Растворимый рецептор br43x2 и способы его применения

007471 Клеточные взаимодействия, которые имеют место во время иммунной реакции, регулируются членами нескольких семейств поверхностных рецепторов клетки, в том числе семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR). TNFR-семейство состоит из ряда интегральных мембранных гликопротеиновых рецепторов, многие из которых, в сочетании с их соответствующими лигандами, регулируют взаимодействия между различными гематопоэтическими последовательностями клеточных поколений (Smithet al.,The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation. Costimulation and Death,76:959-62, 1994; Cosman, Stem Cells 12:440-55, 1994). Одним таким рецептором является TACI, трансмембранный активатор и CAMLвзаимодействующий фактор (von Bulow and Bram, Science 228:138-41, 1997 и WIPO Publication WO 98/39361). TACI представляет собой мембраносвязанный рецептор, имеющий внеклеточный домен, содержащий два богатых цистеином псевдоповтора, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который взаимодействует с CAML (кальций-модулятором и лигандом циклофилина), интегральным мембранным белком, локализованным во внутриклеточных везикулах, который является коиндукторомNF-AT-активации при сверхэкспрессии в клетках Jurkat. TACI связан с В-клетками и субпопуляцией Тклеток. von Bulow и Bram (ibid.) сообщают, что лиганд для TACI неизвестен. Было обнаружено, что полипептиды данного изобретения, изоформа TACI, имеющая только один богатый цистеинами псевдоповтор (BR43x2), TACI и родственный В-клеточный белок, ВСМА (Gras etal., Int. Immunol. 17:1093-106, 1995), связываются с TNF-лигандом, ztnf4, в настоящее время известным как нейтрокин(WIPO Publication, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 285:260-3, 1999), BAFFTHANK (Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274:15978-81, 1999). Как таковые, BR43x2, TACI и ВСМА могли бы быть применимы для регуляции активности ztnf4, в частности, активации В-клеток. Для этой цели данное изобретение обеспечивает белковые терапевтические агенты для модулирования активности ztnf4 или других лигандов BR43x2, TACI или ВСМА, относящиеся к ним композиции и способы, а также другие применения, которые должны быть очевидны специалистам в данной области из приведенных здесь обсуждений. Сущность изобретения В одном (первом) аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полипептид, представляющий собой изоформу рецептора TACI, обозначенную BR43x2, содержащий внеклеточный домен и только один богатый цистеином псевдоповтор, имеющий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:2, кодируемый выделенной полинуклеотидной молекулой с последовательностью SEQ ID NO:1. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенную полинуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид первого аспекта данного изобретения и имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. В родственном варианте обеспечен экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; полинуклеотидную молекулу, описанную выше, и терминатор транскрипции. Также обеспечена культивируемая клетка, содержащая описанный выше экспрессирующий вектор, причем указанная культивируемая клетка экспрессирует полипептид первого аспекта данного изобретения, кодируемый указанным полинуклеотидным сегментом. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ получения полипептида первого аспекта данного изобретения, предусматривающий культивирование описанной выше клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида, и выделение полипептида. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую полипептид первого аспекта данного изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ ингибирования ztnf4-активности в организме млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему необходимого количества соединения, выбранного из группы, состоящей из: а) полипептида, содержащего внеклеточный домен TACI, где TACI является полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQID NO:6 и представляющим собой мембраносвязанный рецептор, имеющий внеклеточный домен, содержащий два богатых цистеином псевдоповтора, трансмембранный домен и цитоплазматический домен; b) полипептида, содержащего внеклеточный домен BR43x2, где BR43x2 является полипептидом первого аспекта данного изобретения; с) полипептида, содержащего внеклеточный домен ВСМА, где ВСМА является полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 и представляющим собой родственный В-клеточный белок, содержащий внеклеточный домен, включающий богатый цистеином псевдоповтор; d) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10,представляющую собой богатый цистеином псевдоповтор; е) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (b); f) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, представляющего собой растворимую форму полипептида BR43x2 первого аспекта данного изобретения, не содержащую трансмембранного и цитоплазматического доменов; g) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (a); h) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (с); i) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (d); j) антитела или фрагмента антитела,которые специфически связываются с полипептидом f); k) полипептида TACI, имеющего аминокислот-1 007471 ную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 166; I) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 150. В одном варианте последнего из названных аспектов изобретения указанное антитело или фрагмент антитела выбраны из группы, состоящей из: а) поликлонального антитела; b) мышиного моноклонального антитела; с) гуманизированного антитела, полученного на основе антитела, указанного в b); и d) человеческого моноклонального антитела. В другом варианте указанное млекопитающее является приматом. В другом варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с В-лимфоцитами. В родственном варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с активированными В-лимфоцитами. Еще в одном варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с покоящимися В-лимфоцитами. В другом вариантеztnf4-активность ассоциирована с образованием антител. В родственном варианте указанное образование антител ассоциировано с аутоиммунным заболеванием. В родственном варианте указанное аутоиммунное заболевание является системной красной волчанкой, тяжелой псевдопаралитической миастенией,множественным склерозом или ревматоидным артритом. В еще одном родственном варианте указанное аутоиммунное заболевание представляет собой инсулинзависимый сахарный диабет или болезнь Крона. В другом варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с астмой, бронхитом или эмфиземой. Еще в одном варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с почечным заболеванием, связанным с почечными неоплазмами. В родственном варианте указанное заболевание представляет собой гломерулонефрит, васкулит, нефрит или пиелонефрит. Еще в одном варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с почечной недостаточностью конечной стадии. В другом варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с множественными миеломами, лимфомами или амилоидозом. В другом варианте указанная ztnf4-активность ассоциирована с эффекторными Т-клетками. В родственном варианте указаннаяztnf4-активность ассоциирована со сдерживанием иммунной реакции. Еще в одном родственном варианте указанная активность ассоциирована с иммуносупрессией. Еще в одном варианте указанная иммуносупрессия ассоциирована с отторжением трансплантата, реакцией трансплантат против хозяина или воспалением. В родственном варианте указанное воспаление ассоциировано с болью в суставах, опуханием,анемией или септическим шоком. Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ ингибирования ztnf4-активность в организме млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему необходимого количества соединения, включающего внеклеточный домен и выбранного из группы, состоящей из: а) полипептида ВСМА, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, представляющего собой родственный В-клеточный белок, имеющий внеклеточный домен и содержащий богатый цистеином псевдоповтор; b) полипептида BR43x2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ IDNO:2 от аминокислотного остатка 25 до аминокислотного остатка 58, содержащую один богатый цистеином псевдоповтор; с) полипептида TACI, представляющего собой мембраносвязанный рецептор,имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 154, содержащего внеклеточный домен, включающий два богатых цистеином псевдоповтора, трансмембранный домен и цитоплазматический домен; d) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 71 до аминокислотного остатка 104; е) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 25 до аминокислотного остатка 104; f) полипептида ВСМА, представляющего собой родственный В-клеточный белок, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 48, содержащего внеклеточный домен, включающий богатый цистеином псевдоповтор; g) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 41 до аминокислотного остатка 88; h) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 8 до аминокислотного остатка 88; i) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ IDNO:4, представляющего собой растворимую форму полипептида BR43x2 первого аспекта данного изобретения. В одном варианте последнего из названных аспектов указанное соединение дополнительно содержит полипептиды, выбранные из группы, состоящей из: а) полипептида ВСМА, представляющего собой родственный В-клеточный белок, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 89 до аминокислотного остатка 150, содержащего внеклеточный домен и богатый цистеином псевдоповтор; b) полипептида BR43x2, представляющего собой изоформу полипептидарецептора TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислотного остатка 59 до аминокислотного остатка 120, содержащего внеклеточный домен, имеющий только один богатый цистеином псевдоповтор; с) полипептида TACI, представляющего собой мембраносвязанный рецептор, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 105 до аминокислотного остатка 166, содержащего внеклеточный домен, включающий два богатых цистеином псевдоповтора, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. В другом варианте указанное соединение выбрано из группы, состоящей из а) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 34 до аминокислотного остатка 66; b) полипеп-2 007471 тида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 8 до аминокислотного остатка 37. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания рецепторовBR43x2, TACI или ВСМА с лигандом ztnf4, предусматривающий введение в организм млекопитающего эффективного количества соединения, содержащего внеклеточный домен и выбранного из группы, состоящей из: а) полипептида TACI, представляющего собой мембраносвязанный рецептор, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, содержащего внеклеточный домен, включающий два богатых цистеином псевдоповтора, трансмембранный домен и цитоплазматический домен; b) полипептида BR43x2 первого аспекта данного изобретения; с) полипептида ВСМА, представляющего собой родственный В-клеточный белок, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащего внеклеточный домен, включающий богатый цистеином псевдоповтор; d) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, включающую богатый цистеином псевдоповтор; е) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (b); f) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, представляющего собой растворимую форму полипептида BR43x2 первого аспекта данного изобретения, не содержащую трансмембранного и цитоплазматического доменов; g) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (a); h) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (с); i) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом (d); j) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом f); k) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 166; l) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 150. В одном варианте последнего из названных аспектов указанное антитело или фрагмент антитела выбраны из группы, состоящей из: а) поликлонального антитела; b) мышиного моноклонального антитела; с) гуманизированного антитела, полученного на основе антитела, указанного в b); и d) человеческого моноклонального антитела. В родственном варианте указанный фрагмент антитела выбран из группы,состоящей из F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv и другого фрагмента, включающего CDR. В другом варианте указанное связывание рецептор-лиганд BR43x2, TACI или ВСМА ассоциировано с В-лимфоцитами. В родственном варианте указанное связывание ассоциировано с активированными В-лимфоцитами. Еще в одном варианте указанное связывание ассоциировано с покоящимися Влимфоцитами. В другом варианте указанное связывание ассоциировано с образованием антител. В родственном варианте указанное образование антител ассоциировано с аутоиммунным заболеванием. В родственном варианте указанное аутоиммунное заболевание является системной красной волчанкой, тяжелой псевдопаралитической миастенией, множественным склерозом или ревматоидным артритом. Еще в одном родственном варианте указанное аутоиммунное заболевание представляет собой инсулинзависимый сахарный диабет или болезнь Крона. В другом варианте указанное связывание ассоциировано с астмой, бронхитом или эмфиземой. Еще в одном варианте указанное связывание ассоциировано с почечным заболеванием. В родственном варианте указанное связывание ассоциировано с почечной недостаточностью конечной стадии. Еще в одном родственном варианте указанное почечное заболевание представляет собой гломерулонефрит, васкулит, нефрит или пиелонефрит. Еще в одном варианте указанное связывание ассоциировано с почечными неоплазмами, множественными миеломами, лимфомами, невропатией легкой цепи или амилоидозом. В другом варианте указанное связывание ассоциировано с эффекторными Т-клетками. В родственном варианте указанное связывание ассоциировано с регуляцией иммунной реакции. Еще в одном родственном варианте указанное связывание ассоциировано с иммуносупрессией. Еще в одном варианте указанная иммуносупрессия ассоциирована с отторжением трансплантата, реакцией трансплантат против хозяина или воспалением. В другом варианте указанное связывание ассоциировано с воспалением. В родственном варианте указанное воспаление ассоциировано с болью в суставах, опуханием, анемией или септическим шоком. Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания рецепторов BR43x2, TACI или ВСМА с лигандом ztnf4, предусматривающий введение в организм млекопитающего эффективного количества соединения, являющегося слитым белком, состоящим из первой части и второй части, соединенных пептидной связью, причем указанная первая часть включает полипептид,выбранный из группы, состоящей из: а) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; b) полипептида BR43x2, имеющего аминокислотную последовательность SEQID NO:2 от аминокислотного остатка 25 до аминокислотного остатка 58; с) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 154; d) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 71 до аминокислотного остатка 104; е) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 25 до аминокислотного остатка 104; f) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 48; g) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 41 до аминокислотного остатка 88; h)-3 007471 полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, представляющего собой растворимую форму полипептида BR 43x2; i) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 8 до аминокислотного остатка 88; j) полипептидаBR43x2 первого аспекта данного изобретения; k) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, содержащего внеклеточный домен, включающий два богатых цистеином псевдоповтора; l) полипептида ВСМА, представляющего собой родственный В-клеточный белок, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащего внеклеточный домен и богатый цистеином псевдоповтор, а указанная вторая часть способна образовывать слитый белок, имеющий свойства, связанные, например, с растворимостью или токсичностью слитого белка. В одном варианте последнего из названных аспектов указанная первая часть дополнительно содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из: а) полипептида BR43x2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислотного остатка 59 до аминокислотного остатка 120;b) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 105 до аминокислотного остатка 166; с) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 89 до аминокислотного остатка 150. В другом варианте указанная первая часть выбрана из группы, состоящей из: а) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 34 до аминокислотного остатка 66; b) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 8 до аминокислотного остатка 37. Еще в одном варианте указанная первая часть выбрана из группы, состоящей из: а) полипептида, имеющего аминокислотную последовательностьSEQ ID NO:4, представляющего собой растворимую форму полипептида BR43x2 первого аспекта данного изобретения; b) полипептида TACI, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 154; с) полипептида ВСМА, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 48. В другом варианте указанная вторая часть является константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина. Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает сопоставление множественных аминокислотных последовательностей междуBR43x1 (SEQ ID NO:9). Отмечены богатые цистеином псевдоповторы и трансмембранный домен. Фиг. 2 показывает графический анализ Скетчарда связывания растворимого I125-ztnf4 с TACI и ВСМА, экспрессируемыми стабильными ВНК-трансфектантами. Фиг. 3 А показывает ztnf4-коактивности человеческих В-лимфоцитов для пролиферации и секреции иммуноглобулина. Фиг. 3 В показывает уровни IgM и IgG, измеренные в супернатантах, полученных из В-клеток, стимулированных растворимым ztnf4, в присутствии IL4 или IL4+IL5 после 9 дней в культуре. Фиг. 4 показывает В-клетки периферической крови человека, стимулированные растворимым ztnf4 или контрольным белком (убиквитином), в присутствии IL-4 в течение 5 дней in vitro. Очищенные TACIIg, BCMA-Ig и контрольный Fc испытывали на ингибирование ztnf4-специфической пролиферации. Фиг. 5 А показывает результаты из ztnf4-трансгенных животных, которые развили признаки системной красной волчанки (SLE). Фиг. 5 В показывает клетки лимфатического узла, селезенки и вилочковой железы (тимуса) из ztnf4 трансгенных животных, окрашенные антителами к CD5, CD4 и CD8. Фиг. 5 С показывает уровни общего IgM, IgG и IgE в сыворотке из ztnf4-трансгенных животных в диапазоне возраста от 6 до 23 недель. Фиг. 5 Е показывает эффекторные Т-клетки в ztnf4-трансгенных мышах. Фиг. 6 А и В показывает повышенные уровни ztnf4 в сыворотке, полученной из мышей ZNBWF1 и мышей MRL/Ipr/Ipr, которые коррелируют с развитием системной красной волчанки (SLE). Фиг. 7 показывает процент мышей ZNBWF1, которые развивают протеинурию на протяжении периода этого исследования. Фиг. 8 показывает уровни анти-dsДНК согласно ELISA из ztnf4-трансгенных мышей и контрольных однопометных мышей в сравнении с сывороткой из мышей ZNBWF1 и MRL/Ipr/Ipr. Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными при ссылке на следующее ниже подробное описание. Подробное описание изобретения Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания изложение определений следующих используемых далее терминов: Аффинная метка используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или детектирования второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания,может быть использован в качестве аффинной метки. Афинные метки включают в себя полигистидино-4 007471 вый участок (тракт), белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3,1991), глутатион S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Flag (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Аллельный вариант используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (т.е. без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Также включен тот же самый белок из того же самого вида, который отличается от ссылочной аминокислотной последовательности вследствие аллельной вариации. Аллельной вариацией называются природно встречающиеся различия среди индивидуумов в генах, кодирующих конкретный белок. Амино-концевой и карбоксил-концевой используются здесь для обозначения положений внутри полипептидов и белков. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида или белка для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в белке, расположена проксимально относительно карбоксил-конца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксил-конце полного белка. Пара комплемент/антикомплемент: обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. В случае, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания 10-9 М. Контиг обозначает полинуклеотид, который имеет непрерывный отрезок идентичной или комплементарной последовательности относительно другого полинуклеотида. Говорят, что непрерывные последовательности (контиги) перекрывают конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо полностью, либо вдоль частичного отрезка этого полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидной последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются 5'-TAGCTTgagtct3' и 3'-gtcgacTACCGA-5'. Комплементы полинуклеотидных молекул обозначают полинуклеотидные молекулы, имеющие комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5'-ATGCACGGG-3' комплементарна 5'CCCGTGCAT-3'. Вырожденная нуклеотидная последовательность или вырожденная последовательность обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток(т.е. триплеты GAU и GAC, каждый, кодируют Asp). Экспрессирующий вектор используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные сегменты включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и необязательно одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер,сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих. Изоформа относится к различным формам белка, которые могут быть получены из различных генов или из одного и того же гена альтернативным сплайсингом. В некоторых случаях изоформы различаются по их транспортной активности, времени экспрессии в развитии, распределению в ткани, локализации в клетке или комбинации этих свойств. Выделенный полинуклеотид обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но мо-5 007471 гут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация ассоциированных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Выделенный полипептид или белок представляет собой полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме, выделенный полипептид является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 95%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте, термин выделенный не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы. Функционально (операбельно) связанные в применении к нуклеотидным сегментам термин функционально связанные, указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора. Ортолог обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования. Полинуклеотид обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно п.н.), нуклеотиды (нт) или тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.). Там, где позволяет контекст, два последние термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину пары нуклеотидов. Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными. Полипептид является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями,получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют пептидами. Промотор обозначает часть гена, содержащую последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов. Белок обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но тем не менее они могут присутствовать. Рецептор обозначает связанный с клеткой белок или полипептидную субъединицу такого белка,которые связываются с биоактивной молекулой (лигандом) и медиируют действие этого лиганда на клетку. Связывание лиганда с рецептором приводит к изменению в рецепторе (и, в некоторых случаях,мультимеризации рецептора, т.е. ассоциации идентичных или различных субъединиц рецептора), что вызывает взаимодействия между эффекторным доменом (доменами) этого рецептора и другой молекулой (молекулами) в клетке. Эти взаимодействия, в свою очередь, приводят к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование, дефосфорилирование, пролиферацию клеток, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. BR43x2 обладает свойствами TNF-рецепторов, как обсуждается более подробно здесь. Секреторная сигнальная последовательность обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид (секреторный полипептид), который, как компонент большего полипептида, направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь. Растворимый рецептор является рецепторным полипептидом, который не связан с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы являются наиболее обычно лигандсвязывающими рецепторными полипептидами, которые не имеют трансмембранного и цитоплазматического доменов. Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, кото-6 007471 рые обеспечивают очистку этого полипептида или обеспечивают сайты для присоединения этого полипептида к субстрату. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют природно встречающиеся, растворимые копии, которые продуцируются протеолизом или трансляцией из образованных альтернативным сплайсингом мРНК. Считается, что рецепторные полипептиды являются по существу не содержащими трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов, когда они не имеют достаточных частей этих сегментов для обеспечения мембранного прикрепления или трансдукции (передачи) сигнала, соответственно. Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как около X или приблизительно X, указанная величина X должна пониматься как величина, определенная с точностью до 10%. Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в полном виде. Данное изобретение основано частично на открытии новой последовательности ДНК 1192 п.н.(SEQ ID NO:1) и соответствующей полипептидной последовательности (SEQ ID NO:2), которая является изоформой рецептора TACI. Эта изоформа была обозначена как BR43x2. Растворимая форма BR43x2 описана в SEQ ID NO:4, полинуклеотид, кодирующий растворимый рецептор, в SEQ ID NO:3. Как описано более подробно здесь, кодирующие BR43 х 2-рецептор полинуклеотиды и полипептиды данного изобретения были первоначально идентифицированы клонированием при помощи сигнальной ловушки с использованием RPMI 1788-библиотеки человека и FLAG-меченого на N- или С-конце, меченого биотином или FITC-меченого ztnf4-лиганда фактора некроза опухолей, теперь известного как нейтрокинTHANK (Mukhopadhyay et al., ibid.). Положительные клоны идентифицировали связыванием лиганда,разделяли до отдельных клонов, кДНК выделяли и секвенировали. Сравнение расшифрованной аминокислотной последовательности BR43x2 (представленной в SEQ ID NO:2) с известными рецепторами фактора некроза опухолей показало, что BR43x2 является изоформой TACI, имеющей единственный,слабо консервативный богатый цистеином псевдоповтор. Структурно, семейство TNF-рецепторов характеризуется внеклеточной частью, состоящей из нескольких модулей, называемых исторически цистеин-богатыми псевдоповторами. Член-прототипTNFR-семейства имеет четыре таких псевдоповтора, каждый из которых имеет длину около 29-43 остатков, каждый следует сразу же за предыдущим. Типичный псевдоповтор имеет 6 остатков цистеина. Их называют псевдоповторами потому, что, хотя они, по-видимому, происходят из общего родового модуля,они не повторяются точно: псевдоповторы 1, 2, 3 и 4 имеют характерные признаки последовательности, которые отличают их друг от друга. Кристаллическая структура TNF-рецептора р 55 выявила,что каждый псевдоповтор соответствует одному домену укладки и что все четыре псевдоповтора укладываются в одну и ту же третичную структуру, удерживаемую вместе внутренними дисульфидными связями.TACI содержит два цистеин-богатых псевдоповтора (von Blow and Bram, ibid.), первый является консервативным по структуре с другими членами семейства TNF-рецепторов, второй является менее консервативным. ВР 43 х 2-изоформа данного изобретения не содержит первого TFCI богатого цистеином псевдоповтора, сохраняя только второй, менее консервативный повтор. Сиквенс-анализ расшифрованной аминокислотной последовательности BR43x2, представленной вSEQ ID NO:2, показывает присутствие зрелого белка, имеющего внеклеточный домен (остатки 1-120SEQ ID NO:2), который содержит один цистеин-богатый псевдоповтор (остатки 25-58 SEQ ID NO:2),трансмембранный домен (остатки 121-133 SEQ ID NO:2) и цитоплазматический домен (остатки 134-247SEQ ID NO:2). Цистеин-богатый псевдоповтор BR43x2 имеет 6 консервативных остатков цистеина (остатки 25, 40, 43, 47, 54 и 58 SEQ ID NO:2), консервативный остаток аспарагиновой кислоты (остаток 34SEQ ID NO:2) и два консервативных остатка лейцина (остатки 36 и 37 SEQ ID NO:2) и имеет 46%-ную идентичность с первым цистеин-богатым псевдоповтором TACI (SEQ ID NO:6) и 35%-ную идентичность с цистеин-богатым псевдоповтором ВСМА (SEQ ID NO:8) (фиг. 1). Богатый цистеином псевдоповтор может быть представлен следующим мотивом:ID NO:10),где С обозначает аминокислотный остаток цистеин, Q глутамин, Е глутаминовую кислоту, K лизин,N аспарагин, R аргинин, D аспарагиновую кислоту, Н гистидин, S серин, Y тирозин, F фенилаланин, W триптофан, L лейцин, I изолейцин, V валин и X обозначает любой природно встречающийся аминокислотный остаток, кроме цистеина. Аминокислотные остатки в квадратных скобках "[] указывают на допускаемую вариацию аминокислотного остатка в этом положении. Число в фигурных скобкахуказывает число допускаемых аминокислотных остатков в этом положении. Данное изобретение обеспечивает также растворимые полипептиды длиной 32-40 аминокислотных остатка, как показано SEQ ID NO:10. Растворимый ВR43 х 2-рецептор, представленный остатками 1-120 SEQ ID NO:4, содержит один-7 007471 цистеин-богатый псевдоповтор (остатки 25-58 SEQ ID NO:4) и не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов BR43x2, как описано в SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области будет понятно, что эти границы доменов являются приближенными и основаны на сопоставлениях с известными белками и прогнозированиями укладки белков. Эти признаки указывают на то, что рецептор, кодируемый ДНК-последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ IDNO:3, является членом семейства TNF-рецепторов. Нозерн-блот- и дот-блот-анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей нуклеотидным зондам для BR43x1, которые, как прогнозируется, детектируют экспрессию BR43x2, показал экспрессию в селезенке, лимфатическом узле, CD19+ клетках, слабую экспрессию в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ-реакции), клетках Daudi и Raji. При помощи ПЦР с обратной транскриптазой BR43x1 детектировали только в В-клетках и не детектировали в активированных Т-клетках, как сообщалось дляTACI (von Blow and Bram, ibid.). При помощи BR43x2-зонда, который перекрывается на 100% с соответствующей последовательностью TACI, TACI и BR43x2 были обнаружены в селезенке, лимфатическом узле и тонкой кишке, желудке, слюнных железах, аппендиксе, легком, костном мозгу, фетальной селезенке, CD19+ клетках и клетках Raji. При помощи Нозерн-блот-анализа ВСМА детектировался в тонкой кишке, селезенке, желудке, ободочной кишке, аппендиксе, лимфатическом узле, трахее и яичке. ВСМА детектировали также в аденолимфоме, не-ходжкинской лимфоме и опухоли паротита (воспаления околоушной железы), ВСМА слабо детектировался в CD8+, CD19+ клетках, клетках MLR, Daudi, Raji и клетках Hut 78. Нозерн-блот-анализ проводили также с использованием мышиного ztnf4 (SEQ ID NO:19) и, подобно TACI, ВСМА и BR43x2 человека, экспрессию мышиного ztnf4 обнаруживали преимущественно в селезенке и тимусе. Мышиный ztnf4 экспрессировался также в легком и слабая экспрессия обнаруживалась в коже и сердце. Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК, которые кодируют описанные здесь полипептиды BR43x2. Специалистам в данной области будет вполне понятно, что, в связи с вырожденностью генетического кода, возможна значительная вариация среди этих полинуклеотидных молекул. SEQ ID NO:11 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, которые кодируют растворимый полипептид BR43x2 SEQ IDNO:4. Подобным образом, SEQ ID NO:12 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, кодирующие полипептид BR43x2 SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области будет понятно, что вырожденная последовательность SEQ ID NO:12 обеспечивает также все последовательности РНК, кодирующие SEQ ID NO:4, путем замены U (урацилом) Т (тимина). Таким образом, кодирующие полипептид BR43x2 полинуклеотиды, содержащие нуклеотид 1 - нуклеотид 360 SEQID NO:11, нуклеотиды 1 - 741 SEQ ID NO:12, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Табл. 1 дает однобуквенные коды, используемые в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. Разрешения представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. Комплемент указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Y обозначает либо С, либо Т, а его комплемент R обозначает А или G, причем А является комплементарным Т, a G является комплементарным С. Вырожденные кодоны, используемые в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, включающие в себя все возможные кодоны для конкретной аминокислоты, представлены в табл. 2. Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (WSN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать аргинин (AGR), а вырожденный кодон для аргинина (MGN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать серии (AGY). Сходная взаимосвязь существует между кодонами,кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности,но специалист с обычной квалификацией в данной области может легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:2 и 4. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь. Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов". В общем, см., Grantham,et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912. 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura. J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. В применении здесь, термин "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов" или "предпочтительные (преферентивные) кодоны" является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (см. табл. 2). Например, аминокислота треонин(Thr) может кодироваться АСА, АСС, ACG или ACT, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Thr. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами,известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинант- 10007471 ную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденные последовательности кодонов, описанные в SEQ ID NO:11 и 12, служат в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь. Высококонсервативные аминокислоты в цистеин-богатом псевдоповторе BR43x2 могут быть использованы в качестве инструмента для идентификации новых членов семейства. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих внеклеточный лигандсвязывающий домен, описанный выше, из РНК,полученной из различных источников тканей или клеточных линий. В частности, для этой цели применимы высоковырожденные праймеры, сконструированные из последовательностей BR43x2. В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами сходных размеров SEQ ID N0:3 или с последовательностью, комплементарной им,при строгих условиях. Обычно выбирают строгие условия, такие как температура ниже на приблизительно 5 С термической точки плавления (Тm) для специфической последовательности при определенных ионной силе и рН. Тm является температурой (при определенных ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с точно согласующимся зондом. Типичными строгими условиями являются условия, в которых концентрация соли составляет до приблизительно 0,03 М при рН 7, а температура равна по меньшей мере приблизительно 60 С. Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно предпочтительно выделять РНК клеток RPMI 1788, PBMNC, покоящихся или активированных трансфицированных В-клеток или ткани миндалин, хотя ДНК может быть также получена с использованием РНК из других тканей или выделена в виде геномной ДНК. Тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции гуанидин-HCl центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Поли(А)+ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Aviv and Leder, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли(А)+ РНК при помощи известных способов. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептид BR43x2, идентифицируют и выделяют, например, гибридизацией или ПЦР. Специалистам в данной области будет понятно, что последовательности, описанные в SEQ ID NO:1 и 3, представляют единственный аллель гена человека и что предполагается возможность существования аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты ДНК-последовательностей,показанных в SEQ ID NO:1 и 3, в том числе варианты, содержащие молчащие мутации, и варианты, в которых мутации приводят к изменениям аминокислотной последовательности, находятся в рамках данного изобретения, как и белки, которые являются аллельными вариантами SEQ ID NO:2 и 4. Аллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК и геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области. Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды BR43x2, которые являются по существу одинаковыми с полипептидами SEQ ID NO:2 и 4 и их видовыми ортологами. Термин "по существу гомологичный" используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих 50%-ную, предпочтительно 60%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, идентичность последовательностям, показанным в SEQ ID NO:2 и 4, или их ортологам. Такие полипептиды будут, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% или более идентичны SEQ ID NO:2 или ее ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-66 (1986) и Henikoff andHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992). Вкратце, две последовательности аминокислот сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием penalty открывания гэпа 10 и penalty удлинения гэпа 1 и оценочной матрицы "blosum 62" Henikoff and Henikoff (ibid.),показаной в табл. 3 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают как: Общее число идентичных совпаденийх 100 [длина более длинной последовательности плюс число гэпов, введенных в более длинную последовательность для сопоставления этих двух последовательностей] Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют сходными способами с использованием описанного выше отношения. По существу гомологичные белки и полипептиды характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений. Эти изменения предпочтительно имеют минорный характер, то есть, консервативные замены аминокислот (см. табл. 4) и другие замены, которые не влияют значимо на укладку или активность белка или полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до приблизительно 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбоксил-концевые удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков, или аффинная метка. Полипептиды, содержащие аффинные метки, могут дополнительно содержать сайт протеолитического расщепления между полипептидом BR43x2 и этой аффинной меткой. Предпочтительно такие сайты включают в себя сайты расщепления тромбином и сайты расщепления фактором Ха. Кроме 20 стандартных аминокислот аминокислотные остатки полипептидов BR43x2 данного изобретения могут быть заменены нестандартными аминокислотами (такими как 4-гидроксипролин, 6-Nметиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и -метилсерин). Аминокислотные остатки полипептида BR43x2 могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и неприродных аминокислот. Белки данного изобретения могут также содержать остатки не встречающихся в природе аминокислот. Не встречающиеся природно аминокислоты включают в себя, без ограничения, транс-3 метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4 азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения природно не встречающихся аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, содержащей экстракт Е. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией (См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722. 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993 и Chung et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J.Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем способе клетки Е. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3 азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в этот белок вместо ее природной копии. См. Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией in vitro. Химическая модификация может комбинироваться с сайт-направленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Wynn andRichards, Protein Sci. 2:395-403, 1993). Аминокислотные остатки BR43x2 могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся природно аминокислот и неприродных аминокислот. Незаменимые аминокислоты в полипептидах BR43x2 данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-5 (1989. Отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, обеспечение уменьшения В-клеточного ответа во время иммунной реакции, ингибирование снижения продуцирования аутоантител) для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996. Сайты биологического взаимодействия, лигандсвязывающие части, такие как цистеин-богатые псевдоповторы, могут быть также определены физическим анализом структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J.Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологии с родственными членами семействаTNFR, такими как TACI и ВСМА. Дополнительные аминокислотные замены могут быть произведены в цистеин-богатом псевдоповторе BR43x2, пока сохраняются консервативные остатки цистеина, аспарагиновой кислоты и лейцина и не нарушается структура более высокого порядка. Предпочтительно производить замены в цистеинбогатом псевдоповторе BR43x2 со ссылкой на последовательности других цистеин-богатых псевдоповторов. SEQ ID NO:10 представляет собой обобщенный цистеин-богатый псевдоповтор, который показывает допустимые замены аминокислот на основе такого сопоставления. Замены в этом домене являются предметом ограничений, изложенных ниже. Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7,1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) и район-направленный мутагенез (Derbyshire etal., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988). Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептида BR43x2 могут быть образованы перетасовкой ДНК, описанной Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994 и WIPO Publication WO 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством гомологичной рекомбинации in vitro случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ может быть модифицирован с использованием семейства исходных ДНК, таких как аллельные варианты или ДНК, из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю "эволюцию" последовательностей посредством отбора на желательные мутации с одновременным отбором против вредных изменений. Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных полипептидов в клетках-хозяевах. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные полипептиды (например, обеспечивающие снижение В-клеточного ответа во время иммунной реакции, ингибирование или уменьшение продукции аутоантител), могут быть извлечены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры. При помощи обсуждаемых здесь способов специалист с обычной квалификацией в данной области может идентифицировать и/или получить многочисленные полипептиды, которые являются по существу гомологичными остаткам 1-120 SEQ ID NO:2, или их аллельные варианты, которые сохраняют свойства супрессии В-клеток белка дикого типа. Такие полипептиды могут включать в себя дополнительные аминокислоты или домены из других членов суперсемейства факторов некроза опухолей, аффинные метки или т.п. Полипептид BR43x2 или слитые конструкции, содержащие функциональные домены других членов суперсемейства TNFR, составляют гибридные рецепторы фактора некроза опухолей, проявляющие модифицированные способности супрессии В-клеток. Далее данное изобретение обеспечивает копии рецепторов и полинуклеотидов из других видов (ор- 14007471 тологи). Эти виды включают в себя, но не ограничиваются ими, виды млекопитающих, птиц, земноводных, пресмыкающихся, рыб, насекомых и других позвоночных и непозвоночных. Особый интерес представляют ВR43 х 2-рецепторы из других видов млекопитающих, в том числе рецепторы мыши, свиньи,овцы, коровы, псовых, кошачьих, лошадиных видов и рецепторы других приматов. Ортологи ВR43 х 2 рецептора человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций, обеспеченных данным изобретением, в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например, кДНК может быть клонирована с использованием мРНК, полученной из типа ткани или клеток, который экспрессирует этот рецептор. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондированием Нозерн-блотов зондами, сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем готовят библиотеку из мРНК положительной ткани или линии клеток. Затем кодирующая рецептор кДНК может быть выделена различными способами, такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или одним или несколькими наборами вырожденных зондов, основанных на описанных последовательностях. Эта кДНК может быть также клонирована при помощи ПЦР с применением праймеров, сконструированных из описанных здесь последовательностей. В дополнительном способе, эта библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителом к этому рецептору. Подобные способы могут быть применены также для выделения геномных клонов. Рецепторные полипептиды данного изобретения, в том числе полноразмерные полипептиды, растворимые рецепторные полипептиды, полипептидные фрагменты и слитые полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клетками-хозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии,грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности, культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клеткихозяева описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, Cold SpringHarbor, NY, 1989 и Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.,NY, 1987. В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид BR43x2, функционально связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет также содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах, и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными через коммерческих поставщиков. Для направления полипептида BR43x2 в секреторный путь клетки-хозяина, в экспрессирующем векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как сигнальная последовательность,лидерная последовательность,пре-пропоследовательность или препоследовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью полипептида BR43x2 или может быть произведена из другого секретируемого белка (например, t-PA (тканевого активатора плазминогена или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность функционально соединена с последовательностью ДНК BR43x2 в правильной рамке считывания и помещена для направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности ДНК(см., например, Welch et al., U.S. Patent No. 5 037 743; Holland et al., U.S. Patent No. 5 143 830). Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами в данном изобретении. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (Ausubel et al., ibid.) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80,1993). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано,например, Levinson et al., U.S. Patent No 4 713 339; Hagen et al., U.S. Patent No 4 784 950; Palmiter et al.,U.S. Patent No 4 579 821; и Ringold, U.S. Patent No 4 656 134. Подходящие культивируемые клетки млекопитающих включают в себя клеточные линии COS-1 (ATCC No CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No CRL 10314), 293 (ATCC No CRL 1573; Graham etal J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977), Jurkat (ATCC No. CRL-8129), BaF3 (интерлейкин-3-зависимую прелимфоидную клеточную линию, полученную из мышиного костного мозга. См., Palacios and Steinmetz,Cell 41:727-34, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-5, 1986) и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К 1; ATCC No. CCL 61). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из публичных депозитариев, таких как American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. В общем, предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловируса. См., например, U.S. Patent No. 4 956 288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (U.S. Patent No. 4 579 821 и U.S.Patent No. 4 601 978) и основной поздний промотор аденовируса. Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют "трансфектантами". Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген их потомству, называют "стабильными трансфектантами". Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как G-418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, способа, называемого "амплификацией". Амплификацию проводят культивированием трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам(например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как CD4, CD8, МНС Класса I, щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для сортинга трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как FACS-сортинг (сортинг клеток с возбуждением флуоресценции) или способ разделения при помощи магнитных гранул. Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том числе клетки растений, клетки насекомых и клетки птиц. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений рассмотрено Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 4758, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаныGuarino et al., U.S. Patent No. 5 162 222 и WIPO publication WO 94/06463. Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдрозаMolecular Biology. Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Второй способ получения рекомбинантного ВR43 х 2 бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67:4566-79, 1993). Эта система, которая использует векторы-переносчики, продается в наборе Вас-toBac (Life Technologies, Rockville, MD). Эта система использует вектор-переносчик, pFastBac1 (LifeChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Кроме того, векторы-переносчики могут содержать слияние в рамке считывания с ДНК, кодирующей метку эпитопа, на С- или N-конце экспрессируемого полипептида BR43x2, например метку эпитопа Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985). При помощи способа, известного в данной области, вектор-переносчик, содержащийBR43x2, трансформируют в Е. coli и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген lacZ, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе. Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный геном бакуловируса, выделяют при помощи известных способов и используют для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda, например, клеток Sf9. Затем получают рекомбинантный вирус, экспрессирующий BR43x2. Исходные материалы рекомбинантного вируса готовят способами, обычно используемыми в данной области. Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из осенних "походных (ратных) червей", Spodoptera frugiperda. См., в общих чертах,Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press,Washington, D.C., 1994. Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия High FiveO(Invitrogen), произведенная из Trichoplusia ni (Патент США 5 300 435). Для выращивания и поддержания этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются Sf900 II (Life Technologies) или ESF 921 (Expression Systems) для клеток Sf9; или ExcellO405 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) или Express FiveO (Life Technologies) для клеток Т. ni. Клетки выращивают от плотности инокуляции приблизительно 2-5 х 105 клеток до плотности приблизительно 1- 16007471 2 х 106 клеток и в это время добавляют исходный материал рекомбинантного вируса при множественности заражения (MOI) 0,1-10, более часто около 3. Используемые процедуры в общем описаны в доступных лабораторных руководствах (King and Possee, ibid.: O'Reilly et al., ibid.; Richardson, ibid.). Последующая очистка полипептида BR43x2 из супернатанта может быть достигнута с использованием описанных здесь способов. Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, могут быть также использованы в данном изобретении. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в этом отношении, включают в себя Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, U.S.al., U.S. Patent No. 5 037 743 и Murray et al., U.S. Patent No. 4 845 075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОT1, описанная Kawasaki et al. (U.S. Patent No. 4 931 373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментов (см., например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4 599 311; Kingsman et al., U.S. Patent No. 4 615 974 иBitter, U.S. Patent No. 4 977 092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также Патенты США 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 и 4 661 454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa, известны в данной области. См., например, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 и Cregg, U.S. Patent No. 4 882 279. Клетки Aspergillus могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., U.S. Patent No. 4 935 349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., U.S. Patent No. 5 162 228. Способы трансформации Neurospora описаны Lambowitz, U.S. Patent No. 4 486 533. Например, применение Pichia methanolica в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано Raymond, U.S. Patent No. 5 716 808, Raymond, U.S. Patent No. 5 736 383, Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998 и в международных публикацияхWO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 и WO 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации P. methanolica обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в P. methanolica предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде были промотором и терминатором гена Р. methanolica, таким как ген утилизации спирта P.methanolica (AUG1 или AUG2). Другие применимые промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (DHAS), формиатдегидрогеназы (FMD) и каталазы (CAT). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь сегмент экспрессии этой плазмиды,фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для применения в Pichia methanolica является ген ADE2 P. methanolica, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (AIRC; ЕС 4.1.1.21), который позволяет клеткам-хозяевамade2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных, промышленных процессов, где желательно минимизировать применение метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола (AUG1 и AUG2). Для получения секретируемых белков предпочтительны клетки-хозяева, дефектные по генам вакуолярных протеаз (РЕР 4 и PRB1). Электропорацию используют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки P. methanolica. Предпочтительно трансформировать клетки Р. methanolica электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля,имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно приблизительно 3,75 кВ/см, и константу времениот 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мс. Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и другие роды, также являются применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см, например, Sambrook et al., ibid). При экспрессии полипептида BR43x2 в бактериях, таких как Е.coli, этот полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае эти клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен и димеризован путем разведения продукта денатурации, например, диализом против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае этот полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения этих клеток (например,обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и извлечения этого белка, посредством чего устраняется необходимость денатурации- 17007471 и повторной укладки. Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно включают в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостаточности незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером,имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяина. Клетки P. methanolica культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов, при температуре приблизительно 25-35 С. Жидкие культуры обеспечивают достаточной аэрацией с использованием общепринятых средств, таких как встряхивание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для P. methanolica является YEPD (2% D-глюкоза, 2% Бакто Пептон (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Бакто дрожжевой экстракт (Difco Laboratories),0,004% аденин и 0,006% L-лейцин. Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды BR43x2 (или химерные или слитые полипептидыBR43x2) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и сред очистки. Предпочтительно обеспечивать белки или полипептиды данного изобретения в высокоочищенном виде, т.е. с чистотой более 95%, более предпочтительно с чистотой более 99%. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя применение гидроксиапатита, гельфильтрацию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие анионообменные среды включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды кремния и т.п. Предпочтительными являются производные PEI, DEAE, QAE и Q, причем особенно предпочтительной являетсяDEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NY). Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами, такие как PhenylSepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и т.п. Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп,гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводные для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступны из коммерческих источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например, Affinity Chromatography: PrinciplesMethods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala,Sweden, 1988. Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их физических свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным ионом металла (IMAC) может быть использована для очистки богатых гистидином белков, в том числе белков, содержащих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с образованием хелата(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Methods in Enzymol Vol. 182:529-39,"Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990). В дополнительных вариантах данного изобретения может быть сконструирован гибрид представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, мальтозусвязывающего белка, FLAG-метки (Asp Туг Lys Asp Asp Asp AspLys (SEQ ID NO:13, Glu-Glu-метки (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO:14, домена иммуноглобулина) для облегчения очистки. Могут быть выгодно использованы процедуры повторной укладки белка (и необязательно повторного окисления). Предпочтительно очищать белок до чистоты 80%, более предпочтительно до чистоты- 18007471 90%, даже более предпочтительно до чистоты 95% и особенно предпочтительно до фармацевтически чистого состояния, которое является чистотой более 99,9% в отношении примесных макромолекул, в частности, других белков и нуклеиновых кислот, при отсутствии инфекционных и пирогенных агентов. Предпочтительно очищенный белок по существу не содержит других белков, в частности, других белков животного происхождения. Полипептиды BR43x2 или их фрагменты могут быть также получены при помощи химического синтеза. Полипептиды BR43x2 могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; пэгилированными или непэгилированными и могут содержать или могут не содержать инициирующий аминокислотный остаток метионин. Примеры полипептидов BR43x2 включают в себя полипептиды длиной из 32-40 остатков, имеющие аминокислотную последовательность, соответствующую мотиву:(SEQ ID NO:10),и подчиняются описанным здесь ограничениям. Полипептиды BR43x2 могут быть также синтезированы эксклюзивным (т.