254 торый включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность или способствует присутствию в этом аналоге по меньшей мере одной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности, которая является гетерологичной относительно этого мультимерного белка. Это особенно выгодно в тех случаях, когда нежелательно изменять аминокислотную последовательность, соответствующую мономерным единицам в TNF. Альтернативно, этот пептидный линкер может не содержать связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности или не способствовать присутствию связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности в виде животного, из которого был получен этот белок TNF; это может быть удобным образом выполнено в случаях, когда необходимо использовать очень короткий линкер, или это, как в данном изобретении,является существенным для детоксификации потенциально токсичного аналога, например, введением связывающего МНС Класса II элемента в активный сайт. Предпочтительным является то, что связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность связывает большинство молекул МНС Класса II из вида животного, из которого был получен мультимерный белок, т.е. связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность является универсальной или смешанной. Конечно, важно, что эта последовательность служит своей цели в качестве Т-клеточного эпитопа в виде, для которого этот иммуноген предназначен в качестве вакцинного компонента. Существует ряд природных "смешанных" Т-клеточных эпитопов, которые являются активными у большой доли индивидуумов видов животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в вакцине, тем самым уменьшая необходимость в очень большом количестве различных аналогов в одной и той же вакцине. Таким образом, по меньшей мере одна связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность предпочтительно выбрана из природного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей MHC-II пептидной последовательности. Особенно предпочтительными последовательностями являются природный Т-клеточный эпитоп, выбранный из эпитопа столбнячного токсоида, такой как Р 2 (SEQ ID NO: 2) или Р 30 (SEQ ID NO: 4), эпитоп дифтерийного токсоида, эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и эпитопCS P. falciperum. На протяжении ряда лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую долю молекул HLA-DR,кодируемых различными аллелями HLA-DR, и они все являются возможными Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые в соответствии с данным изобретением. Сравните также эпитопы,обсуждаемые в следующих ссылках, которые все включены сюда посредством ссылки: WO 98/23635J. et al., 1993, Cell 74: 197-203 и Falk K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. В последней ссылке также рассматриваются HLA-DQ и -DP-лиганды. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, являются релевантными в качестве природных эпитопов-кандидатов, подлежащих использованию в данном изобретении, а также эпитопы, имеющие общие с ними мотивы. Альтернативно, эпитопом может быть любой искусственный Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую долю молекул МНС Класса II. В этом контексте пептиды пан-DR-эпитопа ("PADRE"), описанные в WO 95/07707 и в соответствующей статье Alexander J. et al., 1994, Immunity 1: 751761 (оба описания включены сюда посредством ссылки), являются эпитопами-кандидатами для использования в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что наиболее эффективные пептидыPADRE, описанные в этих статьях, несут D-аминокислоты на С- и N-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение нацелено, прежде всего, на включение релевантных эпитопов в качестве части аналога, которые должны быть впоследствии ферментативно разрушены внутри липосомного компартмента АПК, чтобы сделать возможной последующую презентацию в контексте молекулы MHC-II, и, следовательно, нецелесообразно включать D-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении. Одним особенно предпочтительным пептидом PADRE является пептид, имеющий аминокислотную последовательность AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 6 и 8) или его иммунологически эффективную субпоследовательность. Этот и другие эпитопы, имеющие то же самое отсутствие рестрикции по МНС,являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах,используемых в способе согласно изобретению. Такие суперсмешанные эпитопы делают возможными самые простые варианты осуществления изобретения, в которых только один-единственный модифицированный TNF презентируется иммунной системе вакцинированного животного. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают в себя модификацию посредством введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного ТH-эпитопа. Понятно, что вопрос иммунной доминантности ТH-эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Как используется здесь, термин "иммунодоминантности" относится просто к эпитопам, которые у вакцинированных индивидуумов приводят к возникновению значимой иммунной реакции, но хорошо известно, что ТHэпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме, необязательно является иммуно-9 008254 доминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже если он способен связывать молекулыMHC-II в последнем индивидууме. Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено путем введения по меньшей мере одной инсерции, добавления, делеции или замены аминокислоты. Конечно, в обычном случае будет осуществляться введение более одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции полного Т-клеточного эпитопа или замены полного Т-клеточного эпитопа), но важной задачей, которая должна быть достигнута, является то, чтобы этот аналог при процессировании антигенпрезентирующей клеткой (АПК) приводил к такому Т-клеточному эпитопу, представленному в контексте с молекулой МНС Класса II на поверхности АПК. Таким образом, если аминокислотная последовательность мономерной единицы в подходящих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Т-клеточном эпитопе, то введение чужеродного ТH-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот этого чужеродного эпитопа посредством инсерции, добавления, делеции или замены аминокислот. Другими словами, необязательно вводить полный ТH-эпитоп инсерцией или заменой. Согласно данному изобретению аналог может также образовывать часть большей молекулы, в которой он связан по меньшей мере с одной функциональной частью молекулы, присутствие которой в значительной степени отрицательно не влияет на доступность антитела этого аналога. Природа таких частей молекул (которые могут быть слиты с аналогом) может быть такой, что она обеспечивает нацеливание этой модифицированной молекулы на антигенпрезентирующую клетку (АПК) или В-лимфоцит,для стимуляции иммунной системы и для оптимизации презентации этого аналога иммунной системе. Нацеливающие части молекул предпочтительно выбирают из группы, состоящей из партнера, по существу, специфического связывания для В-лимфоцит-специфического поверхностного антигена или для АПК-специфического поверхностного антигена, такого как гаптен или углевод, для которых имеется рецептор на В-лимфоците или АПК. Иммуностимулирующие части могут быть выбраны из группы, состоящей из цитокина, гормона и белка теплового шока. Оптимизирующая презентацию часть молекулы может быть выбрана из группы, состоящей из липидной группы, такой как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранилгеранильная группа, GPI-якорь и N-ацилдиглицеридная группа. Подходящим цитокином является интерферон(IFN), Flt3L, интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2(IL-2), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12) интерлейкин 13 (IL-13), интерлейкин 15 (IL-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или эффективная часть любого из них. Подходящим белком теплового шока является HSP70, HSC70, GRP94 и калретикулин (CRT) или эффективная часть любого из них. Предпочтительно, чтобы количество аминокислотных инсерций, делеций,замен или добавлений было равно по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21 и 25 инсерциям, заменам, добавлениям или делециям. Кроме того, предпочтительно,чтобы количество аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений не превышало 150, например было равно максимально 100, максимально 90, максимально 80 и максимально 70. Особенно предпочтительно, чтобы количество замен, инсерций, делеций или добавлений не превышало 60, и в частности это количество не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительно это количество равно не более 30. Что касается добавлений аминокислот, следует отметить, что, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, их количество часто является значительно более высоким, чем 150. Предпочтительные варианты согласно изобретению включают в себя модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного ТH-эпитопа (="чужеродной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности"). Будет понятно, что вопрос иммунодоминантности ТH-эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Как используется здесь, термин "иммунодоминантность" относится просто к эпитопам, которые в вакцинированном животном приводят к возникновению значимой иммунной реакции, но хорошо известно, что ТH-эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме, необязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже если он способен связывать молекулы MHC-II в последнем индивидууме. Другим важным моментом является проблема рестрикции по МНС ТH-эпитопов. Обычно природные ТH-эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенный пептид, составляющий ТHэпитоп, будет эффективно связываться только с субпопуляцией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев использование одного специфического ТH-эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который является эффективным только в части этой популяции, и, в зависимости от размера этой фракции, может быть необходимым включение большего количества ТH-эпитопов в ту же самую молекулу или, альтернативно, приготовление мультикомпонентной вакцины, в которой эти компоненты являются вариантами, которые отличаются друг от друга природой введенного ТH-эпитопа. Если рестрикция по МНС Т-клеток является полностью неизвестной (например, в ситуации, когда вакцинируемое животное имеет плохо определенный состав МНС), часть популяции животных, охватываемая конкретным составом вакцины, может быть определена с использованием следующей формулы: где pi является частотой в популяции респондеров на ith чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в вакцинной композиции, а n равно общему количеству чужеродных Т-клеточных эпитопов в вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющая частоты реакции в этой популяции 0,8, 0,7 и 0,6, соответственно, будет давать т.