Способы предотвращения и лечения амилоидогенного заболевания и используемые в них фармацевтические композиции
Номер патента: 6630
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Шенк Дэйл Б., Бард Фредерик, Васкуэз Ники Дж., Еднок Тэд
Формула / Реферат
1. Способ предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Ab в головном мозге пациента, включающий введение пациенту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, имеющее изотип IgG1, которое специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-7 Ab.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание характеризуется когнитивной недостаточностью.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой синдром Дауна.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой когнитивную недостаточность средней тяжести.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что пациент является человеком.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-6 Ab.
8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 Ab.
9. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-7 Ab.
10. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-3 Ab.
11. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-4 Ab.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что антитело способно связываться с отложениями амилоида в организме пациента и индуцировать действенный иммунный ответ против отложений амилоида, приводящий к их разрушению.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный иммунный ответ представляет собой опосредованный рецепторами Fc фагоцитарный ответ.
14. Способ по любому из пп.12 или 13, отличающийся тем, что включает дополнительный мониторинг иммунного ответа.
15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что у пациента отсутствуют симптомы заболевания.
16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что возраст пациента составляет менее 50 лет.
17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что пациент имеет врожденный фактор риска предрасположенности к болезни Альцгеймера.
18. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что пациент не имеет фактора риска предрасположенности к болезни Альцгеймера.
19. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что антитело является гуманизированным антителом.
20. Способ по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что антитело является химерным антителом.
21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что антитело является поликлональным антителом.
22. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом.
23. Способ по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что дополнительно включает введение пациенту эффективной дозы по крайней мере одного другого антитела, которое связывается с другим эпитопом Ab.
24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что антитело включает две копии одной пары легкой и тяжелой цепей.
25. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что антитело является биспецифическим антителом, включающим первую пару легкой и тяжелой цепей, которая специфически связывается с эпитопом Ab , и вторую пару легкой и тяжелой цепей, которая специфически связывается с Fc-рецептором на клетках микроглии.
26. Способ по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что антитело слито с гетерологичным полипептидом.
27. Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что доза вводимого антитела составляет по крайней мере 1 мг/кг веса тела пациента.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что доза вводимого антитела составляет по крайней мере 10 мг/кг веса тела пациента.
29. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что антитело вводят вместе с носителем.
30. Способ по любому из пп.1-18 или 21-29, отличающийся тем, что антитело получено из B-клеток человека, иммунизированного пептидом Ab.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что человек, иммунизированный пептидом Ab , является подлежащим лечению пациентом.
32. Способ по любому из пп.1-31, отличающийся тем, что антитело не связывается с полноразмерным белком-предшественником амилоида (APP).
33. Способ по любому из пп.1-32, отличающийся тем, что антитело вводят интраперитонеально, орально, интраназально, подкожно, внутримышечно, местно или внутривенно.
34. Способ по любому из пп.1-33, отличающийся тем, что дополнительно включает постоянное наблюдение за уровнем введенного антитела в крови пациента.
35. Способ по любому из пп.1-34, отличающийся тем, что композицию вводят в виде множественной дозированной формы в течение периода, составляющего по крайней мере шесть месяцев.
36. Способ по любому из пп.1-34, отличающийся тем, что композиция представляет собой композицию с поддерживаемым высвобождением.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело человека, имеющее изотип IgG1, которое специфически связывается с эпитопом амилоида Ab в пределах аминокислотных остатков 1-7 Ab , и фармацевтически приемлемый носитель.
38. Фармацевтическая композиция по п.37, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-6 Ab.
39. Фармацевтическая композиция по п.37, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 Ab.
40. Фармацевтическая композиция по п.37, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-7 Ab.
41. Фармацевтическая композиция по п.37, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-3 Ab.
42. Фармацевтическая композиция по п.37, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-4 Ab.
43. Фармацевтическая композиция по любому из пп.37-42, отличающаяся тем, что является композицией с поддерживаемым высвобождением.
44. Фармацевтическая композиция по любому из пп.37-42, отличающаяся тем, что носитель является физиологически приемлемым для парентерального введения.
45. Фармацевтическая композиция по любому из пп.37-44, отличающаяся тем, что антитело является гуманизированным антителом.
46. Фармацевтическая композиция по любому из пп.37-44, отличающаяся тем, что антитело является химерным антителом.
47. Фармацевтическая композиция по любому из пп.37-46, отличающаяся тем, что антитело является моноклональным антителом.
48. Способ предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоида Ab в головном мозге пациента, включающий введение пациенту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное или химерное антитело, имеющее IgG1 изотип, которое специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-7 Ab.
49. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанное заболевание характеризуется когнитивной недостаточностью.
50. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
51. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой синдром Дауна.
52. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой когнитивную недостаточность средней тяжести.
53. Способ по любому из пп.48-52, отличающийся тем, что пациент является человеком.
54. Способ по любому из пп.48-53, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-6 Ab .
55. Способ по любому из пп.48-53, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 Ab .
56. Способ по любому из пп.48-53, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-7 Ab .
57. Способ по любому из пп.48-53, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-3 Ab .
58. Способ по любому из пп.48-53, отличающийся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-4 Ab .
59. Способ по любому из пп.48-58, отличающийся тем, что антитело способно связываться с отложениями амилоида в организме пациента и индуцировать действенный иммунный ответ против отложений амилоида, приводящий к их разрушению.
60. Способ по п.59, отличающийся тем, что указанный иммунный ответ представляет собой опосредованный рецепторами Fc фагоцитарный ответ.
61. Способ по п.59 или 60, отличающийся тем, что включает дополнительный мониторинг иммунного ответа.
62. Способ по любому из пп.48-61, отличающийся тем, что у пациента отсутствуют симптомы заболевания.
63. Способ по любому из пп.48-62, отличающийся тем, что возраст пациента составляет менее 50 лет.
64. Способ по любому из пп.48-63, отличающийся тем, что пациент имеет врожденный фактор риска предрасположенности к болезни Альцгеймера.
65. Способ по любому из пп.48-63, отличающийся тем, что пациент не имеет фактора риска предрасположенности к болезни Альцгеймера.
66. Способ по любому из пп.48-65, отличающийся тем, что дополнительно включает введение пациенту эффективной дозы по крайней мере одного другого антитела, которое связывается с другим эпитопом Ab .
67. Способ по любому из пп.48-66, отличающийся тем, что антитело включает две копии одной пары легкой и тяжелой цепей.
68. Способ по любому из пп.48-66, отличающийся тем, что антитело является биспецифическим антителом, включающим первую пару легкой и тяжелой цепей, которая специфически связывается с эпитопом Ab , и вторую пару легкой и тяжелой цепей, которая специфически связывается с Fc-рецептором на клетках микроглии.
69. Способ по любому из пп.48-68, отличающийся тем, что антитело слито с гетерологичным полипептидом.
70. Способ по любому из пп.48-69, отличающийся тем, что доза вводимого антитела составляет по крайней мере 1 мг/кг веса тела пациента.
71. Способ по п.70, отличающийся тем, что доза вводимого антитела составляет по крайней мере 10 мг/кг веса тела пациента.
72. Способ по любому из пп.48-71, отличающийся тем, что антитело вводят вместе с носителем.
73. Способ по любому из пп.48-72, отличающийся тем, что антитело получено из B-клеток человека, иммунизированного пептидом Ab .
74. Способ по п.73, отличающийся тем, что человек, иммунизированный пептидом Ab , является подлежащим лечению пациентом.
75. Способ по любому из пп.48-74, отличающийся тем, что антитело не связывается с полноразмерным белком-предшественником амилоида (APP).
76. Способ по любому из пп.48-75, отличающийся тем, что антитело вводят интраперитонеально, орально, интраназально, подкожно, внутримышечно, местно или внутривенно.
77. Способ по любому из пп.48-76, отличающийся тем, что дополнительно включает постоянное наблюдение за уровнем введенного антитела в крови пациента.
78. Способ по любому из пп.48-77, отличающийся тем, что композиция представляет собой композицию с поддерживаемым высвобождением.
79. Фармацевтическая композиция, содержащая химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-7 Ab , и фармацевтически приемлемый носитель.
80. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-6 Ab .
81. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 Ab .
82. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-7 Ab .
83. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-3 Ab .
84. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-4 Ab .
85. Фармацевтическая композиция по любому из пп.79-84, отличающаяся тем, что является композицией с поддерживаемым высвобождением.
86. Фармацевтическая композиция по любому из пп.79-84, отличающаяся тем, что носитель является физиологически приемлемым для парентерального введения.
87. Фармацевтическая композиция по любому из пп.79-86, отличающаяся тем, что антитело является моноклональным.
Текст
006630 Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческому слабоумию. См. в основном Selkoe, TINS 16, 403-409(1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J.Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447(1994); Duff et al., Nature 373, 476-477(1995); Games et al., Nature 373,523 (1995). В целом, болезнь Альцгеймера развивается в две стадии: поздняя стадия наступает в возрасте 65 и более лет, а ранняя стадия характерна для возрастного периода, предшествующего старости, т.е. для 35-60 лет. В обоих случаях патологические процессы одинаковы, однако, нарушения более распространены и имеют большую тяжесть на ранней стадии развития заболевания. Заболевание характеризуется по крайней мере двумя типами повреждений мозга, старческими бляшками и нейрофибриллярными сплетениями. Старческие бляшки - это области дезорганизованного нейропиля до 150 мкм в диаметре с внеклеточными отложениями амилоида в центре, что можно увидеть при микроскопическом анализе срезов ткани мозга. Нейрофибриллярные сплетения представляют собой внутриклеточные отложения ассоциированного с микротрубочками tau-белка, состоящие из двух филаментов, скрученных в пары друг с другом. Основным компонентом бляшек является пептид, называемый А- или -амилоидным пептидом. А-пептид представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого амилоидным белком-предшественником (АРР). Различные мутации в пределах АРР белка коррелируют с наличием болезни Альцгеймера. См., например, Goale et al., Nature 349, 704 (1991) (валин 717 заменен на изолейцин); Chartier Harlan et al., Nature 353, 844(1991) (валин 717 заменен на глицин);(1992) (двойная замена лизина 595-метинина 596 на аспарагин 595-лейцин 596). Такие мутации, по-видимому,вызывают болезнь Альцгеймера путем усиления или изменения процессинга АРР в А, в частности, процессинга АРР, приводящего к увеличению количества длинной формы А (т.е. А 1-42 и А 143). Мутации в других генах, таких как гены пресенилина PS1 и PS2, по-видимому, косвенно влияют на процессинг АРР с образованием повышенных количеств длинной формы А (см. Hardy, TINS 20, 154(1997. Указанные наблюдения свидетельствуют о том, что А и в особенности его длинная форма являются ключевым элементом в возникновении болезни Альцгеймера.McMichael (ЕР 526511) предлагает вводить гомеопатические дозы (менее чем или эквивалентные-2 10 мг/день) А пациентам с предсуществующей БА. У обычного человека с 5 л циркулирующей плазмы крови даже верхний предел указанной дозы будет соответствовать концентрации А в плазме не более чем 2 пкг/мл. Обычная концентрация А в плазме крови человека обычно составляет 50-200 пкг/мл (Seubert et al. Nature 359, 325-327 (1992. Поскольку доза, предложенная в ЕР 326511, будет незначительно изменять уровень эндогенного циркулирующего А и поскольку в данном источнике информации не рекомендуется использование адъюванта в качестве иммуностимулятора, представляется сомнительным,чтобы какой-либо терапевтический эффект был достигнут. В противоположность указанному настоящее изобретение направлено inter alia на лечение болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путем введения фрагментов А или антител к различным эпитопам А больным данным заболеванием, что приводит к формированию эффективного иммунного ответа у больного. Таким образом, изобретение решает давно стоящую терапевтическую потребность предотвращения и облегчения нейропатологии и в некоторых случаях когнитивной недостаточности, ассоциированной с болезнью Альцгеймера. Краткое описание изобретения Объектом изобретения являются способы предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида А в мозге больного. К таким заболеваниям относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя может наблюдаться вместе с другими признаками амилоидогенного заболевания, а может развиваться сама по себе. Некоторые заявленные способы предусматривают введение больному эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с компонентом отложения амилоида. Такие способы особенно полезны для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера у человека. Определенные способы включают введение эффективной дозы антитела, которое связывается с А. Определенные способы включают введение эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-10 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-6 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-5 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-7. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 3-7 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-3 А. В определенных способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-4 А. В определенных способах антитело связывается с эпитопом, содержащим свободный N-1 006630 концевой остаток А. В некоторых способах антитело специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-10 А, причем остаток 1 и/или остаток 7 А является аспарагиновой кислотой. В других способах антитело специфически связывается с пептидом А и не связывается с полноразмерным амилоидным белком-предшественником (АРР). В некоторых способах антитело относится к изотипу IgG1 человека. Согласно определенным методам антитело связывается с амилоидным депозитом у пациента и индуцирует ответ против него, способствующий разрушению амилоида. Например, такого рода ответ может быть опосредован определенным Fc-рецепторами фагоцитозом. Заявленные способы могут быть применены как при отсутствии симптомов, так и в тех случаях, когда такие симптомы имеют место. Используемое антитело может быть человеческим, гуманизированным, химерным или иметь другую видовую принадлежность. При этом оно может быть моноклональным или поликлональным. В некоторых случаях антитело получает от человека, иммунизированного пептидом А. Такой индивидуум может быть пациентом, который подвергается лечению антителом. В некоторых случаях антитело вводят вместе с фармацевтическим носителем в составе фармацевтической композиции. Иногда антитело вводят в дозе 0,0001-100 мг/кг, предпочтительно по крайней мере 1 мг/кг в расчете на вес тела. Антитело может быть введено в множественных дозах в течение пролонгированного периода, например в течение по крайней мере шести месяцев. Антитело может быть введено в составе композиции с поддерживаемым высвобождением. Антитело может быть введено, например,интраперитонеально, орально, подкожно, внутримышечно, местно, интраназально, внутривенно или внутричерепным образом. В некоторых способах используют полинуклеотид, кодирующий по крайней мере одну цепь антитела. При этом обеспечивают экспрессию данного полинуклеотида с получением цепи антитела в организме больного. Полинуклеотид может кодировать тяжелую или легкую цепь антитела. В некоторых случаях наблюдают за уровнем введенного антитела в крови пациента. В другом контексте изобретение относится к способам предотвращения или лечения заболевания,ассоциированного с отложением амилоида А в мозге больного. Например, способы могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера, синдрома Дауна или когнитивной недостаточности. Такие способы включают введение фрагментов А или его аналогов, что вызывает иммуногенный ответ на определенные эпитопы в пределах А. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы полипептида, содержащего N-концевой сегмент по крайней мере остатков 1-5 А, первый остаток А является N-концевым остатком полипептида, в то время как полипептид свободен от С-концевого сегмента А. Другие способы включают введение больному эффективной дозы полипептида, включающего N-концевой сегмент А, сегмент начинается остатками 1-3 А и заканчивается остатками 7-11 А. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы агента, который индуцирует иммуногенный ответ на N-концевой сегмент А, сегмент начинается остатками 1-3 А и заканчивается остатками 7-11 А. При этом иммуногенный ответ не индуцируется против эпитопа, находящегося в пределах остатков 12-43 А 43. В некоторых из описанных выше способах N-концевой сегмент А связывают на С-концевом участке с гетерологичным пептидом. В других из описанных выше способах N-концевой сегмент А связывают на N-концевом участке с гетерологичным полипептидом. Иногда N-концевой сегмент А связывают на N- и С-концевых участках с первым и вторым гетерологичными полипептидами. ТакжеN-концевой сегмент А связывают на N-концевом участке с гетерологичным полипептидом, а на Сконцевом участке - по крайней мере с одной дополнительной копией N-концевого сегмента. В определенных случаях гетерологичный полипептид включает по крайней мере одну дополнительную копию Nконцевого сегмента. Может быть так, что полипептид включает от N-концевого участка к С-концевому участку N-концевой сегмент А, многочисленные дополнительные копии N-концевого сегмента и гетерологичный аминокислотный сегмент. В некоторых способах N-концевой сегмент содержит А 1-7. Иногда N-концевой сегмент содержит А 3-7. В определенных способах фрагмент свободен по крайней мере от 5 С-концевых аминокислотных остатков А 43. В некоторых случаях фрагмент содержит до 10 непрерывных аминокислот А 43. Фрагменты обычно вводят пациенту в дозе, составляющей более 10 мкг. В некоторых способах фрагмент вводят вместе с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на пептид А. Адъювант и фрагмент могут вводиться последовательно или в составе одной композиции. Адъювант может быть, например, гидроксидом алюминия, фосфатом алюминия, MPL, QS-21(Stimulon) или неполным адъювантом Фрейнда. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей фрагменты А или другие агенты, вызывающие иммуногенный. ответ к тем эпитопам А, которые описаны выше, и адъювант. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любое из описанных выше антител и фармацевтически приемлемый носитель.-2 006630 Краткое описание чертежей Фиг. 1 - показан титр антител после инъекции трансгенным мышам А 1-42. Фиг. 2 - отложения амилоида в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной амилоидными бляшками, осуществлялась в реакции со специфическим к А моноклональным антителом 3D6 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны в соответствии с группой обработки. Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса. Фиг. 3 - невритическая дистрофия в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной дистрофическим невритом, осуществлялась в реакции со специфическим к АРР моноклональным антителом человека 8 Е 5 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны для обработанной AN 1792 группы и группы, обработанной PBS (контроль). Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса. Фиг. 4 - астроцитоз в ретросплениальной коре. Оценка в процентах области коры, в которой выявляются астроциты, положительные по глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), осуществлялась с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга (реакция иммунного окрашивания). Оценка для индивидуальных мышей показана в соответствии с группой обработки и средние оценки по группе отмечены горизонтальными линиями. Фиг. 5 - геометрическое выражение титра антител к А 1-42 после иммунизации 8 дозами AN 1792,содержащими 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 или 300 мкг белка соответственно. Фиг. 6 - кинетика антительного ответа после иммунизации AN 1792. Титры выражены в геометрических значениях для 6 животных в каждой группе. Фиг. 7 - количественный анализ изображений кортикальных амилоидных отложений у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 8 - количественный анализ изображений невритических бляшек у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 9 - процентный количественный анализ изображений областей ретросплениальной коры, заполненных астроцитами, у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 10 - исследование пролиферации лимфоцитов на клетках селезенки после обработки AN 1792(верхняя панель) и PBS (нижняя панель). Фиг. 11 - общие уровни А-профилей у мышей, иммунизированных производными А или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Фиг. 12 - амилоидные отложения в коре определяли количественным анализом изображений срезов мозга мышей, иммунизированных А-пептидными конъюгатами А 1-5, А 1-12 и А 13-28, полноразмерные агрегаты AN 1792 (А 1-42) и AN 1528 (А 1-40) и обработанная контрольная группа. Фиг. 13 - геометрическое значение титров А-специфических антител в группах мышей, иммунизированных производными А или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Фиг. 14 - геометрическое значение титров А-специфических антител в группах морских свинок,иммунизированных AN 1792 или его пальмитолированным производным вместе с различными адъювантами. Фиг. 15(А-Е) - уровни А в коре 12-месячных мышей PDAPP, обработанных AN 1792 или AN 1528 с различными адъювантами. Фиг. 16 - средние титры антител у мышей, обработанных поликлональным антителом к А. Фиг. 17 - средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 10D5 к А. Фиг. 18 - средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 2F12 к А. Фиг. 19 - эпитопная карта. Рестрицированный N-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус,отобранная на 175 день, была тестирована методом ELISA против серии состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся полипептидов (SEQ ID NO: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности AN 1792. Животное под номером F10920M обнаруживает репрезентативный N-концевой рестрицированный ответ на пептид DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), который соответствует аминокислотам 110 пептида AN 1792 и используется в качестве иммунизирующего антигена. Фиг. 20 - эпитопная карта. Нерестрицированный N-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус,отобранная на 175 день, была тестирована методом ELISA против состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся пептидов (SEQ ID NO: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности AN 1 792. Животное под номером F10975F обнаруживает репрезентативный нерестрицированный N-концевой ответ. Показана реактивность против двух N-концевых пептидов и одного С-концевого пептидаDAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), который соответствует аминокислотам 1-10 пептида AN 1792. Показана реактивность по отношению к двум N-концевым пептидам и одному С-концевому пептидуDAEFRHDSGY, который соответствует аминокислотам 1-10 пептида AN 1792. Определения Понятие "по существу идентичный" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном линеаризованном сравнении, например при использовании программ GAP или BESTFIT на ос-3 006630 нове "пробелов" мол. массы обнаруживают по крайней мере 65%-ную идентичность, предпочтительно 80-90%-ную идентичность, более предпочтительно по крайней мере 95%-ную идентичность или более(например, 99%-ную идентичность или более высокую). Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность служит в качестве референспоследовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и референс-последовательности помещают в компьютер, при необходимости задают последующие координаты и обозначают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Программа сравнения последовательностей затем вычисляет процент идентичности последовательностей, тестируемых по отношению к референспоследовательности, что основано на заданных параметрах программы. Для сравнения должно быть обеспечено оптимальное выравнивание последовательностей, например, при использовании локального алгоритма гомологии Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482(1981), алгоритма гомологии при выравнивании Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), метода поиска сходства Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2444 (1988), компьютеризованных улучшений указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем визуальной оценки (см. в целом, Ausubel et al., см. выше). Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для DLASTанализа публично доступно из Национального центра биотехнологической информации(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Обычно программные значения параметров по умолчанию могут быть использованы для осуществления сравнения последовательностей, хотя заказанные параметры также могут быть применены. Для аминокислотных последовательностей BLAST-программа использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (W)3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу DLOSUM 62 (см.Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989. Для целей классификации аминокислотных замещений как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируются следующим образом. Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): gly, pro; группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами в пределах одной и той же группы. Неконсервативные замены подразумевают замену аминокислоты одной группы на замену аминокислоты другой группы. Заявленные в соответствии с настоящим изобретением терапевтические агенты обычно свободны от нежелательных контаминантов. Это означает, что агент обычно имеет по крайней мере примерно 50%-ную чистоту (вес/вес), будучи по существу свободным от примесных белков и контаминантов. Иногда агенты имеют по крайней мере примерно 80%-ную чистоту (вес/вес), более предпочтительно по крайней мере 90%-ную или примерно 95%-ную (вес/вес) чистоту. Однако при использовании соответствующих методов очистки белков могут быть получены гомогенные пептиды, имеющие по крайней мере 99% чистоты (вес/вес). Специфическое связывание между двумя молекулами называется аффинностью. Аффинность может составлять по крайней мере 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1. Предпочтительна аффинность более 108 М-1. Понятие "антитело" или "иммуноглобулин" используется для обозначения интактных антител и их связывающих фрагментов. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфическое связывание с антигеном. К фрагментам относятся отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fabc- и Fv-фрагменты. Фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК или путем энзиматического или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Понятие "антитело" также включает одну или более цепей иммуноглобулинов,которые химически конъюгированы с другими белками или экспрессированы как белки слияния. Понятие антитело также означает биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелых/легких цепей и два различных связывающих сайта. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, в том числе слиянием гибридом или связыванием Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148,1547-1553 (1992).APP695, APP751 и АРР 770 обозначают, соответственно, полипептиды длиной 695, 751 и 770 аминокислот, кодируемые геном АРР человека. См. Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525(1988) и Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Аминокислоты амилоидного белка-предшественника человека (АРР) обозначены номерами в соответствии с последовательностью изоформы АРР 770. Сокраще-4 006630 ния А 39, А 40, А 41, А 42 и А 43 относятся к пептиду А, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43. Понятие "антиген" означает субстанцию, которая специфически связывается антителом. Понятие "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к участку антигена, на который отвечают Т- или В-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть сформированы как непрерывной последовательностью аминокислот, так и прерывающимися в линейной последовательности аминокислотами за счет четвертичного скручивания белка. Эпитопы, сформированные непрерывной последовательностью аминокислот, обычно сохраняют свою структуру при обработке денатурирующими растворителями, в то время как структура эпитопов, образованных в результате четвертичного скручивания белка, утрачивается при такой обработке. Эпитоп обычно включает по крайней мере 3 и более, по крайней мере 5 или 8-10 аминокислот, имеющих уникальную пространственную конформацию. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66, Glenn E. Vorris, Ed. (1996). Антитела, которые распознают тот же самый эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью. Т-клетки распознают эпитопы, сформированные последовательными аминокислотами. Такой эпитоп содержит 9 аминокислот для CD8-клеток и около 1315 аминокислот для CD4-клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированыin vitro, основанными на измерении антигензависимой пролиферации по включению 3 Н-тимидина в праймированные Т-клетки в ответ на эпитоп (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994, по антигензависимому киллингу (исследование цитотоксических Т-лимфоцитов, Tigges et al., J. Immunol. 156, 39013910) или по секреции цитокинов. Понятие "иммунологический" или "иммунный" ответ означает развитие гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного на амилоидный пептид, в организме реципиента. Такой ответ может быть активным, индуцированным введением иммуногена, или пассивным, индуцированным введением антител или праймированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ обеспечивается презентацией полипептидных эпитопов вместе с молекулами МНС класса I или класса II для активации антиген-специфических CD4+ хелперных Т-клеток и/или CD8+ цитотоксических Т-клеток. Иммунный ответ может также включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток, базофилов, дендритных клеток,астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов или других клеток иммунной системы. Наличие опосредованного клетками иммунного ответа может быть определено в исследованиях пролиферации CD4+ Тклеток или цитотоксических Т-лимфоцитов (см. Burke, выше; Tigges, выше). Относительный вклад гуморального и клеточного ответов в протективный или терапевтический эффект иммуногена может быть установлен раздельным выделением антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и определением протективного или терапевтического эффекта у второго индивидуума."Иммуногенный агент" или "иммуноген" способен индуцировать иммунологический ответ при введении его млекопитающему, при необходимости вместе с адъювантом. Понятие "раздетый полинуклеотид" означает полинуклеотид, не находящийся в комплексе с коллоидным материалом. Иногда "раздетые полинуклеотиды" клонируют в плазмидном векторе. Понятие "адъювант" относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но когда вводится само по себе, не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ различным образом, в том числе за счет забора лимфоцитов, стимуляции В- или Т-клеток и стимуляции макрофагов. Понятие "пациент" относится к человеку и другому млекопитающему, которое получает профилактическое или терапевтическое лечение. Дезагрегированный или мономерный А представляет собой растворимый мономерный пептид А. Одним из способов получения мономерного А является растворение лиофилизированного пептида в очищенном DMSO с обработкой ультразвуком. Полученный раствор центрифугируют для удаления каких-либо нерастворившихся образований. Агрегированный А представляет собой смесь олигомеров,в которой мономерные единицы удерживаются вместе посредством нековалентных связей. Конкуренцию между антителами определяют в исследовании, когда тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референс-антититела с общим антигеном, например А. Известны многочисленные модификации анализа конкурентного связывания, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноэссей (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноэссей (EIA), сэндвичный конкурентный анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253(1986; твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвичевый анализ с меткой (см.Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988; твердофазный прямой RIA с меткой при использовании в качестве метки 125I (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15-5 006630 прямой RIA с меткой (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990. Обычно такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеток, несущих такой антиген, немеченного тестируемого иммуноглобулина и меченного референс иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой фазой или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицируемые в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно близким к эпитопу, с которым связывается референс-антитело. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном по крайней мере на 50 или 75%. Композиции и способы, включающие один или более из описанных выше элементов, могут включать и другие элементы, специфически не оговоренные. Например, композиция, которая содержит Апептид, относится к композиции, содержащей выделенный А-пептид и А-пептид как составляющую часть более длинной полипептидной последовательности. Сущность изобретенияI. Общие положения Некоторые амилоидогенные заболевания и состояния характеризуются отложениями А-пептида,агрегированного в нерастворимую массу, в мозге больного. К таким заболеваниям относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя является симптомом болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, но может развиваться и сама по себе. Например, средней тяжести когнитивная недостаточность или связанная с возрастом потеря памяти наблюдается у больных, у которых еще не развилась в полной мере, а может быть никогда и не разовьется болезнь Альцгеймера. Средней тяжести когнитивная недостаточность может быть определена в соответствии с программой MinimentalState Exam и действующими рекомендациями. Указанные заболевания характеризуются наличием агрегатов А, имеющих -складчатую структуру и окрашивающихся красителем Конго Красный. Основной подход к предотвращению или лечению болезни Альцгеймера или других амилоидогенных болезней заключается в обеспечении развития иммунного ответа на компонент амилоидного отложения в организме больного, как описано в заявке WO 99/27944 (ссылочный материал). Настоящее изобретение подтверждает эффективность такого подхода. Однако оно принципиальным образом улучшает существующие реагенты и способы. В первую очередь, авторы настоящего изобретения локализовали предпочтительные эпитопы А-пептида, против которых следует направить иммуногенный ответ. Идентификация предпочтительных эпитопов А-пептида привела к разработке агентов и способов, имеющих повышенную эффективность, редуцированные побочные эффекты и/или более легкое производство, приготовление и использование.II. Терапевтические агенты Иммуногенный ответ может быть активным, когда иммуноген вводится для индуцирования антител, взаимодействующих с А в организме больного, или пассивным, когда в организм больного вводятся готовые антитела, связывающие А. 1. Агенты, индуцирующие активный иммунный ответ. Терапевтические агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к различным эпитопам А-пептидов. Предпочтительные агенты включают пептид А как таковой и его фрагменты. Также могут быть использованы варианты таких сегментов, аналоги и миметики природного Апептида, которые индуцируют образование антител и/или перекрестно реагируют с антителами к предпочтительным эпитопам А-пептида. А, также известный как -амилоидный пептид А 4 (см. US 4666829; Glenner and Wong, Biochem.Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984 представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. А образуется путем процессинга более крупного белка АРР с помощью двух ферментов, называемых - и -секретазами (см.Hardy, TINS 20, 154 (1997. Известные мутации АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, обнаруживаются в непосредственной близости от сайта - или -секретазы или в пределах А. Например,положение 717 является проксимальным по отношению к сайту расщепления -секретазой АРР с образованием А, а положение 670/671 является проксимальным по отношению к сайту расщепления секретазой. Полагают, что мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет нарушения реакций расщепления, за счет которых образуется А, так что увеличивается количество форм А, состоящих из 42/43 аминокислот. А обладает тем необычным свойством, что способен фиксировать и активировать как классический, так и альтернативный пути активации комплемента. В частности, он связывает C1q и обязательно С 3bi. Указанный комплекс обеспечивает связывание с макрофагами, что приводит к активации -клеток. Более того, C3bi далее расщепляется и связывает CR2 на -клетках зависимым от Т-клеток образом с-6 006630 обеспечением активации указанных клеток в 10000 раз. Данный механизм способствует тому, что А генерирует избыточный иммунный ответ по отношению к другим антигенам. Известны различные формы природного А. К формам А человека относятся А 39, А 40, А 41,А 42 и А 43. Последовательности указанных пептидов и их взаимосвязь с предшественником АРР проиллюстрированы на фиг. 1 Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Например, А 42 имеет следующую последовательность:A 41, A 40 и А 39 отличаются от А 42 отсутствием Ala, Ala-Ile, Ala-Ile-Val соответственно на С-концевом участке. А 43 отличается от А 42 наличием треонинового остатка на С-концевом участке. Иммуногенные фрагменты А имеют преимущество по сравнению с интактной молекулой А в заявленных способах по следующим причинам. Во-первых, поскольку только некоторые эпитопы в пределах А индуцируют необходимый для лечения болезни Альцгеймера иммуногенный ответ, эквивалентная доза массы фрагмента, содержащего такие эпитопы, обеспечивает большую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем доза интактного А. Во-вторых, определенные иммуногенные фрагменты А генерируют иммуногенный ответ против отложений амилоида без инициации значительного иммунного ответа против белка АРР, из которого образуется А. В-третьих, фрагменты А проще изготовить, чем интактный А из-за более короткого размера. В-четвертых, фрагменты А не агрегирует таким образом, как интактный А, облегчая приготовление фармацевтических композиций и их применение. Некоторые иммуногенные фрагменты А имеют последовательность, состоящую по крайней мере из 2, 3, 5, 6, 10 и 26 последовательно расположенных аминокислот природного пептида. Некоторые иммуногенные фрагменты имеют более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непоследовательно расположенных остатков А. Фрагменты N-концевой половины пептида А предпочтительны. Предпочтительные иммуногенные фрагменты включают А 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение А 1-5, например, указывает на фрагмент, включающий остатки 1-5 А и утративший другие остатки А. Фрагменты, начинающиеся с остатков 1-3 А и заканчивающиеся остатками 7-11 А, особенно предпочтительны. Фрагмент А 1-12 также может быть использован, но менее предпочтителен. В некоторых способах фрагмент является Nконцевым фрагментом, другим, нежели фрагмент А 1-10. К другим менее предпочтительным фрагментам относятся фрагменты А 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 и 35-42. Указанные фрагменты требуют скрининга на активность в отношении предотвращения образования или разрушения отложений амилоида, как описано в примерах, до использования. Фрагменты, утратившие по крайней мере одну и иногда по крайней мере 5-10 С-концевых аминокислот по сравнению с природными формами А, используются в некоторых способах. Например, фрагмент, утративший 5 аминокислот С-концевого участка А 43,включает первые 38 аминокислот N-концевого участка А. Другие компоненты амилоидных бляшек,например синуклеин и его эпитопные фрагменты также могут быть использованы для индукции иммуногенного ответа. Если не указано иное, ссылка на А означает природную аминокислотную последовательность белка человека, описанную выше, а также на ее аналоги, включая аллельные, видовые и индуцированные варианты. Аналоги обычно отличаются от природно существующих пептидов по одному, двум или нескольким положениям, часто за счет консервативных замещений. Аналоги обычно обнаруживают по крайней мере 80 или 90%-ное сходство последовательностей в сравнении с последовательностями природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Nили С-концевых аминокислот по одному, двум или нескольким положениям. Например, природный остаток аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 А может быть заменен изоаспарагиновой кислотой. Примерами неприродных аминокислот являются D-аминокислоты, L-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, -N,N,Nтриметил-лизин,О-фосфосерин,N-ацетилсерин,N-формилметионин,3-N-ацетил-лизин,метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и изоаспарагиновая кислота. Фрагменты и аналоги могут быть скринированы на профилактическую или терапевтическую эффективность при использовании моделей на трансгенных животных в сравнении с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо, как описано ниже. А, его фрагменты и аналоги могут быть синтезированы твердофазным методом или получены путем рекомбинантной экспрессии. Они также могут быть выделены из природных источников. Автоматические синтезаторы пептидов коммерчески доступны от различных поставщиков, таких как Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбинантная экспрессия может быть получена в бактериях, напримерE.coli, дрожжах, клетках насекомых или клетках млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989). Некоторые формы А-пептида также доступны коммерчески (например, American Peptides Company, Inc.,Sunnyvale, СА и California Peptide Research, Inc. Napa, CA).-7 006630 Терапевтические агенты также включают более длинные полипептиды, содержащие, например, активный фрагмент А-пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные агенты включают белки слияния, содержащие сегмент А, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которые индуцируют Т-хелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, таким образом, В-клеточный ответ против сегмента А. Такие полипептиды могут быть скринированы для анализа профилактической или терапевтической эффективности на моделях на животных по сравнению с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо,как описано ниже. Пептид А, аналог, активный фрагмент или другой полипептид может вводиться в ассоциированной или мультимерной форме или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры мономерных иммуногенных агентов. Кроме того, иммуногенный пептид, например фрагмент А, может быть представлен с помощью вируса или бактерии как части фармацевтической композиции. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный пептид, вводится в геном или эписому вируса или бактерии. Иногда нуклеиновая кислота вводится таким образом, что иммуногенный пептид экспрессируется как секретируемый белок или как белок слияния с внешним поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерии, так что пептид может быть представлен на поверхности вируса или бактерии. Вирусы или бактерии, используемые в таких способах, должны быть непатогенными или аттенуированными. Подходящие вирусы включают аденовирусы, HSV, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфавирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдовирусы, вирус вакцины и оспы домашней птицы. К подходящим бактериям относятся Salmonella и Shigella. Особенно полезным является слияние иммуногенного пептида с HbsAg HBV. К терапевтическим агентам также относятся пептиды и другие соединения, которые необязательно имеют существенную аминокислотную последовательность, сходную с таковой А, но обязательно являются миметиками А и вызывают аналогичный иммунный ответ. Например, любые пептиды и белки, формирующие -складчатую структуру, могут быть оценены на пригодность. Также могут быть использованы антиидиотипические антитела против моноклональных антител к А и другим амилоидогенным пептидам. Такие анти-Id антитела имитируют антиген и генерируют против него иммунный ответ (см. Essential Immunology Roit ed., Blackwell Scientific Publicftions, Palo Alto, 6th ed., p. 181). Агенты, отличные от А-пептидов, способны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более одного предпочтительных сегментов А, перечисленных выше (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7). Предпочтительно такие агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к одному из указанных сегментов и не направленный к другим сегментам А. Выборочные библиотеки пептидов или других соединений также могут быть скринированы на полезность. Комбинаторные библиотеки могут быть получены для различных типов соединений, которые могут быть синтезированы методикой "шаг за шагом". К таким соединениям относятся полипептиды,миметики -поворота, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки указанных соединений могут быть сконструированы способом кодируемых синтетических библиотек (ESL), описанным Affimax, WO 95/12608, Affimax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/080501, Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (каждая работа включена в настоящее описание в качестве ссылки). Пептидные библиотеки также могут быть получены с помощью методов фагового дисплея. См., например, Devlin, WO 91/18980. Комбинаторные библиотеки и другие соединения могут быть первоначально скринированы на пригодность путем определения их способности связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), для которых известна их специфичность по отношению к А или другим амилоидогенным пептидам. Например, первоначальный скрининг может быть осуществлен при использовании поликлональной сыворотки или моноклональных антител к А или его фрагментам. Затем соединения могут быть тестированы на связывание со специфическим эпитопом А (например, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7). Соединения могут быть тестированы теми же самыми методами, которые описаны для картирования антительной эпитопной специфичности. Соединения, идентифицированные такими методами, затем анализируют на их способность индуцировать образование антител или реакционноспособных лейкоцитов, активных в отношении А или его фрагментов. Например, многочисленные разведения сыворотки могут быть тестированы в планшетах для микротитрования, предварительно "покрытых" А или его фрагментами, с помощью стандартного метода ELISA для выявления реакционноспособных антител к А или его фрагментам. Соединения могут быть тестированы на профилактическую и терапевтическую эффективность на трансгенных животных с амилоидогенным заболеванием, как описано в примерах. К таким животным относятся, например, мыши с мутацией 717 АРР, описанные Games et al., см. выше, и мыши, несущие шведскую мутацию 670/671 АРР, описанные McConlogue et al., US 5612486 и Hsiao et al., Science 274, 99-8 006630 скрининга может быть использована для поиска других потенциальных агентов, взаимодействующих с аналогами А и более длинными пептидами, включающими фрагменты А, описанные выше. 2. Агенты, индуцирующие пассивный иммунный ответ. Терапевтические агенты в соответствии с изобретением включают антитела, которые специфически связываются с А или другим компонентом амилоидных бляшек. Такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Некоторые из таких антител специфически связываются с агрегированной формой А и не связываются с диссоциированной формой. Другие специфически связываются с диссоциированной формой и не связываются с агрегированной формой. Некоторые антитела специфически связываются с обеими формами. Одни антитела связываются с природной короткой формой А (А 39, 40 или 41) и не связываются с природной длинной формой А (А 42, 43). Некоторые антитела связываются с длинной формой и не связываются с короткой формой. Некоторые антитела связываются с А и не связываются с полноразмерным амилоидным белком-предшественником. Антитела, используемые в терапевтических способах, обычно имеют интактный константный район или, по крайней мере,достаточный участок константного района для взаимодействия с Fc-рецептором. Предпочтительно использование антител человека изотипа IgG1, поскольку они имеют наибольшую аффинность среди всех изотипов антител человека к FcRI рецептору на фагоцитарных клетках. Могут быть также использованы биспецифические Fab-фрагменты, в которых одно плечо антитела имеет специфичность к А, а другое к Fc-рецептору. Некоторые антитела связываются с А с аффинностью, более или эквивалентной около 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1. Поликлональная сыворотка обычно содержит смешанные популяции антител, связывающихся с определенными эпитопами вдоль А. Однако поликлональная сыворотка может быть специфичной к определенному сегменту А, такому как А 1-10. Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом А, который может быть конформационным или неконформационным эпитопом. Профилактическая и терапевтическая эффективность антител может быть тестирована на трансгенных животных,как описано в примерах. Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 А (с первым N-концевым остатком природного А, обозначенным 1). Некоторые предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом в пределах аминокислот 1-5 А, а другие - с эпитопом 5-10. Другие предпочтительные антитела связываются с эпитопами в пределах аминокислот 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопом,который начинается с остатков 1-3 и заканчивается остатками 7-11 А. Менее предпочтительные антитела связываются с эпитопами в пределах остатков 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 или 10-25 А. Рекомендуется, чтобы такие антитела были скринированы на активность на моделях на мышах, описанных ниже в примерах. Например, было обнаружено, что некоторые антитела к эпитопам в пределах остатков 10-18, 16-24, 18-21 и 33-42 не имеют активности. В некоторых способах многочисленные моноклональные антитела, специфически связывающиеся с различными эпитопами. Такие антитела могут быть введены последовательно или одновременно. Могут быть использованы антитела к другим компонентам амилоида, нежели А. Например, антитела могут быть направлены к ассоциированному с амилоидом белку синуклеину. Если антитело связывает эпитоп в пределах специфических остатков, таких как, например, А 1-5,это означает, что оно специфически связывается с полипептидом, включающим специфические остатки(т.е. остатки 1-5 А в данном примере). Такое антитело не обязательно контактирует с каждым остатком из остатков 1-5 А. Не каждая аминокислотная замена или деления в пределах остатков 1-5 А обязательно существенным образом влияет на связывающую аффинность. Эпитопная специфичность антитела может быть определена, например, созданием фаговой дисплейной библиотеки, в которой различные фаги представляют различные последовательности А. Затем фаговую дисплейную библиотеку скринируют для отбора фагов, специфически связывающихся с тестируемым антителом. Затем выделяют семейство последовательностей. Обычно такое семейство содержит общую коровую последовательность и варьирующие по длине фланкирующие последовательности в различных фагах. Наиболее короткую коровую последовательность, показывающую специфическое связывание с антителом, определяют как эпитоп. Затем антитела могут быть тестированы на эпитопную специфичность в конкурентном анализе с антителом, эпитопная специфичность которого уже определена. Например, антитела, которые конкурируют с антителом CD6 за связывание с А, связывают тот же самый или сходный эпитоп, что и антитело 3D6, т.е. в пределах аминокислотных остатков 1-5 А. Аналогичным образом, антитела, которые конкурируют с антителом 10D5, связывают тот же самый или сходный эпитоп, что и антитело 10D5, т.е. в пределах аминокислотных остатков 3-6 А. Скрининг антител на эпитопную специфичность необходим для оценки их терапевтической эффективности. Например, антитело, связывающееся с эпитопом в пределах остатков 1-7 А, скорее всего будет эффективным в предотвращении и лечении болезни Альцгеймера. Моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом А и не связываются с другими участками А, имеют многочисленные преимущества по сравнению с моноклональными антителами, которые связываются с другими участками А или поликлональной сывороткой к интактному А. Во-первых, для эквивалентных массовых доз дозы антител, которые специфически связываются с предпочтительными сегментами А, содержат большую молярную дозу антител, эффективных в разрушении амилоидных бляшек. Во-вторых, антитела специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами А, могут индуцировать явный ответ на отложения амилоида и не индуцировать такого ответа на интактный полипептид АРР, тем самым снижая потенциально возможные побочные эффекты.i. Основные характеристики иммуноглобулинов. Как известно, основная структурная единица антитела представляет собой тетрамер единиц. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар нуклеотидных цепей. Каждая пара имеет одну "легкую"(около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область, содержащую около 100-110 или более аминокислотных остатков, в первую очередь отвечающих за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи включает константную область, отвечающую за эффекторную функцию. Легкие цепи классифицируются как каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD иIgE соответственно. В пределах легкой и тяжелой цепей вариабельные и константные участки объединяются участком "J", состоящим примерно из 12 или более аминокислот. Тяжелые цепи также содержат участок "D", состоящий примерно из 10 или более аминокислот (см., в основном, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1089, Ch. 7) (указанный источник информации включен в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей). Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепи формируют антиген-связывающий сайт. Таким образом, интактное антитело имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два связывающих сайта одного и того же антитела идентичны. Во всех цепях обнаруживаются участки с относительно консервативной общей структурой, называемые каркасными участками (framework regions, FR). Они соединены с тремя гипервариабельными участками,которые также называют участками, определяющими комплементарность или CDRs. CDRs двух цепей каждой пары имеют определенную конфигурацию в пространстве благодаря каркасным участкам, обеспечивая связывание со специфическим эпитопом. Начиная от N-концевого участка в направлении к Сконцевому участку легкая и тяжелая цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Порядок расположения аминокислот в каждом домене определен Кабатом [ Kabat, Sequences of Proteinsii. Получение антител, имеющих иную видовую принадлежность по отношению к антителам человека. Получение моноклональных антител другой видовой принадлежности, например антител мыши,морской свинки, кролика, крысы, обезьян, может быть осуществлено, например, иммунизацией животного А. Могут быть использованы более длинный полипептид, содержащий А, иммуногенный фрагмент А или антиидиотипические антитела к антителу против А. См. Lane, Antibodies, A LaboratoryManual (CSHP NY, 1988) (работа включена в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей). Такой иммуноген может быть получен из природного источника, синтезом пептидов или рекомбинантной экспрессией. Необязательно иммуноген может использоваться в форме слитого белка или в комплексе с белком-носителем, как описано ниже. Иногда иммуноген может вводиться вместе с адъювантом. Могут быть использованы различные типы адъювантов, как описано ниже. Полный адъювант Фрейнда предпочтителен по сравнению с неполным адъювантом Фрейнда для иммунизации лабораторных животных. Для получения поликлональных антител обычно используются кролики или морские свинки. Мыши обычно используются для получения моноклональных антител. Антитела тестируются на специфическое связывание со специфическим участком А. В последнем случае тестирование может осуществляться определением связывающей способности антитела с коллекцией делеционных мутантов пептида А и выяснением того, какие делеционные мутанты связывают антитело. Связывание может быть определено,например, Вестерн-блоттингом или ELISA. Наименьший фрагмент пептида А, обнаруживающий специфическое связывание, определяют как эпитоп. Альтернативно, эпитопная специфичность может быть определена в конкурентном анализе, в котором тестируемое и референс-антитело конкурируют за связывание с А. Если тестируемое и референс-антитело являются конкурентами, т.е. если они связываются с одним и тем же эпитопом или достаточно близкими к нему эпитопами, то одно тело будет конкурировать с другим за сайт связывания. Предпочтительный изотип указанных антител является изотипом IgG2a мыши или эквивалентным изотипом антител другой видовой принадлежности. Изотип IgG2a антитела мыши эквивалентен изотипу IgG1 антитела человека.iii. Химерные и гуманизированные антитела. Химерные и гуманизированные антитела имеют ту же самую или сходную связывающую специфичность и активность, что и антитела мыши и другие антитела нечеловеческого происхождения, которые являются исходным материалом для конструирования химерных или гуманизированных антител.