Антитела против vla-1
Номер патента: 6705
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Гарбер Эллен А., Карпусас Майкл, Салдана Хосе В., Лайн Пол Д.
Формула / Реферат
1. Антитело против VLA-1, в котором определяющие комплементарность области тяжелой цепи определяются аминокислотными остатками 31-35, 50-65 и 98-107 последовательности SEQ ID NO: 2 (нумерация по Кабату).
2. Антитело по п.1, которое включает по крайней мере один из следующих остатков в своей тяжелой цепи: V12, F29, A49, T93 и R94.
3. Антитело против VLA-1, в котором определяющие комплементарность области легкой цепи определяются аминокислотными остатками 24-33, 49-55 и 88-96 последовательности SEQ ID NO:1 (нумерация по Кабату).
4. Антитело по п.3, которое включает по крайней мере один из следующих остатков в своей легкой цепи: Q1, L4 и Y71.
5. Антитело против VLA-1, в котором определяющие комплементарность области легкой цепи определяются аминокислотными остатками 24-33, 49-55 и 88-96 последовательности SEQ ID NO:1 и в котором определяющие комплементарность области тяжелой цепи определяются аминокислотными остатками 31-35, 50-65 и 98-107 последовательности SEQ ID NO:2.
6. Антитело по п.5, где указанное антитело содержит:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:1 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:2 или
(b) такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепи, как и антитело, продуцированное гибридомой mAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3273).
7. Антитело по п.5, где указанным антителом является гуманизированное антитело.
8. Антитело по п.7, где указанное антитело содержит:
(a) по крайней мере один из нижеследующих остатков в своей легкой цепи: Q1, L4, P46, W47 и Y71; или по крайней мере один из нижеследующих остатков в своей тяжелой цепи: D1, V-42, S28, F29, A49, T93, R94 (нумерация по Кабату); или
(b) последовательность вариабельного домена легкой цепи, определяемую аминокислотными остатками 1-106 последовательности SEQ ID NO:3, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определяемую аминокислотными остатками 1-118 последовательности SEQ ID NO:4; или
(c) такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, как и антитело, продуцированное клеточной линией hAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3275); или
(d) такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, как и антитело, продуцированное клеточной линией hsAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3356); или
(e) такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, как и антитело, продуцированное клеточной линией haAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3274).
9. Антитело по п.7, где тяжелая цепь имеет мутацию в одном или нескольких аминокислотных остатках, выбранных из группы, состоящей из остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (EU-система нумерации), и где указанные мутации приводят к изменению эффекторной функции, но не влияют на связывание с VLA-1 по сравнению с немодифицированным антителом.
10. Антитело по п.9, где антитело содержит тяжелую цепь с мутациями L234A и L235A (EU-система нумерации) по сравнению с немодифицированным антителом.
11. Антитело по п.7, где антитело имеет мутацию в аминокислотном остатке, который представляет собой сайт гликозилирования, что приводит к элиминации сайта гликозилирования.
12. Антитело по п.11, где антитело содержит мутацию N297Q в своей тяжелой цепи (EU-система нумерации).
13. Композиция, содержащая антитело по любому одному из пп.7-12 и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Нуклеиновая кислота, содержащая ДНК, которая кодирует последовательность тяжелой цепи антитела по п.1.
15. Нуклеиновая кислота, содержащая ДНК, которая кодирует последовательность легкой цепи антитела по п.3.
16. Нуклеиновая кислота, содержащая ДНК, которая выбрана из группы, включающей:
(a) ДНК, которая кодирует последовательность SEQ ID NO:1;
(b) ДНК, которая кодирует последовательность SEQ ID NO:2;
(c) ДНК, которая кодирует последовательность легкой цепи антитела, продуцированного гибридомой mAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3273);
(d) ДНК, которая кодирует последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного гибридомой mAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3273);
(e) ДНК, которая кодирует последовательность легкой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3275);
(f) ДНК, которая кодирует последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3275);
(g) ДНК, которая кодирует последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линией haAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3274);
(h) ДНК, которая кодирует последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hsAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3356);
(i) ДНК, которая кодирует последовательность остатков 1-106 SEQ ID NO:3; и
(j) ДНК, которая кодирует последовательность остатков 1-118 SEQ ID NO:4.
17. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, которая кодирует последовательность SEQ ID NO:1.
18. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, которая кодирует последовательность SEQ ID NO:2.
19. Применение композиции по п.13 для получения фармацевтической композиции для лечения иммунологического расстройства, опосредованного VLA-1.
20. In vivo способ определения уровня VLA-1 в ткани, который предусматривает контактирование ткани с антителом по п.5 и определение связывания антитела с тканью, таким образом, определение уровня VLA-1 в ткани.
21. Применение композиции по п.13 для получения диагностической композиции для определения уровня VLA-1 в ткани.
22. Клетка клеточной линии hAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3275) , haAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3274), hsQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3356) или гибридомы mAQC2 (ATCC, регистрационный номер PTA3273).
23. Компьютер для получения трехмерного представления:
(a) молекулярного комплекса, где указанный молекулярный комплекс определен набором структурных координат комплекса химерного домена I a1 b 1 интегрина RDH и гуманизированного антитела hAQC2, в соответствии с фиг. 19; или
(b) гомолога указанного молекулярного комплекса, где указанный гомолог имеет среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот указанного молекулярного комплекса, не превышающее 0,65 Е;
где указанный компьютер включает:
(i) носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат по крайней мере часть структурных координат указанного комплекса, в соответствии с фиг. 19;
(ii) рабочую память для сохранения команд для обработки указанных машинно-считываемых данных;
(iii) центральный процессор, связанный с указанной рабочей памятью и с указанным носителем машинно-считываемых данных, для обработки указанных машинно-считываемых данных в целях преобразования указанных машинно-считываемых данных в указанное трехмерное представление; и
(iv) дисплей, соединенный с указанным центральным процессором, для отображения указанного трехмерного представления.
24. Способ идентификации ингибитора домена I интегрина, предусматривающий стадии:
(a) использования структурных координат аминокислот hAQC2, включая по крайней мере семь остатков легкой цепи Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Trp95 и остатков тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Asp101 в соответствии с фиг. 19, или + среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов указанных аминокислот hAQC2, не превышающее 1,10 Е, для получения трехмерной структуры сайта связывания;
(b) использования указанной трехмерной структуры для конструирования или отбора потенциального антагониста;
(c) синтеза указанного потенциального антагониста и
(d) контактирования указанного потенциального антагониста с hAQC2 для определения способности указанного потенциального антагониётр взаимодействовать с hAQC2, где способность указанного потенциального антагониста взаимодействовать с hAQC2 означает, что указанный потенциальный антагонист является ингибитором домена I.
25. Способ идентификации ингибитора домена I интегрина, включающий стадии:
(a) использования структурных координат
(i) аминокислотных остатков домена I: Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 в соответствии с фиг. 19, для получения трехмерной структуры сайта связывания;
(ii) по меньшей мере трех аминокислотных остатков домена I, включающих остатки Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 в соответствии с фиг. 19, или + среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов указанных аминокислотных домена I, не превышающее 1,30 Е, для получения трехмерной структуры сайта связывания; и
(b) использования указанной трехмерной структуры для конструирования или отбора потенциального антагониста;
(c) синтеза указанного потенциального антагониста и
(d) контактирования указанного возможного антагониста с доменом I для определения способности указанного возможного антагониста взаимодействовать с доменом I, где способность указанного возможного антагониста взаимодействовать с доменом I указывает на то, что возможный антагонист является ингибитором домена I.
Текст
006705 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к антителам против интегрина VLA-1 и к использованию этих антител для лечения воспалительных заболеваний и других иммунологических расстройств. Настоящее изобретение также относится к кристаллической структуре комплекса, образованного между указанным антителом и 1-I-доменом VLA-1, и к использованию информации о такой структуре для компьютерной разработки лекарственных средств. Предпосылки создания изобретения Интегрины представляют собой суперсемейство рецепторов клеточной поверхности, опосредующих межклеточную и клеточно-матриксную адгезию. Известно, что эти белки служат в качестве "якоря",а также в качестве сигналов клеточного роста, миграции и дифференцировки в процессе развития и репарации ткани. Они участвуют в иммунных и воспалительных ответах. Интегрины представляют собой гетеродимерные белки, состоящие из двух нековалентно связанных полипептидных цепей,и . Аминоконцы каждой цепи образуют глобулярные головные домены, которые обеспечивают связывание между цепями и связывание с лигандом. Эти глобулярные головные домены присоединяются к трансмембранным сегментам посредством "стеблей". Цитоплазматические концевые сегменты ("хвосты") обычно имеют длину менее, чем 50 аминокислотных остатков. Сначала, подсемейства интегринов были определены исходя из конкретной -субъединицы, используемой для формирования гетеродимеров. 1-содержащие интегрины также называют VLA-молекулами (антигены с"очень поздней активацией"). Интегрины VLA-1-VLA-6 являются членами 1-подсемейства, содержащими 1-6 (то есть, CD49a-CD49f), соответственно. Общий обзор см. Cellular and Molecular Immunology, eds. Abul K. Abbas et al., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000. Известными лигандами для 11-интегрина (то есть, VLA-1) являются коллаген (обоих типов I иIV) и ламинин. VLA-1 участвует в клеточной адгезии и миграции на коллаген (Keely et al., 1995, J. Cell.Sci. 108:595-607; и Gotwals et al., 1996, J.Clin.Invest., 97:2469-2477); в стимуляции сокращения и реорганизации коллагенового матрикса, важного компонента, необходимого для заживления ран (Gotwals et al.,см. выше и Chiro 1991, Cell, 67:403-410); и в регуляции экспрессии генов, ответственных за ремодуляцию внеклеточного матрикса (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:1-5Langholz et al., 1995, J. Cell Biol.,131:1903-1915). Таким образом, ошибочная регуляция VLA-1 может приводить к развитию некоторых патологических состояний, таких как фиброз. Кроме того, было высказано предположение, что VLA-1 может играть определенную роль в развитии заболеваний, запускаемых Т-клетками/моноцитами. Антитела против VLA-1 блокируют Т-клеточнозависимую экспрессию цитокинов (Miyake et al., 1993, J. Exp. Med., 177:863-868). Экспрессия VLA-1 возрастает в персистентно активированных Т-клетках, культивируемых в течение 2-4 недель (Hemler et al.,1985, Eur, J. Immunol., 15:502-508). VLA-1 также экспрессируется на очень большом числе Т-клеток, выделенных из синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (Hemler et al., 1986, J. Clin.Invest., 78:692-702). Были определены некоторые кристаллические структуры -субъединиц интегринов, включая структуры 2-I-домена 21 (PDB, код доступа laox, Emsley et al., 1997, J. Biol.Chem., 272:28512-28517); 1-I-домена крысиного 11 (PDB, код доступа lck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; WO 00/20459); 1-субъединицы человеческого 11 (PDB, код доступа 1qc5; Rich et al., 1999, J. Biol.Chem.,274:24906-24913); L-I- и M-I-доменов; и vWF-A3 (Lee et al., 1995, Cell, 80:631-635; Lee et al., 1995,Structure 3:1333-1340; Qu et al., 1995, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 92-10277-10281; Qu et al., 1996, Structure,4:931-942). Структура 21 имеет спираль (то есть, С-спираль), которая формирует канавку или бороздку на одной поверхности белка в сайте связывания с ионом металла (Emsley et al., см. выше). Анализ кристаллической структуры 2-I-домена, образующего комплекс с короткими пептидами тройной коллагеновой спирали, обнаружил, что коллагеновый пептид связывается с той бороздкой, где аминокислоты 2-I, осуществляющие межмолекулярные взаимодействия или контактирующие с металлом, представляют собой аминокислоты Asp151, Asn154, Tyr157, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256,His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295 и Lys298 (PDB, код доступа ldzi; Emsley et al., 2000, Cell,101:47-56; WO 01/73444). Нумерация аминокислот, указанных непосредственно выше, основана на коде доступа ldzi PDB и в настоящем описании называется "кристаллической нумерацией". Было обнаружено,что кристаллические структуры крысиных и человеческих 1-I-доменов имеют аналогичную бороздку. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к антителам против VLA-1 и к способам использования этих антител для лечения различных воспалительных и иммунологических расстройств. В частности, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается сVLA-1 (например, с человеческим VLA-1). Это антитело содержит определяющие комплементарность области (CDR) легкой цепи, определяемые аминокислотными остатками 24-33, 49-55 и 88-96 последовательности SEQ ID NO:1; и/или определяющие комплементарность области тяжелой цепи, определяемые аминокислотными остатками 31-35, 50-65 и 98-107 последовательности SEQ ID NO:2. Эти CDR могут содержать мутации (например, делеции, инсерции и/или замены) в областях, не контактирующих с анти-1 006705 геном, как было определено из кристаллической структуры, описанной в настоящей заявке, при условии,что они не влияют на VLA-1-связывающую активность данного антитела. Примерами мутаций являютсяS24N, G92S и D101A в CDR легкой цепи и G55S в CDR2 тяжелой цепи. В одном из вариантов, антитело настоящего изобретения содержит последовательность SEQ ID NO:1 вариабельного домена легкой цепи и/или последовательность SEQ ID NO:2 вариабельного домена тяжелой цепи. В родственном варианте антитело настоящего изобретения содержит такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепи, как и антитело, продуцированное гибридомой mAQC2, депонированной 18 апреля 2001 в Американской коллекции типовых культур ("АТСС"), 10801 UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110-2209, и имеющей регистрационный номер РТА 3273. (Все указанные здесь депозиты АТСС были сделаны в соответствии с Будапештским договором). Указанное антитело может быть продуцировано, например, гибридомой mAQC2 или клетками, содержащими последовательности нуклеиновой кислоты, которые выделены из этой гибридомы, и которые кодируют тяжелую и легкую цепи моноклонального антитела mAQC2. В другом варианте осуществления изобретения указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее по крайней мере один (например, 2, 3, 4 или 5) из нижеследующих остатков в легкой цепи: Q1, L4, Р 46, W47 и Y71; или по крайней мере один (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из нижеследующих остатков в тяжелой цепи: D1, V12, S28, F29, А 49, Т 93, R94 (нумерация по Кабату). Так,например, указанное антитело содержит остатки Q1, L4 и Y71 в легкой цепи и/или остатки (i) F29, А 49,Т 93 и R94 или (ii) A49 и Т 93 в тяжелой цепи. Гуманизированное антитело настоящего изобретения может содержать последовательность вариабельного домена легкой цепи, определяемую аминокислотными остатками 1-106 последовательностиSEQ ID NO:3, и/или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определяемую аминокислотными остатками 1-118 последовательности SEQ ID NO:4. "Гуманизированное" антитело может содержать такие же полипептидные последовательности тяжелой и/или легкой цепи, как и антитело, продуцированное клеточной линией hAQC2, (депонированной 18 апреля 2001 в АТСС, регистрационный номер РТА 3275). В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело настоящего изобретения может содержать мутацию (например, делецию, замену или добавление) в одном или нескольких(например, в 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) определенных положениях в тяжелой цепи, такую, чтобы она изменяла эффекторную функцию данного антитела (например, способность этого антитела связываться с Fcрецептором или фактором комплемента), но, при этом, не влияла на способность данного антитела связываться с VLA-1 (патент США 5648260). Такими положениями остатков в тяжелой цепи являются, но не ограничиваются ими, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (EU-система нумерации). Указанное гуманизированное антитело в своей тяжелой цепи может, например, содержать мутации L234A (то есть, замену лейцина в положении 234 немодифицированного антитела на аланин) и L235A (EU-система нумерации). В одном из родственных вариантов осуществления изобретения данное антитело содержит такие же полипептидные последовательности тяжелой цепи, как и антитело, продуцированное клеточной линией hsAQC2, (депонированной 4 мая 2001 в АТСС, регистрационный номер РТА 3356). В еще одном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело настоящего изобретения может содержать мутацию (например, делецию или замену) в аминокислотном остатке, который представляет собой сайт гликозилирования, например, такую, чтобы этот сайт гликозилирования был элиминирован. Такое антитело может обладать клиническим преимуществом, заключающимся в том, что оно будет иметь ослабленные эффекторные функции или другие нежелательные функции, но при этом будет сохранять свою аффинность связывания с VLA-1. Мутации сайтов гликозилирования могут также благоприятно влиять на течение последующих процессов (например, экспрессию белка и очистку). Так,например, тяжелая цепь антитела может содержать мутацию N297Q (EU-система нумерации), которая приводит к тому, что тяжелая цепь больше не может быть гликозилированной в этом сайте. В одном из родственных вариантов осуществления изобретения, гуманизированное антитело содержит такую же полипептидную последовательность тяжелой цепи, как и антитело,продуцированное клеточной линией haAQC2, (депонированной 18 апреля 2001 в АТСС, регистрационный номер РТА 3274). В еще одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая и/или легкая цепи антитела настоящего изобретения содержат мутации, которые приводят к повышению аффинности связывания с VLA-1,а следовательно и к увеличению эффективности лечения VLA-1-опосредованных расстройств. