Полипептид, обладающий активностью rap [белка, ассоциированного с rip (взаимодействующим с рецептором белком)], кодирующая его последовательность днк и способы их получения и использования

006874 В общих чертах, настоящее изобретение относится к области рецепторов, принадлежащих к надсемейству рецепторов TNF/NGF, и к регулированию их биологических функций. Надсемейство рецепторовTNF/NGF включает такие рецепторы, как рецепторы фактора некроза опухоли р 55 и р 75 (TNF-R, далее именуемых p55-R и p75-R) и рецептор FAS-лиганда (называемый также FAS/AP01 или FAS-R и далее называемый FAS-R) и другие. В частности, настоящее изобретение относится к новым белкам, связывающимся с другими белками, которые сами по себе прямо или опосредованно связываются с членами семейства рецепторов TNF/NGF и другими внутриклеточными модуляторными белками, а более конкретно, настоящее изобретение относится к одному из таких белков, обозначенных в настоящем описании RAP (RIP-ассоциированный белок-2), который связывается с RIP("белок, взаимодействующий с рецептором") который, в свою очередь, связывается сам с собой и с MORT-1, FAS-R, p55-R, TRADD иTraf2. В соответствии с этим, настоящее изобретение, в общих чертах, относится к новым белкам, которые способны модулировать или опосредовать функцию RIP, и, тем самым, способны прямо или опосредованно модулировать или опосредовать функцию других белков, которые непосредственно или опосредованно связываются с RIP. В частности, настоящее изобретение относится к RAP, к его получению и использованию, а также к любым изоформам, фрагментам и производным RAP, к их получению и использованию. Предпосылки создания изобретения Фактор некроза опухоли (TNF-) и лимфотоксин (TNF-) (далее обозначение TNF относится как кTNF-, так и к TNF-) представляют собой полифункциональные провоспалительные цито-кины, образуемые, главным образом, мононуклеарными фагоцитами, которые обладают множественным действием на клетки (Wallach, D. (1986), в: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp.83-122, Academic Press, London; и BeutlerCerami (1987. Эффекты как TNF-, так и TNF- инициируются их связыванием с рецепторами клеточной поверхности. Некоторые из этих эффектов являются, вероятно, благоприятными для организма: они могут разрушать, например, опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки, и усиливать антибактериальную активность гранулоцитов. Таким образом, TNF обеспечивает защиту организма от опухолей и инфекционных агентов, и способствует его восстановлению от повреждения. Поэтому TNF может быть использован в качестве противоопухолевого агента, который связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток, и, тем самым, инициирует процессы, приводящие к гибели опухолевых клеток. TNF может быть также использован в качестве противоинфекционного агента. Однако, как TNF-, так и TNF- обладают также неблагоприятным действием. Имеются данные,что сверхпродуцирование TNF- может играть главную роль в патогенезе некоторых заболеваний. Так, например, известно, что действие TNF-, главным образом, на сосудистую сеть, является основной причиной возникновения симптомов септического шока (Tracey et al., 1986). При некоторых заболеваниях, TNF может вызывать чрезмерную потерю веса (кахексию), подавляя активность адипоцитов и стимулируя анорексию, из-за чего TNF- ранее называли кахетином. Этот факт был также описан как медиатор повреждения ткани при ревматических болезнях (BeutlerCerami, 1987) и как главный медиатор повреждения тканей, наблюдаемого при реакциях "трансплантат против хозяина" (Piquet et al., 1987). Кроме того, известно, что TNF участвует в процессах воспаления и во многих других заболеваниях. Вышеуказанные биологические эффекты TNF инициируют и/или опосредуют два различных, независимо экспрессируемых рецептора TNF-R, р 55 и р 75, которые специфически связываются как с TNF-,так и с TNF-. Эти два рецептора имеют структурно различающиеся внутриклеточные домены, что дает основание предположить, что они различным образом передают сигнал (см., Hohmann et al., 1989;Smith et al., 1990;Heller et al., 1990). Однако еще предстоит выяснить клеточные механизмы, например различные белки и возможно другие факторы, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигналаTNF-рецепторами р 55 и р 75. Внутриклеточная передача сигнала, происходит, очевидно, после связывания лиганда, то есть, TNF ( или ), с рецептором, ответственным за инициацию каскада реакций, которые, в конечном счете, приводят к наблюдаемому ответу клетки на TNF. Что касается вышеупомянутого цитоцидного эффекта TNF, то в большинстве клеток, исследованных до настоящего времени, этот эффект стимулируется, главным образом, рецептором р 55 TNF-R. Антитела против внеклеточного домена (домена, связывающегося с лигандом) р 55 TNF-R, сами могут стимулировать цитоцидный эффект (см., ЕР 412486), который коррелирует с эффективностью перекрестного сшивания рецептора с антителами, что, очевидно, является первой стадией генерирования процесса внутриклеточной передачи сигнала. Кроме того, исследования мутаций (Brakebusch et al., 1992; Tartagliaet al., 1993) показали, что биологическая функция р 55 TNF-R зависит от целостности внутриклеточного домена, и в соответствии с этим было высказано предположение, что инициация передачи внутриклеточного сигнала, приводящая к цитоцидному эффекту TNF, происходит в результате асоцииации двух или более внутриклеточных доменов р 55 TNF-R. Более того, TNF ( или ) присутствует в форме гомотримера, и было высказано предположение, что в этой форме он индуцирует внутриклеточную передачу-1 006874 сигнала посредством р 55 TNF-R благодаря его способности связываться и перекрестно сшиваться с молекулами рецептора, то есть, вызывать агрегацию рецепторов. Другим членом суперсемейства рецепторов TNF/NGF является рецептор FAS (FAS-R), который также был назван FAS-антигеном, белком клеточной поверхности, экспрессируемым в различных тканях и имеющим гомологию с рядом рецепторов клеточной поверхности, включая TNF-R и NGF-R. FAS-R опосредует гибель клеток в форме апоптоза (Itoh et al., 1991), и, очевидно, служит в качестве негативного селектора аутореактивных Т-клеток, то есть, в процессе созревания Т-клеток, FAS-R опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих свои собственные антигены. Было также обнаружено, что мутации в гене FAS-R (Ipr) вызывают лимфопролиферативные расстройства у мышей, напоминающие аутоиммунное заболевание человека, системную красную волчанку (СКВ) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Очевидно, что лиганд для FAS-R представляет собой ассоциированную с клеточной поверхностью молекулу, присутствующую, среди прочих, на Т-клетках-киллерах (или цитотоксических Т-лимфоцитах ЦТЛ), а поэтому при контактировании ЦТЛ с клетками, несущими FAS-R, они способны индуцировать апоптотическую гибель FAS-R-несущих клеток. Кроме того, были получены моноклональные антитела,которые являются специфичными для FAS-R, и эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих FAS-R, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК,кодирующей человеческий FAS-R (Itoh et al., 1991). Заявителями был разработан ряд методов (см., например, Европейские заявкиЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) регуляции неблагоприятных эффектов TNF, предусматривающих ингибирование связывания TNF с их рецепторами с использованием антител против TNF или с использованием растворимых TNF-рецепторов (в основном, растворимых внеклеточных доменов этих рецепторов) для конкурирования с TNF за связывание со связанными с клеточной поверхностью TNF-R. Кроме того,исходя из того факта, что связывание TNF со своим рецептором является необходимым для TNFиндуцирования клеточных эффектов, заявителями были разработаны способы (см., например, ЕР 568925) модуляции TNF-эффекта путем модуляции активности TNF-R. Вкратце, ЕР 568925 относится к способу модуляции передачи сигнала и/или расщепления TNF-R,благодаря чему пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, что приводит к модуляции нормальной функции TNF-R. В ЕР 568925 описаны конструирование и характеризация различных мутантных р 55TNF-R, имеющих мутации во внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах р 55 TNF-R. Таким образом, области, присутствующие в вышеуказанных доменах р 55 TNF-R, были идентифицированы как области, имеющие важное значение для функционирования рецептора, то есть, для связывания лиганда (TNF) и последующей передачи активирующего сигнала и каскада реакций внутриклеточного распространения сигнала, которые, в конечном счете, приводят к наблюдаемому воздействию TNF на клетки. Кроме того, был также описан ряд способов выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, способных связываться с различными участками в вышеуказанных доменах TNF-R, где указанные белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активностиTNF-R. В ЕР 568925 описан также ряд способов выделения и клонирования последовательностей ДНК,кодирующих такие белки и пептиды; способов конструирования экспрессирующих векторов для продуцирования этих белков и пептидов; и способов получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с TNF-R или с вышеуказанными белками и пептидами, связывающимися с различными областями TNF-R. Однако, в ЕР 568925 не указаны конкретные белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R (например, р 55 TNF-R), a также не описан способ с использованием двойных дрожжевых гибридов для выделения и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R. Аналогичным образом, в ЕР 568925 не описаны белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Хотя известно, что рецепторы фактора некроза опухоли (TNF) и структурно родственный рецепторFAS-R запускают в клетках после их стимуляции лейкоцит-продуцированными лигандами, деструктивную активность, что приводит к их собственной гибели, механизмы данного запуска пока еще мало понятны. Исследования мутаций показали, что в передаче сигнала цитотоксичности рецептором FAS-R и рецептором р 55 TNF-R (p55-R) участвуют различные области внутриклеточных доменов этих рецепторов (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; ItohNagata, 1993). Данные области ("домены гибели") имеют схожие последовательности. "Домены гибели" как рецептора FAS-R, так и рецептора p55-R имеют тенденцию к самоассоциации. Их самоассоциация, очевидно, стимулирует агрегацию этих рецепторов, которая необходима для инициации передачи сигнала (см. Song et al., 1994; Wallach et al., 1994;Boldin et al., 1995), и, при высоких уровнях экспрессии рецептора, она может приводить к стимуляции лиганднезависимой передачи сигнала (Boldin et al., 1995). Подобно другим рецептор-индуцированным эффектам, индуцирование гибели клеток рецепторамиTNF и FAS-R осуществляется посредством серии белок-белковых взаимодействий, происходящих в результате связывания лиганда с рецептором, и, в конечном счете, активации ферментных эффекторных функций, которые в конкретных исследованиях пролили свет на неферментативные белок-белковые взаимодействия, которые инициируют передачу сигнала гибели клеток: связывание молекул тримерногоTNF или FAS-R-лиганда с рецепторами, что приводит к взаимодействию их внутриклеточных доменов(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; ItohNagata, 1993), усиленному благодаря способности мотивов "доменов гибели" к самоассоциации (Boldin et al., 1995 а), и индуцированному благодаря связыванию двух цитоплазматических белков (которые могут также связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов МСЖТ-1(или FADD) с FAS-R (Boldin et al., 1995b, Chinnaiyan et al., 1995;Kischkel et al., 1995) и TRADD с p55-R (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом FAS-R и p55-R в области "домена гибели", участвующей в индуцировании гибели клеток благодаря рецепторам посредством гетероассоциации гомологичных областей, и которые также способны независимо стимулировать гибель клеток, были идентифицированы методом скрининга с использованием дрожжевого двойного гибрида. Одним из них является белок, MORT-1 (Boldin et al.,1995b), также известный как FADD (Chinnaiyan et al., 1995), который специфически связывается с FAS-R. Второй белок, TRADD (см. также Hsu et al., 1995,1996), связывается с p55-R, а третий белок, RIP (см. также Stanger et al., 1995), связывается как с FAS-R, так и с p55-R. Помимо их связывания с FAS-R и p55R, эти белки также способны связываться друг с другом, что приводит к функциональным "помехам" между FAS-R и p55-R. Это связывание происходит посредством консервативного мотива последовательности, "модуля домена гибели", общего для рецепторов и ассоциированных с ними белков. Кроме того,хотя в тесте с использованием дрожжевого двойного гибрида было показано, что MORT-1 спонтанно связывается с FAS-R в клетках млекопитающих, однако это связывание имеет место только после стимуляции рецептора, что дает основание предположить, что MORT-1 участвует в инициировании событий передачи сигнала FAS-R. MORT-1 не содержит ни одного мотива последовательности, характерного для ферментативной активности, а поэтому, способность MORT-1 стимулировать гибель клеток, очевидно,не является его собственной присущей ему активностью, а скорее, она является следствием активации некоторого другого белка(ов), который связывается с MORT-1 и является следующим звеном каскада реакций передачи сигнала. Было показано, что клеточная экспрессия мутантов MORT-1, в которых отсутствует М-концевая часть молекулы, блокирует индуцирование цитотоксичности белками FAS/APO1(FAS-R) или p55-R (Hsu et al 1996; Chinnaiyan et al., 1996), что указывает на то, что эта N-концевая область передает сигнал цитоцидного действия обоих рецепторов посредством белок-белковых взаимодействий. Таким образом, очевидно, что мотивы "домена гибели" рецепторов p55-R и FAS-R, а также три ассоциированных с ними белка MORT-1, RIP и TRADD являются участками белок-белковых взаимодействий. Эти три белка MORT-1, RIP и TRADD взаимодействуют с внутриклеточными доменами p55-R иFAS-R посредством связывания их "доменов гибели" с рецепторами; что же касается RIP и TRADD, то их "домены гибели" также способны к самоассоциации, хотя MORT-1 отличается от них в этом отношении, и его домен гибели не способен к самоассоциации. Кроме того, MORT-1 и TRADD различным образом связываются с FAS-R и p55-R, а также связываются друг с другом. Более того, как MORT-1, так иTRADD эффективно связываются с RIP. В соответствии с этим, очевидно, что взаимодействие между тремя белками MORT-1, RIP и TRADD является важной частью всей модуляции внутриклеточной передачи сигнала, опосредованной этими белками. Препятствие взаимодействию между этими тремя внутриклеточными белками будет приводить к модуляции эффектов, вызываемых этим взаимодействием. Так,например, ингибирование связывания TRADD с MORT-1 может модулировать взаимодействие FAS-R с р 55 TNF-R. Аналогичным образом, ингибирование RIP, помимо вышеуказанного ингибирования связывания TRADD с MORT-1, может кроме того, модулировать взаимодействие FAS-R с р 55 TNF-R. Моноклональные антитела, продуцированные против "домена гибели" p55-R, а в частности, против связывающего центра участков TRADD и RIP, могут быть также использованы для ингибирования или предотвращения связывания этих белков, и таким образом, для модуляции взаимодействия между FAS-R и p55-R. Более