Фибринолитически активный полипептид

006487 Область, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к фибринолитически активной металлопротеиназе с последовательностью неприродного происхождения, к рекомбинантным способам е получения и к е применению при лечении тромбоза in vivo. Предпосылки создания изобретения Фибролаза представляет собой ферментативно активный полипептид, конкретно металлопротеиназу, состоящую из 203 аминокислотных остатков, которую первоначально выделили из яда мокасиновой змеи: патент США 4610879, выдан 9 сентября 1986 г. (Markland et al.); и Guan et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, том 289, номер 2, стр.197-207 (1991). Фермент проявляет прямую фибринолитическую активность с небольшой геморрагической активностью или без геморрагической активности, и он растворяет сгустки крови (тромбы), либо образованные фибриногеном, либо сгустки цельной крови. Аминокислотная последовательность фибролазы также была определена методами, описанными для рекомбинантного продуцирования в дрожжах, и применяется для лечения тромбоэмболических состояний in vivo; Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), стр. 590-600 и Европейская патентная заявка 0323722 (Valenzuela et al.), опубликованная 12 июля 1989 г. Сущность изобретения Данное изобретение охватывает фибринолитическую металлопротеиназу, имеющую неприродную линейную аминокислотную последовательность, изображнную как SEQ ID NO: 1, также называемую в данном описании тромболитик нового действия (или NAT). Также охватываются нуклеотидные молекулы, такие как молекула SEQ ID NO:2 и е варианты, кодирующие NAT. Термин зрелый употребляется в общепринятом смысле и относится к биологически активному полипептиду, который ферментативно процессирован in situ в клетке-хозяине, с отщеплением его от препро-участка. Благодаря своей фибринолитической активности NAT применим in vivo в качестве агента, растворяющего тромбы (сгустки крови), для лечения тромбоза у млекопитающего (включая крыс, свиней и человека). Полипептид NAT по данному изобретению имеет преимущества перед природной фибролазой в качестве терапевтического агента (то есть фибринолитического полипептида, обнаруженного в змеином яде). Известно, что природная фибролаза содержит несколько различных N-концов: QQRFP, EQRFP иERFP (где Е обозначает циклизованный глутамин или пироглутаминовую кислоту). Более конкретно,начиная с N-конца, состоящего из QQRFP, молекула фибролазы претерпевает расщепление, давая в результате две изоформы, имеющие N-концевые последовательности EQRFP И ERFP, соответственно. Рекомбинантная фибролаза, будучи продуцирована в дрожжах, обычно дает смесь всех трх из этих форм и, следовательно, не является однородной. См. Loayza et al., Journal of Chromatography, B662, стр. 227243 (1994). Кроме того, циклизованный глутаминовый остаток дат в результате блокированный Nконец, который делает секвенирование невозможным. Напротив, рекомбинантный NAT по данному изобретению дат одну форму: обычно получают только один N-конец. Результатом является большая гомогенность конечного продукта по сравнению с рекомбинантной фибролазой, что является преимуществом, когда предполагаемой конечной целью является применение в медицине. Краткое описание фигур На чертеже дано линейное изображение полной аминокислотной последовательности NAT (SEQ IDNAT можно продуцировать рекомбинантной экспрессией нуклеотидной молекулы SEQ ID NO:4,которая кодирует аминокислотную последовательность NAT (SEQ ID NO:3), включая препро-участок от нуклеотида 1 до 783 и зрелый полипептид, нуклеотиды 784-1386, в подходящем хозяине. После экспрессии препро-участок ферментативно отщепляется, в результате получается зрелый активный полипептид(SEQ ID NO:1). Предпочтительно, NAT продуцируют рекомбинантно в дрожжах, что подробнее описано ниже. Получаемый таким образом зрелый полипептид (SEQ ID NO:1) может иметь или не иметь аминоконцевой метионин, в зависимости от способа получения. Обычно аминоконцевой метиониновый остаток будет присутствовать, когда полипептид продуцируют рекомбинантно в несекретирующем бактериальном (например, Е. coli) штамме в качестве хозяина. Помимо нуклеотида с SEQ ID NO:2 также применимы его вырожденные последовательности, которые кодируют тот же самый полипептид. Данное изобретение также охватывает нуклеотиды, которые могут кодировать дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие 5' или 3' участки области,кодирующей зрелый полипептид, такие как последовательности, кодирующие альтернативные пре/проучастки (то есть последовательности, ответственные за секрецию полипептида через клеточные мембраны) вместо нативного пре/про-участка (то есть обнаруженного в природной фибролазе). Дополнительные последовательности могут также являться не кодирующими последовательностями, включая регу-1 006487 лярные последовательности, такие как промоторы транскрипции или трансляции, зависящие от клеткихозяина.NAT можно получать, используя хорошо известные методы рекомбинантной ДНК, такие как представленные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY (1989) и/или Ausubel et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, GreenPublishers Inc. and Wiley and Sons, New York (1994). ДНК, кодирующая полипептид или его процессированную версию, может быть получена, например, скринингом библиотеки на основе геномной или кДНК или PCR-амплификацией с целью получения нуклеотида, кодирующего фибролазу, с последующим замещением кодонов, кодирующих N-концевые аминокислотные остатки QQR, кодоном для