- 10006630 Химерные антитела представляют собой антитела, у которых экспрессия легких и тяжелых цепей обеспечивается генами, сконструированными обычно методами генной инженерии, на основе сегментов генов Ig, принадлежащих различным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов моноклонального антитела мыши могут быть соединены с константными (С) сегментами антитела человека, такого какIgG1 и IgG4. Предпочтительно использование антитела человека изотипа IgG1. Типичное химерное антитело, таким образом, представляет собой гибридный белок, содержащий V, или антиген-связывающий домен, антитела мыши и С, или эффекторный домен, антитела человека. Гуманизированные антитела имеют каркасную область вариабельного участка, в основном представленную аминокислотами антитела человека (называемого акцепторным антителом) и участки, определяющие комплементарность, в основном представленные аминокислотами антитела мыши (называемого донорным иммуноглобулином). См. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989) иWO 90/07861, US 5693762, US 5693761, US 5585089, US 5530101 и Winter, US 5225539 (все указанные источники информации включены в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей). Константный участок (участки), если присутствует (присутствуют), также, в основном, или полностью происходит (происходят) из иммуноглобулина человека. Вариабельные домены антитела обычно выбирают из антител человека, в которых последовательности каркасных областей обнаруживают высокую степень идентичности с доменами вариабельных участков антител мыши, из которых получены CDRs. Каркасные аминокислоты вариабельного участка легкой и тяжелой цепей могут быть получены из тех же самых или других последовательностей антитела человека. Последовательности антитела человека могут быть последовательностями существующих в природе антител человека или могут быть консенсусными последовательностями различных антител человека. См. Carter et al., WO 92/22653. Определенные аминокислоты каркасных областей вариабельного участка антитела человека выбирают для замещения на основе их способности влиять на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Обнаружение таких возможных влияний подразумевает моделирование, оценку свойств аминокислот в определенных положениях или эмпирическое наблюдение за эффектами замещений или мутагенеза определенных аминокислот. Например, когда аминокислоты каркасного района вариабельного участка антитела мыши и выбранного каркасного района вариабельного участка антитела человека различаются между собой, аминокислоту каркасного района антитела человека обычно следует заместить эквивалентной аминокислотой каркасного района антитела мыши в тех случаях, если обоснованно ожидается, что аминокислота:(1) непосредственно нековалентно связывает антиген;(4) принимает участок во взаимодействии VL-VH. Другие кандидаты на замещение представляют собой акцепторные аминокислоты каркасного участка антитела человека, которые необычны для Ig человека в данном положении. Такие аминокислоты могут быть замещены аминокислотами из эквивалентного положения донорного антитела мыши или из эквивалентного положения Ig человека. Каркасные районы вариабельных областей гуманизированных антител обычно обнаруживают по крайней мере 85%-ную идентичность последовательностей с каркасными районами вариабельных областей антитела человека или соответствуют таким последовательностям (являются по отношению к ним консенсусными).IV. Антитела человека Антитела человека к пептиду А получают с помощью различных методов, известных из уровня техники, описанных выше. Некоторые антитела человека отбирают на основе экспериментов по конкурентному связыванию или на основе того, что они имеют ту же самую эпитопную специфичность, что и определенное антитело мыши, например такое, как одно из описанных в примере IХ моноклональных антител. Антитела человека могут также быть отобраны на основе определенной эпитопной специфичности по использованию только фрагмента А в качестве иммуногена и/или путем скрининга антител против коллекции делеционных мутантов А. Антитела человека предпочтительно имеют изотип IgG1.(1) Методика триомы. Основная методика и клеточная линия для слияния SPAZ-4, используемая в этом подходе, описаныOestberg et al., Hybridoma 2: 361-367 (1983); Oestberg, U.S. Патент 4634664 и Engleman et al., U.S. Патент 4634666 (каждый из документов включен в настоящее описание в качестве ссылки). Антителопродуцирующие клеточные линии, полученные с помощью данного метода, называются триомами, поскольку они получены при слиянии трех клеточных линий - двух человеческих и одной мышиной. Сначала линию мышиных миеломных клеток сливают с В-лимфоцитами с получением не продуцирующей антител ксеногенной гибридной линии, такой как SPAZ-4, описанной Oestberg, см. выше. Затем ксеногенную линию сливают с иммунизированными В-лимфоцитами человека с получением антителопродуцирующей триомной клеточной линии. Обнаружено, что триомы продуцируют антитела более стабильно, чем обычные гибридомы, полученные на основе клеток человека. Иммунизированные В-лимфоциты полу- 11006630 чают из крови, селезенки, лимфатических узлов или из костного мозга человека-донора. Если необходимо получить антитела против специфического антигена или его эпитопа, предпочтительно использовать антиген или эпитоп для иммунизации. Иммунизацию можно осуществлять in vivo. Для иммунизации invivo В-клетки обычно выделяют из организма - человека, иммунизированного А, его фрагментом, полипептидом большей длины, содержащим А или его фрагмент, или антиидиотипическим антителом к антителу против А. В некоторых случаях В-клетки выделяют из организма того же самого пациента,для которого в конечном счете предназначена антительная терапия. Для иммунизации in vitro Влимфоциты обычно подвергают воздействию антигена в течение 7-14 дней в среде, такой как RPMI-1640(см. Engleman, выше) с добавлением 10% плазмы крови человека. Иммунизированные В-лимфоциты сливают с ксеногенными гибридными клетками, например линией SPAZ-4 хорошо известными методами. Например, клетки обрабатывают 40-50%-ным полиэтиленгликолем мол. массы 1000-4000 примерно при 37 С в течение 5-10 мин. Клетки отделяют от среды слияния и размножают в среде, селективной для нужных гибридов (например, HAT или АН). Клоны, секретирующие антитела, обладающие требуемой специфичностью, идентифицируют путем исследования культуральной среды триомы на способность связываться с А или его фрагментом. Триомы, продуцирующие антитела человека нужной специфичности, субклонируют методом лимитирующих разведений и выращивают in vitro в культуральной среде. Затем полученные триомные линии тестируют на способность связываться с А или его фрагментом. Несмотря на то, что триомы генетически стабильны, они не продуцируют антител в очень высоких титрах. Экспрессируемые уровни могут быть увеличены клонированием генов антител из триомы в одном или более векторах и трансформацией такими векторами стандартных клеточных линий млекопитающих, бактерий или дрожжей.(2) Трансгенные млекопитающие, за исключением человека. Антитела человека к А могут быть также получены в трансгенных млекопитающих (не включая человека), имеющих трансгены, кодирующие, по крайней мере, сегмент локуса Ig человека. Обычно эндогенный Ig-локус таких трансгенных млекопитающих функционально инактивирован. Предпочтительно сегмент локуса Ig человека включает неперестроенные последовательности тяжелой и легкой цепей. Инактивация генов эндогенного Ig и введение экзогенных Ig-генов могут быть достигнуты путем направленной гомологичной рекомбинации или путем интрадукции YAC хромосом. Полученные указанным способом трансгенные млекопитающие способны к функциональной перестройке Igпоследовательностей и экспрессии спектра антител различных изотипов, кодируемых генами Ig человека без экспрессии генов эндогенных Ig. Получение и свойства млекопитающих с указанными характеристиками детально описаны, например, Lonberg et al., WO 93/12227(1993). US 5877397; US 5874299; US 5814318; US 5789650; US 5770429; US 5661016; US 5633425; US 5625126; US 5569825; US 5545806, Nature 148: 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14: 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (все источники информации приведены в качестве ссылок для всех целей). Трансгенные мыши особенно подходят для решения указанных задач. Анти-А антитела получают иммунизацией трансгенных животных(не включая человека), как описано Lonberg или Kucherlapati, см. выше, А или его фрагментом. Моноклональные антитела получают, например, сливанием В-клеток таких животных с подходящими миеломными клеточными линиями, согласно методике Клера-Мильштейна. Поликлональные антитела человека могут быть также получены в виде сыворотки крови людей, иммунизированных иммуногенным агентом. Такие поликлональные антитела могут быть сконцентрированы аффинной очисткой при использовании А или другого амилоидного пептида в качестве аффинного реагента.(3) Методы фагового дисплея. Другой подход к получению антител человека к А заключается в скрининге ДНК-библиотеки из В-клеток человека в соответствии с основной методикой, описанной Huse et al., Science 246: 1275-1281(1989). Как указано в разделе о способе получения триом, такие В-клетки могут быть получены из организма человека, иммунизированного А, фрагментами А, более длинными полипептидами, содержащими А или фрагменты А, или антиидиотипическими антителами. Такие клетки также могут быть получены из организма больного человека, который, в конечном счете, будет подвергнут антительной терапии. Отбирают антитела, связывающиеся с А или фрагментом А. Затем клонируют и амплифицируют последовательности ДНК, кодирующие такие антитела (или их связывающие фрагменты). Считается, что методика, описанная Huse, более эффективна в сочетании с фагово-дисплейным подходом. См.,например, Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5837242, US 5733743 и US 5565332 (каждый источник информации приведен в настоящем описании в качестве ссылки для всех целей). В указанных методах получают фаговые библиотека, причем каждый фаг экспонирует на своей поверхности различные антитела. Обычно антитела экспонируются как Fv или Fab фрагменты. Антитела нужной специфичности, полученные фагово-дисплейным методом, отбирают с помощью аффинного обогащения при использовании пептида А или его фрагмента. Применяя один из вариантов фагово-дисплейного метода, могут быть получены антитела человека,имеющие специфичность связывания отобранных антител мыши. См. Wihter, WO 92/20791. Согласно- 12006630 данному методу, вариабельные участки легкой и тяжелой цепи отобранного антитела мыши используют в качестве исходного материала. Если, например, вариабельный участок используется в качестве исходного материала, фаговую библиотеку конструируют таким образом, что каждый фаг экспонирует на своей поверхности один и тот же вариабельный участок легкой цепи (т.е. исходный материал мышиного происхождения) и различные вариабельные участки тяжелых цепей. Вариабельные участки тяжелых цепей получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков тяжелых цепей антител человека. Фаги, обнаруживающие сильное специфическое связывание с А (например, по крайней мере 108 и предпочтительно по крайней мере 109 М-1), отбирают. Вариабельный участок тяжелой цепи антитела человека из указанного фага затем используют в качестве исходного материала для конструирования еще одной фаговой библиотеки. Каждый фаг указанной библиотеки экспонирует один и тот же вариабельный участок тяжелой цепи (т.е. участок, идентифицированный в первой библиотеке) и различные вариабельные участки легких цепей. Вариабельные участки легких цепей получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков легких цепей. Опять-таки фаги, обнаруживающие сильное специфическое связывание с А, отбирают. Такие фаги экспонируют вариабельные участки полных антител человека к А. Эти антитела обычно имеют ту же самую или сходную эпитопную специфичность, что и исходный материал мышиного происхождения.V. Отбор константной области Вариабельные участки легкой и тяжелой цепей химерных, гуманизированных антител или антител человека могут быть соединены, по крайней мере, с участком константной области антитела человека. Выбор константной области зависит частично от того, что необходимо получить: антителозависимую активацию комплемента и/или опосредованную антителами клеточную цитотоксичность. Например, изотипы IgG1 и IgG3 активируют комплемент, а изотипы IgG2 и IgG4 - нет. Выбор изотипа также влияет на поступление антитела в головной мозг. Предпочтителен изотип IgG1 человека. Могут быть использованы константные участки легких цепей каппа и лямбда. Антитела могут быть экспрессированы как тетрамеры, содержащие две легкие и две тяжелые цепи, как отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab, Fab',F(ab')2 и Fv-фрагменты, как одноцепочечные антитела, в которых вариабельные домены легкой и тяжелой цепи соединены с помощью линкера.VI. Экспрессия рекомбинантных антител Химерные, гуманизированные антитела и антитела человека обычно получают путем рекомбинантной экспрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные кострукты обычно включают последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующей последовательностью цепей антитела,например, природный или гетерологичный промоторный участок. Предпочтительно последовательности контроля экспрессии являются эукариотическими промоторными системами. Они входят в состав векторов, способных трансформировать и трансфицировать эукариотические клетки-хозяева. После того как вектор будет введен в подходящую клетку-хозяин, такую клетку поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне, и далее выделяют и очищают перекрестно-реагирующие антитела. Указанные векторы экспрессии обычно способны к репликации в организмах-хозяевах как эписомы или как интегративная часть хромосомной ДНК хозяина. В целом, векторы экспрессии содержат маркеры селекции, например гены устойчивости к ампициллину или гигромицину, обеспечивающие детекцию таких клеток, которые трансформировались нужными ДНК-последовательностями. Бактерии Е. coli представляют собой прокариотические клетки-хозяева, которые особенно подходят для клонирования ДНК-последовательностей в соответствии с настоящим изобретением. Другие микроорганизмы, например дрожжи, также пригодны для экспрессии. Предпочтительно использование дрожжей Saccharomyces вместе с соответствующими векторами, содержащими последовательности контроля экспрессии, ориджин репликации последовательности терминации и другие необходимые элементы. Обычные промоторы включают 3-фосфоглицераткиназу и другие гликолитические энзимы. К индуцибельным дрожжевым промоторам относятся, среди прочих, промоторы алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и фрагментов, ответственных за утилизацию галактозы и мальтозы. Клетки млекопитающих являются предпочтительными клетками-хозяевами для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ig или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes to Clones(VCH Publishers, NY, 1987). Многочисленные подходящие линии клеток-хозяев, способные секретировать интактные гетерологичные белки, известны из уровня техники и включают клеточные линии СНО,COS, HeLa, L и миеломные клеточные линии. Предпочтительно, чтобы клетки не были клетками человека. Векторы экспрессии для таких клеток могут содержать последовательности контроля экспрессии,такие как ориджин репликации, промотор, энхансер [Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)] и необходимые информационные сайты процессинга, например сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями контроля экспрессии являются промоторы, полученные из эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, папилломавируса крупного рогатого скота и т.д. См. Со et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).- 13006630 Альтернативно, последовательности, кодирующие антитела, могут быть включены в трансгенные конструкции для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенных животных (см., например, US 5741957, US 5304489, US 5849992). Подходящие трансгены, содержащие последовательности, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи антитела, также содержат промотор и энхансен, специфичные для гена молочной железы, например гена казеина или бета-лактоглобулина,функционально связанные с кодирующими последовательностями. Векторы, содержащие нужные ДНК-сегменты, могут быть трансфицированы в клетки-хозяева хорошо известными методами, выбор конкретного метода зависит от типа клетки-хозяина. Например,кальций-хлоридная трансфекция обычно используется в случае прокариотических клеток, в то время как кальций-фосфатная трансфекция, электропорация, липофекция, биолистик или трансфекция с помощью вирусов может быть применена в отношении других клеточных хозяев. К другим способам, которые используются для трансформации клеток млекопитающих, включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомную технологию, электропорацию и микроинъекцию (см., в основном, Sambrook etal., выше). Для получения трансгенных животных трансгены могут быть микроинъецированы в оплодотворенные ооциты или могут быть встроены в геном эмбриогенных стволовых клеток, а ядра таких клеток трансфицированы в лишенные ядер ооциты. После экспрессии антитела могут быть очищены в соответствии со стандартными методами, известными из уровня техники, в том числе HPLC-очисткой, колоночной хроматографией, гельэлектрофорезом и т.д. [см., в основном, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)]. 3. Белковые носители. Некоторые агенты для индукции иммунного ответа содержат необходимый эпитоп, генерирующий ответ против отложений амилоида, но сами по себе настолько малы, что не могут быть иммуногенными. В этом случае потенциальный пептидный иммуноген связывают с подходящим носителем, который обеспечивает иммунный ответ. Подходящие носители включают сывороточные альбумины, гемоцианин моллюска фиссуреллы, молекулы Ig, тиреоглобулин, овальбумин, токсоид столбняка или токсоид других патогенных бактерий, например бактерий дифтерии, Е. coli, холерного вибриона, Н. pylori или аттенуированные производные токсоида. К другим носителям относятся Т-клеточные эпитопы, которые связываются с многочисленными аллелями МНС, например по крайней мере 75% всех аллелей МНС человека. Такие носители часто называют универсальными Т-клеточными эпитопами. Примерами универсальных Т-клеточных эпитопов являются следующие: Гемагглютинин вируса гриппа: НА 307-319 HKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 43)PADRE (общие остатки выделены): AKXVAAVTLKAAA (SEQ ID NO: 44) Штамм малярии CS: Т 3 эпитоп EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 45) Поверхностный антиген вируса гепатита В: HBsAg19-28 FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 46) Белок теплового шока 65: hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 47) БЦЖ QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO: 48) Токсоид столбняка: ТТ 830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 49) Токсоид столбняка: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 50)HIV gpl20 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 51). Другие носители для стимуляции или усиления иммунного ответа включают цитокинины, такие какIL-1, пептиды IL-1 и IL-1, IL-2, INF, IL-10, GM-CSF и хемокины, такие как MIP1 ии RANTES. Иммуногенные агенты также могут быть связаны с пептидами, которые увеличивают транспорт между тканями, как описано O'Mahony, WO 97/17613 и WO/17614. Иммуногенные агенты могут быть связаны с носителями путем химического перекрестного соединения. Методики связывания носителя с иммуногеном включают формирование дисульфидных связей при использовании N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил 4-(Nмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (если у пептида нет сульфгидрильной группы,обеспечивают добавление цистеинового остатка). Указанные реагенты создают дисульфидную связь между ними самими и цистеиновыми остатками одного белка и амидную связь между -амином лизина или другой свободной аминогруппой других аминокислот. Многочисленные агенты, формирующие дисульфид/амидные связи, описаны в Immun. Rev. 62, 185 (1982). Другие бифункциональные сшивающие агенты формируют тиоэфирные связи, а не дисульфидные. Многие из таких агентов, формирующих тиоэфирные связи, коммерчески доступны и включают реакционноспособные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2-иодуксусной кислоты, 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их объединения с сукцинимидом или 1-пуроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислотой,натриевой солью. Иммуногенные пептиды также могут быть экспрессированы как белки слияния с носителями (т.