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность SEQ ID NO:1; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность SEQ ID NO:2; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность легкой цепи антитела, продуцированного гибридомой mAQC2; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного гибридомой mAQC2; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность легкой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hAQC2; к изо-2 006705 лированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hAQC2; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линиейhaAQC2; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, продуцированного клеточной линией hsAQC2; к изолированной нуклеиновой кислоте,содержащей кодирующую последовательность для остатков 1-106 SEQ ID NO:3; к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность для остатков 1-118 SEQ ID NO:4; к клеткам гибридомы mAQC2; к клеткам клеточной линии hAQC2; к клеткам клеточной линии haAQC2; и к клеткам клеточной линии hsAQC2. Настоящее изобретение также относится к способу лечения индивидуума с иммунологическим расстройством, опосредуемым VLA-1, предусматривающему введение данному индивидууму эффективного количества антитела настоящего изобретения. Так, например, этот способ может быть использован для лечения индивидуума в целях временного облегчения, улучшения, стабилизации и устранения симптомов, а также для предупреждения, замедления или приостановки прогрессирования заболевания. Альтернативно, указанный способ может быть использован в профилактических целях для введения человеку, подверженному риску возникновения у него указанного иммунологического расстройства, для предотвращения развития данного заболевания или отсрочки начала его развития. "Эффективное количество" композиции может быть введено в виде одноразовой дозы или в виде многократных доз.VLA-1-опосредованными иммунологическими расстройствами являются, но не ограничиваются ими, расстройства, при которых уровень активности VLA-1 в одной или нескольких тканях увеличен по сравнению с уровнем VLA-1 у нормального индивидуума. Примерами таких расстройств являются кожные расстройства (например, псориаз, экзема, ожоги, дерматит и аномальная пролиферация фолликулярных клеток волос), фиброз (например, фиброз почек или легких), аллергический ринит, респираторный дистресс-синдром, астма, бронхит, тендинит, бурсит, повышенная температура, головные боли типа мигрени, желудочно-кишечные расстройства (например, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, гастрит, синдром раздражения кишечника, колит и рак толстой кишки), сосудистые заболевания(например, атеросклероз), узелковый периартериит, тиреоидит, апластическая анемия, болезнь Ходжкина, ревматическая лихорадка, остеоартрит, аутоиммунные болезни (например, диабет типа I, тяжелая миастения, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и рассеянный склероз), саркоидоз, нефротический синдром, почечная недостаточность, синдром Бехчета, полимиозит, гингивит, гиперчувствительность (например, гиперчувствительность замедленного типа или гиперчувствительность немедленного типа), реакции отторжения трансплантата, реакция "трансплантат против хозяина" (GVHD), конъюнктивит, отечность после повреждения, ишемия миокарда и синдром эндотоксинового шока. Настоящее изобретение также относится к способу определения уровня VLA-1 в ткани (например, в образце ткани и в физиологической жидкости), предусматривающему контактирование данной ткани(например, in vivo или in vitro) с антителом настоящего изобретения, а затем детекцию связывания данного антитела с данной тканью и определение в результате уровня VLA-1 в данной ткани. Используемым здесь антителом настоящего изобретения может быть, например, мышиное антитело, "гуманизированное" антитело или химерное антитело. Оно может представлять собой целое антитело(то есть, с двумя полноразмерными легкими цепями и с двумя полноразмерными тяжелыми цепями) любого изотипа и любых подтипов (например, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 и IgA2; с легкой каппа- или лямбда-цепью). Альтернативно, антителом настоящего изобретения может быть антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab, F(ab')2 и одноцепочечный Fv-фрагмент) целого антитела. Настоящее изобретение также относится к кристаллизуемым композициям и кристаллам комплексов, образованных химерным "крыса-человек" 1-I-доменом (мутант RH) и Fab-фрагментом hAQC2; и к способам использования таких композиций и кристаллов. Настоящее изобретение также относится к структурным координатам и сайтам связывания указанного химерного домена и Fab-фрагмента hAQC2. Атомные координаты, полученные исходя из кристаллической структуры, описанной в настоящей заявке, обеспечивают структурную основу для биологической активности hAQC2, а также основу для рационального конструирования агонистов или антагонистов VLA-1 с предсказанными биологическими активностями (например, соединения с низкой молекулярной массой или антитела, такие как вариантыhAQC2). Описанная здесь кристаллическая структура представляет собой первую кристаллическую структуру комплекса 1-I-домен "11-интегрина/Fаb". Эта структура имеет остатки, играющие важную роль в связывании Fab с 1-I-доменом. Кроме того, Fab связывается в предполагаемом коллаген-связывающем сайте и ингибирует связывание с коллагеном. Аминокислотными остатками, присутствующими в сайте связывания на 1-I-домене, являются Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glul92, Glu218, Arg219,Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (нумерация кристаллов). Остатками на Fab-фрагменте, которые, как было обнаружено, связываются с 1-I-доменом, являются остатки легкой цепи Asn30, Tyr48, Тrр 90, Ser91, Asn93 и Тrр 95, и остатки тяжелой цепи Ser30, Arg31,Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Asp101 (кристаллическая нумерация).-3 006705 Настоящее изобретение также относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления молекулярного комплекса, где указанный молекулярный комплекс определен набором структурных координат комплекса химерного домена I 11-интегрина RH и гуманизированного антителаhAQC2, в соответствии с фиг. 19; или гомолога молекулярного комплекса, имеющего среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот, не превышающее 0,65 . Данный компьютер включает носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат по крайней мере часть структурных координат комплекса, описанных на фиг. 19; рабочую память для сохранения команд для обработки машинно-считываемых данных; центральный процессор, связанный с рабочей памятью и с носителем машинно-считываемых данных для преобразования этих машинно-считываемых данных в трехмерные представления; и дисплей, соединенный с центральным процессором для отображения указанного трехмерного представления. Кроме того, настоящее изобретение относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, включающего сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислот hAQC2, включающих по крайней мере семь (например, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) из остатков легкой цепи Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тrр 95 и остатков тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Aspl0l (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или гомолога молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот hAQC2, не превышающее 1,10 А. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления сайта связывания, определенного структурными координатами аминокислот hAQC2, включающих по крайней мере семь (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15 или 16) из остатков легкой цепи Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тrр 95 и остатков тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Glyl00 и Asp101 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; сайта связывания гомолога, который имеет среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот hAQC2 не превышающее 1,10 . Настоящее изобретение также относится к способу идентификации ингибитора домена I интегрина,включающему стадии использования структурных координат аминокислот hAQC2, включая по крайней мере семь (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) из остатков легкой цепи Asn30, Tyr48, Trp90,Ser91, Asn93 и Тrр 95 и остатков тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99,Gly100 и Asp101 (нумерация кристаллов), в соответствии с фиг. 19; илисреднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот hAQC2, не превышающее 1,10 , в целях генерирования трехмерной структуры сайта связывания; использования этой трехмерной структуры для конструирования или отбора потенциального антагониста; синтеза такого потенциального антагониста; и контактирования этого потенциального антагониста с hAQC2 для определения способности указанного потенциального антагониста взаимодействовать с hAQC2, где указанная способность потенциального антагониста взаимодействовать с hAQC2 означает, что указанный потенциальный антагонист является ингибитором домена I. Кроме того, настоящее изобретение относится к ингибитору домена I интегрина, идентифицированного этим способом. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, включающего: сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислотных остатков домена I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160,Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 иLeu294 (нумерация кристаллов), в соответствии с фиг. 19; или гомолога указанной молекулы или указанного молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает второй сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I, не превышающее более чем 0,65 . Настоящее изобретение также относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления первого сайта связывания, определенного структурными координатами аминокислотных остатков домена I: Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221,Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или сайта связывания гомолога, имеющего среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I не более чем 0,65 . Настоящее изобретение относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, включающего сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислотных остатков доменаI, включающих по крайней мере три из следующих остатков Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221(кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или гомолога указанной молекулы или указанного молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает второй сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I, составляющее не более чем 1,0. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для продуцирования трехмерного представления сайта связывания, определенного структурными координатами аминокислот домена I, включающих по крайней мере три из следующих остатков Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (нумерация кристаллов), в соответствии с фиг. 19; или сайта связывания гомолога, имеющего среднеквадратичное от-4 006705 клонение от каркасных атомов аминокислот домена I не более чем 1,0 . Кроме того, настоящее изобретение относится к способам использования этих трехмерных представлений для конструирования химических молекул, которые ассоциируются с химерным доменом или с Fab-фрагментом hAQC2 или с его частью, и действуют как потенциальные ингибиторы химерного домена или Fab-фрагмента hAQC2 или его частей. Настоящее изобретение также относится к композициям,включающим химические молекулы, такие как ингибиторы и варианты химерного домена или вариантыFab-фрагмента hAQC2, где указанные химические молекулы и их варианты рационально конструируют с использованием структурных координат химерного домена или Fab-фрагмента hAQC2 или сайтов связывания. Настоящее изобретение также относится к использованию идентифицированных выше химических молекул для лечения или предупреждения состояний, ассоциированных с нежелательной или аномальной 11-активностью у индивидуума. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации ингибитора домена I интегрина, включающему стадии использования структурных координат аминокислотных остатков доменаI: Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223,Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; в целях генерирования трехмерной структуры сайта связывания; использования этой трехмерной структуры для конструирования или отбора потенциального антагониста; синтеза такого потенциального антагониста; и контактирования этого потенциального антагониста с доменом I для определения способности этого потенциального антагониста взаимодействовать с доменом I, где способность указанного потенциального антагониста взаимодействовать с доменом I означает, что указанный потенциальный антагонист является ингибитором домена I. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации ингибитора домена I интегрина,включающему стадии использования структурных координат по крайней мере для трех из следующих аминокислотных остатков домена I: Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; илисреднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I, не превышающее 0,65 , в целях генерирования трехмерной структуры сайта связывания; использования этой трехмерной структуры для конструирования или отбора потенциального антагониста; синтеза такого потенциального антагониста; и контактирования указанного потенциального антагониста с доменом I для определения способности этого потенциального антагониста взаимодействовать с доменом I интегрина, где указанная способность потенциального антагониста взаимодействовать с доменом I означает, что данный потенциальный антагонист является ингибитором домена I. Настоящее изобретение также относится к ингибитору домена I интегрина, идентифицированного этим способом. Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания и из формулы изобретения. Краткое описание графического материала Фиг. 1. Связывающиеся с коллагеном интегрины 11 и 21 на активированных лейкоцитах.(А) Проточный цитометрический анализ экспрессии интегрина 1 и 21 на IL-2-активированных спленоцитах (d11). Клетки были помечены либо анти-1 mAb, анти-2 mAb, либо несвязывающимся контрольным mAb (серые линии), а затем ФИТЦ-конъюгированным антителом против иммуноглобулинов хомячка.(В) Влияние анти-1 mAb и анти-2 mAb на адгезию лейкоцитов к коллагену. 105 IL-2 активированных спленоцитов обрабатывали указанными mAb в течение 15 мин, а затем помещали в лунки, покрытые либо коллагеном типа IV, либо коллагеном типа I, на 1 ч при 37 С. Адгезию вычисляли как проиллюстрировано в примере 1 и выражали как % адгезии по отношению к адгезии клеток, обработанных контрольным mAb. Анализы на адгезию осуществляли в трех повторах, и было проведено по крайней мере три независимых эксперимента. Проиллюстрирован один репрезентативный эксперимент. Фиг. 2. Влияние mAb против интегрина на эффекторную фазу гиперчувствительности замедленного типа.SRBC-сенсибилизированным мышам внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали указанные mAb за 1 ч до SRBC-сенсибилизации. Через 20 ч после стимуляции антигеном измеряли толщину подушечки лапы,и результаты выражали как % увеличения толщины подушечки лапыср.кв.от., как проиллюстрировано в примере 2 . Эти данные представляют собой суммарные величины для восьми экспериментов, где n=79(анти-5), 20 (анти-6) и 10 (анти-1). Были использованы следующие mAb: На 4/8 (контрольные Ig хомячка группы 2), На 31/8 (анти-l), На 1/29 (анти-2), PS/2 (анти-4), 5 Н 10-27 (анти-5), GoH3 (анти-6) и HM1-1 (анти-1). Фиг. 3. Влияние mAb против интегрина на эффекторную фазу контактной гиперчувствительности. ФИТЦ-сенсибилизированным мышам инъецировали i.p. указанные mAb за 4 ч до ФИТЦсенсибилизации. Толщину уха измеряли до сенсибилизации и через 24 ч после сенсибилизации, и результаты выражали как % увеличения толщины ухаср.кв.от., как проиллюстрировано в примере 3. Эти данные представляют собой суммарные величины для девяти экспериментов, где n=74 (PBS), 60 (кон-5 006705 трольные Ig хомячка), 26 (анти ICAM-1), 44 (анти-l), 44 (анти-2), 38 (анти-l + анти-2), 36 (анти-4),16 (анти-5), 26 (анти-4+анти-5), 24 (анти-6) и 22 (анти-1). Были использованы следующие mAb хомячка: На 4/8 (контрольные Ig хомячка группы 2), На 31/8 (анти-l), На 1/29 (анти-2), HM.1-1 (анти 1), 3 Е 2 (анти-ICAM-1); были использованы следующие крысиные mAb: R35-95 и R35-38 (контрольные крысиные IgG2a и крысиные IgG2b, соответственно), PS/2 (анти-4), 5 Н 10-27 (анти-5) и GoH3 (анти 6). Фиг. 4. Реакции контактной гиперчувствительности у 1-дефицитных мышей по сравнению с мышами дикого типа. ФИТЦ-сенсибилизированным мышам инъецировали i.p. указанные mAb за 4 ч до ФИТЦ-сенсибилизации. Толщину уха измеряли до сенсибилизации и через 24 ч после сенсибилизации, и результаты выражали как % увеличения толщины ухаср.кв.от., как проиллюстрировано в примере 4. Были использованы группы из четырех или пяти мышей для каждого состояния, и все эксперименты проводили минимум три раза. Проиллюстрирован один репрезентативный эксперимент. Фиг. 5. Влияние анти-1 mAb и анти-2 mAb на неспецифическое воспаление, индуцированное кротоновым маслом. Мышам инъецировали i.p. указанные mAb за 4 ч до нанесения на ухо кротонового масла. Толщину уха измеряли до нанесения масла и через 24 ч после нанесения масла, и результаты выражали в % увеличения толщины ухаср.кв.от., как проиллюстрировано в примере 5. Были использованы группы из четырех или пяти мышей для каждого состояния, и все эксперименты проводили минимум три раза. Проиллюстрирован один репрезентативный эксперимент. Фиг. 6. Влияние анти-1 mAb и анти-2 mAb на артрит, индуцированный mAb против коллагена. Мышам инъецировали i.p. указанные mAb против коллагена на день 0, а затем ЛПС на день 3. Мышам инъецировали i.p. указанные mAb через каждые три дня, начиная с дня 0. Клинические признаки артрита появлялись через 2-3 дня после инъекции ЛПС и наблюдались в течение нескольких недель. Каждую конечность оценивали по шкале 0-4 баллов через каждые три дня, как проиллюстрировано в примере 6, и результаты выражали как среднюю оценку поражения артритом, проведенную в дни 9-15 ( ср.кв.от.) для всех четырех конечностей. Эти данные представляют собой суммарные величины по четырем экспериментам, причем в каждом эксперименте использовали группы из трех или четырех мышей для каждого состояния. Фиг. 7. Влияние анти-1 mAb и анти-2 mAb на артрит, индуцированный mAb против коллагена. А. Превентивная обработка мышей анти-1 mAb или анти-2 mAb приводит к снижению оценки степени поражения артритом. Мышей обрабатывали mAb против коллагена на день 0, а затем ЛПС на 3-й день. Признаки артрита появлялись на 6-ой день и наблюдались в течение нескольких недель. Мышей обрабатывали указанными mAb на каждый 3-й день, начиная со дня 0. Каждую конечность оценивали по шкале 0-4 баллов, на каждый 3-й день. Результаты выражали в виде средней оценки поражения артритом в дни 9-15 ( ср.кв.от.) для всех четырех конечностей (максимальная оценка 16). При этом, были использованы группы из 4 мышей для каждого состояния; представлены средние величины для 12 экспериментов. В. 1-дефицитные мыши имеют меньшие оценки поражения артритом по сравнению с мышами дикого типа, обработанными анти-1 mAb. Подробное описание экспериментов и проведения оценки представлено выше. При этом, были использованы группы из 4 мышей для каждого состояния; представлены средние величины для 2 экспериментов. Фиг. 8. Развитие артрита замедляется в отсутствии лимфоцитов, и ингибирование артрита анти-1mAb также происходит в отсутствии лимфоцитов. Мышей дикого типа В 6,129 или RAG-1-дефицитных мышей В 6,129 обрабатывали mAb против коллагена на день 0, а затем ЛПС на 3-й день. Признаки артрита появлялись на 6-ой день и наблюдались в течение нескольких недель. Мышей обрабатывали указанными mAb на каждый 3-й день, начиная со дня 0. Каждую конечность исследовали и оценивали по шкале 0-4 баллов, на каждый 3-й день. Результаты выражали в виде средней оценки поражения артритом на конечность (максимальная оценка 4). При этом, были использованы группы из 4 мышей для каждого состояния. Фиг. 9. Зависимый от дозы ответ на ингибирование артрита анти-1 антителом (mAb). Мышей дикого типа Balb/с обрабатывали mAb против коллагена на день 0, а затем ЛПС на день 3. Признаки артрита появлялись на 6-ой день и наблюдались в течение нескольких недель. Мышей обрабатывали i.p. указанной дозой mAb либо На 4/8 (контрольным изотипом), либо На 31/8 (анти-1 антителом) на каждый 3-й день, начиная со дня 0. Каждую конечность исследовали и оценивали по шкале 0-4 баллов, на каждый 3-й день. Результаты выражали как среднюю оценку поражения артритом на конечность (максимальная оценка 4). При этом, были использованы группы из 4 мышей для каждого состояния. Фиг. 10. Терапевтическая обработка анти-1 антителом (mAb) может снижать оценку поражения артритом. Мышей дикого типа Balb/с обрабатывали mAb против коллагена на день 0, а затем ЛПС на 3-й день. Признаки артрита появлялись на 6-ой день и наблюдались в течение нескольких недель. Мышей обрабатывали i.p. mAb (250 мкг) или гибридным Ig-белком (200 мкг) на каждый 3-й день, начиная со дня 4. Мышам вводили либо mAb (На 4/8, контрольный изотип или На 31/8, анти-1), либо гибридный Igбелок (контрольный изотип Ig или TNF-R55-Ig), либо их комбинацию (250 мкг На 31/8 и 200 мкг TNF-6 006705R55-Ig). Каждую конечность исследовали и оценивали по шкале 0-4 баллов на каждый 3-й день. Результаты выражали как среднюю оценку поражения артритом на конечность (максимальная оценка 4). При этом, были использованы группы из 4 мышей для каждого состояния. Фиг. 11. Локализация эпитопа для блокирующего mAb против 1-I-домена. А. Аминокислотная последовательность крысиного (вверху, SEQ ID NO:63) и человеческого (внизу; остатки 91-96 SEQ ID NO:64) 1-I-домена. Остатки, которые включают мотив MIDAS (зависимый от иона металла сайт адгезии), показаны жирным шрифтом. Человеческие аминокислоты, которые заменяют соответствующие крысиные остатки (RH), показаны под крысиной последовательностью в рамке. Для ясности, нумерация остатков в тексте совпадает с нумерацией на этой фигуре, если это не указано особо, например, кристаллическая нумерация. В. Антитело (mAb) AJH10 (АТССРТА-3580; депонированное 2 августа 2001 в Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA, USA, в соответствии с Будапештским договором), взятое в возрастающих концентрациях, было связано с планшетами, сенсибилизированными 30 мкг/мл человеческого (кружочки), крысиного (треугольники) или RH (квадраты) 1-I-домена. Данные представлены для трех экспериментов. Фиг. 12. Аминокислотная последовательность человеческого 1-I-домена (SEQ ID NO:64). Фиг. 13. Идентификация блокирующего mAb против 1-I-домена. А. Антитела (mAb) AEF3 (треугольники) или AJH10 (кружки), взятые в возрастающих концентрациях, были связаны с планшетами, сенсибилизированными 30 мкг/мл 1-I-домена. В. 1-I-домен обрабатывали возрастающими концентрациями mAb AJH10 (ромбы) или mAb BGC5(квадраты) и подвергали связыванию с планшетами, покрытыми коллагеном IV (2 мкг/мл). С. Клетки K562-1 обрабатывали возрастающими концентрациями mAb AEF3 (треугольники) илиAJH10 (кружки) и подвергали связыванию с планшетами, покрытыми коллагеном IV (5 мкг/мл). 