серина (S). Или же ДНК, кодирующую NAT, можно получать химическим синтезом с применением методов, хорошо известных специалистам, таких как методы, описанные Engels et al. в Angew. Chem. Intl. Ed., том 28,стр.716-734 (1989). Обычно ДНК имеет протяжнность в несколько сот нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты протяжнностью более примерно ста нуклеотидов можно синтезировать в виде нескольких фрагментов, используя те же методы, и фрагменты можно лигировать вместе, получая нуклеотидную последовательность заданной длины. Молекулу ДНК встраивают в соответствующий вектор экспрессии с целью экспрессии в подходящей клетке-хозяине. Вектор выбирают так, чтобы он был функциональным в конкретной применяемой клетке-хозяине (то есть вектор совместим с механизмами клетки-хозяина, так чтобы могла осуществляться экспрессия ДНК). Полипептид можно экспрессировать в прокариотных, дрожжевых клеткаххозяевах, клетках-хозяевах насекомых (бакуловирусные системы) или в эукариотных клетках-хозяевах,хотя дрожжевые являются предпочтительными, как более подробно объясняется ниже. Векторы, используемые в любой клетке-хозяине для экспрессии NAT, могут также содержать 5' фланкирующую последовательность (также называемую промотор) и другие регуляторные элементы экспрессии, функционально связанные с ДНК, которая должна экспрессировать, а также энхансер(ы),ориджин репликации, элемент терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность сигнального пептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерный участок для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей NAT, и селективный маркр. Каждый из этих элементов обсуждается ниже. При необходимости, вектор может также содержать последовательность- метку, то есть олигонуклеотидную последовательность, расположенную на 5' или 3' конце кодирующей полипептид последовательности, которая кодирует полиHis (такой как гeкcaHis), или другой малой иммуногенной последовательности (такой как эпитоп с-mус или гемагглютинина, антитела для которых, включая моноклональные антитела, промышленно доступны). Эта метка может экспрессировать наряду с NAT и может служить как метка афинности для очистки этого полипептида от клетки-хозяина. При необходимости метку затем можно удалять из очищенного полипептида различными методами, например с применением селективной пептидазы. 5' фланкирующая последовательность может быть нативной 5' фланкирующей последовательностью, или она может быть гомологичной (то есть из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин),гетерологичной (то есть из иного вида или штамма нежели клетка-хозяин), гибридной (то есть комбинацией 5' фланкирующих последовательностей более, чем из одного источника), или синтетической. Источником 5' фланкирующей последовательности может быть любой одноклеточный прокариотный или эукариотный организм, любое позвоночное или беспозвоночное, или любое растение при условии, что 5' фланкирующая последовательность функциональна в механизмах клетки-хозяина и может быть активирована с их помощью. Ориджин репликация обычно представляет собой участок векторов экспрессии прокариот, выпускаемых промышленностью, и способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Амплификация вектора до определнного числа реплик может, в некоторых случаях, являться важной для оптимальной экспрессии NAT. Если выбранный вектор не содержит ориджина репликации, его можно синтезировать химически на основе известной последовательности, а затем лигировать в вектор. Элемент терминации транскрипции обычно расположен 3' относительно конца кодирующей полипептид последовательности и служит для терминации транскрипции мРНК. Обычно элемент терминации транскрипции прокариотных клеток представляет собой G-C-обогащнный фрагмент, за которым следует полиТ-последовательность. Хотя элемент легко клонируется на основе библиотеки или даже выпускается промышленностью как часть вектора, его также можно легко синтезировать с помощью известных способов синтеза нуклеиновых кислот. Селективный маркр кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, выращенной в избирательной культуральной среде. Типичный селективный маркр (ген) кодирует белки, которые: (а) сообщают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, тетрациклину или канамицину - в случае прокариотных клеток-хозяев, зеоцину - в случае дрожжевых клеток-хозяев, и неомицину - в случае клеток-хозяев млекопитающих; (b) дополняют ауксотрофный дефицит клетки; или (с) снабжают важными питательными веществами, недоступными из комплексных сред.-2 006487 Предпочтительные селективные маркры для экспрессии в прокариотах представляют собой ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Элемент связывания рибосомы, обычно называемый последовательностью Шайна-Дальгарно(Shine-Dalgarno) (для прокариот) или последовательностью Козака (Kozak) (для эукариот), необходим для инициации трансляции мРНК. Элемент обычно расположен 3' относительно промотора и 5' относительно кодирующей последовательности синтезируемого полипептида. Последовательность ШайнаДальгарно меняется, но обычно представляет собой полипурин (то есть с высоким содержанием A-G). Идентифицированы многие последовательности Шайна-Дальгарно, каждую из которых можно легко синтезировать с помощью вышеописанных методов и использовать в прокариотном векторе. Последовательность Козака обычно включает последовательности непосредственно перед и после инициирующего кодона. Предпочтительная последовательность Козака является последовательностью, которая