того, недавно было также обнаружено, что помимо вышеуказанной цитотоксической активности и ее модуляции, опосредованной различными рецепторами и связывающимися с ними белками,включая FAS-R, p55-R, MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4 и G1, ряд этих рецепторов и связывающихся с ними белков также участвуют в модуляции активности ядерного фактора транскрипции NF-B, который является ключевым медиатором выживания клеток или их жизнеспособности, и который является ответственным за регуляцию экспрессии многих генов иммунного и воспалительного ответа. Так, например, было установлено, что TNF- может фактически стимулировать активацию NF-B, а поэтомуTNF-, способен индуцировать два вида сигнала в клетках, один сигнал, вызывающий гибель клетки, и другой сигнал, защищающий клетки от гибели путем индуцирования экспрессии гена посредством NFB (см, ВеgBaltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). Аналогичный двойной эффект был также описан для FAS-R (см. ссылку на этот эффект, приводимую в вышеуказанной работе VanAntwerp et al., 1996). Из этого следует, что существует хрупкое равновесие между гибелью и выживанием клеток после стимуляции различных типов клеток с TNF- и/или FAS-R-лигандом, причем, конечный результат этой стимуляции зависит от того, какой внутриклеточной каскад реакций стимулируется в-3 006874 большей степени: тот, что приводит к гибели клетки (обычно по типу апоптоза), либо тот, что приводит к выживанию клетки посредством активации NF-B. Кроме того, недавно авторами настоящего изобретения был установлен возможный механизм, посредством которого члены семейства рецепторов TNF/NGF активируют NF-B (см., Malinin et al., 1997, и различные соответствующие ссылки, представленные в этой работе; и совместную одновременно рассматриваемую заявку на патент ИзраиляIL 117800 и IL 119133). Короче говоря, отсюда следует, что несколько членов семейства рецепторов TNF/NGF способны активировать NF-B посредством общего белка-адаптора, Traf2. Только что выявленная протеин-киназа, названная NIK (см. выше, Malinin et al.,1997, IL 117800 и IL 119133) способна связываться с Traf2 и стимулировать активность NF-B. Действительно, было показано (см. вышеуказанную работу Malinin et al., и заявки IL), что экспрессия в клетках мутантов, дефицитных по киназе NIK, приводит к тому, что эти клетки становятся неспособными к стимуляции NF-B нормальным эндогенным образом, и также к тому, что в этих клетках блокируется индуцирование NF-B-активности фактором TNF посредством любого FAS-R, и блокируется индуцированиеNF-B белками TRADD, RIP и MORT-1 (которые являются белками-адаптерами, связывающимися с этими рецепторами p55-R и/или FAS-R). Все эти рецепторы p55-R, p75-R, FAS-R и их белки-адапторыMORT-1, TRADD, и RIP прямо или опосредованно связываются с Traf2, которые, благодаря своей способности связываться с NIK, очевидно, модулируют индуцирование NF-B. Очевидно, что из вышеуказанных белков-модуляторов, участвующих в хрупком равновесии между гибелью и выживанием клеток после стимуляции FAS-R и/или p55-R, белок RIP играет важную роль. Белок RIP (см. Stanger et al., 1995, а также Malinin et al., 1997) имеет в своей С-концевой области "домен гибели", способный индуцировать цитотоксичность клетки независимым образом, а также путем ассоциации с доменами гибели MORT-1, p55-R, FAS-R и TRADD. В своей N-концевой области, RIP также имеет протеин-киназный домен и промежуточный домен, который, очевидно, способен перекрестно взаимодействовать (связываться) с Traf2, и, тем самым, участвовать в индуцировании NF-B. В соответствии с этим, детали, касающиеся характеристик и последовательностей RIP (ДНК и аминокислотной последовательности), приводятся в вышеуказанных публикациях (в частности, Stanger et al., 1995), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Краткое описание изобретения Целью настоящего изобретения является получение нового белка RAP, включая все его изоформы,аналоги, фрагменты или производные, способные связываться с белком RIP (называемым далее "RIP"). Поскольку RIP способен прямо или опосредованно взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами воспаления, клеточной цитотоксичности/клеточной гибели, такими как, p55-R и FAS-R, и с ассоциированными с ними белками-адапторами или белками-модуляторами, такими как, например, MORT-1,TRADD, МАСН, Mch4, G1 и другие, то из этого следует, что новые белки настоящего изобретения, благодаря своей способности связываться с RIP, способны влиять на процесс внутриклеточной передачи сигнала, инициированный связыванием FAS-лиганда со своим рецептором, и связыванием TNF со своим рецептором (p55-R), и что эти новые белки настоящего изобретения, как таковые, являются модуляторами p55-R- и FAS-R-опосредованного воздействия на клетки. Поскольку RIP также способен взаимодействовать с Traf2, и, тем самым, способен прямо или опосредованно взаимодействовать с NIK, и, кроме того, RIP сам по себе действует как модулятор процессов воспаления и выживания клеток, включая индуцирование NF-B, то следовательно, новые белки настоящего изобретения являются модуляторамиFAS-R, p55-R и их белков-модуляторов MORT-1 и TRADD, способных индуцировать NF-B и выживание клеток либо прямо, либо опосредованно путем связывания с RIP или путем связывания с Traf2, с которыми связывается RIP, белки настоящего изобретения могут быть также медиаторами процессов выживания клеток, действуя посредством общих или сходных механизмов внутриклеточной передачи сигнала, где различные вышеуказанные белки индуцируют выживание клеток. Аналогичным образом, поскольку p75-R связывается с Traf2, с которым связывается RIP, то новые белки настоящего изобретения могут быть также модуляторами RIP-ассоциированного опосредования р 75-Р-опосредованной активности. Другой целью настоящего изобретения является получение антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений, или даже некоторых изоформ) по отношению к вышеуказанным новым белкам RAP, их изоформам, аналогам, фрагментам и производным, которые могут быть использованы для ингибирования процесса передачи сигнала, или, более конкретно, процессов воспаления, цитотоксичности, или выживания клеток, если это необходимо. Другой целью настоящего изобретения является использование вышеуказанных новых белков RAP,их изоформ, аналогов, фрагментов и производных для выделения и характеризации дополнительных белков или факторов, которые могут участвовать в регуляции рецепторной активности, например, других белков, которые могут связываться с белками RAP и влиять на их активность, и/или для выделения и идентификации других рецепторов, которые принимают участие в предыдущих или последующих реак-4 006874 циях данного процесса(ов) передачи сигнала, и с которыми связываются эти новые белки, их аналоги,фрагменты и производные, а поэтому, в функции которых, эти белки также принимают участие. Еще одной целью настоящего изобретения является получение ингибиторов, которые могут быть введены в клетки для связывания или взаимодействия с RAP и с возможными изоформами RAP, где указанные ингибиторы могут ингибировать RIP-ассоциированную активность в клеточных цитотоксических процессах, а поэтому, если это необходимо, повышать способность клеток к выживанию, либо они могут ингибировать RIP-ассоциированную активность в процессах выживания клеток, а поэтому, если это необходимо, усиливать клеточную цитотоксичность. Кроме того, целью настоящего изобретения является использование вышеупомянутых белков RAP,их изоформ, аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения поликлональных и/или моноклональных антител против этих белков. Эта антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для выделения новых белков из различных источников, таких как, клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии. Более того, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей, например, для идентификации расстройств, связанных с неправильным функционированием клеточные эффектов, опосредованных p55-R, FAS-R или других родственных рецепторов. Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, содержащих вышеуказанные новые белки RAP, их изоформы, или их аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтических композиций, содержащих вышеуказанные антитела или другие антагонисты. В соответствии с настоящим изобретением был выделен новый белок RAP. RAP способен связываться или взаимодействовать с RIP, и следовательно, является модулятором или медиатором внутриклеточной активности RIP. RIP участвует в модуляции или опосредовании каскадов реакций внутриклеточной передачи сигнала, например процессов, ассоциированных с клеточной цитотоксичностью или с гибелью клеток, в которых RIP обладает собственной цитотоксической активностью, а также цитотоксической активностью в комбинации, прямо или опосредованно, с рядом других ассоциированных с клеточной гибелью белков, таких как, например, MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1, p55-R и FAS-R, с которыми RIP может ассоциироваться или связываться прямо или опосредованно через мотив/модуль "домена гибели", присутствующий в RIP и во всех вышеуказанных белках; других каскадов реакций, которыми являются процессы воспаления, выживания или жизнеспособность клеток, где RIP может играть активирующую роль, прямо или опосредованно, благодаря присутствию киназного мотива или домена,присутствующего в RIP, и способности RIP связываться с Traf2, который может связываться с NIK, который, в свою очередь, непосредственно участвует в активации NF-B, играющего центральную роль в воспалении и выживании клеток. Кроме того, р 55 и TRADD способны взаимодействовать с Traf2, а также участвуют в активации NF-B, и, тем самым, в механизме выживания клеток, а поэтому RIP, благодаря своей способности связываться или взаимодействовать с р 55, FAS-R и TRADD (а также с Traf2), может также участвовать, посредством этих белков, в модуляции воспаления и активации выживания клеток. В соответствии с этим, RIP является модулятором или медиатором этих процессов, а значит, RAP настоящего изобретения, благодаря связыванию с RIP, является модулятором или медиатором указанных внутриклеточных каскадов реакций.RAP был выделен и клонирован с использованием дрожжевой двухгибридной системы, а также был секвенирован и охарактеризован, и как будет подробно описано ниже, RAP представляет собой высокоспецифический RIP-связывающий белок, а следовательно он является специфическим RIPмодулятором/медиатором. RAP не связывается с TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R и MACH. Кроме того,очевидно, что RAP не содержит характерного модуля или мотива "домена гибели", что подтверждает обнаруженный факт, что RAP сам по себе не индуцирует клеточную цитотоксичность. Используемое в настоящем описании понятие RIP-активность означает его активность в модуляции/опосредовании процессов воспаления и гибели/выживания клеток, и его активность в модуляции/опосредовании процесса выживания клеток. Эти активности описаны выше и ниже в настоящем описании, а также в вышеупомянутых публикациях и патентных заявках, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Аналогично, используемое в настоящем описании понятие RAP-активность означает его активность в модуляции/опосредовании RIP-активности благодаря своему специфическому связыванию с RIP, причем, эта RAP-опосредованная модуляция активности RIP включает модуляцию/опосредование процессов воспаления и гибели/выживания клеток, в которых RIP участвует прямо или опосредованно, а поэтому, RAP, как таковой, может рассматриваться как непрямой модулятор/медиатор всех вышеупомянутых белков, и возможно, ряда других белков, которые участвуют в воспалении, гибели и выживании клеток, и с которыми связывается RIP, или с которыми RIP взаимодействует прямым или непрямым способом. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, был получен новый белок, обозначенный RAP. Как указывалось выше, RAP был выделен и клонирован методом двухгибридного скрининга, и охарактеризован как молекула, которая связывается с RIP. Секвенирование RAP, которое проводили путем сравнения последовательности RAP с различными последовательностями, имеющимися в базе дан-5 006874 ных, например, в Genebank "dbest" и в базах данных человеческого генома уровня 1 (Human Genome Database), выявило, что он является новым белком, и какой-либо гомологии между последовательностьюRAP и известными последовательностями обнаружено не было. Фактически были обнаружены две последовательности ДНК, отличающиеся только своими 5'-некодирующими областями, которые, вероятно,произошли от того же самого гена вследствие альтернативного сплайсинга. Еще остается выяснить, каким образом RAP связывается с RIP, а в частности, необходимо определить области гомологии или связывания RAP с RIP, которые обеспечивают их связывание друг с другом. Очевидно, что RAP не содержит ни модуля "домена гибели", ни какой-либо другой известной области ферментативной или другой активности, например, киназного или протеазного домена. Исходя из вышеупомянутого следует, что, как указано выше и как будет указано ниже, RAP является, по видимому, специфическим RIP-связывающим белком, а поэтому модулятором/медиатором внутриклеточной активности RIP. Таким образом, вполне очевидно, что RAP играет определенную роль в модуляции/опосредовании активности, направленной на воспаление, выживание и/или гибель клеток, в которой RIP участвует прямо или опосредованно, а особенно, активности, направленной на цитотоксичность и воспаление, вызываемое или индуцированное различными стимуляторами, включая сигналы, передаваемые рецепторами семейства TNF/NGF и возможно другими рецепторами (для схемы участия RIP в этих внутриклеточных событиях, а следовательно и участия RAP, см. фиг. 1 в работе Malinin et al., 1997).RAP может также служить в качестве ингибитора клеточной цитотоксичности и воспаления благодаря его присутствию как части комплекса с другими белками, например, с RIP и белками, связанными сRIP, и, как таковой, он может влиять на цитотоксические или воспалительные эффекты этих других белков (например, p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, G1 и MORT-1), что, в конечном счете, приводит к ингибированию их цитотоксической активности или их активности при воспалении.RAP может также служить в качестве усилителя или стимулятора клеточной цитотоксичности и воспаления, и данный эффект достигается путем стимуляции активности других белков, например RIP и других белков, связанных с RIP, которые, как отмечено выше, обеспечивают RIP-опосредованный рекрутинг этих белков, причем указанный рекрутинг служит для стимуляции цитотоксической активности различных белков или для стимуляции их воспалительных эффектов. Аналогичным образом, RAP может также служить в качестве ингибитора или стимулятора каскада реакций, направленных на выживание клеток, благодаря, как отмечено выше, участию RIP в этом каскаде реакции. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующейRIP и модулировать или опосредовать внутриклеточную активность RIP, причем указанная внутриклеточная активность направлена на модуляцию/опосредование воспаления и/или гибель клеток и/или выживание клеток. В частности, настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, выбранной из группы,состоящей из:(a) последовательности кДНК, происходящей от кодирующей области нативного белка RAP;(b) последовательностей ДНК, которые способны гибридизоваться с последовательностью (а) в умеренно жестких условиях и которые кодируют биологически активный белок RAP; и(c) последовательностей ДНК, которые являются вырожденными вследствие вырожденности генетического кода для последовательностей ДНК, определенных в (а) и (b), и которые кодируют биологически активный белок RAP. Другим конкретным вариантом вышеуказанной последовательности ДНК настоящего изобретения является последовательность ДНК, содержащая, по крайней мере, часть последовательности, кодирующей по крайней мере одну изоформу белка RAP. Другим вариантом является последовательность ДНК,кодирующая белок RAP, показанная на фиг. 1. Еще одним вариантом является последовательность белкаRAP, показанная на фиг. 2 и выведенная из последовательности ДНК фиг. 1. Настоящее изобретение относится к белкам RAP и его аналогам, фрагментам или производным, кодированным любой из вышеуказанных последовательностей настоящего изобретения; причем указанные белки, аналоги, фрагменты и производные способны к связыванию с RIP и к модуляции/опосредованию его биологической активности во внутриклеточных каскадах реакций, направленных на гибель и/или выживание клеток. Конкретным вариантом настоящего изобретения являются белок RAP, его аналоги, фрагменты и производные. Последовательность белка RAP, выведенная из последовательности ДНК фиг. 1, показана на фиг. 2. Другим вариантом настоящего изобретения является любая изоформа белка RAP, его аналоги,фрагменты и производные. Настоящее изобретение также относится к векторам, кодирующим вышеуказанный белок RAP, и его аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения, которые содержат вышеуказанную последовательность ДНК настоящего изобретения; причем эти векторы способны экспрессироваться в подходящих эукариотических или прокариотических клетках-хозяевах; к трансформированным эукарио-6 006874 тическим или прокариотическим клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы; и к способу продуцирования белка RAP, или его аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения путем культивирования указанных трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии указанного белка, его аналогов, фрагментов или производных, обеспечения посттрансляционных модификаций указанного белка, необходимых для получения указанного белка, и выделения указанного белка, его аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды указанных трансформированных клеток или из клеточных экстрактов указанных трансформированных клеток. Вышеуказанные определения предполагают включение всех изоформ белка RAP. В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к антителам или их активным производным или фрагментам, обладающим специфичностью к белку RAP и его аналогам, фрагментам и производным настоящего изобретения. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к различным способам использования вышеуказанных последовательностей ДНК или белков, кодируемых этими последовательностями в соответствии с настоящим изобретением, причем указанными способами использования являются среди прочих:(i) Способ модуляции внутриклеточных каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, модулированных или опосредованных белком RAP, предусматривающий обработку указанных клеток одним или несколькими белками RAP, их изоформами, аналогами, фрагментами или производными, способными связываться с RIP, где указанная обработка указанных клеток предусматривает введение в указанные клетки указанных одного или более белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для их внутриклеточного введения; или введение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные один или более белков, их изоформ, аналогов, фрагментов, или производных в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность; причем, указанный вектор является пригодным для эффективного введения указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы эта последовательность экспрессировалась в указанных клетках.(ii) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных лигандами семейства TNF путем их влияния на клетки посредством действия белка RIP, как описано выше в (i), где указанная обработка клеток предусматривает введение в указанные клетки указанного белка RAP или его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для внутриклеточного введения; или введение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанный белок G1 или его изоформы, аналоги, фрагменты или производные в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность; причем, указанный вектор является пригодным для эффективного введения указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы эта последовательность могла экспрессироваться в указанных клетках.(iii) Способ, аналогичный описанному выше в (ii), где указанную обработку указанных клеток проводят путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором на основе вирусов животных, и где указанный способ предусматривает проведение стадий: а) конструирования рекомбинантного вектора на основе вируса животных, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим рецептором клеточной поверхности на поверхности FAS-R- или р 55-R-несущей клетки,и вторую последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка RAP, и его изоформ, аналогов,фрагментов и производных, который при его экспрессии в указанных клетках, способен модулировать/опосредовать процессы внутриклеточночного воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток; и(b) инфицирования указанных клеток указанным вектором (а).(iv) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства TNF на клетки посредством действия белка RIP, где указанный способ предусматривает обработку указанных клеток антителами или их активными фрагментами или производными в соответствии с настоящим изобретением, где указанная обработка предусматривает введение в указанные клетки подходящей композиции, содержащей указанные антитела, их активные фрагменты или производные, и где, в том случае, если внеклеточную поверхность обрабатывают, по крайней мере, частью белка RAP, то указанную композицию изготавливают для внеклеточного применения, а в случае, если указанные белки RAP являются полностью внутриклеточными, то указанную композицию изготавливают для внутриклеточного применения.(v) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства TNF на клетки посредством действия белка RIP, где указанный способ предусматривает обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью,кодирующей антисмысловую последовательность по крайней мере части последовательности белка RAP настоящего изобретения, где указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка RAP.(vi) Способ, описанный в п. (ii) для обработки опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток или других патологических клеток, предусматривающий:-7 006874 а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок, способный связываться со специфическим рецептором поверхности опухолевой клетки или рецептором поверхности ВИЧ-инфицированной клетки,или рецептором, находящимся на поверхности другой патологической клетки; и последовательность,кодирующую белок, выбранный из белка RAP, его аналогов, фрагментов и производных настоящего изобретения, который, при его экспрессии в указанных опухолевых клетках, ВИЧ-инфицированных клетках или других патологических клетках, способен уничтожать указанные клетки посредством воздействия на них белка RIP; и(b) инфицирования указанных опухолевых клеток, или ВИЧ-инфицированных клеток, или других патологических клеток указанным вектором.(vii) Способ модуляции каскадов реакций гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства TNF посредством действия на клетки белка RIP, где указанный способ предусматривает процедуру обработки рибозимом, в которой вектор, кодирующий последовательность рибозима, способного взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей белокRAP настоящего изобретения, вводят в указанные клетки в такой форме, которая обеспечивает экспрессию указанной рибозимной последовательности в указанных клетках, и где в случае, если указанная рибозимная последовательность экспрессируется в указанных клетках, то она взаимодействует с указанной клеточной последовательностью мРНК и расщепляет эту последовательность мРНК, что приводит к ингибированию экспрессии указанного белка RAP в указанных клетках.(viii) Способ, выбранный из вышеуказанных способов настоящего изобретения, где указанная последовательность, кодирующая белок RAP, содержит по крайней мере одну из изоформ RAP, или один из его аналогов, фрагментов и производных настоящего изобретения, которые способны связываться с(ix) Способ выделения и идентификации белков настоящего изобретения, способных связываться с белком RIP, предусматривающий проведение процедуры с использованием дрожжевого двойного гибрида, где последовательность, кодирующая указанный белок RIP, или присутствующая в одном гибридном векторе, и последовательность из библиотеки кДНК или библиотеки геномных ДНК, присутствует во втором гибридном векторе, и где эти векторы затем используют для трансформации дрожжевых клетокхозяев, после чего позитивные трансформированные клетки выделяют, и указанный второй гибридный вектор экстрагируют с получением последовательности, кодирующей белок, который связывается с указанным белком RIP.(х) Способ, описанный выше в пп.(i)-(ix), где указанным белком RAP является любая из изоформRAP, или любой из его аналогов, фрагментов и производных.(xi) Способ, описанный выше в пп.(i)-(x), где белок RAP или любая из его изоформ, или любой из его аналогов, фрагментов и производных участвует в модуляции клеточного эффекта, опосредованного или модулированного любым другим медиатором или индуктором, с которым указанный белок RAP или его изоформа, аналог, фрагмент или производное может связываться прямо или опосредованно. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для модуляции процессов воспаления, и гибели и/или выживания клеток, опосредованных воздействием семейства TNF на клетки посредством действия на вышеуказанные клетки белка RIP или другого медиатора или индуктора, где указанная композиция включает в качестве активного ингредиента любой из следующих компонентов:(i) белок RAP настоящего изобретения или его биологически активные фрагменты, аналоги, производные, или их смеси;(ii) рекомбинантный вектор на основе вируса животного, кодирующий белок, способный связываться с рецептором клеточной поверхности, и кодирующий белок RAP или его биологически активные фрагменты или аналоги настоящего изобретения;(iii) олигонуклеотидная последовательность, кодирующая антисмысловую последовательность белка RAP настоящего изобретения, где указанный олигонуклеотид может быть второй последовательностью рекомбинантного вектора на основе вируса животного, определенного выше в п.(ii). Настоящее изобретение также относится:I. К способу модуляции процессов воспаления и внутриклеточных процессов гибели и/или выживания клеток, модулированных/опосредованных белком RIP или действием любого другого медиатора или индуктора, или любого другого индуктора или ингибитора NF-B на клетки, где указанный способ предусматривает обработку этих клеток в соответствии со способом настоящего изобретения, описанным выше в пп.(i)-(x), белком RAP, его изоформами, аналогами, фрагментами или производными, или последовательностями, кодирующими белки RAP, или его изоформы, аналоги или фрагменты, где указанная обработка приводит к усилению или к ингибированию указанного RIP-опосредованного эффекта, и, тем самым, также эффекта, опосредованного FAS-R- или p55-R, либо другим медиатором или индуктором,либо индуктором или ингибитором NF-B.II. К способу, указанному выше, где указанный белок RAP, его аналог, фрагмент или производное является частью белка RAP, который участвует в специфическом связывании с RIP, или с другим медиатором или индуктором, или с другим индуктором или ингибитором NF-kB, либо последовательность указанного белка RAP кодирует часть белка RAP, который участвует в специфическом связывании с RIP,или с другим медиатором или индуктором, или с другим индуктором или ингибитором NF-kB.III. К способу, описанному выше, где указанный белок RAP является одной из изоформ RAP, способной усиливать RIP-ассоциированный эффект.IV. К способу, описанному выше, где указанный белок RAP является одной из изоформ RAP, способной ингибировать RIP-ассоциированное действие на клетки, или действие на клетки, опосредованное другим медиатором или индуктором, и, тем самым, также ингибировать FAS-R- или р 55-Rассоциированное действие на клетки, или действие на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора.V. К способу, описанному выше, где указанный белок RAP, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны усиливать или ингибировать RIP-ассоциированное действие на процесс воспаления и выживания клетки путем прямого или опосредованного ингибирования NF-kB, или путем прямой или опосредованной активации JNK или киназы р 38. Выделение белков RAP, их идентификация и характеризация могут быть осуществлены любыми стандартными методами скрининга, используемыми для выделения и идентификации белков, например методом с использованием дрожжевого двойного гибрида, методами аффинной хроматографии, и любыми другими хорошо известными стандартными методами, обычно используемыми в этих целях. Другие аспекты и варианты настоящего изобретения будут также понятны из нижеследующего подробного описания изобретения. При этом следует отметить, что используемые в описании термины "модуляция/опосредование действия RIP, или FAS-R-лиганда, или TNF на клетки" и любые другие из таких "модуляций/опосредований", упомянутых в настоящей заявке, также включают in vitro и in vivo-обработку, и,помимо этого, также включают ингибирование или усиление/увеличение. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая RAP; и на фиг. 2 показана выведенная аминокислотная последовательность RAP. Подробное описание изобретения В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к новым белкам RAP, которые способны связываться с белком RIP, и, тем самым, опосредовать или модулировать внутриклеточную активность RIP, особенно в тех случаях, где RIP участвует в модуляции или опосредовании каскадов реакций воспаления, гибели клеток/выживании клеток, подробно описанных выше. Таким образом, RAP может ингибировать активность RIP в каскадах реакций воспаления, гибели клеток/выживания клеток; RAP может усиливать активность RIP в процессах воспаления или гибели/выживания клеток; либо он может усиливать активность RIP в одном из указанных процессов, и ингибировать активность RIP в другом. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому белку RAP. RAP был секвенирован и охарактеризован, и было обнаружено, что RAP представляет собой RIP-связывающий белок, который имеет высокую специфичность по отношению к RIP, но не связывается с рядом белков, о которых известно, что они участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, которая приводит к воспалению, гибели клеток или выживания клеток. RAP, очевидно, также не содержит ни одного домена, общего с белками, которые проявляют активность в любом из этих каскадов реакций, то есть, RAP не содержит мотив или модуль "домена гибели", и он не содержит киназного мотива или домена, а также он не содержит протеазного домена или мотива. Определенная последовательность RAP также представляет собой уникальную последовательность, как было установлено, исходя из сравнения с последовательностями в ряде баз данных, включая Genebank, базы данных человеческого генома уровня 1 (Human Genome Database) и"dbest". Как было подробно описано выше (также со ссылками на все указанные публикации и патентные заявки), RIP участвует во внутриклеточных каскадах реакций воспаления, и гибели/выживания клеток. Поэтому, регуляция или контроль активности RIP может обеспечивать регуляцию любого или всех из этих процессов при инициации этих процессов, например, путем связывания TNF- или Fas-лиганда с их рецепторами (в частности, рецепторами для TNF, p55-R). RIP может играть ключевую роль в определении, какой из указанных процессов активирован в большей степени, и такое определение может быть осуществлено благодаря способности RIP связываться с рядом цитотоксических белков, содержащих домены гибели, а также с рядом белков, обладающих киназной активностью. В соответствии с этим, белки, такие как белок RAP настоящего изобретения, который может специфически связываться с RIP, может играть важную роль в модуляции RIP-активности, и тем самым в модуляции степени индуцирования одного из процессов по отношению к другим процессам. Таким образом, белок RAP настоящего изобретения является важным модулятором или медиатором внутриклеточного сигнала. Вследствие уникальной способности рецепторов FAS-R и TNF вызывать гибель клеток, а также способности рецепторов TNF стимулировать различные другие активности, направленные на разрушение тканей, абберация функции этих рецепторов может особенно пагубно влиять на организм. Действи-9 006874 тельно, было показано, что как избыток, так и дефицит функции этих рецепторов способствует развитию патологических симптомов различных заболеваний. Идентификация молекул, которые принимают участие в активности этих рецепторов в передаче сигналов, и выявление механизмов модуляции функции этих молекул, возможно, является ключом для разработки новых терапевтических методов лечения этих заболеваний. В связи с предполагаемой важной ролью RIP в FAS-R- и p55-R-токсичности, а следовательно и предполагаемой важной регуляторной ролью RAP в RIP-опосредованной модуляции FAS-R и TNF,очевидно, что особенно важно разработать нужные лекарственные средства, которые могут блокировать цитотоксическую функцию RIP, вероятно, посредством блокирования связывания RAP с RIP или какимлибо другим способом ингибировать взаимодействие между RAP и RIP в таких условиях, при которыхRAP способствует усилению RIP-опосредованной цитотоксичности (как показано выше, RIP является цитотоксичным сам по себе и в комбинации с другими белками, которые содержат области "домена гибели"). Аналогичным образом, также известно (см. выше), что FAS-R и p55-R участвуют в активации NFB, и, тем самым, в выживании клеток. В соответствии с этим, если нужно уничтожить клетки, например, раковые клетки, ВИЧ-инфицированные клетки и т.п., то необходимо усилить цитотоксическое действие FAS-R и p55-R (и ассоциированных с ними белков, таких как, например, MORT-1, МАСН, Mch4,G1, TRADD), и в то же время ингибировать их способность индуцировать NF-B. Следовательно, если взаимодействие или связывание RAP с RIP приводит к увеличению возможной роли RIP в усилении индуцирования NF-B (возможно посредством Traf2, а возможно посредством киназного домена и/или промежуточного домена RIP), то необходимо блокировать это взаимодействие между RAP и RIP в целях ингибирования или, по крайней мере, предотвращения усиления активации NF-B, и, тем самым, сдвига равновесия TNF- или FAS-лиганд-индуцированных эффектов в сторону клеточной цитотоксичности, что,в конечном счете, приводит к увеличению гибели клеток. Аналогичным образом, в противоположной ситуации (той, что указана выше), при которой связывание RAP с RIP фактически приводит к ингибированию воспалительного или цитоксического действияFAS-R и p55-R, и при которой желательно блокировать эти цитотоксические эффекты, например, при воспалениях, различных аутоиммунных заболеваниях, и т.п., где необходимо стимулировать выживание клеток, очень важно разработать такие лекарственные средства, которые будут усиливать взаимодействие между RAP и RIP с усилением общего ингибирования гибели клеток и сдвига равновесия в сторону выживания клеток. Исходя из вышеуказанного, очевидно, что в случае, когда взаимодействие RAP с RIP вызывает ингибирование функции RIP в повышении активации NF-B, и, если выживание клеток является желательным, то необходимо блокировать это взаимодействие между RAP и RIP, и, тем самым, усилить активность RIP в повышении активации NF-B. Исходя из вышеуказанного, очевидно, что RIP играет ключевую роль в равновесии между индуцированием или опосредованием каскадов реакций воспаления, гибели клеток или выживания клеток, а поэтому RAP также играет такую же важную роль как и модулятор RIP. Влияние на взаимодействие/связывание между RAP и RIP с применением различных лекарственных средств или курсов лечения,как указано выше и ниже, очевидно, позволит достигнуть сдвига в каскаде реакций внутриклеточной передачи сигнала в направлении от гибели клеток в сторону выживания клеток, или наоборот, если это необходимо. Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, кодирующей белок RAP, и к белкам RAP, кодируемым этими последовательностями ДНК. Кроме того, настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные аналоги, фрагменты и производные белка RAP, и к аналогам, фрагментам и производным, кодируемым этими последовательностями. Получение таких аналогов, фрагментов и производных обеспечивается стандартными методами (см. например, Sambrook et al., 1989), где в последовательностях ДНК, кодирующих белок RAP, один или несколько кодонов могут быть делегированы, добавлены или заменены другими кодонами, с получением аналогов, имеющих, по крайней мере, одну замену аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком. Из вышеуказанных последовательностей ДНК настоящего изобретения, которые кодируют белокRAP, его изоформу, аналог, фрагмент или производное, также включенных как вариант настоящего изобретения, последовательности ДНК способны гибридизоваться с последовательностью кДНК, происходящей от кодирующей области нативного белка RAP, где такую гибридизацию осуществляют в умеренно жестких условиях, и где гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активный белок RAP. Следовательно, этими гибридизуемыми последовательностями ДНК являются последовательности ДНК, которые имеют относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК нативного RAP, и, как таковые, представляют собой RAP-подобные последовательности, которые могут быть,например, природными последовательностями, кодирующими различные изоформы RAP, или природными последовательностями, кодирующими белки, принадлежащие к группе RAP-подобных последовательностей, кодирующих белок, обладающий RAP-активностыо. Кроме того, этими последовательностями могут быть также, например, не встречающиеся в природе синтезированные последовательности, ко- 10006874 торые являются аналогичными последовательности кДНК нативного RAP, но, при этом, включают ряд нужных модификаций. Следовательно, такими синтетическими последовательностями являются все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные RAP, каждый из которых обладает активностью RAP. Для получения различных вышеуказанных природных RAP-подобных последовательностей могут быть использованы стандартные методы скрининга и выделения природных образцов ДНК или РНК из различных тканей с использованием природной кДНК RAP или ее части в качестве зонда (см. например,стандартные методы, описанные в руководстве Sambrook et al., 1989). Аналогично, для получения вышеуказанных различных синтетических RAP-подобных последовательностей, кодирующих аналоги, фрагменты или производные RAP, может быть использован ряд стандартных методов, подробно описанных ниже для получения указанных аналогов, фрагментов и производных. Полипептид или белок "существенно соответствующий" белку RAP, означает не только белок RAP,но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами RAP. Аналогами, которые, в основном, соответствуют белку RAP, являются такие полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности белка RAP были заменены другой аминокислотой, делегированы и/или инсертированы, при условии, что полученный в результате этого белок обладает, в основном, той же самой или более высокой активностью, чем белок RAP, которому он соответствует. Для получения белка, в основном, соответствующего белку RAP, замены в последовательности белков RAP, таких как, изоформы, являются, в основном, относительно незначительными. Хотя число замен может быть больше десяти, однако, предпочтительно, чтобы таких замен было не более десяти,более предпочтительно, не более пяти, а наиболее предпочтительно, не более трех. Хотя для обнаружения возможных биологически активных белков, которые, в основном, соответствуют белкам RAP, могут быть использованы любые методы, однако, одним из таких методов является использование стандартной техники мутагенеза белок-кодирующей ДНК, которая приводит к небольшим модификациям. Белки,экспрес-сированные такими клонами, могут быть затем скринированы на их способность связываться сRIP и модулировать активность RIP при модуляции/опосредовании вышеуказанных внутриклеточных каскадов реакций."Консервативными" заменами являются такие замены, которые, как ожидается, не должны изменять активность белка, и которые обычно сначала должны быть оценены, как замены, которые, предположительно, не изменяют размер, заряд или конфигурацию белка, и, таким образом, предположительно,не изменяют его биологических свойств. Консервативные замены белков RAP включают аналог, где, по крайней мере, один аминокислотный остаток в полипептиде был консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замены, предпочтительно, осуществляют в соответствии с нижеследующим списком, представленным в табл. IA, где замены могут быть определены путем рутинного экспериментирования с получением модифицированных структурных и функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулы при сохранении биологической активности, свойственной белку RAP. Таблица IA Альтернативно, другой группой замен в белке RAP являются такие замены, где по крайней мере один аминокислотный остаток в полипептиде был удален, и вместо него вставлен другой остаток в соответствии с табл. IB. Типы замен, которые могут быть сделаны в полипептиде, могут быть выбраны исходя из анализа частоты встречаемости аминокислотных замен между гомологичными белками других виде, таких, которые представлены в табл. 1-2 в работе Schuiz et al., G.E., Principles of Protein StructureSpringer-Verlag, New York, NY, 1978, и Figs. 3-9 of Creighton, Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. FreemanCo., San Francisco, CA, 1983. Исходя из этого анализа, альтернативные консервативные замены определяют в настоящем описании как замены внутри одной из следующих пяти групп: Таблица IB 1. Малые алифатические неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly); 2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; 4. Крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ilе, Val (Cys); и 5. Крупные ароматические остатки: Phe, Туr, Тrр. Три аминокислотных остатка, указанных выше в скобках, играют особую роль в укладке белка. Gly представляет собой остаток, не имеющий какой-либо боковой цепи, и вследствие этого он сообщает цепи гибкость. В этом случае, однако, имеется тенденция к стимуляции образования вторичной структуры,отличающейся от -спирали. Остаток Pro, из-за его необычной геометрии, сильно затрудняет цепь, и, в основном, стимулирует образование -виток-подобных структур, хотя, в некоторых случаях, Cys может оказаться способным участвовать в образовании дисульфидной связи, которая имеет важное значение для укладки белка. Следует отметить, что Schulz и др., см. выше, должны были объединить группы 1 и 2,указанные выше. Следует также отметить, что Тyr, из-за его возможной водородной связи, имеет значительное сродство с Ser и Thr, и т.п. В соответствии с настоящим изобретением, консервативные аминокислотные замены, представленные выше, известны специалистам, и, как предполагается, после осуществления этих аминокислотных замен должны сохраняться биологические и структурные свойства полипептида. Большинство делений и замен, осуществляемых в соответствии с настоящим изобретением, не вносят существенных изменений в характеристики белка или полипептидной молекулы. Термин "характеристики" определен неинклюзивным образом и означает как изменение во вторичной структуре, например, в -спирали или в -складке,так и изменение в биологической активности, например, в связывании с RIP и/или опосредовании влияния RIP на гибель клетки. Примерами продуцирования аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов белков RAP для использования в настоящем изобретении, являются стадии любых известных методов, таких как, которые описаны в патентах США RE 33653, 4959314, 4588585 и 4737462 (Mark et al.); 5116943 (Koths et al.), 4965195 (Namen et al.), 4879111 (Chong et al.), и 5017691 (Leeet al.); и белки с заменами лизина, описанные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Помимо консервативных замен, обсуждаемых выше, которые не должны значительно повлиять на активность белка RAP, в объем настоящего изобретения входят либо консервативные замены, либо менее консервативные замены и более произвольные замены, которые приводят к увеличению биологической активности аналогов белков RAP. Если необходимо точное подтверждение влияния данной замены или делеции, то для любого специалиста очевидно, что влияние данной замены (замен), делеции (делеций), и т.п. может быть оценено путем рутинного анализа на связывание и гибель клеток. Скрининг с использованием такого стандартного теста не предусматривает излишнего экспериментирования. Подходящими аналогами RAP являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, способность к связыванию с RIP, и, тем самым, как указывалось выше, опосредуют активность RIP в каскаде внутриклеточных реакций, описанных выше. Таким образом, могут быть продуцированы аналоги, кото- 12006874 рые обладают так называемым доминантно-негативным действием, а именно, аналоги, которые является дефектным либо по связыванию с RIP, либо по последующей передаче сигнала, либо по какой-нибудь другой активности, продуцируемой после такого связывания. Эти аналоги могут быть использованы,например, для ингибирования действия RIP или для ингибирования NF-B-индуцирующего действияRIP (прямого или непрямого) в зависимости от того, какая из этих активностей является главной активностью, модулированной взаимодействием RAP с RIP (см. выше), и это ингибирование обеспечивается такими аналогами, которые конкурируют с природным RAP за связывание с RIP. На генетическом уровне, эти аналоги обычно продуцируют путем сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок RAP, в результате чего получают ДНК, кодирующую этот аналог, с последующим синтезом этой ДНК и экспрессией полипептида в рекомбинантной клеточной культуре. Этот аналог, обычно, обладает той же самой или повышенной, представляющей особый интерес,биологической активностью по сравнению с природным белком. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, N.Y., 1987-1995; Sambrook et al.,(1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989. Получение белка RAP, как указано выше, или альтернативной нуклеотидной последовательности,кодирующей тот же самый полипептид, но отличающийся от природной последовательности вследствие замен, допустимых благодаря известной вырожденности генетического кода, может быть осуществлено путем сайт-специфического мутагенеза ДНК, кодирующей ранее полученный аналог или нативный вариант белка RAP. Сайт-специфический мутагенез позволяет продуцировать аналоги посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с нужной мутацией, а также достаточное число смежных нуклеотидов с получением праймерной последовательности достаточного размера и вариабельности для образования стабильного дуплекса на обеих сторонах от делеционно-го стыка. В основном, предпочтительным является праймер длиной от около 20 до 25 нуклеотидов примерно с 5-10 дополнительными нуклеотидами на каждой стороне модифицируемой последовательности. В общих чертах, техника сайт-специфического мутагенеза хорошо известна специалистам, и описана в публикациях, таких как, публикация Adelman et al., DNA 2:183 (1983),описание которой вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Следует отметить, что в методе сайт-специфического мутагенеза обычно используют фаговый вектор, который существует как в одноцепочечной форме, так и в двухцепочечной форме. Типичными векторами, используемыми в сайт-направленном мутагенезе, являются такие векторы, как фаг М 13, описанный, например, в публикации Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), описание которой вводится в настоящую заявку в качестве ссылки. Эти фаги являются коммерчески доступными, и широко используются специалистами. Альтернативно, для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы,которые содержат сайт инициации репликации одноцепочечного фага (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3,1987). В общих чертах, вышеупомянутый сайт-направленный мутагенез осуществляют сначала путем получения одноцепочечного вектора, который включает в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую соответствующий полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий нужную мутированную последовательность,получают синтетически путем автоматизированного ДНК/олигонуклеотидного синтеза. Затем этот праймер гибридизуют с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность нужного белка, и подвергают обработке полимеризующими ДНК ферментами, такими как, фрагмент Кленова полимеразы I E.coli, для завершения синтеза цепи, несущей мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут нужную мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как,клетки штамма JM101 (E.coli, и отбирают клоны, которые содержат рекомбинантные векторы, несущие структуру мутированной последовательности. После отбора такого клона, последовательность мутированного белка RAP может быть удалена и введена в соответствующий вектор, обычно, в вектор переноса или экспрессирующий вектор такого типа, который может быть использован для трансфекции соответствующего хозяина. В соответствии с этим, ген или нуклеиновая кислота, кодирующая белок RAP, могут быть также детектированы, получены и/или модифицированы in vitro, in situ, и/или in vivo известными методами амплификации ДНК или РНК, такими как, ПЦР и химический олигонуклеотидный синтез. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличивать число копий) специфические последовательности ДНК посредством повторных полимеразных ДНК реакций. Эта реакция может быть использована вместо клонирования, и все, что требуется для ее осуществления - это знание последовательности нуклеиновой кислоты. Для осуществления ПЦР конструируют праймеры, комплементарные нужной последовательности. Затем, эти праймеры генерируют путем автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку могут быть сконструированы праймеры для гибридизации с любой частью гена, то можно создать такие условия, чтобы было допустимым "ошибочное" спаривание комплементарных оснований. Амплификация участков с таким ошибочным спариванием может приводить к синтезу мутагенизированного продукта, способствующего про- 13006874 дуцированию пептида с новыми свойствами (то есть, сайт-направленный мутагенез). См., также Ausubel,гл.16 (см.выше). Может быть также осуществлен синтез путем связывания комплементарной ДНК(кДНК) с использованием обратной транскриптазы в ПЦР, при этом РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена пролактинового рецептора без клонирования. Кроме того, могут быть сконструированы ПЦР-праймеры для введения новых сайтов рестрикции или других элементов, таких как, кодоны терминации, на концах амплифицируемого генного сегмента. Это введение сайтов рестрикции в 5'- и 3'-концы амплифицированной генной последовательности позволяет продуцировать генные сегменты, которые кодируют белок RAP или его фрагмент, и которые обычно продуцируют для лигирования с другими последовательностями и/или с клонирующими сайтами в векторах. ПЦР и другие методы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны специалистам, и могут быть использованы ими в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования,лишь исходя из описания и инструкций, представленных в настоящей заявке. Известными методами амлификации ДНК или РНК являются, но не ограничиваются ими, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и аналогичные способы амплификации (см. например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159,4965188 (Mullis et al.); 4795699 и 4921794 (Tabor et al.); 5142033 (Innis); 5122464 (Wilson et al.); 5091310(Innis); 5066584 (Gyllensten et al.); 4889818 (Gelfand et al.); 4994370 (Silver et al.); 4766067 (Biswas); 4656134 (Ringold); и Innis et al., eds., PCR Protocols; A Guide to Method and Applications), и РНКопосредованная амплификация, где для целевой последовательности используется антисмысловая РНК в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5130238, Malek et al., с торговым знаком NASBA); и иммуно-ПЦР, где амплификация ДНК используется вместе с мечением антителом(1991); содержание этих патентов во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Аналогичным образом, биологически активные фрагменты белков RAP (например, фрагменты любого из RAP или его изоформ) могут быть получены как описано выше для аналогов белков RAP. Подходящими фрагментами белков RAP являются такие фрагменты, которые сохраняют свойства RAP, и которые могут прямо или непрямо модулировать или опосредовать биологическую активность RIP или других белков, ассоциированных с RIP. В соответствии с этим, могут быть получены фрагменты белкаRAP. которые обладают доминантно-негативным или доминантно-позитивным действием, как описано выше в связи с аналогами RAP. При этом, следует отметить, что эти фрагменты представляют специальный класс аналогов настоящего изобретения, а именно, они определяют части белков RAP, происходящие от полноразмерной последовательности белка RAP (например, от последовательности любого изRAP или его изоформ), где каждая такая часть или фрагмент имеет любую из вышеуказанных желательных активностей. Таким фрагментом может быть, например, пептид. Аналогичным образом, производные могут быть получены посредством стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка RAP, его аналогов или фрагментов, либо путем конъюгирования белка RAP, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, с антителом, ферментом, рецептором, и т.п., как хорошо известно специалистам. В соответствии с этим, термин "производные", используемый в настоящем описании, охватывает те производные, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующих в виде боковых цепей на остатках,либо из N- или С-концевых групп, способом известным специалистам, и которые входят в объем настоящего изобретения. Этими производными могут быть химические молекулы, такие как, углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет ту же самую или повышенную биологическую активность по сравнению с белками RAP. Так, например, такими производными могут быть алифатические сложноэфирные группы, амиды карбоксильных групп, образованные путем реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образованные ацильными группами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами),или O-ацильные производные свободной гидроксильной группы (например, группы серильных или треонильных остатков), образованные ацильными группами. Термин "производные" включает только те производные, которые не содержат аминокислотных замен двадцати природных аминокислот.RAP представляет собой белок или полипептид, то есть, последовательность аминокислотных остатков. В понятие такого полипептида также входит полипептид, состоящий из более крупной последовательности, которая включает полную последовательность белка RAP, определенную в настоящем описании, при условии, что эти добавления не оказывают влияния на основные и новые характеристики белков настоящего изобретения, то есть, при условии, что они либо сохраняют или повышают биологическую активность белка RAP, либо они могут быть отщеплены с образованием белка или полипептида,имеющего биологическую активность, свойственную активности белка RAP. Так, например, в объем на- 14006874 стоящего изобретения могут входить гибридные белки RAP, образованные с другими аминокислотами или пептидами. Новый белок RAP, его аналоги, фрагменты и производные имеют ряд возможных применений, например:(i) Белок RAP, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для модуляции функции RIP в каскаде реакций воспаления, гибели клеток или выживания клеток, описанных выше. Так,например, если RAP может модулировать воздействие RIP на активацию NF-B, JNK (киназу June) или киназу р 38, то такое действие RAP приводит к усилению RAP-RIP-эффекта и в этом случае, его желательно использовать против опухолей, в противо- или провоспалительных реакциях, против ВИЧ, и т.п. В этом случае, белок RAP, его аналоги, фрагменты и производные, которые модулируют воспаление,усиливают цитотоксическое действие, или блокируют эффект выживания клеток, могут быть введены в клетки стандартными способами, известными по существу. Так, например, если белок RAP является полностью внутриклеточным (как предполагается) и должен быть введен только в клетки, где желательно действие FAS-R-лиганда или TNF, или другого цитотоксического белка, опосредуемое RIP, то необходимо использовать систему для специфического введения этого белка в клетки. Одним из путей осуществления этой цели является создание рекомбинантного вируса животного, например, вируса, происходящего от вируса коровьей оспы, в ДНК которого вводят следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками клеточной поверхности, специфически экспрессируемыми клетками, например, такими как, белок gp 120 вируса ВИЧ, специфически связывающийся с некоторыми клетками (CD4-лимфоцитами и родственными клетками лейкоза), или любой другой лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими FAS-R или p55-R, так, чтобы этот рекомбинантный вирусный вектор был способен связываться с указанными FAS-R- или р 55-R-несущими клетками; и ген, кодирующий белок RAP. Таким образом, экспрессия связывающегося с клеточной поверхностью белка на поверхности вируса будет направлена на вирус, специфичный к опухолевой клетке или другой FAS-Rили р 55-R-несущей клетке, после чего последовательность, кодирующая белок RAP, будет введена в клетки посредством этого вируса, и затем экспрессирована в этих клетках, что приведет к усилению RIPопосредованного действия FAS-R-лиганда или TNF или независимого действия RIP. Конструирование такого рекомбинантного вируса животного осуществляют стандартными методами (см., например, Sambrook и др., 1989). Другим возможным способом является введение последовательностей белка RAP (например, любого из RAP или его изоформ) в форме олигонуклеотидов, которые могут быть абсорбированы клетками и экспрессированы в них.(ii) Они могут быть использованы для ингибирования действия FAS-R-лиганда, или TNF, или родственного белка, опосредованного RIP или независимого действия RIP, например, в таких случаях, как повреждение ткани при септическом шоке, реакции "трансплантат против хозяина", или острый гепатит,при которых желательно блокировать внутриклеточную передачу сигнала FAS-R-лигандом или TNFиндуцированным рецептором FAS-R или p55-R, или независимого действия RIP, либо передачу сигнала,опосредованную другим белком; и, в то же самое время, они могут быть использованы для усиления каскада реакций выживания клеток. В этом случае, можно, например, ввести в клетки, стандартными методами, олигонуклеотиды, имеющие антисмысловую кодирующую последовательность для белка RAP,которая должна эффективно блокировать трансляцию мРНК, кодирующей белок RAP, и, тем самым,блокировать его экспрессию и приводить к ингибирова-нию действия FAS-R-лиганда, или TNF, или RIP,или другого белка. Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки методом с использованием вышеуказанного рекомбинантного вируса, второй последовательности, присутствующей в этом вирусе, и являющейся олигонуклеотидной последовательностью. Аналогично указанному выше, в зависимости от природы взаимодействия RAP-RIP, с использованием вышеуказанных способов (i) и (ii) могут быть также усилены или ингибированы клеточные воспалительные реакции и реакции выживания клеток, если это необходимо. Другим возможным способом является использование антител, специфичных для белка RAP, в целях ингибирования его активности во внутриклеточной передаче сигнала. Еще одним способом ингибирования RIP-опосредованного действия или независимого действияRIP является недавно разработанный способ с использованием рибозима. Рибозимы представляют собой каталитические РНК-молекулы, которые специфически расщепляют РНК. Рибозимы могут быть сконструированы для расщепления выбранных целевых РНК, например, мРНК, кодирующих белок RAP настоящего изобретения. Такие рибозимы должны иметь последовательность, специфичную для мРНК белка RAP, и должны быть способны к взаимодействию с нею (комплементарному связыванию) с последующим расщеплением мРНК, что приводит к снижению (или к полной потере) экспрессии белка RAP. причем, уровень снижения экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для введения рибозимов в выбранные клетки (например, в клетки, несущие FAS-R или p55-R), может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмидные векторы, векторы на основе вирусов животных (ретровирусов), которые обычно используются в этих целях (см., также выше п.(i), где этот вирус имеет в качестве второй последовательности кДНК, кодирующую выбранную рибозимную последовательность). (Обзор методов, касающихся рибозимов, см. Chen et al., 1992; ZhaoPick, 1993; Shore et al.,- 15006874 1993; JosephBurke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 иKoizumi et al., 1993). Этот метод применим в том случае, если взаимодействие RAP-RIP усиливает цитотоксичность клеток тогда, когда это необходимо для блокирования этой цитотоксичности, или в том случае, если взаимодействие RAP-RIP ингибирует активацию NF-B также тогда, когда это необходимо для блокирования этого ингибирования в целях повышения указанной активации NF-B, т.