45-50% клеток, добавленных в каждую лунку, связывались с коллагеном IV. Данные представлены для трех независимых экспериментов. Фиг. 14. Тип перекрестной реактивности блокирующих mAb, проанализированной с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS). Клетки гладкой мышцы кроличьих сосудов инкубировали либо с mAb AJH10 (внизу) , либо с мышиным контрольным IgG (вверху) и анализировали с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS). Фиг. 15. Связывание 1-I-домена с коллагеном. А. Человеческий 1-I-домен с возрастающими концентрациями был связан с планшетами, предварительно покрытыми 1 мкг/мл коллагена I (квадраты) или коллагена IV (кружки). Представленные величины были скорректированы на фоновое связывание с BSA. В. 2 мкг/мл человеческого 1-I-домена смешивали с возрастающими концентрациями антитела 5E8D9 против человеческого 1-интегрина (квадраты) или антитела A2IIE10 против человеческого 2 интегрина (кружки), а затем связывали с планшетами, предварительно покрытыми 1 мкг/мл коллагенаIV. С. Планшеты были покрыты 1 мкг/мл коллагена IV или 3% BSA. Затем 1-I-домен (2 мкг/мл) подвергали связыванию с покрытыми планшетами в присутствии 1 мМ Мn2+, 1 мМ Мg2+ или 5 мМ EDTA. Данные представлены для трех независимых экспериментов. Фиг. 16 . Характеристика гуманизированных форм AQC2. Были оценены mAQC2 (треугольники),chAQC2 (кружки), hAQC2 (перевернутые треугольники) и hAQC2' (квадраты).D. Конкуренция с биотинилированным mAQC2 за связывание с иммобилизованным 1-I-доменом. Фиг. 17. Характеристика гуманизированных форм AQC2 с помощью FACS. Фиг. 18. Характеристика гуманизированных форм AQC2 с помощью FACS. Фиг. 19. Координаты атомных структур для комплекса 1-I-домен/Fab, полученные с помощью рентгеновской кристаллографии, проведенной на кристаллах этого комплекса в формате базы данных белков (Protein Data Bank (PDB. Координаты этих двух комплексов в ассиметричном элементе представлены ниже: Комплекс 1: молекула А = домен I интегрина молекула Н = тяжелая цепь Fab hAQC2 молекула L = легкая цепь Fab hAQC2 молекула М = Мn+2 Комплекс 2: молекула В = домен I интегрина молекула X = тяжелая цепь Fab hAQC2 молекула Y = легкая цепь Fab hAQC2 молекула М = Мn+2-7 006705 Фиг. 20. Комплекс "I-домен-Fab". А. "Ленточная" диаграмма комплекса "I-домен-Fab". Помечены домен I и тяжелая и легкая цепи антитела. Ион Мn+2 представлен в виде сферы. В. Показанный на рисунке в увеличенном масштабе MIDAS (зависимый от иона металла сайт адгезии) указывает на координирование иона металла (сфера) остатком Asp101 (кристаллическая нумерация). Белковые каркасы изображены в виде лент, а боковые цепи представлены в виде шариков и стержней. Цилиндры представляют взаимодействия между ионом металла и атомами белков. Тонкие линии представляют Н-связи. Фиг. 20 была построена с использованием программного обеспечения RIBBONS(Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24:958-961). Фиг. 21. Диаграмма системы, используемой для осуществления команд, закодированных на носителе данных, см. фиг. 22 и 23. Фиг. 22. Поперечное сечение магнитного носителя данных. Фиг. 23. Поперечное сечение оптически-считываемого носителя данных. Подробное описание изобретения В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что антитело против интегрина (например, VLA-1) и его фрагмента, а в частности, субъединицы 1-интегрина, может блокировать взаимодействие лейкоцитов про-воспалительной зоны с компонентами внеклеточного матрикса, включая, но не ограничиваясь ими, коллагены, ламинин и фибронектин. Это открытие продемонстрировало важную роль адгезивных молекул семейства интегринов, а в частности, 11, в окружающей периферической ткани, при состояниях, родственных воспалению. Оно также продемонстрировало, что семейство интегринов и их фрагментов, помимо их связывания с лейкоцитами и экстравазации на поверхность эндотелия, играет более широкую роль в воспалении, если принять во внимание важное значение обогащенной матриксом периферической окружающей ткани для продуцирования иммунных ответов, и, кроме того,это открытие показало, что периферические ткани могут представлять собой новый объект для вмешательства при терапии, основанной на адгезии.I. Антитела против интегрина. Способы настоящего изобретения предусматривают использование антител против интегринов, где рассматриваемые интегрины включают молекулы, которые содержат -цепь, включая, но не ограничиваясь ими, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, нековалентно связанную с -цепью, включая но не ограничиваясь ими, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, V, L, M, X, D, E, IIb. Примеры различных интегринов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими:-8 006705 Способы настоящего изобретения также предусматривают использование антител против фрагментов интегринов, включая, например, антитела против лишь одной -цепи, включая, но не ограничиваясь ими, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, а также против лишь одной -цепи, включая но не ограничиваясь ими,a1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, V, L, M, X, D, E, IIb. Кроме того, способы настоящего изобретения предусматривают использование антител против фрагментов интегринов, включая, например, антитела против I-домена -цепи, включают но не ограничиваясь им, I-домен из 11 (Briesewitz etal., 1989, J. Cell Biol. 108:703), M2 (Corbi et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:12403), X2 (Corbi et al. , 1987,EMBO J. 6:4023), D2 (Grayson et al., 1988, J. Exp. Med. 188:2187), E2 (Shaw et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:6016). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенная детерминанта 1-I-домена включает аминокислотную последовательность, состоящую по крайней мере из 6 смежных аминокислот,где указанная непрерывная последовательность присутствует в последовательности на фиг. 12. В родственном варианте осуществления изобретения такой непрерывной последовательностью является ValGln-Arg-Gly-Gly-Arg (остатки 91-96 SEQ ID No: 64). Способы продуцирования интегринов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, известны любому специалисту (см., например, Springer et al., 1990, Nature, 346:425-434). Варианты осуществления настоящего изобретения также включают поликлональные и моноклональные антитела против интегрина. Варианты осуществления настоящего изобретения также включают моноклональное антитело, такое как моноклональное антитело против 1. Антитела, используемые для лечения, а в частности, для лечения человека, включают человеческие антитела, "гуманизированные" антитела, химерные антитела и антиген-связывающие фрагменты целого антитела, такие как Fab, Fab',F(ab')2 и F(v)-фрагменты антитела. Некоторые антитела настоящего изобретения могут также включать белки, содержащие одну или несколько легких и/или тяжелых цепей иммуноглобулина, таких как мономеры и гомо- или гетеромультимеры (например, димеры или тримеры) этих цепей, где указанные цепи необязательно связаны дисульфидами, или сшиты как-либо иначе. Эти антитела способны связываться с одним или несколькими антигенами (например, с субъединицами интегрина, содержащими 1, 2, 6 или альфа-I-домен). Используемый здесь термин "антитело, блокирующее функцию 11", означает антитело, которое связывается с 1-I-доменом, например, с остатками 91-97, показанными на фиг. 12, и блокирует функцию 11, как было показано, например, в тесте на их способность ингибировать К 562-1-зависимую адгезию к коллагену IV (см. пример 15). Ниже описаны различные способы получения антител настоящего изобретения. Методы, которые известны специалистам, но конкретно не описаны в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Так, например, антитела настоящего изобретения могут быть также идентифицированы с использованием библиотек антител фагового представления, таких как библиотеки, описанные Smith,1985, Science 228:1315-7; патенты США 5565332, 5733743, 6291650 и 6303313. Другие антитела настоящего изобретения могут быть получены путем связывания идентифицированных здесь тяжелых цепей с некогнатной легкой цепью, например, с легкой цепью, идентифицированной с помощью техники фагового представления.II. Антитела, продуцированные нечеловеческой гибридомой. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть генерированы с использованием хорошо известной гибридомной технологии. Так, например, 1 (-/-)-животные (например, мыши, крысы или кролики) могут быть иммунизованы очищенными или неочищенными 1,1-препаратами; клетками,трансфецированными кДНК-конструкциями, кодирующими 1,1 или оба антигена; клетками, конститутивно экспрессирующими 1,1, и т.п. Антиген может быть введен в виде очищенного белка, белка, экспрессированного на клетках, фрагмента или пептида этого белка, или в виде "оголенной" ДНК или вирусных векторов, кодирующих указанный белок, его фрагмент или пептид. Затем сыворотку иммунизованных животных тестируют на присутствие aнти-1,1 антител. У животных с положительным тестом выделяют В-клетки, и с использованием этих В-клеток получают гибридомы. Антитела, секретированные указанными гибридомами, скринируют на их способность к специфическому связыванию с VLA-1 (например, к связыванию с 1-трансфецированными клетками, но не с нетрансфецированными родительскими клетками) и на какие-либо другие нужные признаки, например, на присутствие нужных консенсусных последовательностей CDR, ингибирование (или на отсутствие ингибирования в случае неблокирующих антител) связывания коллагена с VLA-1. Гибридомные клетки, которые были тест-положительными в скрининг-анализах, культивируют в питательной среде в условиях, способствующих секреции моноклональных антител указанными клетками в культуральную среду. Затем супернатант кондиционированной гибридомной культуры собирают, и антитела, находящиеся в супернатанте, очищают. Альтернативно, нужное антитело может быть продуцировано путем инъекции гибридомных клеток в брюшную полость неиммунизованного животного (например, мыши). Гибридомные клетки пролиферируют в брюшной полости и секретируют антитело, ко-9 006705 торое аккумулируется в асцитной жидкости. Затем это антитело может быть собрано после забора асцитной жидкости из брюшной полости с помощью шприца. Моноклональные антитела могут быть также продуцированы путем выделения антителокодирующих кДНК из нужных гибридом, трансфекции клеток-хозяев млекопитающих (например, клеток СНО или NSO) указанными кДНК, культивирования трансфецированных клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды.III. Химерные антитела. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть также генерированы путем конструирования когнатного гибридомного (например, мышиного, крысиного или кроличьего) антитела. Так,например, когнатное антитело может быть модифицировано с помощью техники рекомбинантных ДНК,так, чтобы часть или вся шарнирная и/или константная области тяжелой и/или легкой цепи антитела были заменены соответствующими компонентами антитела других видов (например, человеческого антитела). Обычно вариабельные домены сконструированного антитела остаются идентичными или, в основном, идентичными вариабельным доменам когнатного антитела. Такое сконструированное антитело называется химерным антителом и оно обладает меньшей антигенностью, чем когнатное антитело при его введении индивидууму того вида, от которого происходит указанная шарнирная и/или константная область (например, человека). Методы получения химерных антител хорошо известны специалистам. Человеческие константные области включают области, происходящие от IgG1 и IgG4.IV. Полностью человеческие антитела. Моноклональные антитела настоящего изобретения также включают полностью человеческие антитела. Они могут быть получены с использованием in vitrо-примированных человеческих спленоцитов,как описано Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95, или с использованием библиотек антител фагового представления, как описано, например, в патенте США 6300064. Альтернативно, полностью человеческие антитела могут быть получены путем клонирования спектра антител, как описано Persson et al., 1991, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:2432-2436; и HuangStollar,1991, J. Immunol. Methods 141:227-236. Кроме того, в патенте США 5798230 (25 августа 1998) описано получение человеческих моноклональных антител из человеческих В-клеток, где В-клетки, продуцирующие человеческое антитело, являются иммортализованными вследствие их инфицирования вирусом Эпштейна-Барра или его производным, экспрессирующим ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барра(EBNA2), то есть, белок, необходимый для иммортализации. Затем функция EBNA2 отключается, что приводит к увеличению продуцирования антитела. Некоторые другие методы продуцирования полностью человеческих антител предусматривают использование других животных, не относящихся к человеку, которые имеют инактивированный эндогенный локус Ig и являются трансгенными по нереаранжированным генам тяжелой и легкой цепи человеческого антитела. Такие трансгенные животные могут быть иммунизованы 1,1, после чего из В-клеток,взятых от этих животных, получают гибридомы. Эти методы описаны, например, в различных публикациях GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA)/патентах, относящихся к трансгенным мышам, имеющим минилокусы Ig человека (например, Lonberg, патент США 5789650); в различных публикациях AbgenixV. Гуманизированные антитела. Моноклональные антитела настоящего изобретения также включают гуманизированные варианты когнатных 1,1 антител, происходящих от других видов. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, продуцированное с помощью техники рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, не участвующие в связывании с антигеном (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов), используются для замены соответствующих аминокислот легкой или тяжелой цепи когнатного нечеловеческого антитела. Так, например, гуманизированный вариант мышиного антитела против данного антигена имеет на своих обеих тяжелых и легких цепях (1) константные области человеческого антитела; (2) каркасные области вариабельных доменов человеческого антитела; и (3) CDR мышиного антитела. При необходимости, один или несколько остатков в человеческих каркасных областях могут быть заменены остатками в соответствующих положениях мышиного антитела, но так, чтобы сохранялась аффинность связывания гуманизированного антитела с антигеном. Эту замену иногда называют "обратной мутацией". Вероятность вырабатки иммунного ответа у человека против гуманизированных антител обычно является более низкой по сравнению с вероятностью выработки указанного ответа против химерных человеческих антител, поскольку гуманизированные антитела содержат значительно меньшее количество нечеловеческих компонентов. Методы получения гуманизированных антител описаны, например, в Winter ЕР 239400; Jones et al.,1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., 1988, Science- 10006705 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; в патенте США 6180370; и Orlandi et al., 1989, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833. Обычно, трансплантацию мышиных (или других нечеловеческих) CDR в человеческое антитело осуществляют следующим образом. Из гибридомы выделяют кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей. ДНК-последовательности вариабельных доменов, включая CDR, определяют путем секвенирования. ДНК, кодирующие CDR, переносят в соответствующие участки последовательности, кодирующие вариабельный домен тяжелой или легкой цепи человеческого антитела, посредством сайт-направленного мутагенеза. Затем добавляют сегменты гена человеческой константной области антитела нужного изотипа (например, 1 для СН и k для CL). Гены гуманизированной тяжелой и легкой цепи подвергают коэкспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих (например, в клетках СНО или NSO) для продуцирования растворимого гуманизированного антитела. Для облегчения крупномасштабного продуцирования антител, часто бывает желательно продуцировать указанные гуманизированные антитела в биореакторах,содержащих антитело-экспрессирующие клетки, или продуцировать трансгенных млекопитающих (например, коз, коров или овец), у которых антитела экспрессируются в молоке (см. например, патент США 5827690). В то же время, прямой перенос CDR в каркасную область человеческого антитела приводит к потере полученным антителом аффинности связывания с антигеном. Это обусловлено тем, что в некоторых когнатных антителах, некоторые аминокислоты в каркасных областях взаимодействуют с CDR и таким образом влияют на суммарную аффинность связывания антигена с антителом. В таких случаях, для сохранения антиген-связывающей активности когнатного антитела очень важную роль может играть введение "обратных мутаций" (см. выше) в каркасные области антитела-акцептора. Общие методы введения обратных мутаций известны специалистам. Так, например, в работахDesign Labs Inc.) описан метод, который включает две ключевые стадии. Сначала, каркасные V-области человеческого антитела выбирают с помощью компьютерного анализа на оптимальную последовательность белка, гомологичную каркасной V-области когнатного мышиного антитела. Затем, третичную структуру мышиной V-области моделируют на компьютере для визуализации каркасных аминокислотных остатков, которые, вероятно, взаимодействуют с мышиными CDR, после чего эти мышиные аминокислотные остатки совмещают методом суперпозиции с гомологичной человеческой каркасной областью. В этом двухстадийном методе для конструирования гуманизированных антител используется несколько критериев. Первым критерием является использование, в качестве человеческого акцептора,каркасной области от конкретного человеческого иммуноглобулина, который обычно является гомологичным нечеловеческому донорному иммуноглобулину, или использование консенсусного участка каркасной области от многих человеческих антител. Вторым критерием является использование вместо акцепторной аминокислоты донорной аминокислоты, в случае, если человеческий акцепторный остаток является необычным, а донорный остаток является типичным для человеческих последовательностей в специфическом остатке данной каркасной области. Третьим критерием является использование вместо акцепторного аминокислотного остатка донорного каркасного аминокислотного остатка в положениях,непосредственно смежных с CDR. Может быть также использован другой метод, описанный, например, Tempest, 1991, Biotechnology 9:266-271. В этом методе, каркасные участки V-области, происходящие от тяжелой и легкой цепейNEWM и REI, соответственно, используются для CDR-трансплантации без введения большого числа мышиных остатков. Преимущество использования этого метода заключается в том, что трехмерные структуры вариабельных областей NEWM и REI известны и определены с помощью рентгеновской кристаллографии, а поэтому специфические взаимодействия между CDR и каркасными остатками V-области могут быть легко моделированы.VI. Другие составные части. Кроме того, для осуществления желательных функций, моноклональные антитела настоящего изобретения могут включать другие составные части. Так, например, для уничтожения клеток, на которые нацелены указанные антитела, эти антитела могут включать молекулу токсина (например, токсоид столбняка или рицин) или радионуклид (например, 111In или 90Y) (см., например, патент США 6307026). Для облегчения выделения или детекции, антитела могут включать соответствующую составную часть (например, биотин, флуоресцентные части, радиоактивные части, гистидиновую метку или другие пептидные метки). Эти антитела могут также включать молекулу, которая может удлинять время их полужизни в сыворотке, например, молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ), и член суперсемейства иммуноглобулинов или его фрагмент (например, часть константной области тяжелой цепи человеческогоIgG1, такую как шарнирные области, СН 2- и СН 3-области).VII. Кристаллизуемые композиции и кристаллы. Настоящее изобретение также относится к кристаллизуемой композиции, содержащей комплекс из:(1) химерного "крыса-человек" 1-I-домена (например, мутантного RH) или его части (например, поли- 11006705 пептида, включающего 135-336 аминокислот химерного "крыса-человек" 1-I-домена) ; и (2) Fabфрагмента hAQC2 или его части (например, полипептида, включающего 3-213 аминокислот легкой цепи и/или полипептида, включающего 3-219 аминокислот тяжелой цепи). Пример такого комплекса показан на фиг. 20. 