Применение ингибиторов il-18

005583 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лечебному применению ингибиторов IL-18 при некоторых паталогических состояниях. Конкретнее, изобретение относится к лечению и/или предупреждению артрита, к лечению и/или предупреждению болезней печени и к лечению и/или предупреждению воспалительных заболеваний кишечника (IBD). Предпосылки создания изобретения В 1989 г. описана эндотоксининдуцированная сывороточная активность, индуцирующая интерферон- (IFN-), полученный из клеток селезенки мыши (Micallef et al., 1996). Такая сывороточная активность действует не как прямой индуктор IFN-, а как костимулятор вместе с IL-2 или митогенами. При попытке выделить активность в чистом виде из постэндотоксинной мышиной сыворотки обнаружили явно гомогенный белок в 50-55 кДа. Так как другие цитокины могут действовать как костимуляторы для продуцирования IFN-, неэффективность нейтрализующих антител к IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 или TNF для нейтрализации сывороточной активности позволила предположить, что она является особым фактором. В 1995 г. те же ученые показали, что эндоксининдуцированный костимулятор для продуцирования IFN присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно кондиционированных P. acnes (Novick et al.,1992 г.). На данной модели растет популяция печеночных макрофагов (клетки Купфера), и у таких мышей низкая доза бактериального липополисахарида (LPS), нелетальная для мышей, предварительно некондиционированных, становится летальной. Фактор, названный IFNиндуцирующим фактором (IGIF),а позднее названный интерлейкином-18 (IL-18), выделен в чистом виде из 1200 г печени мышей, обработанных P. acnes. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей очищенного IL-18, использовали для клонирования кДНК мышиного IL-18 (Novick et al., 1992 г.). IL-18 представляет собой белок в 18-19 кДа из 157 аминокислот, не обладающий явным подобием с какимлибо пептидом в базе данных. Матричные РНК IL-18 и интерлейкина-12 (IL-12) хорошо обнаруживаются в клетках Купфера и активированных макрофагах. Рекомбинантный IL-18 индуцирует IFN-гамма сильнее, чем IL-12, очевидно, через отдельный каскад (Novick et al., 1992 г.). Подобно эндотоксининдуцированной сывороточной активности IL-18 сам не индуцирует IFN-, а действует в первую очередь как костимулятор с митогенами или IL-2. IL-18 усиливает клеточную пролиферацию, очевидно, через IL-2 зависимый каскад, и усиливает продуцирование цитокинов Th1 in vitro, и обнаруживает синергизм при сочетании с IL-2 в смысле усиленного продуцирования IFN- (Malizewski et al., 1990 г.). Показано, что нейтрализующие антитела к мышиному IL-18 предотвращают летальность низкой дозы LPS для мышей, предварительно кондиционированных P. acnes. Имеются другие сообщения о важности IFN- как медиатора летальности LPS у предварительно кондиционированных мышей. Например,нейтрализующие aнти-IFNaнтитeлa защищают мышей от шока, подобного шоку Шварцмана (Fantuzziet al., 1998 г.), и обработанные галактозамином мыши с недостатком в IFNрецепторах были устойчивы к вызываемой LPS гибели (Вут, 1990). Поэтому не стало неожиданностью, что нейтрализующие антитела к мышиному IL-18 защищают мышей, предварительно кондиционированных P. acnes, от летального LPS(Novick et al., 1992 г.). Обработка антимышиным IL-18 также защищала выживших мышей от тяжелой печеночной цитотоксичности. После того как была клонирована мышиная форма, в 1996 г. появилось сообщение о последовательности кДНК для IL-18 человека (Okamura et al., 1995 г.). Рекомбинантный IL-18 человека обнаруживает природную IL-18-активность (Okamura et al., 1995 г.). Рекомбинантный IL-18 человека не проявляет прямой IFNиндуцирующей активности в отношении Т-клеток человека, но действует как костимулятор продуцирования IFN- и других цитокинов Т-хелперных клеток-1 (Th1) (Okamura et al., 1995 г.). На сегодняшний день IL-18 рассматривают в первую очередь как костимулятор продуцирования цитокиновTh1 (IFN-, IL-2 и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов) (Izaki, 1978 г.), а также как костимулятор FAS-лиганд-опосредованной цитотоксичности мышиных клонов клеток природных киллеров (Novick et al., 1989). Путем клонирования IL-18 из пораженных тканей и исследования экспрессии гена IL-18 обнаружена тесная связь этого цитокина с аутоиммунной болезнью. У мыши с диабетом, не связанным с ожирением (NOD), спонтанно развивается аутоиммунный инсулит и диабет, которые можно ускорить и синхронизировать одной инъекцией циклофосфамида. На ранних стадиях инсулита в поджелудочной железеNOD-мыши методом ПЦР с обратной транкрипцией показано наличие мРНК IL-18. Уровни мРНК IL-18 быстро повышаются после обработки циклофосфамидом и предшествуют возрастанию уровня мРНКIFN- и затем развитию диабета. Представляет интерес то, что такая кинетика напоминает кинетику мРНК IL-12-p40, причем получают тесную корреляцию уровней отдельных мРНК. Клонирование кДНКIL-18 из РНК поджелудочной железы с последующим секвенированием показывает идентичность с последовательностью IL-18, клонированной из клеток Купфера и предварительно активированных in vivo макрофагов. Также макрофаги NOD-мыши отвечали на циклофосфамид экспрессией гена IL-18, в то время как макрофаги параллельно обработанных мышей Balb/c не реагировали. Следовательно, экспрессия IL-18 у аутоиммунной NOD-мыши регулируется аномально и тесно связана с развитием диабетаIL-18 играет возможную роль в иммунорегуляции или в воспалении путем увеличения функциональной активности Fas-лиганда на клетках Thl (Conti et al., 1997 г.). IL-18 также экспрессируется в корковом веществе надпочечника и, следовательно, может представлять собой секретируемый нейромодулятор, играя важную роль в организации иммунной системы после сильного стресса (Chater, 1986 г.).In vivo IL-18 образуется путем расщепления про-IL-18, и оказывается, что его эндогенная активность отвечает за продуцирование IFN- при летальности, опосредованной P. acnes и LPS. Зрелый IL-18 продуцируется из своего предшественника с помощью IL-1-конвертирующего фермента (IL-1 бетаконвертирующий фермент, ICE, каспаза-1). Рецептор IL-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, совместно действующих при связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания IL-18 обнаружены в Т-клетках, стимулированных мышиным IL-12 (Yoshimoto et al., 1998 г.), что наводит на мысль о многоцепном рецепторном комплексе. Пока идентифицированы две рецепторные субъединицы, причем обе принадлежат семейству рецепторов IL-1 (Parnet et al., 1996 г.). Сигнальная трансдукция IL-18 участвует в активации NF-В (DiDonato et al., 1997 г.). Некоторые известные цитокинсвязывающие белки являются растворимыми цитокиновыми рецепторами и соответствуют внеклеточным лигандсвязывающим доменам их соответствующих цитокиновых рецепторов клеточной поверхности. Они образуются или путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК,обычного для рецептора клеточной поверхности, или путем протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Такие растворимые рецепторы описаны, в том числе, среди прочих, растворимые рецепторы IL-6 и IFN- (Nakamura et al. , 1989 г.), TNF (Dao et al., 1996 г.; Englemann et al., 1989 г.),IL-1 и IL-4 (John, 1986 г.), IFN-/ (Mizushima and Nagata, 1990 г.) и другие. Оказывается, что один цитокинсвязывающий белок, названный остеопротегерином (OPG, также известный как фактор, ингибирующий остеокласты - OCIF), член семейства TNFR/Fas, является первым примером растворимого рецептора, который существует только в виде секретируемого белка (Anderson, 1997 г.; Bollon, 1980 г.). Недавно растворимый белок с высокой аффинностью к IL-18 выделен из человеческой мочи, и описаны кДНК человека и мыши (Novick et al., 1999 г.; WO 99/09063). Белок назван IL-18-связывающим белком (IL-18BP).IL-18BP является не внеклеточным доменом одного из известных рецепторов IL-18, а секретируемым естественно циркулирующим белком. Он принадлежит новому семейству секретируемых белков. Семейство также включает в себя некоторые кодируемые поксвирусами белки с высокой гомологией сIL-18BP (Novick et al., 1999 г.). IL-18BP конститутивно экспрессируется в селезенке, принадлежит суперсемейству иммуноглобулинов и имеет ограниченную гомологию с рецептором IL-1 типа II. Его ген локализуется на хромосоме человека 11q13, и экзон, кодирующий трансмембранный домен, в геномной последовательности 8,3 т.п.н. не обнаружен (Novick et al., 1999 г.). Четыре изоформы IL-18BP человека и две изоформы мыши, являющиеся результатом сплайсинга мРНК, обнаружены в различных библиотеках кДНК и экспрессированы, очищены и испытаны на связывание и нейтрализацию биологической активности IL-18 (Kimet al., 2000 г.). Изоформа IL-18BP человека(IL-18BPa) обнаружила самую высокую аффинность к IL-18 с быстрым "включением" (rapid on-rate) и медленным "выключением" (slow off-rate) и константой диссоциации (K(d 399 пМ. IL-18BPC разделяет общий Ig-домен с IL-18BPa, за исключением 29 С-концевых аминокислот; K(d) IL-18 ВРс в 10 раз меньше(2,94 нМ). Тем не менее, IL-18BPa и IL-18BPC нейтрализуют IL-18 95% при молярном избытке того и другого. Изоформы IL-18BPb и IL-18BPd утрачивают полный Ig-домен и утрачивают способность связывать или нейтрализовывать IL-18. Мышиные изоформы IL-18BPC и IL-18BPd, обладающие идентичностью с Ig-доменом, также нейтрализуют 95% мышиного IL-18 при молярном избытке того и другого. Однако мышиный IL-18BPd, разделяющий общий обычный С-концевой мотив с IL-18BPa человека, также нейтрализует IL-18 человека. С помощью молекулярного моделирования идентифицирован большой избыток электростатического и гидрофобного связывающего сайта в Ig-домене IL-18BP, который может отвечать за его высокоаффинное связывание с лигандом (Kim et al., 2000 г.). Недавно сделано предположение, что интерлейкин IL-18 участвует в развитии патогенности при хронических воспалительных заболеваниях, в том числе эндотоксинного шока, гепатита и аутоиммунного диабета (Kahiwamura and Okamura, 1998 г.). Другое указание на положительную роль IL-18 в развитии повреждения печени следует из экспериментов, результаты которых опубликованы Tsui et al. (Tsui et al.,1999), где на мышиной модели показан повышенный уровень IL-18 при вызванном липополисахаридом остром повреждении печени. Однако механизм действия многофункционального фактора IL-18 при развитии повреждения печени пока не выяснен. Повреждение печени может иметь разные причины. Это может происходить, например, из-за вирусных или бактериальных инфекций, злоупотребления алкоголем, иммунных расстройств или рака. Вирусные гепатиты, вызванные, например, вирусом гепатита В или вирусом гепатита С, являются плохо управляемыми болезнями, поражающими большое число людей во всем мире. Число известных вирусов гепатита постоянно растет. Кроме вирусов гепатита В и С пока обнаружены по меньшей мере-2 005583 четыре других вируса, вызывающих связанный с вирусом гепатит, названные вирусами гепатита A, D, Е и G. Алкогольная болезнь печени является другим широкораспространенным заболеванием, связанным с хроническим употреблением алкоголя. Иммунный гепатит является редким аутоиммунным заболеванием, которое плохо лечится. Повреждение печени также включает в себя повреждения желчных протоков. Первичный билиарный цирроз (ПБЦ) является аутоиммунным заболеванием печени, характеризующимся разрушением внутрипеченочных желчных протоков. В некоторых исследованиях показано, что повреждение печени при болезнях, таких как алкогольный гепатит, цирроз печени, вирусный гепатит и первичный билиарный цирроз, связано с реакциями Тхелперных клеток-1 (Th1). В одной из работ создана новая модель поврежденя печени у мышей путем направленной доставки в печень овальбуминсодержащих липосом с последующим адаптивным переносом овальбуминспецифических клеток Тh1. Комбинированная обработка мышей овальбуминсодержащими липосомами и переносчиком клеток Тh1 вызывала повышение сывороточной трансаминазной активности параллельно с повышением уровней IFN- в сыворотке. Как резкий контраст, перенос овальбуминспецифических клеток Тh2 приводил к повышению уровней IL-4 в сыворотке, но не вызывал повреждения печени. Повреждение печени блокировалось антителами против IFN- и антителами против фактора некроза опухоли TNF-. Такие результаты показывают, что клетки Тh1 являются главными эффекторными клетками при остром повреждении печени (Nishimura and Ohta, 1999 г.). В ряде других работ показано, что у мышей со сверхэкспрессией обнаруживается спонтанный гепатит без какого-либо патогена или какого-либо другого стимулятора (Okamoto et al., 1998 г.). Другое исследование связано с реакциями Тh1 при первичном билиарном циррозе (ПБЦ). ПБЦ является аутоиммунной болезнью печени, характеризующейся разрушением внутрипеченочных желчных протоков. Как правило, полагают, что к такому повреждению желчных протоков приводят клеточные иммунные механизмы, в частности, с участием Т-клеток. В последнее время сделано предположение, что относительная сила реакций Тh1 и Тh2 является важным фактором в патофизиологии различных аутоиммунных болезней. В данном исследовании баланс подмножеств при ПБЦ оценивали путем обнаружения цитокинов, специфичных для двух подмножеств Т-клеток, т.е., IFN- для клеток Тh1 и IL-4 для клеток Th2. Клетки, положительные в отношении IFNматричной РНК (мРНК) и IL-4-мРНК, подсчитывали в отделах печени 18 пациентов с ПБЦ и 35 контрольных больных, имевших хронический активный гепатит С, внепеченочную билиарную обструкцию и здоровую печень, с использованием неизотопной гибридизации in situ и иммуногистохимии. Мононуклеарные клетки, экспрессирующие мРНК IFN- и IL4, при ПБЦ собирались в воспаленных входных путях в печени, но редко присутствовали в отделах печени при внепеченочной билиарной обструкции, алкогольном фиброзе или при здоровой печени. Клетки,положительные в отношении мРНК IFN- и IL-4, при ПБЦ печени обнаруживались в значительно большем числе, чем в печени в контроле (Р 0,01). Кроме того, при ПБЦ печени экспрессия мРНК IFN- обнаруживалась чаще, чем экспрессия IL-4, и уровни экспрессии мРНК IFN- больше коррелируют со степенью воспалительной активности на входах. Клетки, положительные в отношении мРНК IFN-, обнаруживались, главным образом, вблизи поврежденных желчных протоков, которые окружались лимфоидными агрегатами. Результаты показывают, что клетки Тh1 являются более заметной субпопуляцией Тклеток в лимфоидных инфильтратах при ПБЦ (Harada et al., 1997 г.). Картина цитокинов при узнавании вирусных антигенов также, как полагают, оказывает глубокое влияние на растворение вирусных инфекций и вирусный клиренс. В одной из работ исследовалось, играет ли какую-либо роль цитокиновый дисбаланс, ориентированный на реакцию клеток типа Th2, при хроническом гепатите В. Профили цитокинов мононуклераных клеток периферической крови, связанных с хроническим гепатитом В, анализировали методом ОТ-ПЦР. После стимуляции поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) обнаруживали экспрессию IFN-, IL-2, IL-4 и IL-10 у 41, 8, 41 и 50% пациентов,соответственно. Среди указанных цитокинов экспрессию цитокина Тh1 IFN- связывали с высокими уровнями в сыворотке AST/ALT (аспартатаминотрансферазы/аланинаминотрансферазы), представляющих собой типичные маркеры повреждения печени. Не показано, что цитокины типа Th2 оказывают защитное действие на гепатоциты. Как вывод, продуцирование цитокина Тh1 IFN-, HBsAg-реактивными клетками связано с повреждением гепатоцитов при хроническом гепатите В (Lee et al., 1999 г.). Есть сообщение о высоких уровнях FAS-лиганда и его рецептора (CD95) в печени пациентов с гепатитом В (Luoet al., 1997 г.). Считается, что FAS-лиганд является одним из главных цитотоксических факторов, приводящих к апоптозу гепатоцитов. В другой работе идентифицированы факторы, связанные с развитием повреждения печени у 30 не подвергавшихся лечению пациентов с хроническим гепатитом, положительных в отношении вируса гепатита С/РНК (HCV/RNA). Некровоспалительные и архитектурные повреждения оценивали с использованием шкалы Ishak. Активированные звездчатые клетки печени (HSC) визуализировали методом иммуногистохимии для -актина гладких мышц (SMA) и определяли количественно методом морфометрии.HCV/RNA в плазме оценивали с использованием метода ОТ-ПЦР. Для того чтобы исследовать тип иммунного ответа, участвующего в развитии повреждения печени, IFNположительные клетки (как выра-3 005583 жение Th1-подобной реакции) оценивали методом иммуногистохимии и определяли количественно методом морфометрии. Обнаружено, что больше всего HSC определяли вблизи областей долькового некровоспаления или фиброзных перегородок выстилки. Паренхима, SMA- и сириус красныйположительная, существенно коррелирует с оценками некровоспаления и архитектуры. IFN-положительные клетки обнаружены вокруг входных областей, связанных с воспалительными инфильтратами, что хорошо коррелирует с архитектурными повреждениями. Поэтому сделан вывод, что активация HSC и развитие повреждения печени связаны с Th1-подобной реакцией (Baroni et al., 1999 г.). Подобным образом, в случае гепатита В в печени и сыворотке пациентов с гепатитом С обнаружены FASлиганд и его рецептор (Hiramatsu et al., 1994 г.; Okazaki et al., 1996 г.; Lio et al., 1998 г.). Обнаружено, что цитокины Th1 и другие маркеры Th1 связаны с алкогольным гепатитом и циррозом печени. Воспалительные стимулы и перекисное окисление липидов активируют нуклеарный фактор В (NF-В) и активируют провоспалительные цитокины и хемокины. В одной из работ оценивали соотношение между патологическим повреждением печени, эндотоксикозом, перекисным окислением липидов и активацией NF-В и дисбалансом между про- и противовоспалительными цитокинами. Крысам (5 особей в группе) путем внутрижелудочной инфузии давали этанол и корм, содержащий насыщенный жир, пальмовое масло, кукурузное масло или рыбий жир. Контрольным крысам этанол заменяли изокалорийным количеством декстрозы. Осуществляли анализ патологии и определяли уровни эндотоксина,перекисного окисления липидов, NF-В и матричной РНК (мРНК) провоспалительных цитокинов(TNF, IL-1-бета, IFN и IL-12), С-С-хемокинов (регулируемые при активации экспрессируемые и секретируемые нормальными Т-клетками [RANTES], хемотаксический белок моноцитов [МСР]-1, макрофагальный воспалительный белок [МIР]-1 а), С-Х-С-хемокинов (цитокининдуцированный нейтрофильный хемоаттрактант [CINC], MIP-2, IP-10 и эпителиальный нейтрофилактивирующий белок [ENA]-78) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-4 и IL-13). У крыс, обнаруживающих некровоспалительное повреждение (рыбий жир и этанол и кукурузное масло и этанол), видна активация NF-В и повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов С-С и хемокинов С-Х-С. В указанных группах также были самые высокие уровни эндотоксина и перекисного окисления липидов. Уровни мРНК IL-10 и IL-4 были ниже в группе, обнаруживающей воспалительное повреждение печени. Таким образом, активация NF-В происходит в присутствии провоспалительных стимулов и приводит к повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов Тh1 и хемокинов (Naji et al., 1999 г.). При алкогольных болезнях печени также повышались количества FAS-лиганда и его рецептора, что еще раз наводит на мысль о том, что цитокины Тh1 вовлекаются в аутоиммунные процессы, индуцированные при алкогольном гепатите (Galle et al.,1995 г.; Taieb et al., 1998 г.; Fiore et al., 1999 г.).TNF также выявляется как обычный путь метаболизма при патогенезе некровоспаления печени,связанного с алкголем. Повышенные уровни TNF в печени и сыворотке подтверждены на животных моделях алкогольной болезни печени и при алкогольной болезни печени у людей. Постулировано, что такой разрегулированный метаболизм TNF играет роль при многих метаболических осложнениях и повреждении печении при алкогольной болезни печени (Grove et al., 1997; McClan and Cohen, 1989). Например, при исследовании обнаружено, что у пациентов с алкогольным гепатитом более высокие уровниTNF (в среднем 26,3 нг/л; 95% Сl - 21,7-30,9), чем у здоровых людей (6,4 нг/л; Сl - 5,4-7,4). У больных,умерших впоследствии, уровень TNF более высокий (34,7 нг/л; Сl - 27,8-41,6), чем у оставшихся в живых (16,6 нг/л; Сl - 14,0-19,2). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни TNF- положительно коррелируют с билирубином сыворотки (r = 0,74; Р = 0,0009) и креатинином сыворотки (r = 0,81; Р = 0,0003). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни TNF- выше, чем у пациентов с неактивным алкогольным циррозом (11,1 нг/л; Сl - 8,9-13,3) и тяжелых алкоголиков без болезни печени (6,4 нг/л; С 1 - 5,0-7,8). У пациентов с аномальной функцией почек уровни TNF- ниже (14,1 нг/л; Сl - 5,4-22,8), чем у пациентов с алкогольным гепатитом. Поэтому сделан вывод, что повышение уровня TNF- при алкогольном гепатите наиболее заметно в тяжелых случаях, что наводит на мысль о том, что TNF- играет некую роль при патогенезе (Bird et al., 1990 г.).TNF опосредует многие биологические действия эндотоксина. Недавно проведенные исследования показали, что введение TNF может вызвать повреждение печени и что TNF может опосредовать летальность гепатотоксина галактозамина. Одним из наиболее сильных индукторов TNF является эндотоксин. Поскольку у пациентов с алкогольной болезнью печени часто имеется эндотоксемия и поскольку многие клинические проявления алкогольного гепатита являются известными биологическими эффектами TNF,оценивали его активность у пациентов с алкогольным гепатитом. Базальное и стимулированное липополисахаридами высвобождение TNF из моноцитов периферической крови - главного источника продуцирования TNF - определяли у 16 пациентов с алкогольным гепатитом и 16 здоровых добровольцев. У восьми из 16 пациентов с алкогольным гепатитом и только у двоих из 16 здоровых добровольцев имелась обнаруживаемая спонтанная TNF-активность (р менее 0,05). После стимуляции липополисахаридами средний уровень высвобождения TNF из моноцитов у пациентов с алкогольным гепатитом существенно, более чем в два раза, превышал уровень высвобождения TNF у здоровых людей (25,33,7 против 10,92,4 единиц на мл, р менее 0,005). Поэтому сделан вывод, что моноциты пациентов с алкогольным-4 005583 гепатитом имеют существенно повышенное спонтанное и стимулированное липополисахаридами высвобождение TNF по сравнению со здоровыми добровольцами (McClain and Cohen, 1989 г.). Липополисахарид (LPS)-связывающий белок (LBP) и CD14 играют ключевые посреднические роли в активации клеток эндотоксином. Постулировано, что LPS, образовавшийся в кишечнике, принимает участие в промотировании патологического повреждения печени при алкогольной болезни печени. Показано, что у крыс, которым давали внутрижелудочно этанол в масле в течение 4 недель, повышались уровни CD14 и LBP в Купферовских клетках и гепатоцитах, соответственно. Экспрессия мРНК CD14 также может повыситься в немиелоидных клетках. Усиленная экспрессия LBP и CD14 способствует быстрому повышению LPS-индуцированной экспрессии различных провоспалительных цитокинов и коррелирует с наличием патологического повреждения печени при алкогольном повреждении печени (Su et al.,1998; Lukkari et al., 1999 г.). Артрит является заболеванием, заключающимся в воспалении суставов. Суставы опухают, теряют подвижность, становятся болезненными, краснеют или горят. Симптомы могут сопровождаться потерей веса, лихорадкой или слабостью. Когда указанные симптомы продолжаются более двух недель, это может означать воспалительный артрит, например ревматоидный артрит. Самым обычным типом артрита является дегенеративная болезнь суставов (остеоартрит). Лекарственные средства, обычно назначаемые в случае артрита, относятся к нестероидным противовоспалительным средствам (NSAID). К NSAID относятся аспирин и подобные аспирину лекарственные средства. Они уменьшают воспаление, являющееся причиной боли в суставах, неподвижности и опухания суставов. Однако NSAID являются неспецифическими лекарственными средствами с рядом побочных действий, включая желудочное кровотечение (Homepage of the Departament of Orthopaedics ofNSAID, для ослабления признаков и симптомов остеоартрита и ревматоидного артрита у взрослых применяют целебрекс - ингибитор циклооксигеназы (СОХ-2). Он также показан для лечения больных с семейным аденомным полипозом. В WO 01/00229 описывается комбинация антагонистов фактора некроза опухолей (TNF) и ингибиторов СОХ-2 для лечения воспаления. Антагонисты TNF также применяются для лечения артрита. Антагонисты TNF описываются, например, в WO 9103553. Недавние исследования показали, что интерлейкин IL-18 играет роль провоспалительного фактора при метаболизме в суставах. Olee et al. (1999) показали, что IL-18 продуцируется суставными хондроцитами и индуцирует провоспаление и катаболические реакции. В хонодроцитах мРНК IL-18 индуцируетсяIl-1. Хондроциты продуцируют предшественник IL-18 и в ответ на стимуляцию IL-1 секретируют зрелую форму IL-18. Исследование действия IL-1 на хондроциты также показало, что он ингибирует TGF-индуцируемую пролиферацию и усиливает продуцирование окиси азота. IL-18 стимулирует экспрессию некоторых генов в суставных хондроцитах здоровых людей, включая индуцируемую синтазу окиси азота, индуцируемую циклооксигеназу, IL-6 и стромелизин. Экспрессия гена связана с синтезом соответствующих белков. Обработка суставного хряща здорового человека IL-18 повышала высвобождение гликозаминогликанов. Указанные результаты идентифицируют IL-18 как цитокин, регулирующий реакции хондроцитов и вносящий вклад в деградацию хрящей. Локализация интерлейкин-1-конвертирующего фермента (ICE)/ каспазы-1 в остеоартритных тканях человека и его роль в созревании интерлейкина-1-бета и интерлейкина-18 показаны Saha et al. (1999 г.). Saha et al. исследовали экспрессию и продуцирование каспазы-1 в хряще и синовии здорового человека и в случае остеоартрита (ОА) количественно определяли уровень ICE в ОА-хондроцитах и проверяли соотношение между топографическим распределением ICE, интерлейкина-1 (IL-1) и IL-18, а также апоптоз хондроцитов. Эксперименты, проведенные при данном исследовании, показали, что ICE экспрессировался и синтезировался как в синовиальной мембране, так и в хряще человека, причем значительно большее число клеток окрашивалоь в ОА-положительной ткани, чем в здоровой ткани. Продуцирование ICE локализовано преимущественно во внешних и верхних промежуточных слоях суставного хряща. Продуцирование зрелого IL-1-бета в ОА-хрящевых эксплантатах и хондроцитах полностью блокировалось путем обработки специфическим ингибитором ICE, который также заметно уменьшает числоIL-18-положительных клеток. Соотношение между активным IL-1-бета и ICE наводит на мысль, что ICE может промотировать развитие ОА путем активации данного провоспалительного цитокина и что IL-18 может играть некую роль в патологии хряща.Gracie et al. (1999 г.) предположили для IL-18 роль провоспалительного фактора при ревматоидном артрите. Gracie et al. обнаружили мРНК IL-18 и белок в синовиальных тканях при ревматоидном артрите в существенно большем количестве, чем при остеоартрите (контроль). Также показано, что сочетание IL12 или IL-15 с IL-18 вызывает продукцию IFN- синовиальными тканями in vitro. Кроме того, введениеIL-18 мышам, иммунизированным коллагеном/неполным адъювантом Фрейнда, облегчает развитие эрозивного воспалительного артрита, что наводит на мысль, что IL-18 может являться провоспалительным фактором in vivo. Однако на сегодняшний день показано, что, кроме химических соединений, только блокада TNF иIL-1 путем использования рецепторов или мононуклеарных антител ослабляет коллагениндуцированный артрит у мышей (CIA, является мышиной моделью ревматоидного артрита) (Williams et al., 1994 г.) и поэтому предлагается в качестве лечения ревматоидного артрита. Термин "хронические или идиопатические воспалительные заболевания кишечника" охватывает по меньшей мере два состояния: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит. Оба заболевания являются болезнями кишечного тракта, причем болезнь Крона обычно поражает тонкую кишку. Когда в патологический процесс вовлекается также и ободочная кишка, дифференциальная диагностика, отличающая это заболевание от неспецифического язвенного колита, может быть проблематичной. Хроническое воспаление и изъязвление при болезни Крона обычно начинается или с обструкции тонкой кишки, или с боли в брюшной полости, напоминающей острый аппендицит; другие описания могут относится к ее осложнениям. Ход болезни хронический, и могут быть обострения и ремиссии, несмотря на лечение. Начало, как правило, имеет место в ранней молодости, причем примерно половина всех случаев относится к возрасту 20-30 лет и 90% - к 10-40 годам. Поражается несколько больше мужчин, чем женщин. Микроскопия отражает массивные явления. Воспаление является прерывистым: оно очаговое или пятнообразное. Скопления лимфоцитов и клеток плазмы обнаруживаются, главным образом, в слизистой оболочке и слое ткани под слизистой оболочкой, но, как правило, поражаются все слои (трансмуральное воспаление). Классической микроскопической особенностью болезни Крона является наличие тучных клеток, окруженных скоплением лимфоцитов. Возникновение идиопатических воспалительных заболеваний кишечника имеет существенные географические различия. Указанные болезни чаще случаются в Северной Европе и Соединенных Штатах, чем в странах Южной Европы, Африки, Южной Америки и Азии, хотя повышение урбанизации и экономического процветания ведет к более частым случаям в областях Южной Европы и Японии (General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3rd edition 2000,JCE Underwood, Ed.). При болезни Крона клинически имеются две основные группы, причем первая включает пациентов,болезнь которых входит в длительную ремиссию в течение трех лет с начала заболевания, а вторая включает пациентов, болеющих более трех лет. Какая бы ни была этиология, имеется доказательство персистентности и несоответствия активации Т-клеток и макрофагов при болезни Крона с повышенным продуцированием провоспалительных цитокинов, в частности интерлейкинов (IL) 1, 2, 6 и 8, интерферона (IFN)- и фактора некроза опухоли (TNF). Болезнь Крона характеризуется длительным (хроническим) воспалением, сопровождающимся фиброзом. Процесс пролиферации фибробластов и осаждения коллагена может быть опосредован переносом фактора роста , обладающего некоторым противовоспалительным действием, а именно рекрутментом фибробластов, синтезом матрицы и дезактивацией клеток зоны воспаления, но также вероятно, что могут вовлекаться многие другие медиаторы. Неспецифический язвенный колит является неспецифическим воспалительным расстройством в толстой кишке, которое начинается в прямой кишке и немедленно распространяется в различной степени. В отличие от болезни Крона, неспецифический язвенный колит ограничивается толстой кишкой. Все больше становится свидетельств, указывающих на то, что неспецифический язвенный колит является следствием изменения аутоиммунной реактивности, но повреждение слизистой оболочки также может быть результатом несоответствующей Т-клеточной активации и косвенного повреждения, вызванного цитокинами, протеазами и метаболитами и реактивным кислородом макрофагов и нейтрофилов. Последний механизм повреждения эпителия ободочной кишки назван повреждением с "безвредным свидетелем". Доказательством поддержки аутоиммунитета является наличие аутореактивных Тлимфоцитов и аутоантител против эпителиальных клеток ободочной кишки и эндотелиальных клеток, и цитоплазматических аутоантител против нейтрофилов (ANCA). Однако неспецифический язвенный колит не должен рассматриваться как аутоиммунное заболевание, при котором повреждение слизистой оболочки является прямым следствием иммунной реакции на аутоантигены (General and Systematic Pathology, цит. выше). Что касается лечения болезни Крона, то большинство людей лечат сначала лекарственными средствами, содержащими мезаламин, вещество, способствующее борьбе с воспалением. Больные, которым он не помогает или которые его не переносят, могут получать другие мезаламинсодержащие лекарственные средства, как правило, известные как 5-ASA. К возможным побочным действиям препаратов мезаламина относятся тошнота, рвота, изжога, диарея и головная боль. Некоторые пациенты для борьбы с воспалением принимают кортикостероидные препараты. Такие лекарственные средства наиболее эффективны в случае активной болезни Крона, но они могут вызвать сильное побочное действие, включая повышенную восприимчивость к инфекции. Лекарственные средства, подавляющие иммунную систему, также применяют для лечения болезни Крона. Чаще всего выписывают 6-меркаптопурин и родственное лекарственное средство азатиоприн. Иммунодепрессивные средства действуют путем блокирования иммунной реакции, вносящей вклад в-6 005583 воспаление. Такие лекарственные средства могут вызвать побочное действие, подобное тошноте, рвоте и диарее, и могут снизить сопротивление человека инфекции. Когда пациентов лечат сочетанием кортикостероидных и иммунодепрессивных лекарственных средств, доза кортикостероидов, в конечном счете,может быть снижена. Некоторые исследователи полагают, что иммунодепрессивные лекарственные средства могут усилить эффективность кортикостероидов. Управление США по пищевым продуктам и лекарственным средствам одобрило лекарственное средство инфликсимаб для лечения умеренной и тяжелой форм болезни Крона, не реагирующей на стандартную терапию (мезаламины, кортикостероиды, иммунодепрессивные средства), и для лечения открытых дренирующих свищей. Инфликсимаб - первое лекарственное средство, одобренное специально для болезни Крона, представляет собой моноклональные антитела против фактора некроза опухоли (TNF). Анти-TNF удаляют TNF из кровотока до того, как он достигнет кишечника, посредством чего предупреждается воспаление. Антибиотики применяют для лечения чрезмерного развития микрофлоры в тонкой кишке, вызванного стенозом, свищами или проведенной ранее операцией. В случае такой обычной проблемы врач может назначить один или несколько из следующих антибиотиков: ампициллин, сульфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол. Диарея и судорожная боль в брюшной полости часто облегчаются, когда утихает воспаление, но также может потребоваться дополнительная лекарственная терапия. Можно использовать некоторые противодиарейные средства, включая дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациентов, обезвоженных изза диареи, обычно лечат жидкостями и электролитами. Остается потребность в эффективной терапии для лечения и/или предупреждения воспалительных заболеваний кишечника, в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита, с пониженным побочным действием или, в идеале, даже без побочного действия. Как гистологические, так и иммунологические наблюдения показывают, что клеточноопосредованный иммунитет и Т-клеточная активация являются ключевыми особенностями CD. Исследования на человеке и на экспериментальных моделях наводят на мысль, что при CD локальная иммунная реакция имеет тенденцию развиваться преимущественно по типу Th1 (Desreumaux et al., 1997 г.) и что локально высвобождаемые цитокины, такие как IFN-, IL-1 и TNF-, вносят вклад в промотирование и распространение воспалительной реакции (Reimund et al., 1996 г.). Цитокин IL-18 играет важную роль в Th1-опосредуемой иммунной реакции совместно с цитокиномIL-12 путем стимуляции секретирования IFN-, усиления цитотоксичности природных киллерных клеток и стимуляции дфференцировки клеток ТН 1 (Uschito et al., 1996).IL-18 действует вместе с IL-12, IL-2, антигенами, митогенами и также, возможно, другими факторами для индукции продуцирования IFN-. IL-18 также усиливает продуцирование GM-CSF и IL-2, усиливает пролиферацию Т-клеток, индуцируемую анти-CD-3, и усиливает Fas-опосредованный киллинг природных киллерных клеток. Зрелый IL-18 продуцируется из своего предшественника IL-1 конвертирующим ферментом (ICE, каспаза-1). Рецептор IL-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, совместно действующих при связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связыванияIL-18 обнаружены в Т-клетках, стимулированных мышиным IL-12 (Okamoto et al., 1998 г.), что наводит на мысль о многоцепном рецепторном комплексе. Пока идентифицированы две рецепторные субъединицы, причем обе принадлежат семейству рецепторов IL-1 (Okamoto et al., 1999 г.). Сигнальная трансдукция IL-18 участвует в активации NF-KB (Matsumoto et al., 1997 г.). Недавно сделано предположение, что IL-18 принимает некоторое участие в воспалительных заболеваниях кишечника (Pizarro et al., 1999; Monteleone et al., 1999 г.).Pizarro et