е., в обоих случаях, когда необходимо стимулирование выживания клеток, как описано выше в п.(ii).(iii) Белок RAP, а также его аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е., белков, связывающихся с RIP или с функционально родственными рецепторами или белками, участвующими в процессах внутриклеточной передачи сигнала. В этих целях может быть использована вышеупомянутая дрожжевая двухгибридная система, или может быть использована недавно разработанная система с использованием нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим ПЦР-клонированием (Wilks et al., 1989). В этой публикации, Wilks и др. описывают идентификацию и клонирование двух предполагаемых протеинтирозинкиназ посредством нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим клонированием с помощью ПЦР на основе известной последовательности киназного мотива, выявленной киназной последовательности. Этот метод может быть осуществлен в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка RAP для идентификации и клонирования последовательностей родственных(iv) Еще одним вариантом применения белка RAP настоящего изобретения или его аналогов, фрагментов и производных является их использование в методах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, других белков или факторов, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала. В этом варианте применения, белок RAP настоящего изобретения, его аналоги, фрагменты или производные, могут быть отдельно связаны с матрицами, используемыми в аффинной хроматографии, а затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, предположительно, участвуют в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После проведения аффинной хроматографии, другие белки или факторы, которые связываются с белком RAP настоящего изобретения, или с его аналогами, фрагментами или производными, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.(v) Как указано выше, белок RAP настоящего изобретения, или его аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для продуцирова-ния антител, специфичных для этих белков. Эти антитела могут быть также использованы для очистки белка RAP(например, RAP или любой из его изоформ) либо из клеточных экстрактов, либо из трансформированных клеточных линий, продуцирующих белок RAP, или его аналоги, или фрагменты. Кроме того, эти антитела могут быть использованы в целях диагностики для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием системы RIP-опосредованного FAS-R-лиганда или TNF, или с независимойRIP-активностью, например, с клеточными эффектами, индуцированными сверхактивным или недостаточно активным FAS-R-лигандом или TNF и опосредованными RIP, или со специфическим воздействием на клетки самого RIP. Таким образом, если такие эффекты связаны с недостаточно функционирующей системой внутриклеточной передачи сигнала, включающей белок RIP, или различные вышеупомянутыеRIP-связывающие белки или сам белок RAP, то такие антитела должны служить в качестве важного диагностического инструмента. Следует также отметить, что выделение, идентификация и характеризация белка RAP настоящего изобретения могут быть осуществлены любыми хорошо известными стандартными методами скрининга. Так, например, один из этих методов скрининга, то есть, метод с использованием дрожжевого двойного гибрида, описанный ниже, был использован для идентификации белка RAP (см. Stanger et al., 1995),а затем других различных белков RAP настоящего изобретения (помимо различных других новых вышеуказанных и нижеуказанных белков, описанных в совместных одновременно рассматриваемых заявках). Аналогичным образом, как указывается выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации белка RAP настоящего изобретения, или для выделения, идентификации и характеризации дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.д., способных связываться с белком RAP настоящего изобретения могут быть использованы другие способы, такие как, аффинная хроматография, метод гибридизация ДНК, и т.п. хорошо известные специалистам. Как указывалось выше, белок RAP может быть использован для генерирования антител, специфичных к белкам RAP, например, к RAP и его изоформам. Эти антитела или их фрагменты могут быть использованы способом, подробно описанным ниже, где будет очевидно, что в этих применениях, антителами или их фрагментами являются антитела, специфичные для белков RAP. В соответствии с настоящим изобретением, исходя из того факта, что RAP специфически связывается с RIP, и, как таковой, является медиатором/модулятором RIP, а поэтому, может опосредовать/модулировать RIP-активность в каскадах реакций воспаления, гибели или выживания клеток, таким образом, что RIP функционирует независимо или в сочетании с другими белками (например, с FAS-R,p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1 и TRADD в каскадах реакций гибели клеток, или с Traf2 в каскадах- 16006874 реакций выживания клеток), важное значение имеет получение лекарственных средств, которые могут усиливать или ингибировать взаимодействия RAP-RIP, если это необходимо, и в зависимости от того,какие из этих каскадов реакций усиливаются/ингибируются взаимодействием RAP-RIP. Имеется много заболеваний, при которых использование таких лекарственных средств может оказать значительное благотворное воздействие. Такими заболеваниями, среди прочих, являются острый гепатит, при котором острое поражение печени является, очевидно, следствием опосредованной FAS-R-лигандом гибели клеток печени, аутоиммунно-индуцированной гибели клеток, такой как, гибель -клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, которая приводит к диабету; гибель клеток при отторжении трансплантата(например, почки, сердца и печени), гибель олигодендроцитов в головном мозге при рассеянном склерозе, и ВИЧ-ингибированное "самоубийство" Т-клеток, которое вызывает пролиферацию вируса ВИЧ, и тем самым вызывает СПИД. Возможно, что RAP или один или несколько его возможных изоформ могут служить "природными" ингибиторами RIP в одном или нескольких вышеуказанных каскадов реакций, а поэтому они могут быть использованы в качестве вышеуказанных специфических ингибиторов RIP. Аналогичным образом, другие вещества, такие как пептиды, органические соединения, антитела, и т.д., могут быть также скринированы с получением специфических лекарственных средств, которые способны ингибировать взаимодействие RAP-RIP. Неограничивающий пример способа конструирования и скрининга пептидных ингибиторов взаимодействия RAP-RIP основан на предварительном изучении пептидных ингибиторов ICE или ICEподобных протеаз, субстратной специфичности ICE, и стратегий анализа эпитопов с использованием пептидного синтеза. Было обнаружено, что наименьшим требованием для обеспечения расщепления пептида посредством ICE является включение четырех аминокислот слева от сайта расщепления со значительным предпочтением для аспарагиновой кислоты в положении P1 и метиламина, который достаточно включить справа от положения P1 (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Кроме того, обнаружено, что флуорогенный субстратный пептид (тетрапептид), ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4 метилкумарил-7-амид), сокращенно обозначаемый Ac-DEVD-AMC, соответствующий последовательности поли-(АОР-рибоза)-полимеразы (PARP), расщеплялся в клетках сразу после стимуляции FAS-R, а также других процессов апоптоза (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994), и эффективно расщеплялся СРР 32 (членом семейства СЕD3/IСЕ-протеазы) и МАСН-протеазами (и также возможно аналогично расщеплялся под действием Gl-протеаз - см. например, совместную одновременно рассматриваемую заявку IL 120367). Поскольку, очевидно, Asp в положении P1 субстрата является важным элементом, то тетрапептиды,имеющие Asp в качестве четвертого аминокислотного остатка и различные комбинации аминокислот в положениях первых трех остатков, могут быть проанализированы на их связывание с активным центром протеаз, с использованием, например, метода, разработанного Geysen (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987),где большое число пептидов на твердых носителях было оценено на их специфическое связывание с антителами. Связывание МАСН-протеаз со специфическими пептидами может быть детектировано рядом методов детекции, хорошо известных специалистам, таких как, радиоактивное мечение Gl-протеаз, и т.п. Было показано, что этот метод Geysen позволяет тестировать за каждый рабочий день по крайней мере 4000 пептидов. Аналогичным образом может быть выявлена точная область связывания или область гомологии,которая определяет взаимодействие между RAP и RIP, а затем могут быть скринированы пептиды, которые могут служить для блокирования этого взаимодействия, например синтезированные пептиды,имеющие последовательность, аналогичную последовательности области связывания или комплементарную ей последовательность, которая может конкурировать природным RAP за связывание с RIP. Лекарственные или пептидные ингибиторы, которые способны ингибировать RAP-активность в воспалении или клеточной гибели путем ингибирования взаимодействия RAP с RIP, могут быть конъюгированы или объединены в комплекс с молекулами, которые облегчают доступ в клетки. В патенте США 5149782 описано конъюгирование молекулы, транспортированной через клеточную мембрану посредством агента смешивания с мембраной, такого как фузогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды, и жирные кислоты с длинной цепью, например, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Эти мембраносвязывающие агенты вводят молекулярные конъюгаты в липидный бислой клеточных мембран и облегчают их доступ в цитоплазму. В патенте США 5108921 (Low et al.) дан обзор подходящих методов трансмембранной доставки молекул, которыми являются, но не ограничиваются ими, белки и нуклеиновые кислоты, благодаря механизму рецептор-опосредованной эндоцитотической активности. Этими системами рецепторов являются такие системы, которые распознают галактозу, маннозу, маннозо-6-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин B12), -2-макроглобулин, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF). Low и др. указывают, что рецепторы витаминов,такие как рецепторы биотина и фолата, могут быть предпочтительно использованы для усиления транс- 17006874 порта через клеточную мембрану благодаря локализации и множественности рецепторов биотина и фолата на поверхности мембраны большинства клеток, и ассоциированных с ними процессов рецепторопосредованного трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованный между соединением, доставляемым в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактирует с клеточной мембраной, несущей рецепторы биотина или фолата, и инициирует механизм рецептор-опосредованного трансмембранного транспорта, что позволяет нужному соединению проникнуть в клетку. Кроме того, специалистам известно, что присоединение нужной пептидной последовательности к лидерной/сигнальной пептидной последовательности для создания "химерного" пептида будет обеспечивать транспорт этого "химерного" пептида через клеточную мембрану в цитоплазму. Как известно специалистам в области пептидов, термин "пептидные ингибиторы взаимодействияRAP-RIP настоящего изобретения" включает в себя псевдопептидные лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть также легко скринированы на связывание с RAP/RIP-протеазой для получения, вероятно, более стабильных ингибиторов. Следует также отметить, что те же самые методы для облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, обсуждаемые выше, могут быть также применены и к самому RAP или его изоформам, а также к другим пептидам и белкам, которые обладают аналогичным внутриклеточным действием. Что касается антител, упомянутых выше, термин "антитело" означает поликлональные антитела,моноклональные антитела (MAT), химерные антитела, антиидиотипические (анти-Id) антитела против антител, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, продуцируемые известными методами, такими как, но не ограничиваясь ими, ферментативное расщепление,пептидный синтез или рекомбинантная техника. Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит, в основном,гомогенную популяцию антител, специфичных к антигену, при этом указанная популяция содержит, в основном, сходные сайты связывания эпитопа. MAT могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, KohlerMilstein, Nature, 256:495-497 (1975); патент США 4376110;Interscience, N.Y. (1992-1996), содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Такими антителами может быть любой класс иммуноглобулинов, включая IgG,IgM, IgE, IgA, GILD и их любой подкласс. Гибридома, продуцирующая MAT настоящего изобретения,может быть культивирована in vitro, in situ, или in vivo. Продуцирование высоких титров этого MAT invivo или in situ делает этот метод продуцирования предпочтительным. Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят от различных видов животных, такие как молекулы, имеющие вариабельную область, происходящую от мышиного MAT, и константную область, происходящую от иммуноглобулина человека. Химерные антитела используются, главным образом, для снижения иммунногенности при их применении и для увеличения выхода при продуцировании; так, например, в том случае, когда мышиные MAT имеют более высокие выходы из гибридом, но более высокую иммуногенность для человека, используются такие антитела,как человеческие/мышиные химерные МАТ. Химерные антитела и методы их продуцирования известны специалистам (Cabilly et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 81:3273-3277 (1984), Morrison et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature, 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125023 (опубликованная 14 ноября 1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270(1985); Taniguchi et al., Европейская патентная заявка 171496 (опубликованная 19 февраля 1985); Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494 (опубликованная 5 марта 1986); Neuberger et al., заявкаPCT WO 8601533 (опубликованная 13 марта 1986); Kudo et al., Европейская патентная заявка 184187(опубликованная 11 июня 1986); Sahagan et al., J. Immunol., 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., Международная патентная заявкаWO 8702671 (опубликованная 7 мая, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); и HarlowLane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, см. выше. Эти работы вводятся в настоящее описание в качестве ссылки. Антиидиотипическое антитело (анти-Id) представляет собой антитело, которое узнает уникальные детерминанты, в основном, ассоциированные с антигенсвязывающим центром антитела. Id-антитело может быть получено путем иммунизации животных того же самого вида и генетического типа (например,мышиного штамма) как источника MAT, против которого получено анти-Id. Иммунизованное животное будет распознавать и давать ответную реакцию на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антитела против указанных идиотипических детерминант (антитело против Id). См. например, патент США 4699880, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание в качестве ссылки. Анти-Id антитело может быть также использовано в качестве "иммуногена" для индуцирования иммунного ответа еще у другого животного, с получением так называемого анти-анти-Id антитела. Это- 18006874 анти-анти-Id антитело, по своим эпитопам, может быть идентичным исходному MAT, которое