е. только) твердофазным синтезом, частичными твердофазными способами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Предпочтительно эти полипептиды получают твердофазным синтезом пептидов, например,описанным Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963. Синтез проводят с аминокислотами, которые являются защищенными на альфа-амино-конце. Трифункциональные аминокислоты с лабильными боковыми цепями также защищают подходящими группами для предотвращения нежелательных химических реакций из возникающих во время сборки полипептидов. Альфа-аминозащитную группу селективно удаляют, чтобы позволить прохождение последующей реакции на амино-конце. Условия для удаления альфа-аминозащитной группы не удаляют защитные группы боковых цепей. Альфа-аминозащитными группами являются группы, применимые в области ступенчатого синтеза полипептидов. К ним относятся защитные группы ацильного типа (например формил, трифторацетил,ацетил), защитные группы арильного типа (например, биотинил), защитные группы типа ароматического уретана [например, бензилоксикарбонил (Cbz), замещенный бензилоксикарбонил и 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc)], защитные группы типа алифатического уретана [например, третбутилоксикарбонил (t-Boc), изопропилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил] и защитные группы алкильного типа (например, бензил, трифенилметил). Предпочтительными защитными группами являются tBoc и Fmoc. Выбранные защитные группы боковых цепей должны оставаться интактными во время связывания и не удаляться во время удаления защитной группы амино-конца или во время условий связывания. Защитные группы боковых цепей должны быть также удаляемыми после завершения синтеза при помощи реакционных условий, которые не будут изменять конечный продукт. В tBoc-способе защитные группы боковых цепей для трифункциональных аминокислот являются чаще всего группами на основе бензила. В Fmoc-способе они являются в большинстве случаев группами на основе трет-бутила или тритила. В tBoc-способе предпочтительными защитными группами боковых цепей являются тозил для аргинина, циклогексил для аспарагиновой кислоты, 4-метилбензил (и ацетамидометил) для цистеина, бензил для глутаминовой кислоты, серина и треонина, бензилоксиметил (и динитрофенил) для гистидина, 2-Сlбензилоксикарбонил для лизина, формил для триптофана и 2-бромбензил для тирозина. В Fmoc-способе предпочтительными защитными группами боковых цепей являются 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6 сульфонил (Рmc) или 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf) для аргинина, тритил для аспарагина, цистеина, глутамина и гистидина, трет-бутил для аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина и тирозина, tBoc для лизина и триптофана. Для синтеза фосфопептидов используют либо непосредственное включение, либо включение после сборки фосфатной группы. В стратегии непосредственного включения фосфатная группа на серине, треонине или тирозине может быть защищена метилом, бензилом или трет-бутилом в Fmoc-способе или метилом, бензилом или фенилом в tBoc-способе. Прямое включение фосфотирозина без защиты фосфата может быть также использовано в Fmoc-способе. В стратегии включения после сборки незащищенные гидроксильные группы серина, треонина или тирозина дериватизуют на твердой фазе ди-трет-бутил-,дибензилили диметил-N,N'-диизопропилфосфорамидитом и затем окисляют третбутилгидропероксидом. Твердофазный синтез обычно проводят от карбоксил-конца связыванием альфа-амино-защищенной(с защищенной боковой цепью) аминокислоты с подходящим твердым носителем. Сложноэфирная связь образуется, когда прикрепление производят к хлорметильной, хлортритильной или гидроксиметильной смоле, и полученный полипептид будет иметь свободную карбоксильную группу на С-конце. Альтернативно, при использовании амидной смолы, такой как смола на основе бензилгидриламина или пметилбензилгидриламина (для tBoc-способа) и смол на основе амида Rink или PAL-смолы (для Fmocспособа), образуется амидная связь и полученный полипептид будет иметь карбоксамидную группу на С-конце. Эти смолы, либо на основе полистирола, либо на основе полиамида, или с пришитым полиэтиленгликолем, со связывающей или линкерной группой или без нее, с присоединенной первой аминокис- 19007471 лотой или без нее, являются коммерчески доступными, и их приготовления были описаны Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) и Bayer and Rapp,Chem. Pept. Prot. 3:3,1986; и Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. IRL Press,Oxford, 1989. С-концевую аминокислоту, защищенную в боковой цепи, если необходимо, и при альфааминогруппе, присоединяют к гидроксиметильной смоле с использованием различных активирующих агентов, в том числе дициклогексилкарбодиимида (DCC), N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIPCDI) и карбонилдиимидазола (CDI). Она может быть присоединена к хлорметильной или хлортритильной смоле непосредственно в форме ее цезиевой тетраметиламмониевой соли или в присутствии триэтиламина(ТЭА) или диизопропилэтиламина (DIEA). Присоединение первой аминокислоты к амидной смоле является таким же, что и образование амидной связи во время реакций связывания. После присоединения к смоле-носителю альфа-аминозащитную группу удаляют с использованием различных реагентов в зависимости от способа защиты (например, tBoc, Fmoc). Степень удаления Fmoc может наблюдаться при 300-320 нм или при помощи ячейки для измерения электропроводности. После удаления альфа-аминозащитной группы остальные защищенные аминокислоты связывают ступенчато(постадийно) в требующемся порядке с получением желательной последовательности. Различные активирующие агенты могут быть использованы для реакций связывания (сочетания) в том числе DCC, DIPCDI, 2-хлор-1,3-диметилимидийгексафторфосфат (CIP), бензотриазол-1-ил-окситрис-(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР) и его пирролидиновый аналог (РуВОР), бромтрис-пирролидинофосфонийгексафторфосфат(РуВrОР),O-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU) и его тетрафторборатный аналог (ТВТИ) или его пирролидиновый аналог (HBPyU), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний-гексафторфосфат (HATU) и его тетрафторборатный аналог (TATU) или его пирролидиновый аналог (HAPyU). Наиболее общепринятые каталитические добавки, используемые в реакциях связывания, включают в себя 4-диметиламинопиридин(DMAP), 3-гидрокси-3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (HODhbt), N-гидроксибензотриазол (HOBt) и 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt). Каждую защищенную аминокислоту используют в избытке(2,0 экв.), и связывания обычно проводят в N-метилпирролидоне (NMP) или ДМФ, CH2Cl2 или их смесях. Степень полноты реакции связывания можно подвергать мониторингу на каждой стадии, например,по реакции с нингидрином, как описано Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970. После полной сборки желательного пептида комплекс смола-пептид расщепляют реагентом с подходящими поглотителями (акцепторами). Fmoc-пептиды обычно отщепляют и освобождают от защитных групп при помощи ТФУ с акцепторами (например, Н 2O, этанолдитиолом, фенолом и тиоанизолом). tBoc-пептиды обычно отщепляют и освобождают от защитных групп жидкой HF в течение 1-2 ч при -5-0 С, которая отщепляет полипептид от смолы и удаляет большую часть защитных групп боковых цепей. Акцепторы, такие как анизол, диметилсульфид и п-тиокрезол, обычно используют с жидкой HF для предотвращения алкилирования и ацилирования аминокислотных остатков, присутствующих в полипептиде, образующимися во время отщепления катионами. Формильная группа триптофана и динитрофенильная группа гистидина должна быть удалена, соответственно, пиперидином и тиофенилом в ДМФ перед расщеплением HF. Ацетамидометильная группа цистеина может быть удалена ацетатом ртути(II) и альтернативно иодом, трифторацетатом таллия(III) или тетрафторборатом серебра, которые одновременно окисляют цистеин до цистина. Другие сильные кислоты, используемые для отщепления tBoc-пептида и удаления защитных групп, включают в себя трифторметансульфоновую кислоту (TFMSA) и триметилсилилтрифторацетат (TMSOTf). Далее, данное изобретение обеспечивает разнообразные другие полипептидные слияния (гибриды) и родственные мультимерные белки, содержащие одно или несколько полипептидных слияний. Растворимый полипептид BR43x2, TACI или ВСМА может экспрессироваться в виде слияния (гибрида) с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Fc-фрагментом, который содержит два домена константной области и не содержит вариабельной области. Способы получения таких гибридов описаны в патентах США 5155027 и 5567584. Такие слитые белки обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Fc-части связаны дисульфидными связями друг с другом, а два не-Igполипептида выстроены в тесной близости друг с другом. Полипептидные слияния иммуноглобулинBR43x2 (TACI или ВСМА) могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках с образованием многочисленных мультимерных аналогов BR43x2. Вспомогательные домены могут быть слиты с полипептидами BR43x2 (TACI или ВСМА) для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы. Могут быть также сделаны слияния с использованием токсинов, как обсуждается здесь. Таким путем полипептиды и белки могут нацеливаться для терапевтических или диагностических целей. Полипептид BR43x2 может быть слит с двумя частями молекулы или большим числом частей молекулы,такими как аффинная метка, для очистки, и нацеливающий домен. Полипептидные слияния могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 34:1-9, 1996. Слияния этого типа могут быть также использованы, например, для аффинной очистки родственного лиганда из раствора, в качестве инструмента анализа in vitro, для блокирования сигналов in vitro специфическим оттитровыванием лиганда, для связывания лиганда на клеточной поверхности или в качестве антагонистов BR43x2 in vivo путем введения их для блокирования стимуля- 20007471 ции лиганда. Для применения в анализах слитые белки могут быть связаны с носителем через Fc-район и использованы в формате ELISA. Данное изобретение обеспечивает также растворимые BR43x2-рецепторы и полипептидные фрагменты, используемые для образования слитых белков с аффинными тэгами или метками. Растворимые слитые белки BR43x2-aффиннaя метка используют, например, для идентификации BR43x2-лигандов, а также агонистов и антагонистов природного лиганда. При помощи меченого растворимого BR43x2 клетки, экспрессирующие лиганд, агонисты или антагонисты, идентифицируют флуоресцентной иммуноцитометрией или иммуногистохимией. Растворимые слитые белки применимы в исследовании распределения лиганда на тканях или специфических последовательностях клеточных поколений и для обеспечения способности проникновения в суть биологии рецептор/лиганд. Для очистки лиганда, агонистов или антагонистов слитый белок BR43x2-Ig добавляют к пробе, содержащей лиганд, агонист или антагонист, в условиях, которые облегчают связывание рецептор-лиганд(обычно при близких к физиологическим температуре, рН и ионной силе). Затем комплекс рецепторлиганд отделяют при помощи смеси с использованием белка А, который иммобилизован на твердом носителе (например, нерастворимых гранулах смолы). Затем лиганд, агонист, антагонист элюируют при помощи общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. Альтернативно, сам слитый белок может быть связан с твердым носителем, и связывание и элюцию проводят, как описано выше. Способы иммобилизации рецепторного полипептида с твердым носителем, таким как гранулы агарозы,сшитой агарозы, стекло, целлюлозные смолы, смолы на основе диоксида кремния, полистирол, сшитый полиакриламид, или подобные материалы, которые являются стабильными в этих условиях применения,известны в данной области. Способы связывания полипептидов с твердыми носителями известны в данной области и включают в себя аминную химию, активацию цианогенбромидом, активацию Nгидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию и активацию гидразидом. Полученную среду обычно готовят в форме колонки и жидкости, содержащие лиганд, пропускают через эту колонку один раз или несколько раз, чтобы позволить лиганду связаться с рецепторным полипептидом. Затем этот лиганд элюируют при помощи изменений концентрации соли, хаотропных агентов(МnСl2) или рН для разрушения связывания лиганд-рецептор. Для направления экспорта растворимого рецептора из клетки-хозяина ДНК растворимого рецептора связывают со вторым ДНК-сегментом, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид t-PA. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного домена N- или С-концевое удлинение,такое как аффинная метка, или другой полипептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть слито с рецепторным полипептидом. Клетки, экспрессирующие функциональные растворимые или мембраносвязанные рецепторы данного изобретения, используют в тестах-скринингах. Многочисленные подходящие анализы известны в данной области. Эти анализы основаны на детектировании биологического ответа в клетке-мишени. Изменение в метаболизме в сравнении с контролем указывает, что тест-соединение модулирует опосредованный BR43x2 метаболизм. Одним из таких анализов является анализ клеточной пролиферации. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тест-соединения и пролиферацию клеток детектируют,например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, основанным на метаболическом расщеплении 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида(МТТ) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). Альтернативный формат анализа использует клетки,которые дополнительно конструируют для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген связывают с промоторным элементом, который является чувствительным к связанному с данным рецептором пути, и этот анализ детектирует активацию транскрипции данного репортерного гена. Многочисленные репортерные гены, которые легко анализируются в клеточных экстрактах, известны в данной области, например, lacZ E. coli, хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT) и сывороточный чувствительный элемент(SRE), (см., например, Shaw et al., Cell 56:563-572, 1989). Предпочтительным подобным репортерным геном является ген люциферазы (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987). Экспрессию гена люциферазы детектируют по люминесценции с использованием способов, известных в данной области (например,Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11,1993). Наборы для анализа с люциферазой являются коммерчески доступными, например, из PromegaCorp., Madison, WI. Клеточные линии-мишени этого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химикалиев, клеточно-кондиционированных культуральных сред, грибковых бульонов, почвенных проб, проб воды и т.