1-I-Домен RH может включать, например, аминокислотные остатки 145-336 (кристаллическая нумерация)(SEQ ID NO:59, см. ниже) крысиной 1-субъединицы. Fab-фрагменты hAQC2 могут включать аминокислотные остатки легкой цепи 1-106 (например, 1-213) SEQ ID NO:3 и аминокислотные остатки тяжелой цепи 1-118 (например, 1-219) SEQ ID NO:4. Fab-фрагменты hAQC2 могут быть получены путем расщепления интактного антитела папаином или с помощью техники рекомбинантных ДНК. Указанные Fab-фрагменты включают, по крайней мере, антиген-связывающую часть вариабельных доменов легкой цепи и/или тяжелой цепи hAQC2. Некоторые кристаллизуемые композиции и кристаллы настоящего изобретения могут содержать молекулу или молекулярный комплекс, который, по своей аминокислотной последовательности или по трехмерной структуре является гомологичным 1-I-домену и/или Fab-фрагменту hAQC2. Примеры таких гомологов включают, но не ограничиваются ими, 1-I-домен и/или Fab-фрагмент hAQC2 с мутациями,такими как консервативные замены, добавления, делеции или их комбинации. Термин "консервативные замены" означает замены остатков, которые по своим физическим свойствам, таким как размер, форма,гидрофобность, заряд, и/или по своим химическим свойствам являются подобными соответствующим сравниваемым остаткам. Методы идентификации "соответствующей" аминокислоты являются известными и основаны на сопоставлении последовательности и структуры, ее функционального положения или комбинаций этих свойств с кристаллической структурой, выявленной в настоящем изобретении. Так,например, соответствующие аминокислоты могут быть идентифицированы путем совмещения каркасных атомных аминокислот в комплексе "1-I-домен/hАQС 2" и в гомологе 1-I-домена и/или hAQC2 с использованием хорошо известных прикладных программ, таких как QUANTA (Molecular Simulations,Inc., San Diego, CA 1998, 2000). Соответствующие аминокислоты могут быть идентифицированы с использованием программ сопоставления последовательностей, таких как программа "bestfit", имеющаяся вGenetics Computer Group, где используется алгоритм локальной гомологии, описанный SmithWaterman в Adv. Appl. Math. 2:482 (1981). Кристаллические композиции настоящего изобретения могут, кроме того, включать один или несколько компонентов, которые стимулируют кристаллизацию и/или являются совместимыми с условиями кристаллизации. Такими компонентами могут быть, но не ограничиваются ими, буферы, соли, осаждающие агенты и другие реагенты. Одними из таких компонентов может быть 30% мас./об. полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500). Настоящее изобретение также относится к способам получения кристаллов из кристаллизуемых композиций, включающих комплекс 1-I-домена и ангигенсвязывающего участка hAQC2 (например,Fab-, Fab'- или других фрагментов, см. выше). В заявленном изобретении могут быть использованы различные методы кристаллизации, включая, но не ограничиваясь ими, диффузия из паровой фазы, диализ,приготовление микросмесей, приготовление смесей и диффузия из жидкой фазы в жидкую фазу. Методами диффузии из паровой фазы являются, но не ограничиваются ими, техника упавшей капли, техника висячей капли и сэндвич-капли. Методы диффузии из паровой фазы могут предусматривать использование техники регуляции скорости кристаллизации, такой как добавление масел на капли или в резервуарный раствор. Методы кристаллизации могут предусматривать смешивание резервуарного раствора, содержащего осаждающий агент, с водным раствором комплекса 1-I-домена и антиген-связывающего участка hAQC2 для продуцирования кристаллизуемой композиции. Затем, указанная смесь или кристаллизуемая композиция могут быть кристаллизованы с использованием различных вышеперечисленных методов. Кристаллизуемая композиция настоящего изобретения может представлять собой водный раствор комплекса 1-I-домена и антиген-связывающего участка hAQC2, содержащего указанный комплекс при концентрации примерно от 1 до 50 мг на мл, например, приблизительно от 5 до 15 мг на мл (например, 11 мг на мл).VIII. Кристаллические структуры и структурные координаты. Настоящее изобретение также относится к трехмерной структуре кристалла, включая комплекс мутантного RH, и Fab-фрагмент hAQC2 с разрешением 2,8(пример 24, см. ниже). Трехмерные структуры других родственных кристаллов могут быть также определены описанными здесь методами и мето- 12006705 дами, известными специалистам. Трехмерная структура этого комплекса определяется набором структурных координат, представленных на фиг. 19. Такими структурными координатами являются атомные декартовы координаты, выведенные из математических уравнений, относящихся к картинам дифракции монохроматического луча рентгеновского излучения на атомах или на рассеивающих центрах кристаллического комплекса 1-I-домена и Fab-фрагмента hAQC2. Дифракционные данные сначала используют для вычисления карт электронной плотности повторяющегося элемента кристалла. Затем, такую карту электронной плотности используют для установления положения отдельных атомов указанного комплекса. Настоящее изобретение относится к молекуле или к молекулярному комплексу, определяемому всеми или частью структурных координат для всех аминокислот, представленных на фиг. 19, а также к гомологу указанной молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог имеет среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов этих аминокислот в пределах от 0,00 до 0,65 , таких как от 0,00 до 0,60(например, от 0,00 до 0,50 ). Термин "среднеквадратичное отклонение" или"ср.кв.от." означает квадратный корень из арифметического среднего квадратов отклонения от среднего. Этот термин означает отклонение или вариацию от тренда или объекта. В целях настоящего изобретения,термин "среднеквадратичное отклонение" или "ср.кв. позиционное отклонение" определяет изменение в остове белка по сравнению с соответствующей частью остова полипептида, определенного описанными здесь структурными координатами. Настоящее изобретение относится к молекуле или молекулярному комплексу, которые могут также включать сайт связывания, определенный структурными координатами и состоящий, по крайней мере, из семи аминокислот Fab-фрагмента hAQC2, выбранных из группы, включающей остатки легкой цепиAsn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тrр 95, и остатки тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53,His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Asp101 (кристаллическая нумерация) в соответствии с фиг. 19; или к гомологу указанной молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов одной или нескольких из указанных аминокислот в пределах от 0,00 до 1,10 , таких как от 0,00 до 1,00(например, от 0,00 до 0,50 ). Используемый здесь термин "сайт связывания" означает область молекулы или молекулярного комплекса, которая в результате ее формы и заряда, преимущественно ассоциируется с другой химической структурной единицей. Термин "сайт" включает, но не ограничиваются ими, канавку, щель, канал или карман. Так, например, сайты связывания на 1-I-домене могут включать сайт связывания с коллагеном (Emsley et al., 1997, см.выше), сайт связывания с антителом и аллостерический сайт связывания(или IDAS) (Huth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5231-5236). Термин "химическая структурная единица" включает, но не ограничивается ими, любую молекулу, молекулярный комплекс, соединение или его фрагмент. Термин "ассоциированный с" относится к ассоциации или связыванию, приводящему в состояние непосредственной близости между химической молекулой или ее частью и связывающим"карманом" или сайтом связывания на белке. Это связывание может быть нековалентным, где непосредственно близкое расположение является энергетически выгодным с точки зрения водородных связей или с точки зрения ван-дерваальсовских или электростатических взаимодействий, либо оно может быть ковалентным. Настоящее изобретение относится к молекуле или молекулярному комплексу, которые могут включать сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислот 1-I-домена, выбранных из группы, состоящей из остатков Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219,Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu2 94 (кристаллическая нумерация) в соответствии с фиг. 19; или к гомологу указанной молекулы или молекулярного комплекса,где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот 1-I-домена в пределах от 0,00 до 0,92 . Настоящее изобретение относится к молекуле или молекулярному комплексу, которые могут также включать сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислот 1-I-домена, выбранных из группы, состоящей из остатков Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристаллическая нумерация) в соответствии с фиг. 19; или к гомологу указанной молекулы или молекулярного комплекса,где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот 1-I-домена в пределах от 0,00 до 0,30. Каждому специалисту известно, что набор структурных координат для полипептида представляет собой относительное множество точек, которые определяют форму в трех измерениях. Так, например,возможно, что полностью отличающееся множество координат, которое определяет аналогичную или идентичную форму, может быть генерировано с использованием математических преобразований структурных координат, представленных на фиг. 19. Так, например, структурные координаты могут быть преобразованы путем кристаллографических перестановок структурных координат; получения дробных структурных координат; добавления к набору или вычитания из набора структурных координат целых чисел; обратного преобразования структурных координат или любых их комбинаций. Кроме того, небольшие отклонения в отдельных координатах будут оказывать незначительное влияние на общую фор- 13006705 му. Альтернативно, модификация кристаллической структуры, обусловленная мутациями, такими как добавления, замены и/или делеции аминокислот, или другими изменениями любого из полипептидных компонентов (например, Fab-фрагмента hAQC2 или 1-I-домена) , и способствующая образованию кристалла, может быть также ответственна за изменения в структурных координатах. Если такие изменения не выходят за пределы среднеквадратичной ошибки по сравнению с исходными координатами, то полученная трехмерная форма может рассматриваться как форма, аналогичная форме немодифицированного кристалла. Поэтому необходимо определить, имеет ли данная молекула достаточное сходство со всей описанной здесь структурой или ее частью, такое, чтобы ее можно было считать аналогичной. Такие анализы могут быть осуществлены с использованием существующих прикладных программ, таких как QUANTAA47:110-119) с прилагаемым к ним руководствами для пользователя. Прикладная программа MolecularSimilarity QUANTA и LSQ-приложение О позволяет проводить сравнение между различными структурами, различными конформациями той же самой структуры и различными частями той же самой структуры. Общая процедура, используемая в обоих приложениях, предусматривает ввод данных сравниваемых структур, определение эквивалентных атомных положений в этих структурах, осуществление операции подбора и анализ результатов. При вводе каждой структуры в данное приложение ей присваивается имя, и она идентифицируется как фиксированная структура или как подвижная структура. Атомную эквивалентность обычно определяют по эквивалентным атомам, таким как атомы скелета белка (N, С, С и О) для всех консервативных остатков между двумя сравниваемыми структурами. Подвижную структуру перемещают и вращают для получения оптимального соответствия или аппроксимации методом наименьших квадратов с фиксированной структурой. В обеих программах, среднеквадратичное отклонение при подборе конкретных пар эквивалентных атомов выражают в ангстремах. В соответствии с настоящим изобретением, любой молекулярный комплекс, который имеет среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов консервативных остатков (N, С, С и О) , находящееся в пределах от 0,00 до 1,50, таких как от 0,00 до 1,00(например, от 0,00 до 0,50), при сопоставлении путем суперпозиции с соответствующими каркасными атомами, определяемыми структурными координатами, представленными на фиг. 19, рассматривается как идентичный. IX. Определение других кристаллических структур Структурные координаты, представленные на фиг. 19, могут быть также использованы для получения информации о структуре другой кристаллизованной молекулы, такой как другое антитело hAQC2, содержащее аминокислотные замены в одной из своих CDR. Это может быть достигнуто любыми хорошо известными методами, включая молекулярную замену, которая является особенно подходящим методом определения структур мутантов и гомологов 1-I-домена/Fаb. Структурные координаты, представленные на фиг. 19, могут быть также использованы для определения, по крайней мере, части трехмерной структуры молекул, которые содержат по крайней мере некоторые структурные признаки, аналогичные по крайней мере части 1-I-домена или Fab-фрагментаhAQC2. Поэтому, в другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу использования молекулярных замен для получения информации о структуре кристаллизованной молекулы или молекулярного комплекса с неизвестной структурой, где указанный способ включает стадии: (а) получения рентгенограммы указанной кристаллизованной молекулы или молекулярного комплекса; и (b) нанесения, по крайней мере, части структурных координат, представленных на фиг. 19, на рентгенограмму для получения трехмерной карты электронной плотности данной молекулы или молекулярного комплекса с неизвестной структурой. С применением метода молекулярной замены, все или часть структурных координат, представленных на фиг. 19, могут быть использованы для более быстрого и эффективного определения неизвестной структуры кристаллизованной молекулы, чем это было осуществлено при попытке получения таких данных ab initio. Молекулярная замена позволяет дать точную оценку фаз для неизвестной структуры. Фазы являются независимой переменной в уравнениях, используемых для разрешения кристаллических структур, которые не могут быть определены прямым методом. Получение точных значений для этих фаз не путем молекулярной замены, а другими методами, часто может быть трудоемким процессом, который занимает много времени и включает итеративные циклы аппроксимации и уточнения, а поэтому является очень трудным для разрешения кристаллических структур. Однако при разрешении кристаллической структуры белка, содержащего, по крайней мере, гомологичную часть, фазы известной структуры, в большинстве случаев, позволяют дать достаточно точную оценку фаз для неизвестной структуры. Таким образом, молекулярные замены позволяют генерировать предварительную модель молекулы или молекулярного комплекса с неизвестными структурными координатами путем ориентирования и позиционирования соответствующей области данного комплекса, в соответствии с фиг. 19, в пределах элементарной ячейки кристалла неизвестной молекулы или молекулярного комплекса, так, чтобы она наилучшим образом соответствовала наблюдаемой дифракционной картине рентгеновских лучей на кри- 14006705 сталлах молекулы или молекулярного комплекса, структура которых неизвестна. Затем исходя из этой модели могут быть вычислены фазы и объединены с амплитудами наблюдаемой дифракционной картины рентгеновских лучей для построения карты электронной плотности для структуры с неизвестными координатами. Эта карта, в свою очередь, может быть подвергнута любому моделированию хорошо известными методами и уточнению структуры с получением конечной точной структуры неизвестной кристаллической молекулы или молекулярного комплекса (Lattman, 1985, Meth. Enzymol. 115:55-77; Rossmann, ed., "The Molecular Replacement Method", Int.Sci.Rev.Ser., No.13, GordonBreach, New-York, 1972). Таким методом может быть определена структура в любой точке любой кристаллизованной молекулы или молекулярного комплекса, которые являются достаточно гомологичными любой части 1-I-домена и/или Fab-фрагмента hAQC2 (в соответствии с фиг. 19).X. Компьютер и среда для хранения информации. Обычно, для использования структурных координат настоящего изобретения, например, координат,представленных на фиг. 19, их необходимо преобразовать в трехмерное представление или в трехмерную форму. Существующие коммерчески доступные графические пакеты программ, включая, но не ограничиваясь ими, О (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119) и INSIGHTII (Accerlys, Inc. и Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA), позволяют генерировать трехмерные представления молекул или молекулярных комплексов или их частей, исходя из набора структурных координат. В соответствии с настоящим изобретением, структурные координаты молекул настоящего изобретения хранятся в носителе данных, считываемых машиной (например, компьютером). С использованием компьютера и соответствующего программного обеспечения, эти данные могут быть использованы в различных целях, таких как разработка лекарственного средства и рентгеноструктурный анализ других кристаллических белков. В соответствии с этим, среда для хранения машинно-считываемых данных может включать материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, включая, по крайней мере,часть структурных координат, представленных на фиг. 19. Данный компьютер может, кроме того, включать команды для создания трехмерных представлений молекулярных комплексов 1-I-домена и Fabфрагмента hAQC2 путем обработки машинно-считываемых данных настоящего изобретения. Компьютер настоящего изобретения может также включать дисплей, графический интерфейс для отображения на дисплее, или входное устройство для перемещения и преобразования трехмерного графического представления структурных координат. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для определения, по крайней мере, части структурных координат, соответствующих рентгеноструктурным данным, полученным для молекулярного комплекса 11-интегрина и Fab-фрагмента антитела hAQC2, где указанный компьютер включает носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированных машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат, по крайней мере, часть структурных координат молекулярного комплекса 1-I-домена и Fab-фрагмент hAQC2, представленных на фиг. 19,или рентгеноструктурные данные, полученные для указанного кристаллического молекулярного комплекса. Указанный компьютер, кроме того, включает команды для осуществления преобразования Фурье машинно-считываемых данных координат и команды для преобразования этих машинно-считываемых дифракционных данных в структурные координаты. Указанный компьютер может, кроме того, включать: рабочую память для хранения команд для преобразования машинно-считываемых данных; центральный процессор, связанный с рабочей памятью и машинно-считываемыми данными; и, необязательно, графический интерфейс или дисплей, связанный с центральным процессором для отображения трехмерного графического представления структурных координат данной молекулы или молекулярного комплекса. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для получения трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, определенных, по крайней мере, частью или всеми структурными координатами всех аминокислот 1-I-домена или Fab-фрагмента hAQC2, представленных на фиг. 19, или гомолога данной молекул или молекулярного комплекса, где указанный гомолог имеет среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов этих аминокислот в пределах от 0,00 до 1,50 , таких как от 0,00 до 1,00(например, от 0,00 до 0,50 ). Кроме того, компьютер настоящего изобретения включает: носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат по крайней мере часть или все структурные координаты аминокислот 1-I-домена и Fab-фрагмента hAQC2, представленных на фиг. 19. Компьютер настоящего изобретения может также продуцировать трехмерное изображение молекулы или молекулярного комплекса, включающего сайт связывания, где указанный сайт связывания может быть определен структурными координатами и содержит по крайней мере семь аминокислот Fabфрагмента hAQC2, выбранных из группы, включающей остатки легкой цепи Asn30, Tyr48, Тrр 90, Ser91,Asn93 и Тrр 95 и остатки тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 иAsp101 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или гомолога молекулы или молекуляр- 15006705 ного комплекса, где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов, по крайней мере, для одной аминокислоты Fab-фрагмента hAQC2 в пределах от 0,00 до 1,10 , таких как от 0,00 до 1,00(например, от 0,00 до 0,50 ). Кроме того,компьютер настоящего изобретения включает носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат структурные координаты, по крайней мере, семи аминокислот Fab-фрагмента hAQC2, выбранных из группы, состоящей из остатков легкой цепи Asn30, Tyr4 8, Trp90, Ser91, Asn93 и Тrр 95 и остатков тяжелой цепи Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Asp101 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для получения трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, включающего: сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислотных остатков домена I, выбранных из группы, состоящей из остатков Asp154,Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257,His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или гомолога молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает сайт связывания, имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I, составляющее от 0,00 до 0,92 . Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, указанный компьютер включает: носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинно-считываемыми данными, где указанные данные содержат структурные координаты аминокислот домена I, выбранных из группы, состоящей из остатков Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92,Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19. Настоящее изобретение также относится к компьютеру для получения трехмерного представления молекулы или молекулярного комплекса, включающего сайт связывания, определенный структурными координатами аминокислот домена I, выбранных из группы, состоящей из остатков Glu192, Gln218,Arg219, Gly220 и Gly221 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19; или гомолога указанной молекулы или указанного молекулярного комплекса, где указанный гомолог включает сайт связывания,имеющий среднеквадратичное отклонение от каркасных атомов аминокислот домена I, составляющее в пределах от 0,00 до 0,30 . Кроме того, компьютер настоящего изобретения включает носитель машинно-считываемых данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машинносчитываемыми данными, где указанные данные содержат структурные координаты аминокислот доменаI, выбранных из группы, состоящей из остатков Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристаллическая нумерация), в соответствии с фиг. 19. На фиг. 21 продемонстрирован один из указанных вариантов. Система 10 включает компьютер 11,содержащий центральный процессор ("ЦП") 20, рабочую память 22, которая может представлять собой,например, RAM (память с произвольным доступом) или оперативную память; массовую память (память большой емкости) 24 (такую как один или несколько дисководов или ленточных накопителей или приводCD-ROM или DVD-ROM), один или несколько дисплеев с катодно-лучевой трубкой ("КЛТ") 26; одну или несколько клавиатур 28, одну или несколько входных шин 30, и одну или несколько выходных шин 40, все из этих комплектующих соединены между собой стандартной двухнаправленной системной шиной 50. Аппаратное средство для ввода 36, связанное с компьютером 11 входными шинами 30, может быть реализовано различными путями. Машинно-считываемые данные настоящего изобретения могут быть введены с использованием модема или модемов 32, подключенных посредством телефонной линии или выделенной линии связи 34. Альтернативно или дополнительно, аппаратное средство для ввода 36 может включать дисководы CD-ROM или DVD-ROM, либо ленточный или дисковый накопители 24. В качестве аппаратного средства для ввода может быть использована клавиатура 28, подключенная к дисплею 26. Аппаратное средство для вывода 46, связанное с компьютером 11 выходными шинами 40, может быть аналогичным образом реализовано с использованием стандартных устройств. Так, например, аппаратное средство для вывода 46 может включать дисплей на ЭЛТ 26 для отображения графического представления сайта связывания настоящего изобретения, осуществляемого с использованием программыQUANTA, описанной в настоящей заявке. Аппаратное средство для вывода может также включать принтер 42, для получения документированных копий, или дисковод 24, для сохранения системных выходных данных для последующего использования. При работе, ЦП 20 координирует использование различных аппаратных средств для ввода и вывода, 36, 46, координирует вызов данных из массовой памяти 24 и доступ к рабочей памяти и вызов данных из этой рабочей памяти 22, и определяет последовательность стадий обработки данных. Для обработки машинно-считываемых данных настоящего изобретения может быть использован ряд программ. Эти программы обсуждаются при описании вычислительных методов, применяемых для разработки лекарственных средств, как описано в настоящей заявке. Конкретные ссылки на компоненты аппаратной системы 10 приводятся, если это необходимо, на протяжении всего описания носителя данных. На фиг. 22 показано поперечное сечение магнитного носителя информации 100, который может- 16006705 быть закодирован машинно-считываемыми данными, которые затем переносятся системой, такой как система 10, показанная на фиг. 21. Носитель 100 может представлять собой обычную гибкую дискету или жесткий диск, имеющий подходящую подложку 101, которая может быть стандартной подложкой,или подходящее покрытие 102, нанесенное с одной или с обеих сторон, и содержащее магнитные домены(не показаны), полярность и ориентация которых может быть изменена с помощью магнита. Носитель 100 может также иметь отверстие (не показаны) для шпинделя дисковода или для другого запоминающего устройства 24. Магнитные домены покрытия 102 носителя 100 поляризуют или ориентируют так, чтобы они соответствующим образом кодировали машинно-считываемые данные, такие как описанные здесь данные,способом, который может быть приемлемым для работы системы, такой как система 10, представленная на фиг. 21. На фиг. 23 показано поперечное сечение носителя 110 для хранения оптически считываемых данных, который также может быть закодирован такими машинно-считываемыми данными или набором команд, которые могут выполняться системой, такой как система 10, фиг. 21. Носитель 110 может представлять собой стандартный компакт-диск или DVD-диск (CD-ROM или DVD-ROM), доступный только для чтения, или перезаписываемую среду, такую как магнито-оптический диск, который является оптически считываемым и магнито-оптически записываемым диском. Носитель 100 имеет подходящую подложку 111, которая может быть стандартной, и подходящее покрытие 112, которое может быть стандартным, и обычно наносится с одной стороны подложки 111. Хорошо известно, что в случае CD-ROM, покрытие 112 является отражающим и на нем отпечатано множество "питов" 113 для кодирования машинно-считываемых данных. Расположение питов считывается отражающим лазерным лучом с поверхности покрытия 112. Поверх покрытия 112 наносится защитное покрытие 114, которое является, в основном, прозрачным. Хорошо известно, что в случае магнито-оптического диска, покрытие 112 не имеет питов 113, но имеет множество магнитных доменов, полярность или ориентация которых может быть изменена под действием магнитного поля при нагревании выше определенной температуры, или под действием лазера(не показан). Ориентация доменов может считываться путем измерения поляризации лазерного луча,отражаемого поверхностью 112. Расположение доменов кодирует данные, описанные выше.XI. Рациональная разработка лекарственных средств. Настоящее изобретение позволяет использовать структурные данные и рациональные методы разработки лекарственных средств для получения, отбора, синтеза или выделения химических молекул, таких как ингибиторы 1-I-домена, и для улучшения свойств известных ингибиторов этого домена. Эти ингибиторы могут блокировать коллаген-связывающий сайт VLA-1. Настоящее изобретение также позволяет использовать структурные данные и рациональные методы разработки лекарственных средств для получения вариантов, которые могут действовать как ингибиторы связывания с коллагеном. В соответствии с настоящим изобретением, трехмерное представление может быть использовано в экспериментах или в вычислительных методах для получения потенциальных ингибиторов, других химических молекул, вариантов Fab-фрагмента или комбинаций химических молекул, которые могут связываться с Fab-фрагментом hAQC2 или с химерным 1-I-доменом настоящего изобретения и влиять на их биологические функции. Каждый специалист может использовать один из нескольких методов для скрининга химических молекул на их способность ассоциироваться с комплексом Fab-фрагмента hAQC2 или химерного 1-Iдомена настоящего изобретения, а более конкретно, с сайтом связывания либо домена I, либо Fabфрагмента. Этот способ может начинаться с визуальной оценки, например, сайта связывания либо для домена I или для Fab-фрагмента на мониторе компьютера, исходя из координат комплекса, представленных на фиг. 19. Затем выбранные химические молекулы могут быть позиционированы в различных ориентациях или "посажены" в отдельном сайте связывания домена I или Fab-фрагмента. Докинг ("посадка") может быть осуществлен с использованием программы, такой как QUANTA, с последующей минимизацией энергии и с использованием молекулярной динамики и механики со стандартными молекулярными силовыми полями в соответствии с такой программой, как CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA, 1994) и AMBER (P.A. Kollman, University of California at San Francisco, 1994). Для облегчения процесса отбора химических молекул могут быть также использованы специализированные компьютерные программы. Такие программы включают, inter alia. 1. GRID (Goodford, P. J., 1985, J. Med. Chem. 28:849-857). GRID поставляется Oxford University, Oxford, UK. 2. MCSS (Miranker A.M. Karplus, 1991, Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34). MCSS поставляется Molecular Simulations, Burlingthon, MA. 3. AUTODOCK (Goodsell, D.S.A.J.Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function and Genetics 8:195202). AUTODOCK поставляется Scripps Research Institute, La Jolla, CA. 4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., 1982, J. Mol. Biol. 161:269-288). DOCK поставляется University of California, San Francisco, CA.- 17006705 После отбора подходящих частей химических молекул они могут быть собраны в одно соединение. Такая сборка может быть осуществлена путем визуальной оценки взаимосвязи указанных молекулярных структурных единиц друг с другом в трехмерном представлении, отображаемом на мониторе компьютера, в отношении структурных координат комплекса Fab-фрагмента hAQC2 и химерного 1-I-домена. Это может быть осуществлено с помощью мануального построения модели с использованием таких программ как Quanta или Sybyl. Вышеуказанный способ оценки для химических структурных единиц может быть осуществлен аналогичным образом для тех соединений или их вариантов, которые могут связываться с 1-I-доменом. Программы, которые могут быть использованы специалистами для объединения отдельных химических структурных единиц, включают: 1. CAVEAT (Bartlett, P. A. et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design ofBiologically Active Molecules". In "Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub. 1989,Royal Chem. Soc, 78:182-196). CAVEAT поставляется University of California, Berkeley, CA. 2. Системы базы данных 3D, такие как MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Эта область описана у Martin Y.C., 1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154. 3. HOOK (поставляемая от Molecular Simulations, Burlington, MA). Вместо осуществления постадийной сборки ингибитора или связывающего соединения, то есть,сборки по одной химической структурной единице за раз, как описано выше, можно сконструировать связывающее соединение как одно целое или "de novo" с использованием либо "пустого" сайта связывания (такого как сайт связывания 1-I-домена или Fab-фрагмента hAQC2), либо, но необязательно, включения определенной части (частей) известного соединения, связывающегося с 1-I-доменом или Fabфрагментом hAQC2. Эти способы предусматривают использование программ: 1. LUDI (Bohm H.J., 1992, J.Comp. Aid. Molec. Design 6:61-78). LUDI поставляется Biosym Technologies, San Diego, CA. 2. LEGEND (Nishibata, Y.A. Itai, 1991, Tetrahedron 47: 8985). LEGEND поставляется MolecularSimulations, Burlington, MA. 3. LeapFrog (поставляется Tripos Associates, St. Louis, MO). В соответствии с настоящим изобретением могут быть также использованы и другие методы молекулярного моделирования. См. например, Cohen N.C. et al., 1990, J.Med.Chem. 33:883-894. См. также Navia M.A.M.A. Murcko, 1992, Curr.Opin.Struct.Biol. 2:202-210. После конструирования или отбора структурной единицы вышеуказанными методами эффективность, с которой эта структурная единица может связываться с 1-I-доменом или с Fab-фрагментомhAQC2, может быть оценена и оптимизирована вычислительными методами. Так, например, соединение,которое может быть сконструировано или отобрано на его способность действовать как соединение, связывающееся с 1-I-доменом, может пересекать, но не перекрывая, объем, занимаемый сайтом связывания при его связывании с химерным 1-I-доменом. Эффективное соединение, связывающееся с 1-Iдоменом, может иметь относительно небольшую разницу в энергиях в его связанном и свободном состояниях (то есть, небольшую энергию деформации при связывании). Таким образом, наиболее эффективное соединение, связывающееся с 1-I-доменом, должно быть сконструировано так, чтобы его энергия деформации при связывании не превышала примерно 10 ккал/моль, например, не превышала 7 ккал/моль. Соединения, связывающиеся с 1-I-доменом, могут взаимодействовать с 1-I-доменом в более, чем одной конформации, которая является аналогичной в отношении общей энергии связывания. В этих случаях энергия деформации при связывании выражается как разница между энергией свободного соединения и средней энергией конформаций, наблюдаемых при связывании соединения с белком. Соединение, сконструированное или отобранное как соединение, связывающееся с 1-I-доменом,может быть, кроме того, оптимизировано вычислительными методами так, чтобы при его связывании с белком-мишенью не наблюдалось взаимного электростатического отталкивания. Такими некомплементарными (например, электростатическими) взаимодействиями являются взаимное отталкивание при взаимодействии "заряд-заряд", "диполь-диполь" и "заряд-диполь". В частности, сумма всех электростатических взаимодействий между соединением и белком при связывании этого соединения с 1-Iдоменом, должна оказывать нейтральное или благоприятное воздействие на энтальпию связывания. Для оценки энергии деформации соединения и электростатического взаимодействия имеются специальные компьютерные программы. Примеры программ, разработанных для этих целей, включают:Gaussian 92, revision С (M.J. Frisch, Gaussian, Inc. Pittsburgh, PA 1992); AMBER, version 4.0 (P.A. Kollman,University of California at San Francisco, 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA, 1994); и Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA, 1994). Эти программы могут быть реализованы, например, с использованием рабочей станции Silicon Graphics. Имеются и другие системы аппаратных средств и пакеты программ, известные специалистам. Другим подходящим способом разработки лекарственных средств, который может быть использован в целях настоящего изобретения, является итеративное конструирование лекарственных средств. Итеративное конструирование лекарственных средств представляет собой метод оптимизации ассоциа- 18006705 ций между белком и соединением (которое включает антитело) путем определения и оценки трехмерных структур последовательного набора комплексов белок/соединение. При итеративном конструировании лекарственных средств, может быть получена серия кристаллов белков, образующих комплекс со структурными единицами, связывающимися с белком, а затем может быть разрешена трехмерная структура каждого молекулярного комплекса. Такой подход дает представление об ассоциациях между белками и другими структурными единицами каждого комплекса. Это может быть осуществлено путем отбора химических структурных единиц с ингибирующей активностью, получения кристаллов этих новых комплексов, разрешения трехмерной структуры этих комплексов и сравнения этих ассоциаций между новыми комплексами и комплексами с уже разрешенной структурой. Ассоциации в комплексах могут быть оптимизированы путем наблюдения, какие именно изменения компонентов данного комплекса влияют на ассоциацию. В некоторых случаях итеративное конструирование лекарственных средств осуществляют путем формирования последовательных комплексов с последующей кристаллизацией каждого нового комплекса. Альтернативно, предварительно полученный кристалл белка смачивают в присутствии другой химической структурной единицы, что позволяет сформировать комплекс и при этом избежать необходимости кристаллизовать каждый отдельный комплекс.XII. Фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат один или несколько антагонистов VLA-1 настоящего изобретения (например, анти-VLA-l антител и антагонистов VLA-1 с небольшой молекулярной массой, идентифицированных вышеописанными методами рационального конструирования лекарственных средств), или их фармацевтически приемлемые производные. Кроме того, эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, такой как адъювант, наполнитель, буфер и стабилизатор. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть введены перорально, местно,внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, внутриартериально,внутрисуставно, интрасиновиально, внутригрудинно, подоболочечно, внутрипеченочно, интраспинально и интракраниально, если это необходимо, либо нанесены непосредственно на участки воспаления или роста опухоли. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть также введены путем ингаляции с использованием, например, аэрозольного распылителя, инсуффлятора или ингалятора с регулируемой дозой, либо путем имплантации индивидууму инфузионного насоса или биологически совместимого имплантата с пролонгированным высвобождением лекарственного средства. Фармацевтические композиции могут быть получены в форме стерильного инъецируемого препарата, например, стерильно инъецируемой водной или масляной суспензии. Эта суспензия может быть приготовлена методами, известными специалистам, с использованием подходящих диспергирующих,смачивающих и суспендирующих агентов. При пероральном применении фармацевтические композиции могут быть введены в форме капсул, таблеток, водных суспензий или растворов. Для местного применения фармацевтические композиции могут быть получены в форме подходящей мази. Доза и частота введения дозы антагонистов VLA-1 настоящего изобретения, эффективные для продуцирования нужного действия, зависят от ряда факторов, таких как природа заболевания, подвергаемого лечению, веса индивидуума, цели лечения, конкретно используемой фармацевтической композиции и назначения лечащего врача. Дозы соединения, используемого в качестве активного ингредиента, составляют в пределах примерно от 0,001 до 100 мг/кг веса тела в день, например, примерно от 0,1 до 50 мг/кг веса тела в день. Так, например, антитело настоящего изобретения может быть введено в дозе, составляющей примерно от 0,01 мг/кг веса тела в день до 20 мг/кг веса тела в день, например, в пределах, примерно от 0,1 мг/кг веса тела в день до 10 мг/кг веса тела в день, и с интервалом через каждые 1-14 дней. В другом варианте осуществления изобретения, при внутрибрюшинном введении, доза вводимого антитела составляет примерно от 0,3 до 1 мг/кг веса тела. В еще одном варианте осуществления изобретения,при внутривенном введении, доза вводимого антитела составляет примерно от 5 до 12,5 мг/кг веса тела. В одном из вариантов осуществления изобретения, композицию антитела вводят в количестве, эффективном для продуцирования уровней антитела в плазме, составляющих, по крайней мере, 1 мг/мл.XIII. Патологические состояния и животные с моделями этих состояний. Антагонисты VLA-1 настоящего изобретения могут быть использованы для лечения, включая предупреждение, 11-опосредованных заболеваний, таких как заболевания, перечисленные выше. Лечение способами настоящего изобретения является эффективным как для человека, так и для животного с указанными состояниями. Животными, к которым может быть применено настоящее изобретение, являются домашние животные и крупный рогатый скот, а также домашние питомцы, или животные, используемые в коммерческих целях. Примерами таких животных являются собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи и козы. Эффективность антагонистов VLA-1 настоящего изобретения может быть протестирована на различных животных, используемых в качестве моделей. Так, например, используемые модели псориаза и артрита включают модели, описанные в WO 00/72881. Модели фиброза почек включают модели, описанные в WO 99/61040, модель нефротического синдрома Олпорта, описанную Cosgrove et al., 2000,- 19006705Am.J.Path., 157:1649-1659, и SNF1-мышиную модель волчаночного нефрита, описанную Kalled et al.,2001, Lupus 10:9-22. Модели васкулярного фиброза для рестеноза включают крысиную модель баллонного повреждения сонной артерии, описанную Smith et al., 1999, Circ. Res. 84:1212-1222. Модели фиброза легких для идиопатического фиброза легких и для ассоциированного со склеродермией фиброза легких включают индуцированную блеомицином модель фиброза легких, описанную Wang et al., 1999, Thorax 54:805-812. Модели цирроза печени для имитации цирроза печени, индуцированного гепатитом С или алкоголизмом, включают модель лигирования желчных протоков, описанную George et al., 1999,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12719-12724, и модель CCL4-индуцированного фиброза печени, описаннуюShi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10663-10668. Эффективность лечения способами настоящего изобретения может быть оценена рядом доступных диагностических методов, включая физическое обследование, анализ крови, измерение патологических изменений концентрации белка в моче, определение уровней креатинина и клиренса креатинина, тест на функцию легких, флюораграфия грудной клетки, бронхоскопия, бронхоальвеолярный лаваж, биопсия легких, измерения уровней азота мочи в крови (BUN), наблюдение и оценка рубцевания или фиброзных поражений, оценка отложения внеклеточного матрикса, такого как коллаген, актин гладкой мышцы и фибронектин, тесты на функцию почек, ультразвуковое исследование, визуализация методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР-томография) и компьютерное сканирование.XIV. Диагностические методы. Антитела настоящего изобретения могут быть использованы для диагностики патологических состояний с измененными уровнями экспрессии 11. Образец ткани, взятой у индивидуума, такой как биоптат ткани, проба физиологической жидкости или лаваж (например, альвеолярный лаваж), могут быть протестированы с помощью анализа методом "антигенной ловушки", анализа ELISA, иммуногистохимического анализа и аналогичных анализов с использованием антител. В качестве контроля используют образец ткани, взятый от нормального индивидуума. Настоящее изобретение может быть осуществлено, если это не оговорено особо, стандартными методами клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, с использованием техники рекомбинантных ДНК, методами, используемыми в химии белков и иммунологии, которые известны специалистам. Указанные методы описаны в литературе. См. например, MolecularImmunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo,1986. Если это не определено особо, то все технические и научные методы, используемые в настоящем описании, имеют свои обычные значения, понятные любому специалисту, работающему в области, к которой относится настоящее изобретение. Примеры методов и материалов приводятся ниже, хотя для осуществления на практите при проверке настоящего изобретения и проведения тестов в соответствии с настоящим изобретением могут быть также использованы методы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке. Все публикации и другие упомянутые здесь источники во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В случае разногласий,описание настоящей заявки, включая определения, будет служить основой для урегулировния споров. Описанные материалы, методы и примеры приводятся лишь в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение изобретения. В описании настоящего изобретения, слово "включать" или его варианты, такие как "включает" или "включающий" следует понимать как содержащие указанное целое число или группу целых чисел включительно, но не исключает любое другое целое число или группу чисел. Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение. Примеры Химические реагенты. Флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ) закупали у Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.). Кротоновое масло закупали у ICN Biochemicals (Aurora, OH). Цельную баранью кровь в растворе Олсвера получали от East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Коллаген из крысиного хвоста типа I и мышиный коллаген типа IV закупали у Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) и Gibco (Gaithersburg, MD), соответственно. Самок мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель закупали у Taconic (Germantown, NY), а дефицитные по 11-интегрину мыши с фенотипом Balb/с были описаны ранее (3). Пример 1. Моноклональные антитела.- 20006705 Функцию-блокирующую антитела (mAb) против мышиных антигенов получали в формате, не содержащем азида и содержащем низкий уровень эндотоксина: На 31/8 (антитело хомячка против CD49a; интегрин 1)(Mendrick et al., 1995. Lab. Invest. 72:367-375), Hal/29 (антитело хомячка против CD49b; интегрин 2) (1) (Mendrick et al., 1995. Lab.Invest. 72:367-375; Mendrick D.L.D.M.Kelly, 1993. Lab.D. L.D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702) и PS/2 (крысиное антитело против CD49d; цепь 41 интегрина) (Miyake et al., 1991, J. Exp.Med. 173:599-607). Кроме того, функцию-блокирующие mAb против мышиных антигенов закупали как препараты, не содержащие азида и имеющие низкий уровень эндотоксина, у Pharmingen (San Diego, СА); HM1-1 (антитело хомячка против CD29; цепь 1 интегрина)(Noto et al., 1995, Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (антитело хомячка против CD29; цепь интегрина 1) (Mendrick D. L.D.M. Kelly 1993, Lab. Invest. 69:690-702), 3E2 (антитело хомячка противCD49e; интегрин 5) (Kinashi Т.Т.A. Springer. 1994. Blood Cells. 20:25-44), GoH3 (крысиное антитело против CD49f; интегрин 6) (Sonnenberg et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383) и контрольные крысиные mAb изотипа R35-95 (крысиный IgG2a) и R35-38 (крысиный IgG2b). Анализ на адгезию. Спленоциты мышей Balb/c культивировали с 20 нг/мл IL-2 в течение 7-12 дней. Адгезия клеток к коллагену типа I и типа IV была описана ранее (Gotwals et al., 1996, J.Clin. Invest. 97:2469-2477). Вкратце, 96-луночные планшеты Maxisorp (Nunc, Napierville, IL) покрывали либо 10 мкг/мл коллагена типа IV, либо 5 мкг/мл коллагена типа I, и неспецифические сайты блокировали 1%BSA. IL-2-активированные спленоциты метили 2 мкМ BCECF [пентаацетоксиметиловый эфир 2',7'бис(карбокси-этил)-5(6)-карбоксилфлуоресцеина](Molecular Probes, Eugene, OR) и инкубировали с 10 мкг/мл указанных mAb в течение 15 мин. Затем в эти покрытые коллагеном лунки добавляли 105 клеток в 0,25% BSA в RPMI и инкубировали в течение 60 мин при 37 С. Несвязанные клетки удаляли путем трехкратной промывки 0,25% BSA в RPMI. Уровень адгезии количественно определяли на флуоресцентном планшет-ридере CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, MA). Затем измеряли отношение связанных клеток к введенным клеткам и вычисляли процент адгезии по отношению к клеткам, обработанным контрольным mAb (нормализовано на 100%). Фоновые величины, полученные для адгезии клеток на лунках,покрытых только BSA, вычитали. Экспрессия и функциональная блокада 11 и 21 на активированных лейкоцитах. Учитывая ключевую роль лейкоцитов в воспалении, авторы решили провести тест для того, чтобы выявить, способны ли анти-1 и анти-2 mAb блокировать адгезию лейкоцитов к коллагенам. Для того, чтобы получить лейкоциты, экспрессирующие высокие уровни 1 и 2, мышиные Т-клетки стимулировали in vitroIL-2 в течение 7-12 дней. Эти клетки экспрессировали высокие уровни как 1, так и 2 (фиг. 1 А), и хорошо связывались с поверхностями, покрытыми коллагеном типа IV и коллагеном типа I (фиг. 1 В). Адгезия к коллагену типа IV частично ингибировалась только одним анти-1 mAb, и не ингибировалась анти-2 mAb, взятым отдельно. В противоположность этому, адгезия к коллагену типа I полностью ингибировалась анти-2 mAb, а анти-1 mAb, взятое отдельно, обнаруживало лишь частичное ингибирование. Как анти-1 mAb, так и комбинация анти-1 и анти-2 mAb полностью ингибировали адгезию к коллагену типов I и IV. Поскольку было продемонстрировано, что 1,1 и 2,1-интегрины экспрессируются на активированных Т-клетках, и что анти-1 и анти-2 mAb обладают способностью функционально блокировать адгезию лейкоцитов к коллагенам, авторы настоящего изобретения использовали этиmAb для исследования in vivo роли этих интегринов у животных с моделями воспалительных заболеваний. Пример 2. Ингибирование ГЗТ-ответов антителами (mAb) против интегрина. SRBCиндуцированные реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) были адаптированы исходя из ранее опубликованного протокола (Hurtrel et al., 1992, Cell Immunol. 142:252-263). Вкратце, мышей иммунизировали подкожно (s.c.) в спинку 2 х 107 SRBC в 100 мкл PBS на день 0. На 5-й день мышам инъецировали s.c. 1 x 108 SRBC в 25 мкл PBS в подушечку правой задней лапы. Через 20 ч после стимуляции антигеном толщину подушечки лапы измеряли инженерным штангенциркулем (Mitutoyo/MTI, Paramus,NJ) и определяли степень опухания подушечки лапы. Результаты выражали как средний процент увеличения толщины подушечки лапы + ср.кв.от. и вычисляли по формуле: % увеличения = [1-(толщина подушечки правой лапы через 20 ч после стимуляции антигеном/толщина подушечки неинъецированной левой лапы через 20 ч после стимуляции антигеном)] х 100. Для блокирования эффекторной фазы SRBCиндуцированного ГЗТ-ответа, на 5-й день за 1 ч до стимуляции антигеном, мышам i.p. инъецировали терапевтическое или контрольное mAb (100 мкг), которое было получено методами, описанными в примере 1.SRBC-индуцированный ГЗТ-ответ представляет собой хорошо охарактеризованную in vivo-модель воспаления, а в частности, псориаза, которая была использована для демонстрации важной роли ряда цитокинов и адгезивных молекул в воспалении (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181:2259-2264, Terashitaet al., 1996, J. Immunol. 156:4638-4643). 3a 1 ч до стимуляции антигеном подушечки лапы, SRBCсенсибилизированным мышам вводили mAb против интегрина, и через 20 ч оценивали степень воспале- 21006705 ния путем измерения увеличения толщины подушечки лапы. Мыши, обработанные PBS и контрольнымIg хомячка, обнаруживали 60-70% увеличение толщины подушечки лапы через 20 ч после стимуляции антигеном (фиг. 2). По сравнению с обработкой контрольным Ig хомячка, обработка анти-1 или анти-2mAb приводила к 68%-ному и 60%-ному уменьшению толщины подушечки лапы, соответственно. Комбинация анти-1 и анти-2 mAb давала 71%-ное ингибирование, что продемонстрировало небольшой аддитивный эффект по сравнению с эффектами анти-1 mAb или анти-2 mAb, взятых отдельно. Обработка другими mAb против интегрина была также эффективна в ингибировании эффекторного ГЗТответа. Степень ингибирования, наблюдаемая при обработке различными mAb, составляла 49% (анти 4), 23% (анти-5) и 57% (анти-6). И наконец, mAb-блокирование наиболее распространенной субъединицы 1 интегрина (mAb HMBI-1) приводило к 67%-ному ингибированию эффекторного ГЗТ-ответа. Пример 3. Ингибирование эффекторных КГ-ответов антителами (mAb) против интегрина. Контактную гиперчувствительность (КГ) в ответ на действие ФИТЦ анализировали как описано ранее (Gaspari et al., 1991,In Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach,W.Strober, editors. John WileySons, New York, Section 4,2:1). Вкратце, мышей сенсибилизировали путем нанесения 100 мкл 0,5% ФИТЦ в ацетоне/дибутилфталате, 1:1, на выбритую спинку на день 0. Через 10 дней животным наносили 5 мкл 0,5% ФИТЦ на обе стороны каждого уха. Реакцию опухания уха определяли по толщине уха, измеренной инженерным штангенциркулем (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ), во время стимуляции антигеном (день 10) и через 24 ч, и результаты выражали как средний процент увеличения толщины уха (начиная с базового значения)ср.кв.от. Увеличение толщины уха вычисляли по формуле:% увеличения = [1-(толщина уха через 24 ч после стимуляции антигеном/толщина уха во время стимуляции антигеном)] х 100. Для блокирования эффекторной фазы КГ-ответа, на 10-й день за 4 ч до стимуляции антигеном, мышам i.p. инъецировали терапевтическое или контрольное mAb (250 мкг). Мыши, которые были сенсибилизированы антигеном и ухо которых было подвергнуто воздействию только носителя(носитель-контроль), или мыши, ухо которых было стимулировано антигеном без предварительной сенсибилизации (раздражающий контроль), служили в качестве негативного контроля (увеличение толщины уха никогда не превышало 2%). Учитывая, что, по своему механизму, КГ отличается от ГЗТ, и что в этих реакциях участвуют различные эффекторные клетки, авторами было исследовано действие mAb против интегрина на эффекторную фазу КГ-ответа. Мышей сенсибилизировали гаптеном с использованием ФИТЦ, наносимого на их выбритые спинки, а затем через 10 дней проводили ФИТЦ-стимуляции уха, что приводило к воспалительному ответу на следующий день. ФИТЦ-сенсибилизированные мыши продемонстрировали 60-70% увеличение толщины уха через 24 ч после стимуляции антигеном (фиг. 3). В соответствии с опубликованными результатами (Scheynius et al., J. Immunol. 150:655-663), обработка анти-ICAM-l mAb приводила к 51%-ному ингибированию опухания уха. По сравнению с контрольным mAb хомячка, обработка мышей анти-1 или анти-2 mAb за 4 ч до стимуляции антигеном приводила к 37 и 57% ингибированию опухания уха, соответственно (фиг. 3). Комбинация анти-1 и анти-2 mAb давала несколько более высокую степень ингибирования опухания уха (65%). Обработка другими mAb против 1 интегринов показала, что хотя анти-4 и анти-5 mAb не оказывали ингибирующего действия на ФИТЦ-индуцированный эффекторный КГ-ответ по сравнению с контрольным крысиным mAb, однако, обработка анти 6 mAb приводила к 86%-ному ингибированию эффекторных ответов. И наконец, mAb-блокирование наиболее распространенной субъединицы 1-интегрина приводило к 74%-ному ингибированию эффекторных КГ-ответов. Аналогичные результаты для КГ были получены с использованием различных штаммов мышей (C57/BL6, 129/Sv) и другого сенсибилизирующего агента (оксазолона)(данные не приводятся). Аналогично результатам, наблюдаемым в SRBC-индуцированной ГЗТ-модели, гистологический анализ ушей с воспалением показал, что как образование отека, так и инфильтрация лейкоцитов ингибировались посредством обработки анти-1 и анти-2 mAb. Исходя из обнаружения того факта, что 1l и 2l могут экспрессироваться на IL-2 активированных спленоцитах, анализ лимфатических узлов сенсибилизированных антигеном мышей(ФИТЦ или оксазолоном) показал, что 11 и 21 экспрессируются исключительно на СD44hi-LFА-1hiактивированных CD4+- и CD8+-T-клетках (данные не приводятся). Обработка мышей анти-1 и анти-2mAb не приводила к уничтожению этих клеток, поскольку некоторое количество активированных Тклеток как в селезенке, так и лимфоузлах, наблюдаемое в ответ на сенсибилизацию антигеном в КГмодели, оставалось неповрежденным. Кроме того, эффекторные клетки не были функционально делетированы, поскольку продолжительная обработка сенсибилизированных антигеном мышей анти-1 и анти 2 mAb (дни 10-16) не оказывала какого-либо влияния на воспалительный ответ у мышей, стимулированных антигеном на день 20 (данные не приводятся). Пример 4. Эффекторные КГ-ответы снижались у 11-дефицитных мышей. Для того, чтобы исключить возможность mAb-опосредования ингибирующей роли 11 в эффекторном ФИТЦопосредованном КГ-ответе, были проведены эксперименты на мышах дикого типа и на мышах, дефи- 22006705 цитных по 11-интегрину (фиг. 4). mAb-Ингибирование эффекторной фазы у мышей дикого типа соответствовало предыдущим результатам, причем с использованием анти-1 mAb наблюдалось 56%-ное уменьшение толщины уха, с использованием анти-2 mAb наблюдалось 56%-ное уменьшение толщины уха, а с использованием комбинации анти-1 и анти-2 mAb наблюдалось 62%-ное уменьшение толщины уха. Эффекторная фаза КГ значительно снижалась у необработанных 11-дефицитных мышей по сравнению с необработанными мышами дикого типа (увеличение толщины уха составляло 30% против 71%, соответственно). Как и ожидалось, уровень опухания уха у необработанных 11-дефицитных мышей был эквивалентен уровню опухания уха, наблюдаемого у мышей дикого типа, обработанных анти 1 mAb. И наконец, mAb-блокирование 21 у 11-дефицитных мышей приводило лишь к небольшому увеличению ингибирования опухания уха, что соответствовало результатам, наблюдаемым у мышей дикого типа, обработанных комбинацией анти-1 и анти-2 mAb. Пример 5. Для исключения возможности того, что ингибирующий эффект mAb против интегрина,наблюдаемый в ГЗТ- и КГ-моделях воспаления, вызывается общим противовоспалительным действием,опосредуемым анти-1 и анти-2 mAb, было исследовано влияние этих mAb на дерматит, вызываемый раздражением. Для оценки дерматита, вызываемого раздражением, на ухо каждой мыши, с обеих сторон, наносили 5 мкг 0,8% кротонового масла в ацетоне. За 4 ч до нанесения раздражителя были введены терапевтические или контрольные антитела. Опухание уха измеряли через 24 ч, как описано выше, и сравнивали с толщиной уха перед нанесением кротонового масла. Результаты выражали как средний процент увеличения толщины уха по сравнению с базовым уровнемср.кв.от., как описано выше. Мыши, которым был нанесен только ацетон (контроль-носитель), служили в качестве негативного контроля. Через 24 ч, у мышей, уши которых были обработаны кротоновым маслом, наблюдалось значительное увеличение толщины ушей (48%) по сравнению с мышами, на уши которых наносили только носитель (ацетон). У мышей, предварительно обработанных анти-1 или анти-2 mAb, не наблюдалось значительного токсического опухания ушей, вызываемого кротоновым маслом, по сравнению с животными,обработанными либо PBS, либо контрольным mAb (фиг. 5). Гистологический анализ обработанных кротоновым маслом ушей не выявил никаких различий в отношении количеств или типов инфильтрирующих клеток или возникновения отеков у мышей, обработанных анти-1 или анти-2 mAb, по сравнению с мышами, обработанными контрольным mAb, или мышами, обработанными PBS (данные не приводятся). Пример 6. Ингибирование артрита 11 и 21. Поскольку 11 хорошо экспрессируется на инфильтрирующих клетках в синовиальной жидкости у пациентов с артритом, авторы решили проверить,будут ли анти-1 или анти-2 mAb оказывать ингибирующее действие в ускоренной модели артрита,описанной в литературе (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Наборы антител Arthrogen-CIA закупали у Stratagene (La Jolla, CA), и артрит индуцировали с использованием хорошо известного протокола (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al.,1995, Autoimmunity 22:137-147). Вкратце, артрит индуцировали путем i.р.-инъекции смеси 4 mAb против коллагена типа II (1 мг каждого) на день 0, а затем i.р.