Способы получения мембранных везикул
Номер патента: 5425
Опубликовано: 24.02.2005
Авторы: Ругг Кертис, Яо Дзенк-Юан, Хсу Ди-Хвей, Ле Пек Жан-Бернар, Лампарски Генри
Формула / Реферат
1. Способ приготовления иммуногенной мембранной везикулы, причем способ включает в себя выделение или очистку мембранной везикулы из биологического образца и взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с пептидом или липидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида или липида с антигенпрезентирующей молекулой на поверхности указанной мембранной везикулы.
2. Способ по п.1, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца, содержащего антигенпрезентирующие клетки.
3. Способ по п.2, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца, содержащего дендритные клетки человека.
4. Способ по п.1, включающий в себя стадию воздействия выбранной кислой среды на выделенные или очищенные мембранные везикулы до, во время или после взаимодействия указанных везикул с указанным пептидом или липидом.
5. Способ по п.1, где после взаимодействия везикулы подвергаются центрифугированию в градиенте плотности или диафильтрации для удаления несвязанного пептида или липида.
6. Способ по п.1, где пептид представляет собой рестриктированный петид класса I.
7. Способ по п.1, где пептид представляет собой рестриктированный пептид класса II.
8. Способ по п.1, где везикулы взаимодействуют со смесью пептидов.
9. Способ по п.8, где везикулы взаимодействуют с элюатом пептидов из клеток опухоли.
10. Способ по п.1, где антигенпрезентирующая молекула представляет собой молекулу CD1 и липид является выбранным из микробного липида, микробного гликолипида и липидного или гликолипидного антигена опухоли.
11. Способ по п.1, предназначенный для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса I, связанного с молекулой HLA класса I, причем способ включает в себя (i) воздействие на выделенную или очищенную мембранную везикулу выбранной кислой средой, (ii) взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса I в присутствии бета-2-микроглобулина при условиях, обеспечивающих образование комплекса пептида с молекулой HLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iii) сбор нагруженной мембранной везикулы.
12. Способ по п.11, где стадия (i) включает в себя воздействие на выделенные или очищенные мембранные везикулы среды при значении pH, находящемся в пределах между примерно 3 и 5,5, в течение менее чем 15 мин.
13. Способ по п.11, где стадия (ii) включает в себя взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с 0,005-50 мкг/мл рестриктированного пептида класса I в присутствии бета-2-микроглобулина.
14. Способ по п.1, предназначенный для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса I, связанного с молекулой HLA класса I, способ включает в себя (i) взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса I в отсутствие бета-2-микроглобулина, (ii) воздействие на смесь после стадии (i) выбранной кислой средой при условиях, обеспечивающих обмен пептида с любым эндогенным пептидом, с целью связывания с молекулой HLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, (iii) нейтрализацию среды для прекращения обмена и стабилизации комплекса, сформированного на стадии (ii), и (iv) сбор нагруженной мембранной везикулы.
15. Способ по п.14, где стадия (ii) включает в себя воздействие на смесь выбранной кислой средой при значении pH, находящемся в пределах между примерно 4 и 5,5 в течение менее чем 2 ч.
16. Способ по п.14, где стадия (i) включает в себя взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида класса I в отсутствие бета-2-микроглобулина.
17. Способ по п.11, где пептид выбран из антигена опухоли, антигена вируса, антигена паразита и антигена бактерии.
18. Способ по п.14, где пептид выбран из антигена опухоли, антигена вируса, антигена паразита и антигена бактерии.
19. Способ приготовления нагруженных пептидами мембранных везикул, включающий в себя
a) культивирование популяции антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток, при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул антигенпрезентирующими клетками, в частности дендритными клетками,
b) стадию обогащения или очистки мембранных везикул и
c) взаимодействие мембранных везикул с пептидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида с молекулой MHC на поверхности указанных мембранных везикул, с получением нагруженных пептидом мембранных везикул.
20. Способ приготовления нагруженных пептидом мембранных везикул, включающий в себя
a) получение популяции незрелых дендритных клеток,
b) культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,
c) стадию обогащения или очистки мембранных везикул и
d) взаимодействие мембранных везикул с пептидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида с молекулой MHC на поверхности указанных мембранных везикул, с получением нагруженных пептидом мембранных везикул.
21. Способ по п.19, где до или после стадии c) мембранные везикулы подвергаются воздействию выбранной кислой среды.
22. Способ по п.20, где до или после стадии d) мембранные везикулы подвергаются воздействию выбранной кислой среды.
23. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, причем способ включает в себя (i) получение биологического образца, содержащего дендритные клетки, (ii) выделение или очистку мембранной везикулы из указанного биологического образца, (iii) взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с пептидом или липидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида или липида с молекулой MHC или CD1 на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iv) введение мембранной везикулы со стадии (iii) субъекту для индукции иммунного ответа у указанного субъекта.
24. Способ по п.23, где антигенпрезентирующая молекула представляет собой молекулу CD1 и липид выбран из липида микроба, гликолипида микроба и липидного или гликолипидного антигена опухоли.
25. Способ приготовления фармацевтического продукта, содержащего иммуногенную мембранную везикулу и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где способ включает в себя (i) выделение мембранной везикулы из биологического образца, (ii) нагрузку указанной выделенной мембранной везикулы иммуногенным пептидом или липидом с получением иммуногенной мембранной везикулы, (iii) предпочтительно удаление несвязанного иммуногенного пептида или липида и (iv) взаимодействие иммуногенной мембранной везикулы с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
26. Способ по любому из пп.1-25, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца путем обработки указанного биологического образца с помощью центрифугирования в градиенте плотности.
Текст
005425 Настоящее изобретение относится к способам приготовления биологического материала для использования при различных экспериментальных, диагностических или терапевтических применениях,включая иммунотерапевтическое лечение или профилактику опухолей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам приготовления мембранных везикул (в частности, экзосом), которые высвобождаются различными типами клеток млекопитающих, включая диафильтрацию и/или центрифугирование в градиенте плотности. Настоящее изобретение также предусматривает новые способы для характеризации и анализа препаратов экзосом, которые могут использоваться в исследованиях для контроля качества в целях производства фармацевтического продукта, а также способы нагрузки мембранных везикул иммуногенными соединениями. Настоящее изобретение является пригодным для использования при получении препаратов фармацевтического качества из таких мембранных везикул и для полной характеризации указанных препаратов с целью использования на людях. Предпосылки изобретения Мембранные везикулы являются, по существу, сферическими везикулами, как правило, меньшими,чем 130 нм в диаметре, состоящими из двойного слоя липидов, содержащими цитозольную фракцию. Конкретные мембранные везикулы, более конкретно, производятся клетками из внутриклеточных компартментов путем слияния с плазматической мембраной клетки, что приводит к их высвобождению в биологические жидкости или в супернатант культуры клеток. Такие везикулы, как правило, упоминаются как экзосомы. Экзосомы имеют, более конкретно, размер примерно между 30 и примерно 120 нм,предпочтительно 50 и 90 нм, более конкретно примерно между 60 и 80 нм в диаметре, и преимущественно несут в себе мембранные белки (в частности, белки главного комплекса гистосовместимости, или другой белок, который непосредственно или опосредованно участвует в презентировании антигена). Кроме того, в зависимости от их происхождения, экзосомы содержат мембранные белки, такие как МНС I, MHC II, CD63, CD81 и/или HSP70, и не имеют эндоплазматического ретикулума или аппарата Гольджи. Более того, экзосомы, по существу, не содержат нуклеиновых кислот (например, ДНК или РНК). Высвобождение экзосом продемонстрировано на различных типах клеток и в различном физиологическом контексте. В частности, продемонстрировано, что экзосомы, высвобождаемые В-лимфоцитами,несут в себе молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II, которые играют роль в презентировании антигенов (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161). Подобным же образом продемонстрировано, что дендритные клетки производят экзосомы (то есть, декзосомы, Dex), с определенными структурными и функциональными характеристиками, играющие роль в опосредовании иммунного ответа, в частности, в стимуляции цитотоксических Т-лимфоцитов (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594). Также продемонстрировано, что клетки опухоли регулируемо секретируют определенные экзосомы (то есть, текзосомы, Тех), которые несут на себе антигены опухоли и способны к презентированию этих антигенов или к их передаче антиген-презентирующим клеткам (патентная заявка No. WO 99/03499). Также известно, что клетки мастоцитов накапливают молекулы во внутриклеточных везикулярных компартментах, которые могут секретироваться под воздействием сигналов (Smith and Weis, Immunology Today 17 (1996) 60). Следовательно, как правило, клетки испускают сигналы и общаются друг с другом посредством мембранных везикул, которые они высвобождают и которые могут нести в себе белки антигенов(или полипептиды, или пептиды), молекулы МНС или любые другие сигналы (цитокин, фактор роста, и тому подобное) со специфическими структурными и функциональными характеристиками, производимые в различных физиологических ситуациях. Эти везикулы, в частности экзосомы, таким образом,представляют собой продукт, являющийся объектом особого интереса для применения в диагностике,вакцинации или терапии, или для доставки молекул, представляющих интерес. Следовательно, было бы особенно интересно иметь эффективный способ, который может быть использован в промышленном масштабе, для приготовления мембранных везикул, совместимых с биологическим применением, в частности фармакологическим применением. Обычные способы для получения мембранных везикул (например, экзосом) включают в себя ряд различных стадий центрифугирования для отделения везикул от клеток или остатков клеток, присутствующих в культуральной среде. В этом отношении документы, упомянутые выше, по существу описывают приготовление везикул с помощью последовательных центрифугирований при 300 g, 10000 g и 70000 g или 100000 g, после которых полученный осадок повторно суспендируется до 1/1000 от ее исходного объема в солевом растворе с получением концентрированного раствора экзосом. Однако по ряду причин, эти способы являются, по существу, непригодными для клинических применений: 1) долгое время, 2) масштабирование и проверка в GMP окружении, 3) значительный риск загрязнения остатками клеток, 4) плохая воспроизводимость из-за разброса, связанного с человеческим фактором, 5) агрегация экзосом, полученных из осадка (высокая локальная концентрация экзосом в лепешке) и 6) низкое извлечение в конце обработки. Существует, следовательно, потребность в усовершенствовании способов приготовления мембранных везикул, пригодных для использования при промышленных ограничениях и дающих возможность получения препаратов везикул терапевтического качества.-1 005425 Заявка на международный патентPCT/FR 00/00105 описывает способы приготовления мембранных везикул с помощью хроматографических методик, таких как анионобменная хроматография и/или гель-проникающая хроматография. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к новым способам приготовления мембранных везикул с высокими выходами, высокого качества и в относительно короткие периоды времени. Настоящее изобретение также описывает способы характеризации (или анализа, или дозирования) препарата мембранных везикул, которые могут использоваться в фармацевтическом производстве для определения активности, фенотипа и/или количества везикул. Настоящее изобретение теперь дает возможность получения и характеризации клинически пригодных партий мембранных везикул с воспроизводимостью, малым разбросом, связанным с человеческим фактором, и с повышением качества продукта. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам удаления частиц, таких как гаптоглобин, из различных сред или композиций, к полученным композициям и средам и к их применениям. Настоящее изобретение также касается новых способов нагрузки мембранных везикул иммуногенными соединениями и их применений. Более конкретно один из аспектов настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием ряда стадий ультрафильтрации и/или стадии осветления, более конкретно, сочетания концентрирования и диафильтрации с помощью ультрафильтрации, предпочтительно с предварительным осветлением. Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием сочетания центрифугирования в градиенте плотности и ультрафильтрации, и/или стадии осветления, более конкретно, сочетания концентрирования и диафильтрации с помощью ультрафильтрации, предпочтительно, с предварительным осветлением, за которым следует центрифугирование в градиенте плотности. В конкретном аспекте способ по настоящему изобретению включает в себя центрифугирование в градиенте плотности с предварительной или последующей диафильтрацией. Способ настоящего изобретения может относиться к различным биологическим образцам, содержащим мембранные везикулы, включая биологическую жидкость, супернатант культуры, клетки лизата или предварительно очищенный раствор. В конкретном воплощении способ используется для получения(например, очистки или разделения, или выделения) мембранных везикул из биологического образца,обогащенного мембранными везикулами. Конкретный аспект настоящего изобретения заключается в способе приготовления мембранных везикул из биологического образца, включающем в себя: а. культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные везикулы, при условиях, делающих возможным высвобождение везикул,b. стадию накопления мембранных везикул и с. обработку указанного обогащенного биологического образца с помощью центрифугирования в градиенте плотности. В дополнительном предпочтительном воплощении клетки продуцирующие мембранные везикулы культивируют в культуральной среде с пониженным содержанием частиц, предпочтительно в среде, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Как будет продемонстрировано в этой заявке, использование такой среды дает возможность достижения повышенных выходов производства и/или более высоких уровней чистоты и качества. Стадия обогащения может включать в себя одну или несколько стадий центрифугирования, осветления, ультрафильтрации, нанофильтрации, аффинной хроматографии и/или диафильтрации. Более предпочтительно, стадия обогащения включает в себя осветление, и/или концентрирование, и/или диафильтрацию. Препарат экзосом может быть собран после стадии с) с помощью любых соответствующих средств,включая пипетирование, или с помощью иглы. В предпочтительном воплощении способ дополнительно включает в себя стерильную фильтрациюd) препарата после стадии с. Настоящее изобретение может использоваться для получения мембранных везикул из различных источников, включая мембранные везикулы, полученные с помощью антиген-презентирующих клеток(таких как макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты), клеток опухолей или любых других клеток,или линий клеток, продуцирующих везикулы, предпочтительно трансдуцированные для продукции антигенов. Это является, в частности, пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул, продуцируемых дендритными клетками, предпочтительно незрелыми дендритными клетками (то есть, декзосом). Более того, мембранные везикулы или соответствующие клетки могут быть сенсибилизированы по отношению к одному или нескольким антигенам до, во время или после приготовления. Более предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают в себя:- способ приготовления мембранных везикул, включающий в себя:b. культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, в частности дендритных клеток,при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, в частности, дендритными клетками, с. стадию накопления мембранных везикул и а. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности.- способ приготовления мембранных везикул, включающий в себя: а. получение популяции незрелых дендритных клеток b. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,с. стадию накопления мембранных везикул и d. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Как показано выше, дополнительная стадия сенсибилизации везикул (или полученных клеток) по отношению к одному или нескольким конкретным антигенам может быть введена в способ, либо перед стадией b) для сенсибилизации полученных клеток, либо после стадии b), для сенсибилизации непосредственно мембранных везикул. В этом отношении, настоящее изобретение описывает процедуру для непосредственной нагрузки экзосом, в частности для прямого введения иммуногенных соединений (таких как пептиды или липиды) в комплексы МНС на экзосомах, предварительно приготовленных и очищенных от культуры антигенпрезентирующих клеток. Способ в соответствии с настоящим изобретением является особенно предпочтительным для непосредственной нагрузки пептидов на комплексы МНС (класса I) на декзосомах, предварительно очищенных от культуры незрелых дендритных клеток. Как указано выше, нагрузка экзосом, полученных из дендритных клеток (декзосом), пептидами,связанными с HLA класса I или II, до сих пор достигалась с помощью опосредованной нагрузки, то есть,с помощью добавления терапевтического (антигенного) пептида (например, рестриктированного пептида опухоли класса I) (например, при 10 мкг/мл, в день 6) к культуре клеток, продуцирующих везикулы (например, дендритных клеток (DC), дифференцировавшихся из обогащенных моноцитами адгезивных клеток в присутствии GM-CSF и IL-4) (смотри, например, патент США 5846827 и цитируемые там ссылки). Предполагается, что DC поглощают экзогенные пептиды и при этом производят декзосомы с закреплением этих пептидов класса I на поверхности экзосомы. In vivo эксперименты с моделью Р 1 А опухоли мастоцитомы мышей показывают, что декзосомы, продуцируемые таким образом, вызывают антиопухолевые иммунологические ответы, которые приводят к регрессии опухоли. Декзосомы, опосредованно нагруженные пептидом Mart-1, могут также стимулировать маргинальную секрецию IFN- у специфичного к Mart-1 клона CTL, LT 11, что говорит о том, что некоторая степень нагрузки пептидом действительно осуществляется. Однако, даже используя флуориметрию с временным разрешением (TRF), биохимический подход с чувствительностью, подобной радиоактивному детектированию, связывание пептидов класса I на этих декзосомах едва детектируется. В порядке повышения эффективности и промышленного осуществления процессов, авторы теперь неожиданно обнаружили, что является возможным осуществление подхода с непосредственной нагрузкой, при котором стадия добавления пептида к культуре DC заменяется добавлением пептида на декзосомы после того, как они очищаются от культуры DC. В частности, авторы теперь обнаружили, что могут быть разработаны и определены выбранная кислотная среда или буфер для защиты мембранных везикул и предоставления возможности непосредственной нагрузки иммуногенными соединениями антиген-презентирующих молекул на поверхности указанных везикул, в частности молекул МНС, таких как молекулы класса-I, класса-II или CD1. Конкретная цель настоящего изобретения, таким образом, заключается также в способе приготовления иммуногенной мембранной везикулы, способ включает в себя выделение или очистку мембранной везикулы из биологического образца и взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с иммуногенным соединением (например, с пептидом или липидом) при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания антиген-презентирующих молекул (например,МНС класса I или класса II для пептидов, и CD1 для липидных антигенов) на поверхности указанной мембранной везикулы. В предпочтительном воплощении, способ включает в себя стадию воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой или обработку до, во время или после взаимодействия указанных везикул с помощью указанного иммуногенного соединения с тем, чтобы сделать возможной или облегчить их нагрузку. В этом отношении, использование выбранных кислых сред или обработок, как описано в настоящей заявке, предоставляет возможность, по меньшей мере, для частичного удаления эндогенных пептидов или липидов, связанных на поверхности везикул, и/или облегчения обмена иммуногенных соединений. В дополнительном предпочтительном воплощении, после взаимодействия с иммуногенным соединением, везикулы подвергаются центрифугированию, предпочтительно, центрифугированию в градиенте плотности, или диафильтрации для удаления несвязанных иммуногенных соединений.-3 005425 Иммуногенное соединение может быть, например, любым пептидом или липидом, которые презентируются иммунной системе в связи с антиген-презентирующими молекулами. Пептиды могут быть рестриктированными пептидами класса-I, рестриктированными пептидами класса-II, либо сами по себе,либо в смеси, либо в сочетании с другими пептидами, или даже пептидным элюатом клеток опухоли. Настоящее изобретение является, в частности, пригодным для использования при непосредственной нагрузке рестриктированными пептидами класса-1. Липиды могут быть микробным липидом, микробным гликолипидом, или липидным или гликолипидным антигеном опухоли либо в выделенной форме, либо в различных сочетаниях, или смесью (смесями). Способ непосредственной нагрузки обеспечивает значительные преимущества по сравнению с известными ранее методиками. В частности, как иллюстрируется в примерах, непосредственная нагрузка пептидами является более эффективной, чем известная ранее опосредованная нагрузка, в том, что при этом может быть получена более высокая доля занятых HLA рецепторов на поверхности с использованием более низкого количества пептида. Это явным образом повышает иммуногенный потенциал мембранных везикул. Кроме того, структура нагруженного пептида может контролироваться более точно, так как нагруженные пептиды не обрабатываются клеткой в целом и, таким образом, остаются интактными и не модифицированными при нагрузке. Настоящее изобретение теперь показывает впервые, что непосредственная нагрузка пептидами может быть осуществлена с использованием очищенных мембранных везикул, таких как декзосомы. В этом отношении, настоящее изобретение показывает, что мембранные везикулы выдерживают условия с низкими значениями рН без потери своей активности и функциональности. Настоящее изобретение также описывает конкретные условия, дающие возможность усовершенствования непосредственной нагрузки. Настоящее изобретение, в частности, показывает, что обычные буферные среды, используемые для опосредованной нагрузки (то есть для нагрузки всей клетки) могут быть с преимуществами заменены различными буферными средами для повышения эффективности непосредственной нагрузки и получения более высоких долей занятой поверхности, что указывает на то, что везикулы ведут себя не так, как целые клетки. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение направлено на способ для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса-I, связанного с молекулой HLA класса I, способ включает в себя (i) воздействие на выделенную или очищенную мембранную везикулу выбранной кислой средой, (ii) взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса I при условиях, дающих возможность образования комплекса пептида и молекулы HLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iii) сбор нагруженных мембранных везикул. Термин "экзогенный" обозначает, что пептид добавляется к композиции. В конкретном варианте способ включает в себя стадии (i) воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой, (ii) взаимодействия указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса-I в присутствии бета-2 микроглобулина, при условиях, дающих возможность для образования комплекса пептида и молекулыHLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iii) сбор нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно стадия (i) включает в себя воздействие на выделенные или очищенные мембранные везикулы кислой средой при значении рН, попадающем в пределы между примерно 3 и 5,5,еще более предпочтительно, между примерно 3,2 и 4,2, в течение менее чем 5 мин. Подход с непосредственной нагрузкой в присутствии бета-2-микроглобулина является предпочтительным, так как он предоставляет возможность эффективной нагрузки, даже если доступными являются только очень малые количества иммуногенных соединений. В самом деле, когда используется бета-2-микроглобулин, как показали авторы, является возможным использование определенных кислых сред, которые удаляют, по существу, все эндогенные пептиды с мембранных везикул и, таким образом, способствуют восстановлению функциональных комплексов МНС даже при низких уровнях иммуногенных соединений (например, от 0,005 до 50 мкг/мл). Этот подход, таким образом, является особенно пригодным для использования при непосредственной нагрузке элюатами опухолей, липидами, природными антигенами или другими иммуногенными соединениями, которые не могут быть произведены экономично в больших количествах (например, путем синтеза). Там, где являются доступными более высокие количества иммуногенных соединений, авторы определяют второй общий подход с нагрузкой, в котором бета-2-микроглобулин не является необходимым. Это воплощение является преимущественным, так как необходимо меньше стадий обработки (так, что экзосомы не изменяются), и нет необходимости в экзогенном 2-m, что может понижать стоимость и потенциальные погрешности при добавлении экзогенного материала к способу. В этом отношении, в другом конкретном варианте способ включает в себя стадии (i) взаимодействия выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным иммуногенным соединением (например, с пептидом или липидом) класса-I в отсутствие бета-2-микроглобулина, (ii) воздействие на смесь из (i) выбранной кислой средой или обработку при условиях, дающих возможность для обмена иммуногенного соединения с любым эндогенным соединением, с целью связывания с молекулой HLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, (iii) нейтрализацию среды для прекращения обмена и/или стабилиза-4 005425 ции комплекса, сформированного в (ii), и (iv) сбор нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно, стадия (ii) включает в себя воздействие на смесь кислой средой при значении рН, находящемся в пределах примерно между 4 и 5,5, в течение периода времени, достаточного для осуществления обмена между любой эндогенной молекулой и иммуногенным соединением, с целью связывания с комплексом МНС. В самом деле, авторы показали теперь, что, в противоположность клетке в целом мембранные везикулы могут выдерживать длительное соприкосновение с кислой средой или условиями, таким образом,делая возможной замену эндогенных молекул с помощью любого желаемого иммуногенного соединения, без изменения или дестабилизации молекулы МНС и, по существу, без деградации или удаления эндогенного 2-m. Авторы также определили конкретные кислые среды и условия, дающие возможность для осуществления обмена без изменения функциональности мембранных везикул. Эти выбранные среды более конкретно характеризуются значением рН, находящимся в пределах примерно между 4 и 5,5,более предпочтительно между 4,2 и 5,2. Мембранные везикулы предпочтительно взаимодействуют с выбранными выше кислотными средами в течение периода времени, превышающего 15 мин, как правило,меньшего чем 2 ч, еще более предпочтительно в течение менее чем 1 ч. В соответствии с этим вариантом способ не включает в себя использование бета-2-микроглобулина, и нагрузка осуществляется путем обмена между желаемым пептидом и эндогенным пептидом, без высвобождения эндогенного 2-m. В этом не содержащем бета-2-микроглобулина воплощении выделенная или очищенная мембранная везикула,как правило, взаимодействует с избытком экзогенного иммуногенного соединения, например с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида или липида класса-I, в отсутствие бета-2-микроглобулина. Это воплощение является, в частности, пригодным для использования при нагрузке иммуногенных соединений,доступных в больших количествах, таких как пептиды, получаемые путем синтеза. Как показано выше, способ может быть осуществлен с использованием различных иммуногенных молекул. Пептиды являются предпочтительно пептидами, презентируемыми молекулами класса I или класса II, то есть пептидами, которые получают в результате обработки антигенов антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки и макрофаги, и В-лимфоцитами. Предпочтительный класс пептидов представлен рестриктированными пептидами класса-1, еще более предпочтительно, рестриктированными пептидами опухоли класса-1, то есть пептидами, полученными из антигенов опухоли, которые представлены дендритными клетками или макрофагами иммунной системы. Конкретные пептиды включают в себя, например, HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B35 или другие гаплотипы рестриктированных пептидов опухоли, из различных клеток опухолей, или антигены, такие как Маgе, Ваgе, Mart, CEA, PSA и тому подобное. Нужно понять, что способ может быть осуществлен с использованием выделенных пептидов или их смесей, таких как элюаты пептидов клеток опухоли или других сочетаний пептидов. Антигенные пептиды, полученные от других патогенных агентов (вирусов, клеток, паразитов и тому подобного) могут также нагружаться в соответствии с настоящим изобретением, например, для получения иммуногенных мембранных везикул, пригодных для использования при лечении различных болезненных состояний, таких, например, как злокачественные заболевания, инфекции или иммунные заболевания. Липиды могут представлять собой любой липид, гликолипид или липопротеин, презентированный иммунной системе с помощью молекулы CD1 на поверхности антиген-презентирующих клеток. Молекулы CD1 представляют собой МНС-подобные молекулы, ответственные за презентирование липидных или гликолипидных антигенов Т-лимфоцитам. Описано несколько изотопов CD1, включая CD1a, CD1b,CD1c, CD1d и CD1e, которые участвуют в презентировании липидных антигенов. В конкретном воплощении, способ используется для нагрузки липидными антигенами молекул CD1 на поверхности мембранных везикул, в частности, CDlb и CDld. Липид может представлять собой любой микробный липид,микробный гликолипид, липид или гликолипид, антиген опухоли и тому подобное. Более предпочтительные примеры липидов включают в себя микобактериальные липиды, такие как миколевые кислоты,мономиколят глюкозы, гексоз-1-фосфоизопреноиды и производные липоарабиноманнанов (LAM), такие как фосфатидилинозитол маннозиды. Другие примеры включают в себя сами керамиды, такие как ганглиозиды, гликолипидные антигены опухоли и тому подобное. Конкретные воплощения настоящего изобретения включают в себя: способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя:b) культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, в частности дендритных клеток,при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, в частности дендритными клетками,c) накопление мембранных везикул или стадию их очистки иd) взаимодействие мембранных везикул с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МHС на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул. Способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя: а. получение популяции незрелых дендритных клетокb. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,с. стадию накопления или очистки мембранных везикул иd. взаимодействие мембранных везикул с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МНС на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул. Способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя: а. получение популяции незрелых дендритных клеток,b. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,с. стадию накопления или очистки мембранных везикул и а. взаимодействие мембранных везикул с липидным антигеном при условиях, дающих возможность липидному антигену для связывания с молекулой CD1 на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул. Обогащение или очистка предпочтительно выполняются, как описано выше, также как и непосредственная нагрузка. Конкретное воплощение настоящего изобретения заключается в способе приготовления мембранных везикул, включающем в себя: а. получение популяции антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно незрелых дендритных клеток,b. необязательно, сенсибилизирование антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно,незрелых дендритных клеток, по отношению к одному или нескольким антигенам,с. культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно незрелых дендритных клеток, при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, более предпочтительно незрелыми дендритными клетками,d. осветление супернатанта культуры,е. концентрирование осветленного супернатанта,f. диафильтрацию концентрированного супернатанта,g. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности,h. необязательно, взаимодействие мембранных везикул с пептидом для получения нагруженных пептидом мембранных везикул иi. стерильную фильтрацию мембранных везикул, полученных в g. Стерильная фильтрация i) может предваряться стадией замены буфера, например, путем диафильтрации. Типичная схема процесса изображена на фиг. 1. В процессе выше осуществляется либо стадия b) либо стадия h). Более того, настоящее изобретение также предусматривает способы удаления частиц из различных сред или композиций. Более конкретно, настоящее изобретение демонстрирует, что обычные культуральные среды включают в себя частицы, такие как гаптоглобин и связанные с ним полимеры (например,агрегированный гаптоглобин), и указывает способы их удаления. В более общем смысле, эти способы предоставляют возможность для производства культуральных сред или любых других биологических продуктов, таких как белки крови или полипептиды (или их производные), растворы препаратов, фетальная сыворотка теленка и тому подобное, которые по существу не содержат агрегированного гаптоглобина. Агрегированный гаптоглобин может проявлять иммуносупрессивную активность и, таким образом,воздействовать на биологические свойства, безопасность и чистоту мембранных везикул или других биологических продуктов, как будет показано ниже. Однако проблема удаления конкретных частиц не решена в данной области, их присутствие в различных биологических продуктах не определяется, и эффективные способы их удаления недоступны. Настоящее изобретение теперь предусматривает эффективные способы для приготовления биологических продуктов высокого качества, указанные конечные продукты также представляют собой цели настоящего изобретения. В этом отношении, настоящее изобретение заключается, в целом, в композиции, содержащей культуральную среду клеток млекопитающего, по существу не содержащую частиц, более предпочтительно не содержащую агрегированного гаптоглобина. Настоящее изобретение также заключается в культуральной среде клеток, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Настоящее изобретение дополнительно заключается в композиции материала, содержащего антиген-репрезентирующие клетки (или любые другие клетки, продуцирующие мембранные везикулы, в частности дендритные клетки) в культуральной среде, имеющей пониженное содержание частиц, более конкретно, по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина. Более предпочтительно, культуральная среда представляет собой культуральную среду, обработанную с целью удаления частиц или агрегированных соединений, более конкретно, путем ультрафильтрации.-6 005425 Другой аспект настоящего изобретения заключается в способе получения или культивирования антиген-презентирующих клеток (или любых клеток, продуцирующих мембранные везикулы), в частности дендритных клеток, с использованием культуры или продуцирующей среды с пониженным содержанием частиц. Более предпочтительно, культуральная среда представляет собой культуральную среду, которая является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина, более конкретно, средой, обработанной с помощью ультрафильтрации. Настоящее изобретение является также пригодным для использования при получении композиции продуктов крови, которые являются, по существу, не содержащими агрегированного гаптоглобина, а также с целью обработки различных буферных растворов перед приготовлением продуктов для фармацевтического применения. В этом отношении, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей полипептид крови или его производное, которая является, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Более конкретно, настоящее изобретение заключается в композиции, содержащей термически инактивированный продукт крови, которая является, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Еще более предпочтительно настоящее изобретение относится к композиции (термически инактивированной) сывороточного альбумина, более предпочтительно сывороточного альбумина человека, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Настоящее изобретение также относится к способу обработки биологического продукта, более предпочтительно термически инактивированного биологического продукта, в порядке понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в нем, который включает в себя воздействие на продукт фильтрации, более предпочтительно ультрафильтрации. Конкретный ответ настоящего изобретения также заключается в способе приготовления биологического продукта, включающем в себя (i) термическое инактивирование биологического продукта и (ii) фильтрование термически инактивированного биологического продукта. Более предпочтительно способ дополнительно включает в себя стадию (iii) концентрирования фильтрованного, термически инактивированного биологического продукта, и/или (iv) их сочетание. Способ может использоваться для различных биологических продуктов, включая любой белок или полипептид (или их производное), выделенные(или экстрагированные) из биологических жидкостей млекопитающих, таких как кровь человека, или плазма, или сыворотка. Как будет дополнительно показано в этой заявке, этот способ впервые предоставляет возможность для получения термически инактивированных биологических продуктов, имеющих пониженное содержание агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно, по существу, не содержащих агрегированного гаптоглобина и, таким образом, имеющих повышенную безопасность. Способ является особенно пригодным для использования при приготовлении фармацевтических белков, экстрагированных из крови или плазмы, таких как сывороточный альбумин, более предпочтительно сывороточный альбумин человека, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции крови и тому подобное. Настоящее изобретение также заключается в способе обработки препарата сыворотки, более предпочтительно препарата фетальной сыворотки теленка, для понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в ней, включающем в себя воздействие на препарат фильтрации, более предпочтительно ультрафильтрации. Как будет дополнительно показано ниже, выражение "по существу не содержащий" указывает на то, что композиция или среда содержит меньше чем примерно 1 м.д. агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно меньше, чем примерно 0,5 м.д., еще более предпочтительно агрегированный гаптоглобин не детектируется с помощью SDS PAGE анализа, а также с помощью количественного анализаELISA. Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах анализа или характеризации (или дозирования) мембранных везикул в препарате, в порядке определения их фенотипа и/или активности,и/или количества. Более конкретно, один из аспектов настоящего изобретения заключается в способе характеризации мембранных везикул, включающем в себя взаимодействие мембранных везикул, параллельно с двумя или более видами антител, специфичных к маркерным компонентам мембранных везикул, и определение образования иммунных комплексов антиген-антитело. Другой конкретный аспект включает в себя способ характеризации активности препарата на основе мембранных везикул, включающий в себя взаимодействие нагруженных суперантигеном везикул с Тлимфоцитами в присутствии А-клеток, и определение активации Т-лимфоцитов. Настоящее изобретение также предусматривает способ дозирования мембранных везикул в образце,включающий в себя (i) нагрузку образца на твердой подложке, (ii) взаимодействие подложки с антителом анти-класса II (или другими компетентными антителами) и (iii) определение присутствия иммунных комплексов антитело-антиген. Настоящее изобретение также включает в себя композиции, содержащие (i) мембранные везикулы,(ii) буферный агент и (iii) криопротекторное или стабилизирующее соединение. Настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие иммуногенную мембранную везикулу и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где иммуноген-7 005425 ную мембранную везикулу получают с помощью непосредственной нагрузки, например путем выделения мембранной везикулы из биологического образца, содержащего антиген-презентирующие клетки(например, дендритные клетки), и нагрузки указанной выделенной мембранной везикулы иммуногенным соединением, и предпочтительно удаления несвязанного иммуногенного соединения (преимущественно,с помощью центрифугирования в градиенте плотности или диафильтрации). Предпочтительные композиции содержат иммуногенные мембранные везикулы, где по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% молекул HLA на поверхности везикул являются нагруженными экзогенным пептидом или липидом. Настоящее изобретение также охватывает способы приготовления фармацевтического продукта,содержащего иммуногенные мембранные везикулы и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где способ включает в себя (i) выделение мембранной везикулы из биологического образца(например, содержащего антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки, (ii) нагрузку указанной выделенной мембранной везикулы иммуногенным соединением для получения иммуногенной мембранной везикулы, (iii) предпочтительно удаление несвязанного иммуногенного соединения (преимущественно, с помощью центрифугирования в градиенте плотности или диафильтрации), и (iv) взаимодействие иммуногенной мембранной везикулы с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Другие аспекты настоящего изобретения включают в себя наборы, диагностические тест-системы,композиции мембранных везикул, устройство (устройства) для приготовления мембранных везикул или антиген-нагруженные антиген-презентирующие клетки (такие как дендритные клетки) или мембранные везикулы. Это включает в себя способ возбуждения иммунного ответа у субъекта, включающий в себя (i) получение биологического образца, содержащего дендритные клетки, (ii) выделение мембранной везикулы из указанного биологического образца или его очистку, (iii) взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МНС на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iv) введение мембранной везикулы из (iii) субъекту для возбуждения иммунного ответа у указанного субъекта. Субъектом является предпочтительно человек, хотя предполагается также и ветеринарное применение. Настоящее изобретение является, в частности, пригодным для использования с целью приготовления декзосом (то есть мембранных везикул, полученных с помощью дендритных клеток) или текзосом(то есть мембранных везикул, полученных с помощью клеток опухолей), более конкретно, происходящих от человека. Эти мембранные везикулы могут использоваться в различных экспериментальных,биологических, терапевтических, диагностических или профилактических применениях. В частности,мембранные везикулы могут использоваться для модуляции иммунного ответа у субъекта, в частности в патологических условиях, таких как злокачественные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергия, бронхиальная астма, воспаление и тому подобное. Подписи к фигурам Фиг. 1. Блок-схема конкретного способа аутологичного выделения и очистки декзосом. Фиг. 2. DC культивируют в присутствии рестриктированного пептида CMV pp65 HLA-A2 в день 5. Декзосомы собирают в день 7 и очищают. Очищенные CMV декзосомы, в которые введен пептид, затем добавляют к линии Т-лимфоцитов с рестриктированным CMV pp65 HLA-A2 в присутствии положительных по отношению к HLA-A2 или отрицательных по отношению к HLA-A2 DC. Культивирование клеток производится в формате ELISPOT, где лунки для культур покрываются антителами, специфичными по отношению к IFN-, и присутствие клеток, специфично секретирующих этот цитокин, отмечается числом как мера активации Т-лимфоцитов. Образцы представляют собой следующее: 1. Т + А 2+ DC + ехо/А 2+ DC/ Без пептида 2. Т + A2+ DC + ехо/А 2+ DC/ Пептид CMV 3. Т + А 2- DC + ехо/А 2+ DC/ Без пептида 4. Т + А 2- DC + ехо/А 2+ DC/ Пептид CMV Специфичная по отношению к пептиду реакция Т-лимфоцитов на декзосомы может наблюдаться путем сравнения образца 2 с образцом 1, и доказательство того, что стимуляция вызывается пептидом,введенным в декзосомы, а не свободным пептидом, непосредственно стимулирующим DC, иллюстрируется путем сравнения образца 4 с образцом 3. Фиг. 3. SDS-PAGE сред AIM V до и после обработки с помощью ультрафильтрации через 500 кДа(MWCO) мембран в виде полого волокна. AIM V и обработанные УФ AIM V осаждаются с помощью ультрацентрифугирования при 100000g в течение 1 ч. Супернатант удаляют и осадочный слой повторно суспендируют в PBS и центрифугируют в ультрацентрифуге второй раз при 100000g в течение 1 ч. Осадок повторно суспендируют до 1/1000 от исходного объема в PBS. 20 мкл осадка (восстанавливающие условия) помещают в 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Coomassie Blue.-8 005425 Фиг. 4. SDS-PAGE среды AIM V через 3 месяца после обработки с помощью ультрафильтрации через 500 кДа (MWCO) мембрану в виде полого волокна. Обработанную УФ AIM V осаждают путем ультрацентрифугирования при 100000 х g в течение 1 ч. Супернатант удаляют и осадочный слой повторно суспендируют в PBS и ультрацентрифугируют во второй раз при 100000 х g в течение 1 ч. Осадок повторно суспендируют до 1/1000 исходного объема вместе с PBS. 20 мкл осадка (восстанавливающие условия) помещают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Coomassie Blue. Фиг. 5. Блок-схема системы микрофильтрации с помощью 3/0,8 мкм фильтра в виде мешка. Фиг. 6. Схема: Ультрафильтрация осветленного супернатанта культуры ткани с использованием системы с картриджем в виде полого волокна. Фиг. 7. SDS-PAGE супернатанта концентрированной культуры ткани, содержащей декзосомы, до и после диафильтрации вместе с PBS и с использованием 500 кДа мембраны в виде полого волокна. Образец подвергают диафильтрации вместе с 5 объемами PBS. Декзосомы до и после диафильтрации дополнительно очищают с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис D2O буфера. Концентрация складок обозначена для каждого анализируемого образца. 20 мкл вещества осадка (восстанавливающие условия) помещают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Coomassie Blue. Фиг. 8 а. Ультрацентрифугирование концентрированных декзосом в градиенте плотности 30% сахарозы/Трис D2O (плотность = 1,190-1,210 г/мл). Приготовление образца. Фиг. 8b. Сбор образца от ультрацентрифугирования декзосом в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис D2O буфера. Осадок повторно суспендируется до 1/1000 от его исходного объема вместе с буфером для приготовления. Фиг. 9 а. SDS-PAGE фракции декзосом, собранной после ультрацентрифугирования в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис D2O буфера. Все образцы нормализуют до 1/21 от исходного объема. Фракции представляют собой следующее: дорожка 1 - после ультрафильтрации/перед ультрацентрифугированием, дорожка 2 - фракция от УЦ в градиенте плотности, дорожка 3 - УЦ осадок на дне в градиенте/восстановлена до 1/1000 от исходного объема, дорожка 4 - осадок от УЦ, полученный классическим способом седиментации/восстановлена до 1/1000 от исходного объема, и дорожка 5 - от УЦ выше в градиенте плотности. Фиг. 9b. Результаты HLA/DR ELISA для различных фракций ступенчатого распределения плотности caxaposa/D2O после ультрацентрифугирования при 100000g в течение 1 ч. Никакого HLA/DR не наблюдается выше плотной части в градиенте, приблизительно 10% соответствует восстановленному осадку (1/1000), и 90% находится в градиенте. Фиг. 10. SDS-PAGE декзосом и диафильтрация в буфере PBS для приготовления. Декзосомы дополнительно концентрируются с помощью седиментации путем ультрацентрифугирования при 100000 хg в течение 1 ч. Осадок восстанавливается в PBS до 1/2800 от исходного объема супернатанта. 