ассоциирована с высокой эффективностью инициации трансляции при AUG стартовом кодоне. В тех случаях, когда желательно, чтобы NAT-полипептид секретировал из клетки-хозяина, можно использовать сигнальную последовательность для того, чтобы направить полипептид из клетки-хозяина,где он синтезирован. Обычно сигнальная последовательность позиционирована в кодирующей области нуклеотидной последовательности или непосредственно на 5'-конце кодирующей области. Были определены многие сигнальные последовательности, и некоторые из них, которые являются функциональными в выбранной клетке-хозяине, могут использоваться по данному изобретению. Соответственно, сигнальная последовательность может быть гомологичной или гетерологичной последовательностью полипептида. Кроме того, сигнальную последовательность можно химически синтезировать, ссылки на которую даны выше. После того, как вектор сконструирован и нуклеиновая кислота встроена в нужный сайт вектора,полный вектор можно ввести в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Как уже упоминалось, клетки-хозяева могут быть прокариотные (такие как E.coli) или эукариотные(такие как дрожжевая клетка, клетка насекомых или клетка позвоночных). Клетка-хозяин, будь это дрожжи или любой другой хозяин, при культивировании в подходящих условиях, может синтезироватьNAT, который затем можно собирать с культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретирует). После сбора полипептид NAT можно очистить такими методами, как хроматография на молекулярных ситах, афинная хроматография и т.п. Выбор клетки-хозяина в большой степени зависит от того, является ли способ, каким клетка-хозяин способна скручивать NAT в его нативную вторичную или третичную структуру (например, подходящая ориентация дисульфидных мостиков и т.п.), таким, что клетка образует биологически активный материал. Однако, даже если клетка-хозяин не синтезирует биологически активный материал, он может скручиваться после синтеза при использовании соответствующих химических условий, таких, которые известны специалистам в данной области техники. В любом случае тот факт, что получен биологически активный материал, подразумевает соответствующее скручивание. Подходящими клетками-хозяевами или клеточными линиями могут быть клетки млекопитающих,такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки 3 Т 3. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающих или способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта известны в технике. Другими подходящими клеточными линиями млекопитающих являются клеточные линии COS-1 и COS-7 и CV-1 обезьян. Другие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клеточные линии приматов и грызунов, включая трансформированные клеточные линии. Также применимы нормальные диплоидные клетки, клеточные штаммы in vitro культур первичной ткани, а также первичных эксплантатов. Предполагаемые клетки (кандидаты) могут генотипически отличаться по гену селекции или могут содержать доминантно действующий ген селекции. Другие подходящие клеточные линии млекопитающих включают, без ограничения, HeLa, мышиные L-929 клетки,3 Т 3 линии мышей Swiss, Balb-c или NIH, клеточные линии хомячков ВНК или НаК. Также пригодны в качестве клеток-хозяев бактериальные клетки. Например, различные штаммы Е.coli (например, НВ 101, ДН 5 а, ДН 10 и МС 1061) хорошо известны как клетки-хозяева в биотехнологии. Различные штаммы B.subtilis, Pseudomonas spp, других Bacillus spp, Streptomyces spp и т.п. также могут применяться. Кроме того, многие штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, также применимы в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептида по данному изобретению. Также, если требуется, можно в качестве клеток-хозяев использовать клетки насекомых. См., например, Miller et al., Genetic Engineering, том 8, стр. 277-298 (1986). Включение (также называемое трансформация или трансфекция) вектора в выбранную клеткухозяина можно осуществлять такими методами, как кальций-фосфатный, электропорация, микроинъекция, липофекция или метод DEAE-декстраном. Выбор метода частично зависит от вида используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие пригодные методы хорошо известны специалистам в данной области техники и представлены, например, в Sambrook et al., см. выше. Клетки-хозяева, содержащие вектор, можно культивировать, применяя стандартные среды, хорошо-3 006487 известные специалистам в данной области техники. Среды обычно содержат все питательные вещества,необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для выращивания клеток Е. coli являются, например, бульон Лурия (LB) и/или бульон Террифика (ТВ). Подходящими средами для культивирования эукариотных клеток являются RPMI 1640, MEM, DMEM, каждая из которых может быть дополнена сывороткой и/или факторами роста, как требуется конкретной культивируемой клеточной линией. Подходящей средой для культур насекомых является среда Грейса (Grace), дополненная, при необходимости, дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и/или фетальной телячьей сывороткой. Как правило, антибиотик или другое соединение, пригодное для избирательного роста только трансформированных клеток, добавляют как дополнение к средам. Использование конкретного соединения диктуется селективным маркром, присутствующим на плазмиде, при участии которой трансформирована клетка-хозяин. Например, если селективный маркер представляет собой ген устойчивости к канамицину, соединение, добавляемое в культуральную среду, является канамицином. Количество