индуцирует анти-Id антитело. Таким образом, с использованием антител против идиотипических детерминантMAT можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью. В соответствии с этим, MAT, генерированные против белков RAP, их аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения, могут быть использованы для индуцирования анти-Id антител у подходящих животных, таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки от таких иммунизованных мышей используют для продуцирования анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id МАТ. Кроме того, анти-IdMAT могут быть связаны с носителем, таким как, гемоцианин лимфы улитки (KLH), и использованы для иммунизации других мышей BALB/c. Сыворотка от указанных мышей будет содержать анти-анти-Id антитела, которые имеют связывающие свойства исходного MAT, специфического для эпитопа вышеуказанного белка RAP, или их аналогов, фрагментов и производных. Таким образом, анти-Id MAT имеют свои собственные идиотипические эпитопы, или "идиотопы",структурно сходные с оцениваемым эпитопом, таким как белок-а GRB. Термин "антитело", кроме того, относится к обеим интактным молекулам, а также к их фрагментам,таким как, например, Fab и (Fab')2, которые обладают способностью связываться с антигеном. Fab и(Fab')2-фрагменты не содержат Fc-фрагмента интактного антитела, быстро выводятся из кровотока, и могут обладать более тканеспецифическим связыванием, чем интактное антитело (Wahl et al., J. Nucl.Med. 24:316-325 (1983. Отсюда ясно, что Fab и (Fab')2 и другие фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для детекции и количественной оценки белка RAP в соответствии с методами, описанными в настоящей заявке для молекул интактного антитела. Такими фрагментами обычно являются фрагменты, продуцированные путем протеолитического расщепления, с использованием ферментов, таких как папаин (для продуцирования Fab-фрагментов) или пепсин (для продуцирования(Fab')2-фрагментов). Считается, что антитело "способно связываться" с молекулой в том случае, если оно способно специфически реагировать с этой молекулой с последующим связыванием этой молекулы с антителом. Термин "эпитоп" означает часть любой молекулы, способную связываться с антителом, которая также может распознаваться указанным антителом. Эпитопы "антигенных детерминант" обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как, боковые цепи аминокислот и сахаров, и имеют специфическую трехмерную структуру, а также конкретный заряд. Термин "антиген" означает молекулу или часть молекулы, которая способна связываться с антителом, и которая, кроме того, способна индуцировать вырабатывание у этого животного антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов. Специфическая реакция, упомянутая выше, означает, что антиген будет реагировать с высокой степенью селективности с соответствующим ему антителом, а не с множеством других антител, которые могут быть продуцированы другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для количественного или качественного обнаружения белка RAP в образце или для обнаружения присутствия клеток, которые экспрессируют белок RAP настоящего изобретения. Это может быть осуществлено иммуно-флуоресцентными методами с применением флуоресцентно меченного антитела (см. ниже) в сочетании с детекцией, проводимой методами оптической микроскопии, проточной цитометрии или флюрометрии. Антитела (или их фрагменты), используемые в настоящем изобретении, могут быть использованы в гистологическом анализе, проводимом методами иммунофлуоресцентной или иммуно-электронной микроскопии для in situ-детекции белка RAP настоящего изобретения. Детекция in situ может быть осуществлена путем взятия гистологического образца у пациента, и получения меченого антитела настоящего изобретения против такого образца. Антитело (или фрагмент) предпочтительно получают путем внесения меченого антитела (или фрагмента) в биологический образец или путем нанесения этого антитела на биологический образец. Этим способом можно определить не только присутствие белка RAP, но также и его распределение на исследуемой ткани. С использованием настоящего изобретения, для каждого специалиста очевидно, что для достижения такой in situ-детекции может быть модифицирован весь широкий спектр гистологических методов (таких как, методы окрашивания). Такие анализы для белка RAP настоящего изобретения обычно предусматривают инкубирование биологического образца, такого как, биологическая жидкость, экстракт из ткани, свежесобранные клетки, такие как, лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в культуре ткани в присутствии детектируемого меченого антитела, способного идентифицировать белок RAP; и детекцию антитела любым из ряда методов, хорошо известных специалистам. Биологический образец может быть нанесен на твердофазную подложку или носитель, такой как,нитроцеллюлоза, или другую твердую подложку или носитель, который способен иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой детектируемым меченым антителом в соответствии- 19006874 с настоящим изобретением, как указано выше. Эта твердофазная положка или носитель затем могут быть второй раз промыты буфером для удаления несвязанного антитела. Затем количество связанной метки на указанной твердой подложке или носителе могут быть детектированы стандартными методами. Термин "твердофазная подложка", "твердофазный носитель", "твердая подложка", "твердый носитель", "подложка" или "носитель" означает любую подложку или носитель, способные к связыванию с антигеном или антителами. Широко известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, амилазы на найлоне, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габброс и магнетит. В целях настоящего изобретения, носитель, по своей природе, может быть либо до некоторой степени растворимым, либо нерастворимым. Подложка может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что объединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, в виде гранулы, цилиндрической, в виде внутренней поверхности тестпробирки, или внешней поверхности стержня. Альтернативно, эта поверхность может быть плоской, такой как, лист, бумажная тест-полоска, и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистироловые гранулы. Специалистам в этой области могут быть известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, либо они могут сами выявить нужные носители путем рутинного экспериментирования. Активность связывания данного количества антитела настоящего изобретения, указанного выше,может быть определена хорошо известными методами. Каждый специалист может самостоятельно определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого теста путем рутинного экспериментирования. Помимо этих анализов могут быть проведены другие стадии, такие как, промывка, перемешивание,встряхивание, фильтрование, и т.п., как временные или необходимые стадии для данного и конкретного случая. Одним из способов, которым антитело настоящего изобретения может быть детектируемо помечено, является связывание этого антитела с ферментом и использование его в иммуноферментном анализе(ИФА). Этот фермент при его последующей обработке соответствующим субстратом, будет, в свою очередь, реагировать с субстратом так, что в результате этого будет продуцироваться химическая молекула,которая может быть детектирована, например, спектрофотометрическим методом, флюрометрическим методом, или путем визуализации. Ферментами, которые могут быть использованы для детектируемого мочения антитела, являются, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза,дельта-5-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа,триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, бетагалактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Эта детекция может быть осуществлена колориметрическими методами, в которых используется хромогенный субстрат для фермента. Детекция может быть также осуществлена путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогично полученными стандартами. Детекция может быть осуществлена с использованием любых других иммуноанализов. Например,путем радиоактивного мечения антител или фрагментов антител, можно детектировать R-РТРазу с использованием радиоиммуноанализа (РИА). Полное описание РИА можно найти в работе LaboratoryTechniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company,NY (1978) с конкретной ссылкой на главу, озаглавленную "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard, Т., которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Радиоактивный изотоп может быть детектирован методами с использованием g-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или с помощью авторадиографии. Антитело настоящего изобретения может быть также помечено флуоресцентным соединением. При экспонировании флуоресцентно меченного антитела светом с соответствующей длиной волны, его присутствие может быть затем обнаружено благодаря флуоресценции. Из большого ряда соединений, обычно используемых для флуоресцентного мечения, могут быть упомянуты флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуоресцамин. Указанное антитело может быть также детектируемо помечено с использованием флуоресцентных металлов, таких как 152 Е или других металлов ряда лантаноидов. Эти металлы могут быть связаны с антителом с использованием групп, образующих хелатные комплексы с металлами, таких как диэтилэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Это антитело может быть также детектируемо помечено путем его связывания с хемилюминесцентным соединением. Присутствие антитела, помеченного хемилюминесцентной меткой, затем определяют путем обнаружения присутствия люминесценции, которая продуцируется в процессе химической реакции. Примерами особенно подходящих хемилюминесцентных соединений-меток являются люминол, изолюминол, терароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.- 20006874 Аналогичным образом, для мечения антитела настоящего изобретения может быть использовано биолюминесцентное соединение. Биолюминсценция представляет собой тип люминесценции, обнаруживаемой в биологических системах, в которых каталитический белок способствует увеличению эффективности хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем обнаружения присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями, которые могут быть использованы для мечения, являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекула антитела настоящего изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, а также в "двухслойном" или "сэндвич"-анализе. В типичном иммунометрическом анализе, определенное количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывается с твердой подложкой или с твердым носителем, после чего добавляют определенное количество детектируемо меченного растворимого антитела для обнаружения и/или количественной оценки третичного комплекса, образуемого между антителом, связанным с твердой фазой, антигеном и меченым антителом. Обычно и предпочтительно, иммунометрический анализ представляет собой "прямой" анализ, в котором антитело, связанное с твердой фазой, сначала подвергают контакту с тестируемым образцом для экстракции антигена из образца путем образования двойного комплекса "антитело-антиген". После соответствующего периода инкубации, твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если он присутствует, а затем подвергают контакту с раствором, содержащим неизвестное количество меченного антитела (которое функционирует как "молекула-репортер"). После второго периода инкубирования, меченное антитело связывается с комплексом, образованным антигеном, связанным с твердой подложкой или твердым носителем,посредством немеченного антитела, а затем твердую подложку или твердый носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченного антитела. Другой тип "сэндвич"-анализа, который также может быть использован с антигенами настоящего изобретения, представляет собой так называемый "одновременный" или "обратный" анализ. Одновременный анализ предусматривает одну стадию инкубирования, поскольку антитело, связанное с твердой подложкой или твердым носителем меченное антитело добавляют к тестируемому образцу одновременно. После завершения инкубирования твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкого образца и меченного антитела, которое не образовало комплекс. Затем присутствие меченного антитела, ассоциированного с твердой подложной или твердым носителем, определяют таким же образом, как это делают в стандартном "прямом" сэндвич-анализе. В "обратном анализе", используется постадийное добавление сначала раствора меченого антитела в жидкий образец, а затем помеченного антитела, связанного с твердой подложкой или твердым носителем после соответствующего периода инкубирования. После второго инкубирования твердую фазу промывают стандартным способом для удаления остатка тестируемого образца и раствора непрореагировавшего меченного антитела. Затем присутствие меченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или твердым носителем, определяют таким же образом, как это делают в "одновременном" и "прямом" анализах. Белок RAP настоящего изобретения может быть получен стандартным методом рекомбинантных ДНК (см., например, Sambrook et al., 1989, и Ansabel et al., 1987-1995, см. выше), в котором подходящие эукариотические или прокариотические клетки, хорошо известные специалистам, трансформируют соответствующими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие белки. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к указанным экспрессирующим векторам и трансформированным хозяевам, используемым для продуцирования белков настоящего изобретения. Как упоминалось выше, этими белками также являются их биологически активные аналоги, фрагменты и производные, а поэтому векторами, кодирующими эти белки, также являются векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, а трансформированными хозяевами являются хозяева, продуцирующие такие аналоги и фрагменты. Производными этих белков, продуцированных трансформированными хозяевами, являются производные, полученные посредством стандартной модификации белков, или их аналогов, или фрагментов. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки RAP, причем этот вектор также кодирует белок вирусной поверхности, способный связываться со специфическими белками поверхности клеток-мишеней (например, раковых клеток), что обеспечивает прямую инсерцию последовательностей белка RAP в клетки. Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения в качестве активного ингредиента включают: (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность белка RAP, или (b) лекарственные средства, которые блокируют RAP-RIPвзаимодействие. Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают достаточное количество активного ингредиента, необходимого для достижения поставленной цели. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие наполнители или добавки, которые облегчают введение активных соединений в препараты, которые могут- 21006874 быть использованы фармацевтически, и которые могут стабилизировать такие препараты для введения нуждающемуся в этом индивидууму, как хорошо известно каждому специалисту. Белок RAP и его изоформы или изотипы предположительно экспрессируются в различных тканях на заметно различных уровнях, и очевидно также, что наряду с ними аналогичным образом экспрессируются различные виды изотипов других белков, участвующих в каскадах реакций внутриклеточной передачи сигнала, как это было показано в цитированных выше совместных и одновременно рассматриваемых патентных заявках. Эти различия можно, вероятно, отнести за счет тканеспецифического характера ответа на действие Fas/APOI-лиганда и TNF. Как и в случае других СЕD3/IСЕ-гомологов (Wang etal., 1994; Alnemri et al., 1995), авторами настоящего изобретения было ранее показано (в вышеупомянутых заявках), что изоформы МАСН, которые содержат неполные СЕD3/IСЕ-области (например,МАСН 3), обладают ингибирующим действием на активность ко-экспрессированных молекул MACH1 или МАСН 2; при этом было также обнаружено, что индуцирование гибели клеток блокируетсяFas/APO1 и p55-R. Экспрессия таких ингибиторных изоформ в клетках может представлять собой механизм самозащиты клеток от Fas/APO1- и TNF-опосредованной цитотоксичности. Подозревается, что аналогичное ингибирующее действие имеют по крайней мере некоторые G1-изоформы (G1 представляет собой недавно выделенный новый белок, связывающийся с Mch4 и возможно с МАСН, а также белок,связывающийся с MORT-1, который имеет MORT-модули и протеазный домен - см. совместную и одновременно рассматриваемую заявку IL 120367). Широкая гетерогенность изоформ МАСН, и таким образом, предполагаемая аналогичная гетерогенность изоформ G1, которые в значительной степени преобладают над наблюдаемыми любыми другими протеазами семейства CED3/ICE, должна обеспечивать особенно точную регуляцию функций активных изоформ МАСН, и аналогично активных изоформ G1. Следовательно, как указывается выше, белки RAP или их возможные изоформы могут обладать различным действием в различных тканях с точки зрения их взаимодействия с RIP и, тем самым, различным влиянием на равновесие между активацией каскадов реакций гибели клеток и выживания клеток, как описано выше. Вероятно также, что некоторые возможные изоформы RAP имеют другие функции. Например, RAP или некоторые изоформы RAP могут также действовать как "заякоривающие" сайты для молекул, которые участвуют в других не-цитотоксических эффектах Fas/APO1- и TNF-рецепторов посредством взаимодействия с RIP или даже независимо от RIP. Вследствие уникальной способности Fas/APO1- и TNF-рецепторов вызывать воспаление, гибель клеток, а также вследствие способности TNF-рецепторов стимулировать другие активности, способствующие разрушению ткани, отклонения в функции этих рецепторов должны оказывать особенно неблагоприятное воздействие на организм. Действительно, было показано, что как избыточная, так и недостаточная функция этих рецепторов приводят к патологическим проявлениям различных заболеваний (Vassalli, 1992; NagataGolstein, 1995). Идентификация молекул, которые обеспечивают активность рецепторов в передаче сигнала, и поиск путей модуляции активности этих молекул должны привести к прямому получению новых терапевтических методов. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих примеров. Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих неограничивающих примерах,сопровождаемых чертежами. При этом следует отметить, что такие процедуры, как (i) двухгибридный скрининг и двухгибридный тест на экспрессию -галоктозидазы; (ii) индуцированная экспрессия, метаболическое мечение, и иммунопреципитация белков; (iii) in vitro-связывание; (iv) анализ на цитотоксичность; и (v) нозернанализ и анализ последовательности (см., также Boldin et al., 1995b) 2, 3 (см. также Boldin et al., 1996) и 4,см. ниже, относящиеся к MORT-1 и MORT-1- связывающему белку (например, МАСН), а также к только что выделенному белку G1 (см. II 120367), могут быть в равной степени применены (с некоторыми модификациями) для соответствующего выделения, клонирования и характеризации RAP настоящего изобретения и его возможных изоформ. Таким образом, эти процедуры рассматриваются как полное описание тех же самых процедур, используемых для выделения, клонирования и характеризации RAP настоящего изобретения, и подробно описанных, например, в той же самой или эквивалентной форме в совместных и одновременно рассматриваемых заявках на патент Израиля 114615, 114986, 115319, 116588,117932 и 120367, а также в соответствующей заявке РСТPCT/US96/10521. Кроме того, что касается белка NIK и его роли в активации NF-B, а следовательно и в выживании клеток и роли, которую играетTraf2 в этом каскаде реакций выживания клеток, например, во взаимодействии между Traf2 и RIP и других белков, то они были подробно описаны авторами настоящего изобретения в совместных и одновременно рассматриваемых заявках IL117800, 119133 и Malinin et al., 1997. Пример. Клонирование и выделение белка RAP, который связывается с белком RIP.(i) Секвенирование путем двухгибридного скрининга и предварительный анализ. Методом двухгибридного скрининга (см., например. FieldsSong, 1989, WO/96/18641) с использованием RIP, у которого отсутствовал домен гибели, в качестве затравки в В-клеточной библиотеке, был выделен и секвенирован клон длиной около 1.9 т.п.о.- 22006874 Были сконструированы и получены праймеры от 5'-конца этой последовательности. С использованием ПЦР были скринированы несколько библиотек кДНК. Из библиотеки кДНК толстой кишки и библиотеки кДНК сердца был получен клон длиной около 0,3 т.п.о., и этот клон были лигирован с клоном длиной около 1,9 т.п.о., полученным из В-клеточной библиотеки. Был секвенирован новый клон длиной около 2,2 т.п.о. (см., фиг. 1) и была определена его выведенная аминокислотная последовательность (фиг. 2). Анализ этой последовательности показал, что белок RAP, очевидно, не имеет ни "домена гибели",ни модуля MORT, ни протеазного домена, аналогично семейству ICE, ни киназного домена, ни доменовTRAF (см. вышеуказанные совместные и одновременно рассматриваемые патентные заявки и различные ссылки, а в частности, Malinin et al., 1997, касающиеся всех различных доменов, участвующих в каскадах реакций внутриклеточной передачи сигнала, ). Исследования связывания выявили, что RAP связывается,главным образом, только с RIP, и не способен связываться с TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R и МАСН. Поэтому очевидно, что RAP представляет собой специфический RIP-связывающий белок, который в высокой степени специфически взаимодействует/связывается с RIP, возможно посредством связывающей области домена, которая не присутствует в других белках, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, и выделенных до настоящего времени. Исходя из этого очевидно, что RAP является модулятором/медиатором внутриклеточной активности RIP, играющей важную роль в RIPмодуляции/опосредовании каскадов реакций воспаления и гибели клеток/выживания клеток. Короче говоря, клон белка RAP получали методом двухгибридного скрининга двухгибридной библиотеки кДНК лимфоцитов периферической крови человека с использованием в качестве затравки фрагмента белка RIP, у которого отсутствовал "домен гибели". Последовательность RIP была взята из предыдущих публикаций (например, Stanger et al., 1995), и, кроме того, она имеется в банке данных GenBank под номером доступаU25994, и представляет собой последовательность RIP человека (имеется также мышиная последовательность RIP под номером доступаU25995). С использованием данных об этой последовательности были сконструированы соответствующие ПЦР-праймеры с помощью программного обеспечения OLIGO4, и был получен фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей части RIP, но без его С-концевого участка "домена гибели", посредством ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, происходящей от библиотеки полной РНК фибробластов человека (стандартными методами). Эта кодирующая часть RIP, в которой отсутствовала область "домена гибели" RIP, была затем клонирована в вектор pGBT-9 (Clontech) и использована в качестве затравки, как указывалось выше, в процедуре двухгибридного скрининга. Посредством этого двухгибридного скрининга был получен ряд клонов, все из которых кодировали белки, являющиеся RIP-связывающими белками, взаимодействующими с RIP в той области RIP, которая находится за пределами "домена гибели" (С-концевая область RIP), не присутствующего в RIР-"затравке". В соответствии с последующими процедурами, описанными выше, был получен клон кДНК, последовательность которого показана на фиг. 1. Анализ вышеуказанных последовательностей клона RAP и последовательностей в базах данных человеческого генома уровня 1 "dbest" (Human Genome Database) и базах данных Genebank показали, что последовательность RAP является уникальной (новой) последовательностью, поскольку известные последовательности не обнаруживали какой-либо заметной гомологии с этой последовательностью RAP. Для того, чтобы определить, может ли RAP связываться с любым другим из известных белков, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, были проведены аналитические тесты на связывание. В этих тестах белки TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH были проанализированы на их способность связываться с RAP. Однако было обнаружено, что RAP не способен связываться ни с одним из этих белков. RAP также не связывается ни с одним из нерелевантных контрольных белков, например ламином,циклином D. Следовательно, все вышеуказанные результаты показали, что новый белок RAP может в высокой степени специфически взаимодействовать с RIP, и этот белок, как таковой, представляет собой специфический модулятор/медиатор RIP. Конкретный участок взаимодействия между RAP и RIP еще необходимо определить, но предполагается, что этот участок является специфичным для RIP и RAP, и известно,что он не является общим с участками других белков, взаимодействующих с RIP, например MORT-1,TRADD, FAS-R и возможно также и Traf2 (см. Malinin et al., 1977). Из этого также следует (исходя из анализа последовательности и сравнения с последовательностями в различных базах данных, указанных выше), что RAP не имеет ни "домена гибели", ни модуля MORT, ни протеазного домена (например, мотива ICE/CED3), ни киназного домена/мотива, и ни домена TRAF. В соответствии с этим, предварительный анализ на биологическую активность также выявил, что RAP очевидно имеет следующие свойства:(i) RAP сам по себе не является токсичным для клеток в случае его сверхэкспрессии;(ii) RAP не защищает клетки от TNF-уничтожения, и таким образом, очевидно, что он не является ингибитором TNF-индуцированной клеточной цитотоксичности;(iii) RAP сам по себе не индуцирует NF-B;(v) как было обнаружено, RAP также блокирует индуцирование JNK (киназы Jun), вызываемое RIP.- 23006874 Следовательно, в соответствии с вышеуказанным, очевидно, что RAP является в высокой степени специфическим RIP-связывающим белком, а поэтому он является модулятором/медиатором RIP, и вероятно, участвует в RIP-опосредованных процессах внутриклеточной передачи сигнала. В свете вышеописанного очевидно, что RAP участвует в модуляции/опосредовании внутриклеточных активностей RIP, где этими активностями являются его участие в каскаде реакций воспаления и гибели клеток (независимо, посредством его "домена гибели" или посредством взаимодействия с другими белками, такими как, MORT-1, TRADD, p55-R, FAS-R, и ассоциированными с ними протеазами, такими как, MACH, Mch4, G1 и т.п.) и участия RIP в каскаде реакций выживания клеток (активация NF-B, возможно посредством взаимодействия с Traf2). Возможные механизмы, в соответствии с которыми RAP может модулировать/опосредовать активность RIP, подробно описаны выше; так, например, RAP-RIPвзаимодействие может приводить к усилению либо реакций гибели клеток, либо реакций выживания клеток, или оно может приводить к ингибированию либо реакций гибели клеток, либо реакций выживания клеток, и это усиление или ингибирование, возможно, зависит от относительной активности участников этих двух противоположных внутриклеточных процессов. RAP может также действовать как заякоривающий белок, способствующий агрегации ряда молекул RIP и других RIP- или RAP-связывающих белков, агрегаты которых могут затем функционировать в направлении гибели клеток или выживания клеток (или даже того и другого) в зависимости от относительных активностей/количеств других участников этих каскадов реакций, происходящих в клетке. В соответствии с вышеприведенным полным описанием настоящего изобретения следует отметить,что каждому специалисту очевидно, что оно может быть осуществлено с использованием широкого ряда эквивалентных параметров, концентраций и условий, не выходящих за рамки существа и объема изобретения, и без излишнего экспериментирования. Хотя настоящее изобретение описано на конкретных вариантах его осуществления, однако, в него могут быть внесены дополнительные модификации. Применение настоящего изобретения включает в себя любые его варианты, способы или адаптации, соответствующие в общих чертах идее изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания в том виде, как они следуют из известной или обычной практики, к которой имеет отношение настоящее изобретение, и как они могут быть применены к основным отличительным признакам, описанным выше и сформулированным в нижеследующей формуле изобретения. Все работы, цитированные в настоящем описании, включая журнальные статьи и рефераты, опубликованные или соответствующие патентные заявки США, или иностранные патентные заявки, выданные патенты США или иностранные патенты, или любые другие работы, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки, включая все данные, таблицы, рисунки и текст, представленные в цитируемых работах. Кроме того, полное содержание работ, цитируемых в настоящей заявке, также во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Ссылки на стадии известных методов, стадии стандартных методов, на известные методы или стандартные методы никоим образом не должны означать, что какой-либо аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения раскрывается, описывается или предполагается в этих работах. Вышеприведенное описание конкретных вариантов осуществления изобретения настолько полно раскрывает общую идею настоящего изобретения, что другие специалисты, используя данные, известные в этой области (включая содержание цитированной литературы), могут легко модифицировать и/или адаптировать эти конкретные варианты изобретения для различных целей без излишнего экспериментирования, не выходя, однако, за рамки общей концепции настоящего изобретения. Поэтому такие адаптации и модификации, исходя из их описаний и пояснений, представленных в настоящей заявке, также входят в существо и объем настоящего изобретения как эквиваленты описанных вариантов осуществления изобретения. Следует отметить, что фразеология и терминология приводится в настоящей заявке лишь в описательных целях и должна рассматриваться специалистами не как ограничение, а лишь как описание и объяснение в комбинации со знаниями, которым владеет каждый специалист. Источники: ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Последовательность ДНК, способная гибридизоваться с последовательностью ДНК, приведенной на фиг. 1, в умеренножестких условиях и кодирующая полипептид, обладающий активностью RAP [белка, ассоциированного с RIP (взаимодействующим с рецептором белком)], причем указанный полипептид обладает следующими свойствами:(а) сам по себе не токсичен по отношению к клеткам при сверхэкспрессии;(б) не защищает клетки от уничтожения TNF (фактором некроза опухоли) и, таким образом, не является ингибитором TNF-индуцируемой цитотоксичности;