е. гетерологичными пептидами). Иммуногенный пептид может быть связан на аминоконцевом участке,карбоксиконцевом участке или обоих участках с носителем. Иногда в белке слияния могут быть множественные повторы иммуногенного пептида. С другой стороны, иммуногенный пептид может быть связан- 14006630 с многочисленными копиями гетерологичного пептида, например, как на С-концевом участке пептида. Некоторые пептидные носители служат для индукции хелперного Т-клеточного ответа на пептидноситель. Индуцированные хелперные Т-клетки в свою очередь индуцируют В-клеточный ответ против иммуногенного пептида, связанного с пептидом-носителем. Некоторые из заявленных агентов включают белок слияния, в котором N-концевой фрагмент А связан на своем концевом участке с пептидом-носителем. В случае таких агентов N-концевой остаток фрагмента А представляет собой N-концевой остаток белка слияния. Соответственно, такие белки слияния эффективны в отношении индукции антител, которые связываются с эпитопом, для которого необходимо, чтобы N-концевой остаток А находился в свободной форме. Некоторые заявленные агенты включают многочисленные повторы N-концевого сегмента А, связанного на С-концевом участке с одной или более копиями белка-носителя. N-концевой фрагмент А, включенный в такие белки слияния,иногда начинается с А 1-3 и заканчиваются А 7-11. А 1-7, А 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 предпочтительны в качестве N-концевого фрагмента А. Некоторые белки слияния включают различные N-концевые сегменты А в тандеме. Например, белок слияния может включать А 1-7 за А 1-3 и далее гетерологичный пептид. В некоторых белках слияния N-концевой сегмент А сливают на N-концевом участке с гетерологичным пептидным носителем. Тот же самый набор N-концевых сегментов А может быть использован для слияния по С-концу. Некоторые белки слияния включают гетерологичный пептид, связанный с Nконцевым участком N-концевого сегмента А, который в свою очередь связан с одним или более дополнительных N-концевых сегментов А в тандеме. Некоторые примеры белков слияния, подходящих для использования в изобретении, приведены ниже. Некоторые из указанных белков слияния включают сегменты А, связанные с эпитопами токсоида столбняка, такими как описанные в US 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Определенные белки слияния содержат сегменты А, связанные с пептидными носителями, описанными в US 5736142. Некоторые гетерологичные пептиды представляют собой универсальные клеточные эпитопы. В некоторых способах агент для введения представляет собой один белок слияния, состоящий из А-сегмента, связанного с гетерологичным сегментом в линейной конфигурации. В других способах агент представляет собой мультимерные белки слияния, выраженные формулой 2 х, где х представляет собой целое число 1-5. Предпочтительно х является 1, 2 или 3, значение 2 наиболее предпочтительно. Когда х=2, такой мультимер содержит 4 белка слияния, связанных в предпочтительной конфигурации, обозначенной как МАР 4 (см. US 5229490). Эпитопы А подчеркнуты. Конфигурация МАР 4 показана ниже. Разветвленные структуры получают путем инициирования пептидного синтеза по N-концевому амину и амину боковой цепи лизина. В зависимости от числа участков разветвления лизин включается в последовательность и обеспечивает разветвление; полученная в результате этого структура будет включать многочисленные концевые участки. В данном примере получают 4 идентичных N-концевых участка на разветвленном содержащем лизин ядре. Такая множественность во много раз усиливает отвечаемость распознающих В-клеток. Другие примеры белков слияния включают иммуногенные эпитопы (А выделены жирным шрифтом) Аналогичные или сходные белки-носители и способы связывания могут быть использованы для генерации иммуногенов с целью их применения для получения антител к А для пассивной иммунизации. Например, фрагмент А, связанный с носителем, может быть введен лабораторному животному для получения моноклональных антител к А.- 16006630 4. Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические агенты. Иммунный ответ против отложений амилоида также может быть индуцирован введением нуклеиновых кислот, кодирующих сегменты А-пептида, а также их фрагментов, нуклеиновых кислот, кодирующих другие пептидные иммуногены или антитела и их отдельные цепи, используемые для пассивной иммунизации. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно связан с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, обеспечивающими экспрессию ДНК сегмента в необходимых клетках-мишенях в организме больного. Для экспрессии нуклеиновых кислот в клетках крови, что желательно для индукции иммунного ответа, могут быть использованы промоторные и энхансерные элементы генов легкой или тяжелой цепи Ig или основные средние промоторный и энхансерный элементы цитомегаловируса. Соединенные регуляторные элементы и кодирующие последовательности клонируют в векторе. Для исследования двуцепочечных антител две цепи могут быть клонированы в одном или отдельных векторах. Для указанных целей подходят многочисленные векторные системы, в том числе на основе ретровирусов [см., например, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)]; аденовирусные векторы [см., например, Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)]; векторы на основе аденоассоциированных вирусов [см., например, Zhou et al., J. Exp. Vtd. 179, 1867 (1994)]; вирусные векторы на основе поксвирусов, в том числе вируса вакцины и вируса оспы птиц, вирусные векторы на основе вирусов рода альфавирусов, например вируса Синдбис и леса Семлики [см., например, Dubensry et al., J. Virol. 70, 508-519(1996)]; вируса венесуэльского энцефалита лошадей (см. US 5643576) и рабдовирусов, например вируса везикулярного стоматита (см. WO 96/34625) и папилломавирусов [Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 и XiaoBrandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2622-2630 (1996)]. ДНК, кодирующая иммуноген, или содержащий такую ДНК вектор могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и родственные им аналоги описаны в патентах США 5208036, 5264618,5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, могут быть адсорбированы или ассоциированы с определенными носителями, к которым относятся, например, полимеры полиметилметакрилата и полилактиды и сополи(лактидгликолиды), см., например, McGee et al., J. Micro Encfp. (1996). Векторы для генной терапии или ДНК сама по себе могут быть введены in vivo отдельному пациенту обычно путем системной доставки (например, внутривенной, интраперитонеальной, назальной, внутрикожной, внутримышечной подкожной), внутрижелудочно, путем внутричерепной инфузии или путем местного применения (см., например, US 5399346). Такие векторы могут также содержать специальные агенты, облегчающие введение (US 5593970). ДНК также может быть введена методом генного ружья. См. XiaoDrandsma, выше. ДНК, кодирующую иммуноген, преципитируют на поверхности микроскопических металлических бус. Микрочастицы разгоняются ударной волной или за счет расширения газообразного гелия и проникают в ткани на глубину нескольких клеточных слоев. Например, можно использовать устройство для доставки генов Accel фирмы Agacetus, Inc. Middleton W.I. Альтернативно,"раздетую" ДНК можно доставить через кожу в кровяное русло простым нанесением ДНК на поверхность кожи при химическом или механическом ее повреждении (см. WO 95/05853). В другом варианте векторы, кодирующие иммуногены, могут быть доставлены в клетки ex vivo,выделенные из организма индивидуального пациента (например, в лимфоциты, вытяжки костного мозга,биопсии тканей) или универсального донора гематопоэтических стволовых клеток с последующим введением таких клеток пациенту, обычно после отбора клеток, которые содержат включенный в них вектор.III. Скрининг антител на активность в отношении разрушения отложений амилоида Изобретение также относится к способам скрининга антител на активность в отношении разрушения отложений амилоида или любого другого антигена или ассоциированного с антигеном биологического материала. Для скрининга на активность против отложений амилоида обеспечивают контактирование образца ткани из головного мозга пациента с болезнью Альцгеймера или животного-модели с характерной для указанной болезни патологией с фагоцитарными клетками, имеющими Fc-рецепторы, например клетками микроглии и тестируемым антителом в среде in vitro. Фагоцитарные клетки могут быть первичной культурой или клеточной линией, например BV-2, C8-134 или ТНР-1. В некоторых способах компоненты объединяют на стекле для микроскопирования для облегчения контроля под микроскопом. В других способах многочисленные реакции осуществляют в параллельных лунках планшета для микротитрования. В этом случае отдельное миниатюрное стекло для микроскопирования может быть помещено в отдельные лунки или устройство для немикроскопической детекции. Например, может использоваться система детекции ELISA для выявления A. Предпочтительно для количественного определения отложений амилоида в реакционной смеси in vitro используют серию измерений, начиная с базового значения, установленного до начала реакции, и далее фиксируя одно или более тестовых значений во время течения реакции. Антиген может быть выявлен путем окрашивания, например, флуоресцентно меченным антителом к А или другому компоненту амилоидных бляшек. Антитело, используемое для окрашивания, может быть тем же самым или другим антителом, что и антитело, тестируемое на активность, связанную с разрушением бляшек. Уменьшение количественных значений, связанных с отложениями ами- 17006630 лоида, во время реакции по сравнению с базовым значением свидетельствует о том, что тестируемое антитело обладает активностью в отношении разрушения бляшек. Такие антитела с высокой вероятностью могут быть использованы для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний. Аналогичные способы могут быть использованы для скрининга антител на активность, связанную с разрушением других типов биологического материала. Обычно биологический материал в той или иной степени связан с заболеванием человека или животного. Биологический материал может представлять собой образец ткани или находиться в изолированной форме. Если биологический материал представляет собой образец ткани, его предпочтительно не фиксируют, чтобы обеспечить доступность компонентов образца ткани и избежать изменения их конформации, связанного с фиксацией. Примерами образцов тканей, которые могут быть тестированы описанным выше способом, включают раковые ткани, ткани с патологическим ростом, такие как бородавки и родинки, ткани, инфицированные патогенными микроорганизмами, ткани, инфицированные клетками воспаления, ткани с патологическим бесклеточным матриксом (например, фибринозные ткани перикарда), ткани с аберрантными антигенами и рубцовые ткани. Примерами изолированного биологического материала могут служить А, вирусные антигены или вирусы, протеогликаны, антигены других патогенных микроорганизмов, опухолевые антигены и молекулы адгезии. Такие антигены могут быть получены из природных источников, путем рекомбинантной экспрессии или химическим синтезом или каким-либо другим путем. Образец ткани или изолированный биологический материал приводят в контакт с фагоцитарными клетками, несущими Fc-рецепторы, такими как моноциты или клетки микроглии, и тестируемым антителом в среде. Антитело может быть направлено к тестируемому биологическому материалу или антигену, ассоциированному с биологическим материалом. В последнем случае определяют, подвергается ли биологический материал вместе с антигеном фагоцитозу. Обычно, хотя в этом нет необходимости, антитело и биологический материал (иногда с ассоциированным антигеном) приводят в контакт друг с другом до внесения фагоцитарных клеток. Затем фиксируют концентрацию биологического материала и/или ассоциированного антигена, если он присутствует, остающегося в среде. Уменьшение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического материала в среде свидетельствует о том, что антитело обладает активностью, связанной с разрушением антигена и/или ассоциированного биологического материала в комплексе с фагоцитарными клетками (см., например, пример 14).IV. Пациенты, подлежащие лечению Пациенты, подлежащие лечению, могут не обнаруживать симптомов заболевания, но иметь к нему предрасположенность, а могут обнаруживать явные симптомы заболевания. В случае болезни Альцгеймера к пациенту с предрасположенностью к ней или страдающему от нее может быть отнесен любой человек, если он живет достаточно долго. Таким образом, заявленные способы могут применяться профилактически по отношению ко всем людям без какой-либо оценки риска возникновения заболевания у конкретного человека. Заявленные способы особенно эффективны в тех случаях, когда пациенты имеют генетическую предрасположенность к болезни Альцгеймера. Это могут быть родственники людей с такой болезнью или индивидуумы, чья предрасположенность к болезни Альцгеймера установлена с помощью анализа генетических или биохимических маркеров. Генетическими маркерами предрасположенности к болезни Альцгеймера являются мутации в гене АРР, в особенности мутации в положениях 717 и 670 и 671, известных как мутации Hardy и Swedish соответственно (см. Hardy, TINS, выше). Другими маркерами риска являются мутации генов пресенилина PS1 и PS2, белок АроЕ 4, случаи заболевания болезнью Альцгеймера в семье, гиперхолестеролемия или атеросклероз. Индивидуумы, страдающие болезнью Альцгеймера, могут быть выявлены по характерному слабоумию, а также по наличию факторов риска, описанных выше. Кроме того, многочисленные диагностические тесты могут быть использованы для идентификации людей с болезнью Альцгеймера. Они включают, например, определение уровнейCSF тау и А 42. Увеличенные уровни тау и А 42 свидетельствуют о наличии болезни Альцгеймера. Индивидуумы, страдающие от болезни Альцгеймера, также могут быть выявлены в соответствии с критерием ADRDA, как описано в примерах. У пациентов с отсутствием симптомов лечение может начинаться в любом возрасте (например, 10,20, 30). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до того, как возраст пациента достигнет 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно включает введение множественных доз препарата в течение определенного периода времени. Лечение можно контролировать наблюдением за уровнем антител или активированным Т-клеточным или В-клеточным ответом на терапевтический агент (например, А-пептид) с течением времени. Если ответ спадает, назначают бустерную дозу. В случае потенциальных больных с синдромом Дауна лечение может начинаться в пренатальный период путем введения терапевтического агента в организм матери или сразу же после рождения.V. Режим лечения В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, чувствительному к болезни Альцгеймера или имеющему предрасположенность к данной болезни, в количестве, достаточном для элиминирования или редукции риска возникновения заболевания,- 18006630 снижения его тяжести, задержки возникновения заболевания, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникающих в процессе развития заболевания. В случае терапевтического применения композиции или лекарственные средства вводят пациенту, у которого возможно развитие заболевания, или с уже развившимся заболеванием в количестве, достаточном для лечения, или, по крайней мере, частичного элиминирования симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), в том числе его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникших в процессе развития заболевания. В некоторых способах введение агента, редуцирующего или элиминирующего миокогнитивную недостаточность у пациентов, у которых еще не наблюдаются развившиеся признаки болезни Альцгеймера. Количество препарата, адекватное для обеспечения терапевтического или профилактического лечения, определяется как терапевтическая или профилактическая эффективная доза. В случае профилактических и терапевтических схем агенты обычно вводят в нескольких дозах, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируется и повторные дозы могут быть назначены, если иммунный ответ начинает затихать. Эффективные дозы и композиции заявленного изобретения для лечения описанных выше состояний в большой степени зависят от многих различных факторов, в том числе способов введения, сайтамишени, физиологического состояния пациента, видовой принадлежности пациента (медицинское или ветеринарное применение), других принимаемых препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, однако, заявленные способы лечения применимы и к другим млекопитающим. Дозы, используемые для лечения, следует титровать, чтобы оптимизировать их безопасность и эффективность. Количество иммуногена зависит от того, используется ли адъювант или нет, более высокие дозы не требуют введения адъюванта. Количество иммуногена для введения пациенту иногда варьирует от 1-500 мкг, однако, обычно составляет 5-500 мкг на инъекцию при введении человеку. Иногда используется более высокая доза (1-2 мг) в расчете на инъекцию. Количество иммуногена также зависит от соотношения числа иммуногенных эпитопов и массы иммуногена в целом. Обычно 10-3-10-5 мкм иммуногенного эпитопа используют в расчете на микрограмм иммуногена. Число инъекций варьирует существенным образом от одной в день до одной в год и одной в декаду. Доза иммуногена, вводимая пациенту в день, составляет более чем 1 мкг и обычно более чем 10 мкг, если она вводится совместно с адъювантом, и более 10 мкг, если адъювант не используется. Обычная схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями в определенные временные интервалы,например шестинедельные. Другая схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями 1, 2 и 12 месяцев спустя. Другая схема включает инъекции каждые два месяца в течение дальнейшей жизни. Альтернативно, бустерные инъекции могут быть нерегулярными в соответствии с контролем иммунного ответа. Для пассивной иммунизации антителом дозы варьируют от около 0,0001 до 100 мг/кг и более часто от 0,01 до 5 мг/кг веса тела. Например, доза может составлять 1 мг/кг веса тела, или 10 мг/кг веса тела,или в пределах 1-10 мг/кг. Примерная схема лечения включает введение препарата один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными связывающими специфичностями вводят подкожно, причем доза вводимого антитела указана выше. Антитело обычно вводят множественными дозами. Интервалы между отдельными дозами могут составить неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, что зависит от уровней антитела к А в крови пациента. В некоторых способах доза подбирается таким образом, чтобы уровень антитела в плазме крови достиг 1-1000 мкг/мл и иногда 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело может быть введено в форме композиции с поддерживаемым высвобождением; в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения в большой степени зависят от периода полужизни антитела в организме пациента. В целом, антитела человека обладают наибольшим периодом полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела другой видовой принадлежности (нечеловеческие антитела). Доза и частота введения варьируют в большой степени от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических случаях используются относительно низкие дозы, которые вводят относительно нечасто в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение всю оставшуюся жизнь. В терапевтических случаях используются относительно высокие дозы, вводимые в относительно короткие интервалы времени до тех пор, пока не закончится или не остановится прогрессивное развитие заболевания или предпочтительно до тех пор, пока у пациента частично или полностью не исчезнут симптомы заболевания. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, варьируют от около 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30-300 мкг ДНК в расчете на одного пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100 или более вирионов на дозу. Агенты, индуцирующие иммунный ответ, могут вводиться парентерально, местно, внутривенно,орально, подкожно, внутриартериально, интраперитонеально, интраназально, внутримышечно или внутричерепным образом для профилактического и/или терапевтического лечения. Наиболее обычный способ введения иммуногенного агента - это подкожный, хотя и другие способы так же эффективны. Другой- 19006630 наиболее распространенный способ введения - это внутримышечная инъекция, которую обычно осуществляют в плечо или ногу. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в определенную ткань, где аккумулированы отложения амилоида, например, внутричерепным образом. Внутримышечная инъекция или внутривенное вливание предпочтительны для введения антител. В некоторых способах определенные терапевтические антитела инъецируют непосредственно под черепную коробку. Иногда антитела вводят в форме композиции с поддерживаемым высвобождением или с помощью устройства,например Medipal. Заявленные агенты иногда могут быть введены в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере, частично эффективны в лечении амилоидогенной болезни. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых отложения амилоида обнаруживаются в мозге, заявленные агенты также могут вводиться совместно с другими агентами, которые увеличивают поступление терапевтически значимых соединений через гематоэнцефалический барьер. Заявленные иммуногенные агенты, такие как пептиды, иногда вводят в сочетании с адъювантом. Для генерации иммунного ответа в сочетании с пептидом, например пептидом А, могут вводиться различные адъюванты. Предпочтительные адъюванты усиливают иммунный ответ на иммуноген и не вызывают его конформационных изменений, которые влияют на качественный характер ответа. К таким адъювантам относятся гидроксид алюминия и фосфат алюминия 3 De-0-ацилированный монофосфорил липид A (MPL) (см. GB 2220211). Стимулон QS-21 представляет собой тритерпеновый гликозид или сапонин, выделенный из коры дерева Quillaja Saponaria Molina, растущего в Южной Америке [cм.Kensilet al., в Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. PowellNewman, Plenum Press, NY,1995); US 5057540 (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). К другим адъювантам относятся эмульсии типа масло в воде (например, сквален или арахисовое масло), часто в комбинации с иммунными стимуляторами, такими как монофосфорил липид А [см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)]. Другим адъювантом является CpG (WO 98/40100). Альтернативно, А может быть связан с адъювантом. Однако такое связывание не должно существенным образом изменять конформацию А так, чтобы не влиять на природу возникающего иммунного ответа. Адъюванты могут использоваться в качестве компонентов терапевтической композиции вместе с активным агентом или могут вводиться отдельно, до,одновременно или после введения терапевтического агента. Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (алюминиевые квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Такие адъюванты могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как MPL или 3-DMP,QS-21, полимерные или мономерные аминокислоты, например полиглутаминовая кислота или полилизин. Другой класс адъювантов включает водно-масляные эмульсии, которые могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамил-пептиды,например, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr - VDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-Dизоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоилsn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), N-ацетил-глюкозаминил-N-ацетилмурамил-LАl-D-изоглу-L-Аla-дипальмитокси пропиламид (DTP-DPP)терамид или другие компоненты клеточной стенки бактерий. К указанным эмульсиям относятся:a) MF 59 (WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% твина 80 и 0,5% спана 80 (часто содержащего различные количества МТР-РЕ) и представляющий собой субмикронные частицы, сформированные с помощью специального устройства (Model 110Y, Microfluidics, Ntwton MA); б) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% блок-полимера плюроника L 121 и thr-MDP,сформированного в виде субмикронной эмульсии или в виде эмульсии с более крупными частицами (полученными с помощью устройства Vortex), и в) Ribi система на основе адъюванта (RAS), (Ribi Immunochem., Hamilton, МТ), содержащая 2% сквалена, 0,2% твина 80 и один или более компонентов бактериальной стенки, выбранных из группы,включающей монофосфориллипид А (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и скелетон клеточной стенки бактерий (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox). Другой класс предпочтительных адъювантов включает сапониновые адъюванты, такие как стимулон(QS-21, Aquila, Framingham, MA) или частицы, полученные на его основе, например, ISCOMS (иммуностимулирующие комплексы) иISCOMATRIX. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFА). К адъювантам относятся и цитокины, такие как интерлейкины (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF). Адъювант может быть введен вместе с иммуногеном в составе одной композиции или же до, одновременно или после введения иммуногена. Иммуноген и адъювант могут быть упакованы вместе и храниться в одной ампуле или же быть упакованы в отдельные ампулы и смешиваться перед использованием. Обычно иммуноген и адъювант упаковывают вместе с аннотацией, раскрывающей необходимое терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы отдельно, упаковка обычно содержит инструкции по их смешиванию до использования. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности иммуногенной композиции, содержащей адъювант, способа введения, схемы дозирования и- 20006630 эффективности адъюванта в отношении видовой принадлежности иммунизируемого пациента. В случае человека фармацевтически приемлемым адъювантом является такой адъювант, который был протестирован и утвержден к применению на людях соответствующими инстанциями. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку. Предпочтительны алюминиевые квасцы, MPL и QS21. Одновременно могут быть использованы два или более различных адъюванта. Предпочтительные комбинации включают алюминиевые квасцы и MPL, квасцы и QS-21, MPL и QS-21, a также квасцы, QS21 и MPL. Также может быть использован неполный адъювант Фрейнда [Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)], иногда в комбинации с какими-либо из квасцов, QS-21 и MPL, а также комбинации всех указанных веществ. Заявленные агенты часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент и другие фармацевтически приемлемые компоненты. См. Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton , Pensylvania, 1980). Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического назначения. Композиции также могут включать, в зависимости от нужного состава, фармацевтически приемлемые нетоксичные носители или разбавители, которые широко используются для доставки композиций при введении человеку и животным. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность композиции. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатный-буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические неиммуногенные стабилизаторы и т.д. Фармацевтические композиции также могут включать более крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры [например, латексную сефарозу (ТМ)], агароза, целлюлоза и т.д., полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (например, капли масел или липосомы). Кроме того, указанные носители могут функционировать в качестве иммуностимулирующих агентов (т.е. адъювантов). Для парентерального применения заявленные агенты могут вводиться дозами в виде инъекций раствора или суспензии активного вещества в физиологически приемлемом разбавителе вместе с фармацевтически приемлемым носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как водные масла,физиологический раствор, глицерол или этанол. Кроме того, в состав композиций могут входить дополнительные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, сурфактанты, вещества, поддерживающие рН, и т.д. Другими компонентами композиций могут быть масла животного или растительного происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, а также синтетические и минеральные масла. В целом предпочтительны гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль в качестве жидких носителей, в особенности для растворов, предназначенных для инъекций. Антитела могут вводиться в форме препаратов с поддерживаемым высвобождением активного ингредиента (инъекции типа "депо" или имплантаты). Примером антительной композиции может быть композиция, содержащая 5 мг/мл антител в водном буфере, включающем 50 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl (pH композиции доводят до 6,0 с помощью НСl). Обычно композиции готовят как пригодные для инъекций, как в виде жидких растворов или суспензий, так и в виде твердых форм, предназначенных для растворения или суспендирования в заранее приготовленных средствах доставки. Препарат может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактидные, полигликолидные или сополимерные, для усиления адъювантного эффекта, как описано выше [см. Langer, Science 249, 1527 (1990) и Hanes, Advanced DrugDelivery Reviews 28, 27-119(1997)]. Заявленные агенты могут вводиться в форме депо-инъекций или имплантатов, которые имеют такой состав, чтобы обеспечить как поддерживаемое, так и пульсовое высвобождение активного ингредиента. Другие способы введения препаратов включают оральный путь, интраназальный, легочный, а также применение суппозиториев и чрезкожных пластырей. Для суппозиториев носителями и связывающими агентами могут быть, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть сформированы из смесей, содержащих активный ингредиент в количестве 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Оральные составы включают наполнители, например, фармацевтической степени чистоты маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, целлюлозу и карбонат натрия. Указанные композиции могут быть в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с поддерживаемым высвобождением и содержать 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Местное применение обеспечивается путем чрескожной или внутрикожной доставки. Такое применение может сопровождаться совместным использованием холерного токсина или его производных или субъединиц, лишенных токсичности, а также других бактериальных токсинов [см. Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)]. Совместное введение может быть достигнуто использованием компонентов в виде смеси или в форме связанных молекул, полученных путем химического перекрестного сшивания или экспрессии белков слияния.- 21006630 Альтернативно, чрескожная доставка может обеспечиваться при использовании кожных аппликаторов или трансферосом [(Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys.VI. Методы диагностики Изобретение относится к способам детекции иммунного ответа против пептида А у пациента,страдающего от болезни Альцгеймера или восприимчивого к такой болезни. Способы особенно полезны для мониторинга курсом лечения, назначенным больному. Указанные способы могут быть использованы для наблюдения за терапевтическим лечением пациентов с симптомами заболевания, а также профилактическим лечением бессимптомных пациентов. Такие способы применяются для контроля как активной иммунизации (например, за титром антител, образующихся в ответ на введение иммуногена), так и пассивной иммунизации (например, измерение уровня введенных антител). 1. Активная иммунизация. Некоторые способы подразумевают определение базового значения иммунного ответа у пациента до введения дозы терапевтического агента и сравнение его со значением, полученным после лечения. Существенное увеличение (большее, чем обычный предел экспериментальной ошибки в повторяющихся измерениях одного и того же образца, выражаемый как одно стандартное отклонение от среднего при таких измерениях) значения иммунного ответа свидетельствует о том, что лечение было позитивным(т.е. введение агента обеспечило иммунный ответ или усилило его). Если показатель иммунного ответа существенно не изменился или не увеличился, это свидетельствует о негативном лечении. В целом, у пациентов, которые подвергаются первоначальному курсу лечения иммуногенным агентом, ожидается усиление иммунного ответа, которое затем выходит на плато. Введение агента обычно продолжается до тех пор, пока иммунный ответ не перестает усиливаться. Поддержание уровня плато говорит о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза, или частота введения препарата. В других способах для контрольной популяции определяют контрольное (т.е. среднее и стандартное отклонение) значение иммунного ответа. Обычно индивидуумы в контрольной популяции не получают предварительного лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента после введения терапевтического агента сравнивают затем с контрольным значением. Существенное увеличение значений иммунного ответа по сравнению с контролем (например, на величину, большую, чем одно стандартное отклонение от среднего значения) свидетельствует о положительном лечении. Отсутствие существенного увеличения или снижения сигналов указывает на негативное лечение. Введение агента обычно продолжают в течение периода времени, пока иммунный ответ увеличивается по сравнению с контрольным значением. Как и в ранее описанных способах, поддержание значений иммунного ответа на уровня плато по сравнению с контрольным свидетельствует о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза или частота введения препарата. В других способах определяют контрольное значение иммунного ответа (т.е. среднее и стандартное отклонение) для контрольной популяции индивидуумов, которые ранее подвергались лечению и чей иммунный ответ вышел на плато в результате лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента сравнивают с контрольным значением. Если значение иммунного ответа у пациента существенно не отличается (т.е. не выше одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение может быть остановлено. Если значение иммунного ответа у пациента существенно ниже контрольного значения,продолжается введение терапевтического агента. Если значение иммунного ответа у пациента постоянно находится ниже контрольного уровня, даже при изменении схемы лечения, может быть показано, например, использование адъюванта. В других способах у пациента, который не получает лечения в данное время, но прошел курс предварительного лечения, постоянно контролируют имунный ответ для того, чтобы определить, не требуется ли повторение лечения. Измеренное значение иммунного ответа пациента можно сравнить со значением иммунного ответа, выявленного у пациента после предварительного курса лечения. Существенное снижение значения иммунного ответа по сравнению с предварительно измеренным (на величину, большую, чем обычная ошибка повторных измерений одного и того же образца) свидетельствует о том, что лечение следует возобновить. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением (среднее + стандартное отклонение), измеренным для популяции пациентов после предварительного курса лечения. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением, измеренным для популяции пациентов, подвергнутых профилактическому лечению, у которых отсутствуют симптомы заболевания, или со значением для популяции пациентов, подвергнутых терапевтическому лечению, у которых снижены симптомы заболевания. Во всех случаях существенное снижение величины иммунного ответа по сравнению с контрольным (т.е. более чем на величину одного стандартного отклонения) свидетельствует о том, что лечение пациента следует возобновить. Образец ткани для анализа обычно представляет собой кровь, плазму, сыворотку крови, слизь или спинно-мозговую жидкость, полученные от пациента. Образцы анализируют на показатели иммунного ответа к любой форме пептида А, обычно А 42. Иммунный ответ может быть определен по наличию,например, антител или Т-клеток, которые специфически связываются с пептидом А. Методы ELISA для определения антител, специфических к А, описаны в примерах. Способы выявления реакционноспособных Т-клеток описаны выше (см. раздел "Определения"). В некоторых способах иммунный ответ определяют по разрушению бляшек, как описано в разделе III выше. В таких случаях образец ткани пациента тестируют, обеспечивая его контактирование с отложениями амилоида (например, полученными от мышей PDAPP) и фагоцитарными клетками, несущими рецепторы Fc. Последующее разрушение амилоидных отложений подвергается контролированию. Наличие и продолжительность такого иммунного ответа свидетельствует о том, что существующий уровень антител эффективен для очищения от отложений А тестируемого образца ткани, полученного от больного. 2. Пассивная иммунизация. В целом, методики наблюдения за пассивной иммунизацией сходны с таковыми, описанными для активной иммунизации. Однако антительный профиль, сопровождающий пассивную иммунизацию,обычно обнаруживает промежуточный пик концентрации антител с последующим экспоненциальным снижением. Без введения дальнейшей дозы препарата снижение достигает уровней до начала лечения в течение периода времени, составляющего от нескольких дней до нескольких месяцев, что зависит от периода полужизни используемого антитела. Например, период полужизни некоторых антител человека составляет около 20 дней. В некоторых способах измерение базового значения уровня антител к А в организме пациента осуществляют до их введения, второе измерение осуществляют сразу же после введения, чтобы определить пиковое значение уровня антител, и далее одно или более измерений осуществляют с определенными интервалами, чтобы проследить за снижением уровня антител. Когда уровень антител снижается до базового значения или предварительно определенное пиковое значение будет меньше базового (50%,25% или 10%), назначается повторное введение антител. В некоторых способах пиковое или последующие измеренные значения уровня антител, меньшие, чем базовые, сравнивают с контрольными уровнями, предварительно определенными для разработки наилучшего профилактического или терапевтического режима лечения больных. Если измеренный уровень антител существенно ниже, чем контрольный уровень (например, меньше, чем среднее значение за вычетом одного стандартного отклонения контрольного значения для популяции индивидуумов, успешно прошедших лечение), назначается введение дополнительной дозы антител. 