NAT, продуцированного в клетке-хозяине, можно оценивать стандартными методами,известными в технике. Такие методы включают, без ограничения, вестерн-блоттинг, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата, ВЭЖХ-разделение, иммунопреципитацию и/или анализы активности, такие как анализы сдвига в геле при ДНК-связывании. Если NAT секретирует из клеток-хозяев, иных, нежели грам-отрицательные бактерии, основную часть, по-видимому, можно обнаружить в клеточной культуральной среде. Если NAT секретирует из грам-отрицательных бактерий, какую-то часть его обнаруживают в периплазме. Если NAT не секретирует, он находится в цитоплазме. В случае внутриклеточного NAT клетки-хозяева обычно сначала разрушают механически. В случаеNAT, расположенного в периплазме, для выделения периплазматического содержимого в буферный раствор можно применять либо механический лизис, либо осмотическую обработку. Затем полипептид NAT выделяют из этого раствора. Далее можно различными методами проводить очистку от раствора. ЕслиNAT синтезирован так, что он содержит метку, такую как гексагистидин или другой малый пептид, либо на карбоксильном, либо на аминоконце, он практически может быть очищен с помощью одностадийного процесса пропусканием раствора через афинную колонку, если матрица колонки имеет высокое сродство к метке или к полипептиду непосредственно (то есть моноклональное тело). Например, полигистидин связывается с высоким сродством и специфичностью с никелем, следовательно, для очистки можно использовать афинную колонку из никеля (такую как никелевые колонки Qiagen) (см., например, Ausubel etal., editors, Current Protocols in Molecular Biology, см. выше). Если, с другой стороны, полипептид не содержит сетки и не доступны никакие антитела, можно использовать для очистки другие хорошо известные методы. Такие методы включают, без ограничения,ионообменную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, обращнно-фазовую хроматографию, ВЭЖХ, электрофорез в естественном геле в сочетании с гель-элюцией и препаративное изоэлектрофокусирование (Isoprime прибор/метод, Hoefer Scientific). В некоторых случаях для достижения повышенной степени чистоты можно комбинировать два или более этих метода. Особенно предпочтительными для получения NAT являются дрожжевые клетки и наиболее желательны клетки рода дрожжей, известные как Pichia (например, Pichia pastoris), вследствие большей эффективности повторного скручивания по сравнению, например, с бактериальными клетками, такими как Е. coli. Соответствующие рекомбинантные методы экспрессии для этих дрожжевых штаммов описаны в патентах США 4855231 (Stroman et al.), 4812405 (Lair et al.), 4818700 (Cregg et al.), 4885242 (Cregg) и 4837148 (Cregg). Замечательно, что клетки Pichia можно также применять для экспрессии фибролазы с аналогичной эффективностью при участии ДНК, кодирующей эту металлопротеиназу, и такой метод составляет ещ один аспект данного изобретения. Фибролаза представляет собой известную металлопротеиназу, которая описана в научной и патентной литературе, см. Randolph et al., и Европейскую патентную заявку 0323722, приведнные выше. Как правило, экспрессируемая фибролаза имеет последовательность SEQID NO:5, которая кодируется кДНК с последовательностью SEQ ID NO: 6 (или е вариантами, кодирующими ту же самую аминокислотную последовательность). Экспрессия фибролазы в такой системе обычно включает ДНК с последовательностью SEQ ID NO:7, которая кодирует препро последовательность(нуклеотиды 1-783) в дополнение к зрелому полипептиду (нуклеотиды 784-1392). Химически модифицированные версии NAT, в которых полипептид связан с полимером или другим веществом, образуя производное, с целью модификации свойств, также входят в объм данного изобретения. Для целей терапии человека в особенности может быть предпочтительной дериватизация NAT присоединением одного или более других химических фрагментов к полипептидному фрагменту. Такие химические фрагменты можно выбирать из различных водорастворимых полимеров. Полимер должен быть водорастворимым, так что полипептид NAT, к которому он присоединяется, смешивается с водной средой, такой как физиологическая среда. Водорастворимый полимер можно выбирать из группы, состоящей, например, из полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы, декстрана, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, поли-1,3-диоксолана, поли-1,3,6-триоксана, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, полиаминокислот (либо гомополи-4 006487 меров, либо статистических, либо нестатистических сополимеров (см. подробнее ниже, при рассмотрении слитых молекул) и декстрана или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоля, гомополимеров пропиленгликоля, сополимеров полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированных полиолов, полистиролмалеата и поливинилового спирта. Полиэтиленгликольпропиоальдегид может быть предпочтительным в процессе производства благодаря своей стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвлнным или неразветвлнным. В случае полиэтиленгликоля для простоты обращения и производства предпочтительна молекулярная масса около 2-100 килодальтон (кДа) (термин около, приблизительно указывает, что при получении полиэтиленгликоля некоторые молекулы могут иметь большую или меньшую молекулярную массу, чем указано). Можно использовать полимер другого размера в зависимости от терапевтического профиля (например, желательная пролонгированность действия; влияние, если таковое есть, на биологическую активность; лгкость обработки (обращения); степень или отсутствие антигенности и другое известное действие полиэтиленгликоля на терапевтический белок). Число полимерных молекул, присоединнных таким образом, может меняться, и специалист в данной области техники может выяснить влияние на функцию. Можно монодериватизировать или получить ди-, три-, тетра- или какую-либо комбинацию дериватизации с тем же самым или другими химическими фрагментами (например, с полимерами, такими как полиэтиленгликоль различной молекулярной массы). Соотношение молекул полимера и молекул полипептида NAT изменяется с изменением их концентраций в реакционной смеси. В большинстве случаев оптимальное соотношение (или, если говорить об эффективности реакции, когда нет избытка непрореагировавшего полипептида или полимера) определяется такими факторами, как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярная масса выбранного полимера, является ли полимер разветвлнным или неразветвлнным и условия реакции. Химические фрагменты присоединяются к NAT с учтом влияния функциональных или антигенных доменов полипептида. Существует ряд способов присоединения, известных (доступных) специалистам в данной области техники. См., например, ЕР 0401384 (присоединение PEG (ПЭГ) к G-CSF) и Malik et al.,Experimental Hematology, том 20, стр. 1028-1035 (1992) (сообщает о пэгировании GM-CSF при участии трезилхлорида). В качестве примера (иллюстрации) полиэтиленгликоль может ковалентно связываться с аминокислотными остатками с помощью реакционно-способной группы, такой как свободная аминоили карбоксильная группа. Реакционно-способными группами являются такие, с которыми может связываться активированная молекула полиэтиленгликоля (или другой химический фрагмент). Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и N-концевой аминокислотный остаток. Аминокислотные остатки, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой аминокислотный остаток. Сульфгидрильные группы также можно использовать в качестве реакционно-способной группы для присоединения молекул(ы) полиэтиленгликоля (или другого химического фрагмента). Для целей производства предпочтительно присоединять по аминогруппе, такой как аминогруппа при N-конце или в лизиновом остатке. Присоединения к остаткам, важным для рецепторного связывания, следует избегать, если желательно рецепторное связывание. Могут требоваться конкретно производные, химически модифицированные по N-концу. Если брать в качестве примера полиэтиленгликоль, можно выбрать из ряда полиэтиленгликоля молекулы (по молекулярной массе, разветвлению и т.п.), молекулярное соотношение в реакционной смеси полиэтиленгликоля к полипептиду, тип осуществляемой реакции пэгирования и способ получения выбранного пэгированного по N-концу NAT. Способом получения пэгированного по N-концу препарата (то есть по возможности отделения этого фрагмента от других монопэгированных частиц) может быть очистка пэгированного по N-концу материала от совокупности пэгированных молекул NAT. Селективную N-концевую химическую модификацию можно провести с помощью восстановительного алкилирования, которое использует различную реакционную способность различных первичных аминогрупп (лизина и Nконцевой), пригодных для дериватизации. См. международную заявку WO 96/11953, опубликованную 25 апреля 1996 г. При соответствующих условиях реакции достигается практически селективная дериватизация NAT по N-концу в присутствии карбонилсодержащего полимера. Например, можно селективно пэгировать NAT по N-концу, проводя реакцию при рН, позволяющем воспользоваться разницей рКа -аминогруппы лизиновых остатков и рКа -аминогруппы N-концевого остатка полипептида. С помощью такой селективной дериватизации контролируется присоединение полимера к полипептиду: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу полипептида и не наблюдается заметной модификации других реакционно-способных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. Для использования в восстановительном алкилировании полимер может быть описанного типа и должен иметь одну альдегидную группу для присоединения к полипептиду. Может использоваться полиэтиленгликольпропиоальдегид, имеющий одну реакционно-способную альдегидную группу.NAT или химически модифицированные производные по данному изобретению можно приготовить в виде препаратов для применения in vivo и, наиболее предпочтительно, внутрь тромба (внутритром-5 006487 бозно, то есть путм местной доставки непосредственно к сгустку в кровеносном сосуде, например, с помощью катетера). Обычно системная доставка не является предпочтительной, ввиду вероятности того,что природный L2 макроглобулин в общем кровотоке может давать комплекс с NAT, предупреждая взаимодействие между фибрином или фибриногеном, таким образом препятствуя лизису (разрушению) сгустка. Однако могут существовать примеры, когда можно использовать большие количества NAT, которые превышают уровни L2 макроглобулина в кровотоке, что делает возможным системное введение и доставку. В целом данное изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества NAT вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Под эффективным количеством понимается количество, достаточное для достижения измеряемого (определяемого) биологического эффекта(то есть тромболитически эффективное количество, которое вызывает растворение тромба или тромбов,подвергаемого(-ых) лечению). Обычно NAT имеет высокую степень чистоты, и любая применяемая в качестве средства доставки фармацевтическая композиция обычно предварительно стерилизуется перед