п. Например, банк проб клеточно кондиционированных сред может быть анализирован на клетку-мишень для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе для клеток млекопитающих, который разделяют на два пула, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Затем пробы сред из трансфицированных клеток анализируют, с последующим разделением пулов, повторно трансфицируют, субкультивируют и повторно анализируют положительные клетки для выделения клонированной кДНК, кодирующей лиганд. Тест-система, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный- 21007471 прибор (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) могут быть выгодно использованы. Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного чипа (набора матриц). Применение этого прибора описано Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 и Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Например, полипептид BR43x2,фрагмент, антитело или член пары комплемент/антикомплемент присоединяют ковалентно при помощи аминной или сульфгидрильной химии к волокнам декстрана, которые присоединены к пленке золота в проточной ячейке. Тест-пробу пропускают через эту ячейку. Если лиганд, эпитоп или противоположный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в этой пробе, он будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, которое детектируется как изменение в резонансе поверхностных плазмонов золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости включения и выключения (on- и off-скорости), из которых может быть рассчитана аффинность связывания и сделана оценка стехиометрии связывания. Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других системах анализа, известных в данной области. Такие системы включают в себя анализ Скетчарда для определения аффинности связывания (см. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51; 660-72,1949) и калориметрические анализы (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991). Графический анализ Скетчарда для связывания растворимого 125l-ztnf4 с TACI и ВСМА показан на фиг. 2 и сравнен со связывающими константами других членов семейства TNFR в табл. 7. Таблица 7e Shuford et al., J. Exp. Med. 186:47-55, 1997 Активация полипептида BR43x2 в качестве рецептора может быть измерена биосенсорным микрофизиометром на основе кремния, который измеряет скорость внеклеточного подкисления или экскрецию протонов, ассоциированную со связыванием рецептора и последующими физиологическими клеточными ответами. Примером устройства является микрофизиометр Cytosensor, изготовляемый Molecular Devices, Sunnyvale, СА. Разнообразные клеточные ответные реакции, такие как пролиферация клеток, ионный транспорт, продуцирование энергии, воспалительный ответ, регуляторная и рецепторная активация- 22007471 и т.п., могут быть измерены этим способом. См., например, McConnel et al., Science 257:1906-1912, 1992;Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Микрофизиометр может быть использован для анализа прикрепленных или неприкрепленных эукариотических или прокариотических клеток. Путем измерения изменений внеклеточного подкисления в клеточных средах во времени микрофизиометр измеряет непосредственно клеточные ответные реакции на различные стимулы, в том числе агонисты, лиганды или антагонисты полипептида BR43x2. Предпочтительно, микрофизиометр используют для измерения ответов экспрессирующей BR43x2 эукариотической клетки, в сравнении с контрольной эукариотической клеткой, которая не экспрессирует полипептид BR43x2. Экспрессирующие BR43x2 эукариотические клетки включают в себя клетки, в которые был трансфицирован BR43x2, как описано здесь, с образованием клетки, которая отвечает на модулирующие BR43x2 стримулы, или клетки, природно экспрессирующие BR43x2, такие как экспрессирующие BR43x2 клетки, полученные из ткани селезенки. Различия,измеренные по изменению внеклеточного подкисления, например, по увеличению или уменьшению, в ответной реакции клеток, экспрессирующих BR43x2, относительно контроля, являются прямым измерением модулируемых BR43x2 клеточных ответов. Кроме того, такие модулированные BR43x2 ответы могут анализироваться при действии различных стимулов. С использованием микрофизиометра обеспечен также способ идентификации агонистов и антагонистов полипептида BR43x2, предусматривающий обеспечение клеток, экспрессирующих полипептид BR43x2, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тестсоединения и детектирование изменения, например, увеличения или уменьшения, в клеточной ответной реакции второй порции клеток в сравнении с первой порцией клеток. Изменение клеточного ответа демонстрируется как измеряемое изменение скорости внеклеточного подкисления. Антагонисты и агонисты полипептида BR43x2, могут быть быстро идентифицированы с использованием этого способа. Растворимый BR43x2 применим в исследовании распределения лиганда на тканях или специфических последовательностях клеточных поколений и для обеспечения способности проникновения в суть биологии рецептор/лиганд. Он может также применяться в исследовании специфичности TNFрецепторов для их лигандов как механизма разрушения несущих лиганд клеток-мишеней. Например,токсичные соединения могут быть связаны с растворимым BR43x2-рецептором или слитым белкомBR43x2. Примеры токсичных соединений могли бы включать в себя радиоактивные фармацевтические агенты, которые инактивируют клетки-мишени; химиотерапевтические агенты, такие как доксорубицин,даунорубицин, метотрексат и цитоксан; токсины, такие как рицин, дифтерийный токсин, экзотоксин APseudomonas и абрин; и антитела к цитотоксическим молекулам поверхности Т-клеток. Было обнаружено, что ztnf4 (5 нг/мл) связывается с BR43x2 (SEQ ID NO:2), TACI (SEQ ID NO:6),BCMA (SEQ ID NO:8) и BR43x1 (SEQ ID NO:9), при помощи FACS-анализа (Flow Cytometry and Sorting,Melamed et al., eds. Wiley-Liss, 1990 и Immunofluorescence and Cell Sorting, Current Proticols in Immunology, Volume 1, Coligan et al., eds. John WileySon, 1997). Было также показано, что FITC-меченый растворимый ztnf4 связывается специфически, среди других тканей, с В-лимфоцитами в PBMNC, клетках миндалин, с клеточными линиями В-клеточной лимфомы (Raji, лимфома Беркитта человека, АТССFACS-анализа. Не наблюдали связывания с HL-60 (клеточная линия промиелоцитов АТСС, ATCCCCL240). Специфичность связывания с В-клетками из PBMNC и клеток миндалин подтверждали коокрашиванием антителами к В-специфическим молекулам, в том числе CD19, IgD, IgM и CD20. Сходство ztnf4 сCD40L предполагало более широкое тканевое распределение, чем наблюдаемое распределение. Аффинность ztnf4 испытывали на моноцитах, дендритных клетках и очищенных Т-клетках при помощи теста пролиферации с использованием цитокинов и теста пролиферации Т-клеток, например, и не смогли детектировать связывания ztnf4 или какого-либо иного биологического действия на любом другом типе испытанных клеток. Таким образом, специфичность в отношении В-клеток для этого лиганда и рецептора предполагает, что они применимы для исследования и лечения аутоиммунитета, В-клеточных раков,иммуномодуляции, IBD и любых опосредованных антителами патологий, например IТСР, тяжелой псевдопаралитической миастении и т.п., почечных заболеваний, непрямой Т-клеточной иммунной реакции,отторжения трансплантата, реакции трансплантат против хозяина. Было показано, что ztnf4 активирует В-клетки, приводя к пролиферации В-клеток, образованию антител и положительной регуляции маркеров активации in vitro (см. примеры ниже). Эти воздействия могут требовать костимуляции через IL-4 или другие цитокины или стимуляции через рецептор Вклеточного антигена или другие рецепторы поверхности клеток, которые активируют В-клетки, т.е.CD40. Другие лиганды фактора некроза опухолей, такие как gр 39 и TNF, также стимулируют пролиферацию В-клеток. Таким образом, полипептиды данного изобретения могут быть нацелены для специфической регуляции В-клеточных ответов, ингибирование активированных В-клеток, во время иммунной реакции, без воздействия на другие клеточные популяции, что является полезным в лечении заболевания. Кроме того, полипептиды данного изобретения могли бы быть использованы для модуляции развития Вклеток, развития других клеток, образования антител и продуцирования цитокинов. ПолипептидыBR43x2 могут также найти применение в индукции апоптоза и/или анергии в клетках. Полипептиды данного изобретения могли бы также модулировать коммуникацию Т- и В-клеток нейтрализацией пролиферативных эффектов ztnf4. Биотесты и анализы ELISA доступны для измерения клеточного ответа наztnf4 в присутствии растворимых BR43x2, TACI и/или ВСМА. Другие тесты включают в себя тесты, которые измеряют изменения в продуцировании цитокинов как меру клеточного ответа (см., например,Current Protocols in Immunology ed. John E. Coligan et al., NIH, 1996), тесты для измерения других клеточных ответов, в том числе изотипа антител, активации моноцитов, образования NK-клеток, функции антигенпредставляющих клеток, апоптоза. Полипептиды BR43x2 данного изобретения могут быть применимы для нейтрализации эффектовztnf4 в лечении преВ- или В-клеточных лейкозов, таких как плазмоцитарный лейкоз, хронический или острый лимфоцитарный лейкоз, миелом, таких как множественная миелома, плазмоцитарная миелома,эндотелиальная миелома и гигантоклеточная миелома; и лимфом, таких как не-ходжкинская лимфома, с которой ассоциировано увеличение полипептидов ztnf4. Растворимый BR43x2 был бы полезным компонентом в программе лечения для ингибирования развития опухоли и выживания. Нозерн-блот-анализ показал, что ztnf4 экспрессируется в CD8+ клетках, моноцитах, дендроцитах,активированных моноцитах. Это предполагает, что в некоторых аутоиммунных нарушениях цитотоксические Т-клетки могут стимулировать образование В-клеток через избыточное продуцирование ztnf4. Иммуносупрессорные белки, которые селективно блокируют действие В-лимфоцитов, были бы полезными в лечении заболевания. Образование аутоантител является обычным для нескольких аутоиммунных заболеваний и способствует деструкции тканей и обострению заболевания. Аутоантитела могут также приводить к появлению осложнений, связанных с отложением иммунного комплекса, и приводить ко многим симптомам системной красной волчанки, в том числе почечной недостаточности, невралгическим симптомам и смерти. Модуляция образования антител, независимая от клеточного ответа, была бы выгодной во многих патологических состояниях. Было показано, что В-клетки играют роль в секреции артритогенных иммуноглобулинов в ревматоидном артрите (Korganow et al., Immunity 10:451-61, 1999). Само по себе ингибирование образования ztnf4-антител было бы полезным в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как тяжелая псевдопаралитическая миастения и ревматоидный артрит. Иммуносупрессивные терапевтические агенты, такие как растворимый BR43x2, который селективно блокирует или нейтрализует действие В-лимфоцитов, мог бы использоваться для таких целей. Для проверки этих способностей растворимых рецепторных полипептидов BR43x2 данного изобретения такие ВR43 х 2 полипептиды оценивали с использованием анализов, известных в данной области и описанных здесь. Данное изобретение обеспечивает способы с использованием полипептидов, слитых белков, антител, агонистов или антагонистов BR43x2, TACI или ВСМА для селективного блокирования или нейтрализации действий В-клеток в связи с почечными заболеваниями конечной стадии, которые могут быть связанными или могут не быть связанными с аутоиммунными заболеваниями. Такие способы были бы также ценными для лечения иммунологических почечных заболеваний. Такие способы были бы применимы для лечения гломерулонефрита, связанного с такими заболеваниями, как мембранная нефропатия,IgA-нефропатия или болезнь Бергера, IgM-нефропатия, болезнь Goodpasture, пост-инфекционный гломерулонефрит, мезангиопролиферативное заболевание, нефротический синдром с минимальным изменением. Такие способы могли бы служить в качестве терапевтических применений для лечения вторичных гломерулонефрита и васкулита, связанных с такими заболеваниями, как системная красная волчанка,полиартериит, болезнь Геноха-Шенлейна (геморрагический васкулит), склеродерма, ВИЧассоциированные заболевания, амилоидоз или гемолитико-уремический синдром. Способы данного изобретения были бы также применимы в виде части терапевтического применения для лечения интерстициального нефрита или пиелонефрита, связанных с хроническим пиелонефритом, злоупотреблением аналгетиками, нефрокальциноза, нефропатии, вызываемой другими агентами, нефролитиаза (почечнокаменной болезни) или хронического или острого нефрита. Способы данного изобретения включают в себя также использование полипептидов, слитых белков,антител, агонистов или антагонистов BR43x2, TACI или ВСМА в лечении гипертензивных заболеваний или заболеваний больших сосудов, в том числе стеноза или закупорки почечной артерии или закупорки или холестериновой эмболии или почечной эмболии. Данное изобретение обеспечивает также способы диагностики и лечения почечных или урологических неоплазм, множественных миелом, лимфом, невропатии легкой цепи или амилоидоза. Данное изобретение обеспечивает также способы блокирования или ингибирования активированных В-клеток с использованием полипептидов, слитых белков, антител, агонистов или антагонистовBR43x2, TACI или ВСМА для лечения астмы и других хронических заболеваний дыхательных путей,таких как бронхит и эмфизема. Также обеспечены способы ингибирования или нейтрализации реакции эффекторных Т-клеток с использованием полипептидов, слитых белков, антител, агонистов или антагонистов BR43x2, TACI или ВСМА для применения в иммуносупрессии, в частности, для такого терапевтического применения, как реакция трансплантат против хозяина и отторжение трансплантата. Дополнительным применением было бы применение в регуляции иммунной реакции, в частности, активации и регуляции лимфоцитов.- 24007471 Полипептиды, слитые белки, антитела, агонисты или антагонисты BR43x2, TACI или ВСМА были бы применимы в терапиях для лечения иммунонедостаточностей. Полипептиды, слитые белки, антитела,агонисты или антагонисты BR43x2, TACI или ВСМА могли бы быть применимы в терапевтических протоколах для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM) и болезнь Крона. Способы данного изобретения могли бы представлять дополнительную терапевтическую ценность для лечения хронических воспалительных заболеваний, в частности, для ослабления боли в суставах, опухания, анемии и других ассоциированных симптомов, а также для лечения септического шока. Действие растворимых полипептидов и слитых белков BR43x2, TACI или ВСМА на иммунную реакцию может быть измерено введением полипептидов данного изобретения животным, иммунизированным антигеном, с последующей инъекцией ztnf4 и измерением образования изотипа антител и В- и Тклеточных ответов, в том числе аллергической реакции замедленного типа и пролиферации in vitro и продуцирования цитокинов в соответствии со способами, известными в данной области. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ ингибирования ztnf4-активности в млекопитающем, предусматривающий введение указанному млекопитающему количества соединения, выбранного из группы, состоящей из: а) полипептида SEQ ID NO:4; b) полипептида SEQ ID NO:8; с) слитого белка; d) полипептида SEQ ID NO:6 от аминокислотного остатка 1 до остатка 166; е) полипептидаSEQ ID NO:8 от аминокислотного остатка 1 до остатка 150; f) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом SEQ ID NO:4; и g) антитела или фрагмента антитела, которые специфически связываются с полипептидом SEQ ID NO:10. Примеры слитых белков включают в себя слияния растворимого BR43x2 (SEQ ID NO:4), TACI (от аминокислотного остатка 1 до остатка 166SEQ ID NO:6) или ВСМА (от аминокислотного остатка 1 до остатка 150 SEQ ID NO:8) с другим полипептидом, предпочтительно Fc-фрагментом константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Данное изобретение обеспечивает также способ ингибирования связывания рецептор-лиганд BR43x2, TACI или ВСМА. Такие способы были бы особенно полезны, когда ztnf4-активность ассоциирована с активированными В-лимфоцитами, и для лечения пре-В-клеточных или В-клеточных раков. Такие способы были бы также полезны, когда ztnf4-активность ассоциирована с продуцированием антител. В частности, продуцирования антител, ассоциированного с аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка, тяжелая псевдопаралитическая миастения или ревматоидный артрит. Данное изобретение обеспечивает также агонисты и антагонисты BR43x2. Соединения, идентифицированные как агонисты BR43x2 применимы для модификации пролиферации и развития клетокмишеней in vitro и in vivo. Например, соединения-агонисты применимы отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами в качестве компонентов сред для культур клеток. Так, агонисты применимы в специфическом медиировании роста и/или развития несущих BR43x2 клеток В-лимфоцитов в культуре. Агонисты и антагонисты могут также оказаться применимыми в исследовании эффекторных функций В-лимфоцитов, в частности, активации и дифференциации В-лимфоцитов. Антагонисты применимы в качестве реагентов для исследования в характеристике лиганд-рецепторного взаимодействия. Соединения, идентифицированные как антагонисты BR43x2, применимы также для усиления гуморальной иммунной реакции. В-клеточные ответные реакции являются важными в борьбе с инфекционными заболеваниями, в том числе бактериальными, вирусными, вызываемыми простейшими и паразитарными инфекциями. Антитела против инфекционных микроорганизмов могут иммобилизовать патоген путем связывания с антигеном с последующим комплемент-опосредованным лизисом или клеточноопосредованной атакой. Антагонист BR43x2 мог бы служить для усиления гуморального ответа и был бы ценным терапевтическим агентом для индивидуумов с риском инфекционного заболевания или в качестве дополнения к вакцинации. Данное изобретение обеспечивает также антагонисты, которые связываются либо с полипептидамиBR43x2, либо, альтернативно, с лигандом, с которым связываются полипептиды BR43x2, тем самым ингибируя или исключая функцию BR43x2. Такие антагонисты BR43x2 включают в себя антитела; олигонуклеотиды, которые связываются либо с полипептидом BR43x2, либо с его лигандом; природные или синтетические аналоги лигандов BR43x2, которые сохраняют способность связываться с рецептором, но не приводят к передаче сигнала лиганда или рецептора. Такие аналоги могут быть пептидными или пептид-подобными соединениями. Природные или синтетические небольшие молекулы, которые связываются с полипептидами BR43x2 и предотвращают передачу сигнала, также рассматриваются как антагонисты. Как таковые, антагонисты BR43x2 были бы применимы в качестве терапевтических средств для лечения определенных нарушений, в которых был бы полезным блокированный сигнал либо от рецептора, либо от лиганда BR43x2. Антагонисты применимы в качестве исследовательских реагентов для характеристики взаимодействий лиганд-рецептор. BR43x2 экспрессируется на трансформированных линиях В-клеток, в том числе EBV-индуцированной и самопроизвольной лимфоме Беркитта и нескольких Вклеточных миеломах. Ингибирование функции BR43x2 было бы полезным в лечении В-клеточных лимфом или множественных миелом. Антагонисты BR43x2, такие как растворимые рецепторы или антителаBR43x2, могли бы использоваться терапевтически для медиирования развития опухоли.- 25007471 Активность агонистов и антагонистов может быть определена при помощи анализов активности,которые определяют силу связывания рецептор-лиганд. Были получены стабильно трансфицированные В-клеточные линии, такие как Baf3 (мышиная пре-В-клеточная линия Palacios and Steinmetz, ibid. иMathey-Prevot et al., ibid.), которые коэкспрессировали высокие уровни конструкций с репортерным геном для NfKB, NFAT-1 и АР-1, которые экспрессировали BR43x2. Клеточные линии, экспрессирующиеTACI и ВСМА, были также получены сходным образом и в Jurkat и других клеточных линиях В-лимфом. Было обнаружено, что ztnf4 передает сигнал, посредством репортерных генов в этих конструкциях. Растворимый BR43x2 и антитела могут быть использованы для измерения связывания. Подход in vivo для тестирования белков данного изобретения включает в себя вирусные системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают в себя аденовирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (AAV). Аденовирус, двухцепочечный ДНК-вирус, является в настоящее время наиболее исследованным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в отношении обзора см. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994 и Douglas and Curiel,ScienceMedicine 4:44-53, 1997). Аденовирусная система предоставляет несколько преимуществ: (i) аденовирус может вместить относительно большие инсерционные сегменты (вставки) ДНК; (ii) может выращиваться до высокого титра; (iii) инфицирует широкий спектр типов клеток млекопитающих и (iv) может быть использован в большом числе доступных векторов, содержащих различные промоторы. Кроме того, поскольку аденовирусы являются стабильными в кровотоке, они могут вводиться также внутривенной инъекцией. Путем делетирования частей аденовирусного генома могут быть помещены большие инсерционные сегменты (вставки) (до 7 т.п.н.) гетерологичной ДНК. Эти вставки могут быть включены в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с котрансфицируемой плазмидой. В приводимой в качестве примера системе, основной ген Е 1 был делетирован из вирусного вектора, и этот вирус не будет реплицироваться, пока ген Е 1 не будет обеспечен клеткой-хозяином (примером является клеточная линия 293 человека). При внутривенном введении интактным животным аденовирус прежде всего поражает печень. Если эта аденовирусная система доставки имеет делецию гена Е 1, этот вирус не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Однако, ткань хозяина (например, печень) будет экспрессировать и процессировать (и, если присутствует секреторная сигнальная последовательность, секретировать) гетерологичный белок. Секретированные белки будут входить в кровоток в высоковаскуляризованной печени, и могут быть определены действия на инфицированное животное. Аденовирусная система может быть также использована для получения белков in vitro. При культивировании инфицированных аденовирусом не-293 клеток в условиях, в которых эти клетки не являются быстро делящимися, эти клетки могут продуцировать белки в течение продолжительных периодов времени. Например, клетки ВНК выращивают до конфлюэнтности в клеточных фабриках (кассетах биореакторов для крупномасштабного производства клеток), затем экспонируют аденовирусному вектору, кодирующему представляющий интерес секретируемый белок. Затем клетки выращивают в бессывороточных условиях, которые позволяют инфицированным клеткам выживать в течение нескольких недель без существенного деления клеток. Альтернативно, инфицированные аденовирусным вектором клетки 293S могут выращиваться в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток для продуцирования значительных количеств белка (см. Garnier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). В случае любого протокола, экспрессируемый, секретируемый гетерологичный белок может периодически выделяться из супернатанта клеточной культуры. В протоколе с продуцированием инфицированными клетками 293S, также могут быть эффективно получены несекретируемые белки. Хорошо разработанные модели животных также доступны для тестирования эффективности in vivo растворимых полипептидов BR43x2, TACI или ВСМА данного изобретения в некоторых патологических состояниях. В частности, растворимые полипептиды BR43x2, TACI или ВСМА могут быть испытаны invivo в ряде моделей животных аутоиммунного заболевания, таких как MRL-lpr/lpr или NZB x NZW F1 имеющие общее происхождение штаммы мышей, которые служат в качестве модели SLE (системной красной волчанки). Такие модели животных хорошо известны в данной области, Autoimmune DiseaseModels A Guidebook, Cohen and Miller eds. Academic Press. Потомки скрещивания между НовоЗеландскими черными (NZB) и Ново-Зеландскими белыми (NZW) мышами развивают спонтанную форму SLE, которая близко напоминает SLE у человека. Мыши-потомки, известные как NZBW, начинают развивать IgM-аутоантитела против Т-клеток в возрасте 1 месяца и в возрасте 5-7 месяцев, Igаутоантитела против ДНК являются преобладающим иммуноглобулином. Повышенная функция поликлональных В-клеток приводит к сверхпродуцированию аутоантител. Отложение этих аутоантител, в частности, аутоантител, направленных против одноцепочечной ДНК, ассоциировано с развитием гломерулонефрита, который манифестируется клинически в виде протеинурии, азотемии и смерти от почечной недостаточности. Недостаточность почек является главной причиной смерти у мышей, пораженных спонтанной SLE, и в штамме NZBW, этот процесс является хроническим и разрушающим. Это заболевание является более быстрым и тяжелым в случае самок, чем в случае самцов, со средним выживанием только 245 дней в сравнении с 406 днями для самцов. Хотя многие из мышей-самок имеют симптомы(протеинурию) в возрасте 7-9 месяцев, некоторые могут быть гораздо более молодыми или более старыми, когда они развивают симптомы. Летальный иммунонефрит, наблюдаемый в мышах NZBW, является очень сходным с гломерулонефритом, наблюдаемым у людей с SLE, что делает эту спонтанную мышиную модель очень привлекательной для тестирования потенциальных терапевтических агентов для SLEDaikh et al., J. Immunol. 159:3104-08, 1997). Введение растворимых TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или других растворимых и слитых белков этим мышам для облегчения симптомов и изменений развития заболевания описано ниже в разделе примеров. Мышиные модели для экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) использовали в качестве инструмента для исследования как механизмов иммуноопосредованного заболевания, так и развития способов потенциального терапевтического вмешательства. Эта модель сходна с множественным склерозом человека и производит демиелинизацию в результате Т-клеточной активации в отношении нейробелков, таких как миелиновый основной белок (МВР) или протеолипидный белок (PLP). Инокуляция антигеном приводит к индукции CD4+, рестриктированным по антигенам МНС класса II Т-клеткам(Th1). Изменения в протоколе для ЕАЕ могут давать острые, хронически-рецидивирующие варианты или варианты пассивного переноса этой модели (Weinberg et al., J. Immunol. 162:1818-26, 1999; Mijaba et al.,Cell. Immunol. 186:94-102, 1999; и Glabinski, Meth. Enzym. 288:182-90, 1997). Введение растворимыхTACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или других растворимых и слитых белков этим мышам для оценки эффективности TACI, BR43x2 или ВСМА в ослаблении симптомов и изменений развития заболевания описано ниже в разделе примеров. В модели коллаген-индуцированного артрита (CIA) мыши развивают хронический воспалительный артрит, который близко напоминает ревматоидный артрит человека (RA). Поскольку CIA имеет сходные иммунологические и патологические признаки с RA, это делает эту модель идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных соединений для человека. Другим преимуществом применения модели CIA является то, что механизмы патогенеза являются известными. Т-клеточные и Вклеточные эпитопы на коллагене типа II были идентифицированы и были определены различные иммунологические (аллергическая реакция замедленного типа и антитела против коллагена) и воспалительные(цитокины, хемокины и деградирующие матрикс ферменты) параметры, относящиеся к иммуноопосредованному артриту, и они могут быть использованы для оценки эффективности тест-соединения в данных моделях (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992;TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или других растворимых и слитых белков этим мышам для оценки эффективности TACI, BR43x2 или ВСМА для ослабления симптомов и изменений развития заболевания описаны ниже в разделе примеров. Модели для бронхиальной инфекции, такой как астма, могут быть получены при инъекции мышей овальбумином и повторной стимуляции назально антигеном, который производит астматическую реакцию в бронхах, сходную с астмой. Введение растворимых TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или других растворимых и слитых белков этим мышам для оценки эффективности TACI, BR43x2 или ВСМА для ослабления симптомов и изменений развития заболевания описаны ниже в разделе примеров. Другое применение моделей in vivo включает в себя доставку антигенного стимула животному с последующим введением растворимого BR43x2 (TACI) или его лиганда ztnf4 и измерением Т-клеточного и В-клеточного ответа. Т-клеточно-зависимые и Т-клеточно-независимые иммунные реакции могут быть измерены, как описано в Perez-Melgosa et al., J. Immunol. 