3,3 мкл декзосом (восстанавливающие условия) нагружают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Coomassie Blue. Фиг. 11. ELISA экзосом. Экзосомы очищаются либо путем осаждения с помощью ультрацентрифугирования, либо путем ультрацентрифугирования в растворе с градиентом плотности (30% сахароза/ 20 мМ Трис в D2O). Для сравнения, лизат DC используют в качестве эквивалентов эквивалентных культур клеток. Сайты неспецифичного связывания блокируются с помощью нежирного сухого молока, иCD81 (фиг. 11 а) и HLA-DR (фиг. 11b) детектируются посредством специфичного mАb с последующим детектированием с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Образцы количественно характеризуются с помощью хемилюминесцентного детектирования, и строится график как функция эквивалентности культуры клеток. Фиг. 12. ELISA препарата декзосом HLA/DR (фиг. 12 а, b) и МНС I (фиг. 12 с, d). Препарат декзосом получают с помощью способов, описанных ранее. Супернатант культуры клеток (3,7 л) осветляют путем фильтрования, концентрируют путем ультрафильтрации, концентрируют путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароза/D2 О и концентрируют с помощью обмена буферов путем ультрафильтрации/диафильтрации. Объем нормализуют, чтобы он представлял 1000 х (1 мкл эквивалентность = 1 мл супернатанта) концентрацию исходного объема супернатанта. Фиг. 12 а: титрование анти-HLA/DR с избытком экзосом. Фиг. 12b: титрование декзосом после ультрацентрифугирования в градиенте (УЦ-в градиенте плотности) и после диафильтрации в буфере для приготовления (2-ая УФ) с избытком анти-HLA/DR. Фиг. 12 с: титрование анти-МНС I (гибридома НС 10) с избытком декзосом. Фиг. 12d: титрование декзосомы А и В с избытком анти-МНС I. Фиг. 13. Фиг. 13 а: анализ декзосом с помощью проточной цитометрии на специфичные поверхностные рецепторы. Черные гистограммы иллюстрируют удельную интенсивность связывания флуоресцентно меченых антител, распознающих указанные рецепторы, и белые гистограммы показывают неспецифическое фоновое связывание. Фиг. 13b. Как и для фиг.13 а, за исключением того, что окрашивание осуществляется с использованием немеченых первичных антител с последующим флуоресцентным мечением вторичных антител,-9 005425 поскольку лактадгериновое антитело является недоступным для прямого флуоресцентного конъюгирования. Фиг. 14. Суперантигенный анализ с использованием декзосомы с присоединенным SEE. Декзосомы очищают и к ним присоединяют SEE, как определено в примерах, а затем инкубируют вместе с сочетанием Т-лимфоцитов Jurkat и клеток Raji. Продукция IL-2 измеряется с помощью ELISA и изображается на графике как функция от количества молекул HLA-DR на лунку, как определяется с помощью анализаHLA-DR ELISA. Данные аппроксимируют с использованием S-образной подгоночной кривой, и вычисленную дозу, половинную от максимальной эффективной дозы (ED50) используют как меру сильнодействия препарата декзосом. Фиг. 15. В разбавленные порции декзосомы (показанные на рисунке в виде надписи) вводят SEE и культивируют вместе с клетками Jurkat и Raji с целью исследования сильнодействия препаратов декзосом. После извлечения из плотной части ступенчатого распределения Optiprep, каждый образец подвергается последовательному титрованию и исследуется в анализе клеток. Данные показывают, что после коррекции на разбавление каждого препарата декзосом регистрируется такой же уровень активности, как если смотреть на область кривых, приблизительно соответствующую половинной максимальной активности (приблизительно 350 пг/мл IL-2) для диапазона от 0,7 до 50 мкл экзосом, что представляет собой диапазон приблизительно 100-кратного превышения того уровня, при котором анализ является линейным. Этот результат является неожиданным для такого анализа и делает такой анализ очень полезным при измерениях в широком диапазоне неизвестных препаратов декзосом. Фиг. 16. Сравнение с помощью HLA/DR ELISA комплексов экзосома/SEE, очищенных путем осаждения и зонального ультрацентрифугирования. Фиг. 17. Связывание пептидов с декзосомами HLA-A2+ (вверху) и HLA-A2- (ниже). Биотинилированный пептид сравнения используется при концентрации, указанной в надписи на фигуре, для нагрузки декзосом. Количество связанного пептида указано по оси у в единицах флуоресцентного Еu (отсчеты в секунду) как функция от анализируемого количества лизата декзосом (указанного в единицах мкл объема по оси х). Фиг. 18. Нагрузка пептидом для различных буферов и значений рН. Биотинилированный пептид сравнения нагружается с использованием ацетатного или цитратного буфера при значении рН 3,2-5,2. Количество нагруженного пептида указывается по оси у в единицах отсчетов флуоресцентного Еu. Фиг. 19. Декзосомы, обработанные слабой кислотой при значении рН 4,2 в Na-ацетатном буфере,сохраняют лучшую функциональную активность, чем декзосомы, обработанные лимонной кислотой при значении рН 4,2. Декзосомы обрабатывают либо с помощью лимонной кислоты (буфер А), либо ацетата Na (буфер В), вводят в них суперантиген 'SEE' и исследуют в функциональном анализе для оценки воздействия на биологическую активность декзосом, что измеряется по их способности выявлять секрецию IL-2 эффекторными клетками. Секреция IL-2 указывается по оси у как функция от объема декзосом. Фиг. 20. 2-микроглобулин облегчает прямую нагрузку пептидами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при концентрациях 2-микроглобулина 0-80 мкг/мл. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Еu (отсчеты в секунду) как функция от концентрации 2-микроглобулина. Фиг. 21. Насыщение связывания пептида сравнения с декзосомами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при концентрации 0-20 мкг/мл. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Еu (отсчеты в секунду) как функция от количества пептида сравнения. Фиг. 22. Кинетика связывания пептида сравнения с декзосомами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при комнатной температуре в течение 0,5-4 ч. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Еu (отсчеты в секунду) как функция от времени инкубации пептида сравнения вместе с декзосомами. Фиг. 23. Конкурентное связывание немеченого пептида сравнения, MAGE3, 4 и 10 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 1-100 х немеченого пептида сравнения, MAGE-3, 4 и 10 инкубируют вместе с биотинилированным пептидом сравнения (5 мкг/мл) с целью конкурентного связывания с декзосомами. Процент ингибирования указывается по оси у как функция от количества конкурирующего пептида. Фиг. 24. Анализ клона Т-лимфоцитов с использованием декзосом, нагруженных Mart-1. Фиг. 25. Анализ клона Т-лимфоцитов с использованием декзосом, нагруженных Р 1 А. RD представляет собой стандартный анализ с использованием 100 единиц IL-2. Фиг. 26. Сравнение связывания биотин-меченого пептида сравнения с декзосомами в ацетатном буфере при значении рН 4,8 и 5,2 в отсутствие бета-2-микроглобулина. Количество нагруженного пептида указывается по оси у в единицах отсчетов флуоресцентного Еu. Фиг. 27. Декзосомы, обработанные слабой кислотой при значении рН 4,8 и 5,2 в Na-ацетатном буфере, сохраняют такую же функциональную активность, как и необработанные декзосомы. Декзосомы обрабатывают при значении рН 4,8 или 5,2 Na-ацетатом (буфер А), в них вводят суперантиген 'SEE' и- 10005425 исследуют в функциональном анализе с целью оценки воздействия на биологическую активность декзосомы, которая измеряется по их способности выявлять секрецию IL-2 эффекторных клеток. Секреция IL2 указывается по оси у как функция от объема декзосом. Фиг. 28. Конкурентное связывание MAGE 4 и 10 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 5-20 х MAGE-4 и 10 инкубируют вместе с 100 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения с целью конкурентного связывания с декзосомами при значении рН 4,8, в отсутствие бета-2 микроглобулина. Процент ингибирования указывается над каждым столбиком как функция от количества конкурирующего пептида. Фиг. 29. Конкурентное связывание MAGE 3 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 5-20 х MAGE-3 инкубируют вместе с 100 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения с целью конкурентного связывания с декзосомами при значении рН 4,8 в отсутствие бета-2-микроглобулина. Процент ингибирования указывается над каждым столбиком как функция от количества конкурирующего пептида. Фиг. 30. Секреция IFN- LT 11, стимулируемая декзосомами, нагруженными пептидом Mart-1, в отсутствие бета-2-микроглобулина. Клетки LT 11 стимулируются декзосомами, нагруженными пептидомMart-1, в присутствии DC как А-клеток, и секреция IFN- LT 11 указывается по оси у как функция декзосом. В качестве контроля Ехо 447 также нагружаются при значении рН 4,2 в присутствии бета-2 микроглобулина. Фиг. 31. Связывание (верхний график) и ингибирование (нижний график) рестриктированного пептида HLA-A1 в присутствии бета-2-микроглобулина. Верхний график: рестриктированный биотинмеченый пептид HLA-A1, MAGE-3C5, специфично связанный с декзосомами HLA-A1+. Нижний график: связывание ингибируется немеченым пептидом MAGE-3A1. Фиг. 32. Конкуренция между рестриктированным биотин-меченым пептидом HLA-A1/В 35, MAGE3C5, и немеченым пептидом MAGE-3A1/B35 на декзосомах HLA-B35+ (Ехо 426) в отсутствие бета-2 микроглобулина. Подробное орисание изобретения Как показано выше, настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции для получения и/или характеризации мембранных везикул, которые являются пригодными при использовании в области фармации, например при иммунотерапии различных патологических состояний. Настоящее изобретение также указывает способы удаления агрегированного гаптоглобина из таких композиций, как среды, биологические продукты и тому подобное, которые могут использоваться в различных фармацевтических или экспериментальных областях. Теперь будет приведено подробное описание различных стадий, которые могут быть использованы для приготовления мембранных везикул в соответствии с предпочтительными конкретными воплощениями настоящего изобретения. Необходимо понять, что настоящее изобретение не ограничивается способами, содержащими все эти стадии, но также включает в себя индивидуальные стадии сами по себе,как указано выше. Блок-схема всего способа для приготовления мембранных везикул изображена на фиг. 1. Этот общий способ содержит несколько основных фаз, включая (i) получение (биологического) образца, содержащего мембранные везикулы, (ii) фазу накопления, (iii) разделение фаз в градиенте плотности, (iv) фазу приготовления и кондиционирования, и (v) фазу контроля качества или характеризации. Более того, настоящее изобретение также описывает способы удаления гаптоглобина из биологических материалов,таких как культуральные среды. Удаление агрегированного гаптоглобина Конкретный и важный аспект настоящего изобретения заключается в создании композиций, которые по существу не содержат таких частиц, как гаптоглобин (и родственные полимеры), более конкретно, агрегированного гаптоглобина. В частности, настоящее изобретение заключается в создании сред для культивирования клеток или биологических продуктов, таких как белки или полипептиды (или их производные), выделенные от биологических жидкостей (например, hSA композиций, гамма иммуноглобулинов, факторов коагуляции, сывороток и тому подобное) или препаратов буферов, которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина. Гаптоглобин представляет собой сложный (альфа-бета)2 тетрамерный белок, содержащий два типа альфа цепей, альфа-1 (8,86 кДа) и альфа-2 (17,3 кДа), в различных сочетаниях). Как сообщается, гаптоглобин может формировать большой агрегированный белок при термической инактивации продуктов из сыворотки ("Biological Functions of Haptoglobin - New Pieces to an Old Puzzle". W. Dobryszycka, Eur. J.vitro and its Relevance to Cancer", R. Samak et al., Cancer Immunol Immunother 1982, 13, p. 38-43). Более того, является известным, что гаптоглобин может проявлять иммуногенную активность (Dobryszycka, выше, Oh et al., J. National Cancer Institute 1990, 82(11), p. 934-940). Настоящее изобретение теперь учитывает принципиальную важность агрегированного гаптоглобина, который присутствует во- 11005425 многих биологических продуктах, и предлагает новые способы, которые предоставляют возможности для его удаления. Более конкретно в контексте настоящего изобретения агрегированный гаптоглобин обозначает любую частицу, содержащую полипептид или цепь гаптоглобина, более предпочтительно поперечно сшитую с любым другим полипептидом или белком через S-S связь, например, в частности, любой смешанный агрегат полипептида гаптоглобина и альбумина. Такой агрегированный гаптоглобин может также содержать дополнительные компоненты, такие как гемогексин, трансферрин, Gc-глобулин и/или 2 гликопротеин, как описано Jensen et al. (Vox Sang 67, 1994, 125). В то время как культуральные среды повсеместно используются как в исследовательских, так и в клинических применениях, проблема больших растворимых агрегированных белков (или частиц) в данной области не решена, и их удаление не обеспечивается. Настоящее изобретение теперь показывает, что агрегированный белок AIM V очищается вместе с декзосомами при осаждении посредством ультрацентрифугирования. Более того, эта заявка показывает, что концентрация декзосом, генерируемая в AIM V с помощью ультрафильтрации, приводят к концентрированию белков AIM V. Более того, SDS-PAGE (фиг. 3) концентрированных декзосом показывает 2 главных полосы при 42 кДа и 64 кДа, соответствующих цепи гаптоглобина и альбумину. Настоящее изобретение, таким образом, демонстрирует, что агрегированный гаптоглобин (включая субъединицы, поперечно сшитые цепи, агрегированные формы и тому подобное) находится в обычных средах для культивирования клеток млекопитающих. Настоящее изобретение дополнительно показывает,что агрегированный гаптоглобин не удаляется с помощью обычных способов очистки экзосом. Настоящее изобретение теперь предусматривает способы удаления частиц, более предпочтительно агрегированного гаптоглобина, из биологических материалов, таких как культуральные среды, биологические композиции, препараты буферов и тому подобное. Настоящее изобретение также предусматривает новые композиции материалов, которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина,и их применение. Удаление (или понижение концентрации) большого агрегированного белка, такого как агрегированный гаптоглобин, предоставляет несколько значительных преимуществ, таких как повышение чистоты, повышение безопасности, понижение неспецифичной иммуносупрессивной активности и тому подобное. Более того, настоящее изобретение описывает, что культуральные среды, не содержащие агрегированного гаптоглобина, все еще предоставляют возможности для эффективного культивирования клеток и продукции экзосом, при этом значительно облегчая очистку экзосом. Удаление агрегированного белка из сред предоставляет дополнительную защиту против индуцирования нежелательных иммунных ответов на такие компоненты сыворотки, как гаптоглобин (Dobryszycka, выше). В этом отношении предполагается, что агрегированный гаптоглобин может вызывать более нежелательный иммунный ответ,чем не агрегированный гаптоглобин, который, как уже известно, является иммуносупрессивным (SeKyung Oh et al J. Natl Cancer Inst. 1990, 82, 934-940. Взаимодействие с иммунным ответом на уровне генерации эффекторных клеток связанного с опухолью гаптоглобина). Агрегированный белок, как известно, является в 10000 (десять тысяч) раз более иммуногенными, чем растворимые формы, поскольку они предпочтительно иммобилизуются антиген-презентирующими клетками (М. Kovacsovics-Bankowski et alProc Natl Acad Sci USA 1993, 90, 4942-4946. Эффективная презентация главным комплексом тканевой совместимости класса I экзогенного антигена при фагоцитозе макрофага). Итак, присутствие даже очень низкой дозы агрегированного гаптоглобина может быть нежелательным. Кроме того, способы настоящего изобретения также предоставляют возможности для удаления других частиц, таких как экзосомы, которые могут присутствовать в содержащих сыворотку культуральных средах. Удаление присутствующих ранее экзосом дополнительно увеличивает очистку продуктов и прекращает загрязнение с помощью других иммунно-стимулирующих агентов. Способ удаления Различные способы могут использоваться для удаления частиц (например, агрегированного белка,более конкретно, агрегированного гаптоглобина) в соответствии с настоящим изобретением, такие как(ультра) фильтрация, микрофильтрация, эксклюзионная хроматография (SEC), аффинная хроматография,ионобменнная хроматография и ультрацентрифугирование. Может также быть возможным удаление агрегированного белка в компоненте сыворотки человека (то есть фракции V) с помощью этих способов перед приготовлением вместе со средой. В предпочтительном воплощении среду или композицию обрабатывают путем ультрафильтрации для удаления агрегированного белка или других частиц, более конкретно агрегированного