-инъекции 50 мкг ЛПС на 3-й день. В течение всех следующих 3-4 дней у мышей наблюдалось опухание запястий, лодыжек и пальцев. Терапевтические или контрольные mAb (250 мкг) вводили i.p. за 4 ч до инъекции mAb против коллагена на день 0, а затем их снова вводили за 4 ч до введения ЛПС на 3-й день, после чего это введение повторяли на каждый 3-й день в течение всего эксперимента. Начиная со дня 3, мышей оценивали на развитие артрита. Тяжесть артрита на каждой конечности оценивали по 4-х бальной системе: 0 = норма; 1 = слабое покраснение,небольшое опухание лодыжки или запястья; 2 = умеренное опухание лодыжки или запястья; 3 = сильное опухание, распространяющееся на некоторые пальцы, лодыжку и лапу; 4 = максимально выраженное воспаление. Тяжелый артрит у мышей Balb/c развивался в течение 72 ч после инъекции ЛПС и на этом уровне наблюдался в течение более, чем 3 недель. Артрит не индуцировался ни инъекцией лишь одного mAb против коллагена, ни инъекцией лишь одного ЛПС. У мышей, которых обрабатывали контрольным mAb,наблюдался такой же тяжелый артрит как и у мышей, обработанных PBS (фиг. 6). В противоположность этому, обработка лишь одним анти-1 mAb приводила к заметному ослаблению (78%) артрита, которое сохранялось на протяжении всего эксперимента. Обработка одним лишь анти-2 mAb также давала положительный эффект и приводила к 32%-ному снижению оценок симптомов артрита по сравнению с мышами, обработанными контрольным mAb. Комбинация анти-1 и анти-2 mAb давала степень ингибирования, аналогичную степени ингибирования, наблюдаемого с использованием лишь одного анти-1mAb. Пример 7. Гистологический анализ, проводимый для оценки влияния обработки анти-1 и анти-2mAb на воспалительный клеточный инфильтрат. Последующий гистологический анализ SRBCиндуцированного ГЗТ-ответа подтвердил, что обработка анти-1 и анти-2 антителами (mAb) может- 23006705 модулировать вырабатываемый воспалительный ответ. Необработанная подушечка лапы SRBCсенсибилизированной мыши фактически не обнаруживала никакого воспалительного клеточного инфильтрата по сравнению с SRBC-обработанной подушечкой лапы у той же самой мыши. ОбработкаSRBC-сенсибилизированных мышей анти-1 и анти-2 mAb, взятых либо отдельно, либо в комбинации,приводила к значительному снижению количества этих инфильтрирующих клеток, обнаруженных вSRBC-сенсибилизированных подушечках лап по сравнению с мышами, обработанными контрольнымmAb. Более тщательное исследование инфильтрирующих клеток выявило, что большинство клеток состоят из нейтрофилов, причем присутствует некоторое количество моноцитов и лимфоцитов, и подтвердило, что обработка анти-1 и анти-2 mAb значительно снижает число таких клеток. Пример 8. Демонстрация 1-экспрессирующих клеток в воспалительном клеточном инфильтрате с помощью иммуногистохимического анализа. Иммуногистохимический анализ проводили для более точного определения природы инфильтрирующих клеток и для того, чтобы определить, экспрессируют ли эти клетки интегрины, связывающиеся с коллагеном. Инфильтрирующие клетки, взятые из воспаленной подушечки лапы необработанной мыши, оценивали на экспрессию 11-интегрина и маркеров линии клеточной дифференцировки. Было обнаружено, что 11-интегрин экспрессируется на многих инфильтрирующих лейкоцитах. Для идентификации природы инфильтрирующих клеток и распределения экспрессии 11 проводили двойной иммуногистохимический анализ. С использованием маркеров линии дифференцировки клеток было обнаружено, что инфильтрат состоит, главным образом, из смеси гранулоцитов/моноцитов (Мас-1+), при этом, многие из этих клеток представляли собой нейтрофилы(Grl+), и среди них присутствовало небольшое число Т-лимфоцитов (CD3+). Экспрессия 11-интегрина была обнаружена у всех трех субсерий клеток, при этом, 1 экспрессировался на субсерии Мас-1+- (гранулоцитов/моноцитов), на субсерии Gr1+-нейтрофилов и на большинстве инфильтрирующих СD3+-Тлимфоцитов. Детальный иммуногистохимический анализ выявил, что хотя обработка анти-1 и анти-2mAb приводила к снижению числа инфильтрирующих клеток, однако, никакого изменения в клеточном составе инфильтрата обнаружено не было (данные не приводятся). Иммуногистохимическое окрашивание ФИТЦ-конъюгированным mAb против Ig хомячка подтвердило способность анти-1 и анти-2 mAb локализоваться в воспаленном участке подушечки лапы (данные не приводятся). Пример 9. Ингибирование артрита антителом (mAb) против 11 и 21 у 1-дефицитных мышей. Поскольку 11 хорошо экспрессируется на инфильтрирующих клетках в синовиальной жидкости у пациентов с артритом, авторы решили проверить, будут ли анти-1 или анти-2 mAb оказывать ингибирующее действие в ускоренной модели артрита, описанной ранее (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Эта модель создается инъекцией мышам смеси mAb против коллагена типа II, а затем введением ЛПС, что приводит к развитию артрита в течение следующих 3-7 дней. На каждый 3-й день, начиная с дня 0, мышам вводили mAb и оценивали развитие артрита на каждый 3-й день. Через 72 ч после инъекции ЛПС, у всех мышей развивался тяжелый артрит,который наблюдался в течение более 3 недель. Этот артрит не индуцировался ни инъекцией лишь одногоmAb против коллагена, ни инъекцией лишь одного ЛПС. У мышей, которых обрабатывали контрольнымmAb, наблюдался такой же тяжелый артрит, как и у мышей, обработанных PBS (фиг. 7). В противоположность этому, обработка лишь одним анти-1 mAb приводила к заметному ослаблению (79% и выше) артрита, которое сохранялось на протяжении всего эксперимента. Обработка одним лишь анти-2 mAb также давала положительный эффект и приводила к 37%-ному ослаблению симптомов артрита по сравнению с мышами, обработанными контрольным mAb. Комбинация анти-1 и анти-2 mAb давала степень ингибирования, аналогичную степени ингибирования, наблюдаемого с использованием лишь одного анти-1 mAb. Снижение оценок степени поражения артритом после обработки анти-1 mAb наблюдалось у всех мышей и положительно отличалось при сравнении с обработкой артрита несколькими другими mAb, такими как растворимый гибридный белок рецептор TNF-Ig" (Mori et al., 1996, J.Immunol. 157:3178-3182), анти-Мас-1 антитело (Taylor et al., 1996, Immunology, 88:315-321), анти-4 антитело(Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23:2086-2091) и анти-ICAM-l (Kakimoto et al., 1992, Cell Immunol. 142:326337). В соответствии с данными, основанными на использовании mAb, указывающих на важную роль 11 в развитии артрита, необработанные 1-дефицитные мыши обнаруживали значительное снижение оценки степени поражения артритом по сравнению с мышами дикого типа. Пример 10. Влияние обработки анти-1 mAb на иммунопатологию суставов, пораженных артритом. Суставы мышей дикого типа с артритом (день 8), которые были обработаны либо контрольным mAb,либо анти-1 mAb, подвергали визуальной и гистологической оценке для сравнения с суставами нормальной необработанной мыши. Визуально суставы мышей, обработанных контрольным mAb, обнаруживали покраснение и опухание по всей конечности, включая пальцы, а мыши, обработанные анти-1mAb, обнаруживали незначительные, если вообще обнаруживали, признаки воспаления либо суставов,либо пальцев. Гистологический анализ показал серьезные изменения пораженных артритом суставов,обработанных контрольным mAb, а именно, интенсивную инфильтрацию субсиновиальной ткани воспалительными клетками, прилипание клеток к поверхности сустава, и заметную деструкцию хряща, что- 24006705 свидетельствовало о потери протеогликанов. В соответствии с описанными ранее данными (Terato et al.,1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147), большинство инфильтрирующих клеток в этой модели являются нейтрофилами. Обработка мышей анти-1 mAb приводила к резкому снижению количества воспалительного инфильтрата и степени деструкции хряща. Пример 11. Развитие артрита замедляется в отсутствии лимфоцитов, и ослабление артрита под действием анти-1 mAb происходит в отсутствии лимфоцитов. Для того, чтобы определить, какие типы клеток могут играть важную роль в модели артрита, индуцированного mAb против коллагена, авторы настоящего изобретения сравнивали возможности развития артрита у мышей дикого типа В 6-129 и RAG-1 дефицитных мышей В 6-129 (фиг. 8). Генетическая делеция гена RAG-1 (гена-1 активации рекомбинации) приводит к полной потере зрелых Т- и В-лимфоцитов (Mombaerts et al., 1992, Cell 68:869-877). Артрит развивался как у мышей дикого типа, так и у RAG-1-дефицитных мышей, хотя кинетика индуцирования артрита у RAG-1-дефицитных мышей была значительно медленнее (фиг. 8). Эти результаты позволяют предположить, что хотя лимфоциты и участвуют в этой модели артрита, однако, они не являются необходимыми для развития и прогрессирования этого заболевания. В опубликованных отчетах по исследованию этого эффекта у RAG-1-дефицитных мышей в других моделях артрита также сообщалось, что потеря Т- и В-лимфоцитов приводит к замедлению начала развития артрита (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023). Обработка мышей дикого типа или RAG-1-дефицитных мышей анти-1 mAb приводила к полному ингибированию артрита (фиг. 8). Эти результаты продемонстрировали, что эффективность анти-1 mAb в этой модели не зависит от присутствия лимфоцитов, и что, как позволяют предположить предыдущие эксперименты (фиг. 7), эффективность анти-1 mAb в предупреждении заболевания может быть обусловлена его действием на другие 1-экспрессирующие клетки, такие как макрофаги и нейтрофилы. Пример 12. Зависимое от дозы ингибирование артрита антителом (mAb) против 1. Учитывая сильный эффект обработки анти-1 mAb в предупреждении артрита, авторы настоящего изобретения продолжили исследование, включив в него анализ зависимости ответа от дозы (фиг. 9). Различные дозыmAb вводили i.p. на каждый 3-й день, начиная со дня 0. В соответствии с данными, полученными ранее,доза анти-1 mAb, составляющая 250 мкг, приводила к почти полному предупреждению артрита. Более низкая доза в 100 мкг анти-1 mAb была частично эффективной в предупреждении артрита в этой модели, тогда как более низкие дозы не давали какого-либо заметного эффекта при оценке поражения артритом (фиг. 9). Пример 13. Терапевтическая обработка анти-1 mAb может снижать оценку степени поражения артритом. Учитывая эффективность анти-1 mAb в предупреждении артрита, авторы настоящего изобретения сделали попытку обработать мышей таким образом, чтобы это повлияло на путь развития заболевания. Артрит индуцировали путем инъекции мышам смеси mAb против коллагена типа II на день 0, а затем инъекции ЛПС на 3-й день. Затем мышей обрабатывали либо анти-1 mAb, либо растворимым гибридным белком TNF-рецептор - Ig", начиная со дня 4. Прогрессирование артрита полностью блокировалось у мышей, обработанных анти-1 mAb, начиная со дня 4, по сравнению с мышами, обработанными контрольным mAb хомячка, начиная со дня 4 (фиг. 10). Ингибирование, наблюдаемое при терапевтическом введении анти-1 mAb, было полным и аналогичным ингибированию, наблюдаемому при превентивной обработке анти-1 mAb (начиная со дня 0) (фиг. 10). В отличие от этого, обработка гибридным белком "TNF-рецептор-Ig", начиная со дня 4, приводила лишь к 60-70% ингибированию симптомов артрита по сравнению с контрольным гибридным белком Ig (фиг. 10). Комбинированная обработка анти 1 mAb и гибридным белком "TNF-рецептор-Ig" вместе приводила к полному ингибированию симптомов артрита, что не было неожиданностью, если учесть, что обработка лишь одним анти-1 mAb является абсолютно эффективной в подавлении артрита. В целом, эти результаты показали, что терапевтическая обработка анти-1 mAb является эффективной в ингибировании артрита и имеет преимущество по сравнению с терапевтической обработкой антагонистом TNF. Пример 14. Клонирование и мутагенез 1-I-домена. Последовательности человеческого и крысиного домена I 11-интегрина амплифицировали из полноразмерных кДНК (Kern et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811-22816; Ignatius et al., 1990, J. Cell. Biol. 111, 709-720) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (PCR CORE Kit; Boehringer Mannheim, GmbH Germany) с использованием либо человеческих специфических праймеров 5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [прямого](SEQ ID NO:7) и 5'TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [обратного](SEQ ID NO:8), либо крысиных специфических праймеров 5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [прямого](SEQ ID NO:9) и 5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [обратного](SEQ ID NO:10). Полученные ПЦР-амплифицированные продукты очищали, лигировали в pGEX4t-i (Pharmacia), и переносили в компетентные клетки DH5 (Life Technologies). Колонии, резистентные к ампициллину,скринировали на экспрессию гибридного белка "глутатион-S-трансфераза-домен I", размером 45 кДа. Последовательности вставок из плазмидной ДНК клонов, которые были отобраны для последующей характеризации, подтверждали с помощью ДНК-секвенирования.- 25006705 Химерный "крыса/человек" 1-I-домен (RH) генерировали (набор для мутагенеза MORPH; 5'-3') путем замены крысиных остатков G91, R92, Q93 и L96 (фиг. 11) соответствующими человеческими остатками V, Q, R и R, соответственно. Клоны, содержащие домен RH I, идентифицировали по отсутствию диагностического рестрикционного StuI-сайта, а вставки подтверждали посредством ДНКсеквенирования. Аминокислотная последовательность человеческого 1-I-домена представлена на фиг. 12. Пример 15. Генерирование тАb против 1-I-домена. Было подтверждено, что моноклональные антитела являются наиболее подходящими зондами для исследования взаимосвязи между структурой и функцией субъединиц интегрина. Так, например, mАb были широко использованы для исследования областей 1-субъединицы, ассоциированной с активированной конформацией (Qu A.Leahy, D.J.(1996) Structure 4, 931-942). Так, например, в целях идентификации потенциальных зондов для конформационных изменений 1-I-домена, авторами настоящего изобретения была генерирована панель тАb против человеческого 1-I-домена. Генерирование моноклональных антител против 1-I-домена. Самок робертсоновских мышей (Jackson Labs.) иммунизировали внутрибрюшинно (i.p.) 25 мкг очищенного человеческого 11 (Edwards et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 12635-12640; Gotwals et al.,1999, Biochemistry 38:8280-8), эмульгированного полным адъювантом Фрейнда (Life Technologies). Затем им вводили i.p. три бустер-инъекции по 25 мкг 11, эмульгированного с неполным адъювантом Фрейнда (Life Technologies). За три дня до слияния клеток мышам с самым высоким титром антитела против 1-I-домена вводили i.p. бустер-инъекцию 100 мкг 11, а за 1 день до слияния клеток им внутривенно вводили 50 мкг 11. Клетки селезенки подвергали слиянию с миеломными клетками FL653 в отношении 1:6 и высевали на 96-луночные планшеты для культивирования ткани в количестве 100000 и 33000 на лунку. Супернатанты оценивали на связывание с 11-интегрином с помощью одноцветного FACS. До проведения FACS-анализа супернатанты инкубировали с нетрансфецированными клетками К 562 для элиминации IgG, который связывается только с -субъединицей. Затем, (3-5) х 104 клеток К 562, трансфецированных субъединицей 1 интегрина (K562-1), суспендированных в FACS-буфере (1% фетальная телячья сыворотка (FCS) в PBS, содержащем 0,5% NaN3), инкубировали с супернатантом в течение 45 мин при 4 С, промывали и инкубировали с антителом против мышиных IgG, конъюгированным с фикоэритрином. После двухкратного промывания FACS-буфером клетки анализировали в проточном цитометре Becton Dickinson Flow Cytometer. Супернатанты от полученных гибридом скринировали на связывание с 1-I-доменом. Для этого, 50 мкл 30 мкг/мл гибрида "человеческий 1-I-домен-GST" в PBS помещали в лунки 96-луночного планшета(Nunc) на ночь при 4 С. Планшеты промывали PBS, блокировали 1% BSA в PBS, и супернатант гибридомы инкубировали с доменом I при комнатной температуре в течение 1 ч. После интенсивной промывки PBS, содержащим 0,03% Твина 20, добавляли конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело против мышиных IgG (Jackson ImmunoResearch) на еще 1 ч. После последней промывки добавляли 1 мг/мл п-нитрофенилфосфата (pNPP) в 0,1 М глицине, 1 мМ ZnCl2 и 1 мМ МgСl2 на 30 мин при комнатной температуре, и планшеты считывали при O.D. 4 05. Отобранные супернатанты тестировали на их способность ингибировать К 562-1-зависимую адгезию к коллагену IV. Клетки К 562-1 метили 2 мМ пентаацетоксиметиловым эфиром 2', 7' (бис-2 карбоксиэтил-5 и 6)карбоксифлуоресцеина (BCECF; Molecular Probes) в DMEM, содержащей 0,25% BSA,при 37 С в течение 30 мин. Меченные клетки промывали буфером для связывания (10 мМ Hepes, pH 7,4; 0,9% NaCl; и 2% глюкозы) и ресуспендировали в буфере для связывания, содержащем 5 мМ МgСl2, при конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл. 50 мкл супернатанта инкубировали с равным объемом 2 х 105 клеток К 562-1 в лунках 96-луночного планшета. Затем планшет центрифугировали и супернатанты удаляли. Клетки ресуспендировали в буфере для связывания, переносили в лунки покрытого коллагеном планшета и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. После инкубирования неприлипшие клетки удаляли путем трехкратной промывки буфером для связывания. Связанные клетки анализировали на проточном цитометре (Cytofluor, Millipore). Авторы изобретения сначала идентифицировали 19 гибридом, супернатанты которых связывались с человеческими клетками лейкоза К 562, экспрессирующими 11-интегрин (К 562-1) , и с 1-I-доменом. Из каждой из этих гибридом выделяли иммуноглобулины и тестировали на способность блокировать связывание К 562-1 или 1-I-домена с коллагеном IV. mAb подразделяли на два класса: антитела, которые блокируют, и антитела, которые не блокируют функцию 11. Так, например, хотя mAb, продуцированные клонами AEF3, BGC5, AQC2 и AJH10, связываются с 1-I-доменом (фиг. 13 А, данные дляBGC5 не приводятся), однако, только mAb AJH10 и AQC2 ингибируют зависимую от 1-I-домена (фиг. 13 В; фиг. 16 В) или K562-1 (фиг. 13 С; фиг. 16 С) адгезию к коллагену IV. Секвенирование определяющих комплементарность областей. Для того, чтобы установить клональное происхождение этой панели mAb, авторами настоящего изобретения были ПЦР-амплифицированы и- 26006705 секвенированы CDR от 12 из 19 антител (данные не приводятся). 2 мкг мРНК, выделенной из 107 гибридом (набор для выделения мРНК FastTrack, Invitrogen), подвергали обратной транскрипции (набор: Ready-To-Go You Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) с использованием 25 пМ каждого из следующих праймеров: тяжелой цепи VH1FOR-2 (Michishita et al., 1993,Cell 72:857-8 67) и легкой цепи VK4FOR, которые определяют четыре отдельных олигонуклеотида (Kernet al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22811-22816). Для каждой гибридомы, тяжелые и легкие цепи амплифицировали в четырех отдельных ПЦР-реакциях с использованием различных комбинаций следующих олигонуклеотидов: 1) тяжелой цепи: VH1FR1K (Kamata et al., 1995, J. of Biol. Chem. 270:12531-12535),VH1BACK, VHIBACK (Baldwin et al.(1998) Structwe 6, 923-935), VHfrla, VHfrlb, VHfrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709-720), or VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., and Arnaout, M. A.(1993) Cell 72, 857-867); 2) легкой цепи: VK1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), VK4FOR,VK2BACK oligos (Kern et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22811-22816), or VKfrla, VHfrlc, VHfrle, VHfrlf (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709-720). Продукты амплифицировали (5 минут при 95 С; 50 циклов: 1 мин при 94 С; 2 мин при 55 С; 2 мин при 72 С, и конечный цикл: 10 мин при 72 С), подвергали гель-очистке (QIAquick, Qiagen) и секвенировали на секвенаторе ABI 377 Sequencer непосредственно с использованием различных вышеперечисленных олигонуклеотидов. Последовательности из клонов, продуцирующих функцию-блокирующие mAb, были почти идентичны по всем определяющим комплементарность областям (CDR) и находящимся между ними каркасным областям, что позволяет предположить, что эти гибридомы являются клонально родственными. Пример 16. Иммуноблотинг и FACS-анализ. Последовательности вариабельных областей неблокирующих антител заметно отличались от клонально родственного семейства последовательностей, обнаруженных у блокирующих антител. Поскольку, очевидно, что блокирующие антитела происходят от одного клона, то для последующей характеризации авторы настоящего изобретения выбрали два антитела (AJH10 и AQC2). Иммуноблоттинг. Из овечьей аорты вырезали клеточный слой гладкой мышцы, и клетки К 562-1 экстрагировали 1% Тритоном Х-100 в 50 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 20 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Образцы подвергали электрофорезу в 4-20% градиенте ПААГ с ДСН, а затем подвергали электроблоттингу на нитроцеллюлозных мембранах. Эти блоты блокировали 5% сухим молоком вTBS, промывали в TBS, содержащем 0,03% Твина-20, и инкубировали с антителами в блокирующем буфере, содержащем 0,05% NaN3, в течение 2 ч. Затем блоты промывали как указано выше, инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом против мышиных IgG в течение одного часа, снова промывали, после чего обрабатывали ЭХЛ-реагентом (Amersham). После этого блоты экспонировали с пленкой (Kodak) в течение 30-60 с, и проявляли. Иммуноблоттинг и FACS-анализ (фиг. 14) продемонстрировали, что AJH10 реагирует с человеческим, кроличьим и овечьим, но не с крысиным, 11-интегрином, что позволяет предположить, что указанные блокирующие mAb связываются с эволюционно консервативным линейным эпитопом. Heблокирующие mAb не были эффективны в иммуноблотинге и не реагировали с другими видами интегринов, кроме человеческого. Пример 17. Связывание 1-I-домена с коллагеном зависит от двухвалентного катиона. А. Очистка 1-I-доменов. 