al. (1999 г.) охарактеризовали экспрессию и локализацию IL-18 в образцах ободочной кишки и выделили популяции слизистых клеток у пациентов с болезнью Крона. С использованием схемы полуколичественной ОТ-ПЦР обнаружено, что количество транскриптов мРНК IL-18 в свежевыделенных интестинальных эпителиальных клетках и мононуклеарных клетках собственной пластинки пациентов при CD возрастает при сравнени с пациентами с неспецифическим язвенным колитом и контролем без воспаления. Транскриптов мРНК IL-18 было больше в интестинальных эпителиальных клетках по сравнению с мононуклеарными клетками собственной пластинки. Иммуногистохимический анализ иссеченных тканей ободочной кишки обнаружил локализацию IL18 как в мононуклеарных клетках собственной пластинки (в частности, макрофагах и дендритных клетках), так и в интестинальных эпителиальных клетках. Вестерн-блоттинг показал, что полоса 18,3 кДа,соответствующая как рекомбинатному, так и зрелому белку IL-18, при биопсии слизистой облочки кишечника обнаруживается преимущественно при CD по сравнению с UC; другая полоса 24 кДа, соответствующая неактивному предшественнику IL-18, определяется при биопсии невоспаленных областей как при CD, так и при UC, и является единственной формой, обнаруженной в контроле без воспаления.Monteleone et al. (1999 г.) подтвердили указанные результаты. Цельную ткань слизистой оболочки кишечника и мононуклеарные клетки собственной пластинки 12 пациентов с болезнью Крона, 9 с неспецифическим язвенным колитом и 15 человек (контроль) без воспалительного заболевания кишечника-7 005583 испытывали на IL-18 методом полуколичественной ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. В испытанных образцах обнаружены транскрипты IL-18. Однако повышенное накопление мРНК IL-18 обнаружено в образцах как слизистой оболочки, так и мононуклеарных клеток собственной пластинки при болезни Крона,при сравнении с неспецифическим язвенным колитом и контролем. При болезни Крона больше транскриптов IL-18 накапливалось в образцах слизистой оболочки, взятых из пораженных участков. Полоса 18 кДа, соответствующая зрелому IL-18, преимущественно обнаруживалась в образцах слизистой оболочки при болезни Крона. В образцах слизистой оболочки контроля без IBD IL-18 присутствовал как полипептид в 24 кДа. Сообразно, активная субъединица (р 20) IL-1-бета-конвертирующего фермента (ICE) экспрессировалась в образцах или при CD или при UC, в то время как в слизистой оболочке ободочной кишки контроля без IBD ICE синтезировался только в виде предшественника (р 45).Dayer (1999 г.) рассматривал различные и частично противоречивые функции IL-18. В итоге, IL-18 представляет собой плейотропный интерлейкин, имеющий функции как усиления, так и ослабления воспаления. С одной стороны, он усиливает продуцирование провоспалительных цитокинов, подобныхTNF-, следовательно промотирует воспаление. С другой стороны, он индуцирует продуцирование NOингибитора каспазы-1, таким образом блокируя созревание IL-1 и IL-18 и, возможно, ослабляя воспаление. Такая неопределенная роль IL-18 ставит под сомнение эффективность ингибиторов IL-18 при воспалительных заболеваниях. Кроме того, из-за взаимодействия великого множества различных цитокинов и хемокинов при регуляции воспаления благоприятное действие при лечении или предупреждении воспалительных заболеваний путем блокирования только одного из участников непредсказуемо. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение основано на выводе, что ингибиторы IL-18 эффективны для лечения и/или предупреждения различных заболеваний и расстройств. Первой целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения повреждения печени. Поэтому изобретение относится к применению ингибитора IL-18 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поврежденя печени в острой или хронической стадии. Конкретнее, изобретение относится к лечению и/или предупреждению алкогольного гепатита, иммунного гепатита, молниеносного гепатита, цирроза печени и первичного билиарного цирроза. Второй целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения артрита. Поэтому изобретение также относится к применению ингибиторов IL-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита. Благоприятное действие ингибиторовIL-18 включает в себя снижение тяжести болезни, а также предупреждение распространения болезни. Эти результаты являются неожиданными, так как из состояния техники, описанного выше, нельзя сделать вывод, что блокада одного специфического фактора, участвующего в артрите, а именно интерлейкина IL-18, может привести к облегчению при артрите или даже к лечению пораженного артритом сустава. На мышиной модели также обнаружено, что введение ингибитора IL-18 существенно уменьшает эрозию хряща. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща. Третьей целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (IBD), в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения IBD. Согласно настоящему изобретению теперь обнаружено, что в биоптатах пациентов с болезнью Крона в зонах воспаления слизистой оболочки повышаются концентрации мРНК IL-18BP и белка. Кроме того, на мышиной модели воспалительного заболевания кишечника показано, что два различных ингибитора IL-18 защищают животных от заболевания. Применение сочетаний ингибитора IL-18, и/или интерферона, и/или антагониста TNF, и/или ингибитора СОХ-2 также рассматриваются согласно изобретению. Для того чтобы применить геннотерапевтические подходы к доставке ингибитора IL-18 в больные ткани или клетки, другие аспекты изобретения относятся к применению экспрессирующих векторов, содержащих кодирующую последовательность ингибитора IL-18, для лечения и/или предупреждения болезненных состояний. Изобретение также относится к применению активации эндогенного гена ингибиторов IL-18 и к применению созданных методами генной инженерии клеток для экспрессии ингибиторов IL-18 для предупреждения и/или лечения повреждения печени, артрита и IBD. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена гистограмма, отображающая уровень IFN- в сыворотке (пг/мл) после инъекции различных количеств рекомбинантного IL18BP (0; 0,04; 0,4; 4 мг/кг) мышам за 1 ч до инъекцииLPS. Образцы крови берут через 5 ч после инъекции LPS и методом ELISA анализируют наличие в них циркулирующего IFN-. На фиг. 2 представлена гистограмма, отображающая уровень аланинаминотрансферазы (ALT) в сыворотке. Мышам делают инъекции возрастающих доз рекомбинантного IL18BP человека (0; 0,04; 0,4; 4-8 005583 мг/кг) перед инъекцией LPS мышам, сенсибилизированным Р. acnes. Образцы крови берут через 5 ч после инъекции LPS и измеряют содержание ALT в сыворотке. SF = сигма Френкеля: 1 единица SFAST/ALT будет образовывать 4,8210-4 мкмоль глутамина в минуту при рН 7,5 при 25 С. На фиг. 3 показано время выживания мышей после инъекции LPS. Мышам делают инъекции разных доз рекомбинантного IL18BP человека (0; 0,04; 0,4; 4 мг/кг) за 20 мин до инъекции LPS мышам, сенсибилизированным P. acnes. Треугольники - 4 мг/кг; маленькие ромбы - 0,4; большие ромбы - 0,04; кружочки - IL18BP отсутствует (только LPS). На фиг. 4 представлена гистограмма, отображающая уровень IFN- в сыворотке, измеренный через 5 ч после инъекции различных количеств IL18BP (0; 0,4; 4 мг/кг), который вводят за 20 мин до инъекцииLPS мышам, сенсибилизированным P. acnes. На фиг. 5 показана выживаемость мышей, инъецированных или поликлональной антисывороткой против IL-18 или обычной кроличьей сывороткой (NDS = контроль) за 30 мин до инъекции 40 мг/мл (летальная доза) LPS, полученного из Е. coli (фиг. 5 А) или S. thyphimurium (фиг. 5 В). Треугольники: мышей инъецируют антисывороткой против IL-18; кружочки: мышей инъецируют NDS. По оси X отмечены дни после заражения LPS. р 0,05. На фиг. 6 представлена гистограмма, отображающая среднее + SEM (среднеквадратичная ошибка) для группы из пяти мышей, обработанных следующим способом. Мышам инъецируют интраперитонеально (i.p.) антисыворотку против IL-18, растворимые рецепторы TNF- (TNFsRp55) или носитель (физиологический раствор) сразу же после внутривенного (i.v.) введения конканавалина A (Con А; фиг. 6 А) или PEA (Pseudomonas aeruginosa, фиг. бВ). р 0,01; р 0,001 против одного только СопА или PEA;р 0,01 против или TNFsRp55 или анти-L-18, факториальный ANOVA. На фиг. 7 показано действие IL-18BP на клинические показатели на мышиной модели артрита. Фиг. 7 А представляет собой диаграмму, отборажающую клинические показатели, измеренные после ежедневного i.p. (интраперитонеального) введения мышам различных количеств или IL-18BP, или IFN-, или носителя (NaCl). Обозначения: заштрихованные треугольники - 10000 ME IFN-; незаштрихованные треугольники - 10 мг/кг IL-18BP; перевернутые треугольники - 3 мг/кг IL-18BP; ромбы - 1 мг/кг IL-18BP; кружочки - 0,5 мг/кг IL-18BP; незаштрихованные квадраты - 0,25 мг/кг IL-18BP; и заштрихованные квадраты - NaCl. Дни обработки откладывают по оси X, клинические показатели (средние значения) откладывают по оси Y. Статистические показатели вычисляют с помощью критерия Манна-Уитни. На фиг. 7 представлена гистограмма, отображающая AUC (площадь под кривой), полученную из графика на фиг. 7 А. n = число животных. На фиг. 8 показано действие IL-18BP на опухание лап. На фиг. 8 А представлена диаграмма, отображающая результаты, полученные при измерении толщины больных задних лап (опухание) у отдельных животных, обработанных различными количествами IL-18BP. По оси X откладывают изменение толщины лап в мм от начала обработки. Обозначения те же, что на фиг. 7. Фиг. 8 В представляет собой гистограмму, отображающую AUC, полученные с фиг. 8 А. n = число животных. На фиг. 9 показан анализ числа больных задних лап со временем при остром артрите, т.е. распространение заболевания в другие суставы. Обозначения: заштрихованные квадраты - NaCl (контроль); треугольники - 10 мг/кг IL-18BP; перевернутые треугольники - 3 мг/кг IL-18BP; ромбы - 1 мг/кг IL-18BP; кружочки - 0,5 мг/кг IL-18BP; и незаштрихованные квадраты - 0,25 мг/кг IL-18BP. На фиг. 10 представлена гистограмма, отражающая показатели эрозии хряща больных суставов. На фиг. 11 показана гистопатология мышиных суставов. По окончании эксперимента лапу, где артрит развивался в первую очередь, отсекают, фиксируют и обрабатывают, как описано ниже в примере 10. Фиг. 11 А - здоровый сустав мыши; фиг. 11 В - сустав мыши, больной артритом; фиг. 11 С - сустав мыши,обработанной rhIL-18BP. На фиг. 12 представлена гистограмма, отображающая уровни антител против коллагена типа II изотипа IgGl (незаштрихованные столбцы) или IgG2a (заштрихованные столбцы) у мышей, обработанных 3 мг/кг IL-18BP или физиологическим раствором (носителем), соответственно. Измерения проводили на 4 день (D4) или на 8 день (D8) заболевания. На фиг. 13 представлена гистограмма, отображающая уровни IL-6, в пг/мл, у животных, обработанных 1, 3 или 10 мг/кг IL-18 ВР, 10000 ME интерферона(IFN-), нормальной мышиной сывороткой(NMS) или физиологическим раствором (NaCl), соответственно. На фиг. 14 показана экспрессия hIL-18BP и транскриптов мРНК IL-18 в интестинальных биоптатах пациентов, страдающих активной болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом или здоровых индивидуумов. Видны характерные продукты ОТ-ПЦР IL-18BP, IL-18 и обязательного гена (-актина)(фиг. 14 А). Относительную количественную оценку окрашенных этидийбромидом полос осуществляют с использованием программного обеспечения для анализа изображений Kodak Digital и приводят как отношение гена-мишени к -актину. Геном-мишенью является IL-18 на фиг. 14 В и IL-18BP на фиг. 14 С. На фиг. 15 показана экспрессия транскриптов мРНК hIL-18BP и белка HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) и экспрессия белка ТНР 1 (клеточная линия моноцитов человека). РНК выделяют из необработанных эндотелиальных клеток (среда) и эндотелиальных клеток, стимулирован-9 005583 ных IL-1, TNF, IFN. Положительный контроль: ободочная кишка пациента с болезнью Крона; отрицательный контроль: без кДНК. Экспрессию IL-18BP и IL-18 анализируют методом полуколичественной ОТ-ПЦР (фиг. 15 А). Культуральный супернатант необработанных (среда) клеток и клеток после 24 часовой активации IL-1, TNF, IFN или HUVEC (фиг. 15 В), или ТНР 1 (фиг. 15 С) анализируют на продуцирование белка IL-18BP и IL-18 методом ELISA. На фиг. 16 показано изменение массы тела между 1 и 10 днями на мышиной модели IBD после интраперитонеального (ip) введения либо физиологического раствора (NaCl), либо IL-18BP (8 мг/кг). Изменение массы выражают в процентах изменения массы тела по сравнению с днем 1. Приводятся средние значения и SEM для двух групп по 8 мышей в группе. На фиг. 17 показаны результаты анализов ободочных кишок, каудальных лимфоузлов и селезенок,полученных у мышей с IBD, обработанных IL-18BP и необработанных. На фиг. 17 А отображена масса, в мг, последних 6 см ободочной кишки. На фиг. 17 В показано общее число клеток, присутствующих в каудальном лимфоузле. Фиг. 17 С отображает процентное содержание клеток в селезенке, окрашивающихся положительно на CD4+/CD69+. Данные представляют собой средние значения величин и SEM. Знакпоказывает значимое различие. На фиг. 18 показано количество IFN (фиг. 18, А и В) и TNFa (фиг. 18, С и D), продуцированных через 48 ч клетками каудального лимфоузла (фиг. 18, А и С) и клетками селезенки (фиг. 18, В и D) после стимуляции CD3/CD28, присутствующих в супернатанте. Приводятся средние значения и SEM. На фиг. 19 показано содержание TNF (фиг. 19 А) и IFN (фиг. 19 В) в гомогенатах из ободочной кишки. Данные исправлены на массу ободочной кишки. Приводятся средние значения и SEM. Знакпоказывает значимое различие. Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении благоприятного действия ингибитора IL-18 при различных заболеваниях и расстройствах. Термин "ингибитор" в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продуцирование и/или действие IL-18 таким образом, что продуцирование и/или действие IL-18 ослабевает, уменьшается или частично, существенно или полностью предотвращается или блокируется. Термин"ингибитор" предназначен для обозначения ингибиторов продуцирования IL-18, а также ингибиторов действия IL-18. Ингибитор продуцирования может представлять собой любую молекулу, отрицательно влияющую на синтез, процессинг или созревание IL-18. Ингибиторы, рассматриваемые согласно изобретению, могут представлять собой, например, супрессоры экспрессии гена интерлейкина IL-18, антисмысловые мРНК, снижающие или предупреждающие транскрипцию мРНК IL-18 или приводящие к деградации мРНК, белки, нарушающие правильную пространственную упаковку или частично, или существенно предотвращающие секрецию IL-18, протеазы, разрушающие IL-18 сразу же после синтеза, ингибиторы протеаз, расщепляющих про-IL-18 для генерации зрелого IL-18, такие как ингибиторы каспазы-1, и т.п. Ингибитор действия IL-18 может представлять собой, например, антагонист IL-18. Антагонисты могут либо связываться с молекулой IL-18, либо изолировать саму молекулу с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или полной нейтрализации IL-18 или сайта(ов) связывания IL-18,ответственных за связывание IL-18 со своим лигандом (например, подобно его рецепторам). Антагонист также может ингибировать каскад передачи сигналов IL-18, который активируется в клетках после связывания IL-18 и рецептора. Ингибитор действия IL-18 также может представлять собой растворимые рецепторы IL-18 или молекулы, напоминающие рецепторы, или агенты, блокирующие рецепторы IL-18, или антитела к IL-18,такие как поликлональные или моноклональные антитела, или любой другой агент или молекулу, предупреждающие связывание IL-18 со своими мишенями, причем таким образом уменьшается или предотвращается включение механизмов внутри- или внеклеточных реакций, опосредуемых IL-18. Согласно первому аспекту настоящего изобретения ингибиоры IL-18 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени. Предпочтительно, изобретение относится к применению ингибитора IL-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения острых и хронических болезней печени и, предпочтительнее, алкогольного гепатита, вирусного гепатита, иммунного гепатита, молниеносного гепатита,цирроза печени и первичного билиарного цирроза. Термин "повреждение печени" или "болезнь печени", используемый в данном описании, включает в себя самые разные патологические состояния. Некоторые их таких состояний, рассматриваемых в настоящем изобретении, подробно объясняются выше в разделе "Предпосылки создания изобретения". К другим болезням печени, которые можно лечить и/или предупреждать согласно изобретению, относится,например, пирогенный абсцесс печени. Он также называется бактериальной печенью и представляет собой полость в печени, продуцирующую гной. Причин абсцесса печени много. Он может развиться из абдоминальной инфекции, такой как аппендицит, дивертикулит или перфорированная кишка; инфекции- 10005583 в кровотоке; инфекции из билиарного (печеночный секрет) тракта или травмы, когда ушибленная печень становится инфицированной. Наиболее обычными микроорганизмами, вызывающими абсцесс печени,являются Esherichia coli, Proteus vulgaris и Enterobacter aerogenes. Частота заболевания составляет 1 случай на 10000 человек. Алкогольные болезни печени можно лечить и/или предупреждать с использованием ингибиторовIL-18 согласно изобретению. К ним относятся острое и хроническое воспаление печени, вызванное злоупотреблением алкоголем. Алкогольный гепатит, как правило, имеет место после нескольких лет усиленного употребления алкоголя. Чем больше длительность применения алкоголя и больше потребление алкоголя, тем больше вероятность развития болезни печени. Недостаточность питания развивается как результат малой калорийности алкоголя, пониженного аппетита и малабсорбции (неадекватное поглощение питательных веществ из кишечного тракта). Недостаточность питания вносит вклад в болезнь печени. Токсичность этанола для печени, индивидуальная чувствительность к вызываемой алкоголем болезни печени и генетические факторы также вносят вклад в развитие алкогольной болезни печени. Согласно данному изобретению с использованием ингибиторов IL-18 можно лечить и/или предупреждать цирроз печени. Цирроз является хронической болезнью печени, которая вызывает повреждение ткани печени, рубцевание печени (фиброз; нодулярная