гаптоглобина. В конкретном воплощении ультрафильтрация осуществляется с использованием 500 кДа мембраны в виде полого волокна. Это представляет собой предпочтительный порог по молекулярной массе(MWCO) для этого применения, так как белки, такие как трансферрин (приблизительно 75-80 кДа),должны проходить через мембрану. Измерение концентрации трансферрина с помощью ELISA показывает, что он количественно проходит через поры этого размера. Этот размер мембраны задерживает агрегированный белок в удерживаемом материале, в то же время давая возможность не агрегированным бел- 12005425 кам проходить вместе с пермеатом. Пермеат собирают, фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр в бутылки и хранят при 4 С до тех пор, пока их не используют. В то время как мембрана с MWCO 500 кДа в виде полого волокна является предпочтительной для ультрафильтрации культуральной среды, могут использоваться также и мембраны с другими размерами,такие как 750 кДа, 300 кДа, 100 кДа и тому подобное. Предпочтительно, среда подвергается ультрафильтрации с помощью мембраны, имеющей диаметр, находящийся в пределах между 100 кДа и 1000 кДа, более предпочтительно между 200 кДа и 750 кДа. В этом отношении, авторы в настоящее время определили, что 90% агрегированного гаптоглобина, присутствующего в культуральных средах или других биологических продуктах, таких как нагретая сыворотка альбумина, имеют диаметр, находящийся в пределах между примерно 40 и примерно 200 нм, как измеряется с помощью динамического рассеяния света. Соответственно, любая мембрана (или другое разделительное устройство, такое как фильтры, полые волокна и тому подобное), имеющая диаметр пор ниже примерно 40 нм, является пригодной для использования при осуществлении и предпочтительной для осуществления настоящего изобретения. В качестве иллюстрации, MWCO 500 кДа обеспечивает диаметр поры, находящийся в пределах между примерно 20 и 25 нм. Также, в то время как формат мембраны в виде полого волокна представляет собой предпочтительное воплощение для ультрафильтрации, могут использоваться и другие типы устройств для ультрафильтрации в формате кассеты (то есть планшета или рамочной кассеты), такие как Millipore Pelicon и родственные продукты, а также кассеты от Sartorius Inc или Filtronics Inc. Материал мембраны, как правило, состоит из полиэфирсульфона (PES), однако могут быть использованы также и другие материалы,такие как полипропилен. Кроме того, при ультрафильтрации сред может использоваться большой диапазон рабочих параметров. Типичными рабочими параметрами являются такие, что входное и выходное давление находятся в пределах между 5-15 фунт/кв.дюйм для оптимальной обработки. Во время обработки может использоваться и гораздо более низкое или высокое давление. В другом конкретном воплощении среду обрабатывают с помощью микрофильтрации (0,05 мкм, 0,1 мкм, 0,2 мкм и тому подобное) для удаления частиц (например, агрегированного белка). Предпочтительный диаметр просвета волокна составляет 0,5 мм, однако могут также использоваться и другие диаметры, такие как 0,25 мм, 0,75 мм, и 1 мм. Эти различные обработки предоставляют возможности для получения сред или биологических продуктов с пониженным содержанием частиц, которые, как теперь показано, значительно облегчают очистку экзосом, а также улучшают качество полученного препарата. Среда, не содержащая агрегированного гаптоглобина В конкретном аспекте настоящее изобретение, таким образом, основывается на использовании предварительно обработанных культуральных сред, имеющих пониженное содержание частиц, а также композиций материалов, содержащих такие предварительно обработанные среды. В самом деле, как теперь показано, предварительная обработка сред для понижения содержания белковых частиц (или агрегированного белка) значительно понижает присутствие загрязняющих веществ в процессе, повышает эффективность способа, предоставляет возможность для получения препаратов экзосом с высокой чистотой и безопасностью и не воздействует на эффективность культуры или жизнеспособность клеток. Соответственно, в конкретном воплощении настоящего изобретения мембранные везикулы приготавливают из биологических образцов, полученных с помощью культивирования клеток в культуральной среде с пониженным содержанием частиц (или агрегированного белка). Более того, другая цель настоящего изобретения заключается в способе получения дендритных клеток, содержащих культивированные предшественники дендритных клеток, в среде, содержащей факторы роста и/или цитокины для воздействия на различные указанные предшественники или для стимулирования их дифференциации в дендритные клетки, в частности, в незрелые дендритные клетки, где среда имеет пониженное содержание частиц, более предпочтительно, является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина. Настоящее изобретение также распространяется на композицию, содержащую дендритные клетки(или любые другие клетки, продуцирующие мембранные везикулы) в культуральной среде с пониженным содержанием таких частиц, как агрегированный гаптоглобин, более конкретно, в среде, которая является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина. Культуральная или продуцирующая среда может быть любой средой, пригодной для использования при культивировании клеток млекопитающих, в частности клеток человека. Примеры таких сред включают в себя AIM V, RPMI, DMEM и тому подобное, более обычно, любую среду для культивирования клеток млекопитающего, содержащую белки (или сыворотку, или ее замену). Предпочтительные среды включают в себя бессывороточные среды, которые являются пригодными для использования при клинических применениях. Термины "по существу не содержащий", "не содержащий" или "пониженное содержание в" агрегированного гаптоглобина указывают на то, что среда или продукт предпочтительно содержат меньше,чем 1 м.д. агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно меньше, чем 0,5 м.д. агрегированного- 13005425 гаптоглобина. Более конкретно, как теперь определили авторы, с помощью SDS PAGE и ELISA свыше 99% агрегированного гаптоглобина может быть удалено из таких биологических продуктов, как средыAIM V. Более конкретно, культуральная среда является по существу не содержащей частиц (включая агрегированный белок, преципитаты и тому подобное), имеющих диаметр свыше 100 нм. В дополнительном предпочтительном воплощении среда является по существу не содержащей частиц (включая агрегированный белок, преципитаты и тому подобное), которые не проходят через 500 кДа мембрану. Более предпочтительная культуральная среда настоящего изобретения представляет собой культуральную среду, которая содержит менее чем примерно 20 нг/мл, более предпочтительно, менее, чем примерно 10 нг/мл агрегированного гаптоглобина, как определяется с помощью ELISA (с использованием, например, моноклонального антитела Н 6395 Sigma). Более того, необходимо заметить, что присутствие агрегированного гаптоглобина является, как правило, незаметным до тех пор, пока среды не концентрируются (с помощью ультрацентрифугирования или ультрафильтрации). Предпочтительные среды настоящего изобретения, таким образом, не содержат агрегированного гаптоглобина, как измеряется с помощью анализов SDS PAGE и ELISA. Биологические продукты, не содержащие агрегированного гаптоглобина Настоящее изобретение является также пригодным для использования при получении композиций биологических продуктов (например, продуктов крови), которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина, а также для обработки различных буферных растворов перед приготовлением продуктов для фармацевтических применений. В этом отношении настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биологический полипептид или его производное, который является по существу не содержащим агрегированного гаптоглобина. Более конкретно, настоящее изобретение заключается в композиции, содержащей термически инактивированный биологический полипептид, который является по существу не содержащим агрегированный гаптоглобин. Биологический полипептид может быть любым полипептидом, белком или пептидом, выделенным (или экстрагированным) из биологической жидкости млекопитающего, в частности, из крови, сыворотки или плазмы. Предпочтительные примеры биологических полипептидов включают в себя сывороточный альбумин, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции (например, фактор VIII,фактор IX), более предпочтительно происходящие от человека. Композиция по настоящему изобретению еще более предпочтительно характеризуется как содержащая менее чем примерно 0,01%, в особенности,менее чем примерно 0,001% агрегированного гаптоглобина. В конкретном примере настоящее изобретение относится к композиции термически инактивированного сывороточного альбумина, более предпочтительно сывороточного альбумина человека, по существу не содержащего агрегированного гаптоглобина. Очищенный hSA широко используется в фармацевтической промышленности (компонент плазмы, агент, стабилизирующий белок и тому подобное). Присутствие гаптоглобина в растворе hSA, как показано, является ответственным за образование агрегатов во время термической обработки. Более того, агрегированные белки, видимо, являются, по меньшей мере, в десять тысяч раз более иммуногенными, чем их не агрегированные формы, так что их присутствие может быть вредным для активности и безопасности препарата. Настоящее изобретение теперь предоставляет возможности для удаления любого такого агрегированного гаптоглобина из препаратов hSA,более конкретно, с помощью ультрафильтрации, как описано выше, при этом создавая новые композиции hSA с высокой чистотой и качеством для фармацевтического применения. Более конкретно, настоящее изобретение теперь предусматривает препараты hSA, которые содержат менее чем примерно 0,01 мас.% агрегированного гаптоглобина, еще более предпочтительно менее чем примерно 0,001 мас.% Конкретные примеры, описанные в этой заявке, демонстрируют, что по настоящему изобретению могут быть получены препараты альбумина, содержащие примерно 0,00025 мас.% агрегированного гаптоглобина или менее. Более предпочтительно, препараты альбумина (или композиции) настоящего изобретения являются нагретыми препаратами (или композициями) hSA, главным образом, для фармацевтического применения. Настоящее изобретение также заключается в способе обработки биологического продукта, более предпочтительно термически инактивированного биологического продукта, в порядке понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в нем, способ включает в себя воздействие на продукт фильтрования, более предпочтительно ультрафильтрации. Конкретный объект настоящего изобретения также заключается в способе приготовления биологического продукта, включающего в себя (i) термическую инактивацию биологического продукта и (ii) фильтрование термически инактивированного биологического продукта. Более предпочтительно, способ дополнительно включает в себя стадию (iii) концентрирования отфильтрованного, термически инактивированного биологического продукта и/или (iv) его кондиционирования. Способ может использоваться для различных биологических продуктов, включая любой белок или полипептид (или их производные),выделенные (или экстрагированные) из биологических жидкостей млекопитающих, таких как кровь человека, или плазма, или сыворотка. Как будет дополнительно показано в этой заявке, этот способ предоставляет возможность впервые для получения термически инактивированных биологических продуктов, имеющих пониженное содержание агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно по суще- 14005425 ству не содержащих агрегированного гаптоглобина и, таким образом, с повышенной безопасностью. Способ является, в частности, пригодным для использования при приготовлении фармацевтических белков, экстрагированных из крови или плазмы, таких как сывороточный альбумин, более предпочтительно сывороточный альбумин человека, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции и тому подобное. Стадия фильтрования включает в себя предпочтительно ультрафильтрацию, еще более предпочтительно со значением MWCO, находящимся в пределах между примерно 100 кДа и примерно 1000 кДа, как правило, между 200 и 750 кДа. Фильтрование может проводиться в любом устройстве и при любых условиях,как описано выше. Более того, могут также быть использованы способы, альтернативные тому, что описано выше. В этом отношении, настоящее изобретение также относится к способам обработки препаратов альбумина, включающих в себя воздействие на препарат альбумина фильтрации, предпочтительно ультрафильтрации. Более предпочтительный способ заключается в обработке нагретой композиции (или препарата) hSA с помощью ультрафильтрации в пористом устройстве, имеющем средний диаметр пор, находящийся в пределах между 200 и 750 кДа. Поскольку большие количества hSA используются в фармацевтической области, предлагаемые авторами способ и композиции более высокого качества представляют собой значительное преимущество с точки зрения безопасности. Получение образца Как показано выше, настоящее изобретение относится к получению мембранных везикул и является пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул из различных источников, включая мембранные везикулы, полученные с помощью антиген-презентирующих клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты), клетки опухоли или любые другие клетки, или линии клеток,продуцирующих мембранные везикулы. Оно является, в частности, пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул, полученных из дендритных клеток, предпочтительно незрелых дендритных клеток (то есть, декзосом). Более того, мембранные везикулы или соответствующие продуцирующие клетки могут быть сенсибилизированы по отношению к одному или несколько антигенам до,во время или после приготовления. Культура клеток моноцитов Различные способы получения биологических образцов, содержащих декзосомы или другие мембранные везикулы, описаны в WO 99/03499, включенной сюда в качестве ссылки. Предпочтительная методология в рамках настоящего изобретения основана на получении дендритных клеток ("DC") из предшественников моноцитов или клеток костного мозга, более предпочтительно,незрелых DC. В самом деле, авторы показывают, что незрелые DC имеют способность к продуцированию экзосом, в то время как зрелые DC, по существу, не могут этого делать. Более конкретно, в рамках настоящего изобретения является предпочтительным использование композиции незрелых дендритных клеток, полученных с помощью обработки предшественников моноцитов (содержащихся в крови или костном мозге) в присутствии комбинации цитокинов, более предпочтительно в отсутствие фактора или условий для созревания DC и/или в течение периода времени, который не предоставляет возможности для созревания DC. Композиции незрелых дендритных клеток предпочтительно содержат в основном (то есть, по меньшей мере, 60%, предпочтительно 70%), незрелые дендритные клетки. Следовательно, стадия приготовления дендритных клеток преимущественно включает в себя приготовление композиции незрелых дендритных клеток, в частности происходящих от человека, главным образом, из предшественников моноцитов, более конкретно с помощью обработки с помощью комбинации цитокинов, таких как GM-CSF+IL-4 или GM-CSF+IL-13, в отсутствие факторов созревания и/или в средах, не содержащих сыворотки, для предотвращения созревания. Кроме того, в рамках настоящего изобретения, является также возможным использование иммортализованных популяций дендритных клеток. Они могут состоять из иммортализованных линий дендритных клеток (например, линии D1 или любой другой линии, полученной, например, с помощью введенияmyc онкогена в дендритные клетки). Они могут также состоять из дендритных клеток, приготовленных и иммортализованных in vitro. Представляющие интерес иммортализованные дендритные клетки лежат в банках замены клеток, сенсибилизированных по отношению к данным группам антигенов, которые могут быть использованы в промышленных масштабах для приготовления декзосом, совместимых при введении целым семьям пациентов. Для получения мембранных везикул (декзосом) популяция незрелых дендритных клеток может просто культивироваться при обычных условиях, известных специалисту в данной области. Однако является предпочтительным культивирование этих клеток согласно условиям, стимулирующим продуцирование декзосом, в частности в присутствии факторов, способных к стимулированию продуцирования декзосом, в частности цитокинов, таких как гамма интерферон, интерлейкин 10 или интерлейкин 12 (например, смотри заявку WO 99/03499). В предпочтительном воплощении процесса в соответствии с настоящим изобретением популяцию