применением, например,фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны. Специалист в данной области техники способен определить эффективные дозы путм введения и наблюдения за требуемым терапевтическим эффектом. Конкретные эффективные дозы в этом интервале зависят от конкретного подвергаемого лечению нарушения или состояния, а также от возраста и общего состояния здоровья реципиента и может определяться стандартными клиническими методами. Если возможно, желательно построить кривую эффекта дозы фармацевтической композиции сначала in vitro, в виде биоаналитических систем, а затем на подходящих животных модельных системах, прежде, чем испытывать на людях. Опытные практики, принимая во внимание терапевтическую сторону, вид нарушения, подлежащего лечению, и другие соответствующие факторы, смогут определить нужную дозу без больших усилий. Обычно практикующий специалист вводит композицию NAT до достижения дозы, вызывающей нужное действие (то есть фибринолиз). Композицию можно вводить в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать или не содержать такое же количество полипептида), разделнных во времени или постоянно.NAT можно также использовать для получения антител обычными методами. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, рекомбинантными, химерными одноцепочечными и/или биспецифическими и т.д. С целью повышения вероятности получения иммунного ответа аминокислотную последовательность NAT можно анализировать и определить участки молекулы, которые могут ассоциироваться с иммуногенностью. Так, аминокислотную последовательность можно подвергнуть компьютерному анализу для определения поверхностных эпитопов, например, по методу Хоупа и Вудса: Hope andWoods, Proceedings of the National Academy of Science USA, том 78, стр. 3824-3828 (1981). Различные методы, известные из уровня техники, можно использовать для получения поликлональных антител, которые распознают эпитопы NAT. Для получения антитела различные животные-хозяева можно иммунизировать, делая инъекции полипептида, включая, без ограничения, кроликов, мышей,крыс и т.п. Различные адъюванты можно использовать для усиления иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяина, включая, без ограничения, адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия (alum), поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плурониевые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально применимые адъюванты человека, такие как Вacille Calmette-Guerin и Corynebacterium parvum. Для получения моноклональных антител, специфичных к NAT, можно использовать любые методы,которые позволяют получать антитела при участии клеточных штаммов в культуре. Например, метод гибридом, первоначально предложенный Колером и Мильштейном (Коhler аnd Milstein), описанный вNature, т. 256, стр. 495-497(1975), а также метод триом, метод человеческих В-клеточных гибридом, описанный Kozbor et al. в Immunology Today, т. 4, стр.72 (1983), и метод EBV-гибридом для получения моноклональных антител, описан Cole et al. в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.,стр. 77-96 (1985), все применимы для получения моноклональных антител по данному изобретению. Антитела по данному изобретению могут применяться терапевтически, так чтобы связаться с избыточным количеством NAT in vivo после введения и тем самым нейтрализовать или ингибировать после введения. Антитела могут дополнительно использоваться для целей диагностики, например, в меченой форме для обнаружения присутствия NAT в общей воде организма, образце ткани или другом экстракте в соответствии с известными диагностическими методами. Описание конкретных вариантов изобретения Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Происхождение (деривация) последовательности NAT. Эффективным способом получения фибролазы является первоначальная экспрессия в виде препрофибролазы, при расщеплении которой протеазой kех-2 в месте соединения препро и зрелой областей получается биологически активный материал (зрелая фибролаза). По такому дизайну синтез и процессинг препрофибролазы ведт к секреции фибролазы в культуральную среду. Действительная последова-6 006487 тельность в расщепляемом месте соединения (TKRQQRF). Кех-2 является эндопротеазой, которая расщепляет в месте после двух прилегающих основных аминокислот, в данном случае лизин (К) - аргинин (R). Зрелая фибролаза, экспрессируемая при участии ДНК, имеющей вышеприведнную последовательность, показывает, что ожидаемый N-концевой глутаминовый (Q) остаток в действительности претерпевает деамидирование и циклизацию, образуя пироглутаминовую кислоту (Е). Эта химическая модификация считается нежелательной, так как пептиды с Nконцевым циклическим глутаминовым (пироглутаминовая кислота) остатком не реагируют по методу расщепления по Эдману для секвенирования аминокислот. Соответственно, оба глутаминовых остатка(Q) нa N-конце последовательности зрелой фибролазы делетируют, что приводит к N-концевому остатку(R)-apгининa. Так как кех-2, как уже упоминалось, расщепляется после двух соседних основных аминокислот, ожидали, что последовательность (KRRF) представляет собой двусмысленный сайт расщепления под действием kех-2. Соответственно, N-концевой остаток аргинина (R) (подчркнут, см. выше) заменяется на остаток серина (S), давая последовательность (KRSF). Выбор серина обоснован необходимостью ввести аминокислоту, которая облегчает kех-2-расщепление, когда оно происходит на Сконцевой стороне сайта гидролиза. Rholam et al., European Yournal of Biochemistry, т. 227, стр. 707-714(1995). В