регенерация), прогрессивное снижение функции печени, образование избыточной жидкости в брюшной полости (асцит), кровотечения (коагулопатия),повышенное давление в кровеносных сосудах (портальная гипертензия) и расстройства функций головного мозга (печеночная энцефалопатия). Поврежденная и зарубцевавшаяся печень становится неспособной адекватно удалять продукты жизнедеятельности (токсины) из крови, а образование рубцовой ткани ведет к повышенному давлению (портальная гипертензия) в венах между кишечником и селезенкой и печенью. Избыточное употребление алкоголя является ведущей причиной цирроза. К другим причинам относятся инфекционные болезни (такие как гепатит), болезни и дефекты желчной дренажной системы (такие как билиарные стеноз или обструкция), кистозный фиброз и повышенное поглощение железа и меди. Тип цирроза зависит от причины заболевания. При циррозе могут быть тяжелые осложнения. В США цирроз является 9-й причиной смертности. Могут появиться неврологические проблемы (такие как печеночная энцефалопатия). Повышенное скопление жидкости в брюшной полости (асцит) вызывается пониженным содержанием белка в организме, повышенным содержанием натрия и повышенным давлением в кровеносных сосудах печени (портальная гипертензия). Портальная гипертензия может вызвать повышенное давление, увеличение и утолщение кровеносных сосудов в пищеводе (пищеводное раширение вен). Могут появиться проблемы кровотечения и коагуляции крови. Повышенное давление в кровеносных сосудах и проблемы коагуляции крови могут повысить возможность тяжелого и опасного для жизни кровоизлияния. Другим расстройством, охватываемым термином "повреждение печени" согласно настоящему изобретению, является аутоиммунный гепатит. Он представляет собой воспаление печени, вызванное взаимодействием с иммунной системой. Аутоиммунный гепатит является типом хронического активного гепатита. В крови пациентов с хроническим активным гепатитом можно обнаружить различные циркулирующие антитела. Другие аутоиммунные болезни могут быть связаны с хроническим активным гепатитом или могут иметь место у родственников больных с хроническим активным гепатитом. Такими болезнями являются тиреоидит, сахарный диабет, неспецифический язвенный колит, Coombsположительная гемолитическая анемия, пролиферативный гломерулонефрит и синдром Шегрена. Факторы риска могут включать в себя указанные болезни, или факторы риска связаны с хроническим активным гепатитом. Частота заболевания - 4 случая на 10000 человек. Билиарная атрезия является другим расстройством в сфере термина "повреждение печени". Она представляет собой обструкцию желчных протоков, вызванную недостаточностью их развития, как правило, до рождения (в утробе). Билиарная атрезия вызывается аномальным и неадекватным развитием желчных протоков внутри и вне печени. Назначение билиарной системы - удаление продуктов жизнедеятельности из печени и вынос желчных солей, необходимых для переваривания жиров в тонкой кишке. При таком состоянии блокируется выделение желчи из печени в желчный пузырь. Это может привести к повреждению печени и циррозу печени, который, если его не лечить, в конечном счете смертелен. Согласно изобретению ингибиторы IL-18 также применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения хронического активного гепатита, также называемого хроническим агрессивным гепатитом. Он представляет собой длительное воспаление печени, повреждающее клетки печени. К причинам хронического активного гепатита относятся вирусная инфекция, реакция/поглощение лекарственного средства, метаболические нарушения или аутоиммунные болезни. Причина также может быть неявной. Болезнь характеризуется некрозом или гибелью клеток печени, активным воспалением и фиброзом, которые могут привести к печеночной недостаточности, циррозу и смерти. Частота заболевания - 1 случай на 10000 человек. Факторами риска являются аутоиммунные болезни,предшествующее - свыше 6 месяцев - заражение гепатитом С или положительная реакция на антиген гепатита А или гепатита В.- 11005583 Хронический персистирующий гепатит является умеренной непрогрессирующей формой воспаления печени и также представляет собой болезнь, согласно настоящему изобретению охватываемую термином "повреждение печени". Согласно изобретению ингибиторы IL-18 также применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения первичного билиарного цирроза (ПБЦ). ПБЦ является воспалительным состоянием, являющимся результатом обструкции выделения желчи в печени, вызывающей повреждение клеток печени. Желчные протоки в печени воспаляются по неизвестной причине. Болезнь поражает наиболее часто женщин среднего возраста. Симптомы появляются постепенно, и первым симптомом является зуд кожи. Происходит воспаление желчных протоков в печени. В конце концов, развивается цирроз печени. Заболевание может ассоциироваться с аутоиммунными расстройствами. Частота заболевания - 8 случаев на 100000 человек. Ингибиторы IL-18, рассматриваемые в данном описании,также можно применять для лечения острого отравления печени, например, вызванного большим количеством парацетамола. Такое острое отравление печени может произойти из-за передозировки парацетамола, случайной или преднамеренной. Как показано ниже в примерах, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ингибиторы IL-18 особенно эффективны при предупреждении и лечении молниеносного гепатита (острый гепатит). Поэтому изобретение предпочтительно относится к предупреждению и/или лечению молниеносного гепатита. Согласно второму аспекту настоящего изобретения, ингибиторы IL-18 применяют для изготовления лечебного стредства для лечения и/или предупреждения артрита. Термин "артрит", используемый в данном описании, включает в себя все различные типы артрита и артритных состояний, как острый, так и хронический артрит, как указано, например, в Homepage of theDepartment of Orthopaedics of the University of Washington on Arthritis (www.orthop.washington.edu). Примерами артритных состояний являются анкилозирующий спондилит, боль в спине, синдром запястных отложений, синдром Элерса-Данлоса, подагра, ювенильный артрит, красная волчанка, миозит, несовершенный остеогенез, остеопороз, полиартрит, полимиозит, псориатический артрит, синдром Рейтера,склеродерма, артрит с болезнью кишечника, болезнь Бехчета, детский артрит, дегенеративная болезнь суставов, фибромиалгия, инфекционный артрит, болезнь Лайма, синдром Марфана, остеоартрит, остеонекроз, болезнь Педжета, ревматоидная полимиалгия, псевдоподагра, рефлекторная симпатическая дистрофия, ревматоидный артрит, ревматизм, синдром Шегрена, семейный аденомный полипоз и т.п. Предпочтительно согласно изобретению ингибиторы IL-18 предлагаются для лечения и/или предупреждения воспалительного артрита. Воспалительный артрит классифицируется как хронический артрит в соответствии с упорным, длительным или возвратным течением болезни. В предпочтительном варианте воплощения изобретения воспалительный артрит представляет собой ревматоидный артрит (RA). RA вызывает воспаление в выстилке суставов (синовиальная мембрана, эпителий с одним слоем клеток) и/или внутренних органов. Болезнь имеет тенденцию удерживаться многие годы, как правило, поражает многие разные суставы тела и, в конце концов, может вызвать повреждение хряща, кости, сухожилий и связок. Суставы, которые могут поражаться RA, являются суставами, расположенными, например, в шее, плечах, локтях, бедрах, запястьях, кистях рук, коленях и стопах. Во многих случаях суставы воспаляются при RA симметрично.RA распространен примерно среди 1% населения в Соединенных Штатах, причем распределяется в пределах всех этнических групп и возрастов. Он встречается во всем мире, и число женщин и мужчин сRA соотносится как 3 к 1. Как показано ниже в примерах, доказано, что ингибитор IL-18 обнаруживает весьма эффективное благоприятное действие на эрозию хряща. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща, т.е. к применению ингибитора IL-18 в качестве хондрозащитного средства. Ингибитор IL-18 можно применять при любом состоянии, при котором происходит разрушение или эрозия хряща. Разрушение хряща является прогрессирующим ухудшением структурной целостности суставного хряща. Оно происходит, например, при состояниях, поражающих суставной хрящ, таких как ревматоидный артрит,ювенильный артрит или остеоартрит, но также, например, при инфекционном синовите. Третий аспект настоящего изобретения относится к применению ингибитора IL-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника. Такое применение основано на выводе, что ингибитор IL-18 активируется в воспаленной слизистой оболочке у пациентов с CD. Оно также основывается на выводе, что введение различных ингибиторовIL-18 имеет защитное действие на мышиной модели колита. Активация IL-18 в больной слизистой оболочке у пациентов с CD уже описана в технике (Monteleone et al., 1999; Pizzaro et al., 1999 г.). После того как показано присутствие больших количеств IL-18BP в воспаленных участках слизистой оболочки кишечника согласно изобретению, стало даже более неожиданным обнаружение явного благоприятного действия IL-18BP, введенного системно, на развитие и симптомы колита на животной модели. Хотя IL-18BP уже активируется эндогенно в кишке пациентов с CD, как показано ниже в приме- 12005583 рах, количество IL-18BP в организме, способного к продуцированию, как оказывается, недостаточно для борьбы с заболеванием. Согласно изобретению воспалительным заболеванием кишечника предпочтительно является болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор IL-18 выбирают среди ингибиторов каспазы-1 (ICE), антител, направленных против IL-18, антител, направленных против любой из субъединиц рецептора IL-18, ингибиторов сигнального каскада IL-18, антагонистов IL-18, конкурирующих с IL-18 и блокирующих рецептор IL-18, и IL-18-связывающих белков, изоформ, мутеинов,слитых белков, функциональных производных, активных фракций или их производных с циклической перестановкой, обладающих такой же активностью. Термин "IL-18-связывающие белки" используется в данном описании как синоним "IL-18BP". Он охватывает IL-18-связывающие белки по определению, данному в WO 99/09063 или в Novick et al., 1999 г., включая сплайс-варианты и/или изоформы IL-18-связывающих белков по определению, данному вKim et al., 2000 г. В частности, согласно данному изобретению полезны изоформы а и с IL-18BP человека. Белки, полезные согласно данному изобретению, могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут происходить из природных источников, таких как моча, или предпочтительно могут быть получены рекомбинантными методами. Экспрессию рекомбинантов можно осуществить в прокариотических экспрессирующих системах, подобных Е. coli, или в эукариотических, и предпочтительно в экспрессирующих системах млекопитающих. Используемый в данном описании термин "мутеины" относится к аналогам IL-18BP или аналогам вирусного IL-18BP, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного IL-18BP или вирусного IL-18BP заменены различными аминокислотными остатками или делетированы, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности IL-18BP или вирусного IL-18BP без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с IL-18BP дикого типа или вирусным IL-18BP. Такие мутеины получают известными методами синтеза и/или методами сайтнаправленного мутагенеза или любым подходящим для такой цели известным способом. Любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот, по существу, дублирующую последовательность IL-18BP или, по существу, дублирующую последовательность вирусного IL-18BP, так что активность, по существу, подобна активности IL-18BP. Одной из активностей IL-18BP является его способность к связыванию IL-18. До тех пор пока мутеин обладает существенной связывающей активностью в отношении IL-18, он может использоваться при очистке IL-18 таким способами, как аффинная хроматография, и, таким образом, может рассматриваться как обладающий активностью в основном подобной активности IL-18BP. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин активностью в основном подобной активности IL-18BP, с помощью обычных экспериментов, включающих в себя определение того, связывается ли такой мутеин или не связывается с соответствующим образом помеченным IL-18, например, путем простого конкурентного сэндвич-анализа, например радиоиммуноанализа или анализа методом ELISA. Мутеины полипептидов IL-18BP или мутеины вирусного IL-18BP, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, или кодирующая их нуклеиновая кислота, включают в себя ограниченный ряд, по существу, соответствующих последовательностей в виде замещенных пептидов или полинуклеотидов, которые может получить обычными методами рядовой специалист в данной области техники без излишнего экспериментирования, основываясь на указаниях и руководстве, представленных в данном описании. Предпочтительными изменениями для мутеинов согласно настоящему изобретению являются изменения, известные как "консервативные" замены. Консервативные замены аминокислот полипептидовIL-18BP или белков вирусного IL-18BP могут включать в себя тождественные аминокислоты в пределах группы, которая имеет, по существу, подобные физико-химические свойства, и при заменах между членами группы будет сохраняться биологическая функция молекулы (Grantham, 1974 г.). Ясно, что в вышеуказанных последовательностях также можно осуществить вставки или делеции без изменения их функции, в частности, если вставки или делеции включают в себя только несколько аминокислот, например до тридцати, а предпочтительно до десяти, и не удаляются или не заменяются аминокислоты, критические для функциональной конформации, например цистеиновые остатки. Белки и мутеины, полученные посредством таких делеций и/или инсерций, входят в сферу действия настоящего изобретения. Предпочтительно, когда тождественными аминокислотами являются аминокислоты, указанные в табл. I. Предпочтительнее, если тождественными аминокислотами являются аминокислоты, указанные в табл. II; и наиболее предпочтительно, когда тождественными аминокислотами являются аминокислоты,указанные в табл. III.- 13005583 Таблица I Предпочтительные группы тождественных аминокислот Таблица II Более предпочтительные группы тождественных аминокислот- 14005583 Таблица III Наиболее предпочтительные группы тождественных аминокислот Примеры осуществления замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения мутеинов полипептидов, или белков IL-18BP, или мутеинов вирусного IL-18BP для применения в настоящем изобретении, включают в себя любые известные методы, например, представленные в патентах США RE 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Mark et al.; 5116943, Koths et al., 4965195, Namen et al.; 4879111, Chong et al. и 5017691, Lee et al.; и белки с лизиновым замещением, представленные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Термин "слитый белок" относится к полипептиду, содержащему IL-18BP, или вирусный IL-18BP,или его мутеин или фрагмент, слитый с другим белком, который, например, имеет длительное время пребывания в жидкостях организма. IL-18BP или вирусный IL-18BP, таким образом, можно гибридизовать с другим белком, полипептидом или подобным элементом, например иммуноглобулином или его фрагментом. Используемый в данном описании термин "функциональные производные" охватывает производные IL-18BP или вирусного IL-18BP и их мутеинов и слитых белков, которые можно получить по функциональным группам, имеющимся в боковых цепях остатков N- или С-концевых групп, способами, известными в технике, и входят в изобретение до тех пор, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность белка, которая в основном подобна активности IL-18BP или вирусного IL-18BP, и не придают токсических свойств содержащим их композициям. Такие производные могут включать в себя, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные сайты и удлинять время пребывания IL-18BP или вирусного IL-18BP в жидкостях организма. К другим производным относятся алифатические эфиры, образованные карбоксильными группами, амиды, образованные карбоксильными группами посредством взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами, N-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными группами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например,группы серильных и треонильных остатков), образованные с ацильными группами. В качестве "активных фракций" IL-18BP или вирусного IL-18BP, их мутеинов и слитых белков настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи белковой молекулы как таковой или вместе с ассоциированными молекулами или присоединенными к ней остатками, например остатки сахаров или фосфатов, или агрегаты белковой молекулы или остатки сахаров как таковых по себе, при условии, что указанная фракция обладает активностью в основном подобной активности IL-18BP. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения ингибитором IL-18 являются антитела к IL-18. Антитела против IL-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными,гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела и их фрагменты характеризовались высокоаффинным связыванием с IL-18 in vivo и низкой токсичностью. Антитела, ко- 15005583 торые можно использовать в изобретении, отличаются своей способностью лечить пациентов на протяжении периода, достаточного для получения превосходной регрессии или облегчения патогенного состояния или любого симптома или группы симптомов, связанных с патогенным состоянием, и низкой токсичностью. Нейтрализующие антитела легко получить у животных, таких как кролики, козы или мыши, путем их иммунизации IL-18. Иммунизированные мыши особенно полезны для обеспечения источников Вклеток для получения гибридом, которые, в свою очередь, культивируют и получают моноклональные антитела против IL-18 в больших количествах. Химерные антитела являются молекулами иммуноглобулина, характеризующимися двумя или большим числом сегментов или частей, полученных у животных разных видов. Как правило, вариабельную область химерного антитела получают из антитела млекопитающего, не являющегося человеком,такого как мышиное моноклональное антитело, а иммуноглобулиновую константную область получают из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно, обе области и сочетание имеют низкую иммуногенность, определяемую обычными способами (Elliot at al., 1994 г.). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, созданные методами генной инженерии, в которых мышиные константные области заменяют соответствующими частями иммуноглобулина человека, сохраняя при этом мышиные области связывания антигена. Полученные мышино-человеческие антитела предпочтительноимеют пониженную иммуногенность и улучшенную фармакокинетику в организме человека (Knight et al., 1993 г.). Таким образом, в другом предпочтительном варианте антитела к IL-18 представляют собой гуманизированные антитела к IL-18. Предпочтительные примеры гуманизированных антител к IL-18 описываются, например, в заявке на европейский патент ЕР 0974600. В еще одном предпочтительном варианте антитела к IL-18 являются полностью человеческими. Технология получения человеческих антител подробно описывается, например, в WO 00/76310, WO 99/53049, US 6162963 или AU5336100. Полностью человеческие антитела являются, предпочтительно,рекомбинантными антителами, полученными у трансгенных животных, например, ксеномышах, содержащими все функциональные локусы Ig человека или часть их. В весьма предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитором IL-18 является IL-18BP или его изоформа, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активная фракция или производное с циклической перестановкой. Указанные его изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность IL-18BP, в частности связывание с IL-18, и предпочтительно имеют, по существу, по меньшей мере, активность, подобную активностиIL-18BP. В идеале такие белки имеют биологическую активность, которая даже выше по сравнению с активностью немодифицированного IL-18BP. Предпочтительные активные фракции имеют активность,лучшую, чем активость IL-18BP, или имеют другие преимущества, такие как повышенная стабильность или меньшая токсичность или иммуногенность, или их легче получать в больших количествах, или легче очищать. Последовательности IL-18BP и ее сплайс-варианты/изоформы можно взять из WO 99/09063 или изNovick et al., 1999 г., а также в Kim et al., 2000 г. Функциональные производные IL-18BP можно конъюгировать с полимерами для улучшения свойств белка, таких как стабильность, время полужизни, биологическая доступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения такой цели IL-18BP можно соединить, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Обработку ПЭГ можно осуществить известными способами, описанными, например, в WO 92/13095. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IL-18BP обрабатывают ПЭГ. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибитором IL-18 является слитый белок, содержащий весь IL-18-связывающий белок или его часть, слитые со всем иммуноглобулином или его частью. Специалисту в данной области техники будет понятно, что полученный слитый белок сохраняет биологическую активность IL-18BP, в частности связывание с IL-18. Гибридизация может быть прямой или через короткий пептидный линкер, который может быть недлинным, например длиной 1-3 аминокислотных остатка или длиннее, например длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой трипептид, например, с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met),или линкерную последовательность из 13 аминокислот, содержащую Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-LeuGly-Gly-Gln-Phe-Met, встроенную между последовательностью IL-18BP и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок имеет улучшенные свойства, такие как увеличенное время пребывания в жидкостях организма (период полувыведения), повышенную удельную активность, повышенный уровень экспрессии, или слитый белок легче очищается. В предпочтительном варианте IL-18BP гибридизуют с константной областью молекулы Ig. Предпочтительно, его гибридизуют с участками тяжелой цепи, подобными, например, доменам СН 2 и СН 3IgG1 человека. Получение специфических слитых белков, содержащих IL-18BP и часть иммуноглобулина, описывается, например, в примере 11 WP 99/09063. Другие изоформы молекул Ig также подходят для- 16005583 получения слитых белков согласно настоящему изобретению, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или другие классы Ig, подобные, например, IgM или IgA. Слитые белки могут быть мономерными или полимерными, гетеро- или гомополимерными. Интерфероны известны, главным образом, их ингибирующим действием на репликацию вирусов и пролиферацию клеток. Интерферон-, например, играет важную роль в промоции иммунных и воспалительных реакций. Сообщается, что интерферон(IFN-, интерферон типа I) играет роль противовоспалительного фактора. Данные исследований, опубликованных Triantaphyllopoulus et al. (1999 г.), показывают, что IFN-P оказывает благоприятное действие при лечении ревматоидного артрита, как показано на мышиной модели болезни - модели артрита, вызванного коллагеном (CIA). Такое благоприятное действие IFN- подтверждается ниже в примерах. Изобретение также относится к применению сочетания ингибитора IL-18 и интерферона при изготовлении лекарственного средства для лечения артрита, в частности ревматоидного артрита. Интерфероны также можно конъюгировать с полимерами для увеличения стабильности белков. Конъюгат интерферонаи полиола полиэтиленгликоля (ПЭГ) описывается, например, в WO 99/55377. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения интерферон представляет собой интерферон(IFN-) и предпочтительнее - IFN- 1a. Ингибитор продуцирования и/или действия IL-18 предпочтительно применяют одновременно с интерфероном или отдельно от него. Еще в одном из вариантов воплощения изобретения ингибитор IL-18 применяют в сочетании с антагонистом TNF. Антагонисты TNF проявляют свою активность несколькими способами. Во-первых,антагонисты могут связываться с самой молекулой TNF или изолировать ее с достаточной аффинностью и специфичностью и частично или существенно нейтрализовать эпитоп TNF или эпитопы, ответственные за связывание с рецептором TNF (далее называются "секвестрирующими антагонистами"). Секвестрирующим антагонистом могут являться, например, антитела, направленные против TNF. С другой стороны, антагонисты TNF могут ингибировать каскад передачи сигнала TNF, активируемый рецептором клеточной поверхности после связывания TNF (далее называются "антагонистами передачи сигнала"). Обе группы антагонистов полезны либо порознь, либо вместе, в сочетании с ингибитором IL-18 при лечении артрита, в частности ревматоидного артрита. Антагонисты TNF легко идентифицировались и оцениваются путем обычного скрининга кандидатов по их действию на активность нативного TNF in vitro на сенсибилизированных клеточных линиях,например на В-клетках человека, в которых TNF вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулина. Анализ включает в себя анализ композиций TNF при разных разведениях антагониста-кандидата, например, от 0,1- до 100-кратного разведения молярного количества TNF, используемого при анализе, и контроль без TNF или только с антагонистом (Tucci et al., 1992 г.). Секвестрирующие антагонисты являются предпочтительными антагонистами TNF для использования согласно настоящему изобретению. Среди секвестрирующих антагонистов предпочтительными являются полипептиды, связывающиеся с TNF с высокой аффинностью и обладающие низкой иммуногенностью. Особенно предпочтительными являются растворимые молекулы рецептора TNF и нейтрализующие антитела к TNF. Например, растворимые TNF-RI и TNF-RII полезны в настоящем изобретении. Усеченные формы указанных рецепторов, содержащие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, являются еще более предпочтительными антагонистами согласно настоящему изобретению. Усеченные растворимые рецепторы TNF типа I и типа II описываются, например, в ЕР 914431. Усеченные формы рецепторов TNF являются растворимыми и обнаружены в моче и сыворотке как ингибирующие связывание TNF белки в 30 и 40 кДа, названные TBPI и TBPII, соответственно (Engelmann et al., 1990 г.). Согласно изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или раздельное применение ингибитора IL-18 с антагонистами TNF и/или интерфероном. Согласно изобретению TBPI и TBPII являются предпочтительными антагонистами TNF для применения в сочетании с ингибитором IL-18. Производные, фрагменты, области и биологически активные части рецепторных молекул функционально схожи с рецепторными молекулами и также могут использоваться в настоящем изобретении. К таким биологически активным эквивалентам или производным рецепторной молекулы относится часть полипептида или последовательности, кодирующей рецепторную молекулу, которая имеет достаточный размер и способна связываться с TNF с такой аффинностью,что взаимодействие TNFс мембрансвязанным рецептором ингибируется или блокируется. В другом предпочтительном варианте антагонистом TNF для применения согласно изобретению является растворимый TNF-RI (TBPI) человека. Природные и рекомбинантные растворимые молекулы рецепторов TNF и способы их получения описываются в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 433900. Ингибитор IL-18 можно применять одновременно, последовательно или раздельно с ингибиторомTNF. Выгодно применять сочетание антитела или антисыворотки против IL-18 и растворимый рецептор- 17005583 В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения лекарственное средство также включает в себя ингибитор СОХ, предпочтительно ингибитор СОХ-2. Ингибиторы СОХ известны в технике. Конкретные ингибиторы СОХ-2 описываются, например, в WO 01/00229. Изобретение также относится к применению сочетания ингибиторов IL-18, и/или интерферонов,и/или антагонистов TNF, и/или ингибиторов СОХ-2. Такое сочетание подходит для лечения и/или предупреждения артрита, в частности ревматоидного артрита, и для лечения и/или предупреждения повреждения печени и для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника, в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Активные компоненты можно применять одновременно, последовательно или раздельно. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор IL-18 используют в количестве примерно 0,0001-10 мг на кг массы тела, или примерно 0,01-5 мг на кг массы тела, или примерно 0,1-3 мг на кг массы тела, или примерно 1-2 мг на кг массы тела. В другом предпочтительном варианте ингибитор IL-18 используют в количестве примерно 0,1-1000 мкг на кг массы тела, или примерно 1-100 мкг на кг массы тела, или примерно 10-50 мкг на кг массы тела. Изобретение также относится к применению экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора IL-18, при получении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения артритных состояний, в частности ревматоидного артрита, для лечения повреждения печени и для лечения воспалительного заболевания кишечника. Таким образом, для лечения и/или предупреждения болезни применяют генотерапевтический подход. Затем выгодно провести экспрессию ингибитора IL-18 in situ, причем таким образом IL-18 эффективно блокируется непосредственно в ткани(тканях) или клетках, пораженных болезнью. Для того чтобы лечить и/или предупреждать артрит, генотерапевтический вектор, содержащий последовательность ингибитора продуцирования и/или действия IL-18, можно инъецировать, например,непосредственно в больной сустав, избежав таким образом проблем, связанных с системным введением генотерапевтических векторов, подобных разбавлению векторов, достижения и нацеливания на клеткиили ткани-мишени и побочного действия. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования IL-18 в клетке,обычно молчащей в отношении экспрессии ингибитора IL-18, или экспрессирующей недостаточные количества ингибитора, также рассматривается согласно изобретению. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, желательных для экспрессии ингибитора IL-18. Такие регуляторные последовательности могут представлять собой, например, промоторы или энхансеры. Затем регуляторную последовательность можно встроить в правый локус генома методом гомологичной рекомбинации, таким образом операбельно связывая регуляторную последовательность с геном,экспрессию которого требуется индуцировать или усилить. Такую технологию обычно называют "эндогенной генной активацией (EGA)", и она описывается, например, в WO 91/09955. Специалисту в данной области техники будет понятно, что с использованием такого метода также можно прекратить экспрессию IL-18, т.е. ввести в генный локус IL-18 элемент отрицательной регуляции,подобный, например, молчащему элементу, причем таким образом дезактивируется или предотвращается экспрессия IL-18. Специалисту в данной области техники будет понятно, что такая дезактивация или"глушение" экспрессии IL-18 имеет такое же действие, как применение ингибитора IL-18 для предупреждения и/или лечения заболевания. Изобретение также относится к применению клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора IL-18, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, артрита или воспалительного заболевания кишечника. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, в частности, полезным для предупреждения и/или лечения воспалительного артрита, повреждения печени или воспалительного заболевания кишечника, содержащим терапевтически эффективное количество ингибитора IL-18 и терапевтически эффективное количество интерферона. В качестве ингибитора IL-18 фармацевтическая композиция может содержать ингибиторы каспазы-1, антитела против IL-18, антитела против субъединиц рецептора IL-18, ингибиторы каскада передачи сигнала IL-18, антагонисты IL-18, конкурирующие с IL-18 и блокирующие рецептор IL-18, и белки, связывающие IL-18, их изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные с циклическими перестановками, обладающие такой же активностью.IL-18BP и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные с циклическими перестановками, описанные выше, являются предпочтительными активными ингредиентами фармацевтических композиций. Интерферон, содержащийся в фармацевтической композиции, предпочтительно представляет собойIFN-. В еще одном предпочтительном варианте фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества ингибитора IL-18, необязательно интерферона и антагониста TNF. Антагонисты TNF могут представлять собой антитела, нейтрализующие активность TNF, или растворимые усеченные фрагменты рецептора TNF, также называемые TBPI и TBPII. Фармацевтическая композиция со- 18005583 гласно изобретению также может содержать один или несколько ингибиторов СОХ, предпочтительно ингибиторы СОХ-2. Определение "фармацевтически приемлемый" предназначено для обозначения любого носителя, не влияющего на эффективность биологической активности активного ингредиента и нетоксичного для хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения активный(е) белок(белки) можно ввести в состав стандартной лекарственной формы для инъекции в таком носителе, как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. Активные ингредиенты фармацевтической композиции согласно изобретению можно вводить индивидууму разными способами. Способы введения включают в себя интрадермальный, трансдермальный(например, в композициях с медленным высвобождением), внутримышечный, интраперитонеальный,внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный способы. Можно использовать любой другой эффективный способ введения, например поглощение через эпителиальную или эндотелиальную ткани или генную терапию, когда пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, с помощью вектора), которая вызывает экспрессию и секрецию активного агента in vivo. Кроме того, согласно изобретению белок(белки) можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных средств, такими как фармацевтически приемлемые поверхностноактивные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители. Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный(е) белок(белки) можно ввести в такую композицию, как раствор, суспензия, эмульсия или лиофилизованный порошок, в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например,водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннитом) или химическую стойкость (например, консервантами и буферными веществами). Композицию стерилизуют используемыми обычно методами. Биологическую доступность активного(ых) белка(белков) согласно изобретению также можно улучшить, используя процедуры конъюгации, повышающие время полужизни молекулы в организме человека, например присоединяя молекулу к полиэтиленгликолю, как описывается в заявке на международный патент РСТ WO 92/13095. Терапевтически эффективные количества активного(ых) белка(белков) будут функцией многих переменных, включая тип антагониста, аффинность антагониста к IL-18, остаточную цитотоксическую активность любого рода, обнаруживаемую антагонистами, способ введения, клиническое состояние пациента (в том числе желательность поддержания нетоксичного уровня эндогенной активности IL-18)."Терапевтически эффективное количество" является таким количеством ингибитора IL-18, которое будучи введенным, приводит к ингибированию биологической активности IL-18. Дозировка, вводимая индивидууму в виде однократной или нескольких доз, будет зависеть от разных факторов, в том числе от фармакокинетических свойств ингибитора IL-18, способа введения, состояния пациента и его особенностей (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, объем), тяжести симптомов, сопутствующего лечения, частоты лечения и нужного эффекта. Регулирование и манипуляция в установленных дозировочных интервалах находятся в пределах возможностей специалистов в этой области техники, так же как и способы определения in vitro и in vivo ингибирования IL-18 у индивидуума. Согласно изобретению ингибитор IL-18 используют в количестве примерно 0,0001-10 мг на кг массы тела, или примерно 0,01-5 мг на кг массы тела, или примерно 0,1-3 мг на кг массы тела, или примерно 1-2 мг на кг массы тела. Другими предпочтительными количествами ингибитора IL-18 являются количества примерно 0,1-1000 мкг на кг массы тела, или примерно 1-100 мкг на кг массы тела, или примерно 10-50 мкг на кг массы тела. Способом введения, предпочтительным по изобретению, является введение подкожным способом. Согласно изобретению также предпочтительно внутримышечное введение. В других предпочтительных вариантах ингибитор IL-18 вводят ежедневно или через день. Ежедневные дозы, как правило, дают в виде разделенных доз или в форме с отсроченным высвобождением, эффективной для получения нужных результатов. Второе или последующие введения можно осуществлять в дозировке, которая такая же, как начальная или предшествующая доза, введенная индивидууму, или меньше или больше нее. Второе или последующие введения можно осуществлять во время или до начала заболевания. Согласно изобретению ингибитор IL-18 можно вводить индивидууму в терапевтически эффективном количестве профилактически или терапевтически до, одновременно или после других видов лечения или лекарственных средств (например, схемы с несколькими лекарственными средствами), в частности с интерфероном, и/или антагонистом TNF, и/или ингибитором СОХ. Активные средства, вводимые одновременно с другими лечебными средствами, можно вводить в тех же или в других композициях. Изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему в себя смешивание эффективного количества ингибитора IL-18, и/или интерферона, и/или антагонистаTNF, и/или ингибитора СОХ с фармацевтически приемлемым носителем. Имея описание изобретения, его будет легче понять, обратившись к приведенным далее примерам,которые даются в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.