1-I-Домены экспрессировали в E.coli в виде гибридных белков с GST (глутатион-S-трансферазой),содержащих сайт расщепления тромбином на стыке этих последовательностей. Осветленный супернатант, взятый из клеток, лизированных в PBS, загружали на колонку с глутатион-сефарозой-4 В(Pharmacia), которую интенсивно промывали PBS. Гибридный белок "1-I-домен-GST" элюировали 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 мМ глутатиона (восстановленного). Для исследования денатурации, домен I расщепляли тромбином в 50 мМ Триса, рН 7,5, и отделяли от GST-партнера указанного гибрида. Затем добавляли DTT до конечной концентрации 2 мМ и образец загружали на колонку с глутатион-сефарозой 4 В. Проходящие и промывочные фракции собирали и загружали на колонку с Q сефарозой FF(Pharmacia). 1-I-домен элюировали 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 75 мМ NaCl. Очищенный домен I имел его предсказанную массу (Lee et al. (1995) Structure 3, 1333-1340, 871 Да), как было установлено с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электронапылением (ESI-MS), и мигрировал в виде одной полосы, как показал электрофорез в ДСН-ПААГ, а белок элюировался в виде одного пика соответствующего размера при эксклюзионной хроматографии на ЖЭХБ-колонке с Superose 6(Pharmacia). В. Функциональный анализ. 96-луночные планшеты покрывали в течение ночи при 4 С 1 мкг/мл коллагена IV (Sigma) или коллагена типа I (Collaborative Biomedical), промывали буфером с Тритоном (0,1% Тритон Х-100; 1 мМ МnCl2; 25 мМ Трис-НСl, 150 мМ NaCl) и блокировали 3% альбумином бычьей сыворотки (BSA) в 25 мМ Трис-НСl, 150 мМ NaCl (TBS). Серийные разведения гибридного белка 1-I-домен-GST в TBS, содер- 27006705 жащем 1 мМ МnCl2 и 3% BSA, инкубировали на сенсибилизированных планшетах при комнатной температуре в течение 1 ч и промывали в буфере с Тритоном. Связанный 1-I-домен детектировали последовательными добавлениями 10 мкг/мл биотинилированного поликлонального антитела против GST(Pharmacia); конъюгата "экстравидин-пероксидаза хрена" (Sigma), разведенного 1:3000 в TBS, содержащем 1 мМ МgСl2 и 3% BSA, и 1-Step ABTS (сульфонат 2,2'-азин-ди[3-этилбензтиазолина]; Pierce). Планшеты считывали при O.D.405 на микропланшет-ридере (Molecular Devices). Результаты. Человеческие и крысиные (на 95% идентичные человеческим). 1-I-домены экспрессировали в E.coli в виде GST-гибридных белков и очищали на глутатионсефарозе. Оба белка оценивали на связывание с коллагеном I и IV с использованием варианта ELISAанализа, описанного в литературе (Qu A.Leahy, D.J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277-10281). Человеческий 1-I-домен связывался с коллагеном IV более эффективно, чем с коллагеном I (фиг. 15 А). Антитело, специфичное к 1-I-домену, но не антитело, специфичное к 2-I-домену, (фиг. 15 В), утрачивало способность к связыванию с обоими лигандами (данные для коллагена I не приводятся). Как Мn2+,так и Мg2+ стимулировали связывание, a EDTA снижала уровни связывания до фоновых (фиг. 15 С). Какого-либо заметного различия в связывании с лигандом между человеческим и крысиным 1-I-доменами не наблюдалось, что позволяет предположить, что эта последовательность отличается у различных видов и не является функционально релевантной (данные не приводятся). Таким образом, для эффективного связывания с лигандом, 1-I-домену, в частности, требуется катион. Пример 18. Катионо-зависимый эпитоп присутствует возле мотива MIDAS. При картировании эпитопа для mAb, блокирующих функцию 11, авторы настоящего изобретения взяли за основу тот факт,что AJH10 распознает последовательности человеческого, но не крысиного 1-I-домена. Человеческие и крысиные последовательности отличаются только 12 аминокислотами, 4 из которых находятся во фрагменте из 6 аминокислот (а.к. 91-96, фиг. 11 А), смежных с треонином, имеющем важное значение (фиг. 11 А, а.к. 98) в мотиве MIDAS. Для проверки гипотезы о том, что указанные 6 аминокислотных остатков,Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (остатки 91-96 SEQ ID No: 64), составляют эпитоп для блокирующих mAb, авторы настоящего изобретения сконструировали химерный домен I (RH), в котором крысиные остаткиG91, R92, Q93 и L96 заменены соответствующими человеческими остатками, V, Q, R и R, соответственно. AJH10, наряду со всеми функцию-блокирующими mAb, распознает химерный домен I (RH; фиг. 11 В). Для ориентирования этих остатков в соответствии с доменом MIDAS в третичной структуре 1-Iдомена, авторы настоящего изобретения смоделировали 1-I-домен с использованием координат кристаллической структуры 2-I-домена. Гомологичная модель человеческого 1-I-домена была построена с использованием рентгеновской кристаллической структуры человеческого 2-I-домена (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546). Эта модель была построена с использованием модуля гомологичного моделирования Insight II (version 2.3.5;Biosym Technologies). В программе CHARMM (Clackson et al. (1991) Nature 352, 624-628) использовался набор всех водородных параметров 22 с зависящей от расстояния диэлектрической постоянной, в два раза превышающей межатомное расстояние. Сначала авторы проводили 1000 стадий минимизации с наиболее крутым спуском и со взвешенными по массе гармоническими позиционными ограничениями 1 ккал/(моль 2) по всем атомам 1-I-домена. После этого осуществляли еще 1000 стадий минимизации с наиболее крутым спуском и 5000 стадий с использованием фундаментального метода Ньютона-Рафсона с ограничениями в 0,1 ккал/(моль 2) по Сатомам 1-I-домена во избежание значительных отклонений от структуры 2-I-домена, полученной методом рентгенокристаллографии. Последовательности интегрина 11 и 2l обнаруживали 51%-ную идентичность без вставок или делеций, что дает основание предположить, что полная структура двух доменов I должна быть аналогичной. Как было предсказано, центр координации металла в 1-I-домене является таким же, как в 2-Iдомене, а остатки, которые составляют эпитоп для блокирующих mAb, находятся в петле между спиралью 3 и спиралью 4, которая содержит треонин в мотиве MIDAS, играющий важную роль в связывании с катионом. Модель 1-I-домена позволила предсказать, что водород у азота амида Q92 (фиг. 11 А) связывается с карбонильной группой остатка I33, смежного с S32. Таким образом, петля, которая содержит эпитоп, может играть определенную функциональную роль в стабилизации области MIDAS. Пример 19. Моноклональное антитело AQC2 (то есть, mAQC2; "m" означает мышиное).(Пример 15, см. выше) представляет собой антитело IgGl-каппа. Для идентификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих тяжелые и легкие цепи этого антитела, суммарную клеточную РНК клеток мышиной гибридомы AQC2 получали с использованием набора (midi kit) QIAGEN RNEASY в соответствии с инструкциями производителей. Затем кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, клонировали с помощью ОТ-ПЦР из суммарной клеточной РНК с использованием системы предварительной амплификации GIBCO BRL SUPERSCRIPT для синтеза первой цепи кДНК в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями. В качестве праймеров использовали рандомизированные гексамеры.- 28006705 Вариабельный домен тяжелой цепи mAQC2 амплифицировали с помощью ПЦР из первой цепи кДНК с использованием праймеров; 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG ССС С-3' (SEQNO:12). ПЦР проводили в 30 циклов с использованием полимеразы Taq Clontech's Advantage: денатурация - 30 с при 94 С, отжиг - 1 мин, 50 С и удлинение - 1,5 мин, 68 С. Легкую цепь mAQC2 с ее сигнальной последовательностью подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймеров: 5' ACT AGTTGG TGG GAA GAT GGA 3' (SEQ ID NO:14). ПЦР проводили в 30 циклов с использованием клонированной полимеразы Pfu Stratagene: денатурация - 1 мин, 94 С, отжиг - 1 мин, 50 С и удлинение - 2 мин,72 С. ПЦР-продукты для тяжелой и легкой цепей подвергали гель-очистке с использованием набора для гель-экстракции QIAGEN QIAQUICK в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителями. Очищенный продукт тяжелой цепи субклонировали в вектор pCR2.1-TOPO ТА, Invitrogen, с использованием набора для клонирования ТОРО ТА. Очищенную легкую цепь субклонировали в векторpCRbluntIITOPO Invitrogen с использованием набора для клонирования Zero blunt ТОРО в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями. Были секвенированы вставки из множества независимых субклонов. За исключением вырожденных положений в ПЦР-праймерах, последовательности вставок независимых субклонов были идентичными. Полипептидные последовательности mAQC2 были выведены из их кодирующих последовательностей. N-концевая аминокислотная последовательность для зрелой легкой цепи, предсказанная исходя из кДНК-последовательности ПЦР-продукта, амплифицированного с сигнальной последовательностью,точно соответствовала N-концевой последовательности очищенной легкой цепи mAQC2, полученной путем деградации по Эдману (DVKWESGG; SEQ ID NO:15). BLAST-анализы последовательностей вариабельных доменов подтвердили их идентичность как иммуноглобулинов. Полипептидная последовательность вариабельного домена легкой цепи mAQC2 представлена ниже:CDR показаны жирным шрифтом. CDR определяли как описано Kabat et al., Sequences of Proteins ofStates Government Printing Office, 1991. С использованием системы нумерации Кабата ниже представлена последовательность SEQ ID NO:1, где тире означает отсутствие аминокислоты: Полипептидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи mAQC2 представлена ниже:CDR показаны жирным шрифтом. С использованием системы нумерации Кабата ниже представлена последовательность SEQ ID NO:2, где цифры, обозначающие положения, следуют по порядку, если это не оговорено особо: В настоящем описании, номера положений остатков вариабельных доменов даны в соответствии с нумерацией Кабата, если это не оговорено особо. Пример 20. В этом примере описано получение химерного антитела "мышь-человек", chAQC2. кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей mAQC2, были использовали для- 29006705 конструирования сhАQС 2-экспрессирующих векторов, в которых вариабельные области mAQC2 были присоединены к человеческому IgG1 и константным областям каппа-цепи. Химерные тяжелые цепи конструировали следующим образом. 0,33 т.п.o.-PstI-BstEII-фрагмент из плазмиды pAND083 для тяжелой цепи mAQC2 субклонирвали в обработанный фосфатазой 2,82 т.п.о.PstI-BstEII-фрагмент вектора из плазмиды pLCB7 для тяжелой цепи 5 а 8, для того, чтобы к кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи mAQC2, добавить последовательность, кодирующую сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного антитела и мышиный донорный сайт сплайсинга. 5 а 8 представляет собой молекулярно клонированное СD4-специфическое mAb (см. например, Boon et al.,2002, Toxicology 172:191-203). В зрелой тяжелой цепи, кодируемой полученной плазмидой (pAND092),N-конец отличался от N-конца (DVKVVE; SEQ ID NO:16) тяжелой цепи когнатного mAQC2 пятью остатками. Для коррекции N-конца тяжелой цепи, pAND092 подвергали мутагенезу для элиминации уникального сайта (USE) с использованием набора для USE-мутагенеза (Amersham Pharmacia Biotech) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями. Замены Q1D, Q3K, L4V, Q5V, Q6E кодировались мутагенным праймером 5' GCA CCA GGT GCC САС ТСС GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCAGGG GGA GGC TTA GTG 3' (SEQ ID NO:17). Мутированные плазмидные клоны идентифицировали по их новым AatII и HinfI-сайтам и по элиминированному PstI-сайту. Затем, последовательность, кодирующую тяжелую цепь, подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Мутированную соответствующим образом плазмиду обозначали pAND094. 0,43 т.п.н.-NotI-HindIII-фрагмент плазмиды pAND094 и 1,21 т.п.н.-HindIII-NotI-фрагмент плазмиды pEAG964 (содержащей кодирующую последовательность для константной области человеческого IgG1) субклонировали в NotI-сайт плазмиды рСН 269, происходящей от экспрессирующего вектора рСЕР 4 EBV (Invitrogen). Полученную плазмиду обозначали PAND099. Химеры легкой цепи генерировали следующим образом. 0,46 т.п.н.-EcoRI-фрагмент плазмидыpAND081, кодирующей вариабельный домен легкой цепи mAQC2, субклонировали в обработанный фосфатазой 2,7 т.п.н.-фрагмент клонирующего вектора pNN09, происходящего от pUC, для добавления 5'-Notl-сайта. Полученную плазмиду pAND091 подвергали мутагенезу с использованием набора Amersham USE (см. выше), в результате чего в 3'-конец кодирующей последовательности был введен BglIIсайт. Мутагенный праймер имел последовательность 5'-GGA GGC ACC AAG CTG GAG АТС TAA CGGGCT GAT GCT GC -3' (SEQ ID NO:18). "Правильно" мутированную плазмиду идентифицировали по изменениям в их BglII- и BstYI-сайтах. Последовательность, кодирующую легкую цепь в полученной плазмиде pAND093, подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Затем 0,44 т.п.н.-NotI-BglIIфрагмент вариабельного домена легкой цепи из плазмиды pAND093 и 0,68 т.п.н.-BclI-NotI-фрагмент плазмиды pEAG963 (содержащий последовательность, кодирующую константную область человеческой легкой цепи каппа) субклонировали в NotI-сайт рСН 269 (см. выше) с получением плазмиды pAND102. Для создания неблокированной легкой цепи каппа (Q1E), плазмиду pAND093 подвергали USEмутагенезу с использованием мутагенного праймера 5' -CAT ААТ GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCTCAC CCA 3' (SEQ ID NO:19) для введения XmnI-сайта. Мутированную плазмиду идентифицировали путем скрининга на замену XmnI-сайта. Последовательность легкой цепи в полученной плазмиде pAND097 подтверждали посредством ДНК-секвенирования. 0,44 т.п.н.-NotI-BglII-фрагмент вариабельного домена легкой цепи от плазмиды PAND097 и 0,68 т.п.н.-BclI-NotI-фрагмент от плазмиды pEAG963 (содержащей константную область человеческой легкой цепи каппа) субклонировали в NotI-сайт рСН 269 (см. выше) с получением плазмиды pAND098. Для генерирования антител chAQC2, экспрессирующие векторы (вектор pAND099 для тяжелой цепи chAQC2 + вектор pAND102 для легкой цепи chAQC2, и вектор pAND099 для тяжелой цепи chAQC2 + вектор pAND098 для неблокированной легкой цепи chAQC2) котренсфецировали в клетки 293-EBNA. Трансфектанты тестировали на секрецию и специфичность антител. В качестве контроля использовали клетки, трансфецированные соответствующими векторами без вставки, или ДНК-конструкциями, кодирующими ch5c8 (молекулярно клонированное CD154-специфическое mAb, описанное, например, в работе Elster et al., 2001, Transplantation 72:1473-1478) или chCBE11 (молекулярно клонированное LTRспецифическое mAb, описанное, например, в работе Browning et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:2493424938). Затем трансфектанты с нужной секрецией антитела лизировали, и с помощью белка А осуществляли иммунопреципитацию на лизатах и кондиционированной среде. Вестерн-блот-анализ преципитатов,проведенный с использованием антител против человеческой тяжелой и легкой цепей, показал, чтоchAQC2-трансфецированные клетки синтезировали и эффективно секретировали тяжелую и легкую цепи на уровнях, аналогичных сh5 с 8-трансфецированным и chCBE11-трансфецированным клеткам. Затем,huVLA-1-экспрессирующие клетки К 562-1 окрашивали кондиционированной средой, полученной от указанных трансфецированных клеток, и эти окрашенные клетки подвергали FACS-анализу. Результаты показали, что антитело chAQC2 давало картины окрашивания, аналогичные картинам окрашивания дляmAQC2, а кондиционированные среды, взятые от ложно трансфецированных и сh5 с 8-трансфецированных клеток, не давали окрашивания клеток К 562-1. Химерное AQC2, продуцированное в ре- 30
МПК / Метки
МПК: C07K 16/46, H04N 9/64, H04N 13/02, A61K 39/395, C07K 16/24, G01N 33/53, C12N 5/20, H04N 15/00, C07H 21/04
Метки: антитела, против, vla-1
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-6705-antitela-protiv-vla-1.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Антитела против vla-1</a>
Антитела против рецептора интерферона-альфа/бета
Номер патента: 2543
Опубликовано: 27.06.2002
Авторы: Рубинштейн Менахем, Новик Даниела
МПК: C07K 16/28, A61K 39/395, C12N 15/13...
Метки: рецептора, антитела, против
Формула / Реферат:
1. Антитело, способное связываться с рецептором IFN-a/b и обеспечивающее более высокий антивирусный блокирующий титр против IFN-a, чем против IFN-b, отличающееся тем, что оно не является поликлональным антителом, или его Fаb-фрагменты. 2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело. 3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой химерное антитело. 4. Антитело по п. 1, отличающееся...
Ингибиторы ароматазы и моноклональные антитела против her2 как противоопухолевые агенты
Номер патента: 5931
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Пурандаре Дайнеш, Пишителли Габриэлла, Массимини Джорджо
МПК: A61P 35/00, A61K 39/395
Метки: ингибиторы, антитела, моноклональные, ароматазы, против, агенты, противоопухолевые
Формула / Реферат:
1. Применение ингибитора ароматазы для производства фармацевтической композиции для лечения гормонзависимого нарушения, характеризуемого сверхэкспрессией HER2. 2. Применение по п.1, где нарушение представляет собой рак молочной железы, шейки матки, яичников и эндометрия или эндометриоз. 3. Применение по п.2, где нарушение представляет собой рак молочной железы. 4. Применение по п.1, где ингибитор ароматазы выбран из эксеместана,...
Антитела против il-12 и способы их применения
Номер патента: 6673
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Найт Дэвид М., Шили Дэвид, Скэллон Бернард, Джайлс-Комар Джилл, Перитт Дэвид
МПК: C07K 16/24, A61K 39/395, A61P 37/00...
Метки: способы, против, антитела, применения, il-12
Формула / Реферат:
1. Выделенное антитело против IL-12 млекопитающего, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область, включающую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и одну аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 8, причем указанное антитело специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом, включающим от 1-3 аминокислот до полной последовательности SEQ ID NO: 9. 2. Выделенная молекула...
Антитела против домена ed-в фибронектина, их конструирование и использование
Номер патента: 4329
Опубликовано: 29.04.2004
Авторы: Винтер Грег, Зарди Лучано, Борси Лаура, Нери Дарио, Нери Джованни, Кастеллани Патриция, Бальца Энрика, Сири Аннализа, Пини Алессандро, Карнемолла Барбара
МПК: C12N 15/13, A61K 39/395, C07K 16/18...
Метки: конструирование, против, домена, фибронектина, использование, антитела, ed-в
Формула / Реферат:
1. Способ получения специфичного элемента связывания, представляющего собой антитело или фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий домен антитела, где указанный антигенсвязывающий домен антитела выделен из синтетического молекулярного набора и специфичен по отношению к онкофетальному домену ED-B фибронектина (FN) и непосредственно связывается с ним, причем указанный способ включает а) скрининг фаговой библиотеки фрагментов антитела,...
применение антитела против полипептида april для получения лекарственного препарата для лечения опухолей
Номер патента: 5411
Опубликовано: 24.02.2005
Автор: Чопп Юрг
МПК: A61K 38/00, C07K 14/525, A61P 35/00...
Метки: препарата, полипептида, лечения, антитела, лекарственного, опухолей, april, против, получения, применение
Формула / Реферат:
1. Применение антитела, специфично связывающегося с полипептидом индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL) SEQ ID NO: 2 или его растворимым фрагментом и препятствующего связыванию полипептида лиганда APRIL и полипептида рецептора APRIL, для получения лекарственного препарата для лечения, подавления или изменения роста опухолевой клетки, лечения злокачественной опухоли или лечения гиперплазии. 2. Применение по п.1, где указанная опухолевая...
Предыдущий патент: Нафтилсульфоновые кислоты и родственные соединения в качестве агонистов поглощения глюкозы
Следующий патент: Производные n-аминоимидазола, ингибирующие вич
Случайный патент: Производные карбазола