3. Диагностические наборы. Изобретение также относится к диагностическим наборам для осуществления описанных выше диагностических методов. Обычно такие наборы содержат агент, который специфически связывается с антителами к А. Набор также включает метку. Для определения антител к А метка обычно представляет собой меченые антиидиотипические антитела. Для детекции антител агент может быть предварительно связан с твердой фазой, такой как лунки планшета для микротитрования. Также наборы обычно содержат аннотации по их использованию. Аннотации иногда содержат информацию о коррелировании уровня измеряемой метки с уровнем антител к А. Понятие "аннотация" относится к любой письменной или воспроизводимой информации, которая прилагается к набору в течение всего времени его производства,транспортировки, продажи или использования. Например, понятие "аннотация" охватывает рекламные листы и брошюры, упаковочный материал, инструкции, аудиокассеты или видеокассеты, компьютерные диски, а также все надписи, сделанные непосредственно на наборе. Изобретение также относится к диагностическим наборам для осуществления исследований in vivo. Такие наборы обычно содержат антитела, связывающиеся с эпитопом А предпочтительно в пределах остатков 1-10. Предпочтительно антитела являются мечеными или же в набор включается второй реагент для мечения. Набор обычно снабжается инструкциями по его использованию in vivo.VII. Исследования in vivo Изобретение также относится к способам, позволяющим получить данные об отложениях амилоида у пациента in vivo. Такие способы обычно используются для диагностики или подтверждения болезни Альцгеймера или определения чувствительности к данной болезни. Например, указанные способы могут использоваться по отношению к пациенту, обнаруживающему признаки слабоумия. Если у пациента выявляются патологические отложения амилоида, он, скорее всего, страдает болезнью Альцгеймера. Способы также могут применяться по отношению к пациентам без симптомов заболевания. Присутствие патологических отложений амилоида свидетельствует о чувствительности к заболеванию с дальнейшим развитием симптомов. Способы также полезны для контроля прогресса заболевания и/или ответа на лечение у больных, которым предварительно был поставлен диагноз болезни Альцгеймера. Указанные способы основаны на введении реагента, например антитела, который связывается с А в организме пациента, и затем определении такого агента после связывания. Предпочтительные антитела связываются с отложениями А в организме пациента и не связываются с полноразмерным АРРполипептидом. Антитела, которые связываются с эпитопом А в пределах аминокислотных остатков 110, особенно предпочтительны. В некоторых способах используют антитела, которые связываются с эпи- 23006630 топом в пределах аминокислотных остатков 7-10 А. Такие антитела обычно обладают связывающей активностью, не вызывающей ответ, направленный на разрушение бляшек. В других случаях антитела связываются с эпитопом в пределах аминокислот 1-7 А. Такие антитела обычно обладают связывающей активностью, которая индуцирует ответ, направленный на разрушение бляшек, образованных А. Однако такой ответ не индуцируется при использовании фрагментов антител, утративших полноразмерный константный участок, например Fabs. В некоторых случаях одно и то же антитело может служить как диагностическим, так и терапевтическим реагентом. В целом, антитела, связывающиеся с эпитопами Сконцевого или остатка 10 А, не дают такого сильного сигнала, как антитела, связывающиеся с эпитопами в пределах остатков 1-10 А, предположительно потому, что С-концевые эпитопы недоступны в отложениях амилоида. Соответственно, такие антитела менее предпочтительны. Диагностические реагенты могут вводиться путем внутривенной инъекции в организм пациента или непосредственно в головной мозг внутричерепной инъекцией, а также путем просверливания отверстия в черепе. Доза реагента варьирует таким же образом, как и в случае лечения. Обычно реагент является меченым, хотя в некоторых способах первый реагент с аффинностью к А не имеет метки, а второй меченый реагент используется для связывания с первым. Выбор метки зависит от способа определения. Например, флуоресцентная метка подходит для оптической детекции. Использование парамагнитной метки подходит для томографического анализа без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут быть выявлены при использовании PET или SPECT. Диагноз устанавливается путем сравнения числа, размера и/или интенсивности связавшихся с меткой локусов с соответствующими значениями базового уровня. Значения базового уровня могут соответствовать средним значениям в популяции здоровых индивидуумов. Значения базового уровня также могут соответствовать предварительным уровням, определенным у того же самого пациента. Например,значения базового уровня могут быть определены у пациента до начала лечения и измеренные далее значения сравнивают со значениями базового уровня. Уменьшение измеренных значений по сравнению с сигналами базового уровня свидетельствуют о положительном ответе на лечение. ПримерыI. Профилактическая эффективность А по отношению к болезни Альцгеймера Указанные примеры описывают введение пептида А 42 трансгенным мышам, сверхэкспрессирующим АРР с мутацией в положении 717/APP717VF), за счет чего предрасположены к развитию нейропатологии, характерной для болезни Альцгеймера. Получение и свойства таких мышей (PDAPP мыши) описано Games et al., Nature, см. выше. Указанные животные в гетерозиготной форме обнаруживают тенденцию к отложению А, начиная с 6 месяцев жизни. К 15 месяцам жизни у них обнаруживаются уровни отложения А, эквивалентные таковым, которые свойственны болезни Альцгеймера. Мышей PDAPP инъецируют агрегированным А 42 или фосфатным буферным раствором (PBS). Агрегированный А 42 выбирают потому, что он способен индуцировать образование антител к множественным эпитопам Ар. А. Методы. 1. Источник мышей. 30 гетерогенных самок мышей PDAPP были произвольно разделены на следующие группы: 10 животных инъецировали агрегированным А 42 (одна мышь умерла при перевозке), 5 животных инъецировали PBS/адъювантом или PBS и 10 животных служили контролем. 5 животных инъецировали пептидами, происходящими из последовательности сывороточного амилоидного белка (SAP). 2. Приготовление иммуногенов. Получение агрегированного А 42: 2 мг А 42 (US Peptides Inc, lot K-42-12) растворяют в 0,9 мл воды и доводят до 1 мл добавлением 0,1 мл 10 х PBS. Смесь обрабатывают на установке Vortex и инкубируют в течение ночи при 37 С для агрегации пептида. Любую часть неиспользованного А хранят в виде сухого лиофилизированного порошка при -20 С до следующей инъекции. 3. Осуществление инъекций. Для каждой инъекции 100 мкг агрегированного А 42 в PBS в расчете на мышь эмульгируют с соотношении 1:1 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в конечном объеме 400 мкл эмульсии для первой иммунизации, за которой следует бустерное введение того же самого количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFА) через 2 недели. Две дополнительные дозы препарата в IFA вводят с месячными интервалами. Последующие иммунизации осуществляют с месячными интервалами в 500 мкл PBS. Инъекции осуществляют интраперитонеально (i.p.). Инъекции PBS проводят по той же самой схеме и мышей инъецируют смесью PBS/адъювант в соотношении 1:1 (400 мкл) в расчете на мышь или 500 мкл PBS. Инъекции SAP также проводят по аналогичной схеме при дозе 100 мкг на инъекцию. 4.Титрование крови мышей, препарирование тканей и иммуногистохимия. Указанные способы описаны ниже в разделе "Материалы и методы". В. Результаты. Мышей PDAPP инъецируют агрегированным А 42, пептидами SAP или PBS. Группу мышейPDAPP оставляют без инъекций в качестве положительного контроля. Титры антител у мышей, инъеци- 24006630 рованных А 42, оценивают каждый месяц, начиная с 4-й бустерной инъекции, до тех пор, пока животным не исполнится год. Мышей умерщвляют через 13 месяцев. Во все анализируемые точки времени восемь из девяти мышей, инъецированных агрегированным А 42, обнаруживают высокий титр антител,который остается высоким на протяжении серии инъекций (титры превышают величину 1/10000). У девятой мыши обнаруживается низкий, но измеряемый титр, составляющий примерно 1/1000 (фиг. 1, табл. 1). У мышей, инъецированных SAP, титр составляет 1/100-1/30000 по отношению к данному иммуногену и только у одной мыши титр равен 1/100000. Кровь мышей, инъецированных PBS, титруют против агрегированного А 42 на 6-й, 10-й и 12-й месяцы. При разведении сыворотки контрольных животных 1/100, титруемой против агрегированного А 42, только в одну точку времени фоновое значение титра было превышено более чем в 4 раза, а во все временные точки значение титра было меньше фонового более чем в 4 раза (табл. 1). SAPспецифический ответ не определялся в указанные точки времени во всех титрах, меньших 300. У 7 из 9 мышей, получавших агрегированный А 1-42, не выявлялись отложения амилоида в головном мозге. В противоположность этому в головном мозге мышей, иммунизированных SAP и PBS, обнаруживались значительные отложения амилоида в гиппокампе так же, как во фронтальной и в поясной извилинах. Характер отложений аналогичен таковым у контрольных необработанных животных с характерным включением уязвимых подучастков, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. У одной мыши среди животных, инъецированных А 1-42, наблюдалось существенное снижение отложений амилоида, ограниченное гиппокампом. Изолированная бляшка была идентифицирована у другой мыши, инъецированной А 1-42. Количественный анализ отложений амилоида в гиппокампе подтверждает существенное их снижение у обработанных А 42 (AN 1792) животных (фиг. 2). Средние значения отложений амилоида в группе животных, получавших PBS (2,22%), и группе контрольных необработанных животных (2,65%) были значительно выше, чем у животных, иммунизированных AN 1792 (0,00%, р = 0,0005). В противоположность указанному среднее значение для группы, иммунизированной SAP-пептидами (SAPP), составляло 5,74%. В мозговой ткани необработанных контрольных животных многочисленные отложения амилоида визуализируют с помощью А-специальных моноклональных антител (мАТ) 3D6 в гиппокампе, а также в ретросплениальной коре. Сходный характер амилоидных отложений также наблюдается у мышей, иммунизированных SAPP или PBS (фиг. 2). Кроме того, в последних трех группах выявилось характерное включение уязвимых подучастков в головном мозге, которое всегда наблюдается при болезни Альцгеймера, такое как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. Если в головном мозге не обнаруживалось отложений А, то в них отсутствовали и невритические бляшки, которые обычно визуализируются у мышей PDAPP с помощью антитела человека 8 Е 5 к АРР. У животных всех оставшихся групп (мыши, инъецированные SAP, PBS и необработанные мыши) в головном мозге выявлялись многочисленные невритические бляшки, характерные для необработанных животных. Незначительное число невритических бляшек обнаруживалось у одной мыши, инъецированнойAN 1792, и у второй такой мыши выявлялся определенный кластер дистрофического неврита. Анализ гиппокампа (фиг. 3) показал, что действительная элиминация дистрофического неврита у обработаннойAN 1792 мыши (среднее значение 0,00%) было сравнимо с таковым животных-реципиентов PBS (среднее значение 0,25%, р = 0,0005). Астроцитоз, характерный для ассоциированного с бляшками воспаления, также отсутствовал в головном мозге животных, входящих в группу, инъецированную А 1-42. В головном мозге мышей других групп содержались многочисленные и кластеризованные GFАР-позитивные астроциты, типичные для ассоциированного с бляшками глиоза. Набор срезов с реакцией на GFAP были противоокрашены Тиофлавином С для локализации отложений А. GFAP-позитивные астроциты были ассоциированы с бляшками А у животных, получавших SAP, PBS и контрольных мышей. Подобная ассоциация не обнаруживалась у не имеющих бляшек обработанных А 1-42 мышей, в то время как минимальный, ассоциированный с бляшками глиоз, идентифицировали у одной мыши, инъецированной AN 1792. Анализ ретросплениальной коры, приведенный на фиг. 4, показывает, что редукция числа астроцитов была значительной со средним значением 1,56% для группы, обработанной AN 1792, по сравнению со средним значением, превышающим 6%, для группы, иммунизированной пептидами SAP, PBS или необработанных животных (р = 0,0017). Данные, полученные при исследовании мышей, инъецированных А 1-42 и PBS, показывают, что ассоциированная с бляшками иммунореактивность МНС II отсутствует у животных, которым инъецировали А 1-42, что соответствует утрате связанного с А воспалительного ответа. Срезы головного мозга мышей также подвергали реакции с мАТ, специфичными к моноклональным антителам к МАС-1, белку клеточной поверхности. МАС-1 (CD11b) представляет собой белок семейства интегринов и существует в гетеродимерной форме с CD18. Комплекс CD11b/CD18 присутствует на моноцитах, нейтрофилах и природных киллерных клетках (Мак and Simard). Резидентный МАС-1 реактивный тип клеток в головном мозге скорее всего является клетками микроглии, что основано на сходной фенотипической морфологии МАС-1 иммунореактивных срезов. Мечение МАС-1, ассоцииро- 25006630 ванное с бляшками, было ниже в головном мозге животных, обработанных AN 1792, по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS, что соответствовало утрате индуцированного А воспалительного ответа. С. Выводы. Отсутствие А-бляшек и реактивных нейрональных и глиотических изменений в головном мозге мышей, инъецированных А 1-42, свидетельствует о том, что существенно малые отложения амилоида образуются в головном мозге или не образуются вовсе, а патологические последствия этого, такие как глиоз и невритическая патология, отсутствуют. У PDAPP мышей, обработанных А 1-42, обнаруживается практически точно такая же утрата патологических признаков, что и у контрольных животных. Таким образом, инъекции А 1-42 высокоэффективны в предотвращении отложений амилоида или очищении от А ткани головного мозга, а также в элиминировании последующих нейрональных и воспалительных дегенеративных изменений. Соответственно, введение пептида А может иметь как превентивное значение, так и терапевтическое значение в борьбе с болезнью Альцгеймера.II. Изучение дозового ответа Самок мышей Swiss Webster возраста 5 недель (6 мышей в группе) иммунизировали 300, 100, 33,11, 3, 7, 1, 2, 0,4 или 0,13 мкг А в CFA/IFA интраперитонеально. Три дозы вводили с двухнедельными интервалами, затем через месяц вводили четвертую дозу. Первую дозу эмульгируют в CFA, а оставшиеся дозы - в IFА. Кровь забирают на 4-7 дни после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. У животных из трех групп, которых иммунизировали дозами антигена, составляющими 11, 33 или 300 мкг, дополнительно забирали кровь примерно в месячные интервалы в течение четырех месяцев после четвертой иммунизации для контроля за снижением антительного ответа в зависимости от дозы иммуногена. Указанные животные получали последнюю пятую иммунизацию через семь месяцев после начала исследований. Их умерщвляли одну неделю спустя для измерения антительного ответа на AN 1792 и для осуществления токсикологических анализов. Снижающийся дозовый ответ наблюдали в интервале от 300 до 3,7 мкг и никакого ответа не наблюдали при двух более низких дозах. Средние титры антител составляли около 1:1000 после введения трех доз и около 11-300 мкг антигена (см. фиг. 5). Титры антител существенным образом возросли при введении наиболее низкой дозы; у всех животных после третьей иммунизации [геометрический средний титр антител (GMT) увеличился в 5-25 раз]. Низкий антительный ответ выявляется даже при дозах 0,4 мкг. При дозах 1,2 мкг титры были сравнимы и имели значения GMT около 1000. При четырех наиболее высоких дозах значение GMT составляло около 25000, за исключением дозы 33 мкг, при которой обнаруживалось минимальное значение GMT, составляющее 3000. После четвертой иммунизации увеличение титра было более умеренным для большинства групп. Выявлялся явный дозовый ответ в группах, которым вводили низкие дозы антигена (от 0,14 до 11 мкг), причем при дозе 0,13 мкг антитела не выявлялись, а при дозе 11 мкг значение GMT составляло 36000. Опять же титры при наиболее высоких дозах от 11 до 300 мкг были сравнимы между собой и попадали в группу одной величины. Таким образом, после двух иммунизаций титр антител зависел от вводимой дозы антигена в пределах ее значений от 0,4 до 300 мкг. К третьей иммунизации титры антител при наиболее высоких четырех дозах были сравнимы между собой и оставались на плато после дополнительной иммунизации. Через месяц после четвертой иммунизации титры были в 2-3 раза выше в группе животных, получавших 300 мкг антигена, чем измеренные в крови, забранной через 5 дней после иммунизации (фиг. 6). Указанное наблюдение позволяет предположить, что пик анамнестического антительного ответа приходится на более позднее время, чем 5 дней после иммунизации. Более умеренное (50%) увеличение титра наблюдается в это время в группе, получавшей 33 мкг антигена. В группе, получавшей 300 мкг антигена,через два месяца после введения последней дозы значения GMT резко снижаются примерно на 70%. Через месяц снижение происходит менее круто до 45% (доза 33 и 11 мкг). Таким образом, скорость снижения титров циркулирующих антител после прекращения иммунизации является бифазовым с резким падением в первый месяц после пикового ответа, за которым следует более умеренное падение титра. Титры антител и кинетика антительного ответа у мышей Swiss Webster сходна с таковой у молодых гетерозиготных трансгенных мышей PDAPP, иммунизированных параллельно. Дозы, эффективные для индукции иммунного ответа у человека, обычно сходны с дозами, эффективными у мышей.III. Скрининг терапевтической эффективности в случае установившейся болезни Альцгеймера Данное исследование проводят для тестирования иммуногенных агентов на активность в отношении элиминации или реверсии нейропатологических проявлений болезни Альцгеймера (БА) у старых животных. Иммунизации пептидом А из 42 аминокислот (AN 1792) начинают в то время, когда амилоидные бляшки уже обнаруживаются в головном мозге мышей PDAPP. Во время периода исследования у необработанных мышей PDAPP развиваются многочисленные нейродегенеративные изменения, которые свойственны БА [Games et al., см. выше и Johnson-Wood et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)]. Отложение А в амилоидных бляшках ассоциируется с дегенеративным нейрональным ответом, в основе которого лежит появление аберрантных аксональных и- 26006630 дендритных элементов, называемое дистрофическим невритом. Отложения амилоида, которые окружены дистрофическими невритными структурами, называются бляшками. У мышей с БА и мышей PDAPP дистрофический неврит имеет различную глобулярную структуру, является иммунореактивным по отношению к панели антител, распознающих АРР и элементы цитоскелета, и проявляется комплексом субклеточных дегенеративных изменений на ультраструктурном уровне. Указанные признаки обеспечивают связанные с заболеванием, избирательные и воспроизводимые измерения формирования невритических бляшек в головном мозге мышей PDAPP. Дистрофический нейрональный компонент невритических бляшек у мышей PDAPP легко визуализируется при использовании специфических антител к АРР человека (моноклональное антитело 8 Е 5) и измеряется с помощью компьютерного анализа. Таким образом,помимо определения эффекторов AN 1792 на формирование амилоидных бляшек авторы изобретения контролировали влияние такого лечения на развитие невритической дистрофии. Астроциты и клетки микроглии не являются нейрональными клетками, которые ответственны за нейрональное повреждение и отражают степень такого повреждения. GFAP-позитивные астроциты и МНС П-позитивные клетки микроглии обычно выявляются при БА, и их активация возрастает по мере увеличения тяжести заболевания. Таким образом, авторы изобретения контролировали развитие реакционноспособных астроцитов и клеток микроглии у мышей, обработанных AN 1792. А. Материалы и методы. Сорок восемь гетерозиготных самок мышей PDAPP возраста от 11 до 11,5 месяцев, полученных отCharls River, случайным образом разделили на две группы: 24 мыши были иммунизированы 100 мкг AN 1792 и 24 мыши были иммунизированы PBS. В каждом случае антиген смешивали с адъювантом Фрейнда. Затем группы животных опять разделили по достижении ими возраста, составляющего примерно 15 месяцев. В этом возрасте около половины животных каждой группы умерщвляют (n = 10 и 9 соответственно), остальных животных продолжали иммунизировать до достижения ими примерно 18 месяцев (n = 9 и 12 соответственно). Всего 8 животных (5, получавших AN 1792, и 3, получавших PBS) погибли во время эксперимента. Помимо иммунизированных животных в эксперимент были включены необработанные мыши возраста одного года (n = 10) и 18 месяцев (n = 10) для сравнения в ELISA измеренных уровней А и АРР в головном мозге. Животные возраста одного года были также включены в иммуногистохимический анализ. Методология эксперимента изложена в примере 1, если специально не оговаривается иное. Для получения антигена для шести иммунизации до достижения мышами 15-месячного возраста используют пептиды US lot 12 и California Peptides lot ME0339. Пептиды California lot ME0339 и lot ME0439 используют для трех дополнительных иммунизации, которые осуществляют между 15 и 18 месяцами жизни. Для иммунизаций 100 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в CFA или IFA или PBS до конечного объема 400 мкл. Первую иммунизацию осуществляют в CFA и последние 4 дозы в PBS без добавления адъюванта. В целом, осуществляют 9 иммунизаций в течение 7 месяцев по двухнедельной схеме для первых трех доз с последующим 4-недельным интервалом для остальных инъекций. Четырехмесячную группу обработки умерщвляют в возрасте 15 месяцев, она получает только первые 6 иммунизаций. В. Результаты. 