163:1123-7, 1999. Иммунный ответ в животных, подвергаемых регулярной антигенной стимуляции (например, овальбумином или коллагеном) с последующим введением полипептидов или растворимых Ig-слиянийBR43x2, TACI или ВСМА, может быть получен для измерения действия на В-клеточный ответ. Фармакокинетические исследования могут быть использованы в связи с радиоактивно мечеными растворимыми полипептидами или слияниями BR43x2, TACI или ВСМА для определения распределения и периода полужизни этих полипептидов in vivo. Дополнительно модели животных могут быть использованы для определения действий растворимых BR43x2, TACI или ВСМА на опухоли и на развитие опухолей in vivo. Обеспечены также использование полипептидов BR43x2, TACI или ВСМА в качестве суррогатных маркеров для аутоиммунных заболеваний, заболеваний почек, В- и Т-клеточных заболеваний. Из таких пациентов извлекают кровь и в этой крови могут быть определены растворимые рецепторы BR43x2,TACI или ВСМА и их лиганды. Данное изобретение обеспечивает также антитела. Антитела к BR43x2 или пептидам, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, могут быть получены, например, с использованием в качестве антигена продукта экспрессирующего вектора, содержащего представляющий интерес полипептид, или полипептида, выделенного из природного источника. Предпочтительно применимые антитела связываются специфически с BR43x2 или пептидами, имеющими аминокислотную последователь- 27007471 ность SEQ ID NO:10. Считается, что антитела являются специфически связывающими, если эти антитела связываются с полипептидом BR43x2 или полипептидом SEQ ID NO:8, пептидом или эпитопом со связывающей аффинностью (Kа) 106 М-1 или более высокой, предпочтительно 107 М-1 или более высокой,более предпочтительно 108 М-1 или более высокой и наиболее предпочтительно 109 М-1 или более высокой. Аффинность связывания антитела может быть легко определена специалистом с обычной квалификацией в данной области, например, при помощи анализа Скетчарда (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Подходящие антитела включают в себя антитела, которые связываются с BR43x2, в частности, со внеклеточным доменом BR43x2 (аминокислотными остатками 1-120 SEQ ID N0:2), и антитела,которые связываются с полипептидами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. Антитела против BR43x2 могут быть получены с использованием антигенных несущих эпитопBR43x2 пептидов и полипептидов. Антигенные эпитоп-несущие пептиды и полипептиды данного изобретения содержат последовательность из по меньшей мере девяти, предпочтительно 15-30 аминокислот,содержащихся в SEQ ID NO:2. Однако, пептиды или полипептиды, содержащие большую часть аминокислотной последовательности данного изобретения, содержащие от 30 до 50 аминокислот, или имеющие любую длину и в том числе всю аминокислотную последовательность полипептида данного изобретения, также могут быть применимы для индукции антител, которые связываются с BR43x2. Желательно, чтобы аминокислотная последовательность эпитоп-несущего пептида была выбрана таким образом,чтобы обеспечивать существенную растворимость в водных растворителях (т.е. эта последовательность включает в себя относительно гидрофильные остатки, тогда как гидрофобные остатки предпочтительно избегаются). Гидрофильные пептиды могут быть предсказаны специалистом в данной области из графика гидрофобности, см., например, Норр and Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-8, 1981) и Kyte andDoolittle (J. Mol. Biol. 157:105-142, 1982). Кроме того, аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина, могут быть также желательными для получения антител. Поликлональные антитела к рекомбинантному белку BR43x2 или к BR43x2, выделенному из природных источников, могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. См., например, Green et al., Production of Polyclonal Antisera, in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992) и Williams et al., Expression of foreign proteins in E.Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995). Иммуногенность полипептида BR43x2 может быть увеличена применением адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полного или неполного адъюванта Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, также включают в себя слитые полипептиды, такие как слияния BR43x2 или его части с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозусвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если полипептидная часть является гаптен-подобной, такая часть может быть выгодно связана или соединена с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH), бычий сывороточный альбумин (БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации. Хотя поликлональные антитела обычно индуцируют в животных, таких как лошади, коровы, собаки, куры, крысы, мыши, кролики, хомячки, морские свинки, козы или овцы, антитело против BR43x2 данного изобретения может быть также получено из антитела примата не человека. Общие способы индуцирования диагностически и терапевтически применимых антител в павианах могут быть найдены,например, в Goldenberg et al., Международной патентной публикацииWO 91/11465 и в Losman et al.,Int. J. Cancer 46:310, 1990. Антитела могут быть также индуцированы в трансгенных животных, таких как трансгенные овцы, коровы, козы или свиньи, и могут быть экспрессированы в дрожжах и грибах в модифицированных формах, а также в клетках млекопитающих и насекомых. Альтернативно, могут быть получены моноклональные антитела против BR43x2. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам в данной области (см., например, Kohler et al., Nature 256:495, 1975, Coligan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John WileySons 1991), Picksley et al., Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli, in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al., (eds.) page 93 (Oxford University Press, 1995. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъкцией мышей композицией, содержащей продукт гена BR43x2, подтверждением присутствия образования антител взятием пробы сыворотки, извлечением селезенки для получения В-лимфоцитов, слиянием В-лимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, клонированием этих гибридом, отбором положительных клонов,продуцирующих антитела к данному антигену, культивированием клонов, продуцирующих антитела к данному антигену, и выделением антител из культур гибридом. Кроме того, антитело против BR43x2 данного изобретения может быть получено из моноклонального антитела человека. Человеческие моноклональные антитела получают из трансгенных мышей, которые были получены генной инженерией для продуцирования специфических человеческих антител в ответ на антигенную стимуляцию. В этом способе, элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в штаммы мышей, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синте- 28007471 зировать человеческие антитела, специфические для антигенов человека, и эти мыши могут быть использованы для получения секретирующих антитела человека гибридом. Способы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны, например, Green et al., Nat. Genet. 7:13, 1994, Lonberg et al., Nature 368:856, 1994 и Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур различными хорошо разработанными способами. Такие способы выделения включают в себя аффинную хроматографию с Protein A Sepharose, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см.,например, Coligan стр. 2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1.-2.9.3; Baines et al., Purifications of Immunoglobulin G(IgG), in Methods in Molecular Biology Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992. Для конкретных применений может быть желательно получать фрагменты антител против BR43x2. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антитела. Фрагменты антител могут быть получены расщеплением пепсином или папаином целых антител общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с обеспечением фрагмента 5S, называемого F(ab')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием тиол-восстанавливающего реагента с получением одновалентных фрагментов 3,5S Fab'. Необязательно, реакцию расщепления можно проводить с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые возникают вследствие расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление при помощи пепсина дает сразу два одновалентных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Эти способы описаны, например,Goldenberg, патент США 4 331 647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967) иColigan, ibid. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием одновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть также использованы, пока фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом. Например, Fv-фрагменты содержат ассоциацию VH и VL цепей. Эта ассоциация может быть нековалентной, как описано Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659, 1972. Альтернативно, вариабельные цепи могут быть связаны межмолекулярной дисульфидной связью или перекрестно-сшиты химическими соединениями, такими как глутаровый альдегид (см., например, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992).Fv-фрагменты могут содержать VH и VL цепи, которые соединены пептидным линкером. Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки (sCFv) получают конструированием структурного гена, содержащего ДНК-последовательности, кодирующие домены VH и VL, которые соединены олигонуклеотидом. Этот структурный ген встраивают в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клетку-хозяина,такую как Е. coli. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, соединяющим мостиком эти два V-домена. Способы получения scFv описаны, например,Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991, также см. Bird et al., Science 242:423, 1988, Ladner et al., U.S. Patent No. 4 946 778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993, и Sandhu,ibid. В качестве иллюстрации, scFv может быть получен экспонированием лимфоцитов полипептидуBR43x2 in vitro и отбором библиотек представления антител в фагах или подобных векторах (например,посредством использования иммобилизованного или меченого белка или пептида BR43x2). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные домены связывания полипептида BR43x2, могут быть получены скринингом библиотек случайных пептидов, представленных на фаге (фаговое представление) или на бактериях, таких как Е. coli. Нуклеотидные последовательности, кодирующие данные полипептиды, могут быть получены рядом способов, таких как способ с использованием случайного мутагенеза и способ случайного синтеза полинуклеотидов. Эти библиотеки представления случайных пептидов могут быть использованы для скрининга на пептиды, которые взаимодействуют с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологической или синтетической макромолекулой или органическими или неорганическими веществами. Способы создания и скрининга таких библиотек представления случайных пептидов известны в данной области (Ladner et al., U.S.Patent No. 5 223 409, Ladner et al., U.S. Patent No. 4 946 778, Ladner et al., U.S. No. 5 403 484, Ladner et al.,U.S. Patent No. 5 571 698 и Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996 и библиотеки представления случайных пептидов и наборы для скрининга таких библиотек являются коммерчески доступными, например, из Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), и Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Библиотеки представления случайных пептидов могут быть подвергнуты скринингу с использованием последовательностей BR43x2, описанных здесь, для идентификации белков, которые связываются с BR43x2. Другая форма фрагмента антитела представляет собой пептид, кодирующий один комплементарность-определяющий район (CDR). CDR-пептиды (минимальные единицы узнавания) могут быть получены конструированием генов, кодирующих CDR представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области- 29007471 из РНК продуцирующих антитело клеток (см., например, Larrick et al., Methods: A Companion to MethodsAntibodies: Principles and Applications. Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995. Альтернативно, антитело против BR43x2 может быть получено из гуманизированного моноклонального антитела. Гуманизированные моноклональные антитела получают перенесением мышиных комплементарность-определяющих районов из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельную область человека. Затем типичные остатки антител человека помещают в каркасных районах мышиных копий. Применение компонентов антител, полученных из гуманизированных моноклональных антител, устраняет потенциальные проблемы, связанные с иммуногенностью мышиных константных областей. Общие способы клонирования вариабельных доменов мышиного иммуноглобулина описаны, например Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, Jones et al., Nature 321:522, 1986, Carter et al., Proc.(John WileySons, Inc. 1996) и Queen et al., U.S. Patent No. 5 693 762 (1997). Поликлоналыные антиидиотипические антитела могут быть получены иммунизацией животных антителами против BR43x2 или фрагментами антител с использованием стандартных способов. См., например, Green et al., Production of Polyclonal Antisera, in Methods in Molecular Biology: ImmunochemicalProtocols (Manson, ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992). Также см. Coligan, ibid. стр. 2.4.1-2.4.7. Альтернативно, моноклональные антиидиотипические антитела могут быть получены с использованием антител против BR43x2 или фрагментов антител в качестве иммуногенов с использованием способов, описанных выше. В качестве другой альтернативы, гуманизированные антиидиотипические антитела или антиидиотипические антитела приматов, стоящих ниже человека, могут быть получены с использованием описанных выше способов. Способы получения антиидиотипических антител описаны, например, Irie, U.S. Patent No. 5 208 146, Greene et al., U.S. Patent No. 5 637 677 и Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875,1996. Антитела или полипептиды, описанные здесь, могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений in vivo. Например, полипептиды или антитела данного изобретения могут быть использованы для идентификации или обработки тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную молекулу (например,рецептор или антиген, соответственно). Более конкретно, полипептиды BR43x2 или антитела противBR43x2 или их биоактивные фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в млекопитающее, имеющее клетки, ткани или органы, экспрессирующие антикомплементарную молекулу. Подходящие детектируемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептиду или антителу и включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептиду или антителу и включают в себя бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин,экзотоксин Pseudomonas, рицин, абрин и т.п.), а также терапевтические радионуклиды, такие как иод 131, рений-188 или иттрий-90 (либо непосредственно присоединенные к полипептиду или антителу, либо опосредованно присоединенные, например, через хелатирующую часть молекулы). Полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами, такими как адриамицин. Для непрямого присоединения детектируемой или цитотоксической молекулы эта детектируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, где другой член связан с частью полипептида или антитела. Для этих целей примером комплементарной/антикомплементарной пары является биотин/стрептавидин. Растворимые полипептиды или антитела к BR43x2 могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений in vivo. Например, полипептиды или антитела данного изобретения могут быть использованы для идентификации или обработки тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную молекулу (например, рецептор или антиген, соответственно). Более конкретно, полипептиды BR43x2 или антитела противBR43x2 или их биоактивные фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в млекопитающее, имеющее клетки, ткани или органы, экспрессирующие антикомплементарную молекулу. Подходящие детектируемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептиду или антителу и включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибито- 30