незрелых дендритных клеток культивируют в соответствии с условиями, стимулирующими продуцирование мембранных везикул. Предварительные эксперименты пока- 15005425 зывают, что добавление интерферона гамма повышает эффективность декзосом in vivo в преклинических моделях опухолей мышей. В день 7 среды собирают для последующего выделения декзосом. В конкретном воплощении настоящего изобретения образцы периферической крови пациента культивируют в AIM V клинического качества, бессыворотночной среде для культивирования клеток (LifeTechnologies, Inc). Перед использованием культуральная среда подвергается ультрафильтрации для удаления агрегированных белков (например, гаптоглобина), удаление которого, как показано авторами, не воздействуют на рост клеток, но значительно способствует последующему выделению чистых декзосом. Является понятным, что мембранные везикулы могут быть приготовлены с помощью любого другого метода и использоваться в настоящем изобретении. В частности, мембранные везикулы могут быть получены искусственно или с помощью иммортализованных линий клеток, или получены из предварительно созданных коллекций или банков. Сенсибилизация клеток или везикул. Нагрузка антигена Клетки, продуцирующие мембранные везикулы (например, дендритные клетки), могут быть сенсибилизированы по отношению к антигену до (или во время) получения мембранной везикулы. Альтернативно, мембранные везикулы могут быть сенсибилизированы сами по себе. Это воплощение дает возможность получения везикул с заданной иммуногенностыо. Сенсибилизация может быть осуществлена с использованием различных хорошо известных технологий, включающих в себя, например, размещение клеток в контакте с антигенными пептидами, антигенами, комплексами белков, клетками или мембранами клеток, экспрессирующих антигены, апоптическими частицами, мембранными везикулами, липосомами, РНК опухоли или любой нуклеиновой кислотой, кодирующей один или несколько антигенов, антигенных детерминантов или эпитопов (возможно переносимых вирусным или невирусным вектором) и тому подобное (например, смотри заявку WO 99/03499). Альтернативно, сенсибилизация может быть осуществлена путем непосредственной нагрузки везикул пептидами, то есть путем размещения везикул в контакте с антигенными пептидами. В самом деле, настоящая заявка показывает, что непосредственная нагрузка везикул пептидами является возможной и обеспечивает повышение иммуногенности для везикул. В предпочтительном способе, сенсибилизацию выполняют путем инкубирования полученных клеток с пептидами, антигенами, РНК или нуклеиновыми кислотами, или путем непосредственной нагрузки везикул пептидами. Является понятным, что эта заявка не является ограниченной методиками сенсибилизации или продуцирования. Многие антигены могут использоваться для сенсибилизации дендритных клеток (или мембранных везикул), путем соприкосновения клеток (или везикул) с указанными антигенами, соответствующими белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами и тому подобное. Предпочтительные антигены представляют собой опухолевые антигены, вирусные антигены, бактериальные антигены и тому подобное. Типичные опухолевые антигены включают в себя антигены меланомы MAGE, MART, BAGE и тому подобное), простата-специфичные антигены (например, PSMA), СЕА, rsa, p53, Rb, антигены опухоли печени и тому подобное. Белковые антигены нарабатываются внутри дендритных клеток ("DC") к конкретным пептидам, которые затем иммобилизуются с помощью молекул МНС для презентирования на поверхности клетки. Для данного белка DC человека с различными гаплотипами HLA презентируют различные пептиды(эпитопы). Участвующие в процессе пептиды могут быть нагружены на МНС DC класса I путем инкубирования DC и пептидов при соответствующих условиях. Является также возможным нагружать антигены непосредственно на выделенные декзосомы in vitro. В конкретном примере, пептиды MAGE-A3 и -А 4,содержащие эпитопы для HLA-A2, синтезируют для использования при нагрузке декзосом пациента. Критерии включения для пациента в этом эксперименте включают в себя экспрессию гаплотипа HLAA2. Гаплотип HLA A2+ встречается относительно часто, являясь представленным приблизительно у 50% человеческой популяции. Более того, также могут быть добавлены контрольные антигены, такие как ТТ (столбнячный токсин) и пептиды CMV, в частности пептид ТТ Р 2. Целью контрольных антигенов является служить в качестве внутреннего контроля для исследования функционирования декзосомы при презентировании антигена с использованием известных антигенов. Следовательно, в качестве положительного контроля декзосомы также нагружаются, например, пептидом CMV (класс I) и пептидом ТТ Р 2 (класс II). Положительный ответ при таком контроле показывает, что декзосомы являются активными. CMV имеет то преимущество, что обеспечивает исследование как исходной, так и вызванной реакции на антиген, поскольку приблизительно 50% от всей популяции имеют иммунитет по отношению к CMV (вызванный), а остальные - нет (исходный). Другие антигены представляют собой липидные антигены, такие как любой липид, гликолипид или липопротеин, презентируемый иммунной системе с помощью молекул CD1. Липид может быть любым микробным липидом, микробным гликолипидом, липидом или гликолипидом опухолевых антигенов и тому подобное. Конкретные примеры липидов включают в себя микобактериальные липиды, такие как миколевые кислоты, глюкоза мономиколят, гексоза-1-фосфоизопреноиды и производные липоарабиноманнана (LAM), такие как фосфатидилинозитол маннозиды. Другие примеры включают в себя сами керамиды, такие как ганглиозиды, антигены гликолипидов опухоли и тому подобное.- 16005425 Пример 3 описывает ниже предварительные результаты, полученные на модельной системе для нагрузки и анализа пептида (антигена) CMV на дендритных клетках и декзосомах. Результаты демонстрируют способность нагруженных везикул к стимулированию антиген-специфичных CTL (фиг. 2). Необходимо понять, что и любой другой способ сенсибилизации и антиген (антигены) могут использоваться в настоящем изобретении для придания желаемых иммуногенных свойств мембранным везикулам. В этом отношении настоящее изобретение также описывает способ непосредственной нагрузки мембранных везикул, например, декзосом. Способ может быть осуществлен с использованием пептидов или липидов класса I или класса II и обеспечивает значительные преимущества по сравнению с известными методиками. В частности, как иллюстрируется в примерах, непосредственная нагрузка является более эффективной, чем известная непосредственная нагрузка, в том, что могут быть получены более высокие доли занятых рецепторов HLA на поверхности при использовании более низкого количества пептида. Это четко увеличивает иммуногенный потенциал мембранных везикул. Кроме того, структура нагруженного пептида может контролироваться более прецизионно, так как пептиды, нагруженные красителем, не обрабатываются целыми клетками и, таким образом, остаются интактными и не модифицированными при нагрузке. Настоящее изобретение теперь предлагает и демонстрирует впервые, что непосредственная нагрузка может быть осуществлена с использованием очищенных мембранных везикул,таких как декзосомы. В этом отношении настоящее изобретение описывает, что мембранные везикулы выдерживают условия низких значений рН без потери их активности и функциональности. Настоящее изобретение также описывает конкретные условия, дающие возможность усовершенствования непосредственной нагрузки. Настоящее изобретение, в частности, показывает, что обычные буферные среды, используемые для опосредованной нагрузки (то есть при нагрузке целой клетки), могут преимущественно быть заменены различными буферными средами для повышения эффективности непосредственной нагрузки и с целью получения более высоких долей покрытия, указывая на то, что везикулы не ведут себя как целые клетки. Настоящее изобретение также показывает впервые, что в противоположность целым клеткам мембранные везикулы могут выдерживать длительные кислотные обработки или среды, при этом давая возможность непосредственной нагрузки путем замещения, даже в отсутствие добавленного 2-m. В первом варианте способ непосредственной нагрузки пептидов включает в себя стадию (i) воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой и (ii) взаимодействия мембранных везикул (i), предпочтительно во время или после нейтрализации, с выбранным пептидом, в присутствии бета-2-микроглобулина, таким образом, что указанный пептид нагружается на указанные мембранные везикулы. В дополнительном предпочтительном воплощении, выбранный пептид представляет собой пептид антигена опухоли, презентируемый с помощью молекулы класса I, то есть рестриктированного пептида опухоли класса-I. В этом первом варианте мембранные везикулы (например, декзосомы) сначала подвергаются воздействию выбранной кислой среды. Это кислотное элюирование удаляет, по меньшей мере, часть эндогенных пептидов и бета-2-микроглобулина (2-m), связанного с молекулами HLA класса I или класса II на поверхности везикул, без изменения биологических и иммунологических свойств экзосом. Эта обработка является преимущественной, так как она предотвращает или понижает вторичные иммунные ответы, направленные против эндогенных пептидов. Как определено авторами, выбранная кислая среда или обработка предпочтительно включает в себя воздействие везикул со средой при значении рН, находящимся в пределах между 2 и 6, более предпочтительно между 3 и 5,5. Настоящая заявка, в самом деле,показывает, что экзосомы могут обрабатываться при таких кислотных значениях рН и все еще сохранять свои биологические свойства. В частности, настоящая заявка неожиданно показывает, что экзосомы могут подвергаться обработке слабой кислотой, нейтрализации и нагрузке желаемыми пептидами и при этом все еще демонстрировать способность к стимулированию эффективного иммунного ответа против желаемых пептидов. Среда может дополнительно содержать любой пригодный для использования буферный раствор, такой как цитратный, ацетатный и тому подобное. В этом отношении авторы показывают, что наиболее предпочтительная среда содержит ацетат натрия, который обеспечивает улучшение рабочих характеристик нагрузки по сравнению с обычным цитратным буфером. Выбранные среды могут быть получены из любой обычной культуральной среды или среды роста и приготовлены путем создания в ней условий буфера с целью достижения такого значения рН, как описано. Среды могут быть также искусственными или определенными с использованием различных буферных пищевых добавок согласно способам, известным в данной области. По существу, выбранные кислые среды в соответствии с настоящим изобретением обозначают любую культуральную среду, среду роста, кондиционирующий или другой жидкий раствор или буфер, дающий возможность поддержания мембранных везикул, раствор,имеющий значение рН, как описано выше, и предпочтительно содержащий ацетат, например ацетат натрия. Обработка слабой кислотой осуществляется при низкой температуре, как правило, ниже 8 С, предпочтительно примерно при 4 С в течение периода времени в основном 15 мин или меньше, предпочти- 17005425 тельно 10 мин или меньше, еще более предпочтительно 5 мин или меньше. Необходимо понять, что условия обработки (среда, значение рН, температура, длительность и тому подобное) могут устанавливаться специалистом в данной области без отклонения от настоящего изобретения с использованием концепции настоящей заявки и примеров. Нейтрализация может быть осуществлена в соответствии с обычными способами путем увеличения значения рН раствора. Нейтрализация предпочтительно приводит к получению среды с значением рН,превышающим 5,5, как правило находящимся в пределах между примерно 6 и примерно 9. Нейтрализация, как правило, осуществляется путем добавления к среде нейтрализующей среды со значением рН примерно 10 или 11, например, раствора Трис-буфера. Взаимодействие пептида и экзосом должно осуществляться при условиях, достаточных для предоставления возможности пептидам для связывания молекул МНС на поверхности экзосом. Как правило,экзогенный (класса I) пептид и 2-m добавляют во время нейтрализации или после нее, предпочтительно в избытке, чтобы облегчить восстановление HLA класса I после формирования комплексов с пептидом и 2-m таким образом, чтобы пептид был нагружен. Не является необходимым устранение диссоциированных эндогенных пептидов перед нейтрализацией или удаление несвязанных пептидов после взаимодействия. Как правило, может использоваться от 0,005 до 50 мкг/мл экзогенного пептида (предпочтительно от 0,01 до 10 мкг/мл) и от 1 до 80 мкг/мл 2-m. Пептид и 2-m могут быть получены путем различных технологий, таких как рекомбинантное продуцирование, синтез и тому подобное. Необходимо понять, что 2-m предпочтительно является происходящим от человека (2-m человека является коммерчески доступным (Sigma) и может быть получен с помощью обычных технологий). Взаимодействие может быть осуществлено в течение вплоть примерно до 2 ч, например, при комнатной температуре. Примеры показывают, что насыщение происходит самое раннее через 30 мин после взаимодействия. Используя TRF с биотинилированным пептидом сравнения, авторы могут определить количество пептида,непосредственно нагруженного на декзосомы, и демонстрируют, что существует конкурентное связывание между меченым пептидом сравнения и немечеными целевыми пептидами, что указывает на то, что непосредственная нагрузка целевых пептидов на декзосомы является успешной. Декзосомы, нагруженные таким путем пептидом Mart-1 при концентрациях не выше 0,1 мкг/мл, четко и воспроизводимым образом стимулируют специфичный по отношению к Mart-1 клон CTL LT 11 к продуцированию IL-2(пример 12). В другом варианте способ не требует использования бета-2-микроглобулина. В самом деле авторы показывают, что является возможным определение пригодных для использования условий с целью удаления эндогенных пептидов без значительного удаления или дестабилизации эндогенного 2-m, так что непосредственная нагрузка является возможной даже без использования экзогенного 2-m. В этом предпочтительном варианте способ включает в себя стадии (i) взаимодействия выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом или липидом класса I в отсутствие бета-2 микроглобулина, (ii) воздействия на смесь после (i) выбранной кислотной обработкой при условиях,дающих возможность пептиду или липиду для образования комплекса с молекулой HLA класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (iii) сбора нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно, стадия (ii) включает в себя воздействие на смесь обработки слабой кислотой при значении рН, находящемся в пределах примерно между 4 и 5,5, в течение менее чем 2 ч, еще более предпочтительно, примерно между 4,2 и 5,2, в течение менее чем 1 ч. Это воплощение является преимущественным, так как требует меньших обработок и не существует потребности в экзогенном 2-m, что уменьшает стоимость, объем работы и возможные проблемы, связанные с продуктами, получаемыми от людей как доноров. В этом воплощении не содержащая бета-2-микроглобулина выделенная или очищенная мембранная везикула, как правило, взаимодействует с избытком экзогенного пептида, например с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида класса I, в отсутствие бета-2-микроглобулина. Во время взаимодействия при соответствующих условиях, описанных выше, нагрузка осуществляется путем замещения эндогенных соединений, связанных с антиген-презентирующими молекулами (например, МНС класса I или II, для пептидов, и CD1, для липидов) с помощью представляющего интерес пептида или липида (процесс обмена). Этот обмен становится возможным или достаточным из-за наличия выбранных кислотных условий, определенных авторами. Обмен также становится возможным благодаря тому, что авторы продемонстрировали, что мембранные везикулы, такие как экзосомы, выдерживают долговременное соприкосновение с кислотой, в противоположность целым клеткам, и могут, таким образом, подвергаться воздействию определенной кислотной обработки, достаточной для облегчения стадии замещения без добавления экзогенного 2-m. После осуществления обмена или замещения, обычно по прошествии от 15 до 30 мин (или более, если необходимо, или меньше, в зависимости от условий), нагруженные везикулы могут быть стабилизированы путем увеличения значения рН раствора, при этом обмен блокируется. Нейтрализация может быть осуществлена так, как определено выше. Как показано выше, способ может быть осуществлен с использованием различных иммуногенных соединений, таких как пептиды или липиды. Пептиды являются предпочтительно пептидами, презентируемыми с помощью молекул класса I