е. 97,6% этой популяции будет статистически развивать MHC-II-опосредованную реакцию на эту вакцину. Приведенная выше формула не приложима в ситуациях, когда более или менее точная картина МНС-рестрикции этих пептидов является известной. Если, например, определенный пептид связывает только молекулы MHC-II человека, кодируемые аллелями DR1, DR3, DR5 и DR7 HLA-DR, то применение этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы MHC-II, кодируемые аллелями HLA-DR, будет давать 100% охват в рассматриваемой популяции. Подобным образом,если второй пептид связывает только DR3 и DR5, добавление этого пептида вообще не будет увеличивать охвата. Если оценивать реакцию популяции, основываясь исключительно на МНС-рестрикции Тклеточных эпитопов в вакцине, часть этой популяции, охватываемая специфической вакцинной композицией, может быть определена по следующей формуле: где i является суммой частот в этой популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС,которые связывают любой один из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к jth из 3 известных HLA-локусов (DP, DR и DQ); на практике, сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в этой вакцине, после чего эти молекулы МНС перечисляют по типу (DP, DR и DQ), затем индивидуальные частоты разных перечисленных аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, с получением в результате 1, 2 и 3. Может быть ситуация, когда величина pi в формуле I превышает теоретическую величину ni: где vj является суммой частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают ith Т-клеточный эпитоп в вакцине и которые принадлежат к jth из 3 известных HLA-локусов (DP, DR и DQ). Это означает, что в 1-ni популяции имеется частота респондеров fresidualI=(pi-i)/(1-i). Таким образом, формула II может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу IV: где член fresiduali принимают за ноль, если он отрицательный. Следует отметить, что формула V требует,чтобы все эпитопы были картированы по гаплотипу против идентичных наборов гаплотипов. Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналоги согласно изобретению важно учитывать все доступные сведения об этих эпитопах: 1) частоту респондеров в данной популяции для каждого эпитопа, 2) данные по МНС-рестрикции и 3) частоту в популяции релевантных гаплотипов. Следует отметить, что предпочтительные аналоги согласно изобретению содержат модификации, которые приводят к полипептиду, который включает в себя отрезки (участки), имеющие последовательности,идентичные по меньшей мере на 70% соответствующим мономерным единицам TNF или их субпоследовательностям с длиной по меньшей мере 10 аминокислот. Предпочтительной является более высокая идентичность последовательностей, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80 или 85%. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (Nref-Ndif)100/Nref,где Ndif равно общему числу неидентичных остатков в этих двух последовательностях при сопоставлении и где Nref равно числу остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, ДНК-последовательность AGTCAGTC будет идентична последовательности ААТСААТС на 75% (Ndif=2 и Nref=8). Наконец, для заключительного подтверждения, что аналог TNF согласно изобретению действительно является эффективным в качестве иммуногена, могут быть выполнены различные тесты для обеспечения необходимого подтверждения. В этой связи сюда включена ссылка на WO 00/65058, где обсуждается идентификация применимых аналогов IL-5, - это описание может быть использовано для подтверждения применимости рассматриваемого аналога (полученного из IL-5 или не полученного из IL-5) в способе согласно изобретению. Предпочтительный аналог TNF выбирают из группы, состоящей из 1) двух или трех полных мо- 11008254 номеров TNF, соединенных непрерывно (один за другим) пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность, и 2) двух или трех полных мономеров TNF, соединенных непрерывно(один за другим) инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из мономеров включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность или где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность слита с N- или С-концевым мономером, необязательно через инертный линкер. Особый интерес представляют иммуногенные молекулы TNF с высокой стабильностью, так как ранее авторами изобретения было обнаружено, что мономерные конструкции TNF имеют тенденцию быть относительно нестабильными, см., однако, обсуждение ниже. Ранее был получен ген, кодирующий 3 субъединицы TNF, связанные вместе эпитопами и/или инертными пептидными линкерами. Задачей было создание вариантных молекул TNF с конформацией настолько близкой к нативному тримеру TNF, насколько это возможно. Эти варианты были сконструированы для эффективной индукции нейтрализующих антител против wtTNF. Было обнаружено, что наиболее подходящие варианты TNF являются растворимыми и стабильными белками в отсутствие детергентов или другого типа добавок, которые могли бы нарушать конформацию белка. Последующее обсуждение сосредоточено на предпочтительных модификациях TNF, которые не относятся к детоксификации per se. Посредством экспрессии трех мономеров, связанных вместе в виде одной-единственной полипептидной цепи с использованием линкеров и ТH-эпитопов, предполагается получить варианты TNF, которые являются более стабильными, чем прежние вариантные иммуногены TNF. Это позволяет сохранить структуру TNF посредством введения необходимых ТH-эпитопов вне стабилизирующих водородных связей, солевых мостиков или дисульфидных мостиков. Из кристаллической структуры TNF, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа, видно,что первые 5 остатков N-конца являются слишком гибкими, чтобы сделать возможным определение структуры. Однако С-конец расположен близко к середине границы раздела мономеров и является менее гибким. Расстояние между С-альфа-атомами Arg-6 и Leu-157 равно 10 , что соответствует отрезку 3-4 аминокислотных остатков. Таким образом, связывание этих мономерных субъединиц непосредственно вместе оказывается возможным, но, поскольку С-концы расположены в чувствительном сайте, предпочтительно использовать гибкие линкеры, например глициновые линкеры, для этого соединения. Пока сконструировано пять вариантов, в которых используется подход "мономеризованного тримера". Контрольный TNFT0 (TNF-тример номер 0, SEQ ID NO: 22 в WO 03/042244) состоит из трех мономеров, непосредственно связанных вместе 2 отдельными глициновыми линкерами (GlyGlyGly).TNFT0 сконструирован таким образом, чтобы он был таким же стабильным, как и тримерный белок дикого типа. Конечно, другие инертные гибкие линкеры, известные в области химии белков, могут быть использованы вместо вышеупомянутых глициновых линкеров, причем важным признаком является то,что этот гибкий линкер не должен действовать неблагоприятным образом на способность фолдинга мономеризованного белка в трехмерную структуру, которая является сходной с трехмерной структурой физиологически активного wtTNF. Конструкция TNFT0 экспрессируется в виде растворимого белка в Е. coli, и она была использована для получения конструкции-примера TNFT4 (см. WO 03/042244), которая является вариантом, в котором введен связывающий МНС Класса II PADRE (SEQ ID NO: 6). В этой конструкции отношение между мономерными единицами и чужеродными эпитопами равно, следовательно, 1 эпитопу на 3 мономера,вместо отношения 1 эпитоп на мономер, как это имеет место в вариантах предыдущего уровня техники,которые основаны на иммуногенизированных мономерных белках (это также имеет место для SEQ IDNO: 55 в WO 03/042244). Этот факт обеспечивает потенциально положительное влияние на стабильность тримера. Полученным при таком подходе продуктом является вариант TNFC2 (см. WO 03/042244), который является мономером TNF с эпитопом PADRE в том же положении, что и положение в TNFT4. Параллельно, эпитопы столбнячного токсоида Р 2 и Р 30 (SEQ ID NO: 2 и 4, соответственно) использовали в вариантах TNFT1 и TNFT2 (см. WO 03/042244), содержащих один эпитоп в каждом линкерном районе, а также в TNFT3 (см. WO 03/042244), который содержит один С-концевой эпитоп и один эпитоп во втором линкерном районе. Белки являются, в основном, уложенными от N-конца к С-концу. Идея, лежащая в основе TNFT3, заключается в том, что, когда первые два N-концевых домена уложены,они будут функционировать как внутренние шепероны для третьего домена (мономера), который фланкирован эпитопами. В WO 03/042244 описано, что, кроме способа, описанного подробно выше, где полимерные белки являются "мономеризованными", TNF (и, возможно, другие мультимерные белки) позволяют получать мономеры, которые 1) включают в себя по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию и/или 2) включают в себя по меньшей мере одну не происходящую из TNF связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность, где эти мономерные варианты TNF способны правильно укладываться в- 12008254 третичную структуру, которая затем делает возможным образование димерных и тримерных белковTNF, имеющих правильную четвертичную структуру (что доказывается этими белками, имеющими рецепторсвязывающую активность). Таким образом, в этих конструкциях можно было получить варианты мономерного TNF, который необязательно должен быть образован в виде мономеризованных тримеров, так как изменения, вводимые в мономерные последовательности, вводят настолько ограниченное нарушение третичной структуры мономера, что может образовываться ди- или тример. В соответствиии с идеями, лежащими в основе данного изобретения, дополнительно было обнаружено, что все такие варианты являются экспрессируемыми в виде растворимых белков из бактериальных клеток. Таким образом, была показана возможность получения иммуногенных вариантов TNF в соответствии со следующими стратегиями, которые могут быть объединены и которые могут быть дополнительно объединены с уже обсужденным "подходом мономеризации" согласно изобретению (так как все эти конкретные модификации являются недеструктивными по природе). Стратегия гибкой петли Авторами данного изобретения было обнаружено, что инсерция эпитопа PADRE (SEQ ID NO: 6) в петлю 3 в положении Gly108-Ala109 является перспективным подходом к получению вариантов TNF со структурой, близко сходной с нативной молекулой TNF. На основании кристаллической структурыTNF было установлено, что ТH-эпитоп, инсертированный непосредственно в это положение, не будет иметь по соседству никаких близко расположенных для взаимодействия с ним аминокислотных остатков. Исследования с TNF34 (см. WO 03/042244), первой конструкцией PADRE, изготовленной в соответствии с этим подходом, показали, что приблизительно 5% экспрессируемого белка TNF34 были растворимыми в Е. coli и 95% TNF34 экспрессировались в виде телец включения при выращивании бактериальных клеток-хозяев при 37 С, но после адаптации ферментационного процесса, где температура ферментации 25 С, выходы растворимого белка в случае такой ферментации были близки к 100%. Таким образом, оптимизация условий выращивания увеличивает выход растворимого белка. Был получен ряд других конструкций (TNF35-TNF39, см. WO 03/042244), которые все основаны только на введении PADRE в гибкую петлю 3. Далее предполагается в соответствии с данным изобретением, что введение чужеродного эпитопа может быть произведено в других частях петли 3 или даже вне петли 3. Особенно интересные инсерции рассматриваются, и инсерция чужеродного эпитопа, такого какPADRE или Р 2 или Р 30, может быть предпочтительно получена после любой из аминокислот 95, 96, 97,98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 118 вTNF человека. Однако выгодными считаются также замены в том же самом диапазоне аминокислот(т.