1. Эффекты обработки AN 1792 на отложения амилоида. Результаты влияния обработки AN 1792 на кортикальные отложения амилоида, показаны на фиг. 7. Среднее значение кортикальных отложений амлоида составляет 28% в группе необработанных животных 12-месячного возраста (мыши PDAPP), соответствующее количеству бляшек у мышей в начале исследования. В 18 месяцев амилоидные отложения усиливались более чем в 17 раз, достигая значения 4,87% у мышей, получавших PBS, в то время как у мышей, получавших AN 1792, они существенным образом уменьшались до величины 0,01%, значительно меньшей, чем у необработанных животных 12 месячного возраста и у животных 15- и 18-месячного возраста, получавших PBS. Отложения амилоида существенно редуцировались у реципиентов, получавших AN 1792, возраста 15 месяцев (96% редукции,р = 0,003) и 18 месяцев (99% редукции, р = 0,0002). Обычно кортикальные отложения амилоида у мышей PDAPP начинаются во фронтальной и ретросплениальной извилинах (RSC) и прогрессируют в вентрально-латеральном направлении и охватывают темпоральную и энторинальную извилины (ЕС). Немного амилоида обнаруживается в ЕС 12-месячных мышей (или не обнаруживается совсем). Примерно в этом возрасте впервые начинают введение AN 1792. Через 4 месяца после введения AN 1792 отложения амилоида существенно уменьшаются в RSC, и прогрессирующее вовлечение ЕС в этот процесс действительно элиминируется при лечении с помощьюAN 1792. Позднее наблюдение показывает, что введение AN 1792 полностью останавливает развитие отложений амилоида, которые в норме охватывают темпоральную и вентральную извилины, а также предотвращает возможную реверсию отложений амилоида в RSC. Действительные эффекты введения AN 1792 на развитие кортикальных отложений амилоида у мышей PDAPP далее были показаны на 18-месячных мышах, которых обрабатывали в течение 7 месяцев. Практически полное отсутствие кортикального амилоида обнаруживается у мышей, инъецированных AN 1792, вместе с полным отсутствием диффузных бляшек и редукцией компактных отложений.- 27006630 2. Лечение AN 1792 ассоциируется с клеточными и морфологическими изменениями. Обнаружено, что популяция А-позитивных клеток находится в участках мозга, которые обычно содержат отложения амилоида. Существенно, что в головном мозге реципиентов AN 1792 обнаруживается совсем немного внеклеточных кортикальных амилоидных бляшек или они вообще не обнаруживаются. Большая часть А-иммунореактивности связана с клетками с дольчатой и агрегированной сомой. Фенотипически указанные клетки соответствуют активированным моноцитам или клеткам микроглии. Они обладают иммунореактивностью при связывании с антителами, распознающими лиганды, которые экспрессируются активированными моноцитами и клетками микроглии (МНС II и CD11b), и иногда ассоциированы со стенкой или просветом кровеносных сосудов. Сравнение близлежащих срезов, меченных антителами, специфичными к А и МНС-II, показывает, что оба класса антител выявляют сходные структуры в этих клетках. Детальный анализ головного мозга АN 1792-обработанных животных обнаруживает, что МНС II-позитивные клетки ограничены определенной областью отложений амилоида, которые еще остаются у данных животных после лечения. Если проводится фиксация, то клетки не обладают иммунореактивностью с антителами, распознающими лиганды Т-клеток (CD3, CD3e), В-клеток(CD45RA, CD45RB) или общий лейкоцитарный антиген (CD45), но сохраняют реактивность по отношению к антителу, выявляющему лейкосиалин (CD43), которое перекрестно реагирует с моноцитами. Такого типа клетки не обнаруживаются ни у одного из животных, получавших PBS. У мышей PDAPP неизменно развиваются амилоидные отложения во внешнем молекулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Отложения формируют четкую полосу с отверстиями, классический подучасток которой содержит амилоидные бляшки при БА. Характерное появление таких бляшек у мышей, получавших PBS, соответствует тому, что свойственно необработанным мышам PDAPP. Отложения амилоида состоят как из диффузных, так и из компактных бляшек, формирующих непрерывную полосу. В противоположность указанному во многих случаях в головном мозге мышей, получавших AN 1792, указанный характер отложений существенным образом изменен. Амилоидные отложения гиппокампа уже не содержат диффузного амилоида, и полосы отложений разрушены и носят прерывистый характер. Вместо указанных выше структур выявляются многочисленные нетипичные пятнистые структуры, которые реагируют с антителами к А; некоторые из таких структур содержат клетки с амилоидом. МНС II-позитивные клетки часто выявляются в непосредственной близости от внеклеточного амилоида в головном мозге обработанных AN 1792 животных. Характер взаимосвязи А-позитивных клеток с амилоидом очень схож между собой у некоторых животных, получавших AN 1792. Распределение указанных моноцитарных клеток ограничено близостью отложений амилоида, и они практически полностью отсутствуют в других участках мозга без А-бляшек. Конфокальная микроскопия МНС II- и А-меченых срезов показывает, что бляшки сформированы многочисленными моноцитарными клетками. Количественный анализ МНС II- и MAC I-меченых срезов головного мозга выявил тенденцию к увеличению иммунореактивности в RSC и гиппокампе у обработанных AN 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими PBS, что усиливает значимость измерений реактивности MAC-I в гиппокампе. Указанные результаты являются показателем активного опосредованного клетками разрушения амилоида в участках мозга с амилоидными бляшками. 3. Эффекты AN 1792 на уровни А: определения методом ELISA.(а) Кортикальные уровни. У необработанных мышей PDAPP средний уровень общего А в коре в возрасте 12 месяцев составляет 1,600 нг/г, который увеличивается до 8,700 нг/г к 15 месяцам (табл. 2). В 18 месяцев уровень А достигает 22,000 нг/г, т.е. увеличивается в 10 раз во время течения эксперимента. У животных, получавших PBS, в возрасте 15 месяцев уровень общего А составляет 8,600 нг/г, который увеличивается до 19,000 нг/г в возрасте 18 месяцев. В противоположность указанному у обработанных AN 1792 животных уровень общего А уменьшен на 81% в возрасте 15 месяцев (1,600 нг/г) по сравнению с животными, получавшими PBS. Существенно меньший уровень (р = 0,0001) общего А (5,200 нг/г) обнаруживается у 18-месячных животных при сравнении групп, получавших AN 1792 и PBS (табл. 2), отражая 72%-ное снижение уровня А, который в противном случае был бы обнаружен. Сходные результаты были получены при сравнении уровней А 42 в коре, показывая, что у животных, получавших AN 1792, содержание А 42 существенно ниже, но в этом случае различие между группами обработки AN 1792 и PBS было значительным как в 15-месячном (р = 0,04), так и 18-месячном (р = 0,0001) возрасте (табл. 2).(б) Уровни А в гиппокампе. У необработанных мышей PDAPP средние уровни общего А в гиппокампе в 12-месячном возрасте составляет 15,000 нг/г, которые возрастают до 51,000 нг/г в возрасте 15 месяцев и далее до 81,000 нг/г в возрасте 18 месяцев (табл. 3). Сходным образом у PBS иммунизированных мышей значения общего А составляли 40,000 и 65,000 нг/г в 15 и 18 месяцев соответственно. У иммунизированных AN 1792 животных уровни общего А были ниже, составляя 25,000 и 51,000 нг/г в соответствующие точки времени,равные 15 и 18 месяцам. Значение уровня в группе, получавшей AN 1792, в возрасте 18 месяцев было существенно ниже, чем в группе, получавшей PBS (р = 0,0105; табл. 3). Измерение А 42 давало сходные результаты, показывая, что уровни в обработанной AN 1792 группе были существенно ниже, чем в группе, получавшей PBS (39,000 нг/г против 57,000 нг/г соответственно; р = 0,002) по достижении 18 месячного возраста (табл. 3). Таблица 3 Средние уровни А (нг/г) в гиппокампе(с) Церебральные уровни. У 12-месячных необработанных мышей PDAPP средний церебральный уровень общего А составляет 15 нг/г (табл. 4). В возрасте 15 месяцев указанное значение возрастает до 28 нг/г и к 18 месяцам достигает 35 нг/г. У обработанных PBS животных средние уровни общего А составляли 21 нг/г в возрасте 15 месяцев и 43 нг/г в возрасте 18 месяцев. У животных, получавших AN 1792, общий уровень А составляет 22 нг/г в возрасте 15 месяцев и существенно уменьшается (р = 0,002) в возрасте 18 месяцев (25 нг/г), что соответствует значениям уровней в группе, получавшей PBS (табл. 4). Таблица 4 Средние уровни А (нг/г) в мозжечке р = 0,0018 4. Эффекты лечения с помощью AN 1792 на уровни АРР. АРР- и полноразмерная молекула АРР содержат всю или часть А последовательности и, таким образом, потенциально способны генерировать направленный к AN 1792 иммунный ответ. До настояще- 29006630 го времени было показано, что незначительное увеличение уровней АРР представляет собой нейропатологическое увеличение у мышей PDAPP. В коре уровни APP-/FL (полная длина) или АРР практически не изменяются под действием лечения с ожиданием того, что уровень АРР- снизится до 19% через 18 месяцев в группе животных, обработанных AN 1792 , по сравнению с животными, получившими PBS. Уровни АРР через 18 месяцев у обработанных AN 1792 существенно не отличаются от 12-месячного и 15-месячного уровней АРР у необработанных животных и 15-месячного уровня у животных, получавших PBS. Во всех случаях уровни АРР оставались в тех пределах, которые в норме обнаруживаются у мышей PDAPP. 5. Эффекты лечения AN 1792 на нейродегенеративную и глиотическую патологию. Отложения невритических бляшек существенно редуцируются во фронтальной коре обработанныхAN 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими PBS, к 15 (84%; р = 0,03) и 18 (55%; р = 0,01) месяцам жизни (фиг. 8). Средние значения отложений невритических бляшек возрастает с 0,32 до 0,49% в группе, получавшей PBS, между 15 и 18 месяцами жизни. Это контрастирует со значительным снижением развития невритических бляшек у животных, получавших AN 1792, где среднее значение отложений невритических бляшек составляет 0,05% и 0,22 в 15 и 18 месяцев соответственно. При иммунизациях AN 1792 высокотолерантные и реакционноспособные астроциты также существенно уменьшаются в числе у животных, обработанных PBS и AN 1792, по сравнению с животными,обработанными PBS, к 15 (56%; р = 0,011) и 18 (39%; р = 0,028) месяцам жизни (фиг. 9). Средние значения числа астроцитов в процентах к группе животных, получавших PBS, возрастают между 15 и 18 месяцами жизни от 4,26 до 5,21%. Обработка AN 1792 супрессирует развитие астроцитов в обе временные точки на 1,89 и 3,2% соответственно. Это позволяет предположить, что нейропиль не повреждается в процессе разрушения бляшек. 6. Антительный ответ. Как описано выше, 11-месячные гетерозиготные PDAPP мыши (N = 24) получали серии из 5 иммунизации по 100 мкг AN 1792 в адъюванте Фрейнда, вводимых интраперитонеально в недели 0, 2, 4, 8 и 12. Шестую иммунизацию осуществляют одним PBS (без адъюванта Фрейнда) на 16-ю неделю. В качестве негативного контроля используют группы из 24 трансгенных мышей, совпадающих по возрасту с теми, которым вводят PBS, эмульгированный в тех же самых адъювантах и по той же самой схеме, что и опытным животным. Животных обескровливали через 3-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй дозы. Антительный ответ на AN 1792 измеряют методом ELISA. Средние геометрические значения титров (GMT) для животных, которые были иммунизированы AN 1792, составляют около 1900,7600, 45000 после второй, третьей и последней (шестой) доз соответственно. Никаких А-специфических антител не выявляется у контрольных животных после шестой иммунизации. Примерно половину животных обрабатывают в течение дополнительных трех месяцев, проводя иммунизации примерно на 20, 24 и 27 неделе. Каждую из указанных доз вводят в PBS без добавления адъюванта Фрейнда. Средние значения титров антител остаются без изменений за указанный период времени. В действительности титры антител остаются стабильными от четвертого до восьмого забора крови, соответствующих периоду, охватывающему время от пятой до девятой инъекции. Для определения того, ассоциированы ли А-специфические антитела, образующиеся в ответ на иммунизацию (которые определяются анализом сыворотки AN 1792-обработанных мышей), с отложениями амилоида в головном мозге, срезы головного мозга мышей, обработанных AN 1792 и PBS, подвергают воздействию антител, специфичных к IgG мыши. В противоположность контролю (PBS) Абляшки в головном мозге животных, получавших AN 1792, оказались покрытыми эндогенными IgG. Такое различие между двумя группами можно было наблюдать в группах как 15-, так и 18-месячных животных. Особенно неожиданным было отсутствие метки в группе животных, получавших PBS, несмотря на наличие значительных отложений амилоида у данных животных. Указанные результаты свидетельствуют о том, что иммунизация синтетическим белком А генерирует образование антител, которые распознают и связывают in vivo А в амилоидных бляшках. 7. Клеточно-опосредованный иммунный ответ. Селезенки удаляют у девяти 18-месячных мышей PDAPP, иммунизированных AN 1792, и двенадцати таких же мышей, иммунизированных PBS, через 7 дней после девятой иммунизации. Спленоциты выделяют и культивируют в течение 72 ч в присутствии А 40, А 42 или А 40-1 (белок обратного порядка). В качестве позитивного контроля используют митоген Con А. Оптимальные ответы получают при концентрации белка 1,7 мкМ. Клетки, полученные ото всех 9 животных, обработанных AN 1792,пролиферируют в ответ на белки А 1-40 или А 1-42 с эквивалентным уровнем включения метки в оба белка (фиг. 10, верхняя панель). На белок А 40-1 ответ не обнаруживается. Клетки от контрольных животных не отвечают ни на какой-либо из белков А (фиг. 10, нижняя панель). С. Выводы. Результаты данного исследования показывают, что иммунизация AN 1792 мышей PDAPP воздействует на существующие отложения амилоида и предотвращает их прогрессивное образование, а также замедляет последующие нейропатологические изменения, возникающие с возрастом в головном мозге
МПК / Метки
МПК: A61P 25/28, A61K 39/39, C07K 16/18, A61K 48/00, A61K 39/395, G01N 33/68, C07K 14/47, A61K 39/00, A61K 38/17
Метки: амилоидогенного, фармацевтические, заболевания, предотвращения, лечения, композиции, используемые, способы, них
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-6630-sposoby-predotvrashheniya-i-lecheniya-amiloidogennogo-zabolevaniya-i-ispolzuemye-v-nih-farmacevticheskie-kompozicii.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способы предотвращения и лечения амилоидогенного заболевания и используемые в них фармацевтические композиции</a>
Мостиковые инденопирролокарбазолы, фармацевтические композиции и способы лечения
Номер патента: 4066
Опубликовано: 25.12.2003
Авторы: Андерайнер Теодор Л., Хадкинз Роберт Л., Сингх Джасбир, Трипатхи Рабиндранатх, Малламо Джон П.
МПК: C07D 498/22, A61K 31/553, A61P 35/00...
Метки: мостиковые, лечения, композиции, инденопирролокарбазолы, фармацевтические, способы
Формула / Реферат:
1. Инденопирролокарбазолы формулы II где R1, R4, R6, R7 представляют собой водород; Y представляют собой O; n представляет собой 1; m представляет собой 1 или 2; R2 представляет собой водород, OH или алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода; R3 представляет собой водород, галоген, C1-C4алкокси, 3-(3'-NH2-Ph); R5 представляет собой водород, C1-C4алкокси; R8 представляет собой водород, C1-C4алкил, CO2Et, CH2OH; Z представляет собой связь или O....
Конъюгаты эритропоэтина, их применение, фармацевтические композиции и способы лечения
Номер патента: 3777
Опубликовано: 28.08.2003
Автор: Бейлон Паскаль Себастиан
МПК: A61P 7/06, C07K 14/505, A61K 38/18...
Метки: композиции, эритропоэтина, фармацевтические, применение, конъюгаты, способы, лечения
Формула / Реферат:
1. Конъюгат, который включает гликопротеин эритропоэтина, имеющий, по меньшей мере, одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение продуцирования ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбранный из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов...
Производные пиразолотриазинов, фармацевтические композиции, содержащие их, способы лечения
Номер патента: 4403
Опубликовано: 29.04.2004
Авторы: Арванитис Арджириос Георгиос, Хорват Роберт Джон
МПК: A61K 31/53, A61P 1/04, A61K 31/4162...
Метки: способы, содержащие, композиции, производные, лечения, фармацевтические, их, пиразолотриазинов
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (1) и его изомеры, его стереоизомерные формы или смеси его стереоизомерных форм и его фармацевтически приемлемые соли или пролекарства, где A обозначает N; Z обозначает CR2; Ar выбран из группы фенил, пиридил, где каждый Ar необязательно замещен 1-5 группами R4; R1 независимо выбран в каждом случае из группы H, C1-C4-алкил; R2 независимо выбран из группы H, C1-C4-алкил; R3 выбран из группы -H, OR7, NR6aR7a, или фенил,...
Кальцийдикарбоксилатные эфиры, способы их получения, фармацевтические композиции и способ лечения
Номер патента: 4862
Опубликовано: 26.08.2004
Авторы: Эндо Хауард Йошихиса, Батлер Доналд Юджин, Доузмэн Гэри Джей
МПК: A61K 31/19, C07C 59/125, A61P 3/10...
Метки: композиции, кальцийдикарбоксилатные, способ, получения, фармацевтические, эфиры, способы, лечения
Формула / Реферат:
1. Кристаллическая Форма 1 соединения монокальциевой соли 6-(5-карбокси-5-метилгексилокси)-2,2-диметилгексановой кислоты, имеющая картину дифракции рентгеновских лучей на порошке, содержащую характеристический пик, выраженный в градусах 2q , при 6,760. 2. Кристаллическая Форма 1 соединения монокальциевой соли 6-(5-карбокси-5-метилгексилокси)-2,2-диметилгексановой кислоты по п.1, имеющая картину дифракции рентгеновских лучей на порошке,...
Антибактериальные соединения карбапенема, содержащие их фармацевтические композиции и способы лечения
Номер патента: 1296
Опубликовано: 25.12.2000
Авторы: Вилкенинг Роберт Р., Рэтклифф Рональд В., Близзард Тимоти А.
МПК: C07D 477/14, A61K 31/428
Метки: фармацевтические, содержащие, композиции, лечения, антибактериальные, способы, карбапенема, соединения
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемые соли, где R1 обозначает Н или метил; СО2М обозначает карбоновую кислоту, карбоксилатный анион, фармацевтически приемлемую сложноэфирную группу или карбоновую кислоту, защищенную защитной группой; Р обозначает водород, гидроксил, F или гидроксил, защищенный гидроксилзащитной группой; каждый R независимо выбирают из -R*; -Q; водорода; галогена; -CN; -NO2; -NRaRb; -ORc; -SRc; -C(O)NRaRb;...
Предыдущий патент: Удаляющая пятна на зубах жевательная резинка и способ её получения
Следующий патент: Синтетическая биологически активная молекула и способы ее получения
Случайный патент: Сульфонилпирролгидрохлориды как ингибиторы гистондезацетилазы