- 19005583 Примеры Часть I. Примеры 1-8, относящиеся к применению ингибиторов IL-18 при повреждении печени. Пример 1. Получение IL-18BP с меткой His (IL-18BP-His tag). Очищенный рекомбинантный IL-18BP человека, содержащий метку his (r-hiL-IL-18BP-His tag), получали в клетках СНО. Получение рекомбинантных белков в эукариотических клетках известно специалистам в данной области техники. Хорошо известные способы доступны для конструирования соответствующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую IL-18BP, и подходящих для трансфекции эукариотических клеток с целью получения рекомбинантного IL-18BP. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую IL-18BP (см., например, Novick et al., 1999 г.), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. С другой стороны, такую ДНК можно получить методом ПЦР с подходящими смысловыми и антисмысловыми праймерами. Затем полученные конструкции ДНК встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными в технике (Manaitis, 1982 г.). Рекомбинантный белок очищали до чистоты свыше 95% и обнаруживали, что он биологически активен in vitro и in vivo и обладает высокой аффинностью к своим лигандам. Пример 2. Защитное действие IL-18BP против вызываемой эндотоксином гибели на мышиной модели. Использовали мышиную модель для проверки того, будет ли ингибитор IL-18 IL-18BP защищать мышей от высокой дозы липополисахаридов (LPS). LPS вызывает острое повреждение печени и вслед за тем быструю гибель мышей. Мышам C57BL/6 инъецировали интраперитонеально (i.p.) 4 мг/кг рекомбинантного IL-18BP человека (rhIL18BPhis), содержащего метку his (полученного при рекомбинантном продуцировании белка). Спустя 1 ч инъецировали 60 мг/кг LPS (летальные дозы). Выживание мышей в данной группе сравнивали с выживанием в группе животных, получавших только LPS (без IL-18 ВР). Пять мышей из 7, инъецированных rhIL-18BP-his, выжили после инъекции LPS, в отличие от контрольной группы, где все животные погибли в течение 3 дней. Брали образцы крови через 5 ч после инъекции LPS в отсутствие или в присутствии возрастающих доз rhIL-18BP-his и анализировали методом ELISA на наличие циркулирующего IFN- (фиг. 1). ДозыrhIL-18BP-his в 0,4 и 4 мг/кг вызывали 2-кратное снижение содержания IFN- в сыворотке. Такое ингибирующее действие утрачивалось при более низких дозах rhIL-18BP (0,004 и 0,04 мг/кг). Пример 3. IL-18BP обладает защитным действием против повреждения печени на мышиной модели заболевания. Мышиную модель молниеносного гепатита использовали для проверки действия IL-18BP. У мышей развивалось острое повреждение печени, когда им дополнительно вводили Propionibacterium acnes (P.acnes) и липополисахарид (LPS). Мышам инъецировали возрастающие дозы rhIL-18BP-his (4; 0,4; 0,04; 0 мг/кг) в различные моменты времени (1 ч, 20 мин, одновременно) перед инъекцией LPS мышам C57BL/6, сенсибилизированным P.acnes. Когда rhIL-18BP-his вводили i.p. в то же время, что и LPS, выживших мышей не осталось, и уровни циркулирующих IFN- и TNF- оставались неизменными. Неожиданно rhIL-18BP (4 и 0,4 мг/кг) вызывал у 70% мышей снижение циркулирующей аланин-аминотрансферазы (маркер повреждения печени),как показано на фиг. 2. В дополнение к указанному проверяли выживание мышей (фиг. 3). Когда rhIL-18BP вводили i.p. на 20 мин раньше LPS, две самые высокие дозы IL-18BP (4 и 0,4 мг/кг) замедляли гибель мышей на 10 ч по сравнению с контрольной группой, где вместо IL-18BP мыши получали NaCl. Результаты измерения содержания IFN- в сыворотке приводятся на фиг. 4. rhIL-18BP (4 мг/кг) ингибирует уровни циркулирующего IFN- на 90% и циркулирующей аланин-аминотрансферазы на 80%IFN- были схожи с показателями, наблюдаемыми в случае, когда rhIL-18BP вводили i.p. на 20 мин раньше LPS, но уровни циркулирующей аланин-аминотрансферазы оставались неизменными (не показано). Кроме указанного, анализировали ткань мышиной печени методом окрашивания гематоксилином и эозином, а также туннельной микроскопии. Печени мышей, у которых ранее был вызван тяжелый гепатит, обнаруживают тяжелый некроз при сравнении с тканями здоровой печени. В противоположность этому ткань печени мышей, обработанных IL-18BP, обнаруживает значительно меньше некротических очагов, чем в случае необработанных мышей. Пример 4. Антитела против IL-18 защищают от летальной эндотоксемии. Для того чтобы оценить, будет ли блокада IL-18 антителами против IL-18 защищать мышей от действия летальных доз бактериальных липополисахаридов, мышам C57BL/6J инъецировали сначала нейтрализующие кроличьи антимышиные антитела к IL-18 (поликлональные) или сыворотку здоровых кроликов (NDS) в качестве контроля. Через 30 мин после обработки антителами инъецировали летальные- 20005583 дозы LPS, полученных или из Е. coli (фиг. 5 А) или из S. thyphimurium (фиг. 5 В). Эксперименты включали в себя 10-12 мышей на группу и осуществлялись дважды в двух разных случаях. Как видно на фиг. 5 А, обработка мышей антисывороткой против IL-18 предотвращает смертность,вызываемую 40 мг/кг LPS из Е. coli. Выживает 100% мышей против 10% выживших мышей, обработанных сывороткой здоровых кроликов (р 0,005). На фиг. 5 В показано, что обработанные антителами мыши также защищены от летального действияS. thyphimurium (50% выживших против 0% выживших; р 0,05). Пример 5. Блокада IL-18 и TNF- защищает мышей от гепатотоксичности, вызываемой СоnА иPEA. Использовали две экспериментальные модели гепатотоксичности для оценки роли IL-18 и TNFпри повреждении печени. Обе инъекции конканавалина А (СоnА) и Pseudomonas aeruginosa (PEA) вызывали у мышей повреждение печени и являлись моделями гепатита, опосредованного Т-клетками. Мышей C57BL/6J обрабатывали антисывороткой против IL-18 или растворимым рецептором TNF TNFsRp55. Измеряли сывороточные уровни аланин-аминотрансферазы (ALT) как индикаторы повреждения печени (фиг. 6). Как видно на фиг. 6 А, как антисыворотка против IL-18, так и растворимые рецепторы TNF существенно снижали индуцируемые СоnА уровни ALT в сыворотке по сравнению с контрольной инъекцией одного носителя (апирогенного физиологического раствора). Совместное введение растворимого рецептора TNF и антисыворотки против IL-18 приводит к полному ингибированию вызываемого СоnА повреждения печени. Как видно на фиг. 6 В, у мышей, инъецированных PEA, нейтрализация либо ингибиторами TNF-,либо антителами против IL-18 приводит к 93 и 83% ингибированию уровней ALT в сыворотке, соответственно. Комбинированная блокада тем и другим приводит к 99%-ной защите. Пример 6. Уровни IL-18-связывающего белка в плазме повышены у пациентов с хронической болезнью печени. Измеряли уровни IL-18BP в плазме у 133 пациентов с хронической болезнью печени (CLD) различной этиологии и 31 здорового человека (контроль) методом специфического ELISA с использованием моноклональных антител к IL-18. Уровни IL-18BP в плазме были существенно выше у больных CLD (12,1 + 0,89 нг/мл; среднееSEM), чем у здоровых людей (4,960,43 нг/мл, р 0,001). Пациенты с циррозом имели значительно более высокие уровни, чем пациенты CLD без цирроза (19,231,28 нг/мл, n = 67, против 6,490,51, n = 66,р 0,001). Пациенты в стадии В по классификаци Child-Pugh имеют более высокие уровни IL-18BP, чем пациенты в стадии А (22,482,44 нг/мл против 9,571,25 нг/мл, р 0,001). Однако нет существенного различия между стадиями Child В и С (22,482,44 нг/мл против 20,624,75 нг/мл, р = 0,7). Уровни IL18BP в плазме положительно коррелировали с GOT, билирубином и скоростью оседания эритроцитов. Обнаружена отрицательная корреляция с протромбиновым временем. Как вывод, результаты показывали, что уровни IL-18BP в плазме при CLD повышаются и коррелируют с тяжестью болезни независимо от этиологии болезни. Несмотря на эндогенный антагонист провоспалительного IL-18 оказывается, что повышенных уровней IL-18BP недостаточно для противодействия бесчисленным медиаторам провоспаления при CLD. Пример 7. Подавление алкогольного гепатита с помощью IL-18BP. Четырем группам крыс (5 на группу) путем внутрижелудочной инъекции в течение 4 недель давали этанол и корм, содержащий кукурузное масло. Контрольным животным этанол заменяли декстрозой изокалорийно. Крыс инъецировали ежедневно мышиным IL-18BP (1 мг/кг) или физиологическим раствором. Анализ патологии осуществляли на срезах печени и проводили измерения содержания в сыворотке ферментов печени, TNF-, Fas-лиганда и IFN-. У крыс, которым давали этанол и инъецировали им физиологический раствор, наблюдали некро-воспалительное повреждение и экспрессию ферментов печени,TNF-, Fas-лиганда и IFN-. Крысы, инъецированные IL-18BP, защищены от некровоспалительного повреждения, и уровни ферментов печени, TNF-, Fas-лиганда и IFN- у них существенно снижены (90%). Пример 8. Подавление гепатита, индуцированного Con А, с помощью IL-18BP. Мышам Balb/c вводили 12 мг/кг конканавалина A (Con A) вместе с инъекцией мышиного IL-18BP(1 мг/кг) за 2 ч до введения Con А или без нее и затем ежедневно. Повреждение печени оценивали, определяя уровни в сыворотке ферментов печени, TNF-, Fas-лиганда и IFN-. Сравнивали гистопатологию печени таких мышей и мышей, обработанных только конканавалином А. Предварительная обработка IL-18BP существенно снижает сывороточные уровни ферментов печени и TNF- с отсутствием доказательств воспаления при гистопаталогической проверке по сравнению с контрольными животными, не обработанными Con A. Часть II. Примеры 9 и 10, относящиеся к применению ингибиторов IL-18 при артрите. Пример 9. Получение IL-18BP с меткой His (IL-18BP-His tag).- 21005583 Для эксперимента, подробно описанного ниже в примере 10, в клетках СНО получали рекомбинантный IL-18BP человека, содержащий метку из 6 остатков his (r-hIL-18BP-His tag), и очищали, как описывается у Kim et al., 2000. Рекомбинантный белок очищали до степени свыше 95% и обнаруживали его биологическую активность in vitro и in vivo с высокой аффинностью к его лигандам. Получение рекомбинантных белков в других эукариотических системах без меток или с метками,облегчающими очистку рекомбинантных белков, известно специалистам в данной области техники. Хорошо известные способы доступны для конструирования соответствующих векторов, содержащих ДНК,кодирующую IL-18BP и подходящих для трансфекции эукариотических клеток с целью получения рекомбинантного IL-18BP. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую IL-18BP (см., например, Novick etal., 1999 г.), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. С другой стороны, такую ДНК можно получить методом ПЦР с подходящими смысловыми и антисмысловыми праймерами. Затем полученные конструкции ДНК встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными в технике (Maniatis, 1982 г.). Пример 10. Блокада эндогенного IL-18 на мышиной модели артрита. Методы Индукция вызываемого коллагеном артрита (CIA).CIA индуцировали у самцов мышей DBA/1 (возраст 8-12 недель) путем иммунизации нативным бычьим коллагеном типа II (СII), как описано ранее (Plater-Zyberk et al., 1995 г.). С 25 дня после иммунизации мышей ежедневно проверяли на начало заболевания. Обработка rhIL-18BP-6his. Обработку мышей DBA/1, иммунизированных СII, начинали при первом появлении клинических признаков болезни. Рекомбинантный IL-18BP человека, содержащий метку из 6 гистидинов (rhIL-18BP6his), использовали для нейтрализации эндогенного IL18 у мышей, обработанных коллагеном. rhIL18BP-6his инъецировали интраперитонеально (i.p.) ежедневно в течение 7 (семи) дней при 5 различных концентрациях - 10, 3, 1, 0,5 и 0,25 мг/кг/инъекцию. Контрольные мыши в качестве плацебо получали только носитель (0,9% раствор NaCl). Оценка развития заболевания. Клиническая оценка (клинические показатели). При первом появлении клинических симптомов мышей каждый день проверял сотрудник, связанный с лечением. Каждую конечность оценивали на тяжесть заболевания (шкала 0-3,5, максимальное число оценок = 14/мышь). На лапах, на которых признаки болезни появились первыми, измеряли развитие отека (воспаления) с использованием точных циркулей (Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik). Развитие болезни оценивали ежедневно в течение 8 дней от начала, после чего мышей умерщвляли,и собирали лапы для гистопаталогической проверки. Гистологическая оценка эрозий хряща и оценка микровоспаления. По окончании экспериментов, т.е. на 8 день после начала болезни, мышей умерщвляли и отсекали лапы, на которых признаки болезни появились первыми. Суставы фиксировали, декальцинировали и заливали парафином. Делали стандартные срезы и окрашивали гематоксилином/эозином/сафранином О. Каждый сустав оценивали 2 исследователя, не знакомых с протоколом обработки (отсутствие разрушения хряща или кости = 0; локализованные эрозии хряща = 1-2; более обширные эрозии = 3; общее разрушение хряща и наличие эрозии кости = 4). Конечные оценки для каждой мыши являлись средним из результатов для всех оцененных суставов. Оценку микровоспаления под микроскопом или синовит осуществляли по шкале от 0 до 4 следующим образом: отсутствие воспаления = 0; небольшое утолщение слоя выстилки и/или немного инфильтрирующих клеток в слое под выстилкой = 1-2; утолщение слоя выстилки и/или более выраженный приток клеток слоя под выстилкой = 3; наличие клеток в синовиальном пространстве и синовия, сильно пронизанного многими инфильтрирующими клетками = 4. Определение антиколлагеновых антител. Антитела против бычьего коллагена типа II проверяли с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Измеряли титры IgGl и IgG2a. Вкратце, планшеты сенсибилизировали 10 мкг бычьего коллагена и затем блокировали сайты неспецифического связывания 0,1 М раствором этаноламина (Sigma). Добавляли сериные разведения (1:2) сывороток и затем инкубировали с изотипспецифической козьей антимышиной пероксидазой (Southern Biotechnology Assosiates, Birmingham, Al., USA) и субстратом (5-аминосалициловая кислота, Sigma). Планшеты считывали при 492 нм. Титры выражали как среднее SD разведение, которое дает значение в половину от максимального. Анализы IL-6. Уровни IL-6 определяли коммерческим ELISA (системы RD, Миннеаполис, Миннесота, США). Биологическую активность IL-6 определяли путем анализа пролиферации с использованием клеток В 9. Вкратце, в круглодонные лунки титрационнго микропланшета помещали 5103 клеток В 9 в 200 мкл на лунку среды RPMI 1640 с 5% FCS и инкубировали в течение 3 суток с использованием в качестве стандарта рекомбинантного IL-6 человека (системы RD, Миннеаполис, Миннесота, США). По окончании инкубации добавляли 0,5 мкКи 3[Н]тимидина (NEN-Dupont, Бостон, Миннесота, США) на лунку. Через- 22005583 три часа клетки собирали и определяли включение тимидина. Предел обнаружения для биоанализа на IL6 составлял 1 пг/мл. Статистический анализ. Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна-Уитни с использовванием программы статистического анализа SigmaStat и программы GraphPad Prism. Результаты. Мышиную экспериментальную модель CIA (коллагениндуцированный артрит) использовали для оценки эффективности IL-18BP как средства для лечения артрита. Введение коллагена и неполного адъюванта Фрейнда мышам DBA/1 вызывает развитие эрозивного воспалительного артрита и представлет идеальную возможность исследования лечебного потенциала IL-18BP. С этой целью эндогенный IL-18 нейтрализуют с использованием IL-18BP и оценивают действие на различные патогенные параметры. Исследование проводят в зависимости от дозы. Три группы мышей DBA/1 с коллагениндуцированным артритом обрабатывают терапевтически (т.