е. замена одной-единственной или нескольких последовательных аминокислот 95, 96, 97, 98, 99, 100,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 118 в TNF человека). Усиливающие стабильность мутации Введение ТH-эпитопов в гибкой петле 3 могло бы потенциально дестабилизировать структуру варианта TNF. Однако этой потенциальной дестабилизации может быть противопоставлена стабилизация этой структуры посредством введения цистеинов, которые будут образовывать дисульфидный мостик. До сих пор пара цистинов в двух различных положениях была введена в вариантах TNF34-A и TNF34-B(см. WO 03/042244). Параллельно может быть также делетирован гибкий N-конец (первые 8 аминокислот), который, как известно, уменьшает силу взаимодействия с рецептором, с получением вариантаTNF34-C (см. WO 03/042244). Дисульфидный мостик вводят в мономер для стабилизации сайта инсерции эпитопа вместе с природным дисульфидным мостиком (Cys-67 Cys-101). Считается, что в случае такой стратегии также стабилизируется как мономер TNF, так и мономеризованный ди- или тример. Другие конструкции Несколько разных стратегий использовали при конструировании вариантов, которые будут растворимыми продуктами экспрессии. TNFX1.1-2 (см. WO 03/042244) основан на инсерциях PADRE в первую петлю TNF, где сайт инсерции локализован в области интрона. В TNFX2.1 (см. WO 03/042244) создан искусственный район "ножки", содержащий инсерцию PADRE. В результате мутаций TNF было выявлено, что большие замены гидрофобных аминокислот, направленные в область контакта тримера, стабилизируют структуру тримера. TNFX3.1 и TNFX3.2 (см.WO 03/042244) являются предложениями стабилизировать существующий вариант TNF34. В случаеTNFX4.1 (см. WO 03/042244) используются диглициновые линкеры для уменьшения структурных ограничений из-за пептида PADRE на общую структуру TNF34. В TNFX5.1 (см. WO 03/042244) используется, в качестве точки инсерции, структура петли, обнаруженная у члена семейства TNF BlyS. TNFX6.1-2,TNF7.1-2 и TNFX8.1 (см. WO 03/042244) являются дополнительными вариантами. TNFX9.1 и TNFX9.2(см. WO 03/042244) являются вариантами TNF34, в которых использованы идентичные перекрывающиеся TNF-последовательности из 4-6 аминокислот, как перед эпитопом, так и после эпитопа. Наконец, два варианта (SEQ ID NO: 46 и 47 в WO 03/042244) являются двойными вариантами Р 2/Р 30 в том же самом положении, что и пептид PADRE в TNF34. Далее, было обнаружено в кристаллической структуре TNF, что один стабилизирующий солевой мостик присутствует в мономере TNF между остатками Lys-98 и Glu-116. Объяснением солевого мос- 13008254 тика является электростатическое взаимодействие между атомами кислорода боковых цепей Asp или Glu и положительно заряженными атомами азота боковых цепей Arg, Lys или His с межатомным расстоянием менее 7,0 . Посредством сайт-направленных мутаций-замен Lys-98 на Arg или His в этом положении в комбинации с заменами Glu-116 на Asp может быть достигнуто улучшение стабильности солевого мостика и тем самым стабильности тримерной молекулы. Можно также заменить эти солевые мостики на дисульфидные мостики, как описано выше. Обнаружено, что мышиный TNF является значительно более стабильным, чем TNF человека, в отношении растворимости и протеолиза. Улучшение вариантов TNF включает в себя получение сайтнаправленных мутантов, так чтобы имитировать кристаллическую структуру мышиного TNF, для получения более протеолитически стабильного продукта TNF. Из рентгеновских структур TNF человека и мыши видно, что центр тримера (в середине трех мономеров TNF) удерживается вместе вследствие гидрофобных сил, в то время как верхняя часть и нижняя часть тримера соединены вследствие природных солевых мостиков. Таким образом, посредством скрининга этих солевых мостиков на более сильные связи стабильность тримера TNF также может быть улучшена. В целом, до сих пор были получены следующие специфические варианты TNF.- 14008254 Используемая здесь нумерация ведется от N-концевого V в SEQ ID NO: 10 (т.е. от аминокислоты 2 в SEQ ID NO: 10). Предшествующий N-концевой валин является в некоторых последовательностях метионином, используемым в качестве сайта трансляции. Все обсуждаемые выше варианты TNF, которые описаны в WO 03/042244, являются детоксифицированными согласно данному изобретению. В данной области известен ряд точковых мутаций, необходимых для детоксификации TNF или, по меньшей мере, уменьшения токсичности в наибольшей степени. Эти точковые мутации будут, если необходимо, вводиться в варианты согласно изобретению. Особенно предпочтительными мутациями являются замены, соответствующие зрелому TNF, Tyr-87 на Ser, Asp-143 на Asn и Аlа-145 на Arg. Далее,все эффективные мутации, упомянутые в Loetscher, H., Stueber, D., Banner, S., Mackay, F. и Lesslauer, W. 1993 JBC 268 (35) 26350-7, также являются представляющими интерес детоксифицирующими мутациями в вариантах воплощения согласно изобретению. Эти точковые мутации могут быть использованы с любой из конкретных конструкций, описанных в WO 03/042244. Таким образом, наиболее предпочтительными конструкциями белка согласно изобретению являются конструкции, представленные любой из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, а также любая аминокислотная последовательность, полученная из них, которая включает в себя только консервативные замены аминокислот. В любом случае, важным вариантом осуществления является то, что все из обсужденных выше вариантов TNF могут экспрессироваться в виде растворимых белков из бактериальных клеток, таких как Е. coli. Предпочтительным вектором является рЕТ 28b+, когда задачей является экспрессия из Е. coli,p2Zop2F (SEQ ID NO: 60 в WO 03/042244) является вектором, используемым для экспрессии в клетках насекомых, и рНР 1 (или его коммерчески доступный "близнец" рСI) является вектором, используемым для экспрессии в клетках млекопитающих. Общие терапии, обеспечиваемые данным изобретением Данное изобретение относится к способам, посредством которых становится возможной очень выгодным образом понижающая регуляция TNF очень выгодным образом. В общем, обеспечен способ понижающей регуляции TNF у аутологичного хозяина, предусматривающий выполнение презентации иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога TNF согласно изобретению. Предпочтительно этим аутологичным хозяином является млекопитающее, наиболее предпочтительно человек. Этот способ может быть применен на практике различными путями, одним из которых является введение белковой вакцины, но стратегия вакцинации нуклеиновыми кислотами или стратегия живой вакцинации также представляют интерес. Белковая/полипептидная вакцинация и приготовление композиции При выполнении презентации аналогов иммунной системе животного посредством введения их этому животному в технологии приготовления полипептида следуют принципам, общепризнанным в данной области. Приготовление вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как представлено в качестве примера в патентах США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые включены сюда посредством ссылки. Обычно такие вакцины готовят как для инъекций, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены в твердой форме, пригодной для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими эксципиентами являются, например,вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферирующие рН агенты или адъюванты, которые усиливают эффективность этих вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже. Вакцины обычно вводят парентерально, инъекцией, например, либо подкожно, внутрикожно, либо внутримышечно. Другие готовые формы, которые являются пригодными для других способов введения,включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, сублингвальные,внутрибрюшинные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные композиции. Для суппозиториев традиционные связывающие вещества и носители могут включать в себя,например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые эксципиенты, как, например, фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натрий-сахарина, целлюлозы, карбоната магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, форм пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25- 15008254 70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером композиции (а также возможным партнером конъюгации) является холерный токсин. Полипептиды могут быть составлены в вакцину в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами пептида), которые образованы с неорганическими солями, такими как, например, хлористо-водородная и фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая,винная, миндальная кислоты и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также образованы из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия,аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин,триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п. Вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от получающего лечение субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума развивать иммунную реакцию и от степени желаемой защиты. Подходящие диапазоны доз являются диапазонами порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на вакцинацию с предпочтительным диапазоном приблизительно от 0,1 до 2000 мкг (хотя обсуждаются даже еще более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне приблизительно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг, и в частности в диапазоне приблизительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для первоначального введения и бустерных инъекций также являются вариабельными, но обычно характеризуются начальным введением, за которым следуют последующие инокуляции или другие введения. Способ применения может широко варьироваться. Любые из общепринятых способов введения вакцины являются применимыми. Они включают в себя пероральное введение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентеральное введение, инъекцией или т.