или класса II, то есть пептидами, которые получают в результате- 18005425 обработки антигенов антиген-презентирующими клетками, такими как дендритные клетки и макрофаги,и В-лимфоциты. Предпочтительный класс пептидов представлен в виде рестриктированных пептидов класса I, еще более предпочтительно рестриктированных пептидов опухоли класса-I, то есть пептидов,полученных из антигенов опухоли, которые презентируются иммунной системе с помощью дендритных клеток или макрофагов. Необходимо понять, что способ может быть осуществлен с использованием выделенных пептидов или их смесей, таких как элюаты пептидов клеток опухоли или других сочетаний пептидов. Конкретные примеры липидов включают в себя бактериальные липиды и гликолипиды антигенов опухолей, как описано выше. Пример 12 ниже описывает результаты непосредственной нагрузки декзосом. Результаты демонстрируют способность нагруженных везикул к стимулированию антиген-специфичных CTL. Обогащение образца Как показано выше, образец (например, супернатант, лизат, биологическая жидкость и тому подобное) может быть подвергнут воздействию стадии обогащения, которая может включать в себя одну или несколько стадий центрифугирования, осветления, ультрафильтрации, нанофильтрации, аффинной хроматографии и/или диафильтрации. В конкретном воплощении стадия обогащения включает в себя (i) удаление клеток и/или остатков клеток (осветление), возможно с последующей (ii) стадией концентрирования и/или диафильтрации. Предпочтительная стадия обогащения в соответствии с настоящим изобретением включает в себя (i) удаление клеток и/или остатков клеток (осветление), (ii) концентрирование и(iii) диафильтрацию. Осветление образца Клетки и/или остатки клеток могут быть удалены путем центрифугирования образца, например,при низкой скорости вращения, предпочтительно ниже 1000 g, например в пределах между 100 и 700 g. Предпочтительными условиями центрифугирования во время этой стадии является ускорение приблизительно 300 или 600 g в течение периода, например, в пределах между 1 и 15 мин. Предпочтительно, клетки и/или остатки клеток удаляются с помощью фильтрации образца, возможно в сочетании с центрифугированием, описанным выше. Фильтрация может, в частности, быть осуществлена путем последовательных фильтраций с использованием фильтров с пониженной пористостью. Для этой цели предпочтительно используются фильтры с пористостью выше 0,2 мкм, например между 0,2 и 10 мкм. Является, в частности, возможным использование последовательности фильтров с пористостью 10, 1, 0,5, а затем 0,22 мкм. Культуральные среды для клеток фильтруют с помощью микрофильтрации через одноразовый 0,8 мкм пакетный фильтр, состоящий из ацетата целлюлозы, для удаления клеток и остатков. Пакет для микрофильтрация является одноразовым. Схема процесса показана на фиг. 5. Минимум из 10 экспериментов показывает, что емкость микрофильтра с площадью поверхности, например, 500 см 2 является достаточной для фильтрования супернатантов культур дендритных клеток объемом от 2,5 л до более чем 4 л. Если необходимо, может использоваться и большая площадь поверхности (например, 1000 см 2) в зависимости от количества остатков в суспензии. Другие размеры пор: 2, 1, 0,65, 0,45 мкм и тому подобное, также могут использоваться для разделения при осветлении клеток и остатков клеток от декзосом. Микрофильтр может содержать предварительный фильтр, например 0,8 мкм Sartoclean CA (Sartorius Inc.) содержит предварительный фильтр 3,0 мкм ацетата целлюлозы. Более того, фильтр может состоять из других материалов, кроме ацетата целлюлозы, таких как полипропилен или полиэфирсульфон (PES). Другие способы, которые могут использоваться для удаления клеток и остатков из декзосом, представляют собой центрифугирование при низкой скорости вращения, непрерывную проточную микрофильтрацию через полое волокно и хроматографию. Концентрирование Может быть осуществлена стадия концентрирования в порядке уменьшения объемов образца, который должен быть обработан на стадии центрифугирования в градиенте плотности. Таким образом, концентрирование может быть осуществлено путем центрифугирования образца при высоких скоростях вращения, например, в пределах между 10000 и 100000 g, чтобы вызвать седиментацию мембранных везикул. Она может состоять из серии различных центрифугирований, при этом последнее центрифугирование осуществляется приблизительно при 70000 g. Мембранные везикулы в полученном остатке могут быть извлечены в меньшем объеме и в буфере,пригодном для использования на последующих стадиях процесса. Стадия концентрирования предпочтительно осуществляется путем ультрафильтрации. В соответствии с предпочтительным воплощением (осветленный) биологический образец (например, супернатант) подвергается воздействию ультрафильтрации, предпочтительно тангенциальной ультрафильтрации. Тангенциальная ультрафильтрация включает в себя концентрирование и фракционирование раствора между двумя отделениями (фильтрат и удерживаемая фракция), разделение с помощью мембран с определенными порогами отсечки по молекулярной массе. Разделение осуществляют с помощью приложения потока в отделении для удерживаемой фракции и трансмембранного давления между этим отделением и отделением фильтрата. Для осуществления ультрафильтрации могут использоваться различные системы,- 19005425 такие как спиральные мембраны (Millipore, Amicon), плоские мембраны или полые волокна (Amicon,Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). В рамках настоящего изобретения использование мембран с порогом отсечки по молекулярным массам ниже 1000 кДа, предпочтительно между 300 кДа и 1000 кДа, или еще более предпочтительно между 300 кДа и 500 кДа, является преимущественным. В конкретном воплощении осветленный супернатант культуры ткани (например, полученный после осветления через 0,8 мкм фильтр) концентрируется путем ультрафильтрации через мембрану с порогом отсечки по молекулярным массам (MWCO) 500 кДа, мембрану в виде полого волокна, имеющего диаметр просвета 0,5 мм (A/G Technology Inc). Картридж с таким размером пор удерживает декзосомы в удерживаемой фракции, в то же время давая возможность белкам, которые являются меньшими, чем размер пор, проходить через мембрану. Картридж на основе полых волокон имеет площадь поверхности,достаточную для того, чтобы дать возможность концентрированию происходить быстро и без избыточных сдвиговых усилий, прилагаемых к декзосомам. Типичный объем исходного супернатанта, который подвергается ультрафильтрации, составляет 2-4 л, затем он понижается приблизительно до 100 мл (2040-кратное уменьшение). Схема рабочей установки приведена на фиг. 6. Другие размеры пор, такие как 30 кДа, 100 кДа, 300 кДа и 750 кДа, также могут использоваться для концентрирования объема декзосом. Однако эффективность процесса и процент извлечения при этом могут понизиться. Более того, могут использоваться и другие форматы ультрафильтрации, такие как"пластинчатые и рамочные" кассеты от таких компаний как Millipore, Sartorius и Filtronics. Ячейки с перемешиванием, такие как те, которые поставляет Amicon Inc, также могут использоваться для уменьшения объема декзосом. Концентрирование декзосом путем ультрафильтрации с помощью мембран в виде полого волокна происходит при низких сдвиговых усилиях. Сдвиговое усилие во входном потоке (например, при скорости потока 300 мл/мин для площади поверхности 0,7 кв.фт.) является меньшим, чем 2000 с-1. Входное и выходное давление системы во время процесса составляют в пределах между 3 и 8 фунт/кв.дюйм. Для концентрирования декзосом могут использоваться более жесткие условия, по сравнению с используемыми в настоящее время параметрами. Другие технологии, такие как ионобменная и аффинная хроматография, а также гидродинамическое проточное фракционирование, также могут использоваться для концентрирования декзосом в способе приготовления по настоящему изобретению. Диафильтрация Диафильтрация концентрированного препарата декзосом может быть использована для понижения концентрации загрязняющих сред и клеточных белков. Диафильтрация может быть осуществлена в соответствии с несколькими технологиями, которые дают возможность замены буфера образца на буфер препарата, включая ультрафильтрацию, хроматографию, ультрацентрифугирование и диафильтрацию посредством диализного мешка. В предпочтительном воплощении диафильтрация осуществляется с помощью системы ультрафильтрации. Как демонстрируется в экспериментальном разделе, это воплощение является эффективным. Более того, когда препарат везикул концентрируется с помощью ультрафильтрации, стадия диафильтрации легко может быть объединена с ней с использованием такой же методики. В этом отношении, в конкретном воплощении экзосомы подвергаются диафильтрации с помощью ультрафильтрации, с использованием таких же мембран для ультрафильтрации (то есть мембран сMWCO 500 кДа в виде полого волокна), какие используются на стадии концентрирования. Это воплощение является преимущественным, так как обе стадии могут быть осуществлены по существу в одном и том же устройстве с ограничением вмешательства и манипулирования экзосомами, то есть с помощью одной только модификации продукта, вводимого в полое волокно. Кроме 500 кДа мембран в виде полого волокна, могут использоваться и другие размеры пор, такие как 30, 100, 300 и 750 кДа, предпочтительно находящиеся в пределах между 30 и 1000 кДа, более предпочтительно между 200 и 750 кДа. Буфер для диафильтрации может состоять из наполнителей, отличных от тех, которые находятся в PBS. Объем буфера, используемого при диафильтрации, может составлять где-то от 1 до 10 объемов концентрата декзосом. Рабочие параметры, используемые для диафильтрации, являются подобными тем, которые описаны ранее для концентрирования декзосом из осветленных сред для культур тканей. Выделение и очистка экзосом в градиенте плотности Как указывалось, настоящее изобретение описывает обработку биологического образца, содержащего мембранные везикулы, с помощью центрифугирования в градиенте плотности и извлечение очищенных везикул из плотной части градиента плотности. Центрифугирование в градиенте плотности обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с известными ранее методиками с использованием последовательных центрифугирований или центрифугирования в градиенте плотности. Они включают в себя отсутствие агрегирования везикул, которые, таким образом, подвергаются меньшим физическим повреждениям, дополнительную очистку везикул, так как могут быть удалены дополнительные загрязнения, как будет обсуждаться ниже, отсутствие токсичности используемых компонентов в градиенте плотности, пониженную концентрацию сахарозы и тому подобное. В частности, градиент плотности- 20005425 предоставляет возможность для предотвращения образования осадка из экзосомы, когда образец подвергается ультрацентрифугированию. Различие в удельном парциальном объеме растворимого белка (примерно 0,73) и экзосом (примерно 0,88) и агрегированного белка делает его идеальным способом для разделения и очистки. Агрегированный белок (плотность примерно 1,35), как ожидается, осаждается сквозь градиент плотности, в то время как экзосомы удерживаются в плотной части градиента плотности. Вкратце, способ описывается следующим образом (схема этого процесса приведена на фиг. 8 а и 8b). Добавление раствора в нижней части пробирки центрифуги с более высокой плотностью (то есть нижнего слоя в градиенте), по сравнению с концентрированным раствором декзосом, приводит к формированию прерывистости или градиента (то есть к резкому изменению плотности). Градиент приводит к исключению молекул с более низкими коэффициентами седиментации. Более того, градиент делает более легким повторное суспендирование любого седиментировавшего материала в конце процесса и предотвращает повреждение частиц, которые не могут противостоять образованию осадка. Более того, в качестве другого преимущества предполагается, что градиент плотности предоставляет возможность для дополнительного устранения из композиции любого потенциально загрязняющего агрегированного белка, в частности агрегированного гаптоглобина. Мембранные везикулы, в частности декзосомы, как показано, имеют плотность от 1,100 до 1,140 г/мл. Соответственно, градиент плотности должен иметь конечную плотность в пределах примерно между 1,10 и примерно 1,15. Композиция градиента плотности может быть адаптирована специалистом в данной области с тем,чтобы была достигнута указанная выше предпочтительная конечная плотность. Раствор для градиента плотности является предпочтительно слегка гиперосмотическим с осмолярностью в пределах 700-800 мОс. В предпочтительном воплощении градиент плотности состоит из сахарозы/D2O в Трис буфере. Добавление тяжелой сахарозы/Трис D2O буфера в нижнюю часть каждой пробирки вытесняет концентрированный раствор декзосом вверх, с формированием видимой границы раздела. Ультрацентрифугирование при 100000g в течение приблизительно одного часа или получаса осаждает декзосомы в более тяжелой области градиента плотности сахароза/Трис D2O. Тяжелая область градиента содержит популяцию обогащенных и более очищенных декзосом. Очень мало декзосом находится либо выше тяжелой области градиента плотности, либо в осадке, который иногда виден на дне пробирки. Более того,D2O ранее использовался при клинических исследованиях и не демонстрирует никаких токсических воздействий при тех концентрациях, которые используются. В этом отношении природное содержание дейтерия у человека составляет 15 мг/кг (0,15 мас.%). Предпочтительно, когда используется градиент плотности D2 О/сахароза, плотность исходного раствора для градиента должна находиться в пределах примерно 1,175-1,210 г/мл (отклонения от этих конкретных пределов также могут использоваться). В самом деле, авторы теперь доказали, что диффузияD2 О/сахарозы осуществляется в градиенте плотности во время центрифугирования, приводя к образованию мини-градиента и конечной плотности в пределах между примерно 1,1 и примерно 1,15 г/мл (то есть плотность в сформировавшемся тяжелом слое градиента плотности, согласно измерениям, составляет между 1,100 и 1,150 г/мл). Этого не ожидалось, и это обеспечивает дополнительные преимущества на стадии очистки, так как при формировании мини-градиента градиент плотности предоставляет возможность для дополнительной очистки экзосом. В других случаях могут быть приготовлены другие растворы наряду с раствором сахароза/D2 О, когда плотность раствора является более высокой, чем у экзосом. В этом отношении может использоваться вода с двумя изотопными метками (то есть, D217O или D218O), которая предоставила бы возможность даже для дополнительного уменьшения количества сахарозы в градиенте плотности. Плотность доступнойD218O (97% чистота) составляет 1,22. Смесь D2O и D217O или D218O может использоваться для выделения везикул и клеточных фракций различной плотности без добавления дополнительных компонентов. Более высокие концентрации сахарозы в H2O (не дейтерированной) также могут быть приготовлены для получения раствора со сравнимой плотностью, хотя такой раствор был бы значительно более гиперосмотическим и может вызывать лизис декзосом. Коммерческие среды для создания градиента плотности, включающие йодиксанол (то есть OptiPrep), Percoll и Ficoll, могут использоваться для удержания декзосом подобным же образом, для лабораторных процессов и аналитических целей. Очищенные экзосомы могут быть собраны из плотной части градиента с помощью любого соответствующего средства, включая прокалывание пробирки с помощью иглы, пипетирование и тому подобное. Приготовление и кондиционирование Приготовление экзосом с помощью диафильтрации Очищенные экзосомы могут быть приготовлены в различных буферах или суспензиях, пригодных для использования при клиническом применении или при дальнейшем хранении. Для этой цели очищенные экзосомы могут подвергаться замене буфера с помощью диафильтрации,с использованием 500 кДа картриджа для ультрафильтрации в виде полого волокна, идентичного по формату тому, который использовался ранее для концентрирования и/или диафильтрации (смотри предыдущее обсуждение). Картридж предпочтительно предварительно кондиционируется с помощью буфе- 21005425 ра, содержащего hSA (например, 100 мкг/мл), который является не содержащим загрязнений гаптоглобином, в течение минимум 15 мин перед диафильтрацией. Видимо, присутствие hSA предотвращает неспецифичные потери декзосом из-за связывания с подложкой в виде полого волокна. Фракции, полученные при ультрацентрифугировании в градиенте плотности (приблизительно 16 мл), содержащие очищенные (с введенным антигеном) экзосомы, подвергаются минимум 5-кратной по объему замене буфера для удаления