е., после начала заболевания) 5 дозами IL-18BP i.p. (интраперитонеально). IL-18BP в концентрациях 10, 3, 1, 0,5 или 0,25 мг/кг вводят при первых клинических признаках болезни. Инъекцию физиологического раствора (хлорида натрия, NaCl) используют в качестве контроля. Кроме того, вводят i.p. 10000 ME интерферона(IFN-) для оценки влияния IFN на данной экспериментальной модели артрита. Влияние на тяжесть заболевания контролируют ежедневно, оценивая визуально каждую отдельную лапу, как описано выше. Мышей умерщвляют на 8 день от начала заболевания. Оценивают следующие показатели:- визуальные клинические показатели (каждую лапу, шкала 0-3,5) (фиг. 7, А и В);- опухание/отек суставов (в мм, измеренные циркулем) первой заболевшей лапы, при условии, что это задняя лапа (фиг. 8);- показатели эрозии первой заболевшей лапы (разрушение хряща - 0-4, фиг. 10);- при гистологическом анализе лапы, ставшей первой, в которой развился артрит (фиг. 11);- уровни антител против коллагена типа II (фиг. 12);- уровни IL-6 (фиг. 13). Клиническая тяжесть заболевания. Как видно на фиг. 7, А и В, клиническая тяжесть заболевания существенно снижается в группах,обработанных 1 мг/мл (Р 0,01) и 0,5 мг/мл (0,01 Р 0,05) rhIL-18BP. Мыши, получающие низкую дозуrhIL-18BP (0,25 мг/мл) или высокую дозу в 10 мг/мл, имеют клиническую оценку, подобную оценки группы плацебо. Доза 1 мг/мл IL-18BP эффективна приблизительно так же, как интерферон(обозначенный на фиг. 7 А как IFNb). Воспаление и опухание (отек) суставов. Макровоспаление (опухание) исследовали, измеряя отек лап от дня 1 после начала болезни до дня 8 окончания эксперимента. Результаты приводятся на фиг. 8, А и В. Эффективными дозами IL-18BP являлись 1, 3 и 10 мг/кг. Введение более низких доз не оказывает благоприятного действия на опухание лап. Как видно на фиг. 8, А и В, интерферон(IFNb) при концентрации 10000 ME показывает благоприятное действие на опухание лап. Микросиновит проверяют по окончании эксперимента на гистопатологических срезах и выражают как показатели по шкале ("показатель синовита"). Результаты по воспалению (отеканию) и показатели синовита сведены в табл.1. Хотя обработка rhIL-18BP при дозировках 1 и 3 мг/кг приводит к тенденции уменьшения опухания, обработка любой дозой IL-18BP оказывает только ограниченное действие на воспалительный синовит (табл.1). Таблица 1. Влияние обработки IL-18BP на воспаление суставов На фиг. 9 показано, что число лап, пораженных болезнью, уменьшается после введения IL-18BP. В частности, терапевтические инъекции IL-18BP при дозах 1 и 0,5 мг/кг снижали число лап, вовлекаемых в болезнь, что показывает, что блокада IL-18 in vivo задерживает распространение артрита на другие суставы. Обработка 1 и 0,5 мг/кг IL-18BP способна даже вызвать нормализацию пораженных артритом суставов. Защита от разрушения суставов. Обработка мышей rhIL-18BP приводит к защите суставов от разрушения (фиг. 10). Система полуколичественной оценки показывает, что по эрозии кости видно зависящее от дозы защитное действие,- 23005583 существенное при 10 и 3 мг/кг (Р 0,05, фиг. 10). У мышей, получающих 1 мг/кг rhIL-18BP, эрозия меньше, чем у мышей, получающих только носитель. Защитное действие не обнаружено при дозах 0,5 мг/кг и 0,25 мг/кг. Представлял интерес тот факт, что защитное действие на суставы при дозах 3 и 10 мг/кг rhIL18BP сравнимо и даже более выражено, чем благоприятное действие 10000 ME интерферона(IFN-). На фиг. 11 показана гистология здорового (А) и больного (В) сустава в сравнении с суставом животного, обработанного IL-18BP (С). Срезы сделаны по окончании эксперимента с лап первых, где развился артрит. В суставе мыши, пораженной артритом, выявляется тяжелый деструктивный артрит с исчезновением хряща и эрозиями и многочисленными инфильтрирующими клетками в воспаленном синовии. В суставе мыши, обработанной rhIL-18BP, хрящ выглядит почти здоровым, несмотря на наличие клеток зоны воспаления в синовиальном пространстве. Хрящевая ткань не только представлена в большем количестве, но и выглядит более гладко. Обработка анти-IL-18 модулирует уровни антител против коллагена типа II. У мышей CIA в кровотоке повышены уровни антител IgG1 и IgG2a против коллагена типа II. Антитела изотипа IgG1 ассоциировались с заболеваниями, опосредуемыми ТН 2, в то время как антитела изотипа IgG2a и изотипа IgG2b ассоциируются с заболеваниями, опосредуемыми ТН 1. Определяют изотипы антител IgG1 и IgG2a против коллагена типа II (СII) в сыворотке животных,обработанных IL-18BP (фиг. 12). Содержание изотипов IgG1 и IgG2a анти-CII не изменяется существенно на 4 или 8 день (D4, D8) клинической болезни. Однако после 8 дней обработки rhIL-18BP наблюдается уменьшение отношения IgG1/IgG2a в 2,6 и 3,4 раза при дозах 1 и 3 мг/кг, соответственно. На фиг. 12 отражен эксперимент, при котором используют 3 мг/кг. По существу, такие же результаты получают с использованием 1 мг/кг rhIL-18BP. Пониженное отношение IgG1/ IgG2a антител против СII указывает на пониженную концентрацию антител против коллагена типа II изотипа IgG2a и повышенную концентрацию антител против коллагена типа II изотипа IgG1, что наводит на мысль, что в данной модели артрита имеется смещение в сторону заболевания, опосредуемого ТН 2. Снижение уровней IL-6 после нейтрализации IL-18. Для того чтобы получить представление о действии блокады IL-18, измеряли содержание IL-6 в сыворотке животных, обработанных IL-18BP. На фиг. 13 показано, что содержание биологически активногоIL-6 существенно уменьшается у животных, получающих IL-18BP, при всех измеренных дозах, т.е. 1, 3 и 10 мг/кг, так же, как в случае интерферона(IFNb). Иммунноактивные уровни IL-6, измеренные в сыворотке животных, обработанных 3 мг/кг rhIL-18BP, существенно ниже (Р 0,0023), чем у животных, обработанных физиологическим раствором. Сывороточные уровни IL-6 у больных животных, обработанных 1, 3 или 10 мг rhIL-18BP или 10000 ME IFN-, схожи с уровнями в нормальной мышиной сыворотке(NMS), полученной от здоровых животных, т.е. от животных, не имеющих воспалительного заболевания. Полученные результаты показывают, что IL-18 регулирует уровни IL-6 в начале заболевания. Так как IL-6 являлся маркером воспаления, такие результаты показывают, что обработка больных мышей IL18BP снижает воспаление у животного. Из описанных выше экспериментов можно сделать следующие выводы:- введение IL-18BP уменьшает клиническую тяжесть артрита;- IL-18BP ингибирует дальнейшее развитие или распространение болезни;- после лечения IL-18BP снижались сывороточные уровни IL-6 и уменьшается отношениеIgGl/IgG2a. Данные, представленные выше, показывают, что нейтрализация биологической активности IL-18 после начала заболевания представляет собой противоревматическую терапию, модифицирующую заболевание. Результаты четко показывают, что блокада IL-18 снижает клиническое развитие артрита и, что более важно, задерживает развитие разрушения хряща и костей. Следовательно, блокада IL-18 с помощью IL-18BP, антител против IL-18 или любым другим блокирующим IL-18 средством представляет собой новую противоревматическую терапию, модифицирующую заболевание. Приведенное выше описание конкретных вариантов воплощения изобретения показывает общий характер изобретения, так что другие специалисты, применяя имеющиеся знания, легко модифицировали и/или адаптировали такие конкретные варианты для разных применений без отхода от основной концепции, следовательно, такие адаптации и модификации должны быть включены и предназначены для включения в замысел и пределы эквивалентов описанных вариантов. Следует иметь в виду, что фразеология или терминология, используемые в данном описании, имеют целью описание, а не ограничения. Часть III. Примеры 11 и 12, относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника. Пример 11. Экспрессия IL-18BP эндотелиальными клетками и макрофагами во время активной болезни Крона.- 24005583 Сбор образцов. Образцы интестинальных слизистых тканей извлекают при иссечении образцов, взятых у пациентов с CD или UC. Включают четырнадцать пациентов с CD (трех мужчин и одиннадцать женщин), средний возраст 37,8 лет (интервал 20-78 лет), длительность заболевания 8,3 года (интервал 1-21 год). У восьми пациетов болезнь локализована в подвздошной кишке и у шести - в ободочной кишке. Двенадцать пациентов принимают иммунодепрессивные средства. Диагноз CD поставлен с помощью гистопаталогический проверки и основан на следующих критериях: наличие язв, повышенное число клеток воспалительного инфильтрата и трансмуральное воспаление. Идентифицируют семь пациентов с активной CD и семь пациентов с неактивной болезнью. Существенных различий по возрасту, локализации болезни, полу,лекарственной терапии и длительности заболевания между пациентами с активной и неактивной CD не было. Средний возраст 5 пациентов с UC (трое мужчин и две женщины) 37,6 лет (интервал 30-44 года). У всех пациентов болезнь локализована в ободочной кишке, и всех лечили иммуннодепрессивными средствами. Средняя продолжительность заболевания 4 года (интервал 1-9 лет). Контрольные образцы берут у 5 пациентов, подвергающихся резекции по поводу расстройств, не связанных с IBD (трое мужчин и две женщины). Средний возраст этой группы 55,2 года (интервал 24-76 лет). У всех пациентов болезнь локализована в ободочной кишке. Полуколичественная ОТ-ПЦР для IL-18 человека и IL-18bp. Полную РНК экстрагируют из замороженных образцов интестинальной ткани пациентов с CD, сUC или контроля. Экстракцию РНК осуществляют с использованием тризола (Gibco) согласно рекомендациям изготовителя. Полученные образцы оценивают количественно, измеряя поглощение при 260 нм. Целостность РНК анализируют методом электрофореза на 1% агарозных гелях. Синтезируют кДНК из 1 мкг полной РНК с использованием системы обратной транскрипции Promega согласно схеме изготовителя. Реакции ПЦР проводят в общем объеме 50 мкл в присутствии 1 Е ДНК-полимеразы AmpliTaq (PerkinElmer, Roche, США), 2,5 мМ dNTP (Amersham, США) и 50 пмоль прямых и обратных праймеров ПЦР. Реакционные смеси инкубируют в термоячейке РТС-200 Peltier Effect (MJ Research, США) в следующих условиях: денатурация - 1 мин при 94 С, ренатурация - 1 мин при 55 С и растяжение - 1 мин при 72 С. Определяют оптимальное число циклов для IL-18BP, IL-18 и -актина до насыщения полос (соответственно, 31, 28 и 25). Создают следующие праймеры ПЦР на основе опубликованных последовательностей(AF110799, D49950, Х 00351): IL-18, обратный - 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; прямой -5'GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18BP, прямой - 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; обратный 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; -актин, обратный - 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; прямой - 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Для того чтобы исключить амплификацию геномной ДНК, загрязняющей образцы, реакции ПЦР проводят в отсутствие матрицы кДНК. Продукты ПЦР(10 мкл) анализируют на 1% агарозных гелях при электорофорезе в буфере 1TAE. Размер продуктов ПЦР подтверждают путем сравнения с цепью длиной 1 т.п.н. (Gibco) после окрашивания гелей. Определяют относительное количество полос, окрашенных этидийбромидом в УФ-свете с использованием аналитического программного обеспечения Kodak Digital Sciences, и результаты приводят в виде соотношения гена-мишени (hIL-18BP, hIL-18) и обязательных генов (h-актин). Получение моноклональных антител, направленных против hIL-18 ВР. Мышам BALB/c подкожно в четыре конечности, а также в загривок вводили 50 мкг изоформы rhIL18BP-6his (выделенного в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка, Interpharm Laboratories,Nes Ziona, Израиль) в PBS с адъювантом (эмульсия MPL+TDM, RIBI Immunochem Research, Inc.) в дни 0,7 и 28. Через 4 дня после 3-й иммунизации получают лимфоузлы и гидролизуют 2,4 мкг/мл коллагеназы(коллагеназа IV, Worthington, Biochemical Corp.) и 0,1% ДНКазы (Sigma). Затем выделенные клетки сливают с миелоидными клетками Sp2/0 с использованием ПЭГ-1000 (FLUKA). Клетки ресуспендируют вDMEM-F12, 10% FCS (Gibco) в присутствии HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и распределяют в 96-луночные планшеты в концентрации 510-4 клеток/мл. Образцы супернатантов гибридомных культур скринируют на присутствие реакционноспособных антител при анализе прямым скринингом. Для этого планшеты для ELISA сенсибилизируют козьими антимышиными антителами F(ab')2 (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Швейцария), добавляют супернатанты гибридомных культур и затем биотинилованный rhIL-18BP-6his (выделенный в чистом виде из клеток COS, как описывается в Novick et al.,1999 г.) с добавлением или без rhIL-18 (выделенного в чистом виде из рекомбинантной E.coli, Serono(OPD) (Sigma). Отбирают ненейтрализующие антитела и субклонируют. При таком исследовании использовали мышиные моноклональные антитела IgGl 95-H20. Иммуногистохимические исследования локализации клеток, положительных в отношении IL-18bp. Образцы ткани быстро замораживают и хранят при -80 С. Получали серийные криостатные срезы(10 мкм), заключают в среду на покрытых поли-L-лизином стеклянных пластинах Superfros/PlusIL-18BP человека анализируют методом иммуногистохимии с использованием Mab 95-H20. После крат- 25005583 кой повторной гидратации в PBS срезы предварительно инкубируют в течение 30 мин в PBS с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (FSC) (Cansera, Онтарио, Канада), 1% сыворотки человека (сыворотка АВ+, Transfusion Center, Аннемасс, Франция) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA)(Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Активность эндогенной пероксидазы блокируют, помещая пластины в раствор PBS с 2% FSC, 1% сыворотки человека, 0,5% BSA и 1% пероксида водорода (Н 2 О 2) (Fluka,Швейцария) на 1 ч. После промывки PBS срезы инкубируют в течение ночи с неразведенным культуральным супернатантом Mab 95-H20. После еще одной промывки PBS срезы инкубируют в течение 1 ч с биотинилированными козьими антимышиными антителами (Jackson Immuno Research, Milan analytica,Швейцария) (5 мкг/мл) в PBS, содержащем 0,5% BSA. Чувствительность к окрашиванию повышали путем инкубации с комплексом авидинDН/биотинилированного HRP (Vectastatin Elite ABC Kit, VectorLaboratories, Калифорния, США) в течение 30 мин. Затем пластины промывают PBS и проявляют с использованием раствора 30% Н 2 О 2, 3,3-амино-9-этилкарбазола (АЕС) (Sigma) и N,N-диметилформамида(Merck) в ацетатном буфере, рН 5. После контрокрашивания гематоксилином (Sigma) срезы покрывают глицерином и используют покровные стекла. В качестве изотипического контроля используют мышиные антитела IgGl (система R и D). Для того чтобы идентифицировать клеточную локализацию IL-18BP человека, проводят два иммуногистохимических исследования с окрашиванием на срезах слизистой оболочки кишечника. После повторной гидратации в PBS в течение 10 мин срезы предварительно инкубируют в PBS с добавлением 2%FCS, 1% сыворотки человека и 0,5% BSA. Для солокализации с эндотелиальными клетками срезы инкубируют в течение ночи с биотинилированными Mab 95-H20 (20 мкг/мл), смешанными с мышиными античеловеческими CD31, конъюгированными с FITC (1:50) (Pharmingen, Калифорния, США), в PBS/0,5%BSA. Для солокализации с макрофагами срезы инкубируют в течение ночи с биотинилированными Mab 95-H20 (20 мкг/мл), смешанными с античеловеческими CD68, конъюгированными с FITC (1:25) (Dako,Дания). После промывки в PBS в течение 1 ч добавляют стрептавидин Texas-Red (Southern BiotechnologyAssociates, AL, США). Пластины снова промывают, срезы покрывают мовиолом, и применяют покровные стекла. В качестве изотипического контроля используют биотинилированные мышиные антителаIgGl (Pharmingen), а затем стрептавидин Texas-Red. Клеточная культура. Культивировали эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) (Clonetics Corp., СанДиего, Калифорния) с использованием среды для выращивания эндотелиальных клеток (EGM) с добавлением рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (hEGF) (10 нг/мл), гидрокортизона (1 мкг/мл), гентамицина и амфотерицина В (50 мкг/мл), экстракта бычьего головного мозга (ВВЕ) (3 мг/мл) и 2% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Clone-tics Corp., Сан-Диего, Калифорния), согласно рекомендациям изготовителя. В чашки с культурами тканей предварительно наносили слой фибронектина человека (10 мкг/см 2) (Boehringer, Маннгейм). Клетки инкубировали во влажной камере с 5% СОr, и эксперименты осуществляли с использованием клеток HUVEC в 3-ем пассаже. Клетки HUVEC обрабатывали IL-1 человека (10 нг/мл), TNF (10 нг/мл) и IFN (20 нг/мл) (системы R и D, Германия) в течение 24 ч. По окончании периода культивирования клетки собирали, выделяли ДНК и подвергали ОТ-ПЦР для анализа транскриптов мРНК IL-18BP и IL-18. Супернатанты собирали, и в них анализировали экспрессию белка IL-18BP и IL-18 методом ELISA. Линию моноцитов человека ТНР-1 поддерживали в суспензионной культуре в среде RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием FCS, L-глутамина (2 мМ), пенициллина-стрептомицина (10 Е/мл) (Gibco BRL, Life Technologies) и -меркаптоэтанола (50 мкМ) (Fluka). Клетки инкубировали во влажной камере с 5% СО 2 и пассировали при 1:10 каждые 5 дней. За три дня до эксперимента моноциты человека были дифференцировании при плотности 0,4106 клеток/мл витамином D3 (80 нМ) (BiomolResearch Laboratories, США) и их оставляли для прикрепления. После дифферецировки к клеточной культуре добавляли LPS (100 нг/мл) (Calbiochem), IL-1 человека (10 нг/мл), TNF (10 нг/мл) и IFN (20 нг/мл). Через 48 ч суспернатанты собирали и в них определяли экспрессию IL-18BP и IL-18 методомELISA. Измерение продукции IL-18BP и IL-18 человека. Наличие IL-18BP оценивали методом ELISA в бесклеточных супернатантах HUVEC, нестимулированных и стимулированных в течение 24 ч смесью цитокинов (IL-1, TNF, IFN), а также клеточной линии ТНР-1, нестимулированной и стимулированной в течение 24 ч смесью цитокинов (LPS, IL-1,TNF, IFN). Для этого на планшеты в течение ночи наносили иммобилизованные Маb (клон 657.27 в количестве 0,5 мкг на 100 мкл на лунку, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Израиль), направленные против rhIL-18BP (изоформа а). Затем определяли растворимый rhIL-18BP с использованием кроличьих поликлональных антител (разведение 1/10000), направленных против rhIL-18BP-6his (выделен в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Израиль), с последующей инкубацией с аффинным очищенным козьим антикроличьим IgG, конъюгировнным с пероксидазой (разведенным 1/20000) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Швейцария). Иммобилизованные Mab, а также кроличьи поликлональные антитела тестировали методом вестерн-блоттинга для подтверждения- 26005583 специфичности к IL-18BP. Рекомбинантный rhIL-18BP-6his использовали в качестве стандарта. Чувствительность ELISA 100 пг/мл. Параллельно определяли количество IL-18 с использованием набора дляELISA для IL-18 человека (MBL, Immunotech). Чувствительность ELISA составляла 12,5 пг/мл. Экспрессия rhIL-18BPa-His6 в клетках СНО. Рекомбинантный IL-18BP человека (rhIL-18BPa, метка His6) выделяли в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка (Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Израиль). Результаты. Экспрессия транскриптов мРНК IL-18BP в интестинальных биоптатах. Анализ экспрессии мРНК IL-18BP осуществляли методом ОТ-ПЦР в гомогенатах тканей полученных при операции образцов ободочной кишки пациентов с активной CD или неактивной CD или с UC и без воспаления тканей кишечника (фиг. 14). Транскрипты IL-18BP и актина обнаруживали во всех испытанных интестинальных гомогенатах. Подобным образом, транскрипты IL-18 обнаруживали во всех гомогенатах тканей в случае CD, UC или контроле без IBD (фиг. 14 А). Отношение IL-18BP или IL-18 к уровням контрольной мРНК актина показывает значительное возрастание (как