п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет варьироваться в зависимости от возраста вакцинируемого субъекта и композиции антигена. Некоторые аналоги вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунная реакция будет усиливаться, если эта вакцина дополнительно содержит вещество-адъювант. Известны различные способы достижения адъювантного эффекта для вакцины. Общие принципы и способы подробно описаны в "Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. StewartTull (ed.), John WileySons Ltd. ISBN 0-471-95170-6, а также в "Vaccines: New Generation ImmunologicalAdjuvants", 1995, Gregoriadis G. et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, обе включены сюда посредством ссылки. Особенно предпочтительно использование адъюванта, который, как может быть продемонстрировано, облегчает разрушение аутотолерантности к аутоантигенам. Неограничивающие примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из иммуннонацеливающего адъюванта; иммунномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллу адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикса ISCOM); частицы; DDA; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; инулина и инкапсулирующего адъюванта. В целом, следует отметить, что приведенные выше описания,которые относятся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в этих аналогах, относятся также mutatis mutandis к их использованию в адъюванте вакцины согласно изобретению. Применение адъювантов включает в себя использование таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемых в виде 0,05-0,1% раствора в забуференном солевом растворе,смеси с синтетическими полимерами cахаров (например, Carbopol), используемыми в виде 0,25% раствора, и возможна агрегация белка в вакцине при нагревании до температур в диапазоне между 70 и 101 С в течение периодов 30 с - 5 мин, соответственно, а также агрегация сшивающими агентами. Может быть также использована агрегация, которая получена в результате реактивации обработанных пепсином антител (Fab-фрагментов) против альбумина, смесь с бактериальными клетками, такими как С. parvum,или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамположительных бактерий, эмульгирование в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как моноолеат маннида (Aracel A),или эмульгирование с 20% раствором перфторуглерода (Fluosol-DA), используемым в качестве блокзаменителя. Предпочтительны также смеси с маслами, такими как сквален и IFA. В соответствии с данным изобретением DDA (бромид диметилдиоктадециламмония) является представляющим интерес адъювантом-кандидатом, как и ДНК и -инулин, но также полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины Quillaja, такие как QuilA и QS21, представляют интерес, как иRIBI. Кроме того, возможно применение монофосфориллипида A (MPL), вышеуказанных С 3 и C3d и мурамилдипептида (MDP). Известно также, что липосомные композиции обладают адъювантным действием, и, следовательно,липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением. Кроме того, иммуностимулирующие адъюванты комплексного матриксного типа (матриксISCOM) являются предпочтительными согласно изобретению, в частности, поскольку было показано,что этот тип адъювантов способен положительно регулировать экспрессию МНС Класса II клетками АПК. Матрикс ISCOM состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) изQuillaja saponaria, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция является тем, что называют ISCOM-частицей, в которой сапонин составляет 60-70 мас.%, холестерин и фосфолипид 10-15 мас.% и белок 10-15 мас.%. Подробности, касающиеся состава и применения иммуностимулирующих комплексов, могут быть найдены в вышеупомянутых справочниках по адъювантам, а также у Morein В. et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475, а также уBarr I.G. and Mitchell G.F., 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (обе включены сюда посредством ссылки),которые обеспечивают полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов. Другой представляющей большой интерес (и, следовательно, предпочтительной) возможностью получения адъювантного эффекта является использование способа, описанного в Gosselin et al., 1992(включенном сюда посредством ссылки). Вкратце, презентация релевантного антигена, такого как антиген согласно изобретению, может быть усилена конъюгацией этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Fc-рецепторов на моноцитах/макрофагах. Было показано,в частности, что конъюгаты между антигеном и антителом против FcRI усиливают иммуногенность вакцин. Другие возможности включают в себя использование нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (т.е. цитокинов), упомянутых в формуле изобретения в качестве частей молекулы для белковых конструкций. В этой связи возможными являются также синтетические индукторы цитокинов, подобные поли I:С. Подходящие микобактериальные производные выбирают из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, RIBI и диэфира трегалозы, такого как TDM и TDE. Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбирают из группы, состоящей из лиганда CD40 и антител CD40 и их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, Fab-фрагмента и CTLA-4. Подходящие полимерные адъюванты выбирают из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера и латекса, такого как латексные гранулы. Другим представляющим интерес способом модуляции иммунной реакции является включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в "виртуальный лимфатический узел" (VLN) (патентованное медицинское устройство, разработанное ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (устройство в виде тонкой трубки) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Введение VLN под кожу создает сайт (участок) стерильного воспаления с повышением цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АПК быстро отвечают на сигнал опасности, устремляются к этому воспаленному участку и накапливаются внутри пористого матрикса VLN. Было показано, что необходимая доза антигена, требуемая для развития иммунной реакции на антиген, уменьшается с использованием VLN и что иммунная защита,сообщаемая вакцинацией с использованием VLN, превосходила общепринятую иммунизацию с использованием RIbI в качестве адъюванта. Этот способ описан i.a. вкратце у Gelber С. et al., 1998, "Elicitation ofDevice Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinik, Book of Abstracts,October 12th-15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California". Ожидается, что эта вакцина должна вводиться по меньшей мере 1 раз в год, например по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно, ожидается введение 1-12 раз в год, например 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 раз в год индивидууму, нуждающемуся в этом введении. Ранее было показано,что память иммунитета, индуцированная использованием предпочтительных аутовакцин в соответствии с данным изобретением, не является перманентной, и, следовательно, иммунная система должна периодически стимулироваться этими аналогами. Вследствие генетической изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать иммунными реакциями варьирующейся силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина по данному изобретению может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунной реакции, см. также обсуждение, приведенное выше, касающееся выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Эта вакцина может содержать два или более полипептидов, где все полипептиды являются полипептидами, определенными выше. Вакцина может, следовательно, содержать 3-20 различных аналогов, например 3-10 аналогов. Однако обычно количество аналогов будет поддерживаться на минимальном уровне, таком как 1 или 2 аналога. Вакцинация нуклеиновыми кислотами Как очень важная альтернатива классическому введению вакцины на основе пептидов, способ вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известный как "иммунизация нуклеиновыми кислотам", "генетическая иммунизация" и "генная иммунизация") обладает рядом привлекательных признаков. Прежде всего, в отличие от традиционного подхода к вакцинам, вакцинация нуклеиновыми кисло- 17008254 тами не требует интенсивно потребляющего ресурсы крупномасштабного получения иммуногенного агента (например, в виде ферментации в промышленном масштабе микроорганизмов, продуцирующих белки). Кроме того, нет необходимости в разработке схем очистки и рефолдинга для иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основана на биохимическом аппарате вакцинируемого индивидуума для получения продукта экспрессии вводимой нуклеиновой кислоты, ожидается,что происходит оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это, в частности,важно в случае аутовакцинации, поскольку как упоминалось выше, значительная доля исходных В-клеточных эпитопов полимера должна быть сохранена в модифицированной молекуле и поскольку В-клеточные эпитопы, в принципе, могут быть составлены частями любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, нативные картины гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть очень важными для общей иммуногенности, и ожидается, что это гарантируется наличием хозяина, продуцирующего данный иммуноген. Следует отметить, что увеличенные уровни экспрессии, наблюдаемые для некоторых из раскрытых в настоящее время аналогов, являются очень важными для эффективности ДНК-вакцинации, так как уровень экспрессии in vivo является одним из определяющих факторов в иммуногенной эффективности ДНК-вакцины. Таким образом, предпочтительный вариант осуществления согласно изобретению включает в себя выполнение презентации аналога согласно изобретению иммунной системе введением нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующих этот аналог, в клетки животного и получение посредством этого экспрессии in vivo этими клетками этой нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот). В этом варианте осуществления введенной нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК,которая может быть в форме "голой" ДНК, ДНК, составленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, заключенной в липосомы, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, составленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, составленной с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, составленной с кальций-осаждающими агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимер, например в PLGA (см. способ микроинкапсулирования, описанный в WO 98/31398) или в хитин или хитозан, и ДНК, составленной с адъювантом. В этом контексте отмечается, что практически все примеры, относящиеся к использованию адъювантов при приготовлении традиционных вакцин, приложимы для приготовления ДНК-вакцин. Таким образом, все приведенные здесь описания, которые относятся к использованию адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, могут применяться mutatis mutandis в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами. Что касается способов введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые подробно описаны выше, они также применимы для вакцин нуклеиновых кислот согласно изобретению, и все описания выше, относящиеся к способам введения и схемам введения для полипептидов, применимыmutatis mutandis к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины нуклеиновых кислот могут быть легко введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины нуклеиновых кислот могут быть введены с использованием так называемого генного пистолета, и, следовательно, также и этот и эквивалентные способы введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что использование VLN во введении нуклеиновых кислот дает хорошие результаты, и, следовательно, этот конкретный способ введения является особенно предпочтительным. Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать районы, кодирующие части молекул, указанные в пунктах формулы изобретения, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, описанные в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта осуществления включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать того, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы разные нуклеотидные фрагменты, но это является менее предпочтительным, вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии в случае присутствия обеих кодирующих областей, включенных в одну и ту же молекулу. Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против TNF, содержащей: фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор согласно изобретению (см. обсуждение нуклеиновых кислот и векторов ниже), и фармацевтически и иммунологически приемлемый наполнитель, и/или носитель, и/или адъювант,обсуждаемые выше. При нормальных обстоятельствах эту нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора, в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробного обсуждения векторов и ДНК-фрагментов в соответствии с данным изобретением, см. обсуждение, приведенное ниже. Доступны также подробные описания, касающиеся приготовления и применения вакцин нуклеиновых кислот, см. Donnelly J.J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 и Donnelly J.J. et al., 1997, LifeSciences 60: 163-172. Обе эти публикации включены сюда посредством ссылки. Живые вакцины Третьей альтернативой для выполнения презентации аналогов согласно изобретению иммунной системе является использование технологии живых вакцин. В живой вакцинации презентацию иммунной системе выполняют введением животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог согласно изобретению, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Этим непатогенным микроорганизмом может быть любой подходящий аттенуированный бактериальный штамм (аттенуированный посредством пассажа или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии технологией рекомбинантных ДНК), например Mycobacterium bovis BCG, непатогенный Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella и т.д. Обзоры, касающиеся приготовления живых вакцин существующего уровня техники,могут быть, например, найдены у Saliou P., 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 и Walker P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, оба включены сюда посредством ссылки. В отношении подробностей о фрагментах нуклеиновых кислот и векторах, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже. В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению, обсуждаемый ниже, может быть включен в невирулентный вирусный вакцинный вектор, такой как штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус. Обычно этот непатогенный микроорганизм или вирус вводят только 1 раз животному, но в некоторых случаях может быть необходимо введение этого микроорганизма более 1 раза, на протяжении жизни для поддержания защитного иммунитета. Обсуждается даже, что схемы иммунизации, такие как схемы,подробно описанные для полипептидной вакцинации, будут полезны при использовании живых или вирусных вакцин. Альтернативно живую или вирусную вакцинацию комбинируют с предыдущей или последующей полипептидной вакцинацией и/или вакцинацией нуклеиновой кислотой. Например, можно выполнять первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими бустер-иммунизациями с использованием полипептидного подхода или подхода с использованием нуклеиновых кислот. Микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащими районы, кодирующие вышеупомянутые части молекулы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве полезных адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта осуществления включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать продуцирования аналога или эпитопа в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно,могут быть использованы два различных нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие адъювантных частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечить аналог согласно изобретению в виде продукта экспрессии, и такой вариант осуществления является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением. Комбинированная обработка Один особенно предпочтительный способ осуществления изобретения включает в себя использование вакцинации нуклеиновыми кислотами в качестве первой (первичной) иммунизации, с последующими вторичными (бустерными) иммунизациями вакциной на основе полипептида или живыми вакцинами,как описано выше. Применение способа согласно изобретению в лечении заболеваний Заболеваниями/состояниями, которые являются релевантными, являются ревматоидный артрит,подростковый хронический артрит (болезнь Стилла), спондилоартропатии, полимиозит, дерматомиозит,васкулит, псориаз (чешуйчатый) и псориатический артрит, болезнь Крона, хроническая обструктивная болезнь легких, миелодиспластический синдром, увеит в ревматоидном артрите, острая легочная дисфункция, астма (как острая, так и хроническая), гранулематоз Вегенера, болезнь раздраженного пищеварительного тракта, височно-нижнечелюстной синдром (болезненный челюстной сустав), стоматит, остеопороз и раковая кахексия, а также другие воспалительные заболевания и другие состояния, обычно признаваемые в данной области как заболевания, связанные с неблагоприятными эффектами TNF. Таким образом, можно лечить или ослаблять симптомы, которые ассоциированы с любым из этих заболеваний, с использованием способа согласно изобретению для понижающей регуляции активности мультимерного белка. Композиции согласно изобретению Данное изобретение относится также к композициям, пригодным для практического применения способа согласно изобретению. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или наполнитель, и/или носитель, и/или эксципиент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть согласно изобретению относится к готовым формам аналогов, по существу, описанным выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей согласуется с тем, что было обсуждено выше- 19008254 при ссылке на приготовление аналогов для пептидной вакцинации. Аналоги готовят обычно в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных генов, в том числе путем введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей этот аналог, в подходящий вектор, трансформации подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессии этой последовательности нуклеиновой кислоты (культивированием этой клетки-хозяина при подходящих условиях),извлечения продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующей очистки и необязательной дополнительной модификации, например рефолдинга или дериватизации. Детали, касающиеся этих необходимых способов, можно найти ниже под заголовком "Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению", а также в примерах. В этом разделе описан также способ рекомбинантного получения аналогов, т.е. низкотемпературной ферментации Е. coli, для получения растворимых вариантов TNF. Недавние достижения в технологии пептидного синтеза сделали возможным получение полноразмерных полипептидов и белков этими способами, и, следовательно, получение длинных конструкций при помощи хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза также находится в объеме данного изобретения. Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению Из приведенного выше описания будет понятно, что модифицированные полипептиды могут быть получены посредством технологии рекомбинантых генов, но также посредством химического синтеза или полусинтеза; две последние возможности являются особенно релевантными, когда модификация включает в себя или предусматривает связывание с белками-носителями (такими, как KLH, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, и, конечно, также в том случае, когда эта модификация предусматривает добавление боковых цепей или боковых групп к полученной из полимера пептидной цепи. Эти варианты осуществления, как будет понятно из приведенного выше описания, не являются предпочтительными вариантами. Для целей технологии рекомбинантных генов и, конечно, для цели иммунизации с использованием нуклеиновых кислот важными химическими продуктами являются фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие эти аналоги (как и комплементарные им последовательности). Таким образом, важная часть изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует описанный здесь аналог,т.е. полученный из полимера искусственный полимерный полипептид, как описано подробно выше. Фрагментами согласно изобретению являются либо ДНК-, либо РНК-фрагменты. Наиболее предпочтительный ДНК-фрагмент согласно изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот,кодирующих любую из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, или последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную любой из них. Фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению будут обычно инсертированы в подходящие векторы для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих эти фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов согласно изобретению, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Эти векторы могут быть, в зависимости от цели и типа применения, в виде плазмид, фага, космид, минихромосом или вируса, но также и "голой" ДНК, которая экспрессируется только транзиторно в определенных клетках и которая является важным вектором (и может быть применима в ДНК-вакцинации). Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, позволяя достигать высокой копийности с целью экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования. Общая схема вектора согласно изобретению содержит следующие элементы в направлении 5'3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид,позволяющий секрецию (во внеклеточную среду или, где это применимо, в периплазму) или интеграцию в мембрану этого полипептидного фрагмента, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях, для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы этот вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, которые должны использоваться для выполнения экспрессии в животном (т.е. при использовании этого вектора в ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы этот вектор не мог интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют "голую" ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, которые хорошо известны лицу с квалификацией в данной области. Векторы согласно изобретению используют для трансформации клеток-хозяев для получения модифицированного TNF-полипептида согласно изобретению. Такие трансформированные клетки, кото- 20008254 рые являются частью данного изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно изобретению или используемыми для рекомбинантного получения модифицированных TNF-полипептидов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть подходящими живыми вакцинными штаммами, в которых фрагмент нуклеиновой кислоты (одна-единственная копия или множественные копии) были инсертированы таким образом, чтобы осуществлялась секреция или интеграция в бактериальную мембрану или клеточную стенку этого модифицированного TNF. Предпочтительными трансформированными клетками согласно изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (такие как виды Escherichia [например, Е. coli], Bacillus [например, Bacillussubtilis], Salmonella или Mycobacterium [предпочтительно непатогенный, например М. bovis BCG]),дрожжи (такие как Saccharomyces cerevisiae) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такого как гриб, клетка насекомого, клетка растения или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные из человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты показали хорошую перспективу для использования коммерчески доступной клеточной линии Drosophila melanogaster (клеточная линияSchneider 2 (S2) и векторная система, доступная от Invitrogen) для рекомбинантного получения аналоговTNF согласно изобретению, и, следовательно, эта система экспрессии является особенно предпочтительной, и, следовательно, этот тип системы является также предпочтительным вариантом осуществления согласно изобретению, в целом. Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительными применимыми вариантами согласно изобретению; они могут быть использованы для мелкосерийного или крупномасштабного получения аналога или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине. При получении этих аналогов согласно изобретению с использованием трансформированных клеток удобно, хотя и далеко не обязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо переносился на поверхность трансформированной клетки, так как в обоих случаях облегчается последующая очистка продукта экспрессии. После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно получение на ее основе стабильной клеточной линии, которая несет вектор согласно изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный TNF. Предпочтительно эта стабильная клеточная линия секретирует или несет аналог TNF согласно изобретению, облегчая тем самым его очистку. Обычно, в зависимости от природы хозяина, используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые получены из вида, совместимого с данной клеткойхозяином. Этот вектор исходно несет сайт инициации репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например,Е. coli обычно трансформируют с использованием pBR322, плазмиды, полученной из вида Е. coli (см.,например, Bolivar et al., 1977). Плазмида pBR322 содержит гены для устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкое средство для идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR или другая микробная плазмида или фаг должны также содержать или быть модифицированы, чтобы содержать, промоторы, которые могут быть использованы прокариотическими микроорганизмами для экспрессии. Промоторы, наиболее часто используемые в прокариотической рекомбинантной конструкции ДНК,включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Chang et al., 1978;Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) и промоторную систему триптофана (trp) (Goeddel et al., 1979; EPA-0036776). Хотя они являются наиболее часто используемыми, были открыты и использованы другие микробные промоторы, и подробности, касающиеся их нуклеотидных последовательностей, были опубликованы и позволяют работнику с квалификацией в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами (Siebwenlist et al., 1980). Некоторые гены из прокариот могут экспрессироваться эффективно в Е. coli, используя их собственные промоторные последовательности, что исключает необходимость добавления другого промотора искусственными способами. Согласно данному изобретению предпочтительно, чтобы получение аналогов TNF в прокариотических клетках приводило к обеспечению растворимых белков, см. пример 9, и особенно предпочтительно, чтобы используемой клеткой-хозяином была клетка Е. coli. Авторами данного изобретения было теперь показано, что растворимые варианты TNF относительно легко и удобно получать в Е. coli при пониженных температурах. Если в случае общепринятых способов ферментации Е. coli обычно используют температуры в диапазоне около 37 С, авторами данного изобретения было обнаружено, что увеличенные выходы растворимых вариантов TNF могут быть получены ферментацией при температурах ниже 32 С, - даже хотя общий выход рекомбинантного белка- 21008254 является более низким, чем после ферментации при приблизительно 37 С, выход наиболее выгодных вариантов является значительно более высоким и рефолдинг нерастворимого, денатурированного белка не является необходимым. Вкратце, типичный ферментационный процесс согласно изобретению включает в себя стадии инокуляции ферментера трансформированной бактерией, последующей ферментации для получения достаточного количества биомассы с последующей индукцией рекомбинантной экспрессии и, наконец, сбора рекомбинантного белка. Использование индуцибельных систем не является обязательным, но является более удобным. Таким образом, в важном аспекте изобретение относится к рекомбинантному получению в бактериях, особенно Е. coli, вариантов TNF согласно изобретению, где по меньшей мере одну фазу после индукции продуцирования рекомбинантного аналога TNF проводят при температуре менее 32 С (т.е. в случае использования индуцибельной системы). Однако в примере 9 показаны наивысшие выходы растворимых рекомбинантных аналогов TNF, когда всю ферментацию (как до, так и после индукции) выполняют при такой низкой температуре. Предпочтительно, чтобы пониженная температура в любой из этих двух фаз ферментации (до и после индукции) была ниже 30 С, например ниже 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20 С. Предпочтительно, чтобы температура находилась в диапазоне между 20 и 30 С, более предпочтительно в диапазоне между 22 и 28 С, и наиболее предпочтительно, чтобы температура была равна приблизительно 25 С. Как показано в примере 9, выходы, близкие к 100%, растворимых аналогов TNF, получали при ферментации при этой температуре. Следует отметить, что авторы данного изобретения считают, что условия низких температур для получения растворимых вариантов TNF согласно изобретению применимы, в общем, для рекомбинантного получения растворимых вариантов иммуногенных белков - даже хотя выходы общего белка, полученные такой ферментацией, являются более низкими, чем выходы, достигаемые, например, ферментацией при 31 С, причем конечный выход белка, имеющего применимую трехмерную структуру, является значительно более высоким при использовании условий низких температур, и, что важно, можно избежать последующих занимающих много времени и дорогостоящих процедур рефолдинга. Или, вкратце,выход желаемой конформации этого вариантного белка является более высоким. Таким образом, авторы данного изобретения предполагают также, что стратегия использования вышеуказанных низкотемпературных условий ферментации является общим применимым способом получения применимых иммуногенных вариантов белков. Кроме прокариот, эукариотические микробы, такие как культуры дрожжей, могут быть также использованы, и здесь промотор должен быть способен запускать и регулировать экспрессию. Saccharomycescerevisiase, или обычные пекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя обычно доступным является ряд других штаммов. Для экспрессии вSaccharomyces обычно используют, например, плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al.,1979; Tschemper et al., 1980). Эта плазмида уже содержит ген trpl, который обеспечивает маркер отбора на мутантный штамм дрожжей, лишенный способности расти в триптофане, например АТСС No. 44076 или РЕР 4-1 (Jones, 1977). Присутствие trpl-повреждения как характеристики генома дрожжевой клеткихозяина обеспечивает затем эффективное окружение для детектирования трансформации по росту в отсутствие триптофана. Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Hitzman et al., 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al.,1968; Holland et al., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид последовательности терминации, ассоциированные с этими генами, также лигируют в экспрессионный вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать, для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации. Другими промоторами, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями роста, являются район промотора для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деградационных ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, и вышеуказанной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, сайт инициации репликации и последовательности терминации, является подходящим. Кроме микроорганизмов, культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов, могут также использоваться в качестве хозяев. В принципе, любая такая клеточная культура является работающей,независимо от того, является ли она культурой клеток позвоночных или беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляли клетки позвоночных, и размножение позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой за последние годы (Tissue Culture, 1973). Примерами таких применимых линий клеток-хозяев являются клетки VERO и клетки HeLa, линии клеток яичника китайского хо- 22008254 мячка (СНО) и клетки W138, ВНК, COS-7, Spodoptera frugiperda (SF) (коммерчески доступные в виде полных систем экспрессии от i.a. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA и отInvitrogen), и линии клеток MDCK. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является линия клеток насекомых S2, доступная от Invitrogen, PO Box 2312, 9704 СН Groningen, TheNetherlands. Экспрессионные векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) сайт инициации репликации, промотор, расположенный перед геном, который должен экспрессироваться, сайты сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции. В случае использования в клетках млекопитающих регуляторные функции на экспрессионных векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы получают из вируса полиомы, aденовируса 2 и наиболее часто из вируса 40 обезьян (SV40) или цитомегаловируса (CMV). Ранний и поздний промоторы вируса SV40 особенно применимы, так как оба могут быть легко получены из вируса в виде фрагмента, который содержит также сайт инициации репликации вируса SV40 (Fiers et al., 1978). Могут быть использованы меньшие или большие фрагменты SV40, при условии, что включена последовательность приблизительно 250 п.н., простирающаяся от сайта HindIII к сайту BglI, расположенному в вирусном сайте инициации репликации. Далее, можно также, и даже желательно, использовать промоторные или регуляторные последовательности, обычно ассоциированные с желаемой генной последовательностью, при условии, что такие регуляторные последовательности совместимы с системами клетки-хозяина. Сайт инициации репликации может быть обеспечен либо путем конструирования вектора для включения экзогенного сайта инициации репликации, например он может происходить из SV40 или другого вируса (например, полиомавируса, аденовируса, VSV, BPV), либо он может быть обеспечен путем использования механизма репликации хромосом клетки-хозяина. Если этот вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, последнее часто является достаточным. Пример 1. Получение вариантов TNF. Синтетическую ДНК-последовательность "SMTNFWT3" (SEQ ID NO: 9), кодирующую человеческий мономерный полипептид TNF дикого типа (SEQ ID NO: 10), получали в виде продукта лигирования от Entelechon GmbH. ДНК-последовательность hTNF оптимизировали для экспрессии в Е. coli в соответствии с базой данных Codon Usage путем исключения всех кодонов с частотой в Е. coli менее 10%. Далее, эту последовательность конструировали таким образом, чтобы она включала в себя 5'-сайт рестрикции NcoI для последующих стадий клонирования. Продукт лигирования SMTNFWT3 вводили в вектор pCR 4 ТOРО Blunt и трансформировали клетки Е. coli DH10B. Плазмидную ДНК из 10 полученных клонов SMTNFWT3TOPO очищали и отбирали пять клонов, содержащих ожидаемый фрагмент (при анализе продукта расщепления рестрикционными ферментами (RE. ДНК-фрагменты NcoI/EcoRI из пяти потенциально правильных клонов SMTNFWT3TOPO выделяли и переносили в вектор рЕТ 28b(+) и определяли последовательность. Инсерции, делеции или замены идентифицировали в четырех клонах, в то время как один клон оказался правильным. Затем эту правильную конструкцию SMTNFWT3pET28 использовали в качестве матрицы для генерирования каждого из вариантов TNF. Пример 2. Конструирование TNF34. Аминокислотную последовательность эпитопа PanDR (SEQ ID NO: 6 и 8) вручную "обратнотранслировали" в ДНК-последовательность (SEQ ID NO: 7), оптимизированную для экспрессии в Е. coli,см. ниже, и встраивали в петлю 3 TNF с использованием SOE PGR (splicing by overlapping extension PCR). Полученную конструкцию (ДНК-последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 19 в WO 03/042244) помещали в вектор pET28b+ с получением TNF34-pET28b+. Пример 3. Конструирование мономеризованного тримера. Конструкции мономеризованных тримеров основаны на 3 TNF-кодирующих районах, разделенных или линкером из трех глицинов, и/или эпитопкодирующим районом. Ген TNF синтезировали в виде трех отдельных единиц. Этих три фрагмента собирали с использованием SOE PCR и собранный ген (SEQ ID NO: 21 в WO 03/042244) клонировали в pCR2.1-TOPO. После подтверждения последовательности выделяли правильный клон. Затем ген hTNFT0 (SEQ ID NO: 21 вWO 03/042244, кодирующий TNF-GlyGlyGly-TNF-GlyGlyGly-TNF, SEQ ID NO: 22 в WO 03/042244,т.