результате последовательность ДНК, кодирующей препрофибролазу, модифицируют с помощью сайт-направленного мутагенеза нa N-концевом кодирующем участке для зрелой фибролазы с заменой кодонов для QQR на кодон для S, используя стандартную методику PCR, таким образом получают пpeпpoNAT, отвечающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. Олигонуклеотиды, применяемые для праймирования PCR-реакций, перечислены ниже и также показана их гомология с целевой последовательностью. Сначала проводят две PCR-реакции с применением олигонуклеотидов 1 и 4 в качестве одной пары праймеров и олигонуклеотидов 2 и 3 в качестве другой пары праймеров, обе с ДНК родительского гена в качестве матрицы. ДНК-продукты этих двух реакций протяжнностью 601 и 815 нуклеотидов очищают электрофорезом в агарозном геле и объединяют, чтобы они служили в качестве матрицы во втором цикле PRC с олигонуклеотидами 1 и 2 в качестве пары праймеров. Этот конечный продукт (протяжнностью 1372 нуклеотида) расщепляют с помощью рестиктаз XhoI и NotI. Гидролизат депротеинизируют с помощью фенола/хлороформа и ДНК осаждают. Часть регенерированной ДНК лигируют в плазмиду pPICZ (Invitrogen, Carlsbad, СA, Catalog No V 195-20), которую аналогично расщепляют рестриктазами XhoI и NotI, ферментативно дефосфорилируют и депротеинизируют с помощью фенола/хлороформа. Все последующие стадии проводят в соответствии с руководством к набору InvitrogenPichia Expression Kit (Invitrogen Corp., CatalogK1710-01). Продукты реакции лигирования трансформируют в E.coli электропорацией и отбирают по выживанию на зеоцинсодержащих тврдых средах. Плазмиду выделяют и область фибролазы подтверждают секвенированием ДНК. Плазмиду подвергают линеаризации, расщепляя рестиктазой PmeI, а затем трансформируют в Pichia pastoris GS115his+. ШтаммGS115 обычно his-, поэтому his+ генотип восстанавливают трансформацией при участии источника ДНК,несущего дикий вариант гена his4. Или же штамм his+ можно получить от Invitrogen Corp. (X-33 клеточная линия, CatalogС 180-00). Компоненты отбирают в виде устойчивых к зеоцину колоний. Возможные клоны индуцируют в метанолсодержащих средах и бульон анализируют на NAT-продукцию на 420% PAGE с помощью окрашивания Кумасси голубым. Следующие лигонуклеотиды применяются для сайт-направленного PCR-мутагенеза: Локализация этих нуклеотидов показана ниже в связи с двухнитевой последовательностью ДНК(SEQ ID NO:12 - кодирующая или смысловая нить SEQ ID NO:13 - комплиментарная или антисмысловая нить) и соответствующей аминокислотной последовательностью фибролазы (включая препро-участок),модифицированных с целью создания NAT. N-концевая и С-концевая области зрелой фибролазы указаны подчркиванием концевых аминокислотных последовательностей (QQRF и LNKP). N-концевая область (QQRF) представляет собой область, которая модифицирована (с замещнной S вместо QQR). В олигонуклеотидах 3 и 4, см. ниже, пунктирными линиями показана локализация не включнных (пропущенных) кодонов, кодирующих остатки QQ в N-концевой области фибролазы. Пример 2. Экспрессия NAT в Pichia pastoris. При попытках экспрессировать ДНК, кодирующую NAT, предпринятых в E.coli, очень слабое раскручивание и требование разбавленных условий понижают эффективность очистки. Эти и другие соображения привели к использованию в качестве клеток-хозяев Pichia pastoris, вида дрожжей. Культуру выбранных клонов Pichia pastoris, которые были трансформированы при участии кДНК препроNAT (SEQID NO:4), инокулируют в 500 мл следующей культуральной среды для инокуляции:- 10006487 На литр среды для одноразовой загрузки Дрожжевой экстракт 30,0 г Двухосновный фосфат калия 17,2 г Глюкоза 20,0 г Биотин 0,004 г Вода До 1 л Фосфорная кислота 85% Для доведения рН до 6,00 Трансфицированные клетки P. pastoris инкубируют при 30 С в шюттель-аппарате в течение 30-32 ч. Около 1% (в/о) полученной культуры используют для того, чтобы инокулировать в 10-литровый ферментр. Ферментр содержит стерилизованные основные соли и глюкозу (см. ниже). После стерилизации ферментра на литр загружаемой среды добавляют 12 мл на литр РТМ 4 солей (РТМ 4 представляет собой раствор со следами металлов, содержащий пентагидрат сульфата меди, иодид натрия, моногидрат сульфата марганца, дигидрат молибдата натрия, борную кислоту, гексагидрат хлорида кобальта, хлорид цинка, гептагидрат сульфата двухвалентного железа, d-биотин, серную кислоту и очищенную воду). Температура ферментационного роста составляет 30 С. Значение рН в ферментре - 600, регулируют с помощью гидроксида аммония и фосфорной кислоты. Цинк из добавляемых в среду цинковых солей, встраивается в NAT как часть металлопротеиназной структуры. Основные соли на литр загружаемой среды: Фосфорная кислота, 85% 26,7 мл Сульфат кальция 0,93 г Сульфат калия 18,2 г Сульфат магния - 7 Н 2 О 14,9 г Гидроксид калия 4,13 г Глюкоза 30,0 г Вода До 1 л Партия культур выращивается до тех пор, пока глюкоза не израсходуется полностью (17-20 ч). Затем начинается стадия периодической подпитки. Среды стадии периодической подпитки состоят из глюкозы и 12 мл солей РТМ 4 на литр. Индукционная подпитка состоит из глюкозы, 25% метанола и 12 мл РТМ 4 солей на литр. При индукции температуру реактора изменяют до 20 С. Фаза индукции длится 6075 ч. Кондиционированные среды собирают и клеточный дебрис отбрасывают. Пример 3. Очистка NAT от Pichia pastoris. Дрожжевой бульон (кондиционированные среды минус клеточный дебрис) из примера 2 осветляют и рН и проводимость доводят, соответственно, до 6,5 и 10-20 мS/см. Бульон наносят на иммобилизованную смолу