описано ниже) количества транскриптов в биоптатах как IL-18BP, так и IL-18, полученных у пациентов с активной CD по сравнению с биоптатами пациентов с неактивной CD, UC или контроля без IBD (фиг. 14, В и С). Такие данные показывали, что IL-18BP активируется в ткани слизистой оболочки во время активной CD, и являлись первым доказательстовом того, что уровень экспрессии IL-18BP четко отличает активную CD от неактивной CD, UC и контроля без IBD. Статистический анализ экспрессии транскриптов мРНК IL-18BP в интестинальных биоптатах. Анализ дисперсии осуществляли, собирая вместе все доступные данные. Отклик ясно показывает статистический выброс, относящийся к результатам для одного из пациентов из группы с активной CD(очень высокое отношение OD для IL-18, а именно 16252, и низкое отношение OD для IL-18BP, а именно 1058). Единственная и очень атипичная пара измерений не дает возможности непризнания выборки беспристрастной по модели ANOVA (величина р по критерию Шапиро-Уилкса для нормальности остатков 0,0001). Поэтому решено игнорировать указанную пару измерений при статистическом анализе. Используемая модель ANOVA принимает в расчет фактор группы (контроль, активная CD, неактивная CD и UC), белок (IL-18 или IL-18BP) и число пациентов (23 пациента). Имеется значительное различие в группе (величина р 0,0001). Также интересно отметить, что различие отношения OD междуIL-18 и IL-18BP не существенно (величина р = 0,369). Кроме того, выполнена также корреляция между экспрессией IL-18 и IL-18BP. Коэффициент корреляции между IL-18 и IL-18BP равен 0,67, что предполагает наличие строгой связи между отношением OD, измеренным для IL-18 и IL-18BP. Далее, для результатов, касающихся эффекта группы, использовали метод Scheffe для сравнения различных групп. Можно сделать вывод, что отношение OD для активной CD существенно выше, чем для контроля ( + 3280), UC(+2590) и особенно неактивной CD ( + 4580) как для экспрессии IL-18, так и для экспрессии IL-18BP. Иммуногистохимическая локализация IL-18BP в тканях кишечника. Для того чтобы оценить клеточную экспрессию IL-18BP in situ, с использованием специфичесих моноклональных антител против hIL-18BP выполняли иммунногистохимические исследования на криостатных срезах, полученных из тканей кишечника пациентов с активной CD и контроля без IBD. Клетки,положительные в отношении IL-18BP, обнаруживались в собственной пластинке, слое ткани под слизистой оболочкой и в мышечной пластинке слизистой оболочки (не показано). Положительно окрашенные клетки, присутствующие в собственной пластинке и слое ткани под слизистой оболочкой, обладали обильной цитоплазмой, везикулярными сетевидными ядрами и морфологически напоминали тканевые макрофаги. В мышечной пластинке слизистой оболочки положительно окрашенные клетки имели обильную цитоплазму с открытым некоторое время просветом в середине, что предполагает положительное окрашивание капилляров, и морфологически напоминали эндотелиальные клетки. Крупные сосуды также специфически окрашивались моноклональными антителами против hIL-18BP. Существенное увеличение числа положительно окрашенных клеток, наблюдаемое в образцах, полученных у пациентов с активной CD, по сравнению с образцами, полученными в контроле без IBD, коррелирует с повышенной экспрессией IL-18BP, наблюдаемой при анализе методом ОТ-ПЦР. Смежные срезы инкубировали с соответствующим мышиным изотипическим контролем. Идентификация клеток, продуцирующих IL-18BP, в биоптатах слизистой оболочки. Клетки, положительные в отношении IL-18BP, присутствующие в воспаленных тканях кишечника,идентифицировали с использованием специфических маркеров макрофагов (анти-СD68) и эндотелиальных клеток (анти-СD31) (не показано). СD68-положительные клетки (зеленый цвет) и IL-18BPположительные клетки (красный цвет) обнаруживаются в собственной пластинке и слое ткани под слизистой оболочкой тканей кишечника при активной CD (не показано). CD31-положительные клетки (зеленый цвет) и IL-18 ВР-положительные клетки (красный цвет) обнаруживаются в слое ткани под слизистой оболочкой. Для того чтобы подтвердить, что макрофаги и эндотелиальные клетки также являютсяIL-18 ВР-позитивными, оба цвета - зеленый от анти-СD68 или анти-СD31 и красный от анти-IL-18BP анализировали вместе, при этом показали, что все клетки, связывающие антитела против IL-18BP, являлись или CD68-положительными, или CD31-положительными (оранжево-желтый цвет). Двойное иммун- 27005583 ное окрашивание показало, что макрофаги и эндотелиальные клетки являлись основным источником окрашивания IL-18BP в воспаленных тканях, полученных у пациентов с CD. Экспрессия мРНК IL-l8BP и белка эндотелиальными клетками. Для того чтобы исследовать способность эндотелиальных клеток человека продуцировать IL-18BP,а также подтвердить результат, полученный при иммунноокрашивании и ОТ-ПЦР на общих биоптатах,осуществляли дальнейшие эксперименты методом ОТ-ПЦР на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) (фиг. 15 А). Эндотелиальные клетки обрабатывали смесью цитокинов (hIL-1, TNF,IFN) и собирали через 24 ч для экстракции РНК и ПЦР-анализа. Отношение содержания IL-18BP к уровням контрольной мРНК актина свидетельствовало о возрастании через 24 ч количества транскриптов IL-18BP в обработанных клетках по сравнению с нестимулированными клетками. Кроме того, оказалось, что в эндотелиальных клетках, по-видимому, существенно экспрессируется мРНК IL-18BP. Также анализировали уровень мРНК IL-18BP и выявили его слабое повышение в обработанных клетках. Однако мРНК IL-18BP не экспрессировался в нестимулированных эндотелиальных клетках. Исследование методом ELISA культуральных супернатантов нестимулированных клеток (среда) иHUVEC, обработанных в течение 24 ч, показало, что белок IL-18BP присутствует как в среде, так и в стимулированных клетках, возрастая в 30 раз после 24-часовой стимуляции (фиг. 15 В). Экспрессия белка IL-18BP клеточной линией моноцитов (ТНР-1). Экспрессию IL-18 и IL-18BP анализировали в культуральных супернатантах нестимулированных и стимулированных дифференцированных клеток ТНР-1 методом ELISA (фиг. 15 С). В этом эксперименте пбыло выявлено усиление экспрессии IL-18BP после 48-часовой стимуляци LPS, hIL-l, TNF, IFN. Одновременно с этим после стимуляции повышается секреция IL-18 (фиг. 15 С). Резюме. В настоящем исследовании охарактеризована экспрессия и локализация IL-18BP в ткани слизистой оболочки пациентов с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом. С использованием схемы полуколичественной ОТ-ПЦР обнаружено, что количество транскриптов мРНК IL-18BP в биоптатах слизистой оболочки пациентов с активной болезнью Крона выше по сравнению с биоптатами пациентов с неспецифическим язвенным колитом и контроля без воспаления. Иммуногистохимический анализ биоптатов слизистой оболочки показал, что белок IL-18BP локализуется в эндотелиальных клетках и макрофагах, инфильтрирующих слизистую оболочку во время болезни Крона. Экспрессия IL-18BP эндотелиальными клетками и активированными макрофагами подтверждается в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) и клеточной линии моноцитов ТНР 1, стимулированных in vitro. После стимуляции указанные клетки секретируют биологически активный IL-18BP. Пример 12. Обработка ингибиторами IL-18 дает улучшения при экспериментальном колите. Материалы и методы. Мыши и индукция колита. Все эксперименты разрешены Комитетом по этике исследований на животных Амстердамского университета. Мышей BALB/c получали в Harlan Sprague Dawley Inc. (Хорст, Нидерланды). Мышей содержали в стандартных условиях и обеспечивали питьевой водой и кормом (AM-II 10 мм, Hope Farms,Нидерланды). Эксперименты проводили на самках мышей BALB/c в возрасте 8 и 10 недель. Колит индуцировали путем ректального введения двух 2-мг доз (с 7-дневным интервалом) 2,4,6-триниробензолсульфоновой кислоты (TNBS) (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури, США) в 40% этаноле (Merck, Дармштадт,Германия) с использованием винилового катетера, который вводили в анус на 3 см (10 мышей на группу). Во время инстилляции мышам давали наркоз с использованием изофлурана (дифторметиловый эфир 1-хлор-2,2,2-трифтор-этилизофлурана, Abbott Laboratories Ltd., Queenborough, Кент, UK), и после инстилляции их держали вертикально в течение 60 с. Контрольных мышей подвергали идентичной процедуре, но инстиллировали физиологический раствор. Всех мышей умерщвляли на 9 день после первого введения TNBS (т.е. через 48 ч после второго введения TNBS). Мышей обрабатывали интраперитонеально IL-18BP человека в 500 мкл 0,9% физиологического раствора.HIL-18BP является 6-кратно меченым гистидином рекомбинантным белком человека, полученным в экспрессирующей системе СНО. HIL-18BP биологически активен, так как ингибирует продуцированиеIFN в клеточной линии KG-1 и снижает продуцирование IFN клетками слезенки мыши (Kim et al.,2000). Оценка воспаления. Ежедневно регистрировали массу тела. После умерщвления собирали селезенки, каудальные лимфоузлы и ободочные кишки. Ободочную кишку удаляли через умеренный разрез и вскрывали в продольном направлении. После удаления фекального материала регистрировали массу во влажном состоянии дистального участка в 6 см и использовали в качестве показателя связанного с заболеванием утолщения интестинальной стенки. Затем ободочную кишку в продольном направлении разделяли на две части, одну из которых использовали для гистологической оценки.- 28005583 Гистологический анализ. Ободочные кишки, разделенные в продольном направлении, скатывали, фиксировали в 4% формалине и заливали парафином для обычной гистологии. Два исследователя, производившие обработку мышей слепым методом, проводили оценку следующих параметров: 1) процента пораженной площади, 2) гиперплазии фолликулярных агрегатов, 3) отека, 4) эрозии/изъязвления, 5) утраты крипты и 6) инфильтрации моно- и полиморфноядерных клеток. Процент пораженной площади и утрату крипты оценивали по шкале в интервале от 0 до 4 следующим образом: 0 - нормальное состояние; 1 - менее 10%; 2 - 10%; 3 - 1050%; 4 - свыше 50%. Эрозию определяли как 0, если эпителий без изменений, как 1 - в случае поражения собственной пластинки, как 2 - в случае поражения слоя ткани под слизистой оболочкой и как 3 - в случае, если изъязвления трансмуральные. Степень тяжести других показателей оценивали по шкале от 0 до 3 следующим образом: 0 - отсутствие; 1 - слабое проявление; 2 - умеренное и 3 - тяжелое. Такая шкала заключает в себе от 0 до 26 точек максимум. Гомогенаты ободочной кишки. Из ободочной кишки получали гомогенаты с помощью гомогенизатора тканей в 9 объемах буфера Гринбургера для лизиса (300 мМ NaCl, 15 мМ трис, 2 мМ MgСl2, 2 мМ тритона (Х-100), пепстатин А,лейпептин, апротинин (всех по 20 нг/мл), рН 7,4). Ткани лизировали в течение 30 мин на льду с последующим двукратным центрифугированием (10 мин, 14000 д). До использования гомогенаты хранили при-20 С. Клеточная культура и ELISA для определения цитокинов. Для получения суспензии клеток селезенки и каудальных лимфоузлов использовали сетчатые фильтры с фильтрующими ячейками (Becton/Dickinson Labware, Нью-Джерси, США). Клетки суспендировали в среде RPMI 1640 (BioWhittaker-Boehringer, Вервьерс, Бельгия), содержащей 10% FCS и ципроксин (10 мкг/мл) (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури, США). Клетки селезенки центрифугировали со стерильным фиколлом (Pharmacia, Упсала, Швеция), одноядерные клетки переносили в RPMI и проводили подсчет клеток в клеточной суспензии. Клетки общим числом 1105 на мышь инкубировали при трехкратном повторе в лунках в 200 мкл RPMI (BioWittaker Europe, A Cambrex Company, Вервьерс, Бельгия), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки стимулировали путем предварительного нанесения слоя антител против CD3 (концентрация 1:30; клон 145.2 С 11) и растворимых антител противCD28 (концентрация 1:1000; Pharmingen). Через 48 ч удаляли супернатанты и методом анализа ELISA измеряли концентрации IFN- (Pharmingen) и TNF- (RD systems, Абингдон, Объединенное Королевство). Проточная цитометрия. Выделенные клетки селезенки промывали буфером Facs (PBS, содержащим 0,5% BSA, 0,3 ммоль/л ЭДТК и 0,01% азида натрия) и оставляли на льду для выполнения оставшейся процедуры. Клетки (2.105 клеток на лунку, 96-луночный микропланшет с V-образными лунками, Grener B.V. labor techniek, Alpenaan de Rijn, Нидерланды) инкубировали со следующими антителами (mAbs): крысиными антимышинымиCD4, конъюгированными с Су-хромом (клон RM4-5), крысиными антимышиными CD69, конъюгированными с Fitc, и крысиными антимышиными CD25, конъюгированными с Fitc (Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния). Лимфоциты направляли с помощью переднего и бокового рассеивателя с использованием проточного цитометра FACScan в сочетании с программным обеспечением Facscan (Becton Dickinson,Mountain View, США) и отсчитывали 5000 клеток. Результаты выражали в процентах пропущенных клеток, положительных в отношении используемых mAbs. Статистический анализ. Величины приводятся как среднее и SEM для обработанной группы. Различия между группами анализируются с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Изменения массы со временем анализируются методом одностороннего дисперсионного анализа. Значимым считается Р 0,05. Для всех анализов используется статистическое программное обеспечение SPSS (SPSS Inc., Чикаго,США). Результаты.IL-18BP защищает от потери массы на мышиной модели колита. Для того чтобы исследовать роль IL-18 при экспериментальном колите и, в частности, защитное действие IL-18-связывающего белка (IL-18BP), у мышей BALB/c индуцировали TNBS-колит. Данная модель включает в себя локальное воздействие тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) в 40% этаноле. Она вызывает гиперчувствительную реакцию замедленного типа на гаптен(тринитрофенил)модифицированный аутоантиген, и реакция являлся реакцией типа Th1 с усиленным продуцированием провоспалительных цитокинов. Мышей ежедневно обрабатывали интраперитонеально (ip) IL-18 ВР человека или контролем. Ежедневные интраперитонеальные дозы в интервале от 12,5 до 50 мкг hIL-18BP не влияли на тяжесть заболевания (данные не приводятся). Однако использование дозы в 200 мкг hIL-18BP, вводимой интраперитонеально ежедневно, явилось эффективным для уменьшения потери массы в связи с индукцией заболевания.- 29005583 Как и ожидалось, интраректальная инстилляция TNBS приводит к диарее и истощению. Как видно на фиг. 16, животные в обеих обработанных группах теряли 15% от исходной массы на день 3. Однако в отличие от контрольных мышей, начиная с 4 дня после инстилляции TNBS, животные, обработанныеhIL-18BP, быстро восстанавливали начальную потерю массы, возвращаясь к исходной массе тела на день 8. У контрольных мышей второе введение TNBS в день 8 снова приводит к значительной потере массы,которое, по существу, предотвращается введением hIL-18BP. Введение hIL-18BP мышам, обработанным физиологическим раствором, эффекта не имеет (данные не приводятся). Следовательно, введение hIL18BP существенно ослаблял потерю массы, связанную с колитом, индуцированным TNBS (p0,05). Действие на параметры воспаления. На 10 день мышей умерщвляли и определяли массу последних 6 см ободочной кишки (фиг. 17 А). При TNBS-колите масса ободочной кишки возрастала по сравнению с массой ободочной кишки у мышей, обработанных физиологическим раствором. Такое возрастание массы существенно меньше у мышей, обработанных hIL-18BP (181,6 мг 11,4 по сравнению с 268 мг 27,3 у мышей, обработанных физиологическим раствором р 0,05. Ранее сообщалось, что TNBS-колит ассоциируется с повышенной миграцией клеток в каудальные лимфоузлы (Camoglio et al., 2000). Обработка IL-18BP снижала число клеток, проникающих в каудальный лимфоузел по сранению с числом клеток в каудальном лимфоузлеTNBS-мышей (мышей с TNBS-колитом), обработанных физиологическим раствором (фиг. 17 В). Изменения экспрессии СD69, являющиеся ранним маркером активации Т-лимфоцитов, определяли анализом Facscan (фиг. 17 С). Процент клеток селезенки CD4+, экспрессирующих CD69, у мышей, обработанных TNBS, составлял 11,4%, но у TNBS-мышей, обработанных hIL18-BP, процент CD4+/CD69+ составлял 7,3% (Р 0,05). Продуцирование цитокинов селезенкой, каудальными лимфоузлами и гомогенатами ободочной кишки. Для того чтобы исследовать действие hIL-18BP на способность Т-лимфоцитов осуществлять синтез провоспалительных цитокинов после активации Т-клеточного рецептора, выделяли клетки из каудального лимфоузла и селезенки и стимулировали их в течение 48 ч антителами против CD3/CD28. В супернатантах измеряли продуцирование IFN и TNF (фиг. 18). Не наблюдали существенных различий между продуцированием цитокинов у мышей, обработанных hIL-18BP, и контрольных мышей. Следовательно,нейтрализация IL-18 hIL-18BP не вызывает общего снижения способности Т-лимфоцитов реагировать на активацию Т-клеточного рецептора. Анализировали гомогенаты ободочной кишки на содержание в них цитокинов, определяя локальную продукцию цитокинов (фиг. 19). Не обнаружили различий в уровнях IFN в гомогенатах ободочной кишки TNBS-мышей и TNBS-мышей, обработанных hIL-18BP (134 пг/мл 7,8 и 139 пг/мл 23, соответственно). Однако уровни TNF в гомогенатах ободочной кишки мышей, обработанных hIL-18BP, существенно снижались - от 110 пг/мл 3 у TNBS-мышей до 59 пг/мл 2,7 у TNBS-мышей, обработанныхhIL-18BP. Гистологические результаты. Для того чтобы исследовать, влияло ли снижение параметров воспаления, опосредованное hIL-18BP,также и на гистологические показатели, выполняли гистопатологический анализ на парафинированных срезах. Общая оценка воспаления при гистологии значительно снижается для мышей, обработанных hIL-18BP,по сравнению с оценкой контрольных мышей (15,91,1 у необработанных мышей к 9,81,3 у мышей, обработанных hIL-18 ВР), главным образом, в результате снижения числа лейкоцитов, инфильтрирующих слизистую оболочку (р 0,05). Заметным результатом является полное отсутствие изъязвлений слизистой оболочки у мышей, обработанных hIL-18BP (p0,05). Результаты сведены в табл.2, приведенную ниже. Заметно почти полное предотвращение изъязвлений у мышей, обработанных hIL-18BP. Таблица 2 Различные показатели зоны колита у TNBS-мышей, обработанных физиологическим раствором или hlL-18BPa Данные приводятся как среднее + SEM по шкале 0-4, представлял значимое различие