е. 3 копии SEQ ID NO: 17, разделенные двумя линкерами, состоящими из трех глицинов) переносили в рЕТ 28b+ с получением hTNFT0-pET28b+. Правильный клон выделяли, последовательность проверяли и трансформировали в линии Е. coli BL21-STAR, BL21-GOLD и HMS174.hTNFT0-pET28b+ использовали в качестве матрицы для получения четырех мономеризованных вариантов тримеров: hTNFT1, hTNFT2, hTNFT3 и hTNFT4 (SEQ ID NO: 49, 51, 57 и 59 в WO 03/042244) при помощи SOE PCR. Дополнительный вариант (SEQ ID NO: 53 в WO 03/042244) может быть изготовлен сходным образом.- 23008254 столбнячного токсоида (SEQ ID NO: 2 и 4 соответственно), которые должны собираться двумя раундамиSOE PCR. hTNFT4 является вариантом с инсертом PADRE (SEQ ID NO: 6) и может быть собран одним раундом SOE PCR. Дополнительный вариант (SEQ ID NO: 55 в WO 03/042244) может быть изготовлен сходным образом.hTNFT4 конструировали вышеупомянутыми способами, и правильный клон hTNFT4-pET28b+ обнаруживали в клетках ТОР 10, и эту конструкцию переносили в клетки BL21-STAR и HMS174. Для генерирования hTNFT1, hTNFT2 и hTNFT3 эпитопы встраивали при помощи SOE PCR в очень малые фрагменты тримера, которые инсертировали в hTNFT0-pET28b+ путем разрезания рестрикционными ферментами (RE) и лигирования. Пример 4. Стабилизация мутантов TNF34. Для дополнительной стабилизации варианта TNF34-pET28b+, описанного выше, конструировали варианты, содержащие введенный дополнительно дисульфидный мостик, а также делеционный мутант. Конструировали 3 различных варианта: TNF34-A-pET28b+ содержит замены Q67C и А 111 С, TNF34-BрЕТ 28b+ содержит А 96 С и I118C и TNF34-C-pET28b+, который содержит делецию 8 крайних N-концевых аминокислот, аминокислотные последовательности продуктов экспрессии представлены в SEQ IDNO: 20, 30 и 31 в WO 03/042244. Все 3 конструкции получали с использованием SOE PCR и клонировали в BL21-STAR, BL21-GOLD и NMS174 с последующим подтверждением последовательности. Пример 5. Варианты гибкой петли. Для поиска варианта, который может проявлять улучшенные характеристики в сравнении с вариантом TNF34-pET28b+, получали конструкции, в которых инсерт PADRE (SEQ ID NO: 6) перемещается вокруг в гибкой петле 3 молекулы TNF. Все варианты TNF35-pET28b+, TNF36-pET28b+, TNF37-pET28b+, TNF38-pET28b+, TNF39-pET28b+ и вариант с PADRE, помещенным на С-конце этой молекулы; TNFC2-pET28b+, получали при помощи способа SOE-PCR и клонировали в BL21-STAR, BL21-GOLD и NMS174 с последующим подтверждением последовательности. Аминокислотные последовательности этих продуктов экспрессии представлены вSEQ ID NO: 23, 24, 26, 27 и 28 в WO 03/042244. Также для оценки возможности использования клеток насекомых в качестве системы экспрессииTNFWT, TNF34, TNF35, TNF36, TNF37, TNF38, TNF39 и TNFC2 переносили в вектор p2Zop2f (см. фигуру в PCT/DKI02/00764) и экспрессировали в клетках насекомых S2. Пример 6. Другие конструкции. Готовили большое количество других вариантов TNF, все названные TNFX, см. выше. ДНК, кодирующую эти варианты, получали при помощи SOE PCR и клонировали непосредственно в рЕТ 28b+. Правильные клоны TNFX трансформировали в BL21-STAR и HMS174 и затем подтверждали последовательность. Пример 7. Периплазматическая экспрессия. Лидерную последовательность LTB добавляли непосредственно слева от SEQ ID NO: 16 WO 03/042244 в TNF34-pET28b+ для нацеливания экспрессии в периплазматическое пространство. Пример 8. Экспрессия в млекопитающих. Для испытания экспрессии в клетках млекопитающих SEQ ID NO: 16 WO 03/042244 и ДНК, кодирующую TNF34, переносили в вектор pHP1, который является вариантом коммерчески доступного вектора pCI (Promega Corporation). pHP1 включает в себя ген устойчивости к канамицину в качестве маркера вместо гена AmpR pCI. Пример 9. Оптимизированное продуцирование растворимого белка из Е. coli. Введение. Поскольку первоначальная экспрессия TNF и его вариантов приводила лишь к очень ограниченным количествам растворимого белка при экспрессии из клеток Е. coli, задача состояла в значимом улучшении уровней экспрессии и растворимости вариантов TNF, чтобы гарантировать быструю и удобную систему экспрессии белков. Подход. Первоначально эксперименты проводили во встряхиваемых колбах и приобретенный опыт использовали в работе с ферментерами. 3 ферментера работали одновременно, пробы брали во время ферментации для анализа роста клеток, продукции TNF и уровней деградации. Цель. Цель данного исследования состояла в определении оптимальных условий роста для экспрессии иммуногенных вариантов TNF при экспрессии в клетках Е. coli HMS174 в средах с определенным составом. Материалы и способы. Исходные материалы. Исходные материалы для ферментации с минимальной средой определенного состава. Составы сред и буферов. Приготовление основной культуральной среды.- 25008254 Соединения позиций 1-8 растворяют в указанном порядке в приблизительно 50% конечного объема в деионизованной воде и смешивают тщательно до полного растворения. Затем объем доводят до конечного объема (минус объем, добавленный после автоклавирования) и переносят в ферментер и стерилизуют автоклавированием. Позиции 9-11 смешивают и переносят асептически в охлажденный ферментер (37 С). Значение рН доводят до 7. Приготовление прекультуральной среды. Желаемые объемы исходных растворов, позиции 1-9, переносят в мерную колбу на 1 л. ДобавляютRO-воду до 955 мл. Измеряют рН и доводят рН до 7,0, если необходимо. Перемешивают этот раствор и переносят его в 4 встряхиваемые колбы на 1000 мл с 238 мл в каждой. После автоклавирования компоненты, не подлежащие автоклавированию, позиции 10-12, добавляют асептически в эти встряхиваемые колбы. Приготовление раствора солей микроэлементов.(рН=1) RO-воду до 1000 мл. Раствор перемешивают до растворения всех солей. Раствор переносят в синюю склянку с крышкой на 1 л и автоклавируют его. Приготовление раствора ферросульфата. Систему ферментеров InFors Labfors, состоящую из 6 ферментеров на 2 л, каждый из которых имеет рабочий объем 0,5-1,6 л, и основной контролирующий элемент соединяли с компьютером, инсталлированным программным обеспечением (Iris NT 4.1 для Window) для получения и обработки информации. Способы. Первоначальные эксперименты для оценки процента экспрессируемого растворимого белка выполняли во встряхиваемых колбах на 250 мл, в термостате, встряхиваемом при приблизительно 200 об./мин,в богатой среде с 60 мкг/мл канамицина. Экспрессию белка TNF оценивали с использованием Вестерн-блотов и электрофореза в ДСНПААГ с окрашиванием Кумасси синим, как в штамме HMS174, так и в штамме BL21 Star. Оценивали экспрессию как общего, так и растворимого TNF путем лизиса этих клеток и отбора пробы из супернатанта до и после стадии центрифугирования (20000 хg в течение 10 мин). Процент растворимого TNF оценивали путем визуального осмотра Вестерн-блота. Испытывали различные комбинации температуры: в основном, биомасса продуцировалась при 37 С с последующей индукцией, и испытывали температуры экспрессии 25 С (37/25) или 37 С (37/37).TNF37 (A145R) (SEQ ID NO: 13) выбирали в качестве модельного варианта для экспрессии и затем тестировали со средами определенного состава во встряхиваемых колбах с использованием комбинации 37/25 С. Создание банка клеток для исследований. Банк клеток для исследований (RCB) TNF37(A145R) создавали в дрожжевой среде (YEM) с 60 мкг/мл канамицина, путем инокуляции предварительно нагретой до 37 С встряхиваемой колбы с перегородкой на 1 л, содержащей 225 мл YEM, с 25 мл из 250 мл ночной культуры в YEM с 60 мкг/мл канамицина, и выращивания при 37 С при 200 об./мин в течение 3 ч. Идентичные содержащие глицерин исходные растворы для замораживания готовили смешиванием 60 мл экспоненциально растущей культуры клеток с 140 мл 86% глицерина и приготовлением аликвот в 1 мл. Эти аликвоты хранили при -80 С и использовали одну аликвоту для прекультуры перед ферментацией. Для определения качества RCB 3 колбы прекультуры, содержащие 250 мл среды прекультуры с 60 мкг/мл канамицина, инокулировали RCB-аликвотой, каждую, и следили за OD600. Культуры вели себя идентично до 11 ч после инокуляции, когда они достигали OD600 3,2. Было решено инокулировать ферментеры на 1 л 50 мл прекультур, которые выращивали в течение 11 ч при вышеупомянутых условиях, во всех последующих экспериментах. Оптимизация условий ферментеров. Для определения оптимальных условий ферментации брали пробы из растущих культур в ферментерах Infors и анализировали OD600 спектрофотометрией, уровни экспрессии TNF определяли с использованием количественного TNF-специфического ELISA и деградацию TNF определяли Вестерн-блоттингом. Ферментации тестировали при различных температурных условиях, 25 С/25 С, 25 С/25 С/16 С,37 С/25 С и 37 С/37 С.OD600 и экспрессию TNF испытывали на большом количестве проб и несколько репрезентативных проб в отношении экспрессии TNF дополнительно анализировали Вестерн-блоттингом для определения деградации. Схематическое представление. Общие параметры процесса. Концентрация IPTG была 1 мМ, и температура при индукции снижалась с 37 до 25 С, за исключением процессов 37/37 С и 25/25 С. Общее время ферментации было между 14 и 18 ч для процесса 37/37 С и до 61 ч для процессов 25/25 С и 37/25 С, включая размножение, индукцию и продуцирование белка. Общее время ферментации зависит от роста культуры. OD600 в ферментере было между 0,1-0,3 (26 в прекультуре), как рассчитано из OD в культуре инокуляции. Индукцию в процессе 37/25 С выполняли при OD600=201-2 или спустя 9-11 ч после инокуляции. Продуцирование белка имело место в течение 20-24 ч. Индукцию при процессе 25/25 С выполняли при OD600=101-2 или спустя 22-24 ч после инокуляции. Продуцирование белка имело место в течение 24-36 ч. Экспрессия варианта TNF. Уровни экспрессии TNF исследовали путем взятия 2x1 мл проб и хранения при -20 С. Затем эти пробы оттаивали на льду и обрабатывали ультразвуком 3x30 с, с помещением на лед по меньшей мере на 30 с между обработками для предотвращения нагревания проб. Пробы центрифугировали при 20000 хg в течение 10 мин и супернатант исследовали на содержание TNF с использованием количественнойELISA TNF. В общих чертах, этот процесс представлен на блок-схеме нижеприведенной фигуры. Результаты и обсуждение. Эксперименты, проведенные в этом исследовании, показали, что экспрессия растворимого TNF значимо увеличивалась при экспрессии при 25 С как во встряхиваемых колбах, так и в ферментерах. Эксперименты со встряхиваемыми колбами 100 мл богатой среды инокулировали 5 мл ночной культуры и выращивали при 37 С. Когда эта культура достигала OD600, культуру индуцировали 1 мМIPTG. В то же самое время, культуры, росшие при 37 С, либо хранили при 37 