со сродством к металлу, которая нагружена медью (Сu) и уравновешена физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS). Смолу промывают PBS и элюируют в градиенте имидазола (0100 мМ) в PBS. Фракции, содержащие зрелый NAT (SEQ ID NO:1), собирают и разводят до тех пор,пока проводимость станет менее 1,5 мS/см, рН 6,4. Разбавленный пул наносят на смолу SP Sepharose(0-500 мМ) в MES. Фракции, содержащие NAT, собирают и хранят. Пример 4. Тромболиз при остром тромбозе сонной артерии у крыс. Сравнение NAT с урокиназой. Для того, чтобы продемонстрировать, что зрелый NAT (SEQ ID NO: 1) является биологически активным и функционально уникальным, проведены фармакологические исследования на крысах, у которых очаговое поражение одной из сонных артерий вызывают, подводя анодный ток. Это поражение вызывает окклюзивный тромбоз, образующийся обычно в течение пятнадцати минут. Когда тромб образовался, артерию наблюдают в течение тридцати минут, чтобы убедиться, что окклюзия сонной артерии устойчива. Затем внутривенно вводят гепарин и аспирин для предупреждения дальнейшего развития тромбоза. Затем проводят лечение животных с помощью внутриартериального вливания испытуемого вещества. Ток крови через сонную артерию контролируют в ходе доставки испытуемого материала так,чтобы успешный фибринолиз можно было обнаружить в момент, когда его можно заметить. Отмечают процент экспериментов, в которых происходит разрушение сгустка, и групповые значения рассчитывают только для тех экспериментов, где лизис сгустка успешен. Для измерения геморрагического потенциала испытуемого вещества всю кровь, выделившуюся в месте хирургического вмешательства, собирают марлевыми тампонами. Тампоны помещают в раствор детергента для солюбилизации эритроцитов и выделения гемоглобина, который затем определяют количественно спектрофотометрически. Полученный гемоглобин используют для подсчта объма потерянной крови. Опытные данные приведены ниже в таблице.- 11006487 Таблица 1. Частота фибринолиза, время до фибринолиза и хирургическая потеря крови (среднеестанд. отклонение) Эти исследования показывают, что NAT биологически активен в отношении животных при фибринолизе. Кроме того, растворение тромба достигается в течение значительно более короткого времени и с меньшей потерей крови из хирургического участка по сравнению с урокиназой. Следовательно, профиль активности NAT может отличаться от профиля активности тромболитических агентов класса активаторов плазминогена (представленных урокиназой) тем, что фибринолиз под действием NAT происходит более быстро и с меньшими геморрагическими осложнениями. Фибринолитическая активность NAT сравнима с фибринолитической активностью фибролазы. Кроме того, как упоминалось выше, устойчивость N-конца NAT дат более гомогенный конечный продукт при рекомбинантной экспрессии, что имеет явное преимущество (то есть N-конец не изменяется во времени, приводя к смеси различных форм, и это делает полипептид более стабильным).-Arg в положениях 1-3 заменены на аминокислоту. 2. Фибролаза по п.1, отличающаяся тем, что аминокислота представляет собой серии. 3. Фибролаза по п.1 или 2, содержащая гетерологичный полипептид на N-конце или С-конце SEQID NO: 5. 4. Фибролаза по п.1 или 2, содержащая водорастворимый полимер. 5. Фибролаза по п.4, отличающаяся тем, что водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль. 6. Фибролаза по пп.1, 2 или 3, полученная рекомбинантной экспрессией в дрожжах. 7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фибролазу по пп.1, 2 или 3. 8. Вектор экспрессии, содержащий регуляторные элементы экспрессии, функционально связанные с молекулой нуклеиновой кислоты по п.7. 9. Клетка-хозяин, трансформированная или трансфецированная с использованием молекулы нуклеиновой кислоты по п.7 или 8. 10. Трансформированная или трансфецированная клетка-хозяин по п.9, которая представляет собой прокариотную или эукариотную клетку.- 28006487 11. Трансформированная или трансфецированная эукариотная клетка по п.10, которая представляет собой клетку дрожжей. 12. Трансформированная или трансфецированная клетка дрожжей по п.11, которая представляет собой Pichia pastoris. 13. Способ получения модифицированной фибролазы по п.1 или 2, содержащий стадии культивирования клеток-хозяев, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты по п.7, функционально связанную с регуляторными элементами, для стимулирования е экспрессии, в условиях, в которых экспрессируется нуклеиновая кислота, и выделение модифицированной фибролазы из культуры клеток-хозяев. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что клетки-хозяева представляют собой клетки дрожжей. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки дрожжей представляют собой Pichia pastoris. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая фибролазу по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый разбавитель, консервант, солюбилизатор, эмульгатор, адъювант или носитель. 17. Способ осуществления лизиса тромба, заключающийся в контактировании тромба с композицией, содержащей фибринолитически активную фибролазу по любому из пп.1-6, при котором композиция разрушает тромб. 18. Способ лечения тромбоза у млекопитающего, заключающийся во введении композиции, содержащей фибринолитически активную фибролазу по любому из пп.1-3 и 6, которая разрушает тромб. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что композицию вводят местно в тромб в кровеносном сосуде. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что композицию вводят с помощью катетера.