С, либо перемещали в условия 25 С, где они росли в течение ночи. На следующий день клетки собирали, лизировали и анализировали на экспрессию общего TNF или растворимого варианта TNF. Результаты показали, что смещение температуры с 37 до 25 С в момент индукции имело значимое положительное действие на количество экспрессируемого растворимого TNF, и, таким образом, авторы решили сохранить это смещение температуры в последующих экспериментах. Выбранные варианты. Все варианты тестировали, как описано выше, и TNF34, TNF34A, TNF37, TNFX5.1, TNFX2.1 иTNFT2 были отобраны как экспрессирующие с достаточно высокими выходами для дальнейшего исследования. Когда были доступны детоксифицированные версии вышеупомянутых конструкций, тестировали экспрессию этих вариантов, и результаты показали сравнимые уровни экспрессии относительно недетоксифицированных версий. Экспрессия в ферментерах. Для тестирования экспрессии вариантов TNF в средах с определенным составом авторы провели предварительный эксперимент во встряхиваемых колбах с условиями, описанными выше (37 С/25 С). В течение ночи индуцированная культура обнаружила удовлетворительные уровни экспрессии вариантаTNF, и, следовательно, авторы изобретения решили испытать экспрессию в ферментерах для оптимизации количеств экспрессированного варианта TNF, а также попытаться минимизировать деградацию этих вариантов, которая все еще наблюдается в экспрессируемых вариантах. Рост клеток. Банк клеток для исследований готовили, как описано выше, и авторы использовали прекультуру для инокуляции ферментеров на 1 л 50 мл прекультуры при OD600 3-4. Ферментеры предварительно нагревали до выбранной температуры (37 или 25 С) для минимизации температурного шока. В случае ферментеров с 37 С клетки продолжали экспоненциальный рост без какой-либо лаг-фазы. При инокуляции прекультуры 37 С в ферментер с 25 С эти клетки имели лаг-фазу приблизительно 17 ч, перед нача- 28008254 лом экспоненциального роста при более медленной скорости. Этого следовало ожидать как следствия температурного шока, которому клетки в этом случае подвергаются. Такую же самую лаг-фазу наблюдали при смещении культуры 37 С в условия 25 С непосредственно перед индукцией. Попытка постепенного смещения температуры от 37 до 25 С на протяжении часа(2 С на 10 мин) не уменьшала лаг-фазу. Уровни экспрессии варианта TNF. Уровни экспрессии определяли с использованием TNF-специфического количественного анализаELISA. Наивысшими наблюдаемыми уровнями в случае процесса 25/25 С были полученные уровни приблизительно 250 мг/л. Эти эксперименты являются все еще единственным подтверждением, и время между 15 и 35 ч после индукции все еще следует анализировать. Процесс 37/37 С дает только очень ограниченное количество растворимого варианта TNF, приблизительно 15 мг/л, а в случае процесса 37/25 С наблюдается, максимум, при приблизительно 100 мг/л. Выводы. На основании результатов из более 100 ферментаций, в целом, были выбраны 2 наилучших процесса (из общего числа 6) для получения вариантных белков растворимого TNF. Эти ферментации выполняли в минимальной среде определенного состава (см. описание ниже). Выбранные процессы ферментации были основаны на температурных исследованиях, в которых испытывали 4 различные температуры. Испытываемым вариантом TNF был TNF37-145 в штамме Е. coli HMS174. Оптимальные результаты были получены с использованием 25 С как до, так и после индукции. Остается определить оптимальное время сбора. Пример 10. Анализы отбора. Прямой рецепторный анализ ELISA вместе с поликлональным ELISA и анализом цитотоксичности с клетками KD-4 и Wehi используют в анализах первой очереди для скрининга и контроля очистки. Антитела, продуцируемые против вариантов TNF, используют для ингибирования связывания wtTNF как в рецепторном анализе, так и в анализе цитотоксичности для измерения качества антител. Пример 11. Процедуры очистки. В этом примере подробно описаны рекомбинантное получение и последующая очистка одного из вариантов TNF (TNF37). Однако эта процедура очистки является предпочтительной процедурой согласно данному изобретению и будет также применима (с небольшими коррекциями, относящимися к каждому варианту) для других вариантов TNF согласно изобретению. Однако в настоящее время авторы данного изобретения работают с улучшенной схемой очистки,которая особенно подходит для крупномаштабной ферментации вариантов TNF. В основном, используют те же самые индивидуальные стадии, описанные ниже, но порядок обращен таким образом, чтобы очистка заканчивалась хроматографической стадией с использованием гидроксиапатита после стадий хроматографии с использованием SP-сефарозы и Q-сефарозы. Колонию штамма Е. coli BL21 STAR/TNF37 из чашки с LB-канамицином (60 мг канамицина/л LBсреды, содержащей 1,5% агар) ресуспендируют в 5 мл LB-среды (60 мг канамицина/л LB) и выращивают в течение ночи (16 ч) при 37 С при встряхивании (220 об./мин) в шейкере New Braunswick. 2x2 мл этой культуры переносят в 2x1 л LB (60 мг канамицина/л) во встряхиваемые колбы с перегородками на 2 л и клеткам дают расти в шейкере New Braunswick при 220 об./мин до OD436=0,6-0,8. Эту стадию выполняли при примерных температурах 37 и 25 С, но температура может быть оптимизирована для каждой культуры. 1 мл 1 М IPTG добавляют в каждую колбу и клеткам дают расти в течение 16-20 ч. Перед индукцией температуру доводят до 25 С, если она не является уже температурой ферментации. Клетки собирают в центрифужные пробирки (500 мл) центрифугированием при 5000 об./мин в течение 15 мин с использованием головки SLA-3000 в центрифуге Sorvall. Клетки переносят в одну предварительно взвешенную центрифужную пробирку на 500 мл с использованием 0,9% NaCl и клетки собирают центрифугированием, как описано выше. Супернатант выбрасывают и пробирку взвешивают для определения массы клеток (должно быть 711 г). Добавляют 200 мл 50 мМ Na2HPO4, pH=7,0 (если клетки ресуспендируют, они должны быть сразу же использованы, в противном случае, их можно заморозить). Разрушение, центрифугирование и фильтрование клеток. Механическое разрушение клеток предоставляет несколько преимуществ в сравнении с ферментативным разрушением в отношении эффективности, надежности и возможности выбрать любой буфер,необходимый в следующих стадиях очистки. APV-1000 поддерживают в охлажденном состоянии во время этой операции добавлением ледяной воды в камеру с пробой перед использованием и пропускают ледяную воду через эту машину между двумя пассажами пробы. Центрифугирование и фильтрование служат для удаления любых частиц или агрегатов из раствора перед хроматографическим разделением этих белков. Разрушение клеток и НА-хроматография должны выполняться в один и тот же день, так как- 29008254 это может минимизировать активность возможных протеаз как следствие отделения от них в хроматографической стадии. Процедура разрушения, центрифугирования и фильтрования является следующей. Осторожно ресуспендированный клеточный материал переносят в разрушитель клеток (APV-1000). Суспензию клеток осторожно пропускают 2 х через разрушитель (охлаждая на льду после каждого пассажа и пропуская ледяную воду через APV-1000 между пассажами) с использованием 700 бар противодавления (в этот момент раствор должен быть прозрачным). Разрушенные клетки переносят в центрифужную пробирку на 500 мл и клетки центрифугируют в течение 45 мин при 10000 об./мин в центрифуге Sorvall с использованием головки SLA-3000. Экстракт (приблизительно 225 мл) пропускают через фильтр 0,22 мкм. Гидроксиапатитная (НА) хроматография. Гидроксиапатитный гель Bio-Gel HTP (BIO-RAD; номер по каталогу 130-0420) является кристаллической формой фосфата кальция, оказавшейся уникальным инструментом в разделении белков, таких как моноклональные антитела и другие белки, которые, в противном случае, не могли быть разделены другими способами. Однако в практике авторов данного изобретения характеристики текучести этого материала являются в некоторой степени критическими в том смысле, что поток, более сильный, чем 2 мл/мин,HCl индуцирует давление до неприемлемо высокого уровня. Кроме того, этот материал разрушался несколько раз, когда предпринималась попытка его регенерации гидроксидом натрия, как это рекомендовано изготовителем. Буферы и колонка. Исходный раствор для буфера А+В: 1 М Na2HPO4x2 Н 2O, рН=7,0 (рН доводят до 7 с использованиемHCl). Буферы А+В готовят путем разведения исходного раствора. Буфер А: 50 мМ Na2HPO4x2 Н 2O, рН=7,0. Буфер В: 0,3 мМ Na2HPO4x2 Н 2O, рН=7,0. Колонку заполняли до приблизительно 50-60 мл гидроксиапатитным гелем Bio-Gel HTP (BIO-RAD; номер по каталогу 130-0420) с использованием суспензии в буфере А и колонки ХК 26/40 (AmershamBioscience). Схема хроматографии. Система вытеснения 20 мл при токе 30 мл/мин. Уравновешивание: 4 объема колонки (CV) буфера А при токе 2 мл/мин. Пробу наносят при помощи насоса (входное отверстие F на BioCad) (приблизительно 225+5-10 мл,если требуется эта проба в трубопроводе) при токе 2 мл/мин. Колонку промывают 1,5 CV буфера А при токе 2 мл/мин. Элюция: белок элюируют градиентом 4 CV от 0 до 100% буфера В при токе 2 мл/мин. Колонку очищают 2 CV буфера В при токе 2 мл/мин. Повторно уравновешивают колонку 4 CV буфера А при токе 2 мл/мин. Фракции отбирают, объединяют и диализуют в течение ночи (ON) при 4 С против 15 х объема 20 мМ Трис-HCl, 0,075 М NaCl, рН 8,0. Отбор TNF37-содержащих фракций после НА-хроматографии. Профиль фракций элюции НА-хроматографии состоит, в основном, из "проходящей" фракции и одного элюированного пика, который может быть разделен на несколько пиков. TNF37-содержащие фракции должны отбираться на основе окрашенного Кумасси геля всего пика, так как пик, содержащийTNF37, не может быть непосредственно идентифицирован. Однако в результате последующих стадий очистки отбор фракций в этой точке является менее критическим, и загрязнители могут быть удалены позднее в этой процедуре. Таким образом, менее консервативный отбор фракций гарантирует максимальный выход варианта. Сначала "проходящую через колонку" фракцию проверяют "дот-блотами" на любой TNF37. Это дает положительный результат, который теоретически должен свидетельствовать о том, что значительная часть этого варианта не связалась с колонкой. Однако при подвергании "проходящей фракции" очень эффективной катионообменной хроматографии на SP-сефарозе (см. следующую стадию) и анализе этих фракций с использованием окрашенных Кумасси гелей они не содержат какого-либо детектируемогоTNF37-варианта, что свидетельствует о некой ложноположительной реакции в "дот-блоте" или фракции этого варианта, которая связывается совершенно отличающимся образом с SP-сефарозой. Катионообменная хроматография на SP-сефарозе.SP-сефароза является основной катионообменной стадией, выбранной вследствие более высокого рассчитанного pI 9,4 этого варианта в сравнении с pI 7,8 wtTNF. Увеличение pI является следствием 2 лизинов, введенных посредством эпитопа PADRE. Эта хроматография является очень эффективной и быстрой для варианта TNF37, и ожидается, что она применима для большого количества других петлевых вариантов TNF. Нанесенная проба должна иметь проводимость меньше 8 мС/см, и рН должен быть по меньшей мере 7,7 перед продолжением хроматографии на SP-сефарозе, поскольку отклонения от этих значений, как показала практика авторов данного изобретения, делали характеристики связывания белка отличающи- 30