компонентов градиента плотности (то есть минимум 98% замене буфера). Используется установка, идентичная той, которая изображена на фиг. 5, однако картридж с полыми волокнами уменьшается в размерах для согласования с меньшим объемом. Как описано ранее, диафильтрация осуществляется при низких усилиях сдвига (то есть 2000 с-1), которые могут вообще не потребоваться. Типичный результат SDS-PAGE образца декзосом при 1/2800 от его исходного объема представлен на фиг. 10. Несколько препаратов буфера могут использоваться для приготовления экзосомы. Типичный буфер содержит разбавители USP/NF. Раствор препарата может содержать следующие компоненты: 1) буферный агент, такой как Трис, 2) криопротектор, такой как сахароза, треалоза, глюкоза, глицерин и тому подобное, 3) соли, такие как NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2 и тому подобное, 4) разрыхляющие агенты, такие как маннит, глицин, крахмал и тому подобное, 5) антиоксиданты, 6) витамины, 7) стабилизирующие белки и пептиды, такие как hSA, и 8) другие широко применяемые разбавители, используемые в препаратах. В этом отношении цель настоящего изобретения заключается в композиции, содержащей (i) мембранные везикулы, (ii) буферный агент и (iii) криопротектор или стабилизирующее соединение. Композиция, предпочтительно, дополнительно содержит (iv) соли и/или разрыхляющий агент, и/или антиоксиданты, и/или витамины. Типичные буферы содержат PBS, 20 мМ Трис/5% сахарозы/1 мМ MgCl2, значение рН составляет 7,4 или 20 мМ Трис/5% сахарозы/1 мМ MgCl2 100 мкг/мл hSA, значение рН составляет 7,4 и подвергаются ультрафильтрации для удаления гаптоглобина. Предпочтительно, раствор препарата, как описано выше, является по существу не содержащим гаптоглобина (или родственных полимеров, а также частиц). В этом отношении раствор препарата (или его отдельные индивидуальные компоненты, такие как раствор альбумина) могут быть подвергнуты ультрафильтрации для устранения гаптоглобина, как описано ранее. Эта конечная обработка дополнительно дает гарантию более высокого качества продукта. Стерильная фильтрация и замораживание экзосом Наконец, собранный (или приготовленный) материал может подвергаться дополнительной обработке (обработкам) и/или стадиям фильтрации, в частности, для целей стерилизации. В этом отношении экзосомы могут быть отфильтрованы в стерильных условиях через фильтры с диаметром, меньшим или равным 0,3 мкм. Типичная стерилизация включает в себя фильтрацию через 0,22 мкм шприцевый фильтр(25 мм) с минимальными потерями (смотри результаты анализа HLA/DR). Фильтры, состоящие из материала "Durapore" от Millipore, могут использоваться при стерильной фильтрации. Другие материалы фильтров, состоящие из ацетата целлюлозы или полиэфирсульфона, также могут использоваться. Шприцевые фильтры предпочтительно смачиваются предварительно препаратом буфера, содержащим 100 мкг/мл hSA (минус гаптоглобин), перед фильтрованием экзосом. Образец экзосом (16 мл) может фильтроваться в стерильных условиях либо при контролируемых параметрах с помощью плунжерного насоса, либо с помощью давления, производимого вручную. Очищенные экзосомы (по выбору, приготовленные и/или стерилизованные) могут также быть заморожены и храниться при -80 С, или при других температурах хранения, -20 С или 4 С. Охлаждение предпочтительно осуществляется при контролируемой скорости 1/мин с помощью криоконтейнера "Mr.Frosty" -1C (Nalgene Inc). Другие способы медленного или быстрого замораживания в жидком N2 также могут быть использованы. В этом отношении цель настоящего изобретения также заключается в композиции, содержащей замороженные экзосомы. Контроль качества Настоящее изобретение также описывает и предусматривает новые композиции и способы, которые могут использоваться для характеризации препаратов мембранных везикул, которые приготавливаются(например, очищенных и/или в виде препарата), или во время процесса приготовления. Композиции и способы настоящего изобретения могут использоваться для определения количества экзосом в образце или композиции, для определения фенотипа экзосом в препарате и для оценки биологической активности препарата экзосом. Эти способы являются особенно пригодными для использования при характеризации продукта, предназначенного для использования в клинических применениях, то есть для контроля качества и композиции препарата экзосом. Эти способы являются очень важными для терапевтических целей, так как используются по существу аутологичные (то есть пациент для пациента) препараты везикул, которые требуют индивидуальной характеризации параметров. Эти композиции и способы могут использоваться для характеризации препаратов экзосом из различных источников (то есть антигенпрезентирующих клеток, клеток опухолей и тому подобное), восприимчивость к антигену (нагруженные- 22005425 антигеном, не содержащие антигенов и тому подобное), только что приготовленных или хранимых, из первичных клеток или иммортализованных линий клеток и тому подобное. Дозирование экзосом Разработан способ для оценки количества мембранных везикул, присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя формирование и детектирование иммунного комплекса с использованием антител, которые распознают поверхностные маркеры клеток, присутствующие на экзосомах. Более конкретно, способ дозирования мембранных везикул в образце в соответствии с настоящим изобретением включает в себя (i) адсорбцию образца на твердой подложке, (ii) взаимодействие адсорбирующей подложки с (иммобилизованным) антителом, специфичным по отношению к поверхностным маркерам клеток на экзосоме, и (iii) определение присутствия иммунных комплексов антитело-антиген(или их дозирование). Более предпочтительно, антитело, специфичное по отношению к поверхностному маркеру клеток на экзосомах, представляет собой антитело анти-класса II, то есть антитело, которое связывает молекулы МНС класса II, или антитело анти-класса I. Более того, в конкретных воплощениях используется, по меньшей мере, одно второе иммобилизованное антитело, параллельно, для дополнительного повышения селективности анализа по отношению к экзосомам. Например, предпочтительные дополнительные иммобилизованные антитела являются направленными против поверхностного маркера клеток CD81 или против молекул МНС класса I. Использование антитела анти-СD81 является преимущественным для характеризации (дозирования) декзосом, так как CD81 является значительно меньшим, чем дендритные клетки и, таким образом, обеспечивает сигнал, который является специфичным по отношению к декзосомам. На этой стадии могут использоваться и другие антитела, специфичные по отношению к экзосомам, например, такие как анти-СD63 или анти-СD9. В предпочтительном воплощении экзосомы, таким образом, адсорбируются на твердой подложке и взаимодействуют по отдельности с антителом анти-класса II и с антителом анти-СD81. Иммунные комплексы антитело-антиген, формируемые в результате на стадии взаимодействия, могут детектироваться в соответствии с обычными иммунологическими методиками. Предпочтительно,комплексы обнаруживают с использованием меченого антитела обнаружения, которое связывает первое и/или второе иммобилизованное антитело. Обнаруженное антитело может быть помечено с помощью радиоактивности, ферментативной активности, флуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки и тому подобное. Измерение комплексов коррелирует с количеством экзосом, присутствующих в образце(то есть, обеспечивает их прямую индикацию). Когда используются два антитела (например, анти-классаII и анти-СD81), среднее количество или отношение количеств комплексов, детектируемых с помощью каждого антитела, могут быть использованы в качестве параметра для количественного определения. Различные антитела, которые должны использоваться в способе, могут быть моноклональными или поликлональными антителами либо в природной форме, либо модифицированными (например, очеловеченными) фрагментами или их производными. В типичных экспериментах иммобилизованные антитела являются моноклональными антителами. В другом типичном эксперименте антитело обнаружения представляет собой меченое моноклональное или поликлональное антитело. При осуществлении настоящего способа могут использоваться различные твердые подложки, такие как многолуночный планшет, в частности 96-луночный планшет или любой другой титровальный планшет. Более того, при осуществлении настоящего способа дозирования является в высшей степени предпочтительным использование очищенных образцов экзосом в порядке уменьшения неспецифичного фонового сигнала. Для этой цели образец является предпочтительно очищенным образцом экзосом, еще более предпочтительно образец подвергается (ультра) центрифугированию в градиенте плотности. Для аналитических целей несколько миллилитров раствора экзосом из 200 мкл центрифугируют в градиенте плотности из D20 и сахарозы. Анализ ELISA может быть осуществлен непосредственно в растворе с градиентом плотности. Эта простая стадия очистки предоставляет возможность для достаточного концентрирования и очистки. Извлечение является близким к 100%. В одном из конкретных воплощений анализы на основе ELISA разрабатываются в порядке обеспечения количественной меры экзосом в образце, композиции, жидкости и тому подобное. Фигура 11 а иллюстрирует измерение HLA-DR (то есть, МНС II), и фиг. 11b иллюстрирует измерение CD81 в декзосомах. Анализ HLA/DR является как чувствительным, так и функционально соотносимым с активностью декзосом, так как HLA/DR участвуют в презентировании антигенов. Этот анализ выбирается в качестве количественного анализа для препарата декзосом. Анализ ELISA для определения HLA/DR количественно определяет декзосомы в конечном продукте. Так как этот анализ может также измерять HLA/DR на дендритных клетках, такой анализ обеспечивает средства для соотнесения дозы HLA/DR с количеством дендритных клеток и с объемом выделенных декзосом. Определение фенотипа экзосом Разработан способ для оценки фенотипа мембранных везикул, присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя формирование и детектирование иммунного комплек- 23005425 са с использованием антител, которые распознают несколько маркеров (поверхности) клеток, присутствующих на (в) экзосомах. Способ дополнительно включает в себя образование комплексов экзосом на твердой подложке, такой как шарики, с целью предоставления возможности для чувствительного и безопасного определения фенотипа каждого препарата. В этом отношении цель настоящего изобретения заключается в способе характеризации мембранных везикул в препарате, включающем в себя взаимодействие, параллельно, образцов препарата мембранных везикул с двумя или более антителами, специфичными по отношению к маркеру везикул, и определение формирования иммунных комплексов антиген-антитело. Способ, более конкретно, является направленным на определение фенотипа препарата экзосом, то есть, конкретного типа маркеров на поверхности клеток, экспрессируемых экзосомами в препарате. Принимая во внимание аутологичную природу препаратов экзосом, фенотип является главным при характеризации композиции препарата как с точки зрения структуры, так и с точки зрения потенциальной активности. Более предпочтительно, способ характеризации препарата включает в себя исходную стадию связывания экзосомы на твердых подложках, таких как шарики. Еще более предпочтительно, экзосомы являются ковалентно связанными с твердыми подложками, такими как шарики, или с помощью аффинного связывания, опосредуемого антителом. В типичном воплощении используются шарики диаметром примерно от 1 до 10 нм, более предпочтительно от 3 до 5 мкм, и они могут нести на себе свыше 1000 экзосом, ковалентно связанных с ними или присоединенных с помощью иммуноаффинности, более предпочтительно в пределах между 2000 и 5000 экзосомами. Покрытые экзосомами шарики затем распределяются в лунки планшета и приводятся в контакт параллельно с выбранными антителами. Антитела могут связывать либо маркеры поверхности клетки, либо внутренние белки. В самом деле, предполагается, что связывание экзосом с твердыми подложками, такими как шарики, делает определенные внутренние белки доступными для внешних агентов, таких как антитела. Предпочтительно, используются два антитела или более из перечисленных ниже в табл. 1. Таблица 1: антисыворотка кролика против пептида лактадгерина Предпочтительно, эти антитела метятся с целью предоставления возможности для детектирования и/или дозирования формирующихся иммунных комплексов. Метка может быть радиоактивной, химической, ферментативной, флуоресцентной и тому подобное. Предпочтительными метками являются флуоресцентные, такие как FITC или РЕ. Более предпочтительно, используются по меньшей мере 5 различных антител, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 различных антител. Антитела являются предпочтительно моноклональными. В одном из конкретных воплощений иммунологическое определение фенотипа осуществляется с использованием способа прямого окрашивания. Малую аликвоту очищенных экзосом инкубируют вместе с магнитными сферами, покрытыми антиклассом II (например, анти-HLA/DR). Экзосомы, связанные с магнитными сферами, покрытыми анти-HLA-DR, затем инкубируются вместе с мечеными антителами,более предпочтительно флуоресцентно конъюгированными моноклональными антителами (например,FITC или РЕ). При использовании проточной цитометрии могут быть измерены четыре параметра: прямое рассеяние, обратное рассеяние и два флуоресцентных канала. Этот анализ на основе двухцветной- 24005425 проточной цитометрии дает возможность для идентификации антигенов на экзосомах в одном измерении. Результаты, полученные для нескольких препаратов декзосом, представлены на фиг. 14. Эти результаты четко демонстрируют эффективность и быстроту заявляемого способа при иммунологическом определении фенотипа экзосом в препаратах. Функционирование экзосом Разработан дополнительный способ для оценки биологической активности мембранных везикул,присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя оценку активацииCTL лимфоцитов из популяции Т-лимфоцитов с использованием антигена сравнения, например суперантигена (например, SEE). Конкретная цель настоящего изобретения, таким образом, заключается в способе характеризации активности мембранных везикул, включающем в себя взаимодействие везикул, нагруженных суперантигеном, Т-лимфоцитами, в присутствии А-клеток и определение активации Т-лимфоцитов. Суперантигены получают с помощью множества различных патогенов, подобных бактериям и вирусам. Суперантигены связываются с молекулами МНС II непосредственно, не подвергшись обработке. Вместо связывания в бороздке молекулы МНС II суперантигены связываются на наружной поверхности молекулы МНС II и в области V рецептора Т-лимфоцита (TCR) и являются способными к стимулированию очень большого количества Т-лимфоцитов (2-20%). Тот факт, что суперантигены могут связываться с различными МНС II и TCR и индуцировать сильные реакции Т-лимфоцита, делает их привлекательными агентами для создания общего и чувствительного анализа для исследования функции презентирования антигенов декзосом. Суперантиген может быть приготовлен или выделен из различных источников. Предпочтительный суперантиген для использования в настоящем изобретении представляет собой антиген SEE, ET 404 (Toxin Technology Inc.). Могут использоваться и дополнительные суперантигены, такие как SEA и SEB. Т-лимфоциты могут быть любой только что приготовленной популяцией клеток, содержащей Тлимфоциты, таких, например, как одноядерные клетки периферийной крови ("РВМС"), а также любой иммортализованной линией Т-лимфоцитов, такой как клетки Jurcat. Клетки Jurcat представляют собой иммортализованные Т-лимфоциты человека, секретирующие IL-2 при активации, которые могут функционировать в качестве иммунореактивных клеток при этом анализе. TCR V 8 клеток Jurcat ассоциируется с SEE. Как иммортализованные клетки опухоли, клетки Jurcat являются, в частности, полезными,так как они гораздо менее гетерогенны и их легче выращивать в лаборатории, чем первичные клетки. А-клетками могут быть любые клетки, которые являются способными к опосредованию активационного сигнала для Т-лимфоцитов в настоящем биологическом анализе. А-клетки могут быть дендритными клетками, такими как любая иммунокомпетентная культура первичных дендритных клеток или линия дендритных клеток. А-клетки могут также быть другими иммунными клетками или линиями клеток, в частности антиген-презентирующими клетками или линиями клеток, такими как клетки Raji. Клетки Raji представляют собой EBV-иммортализованные В-лимфоциты и, как показано, функционируют при настоящем анализе. Клетки Raji могут культивироваться в любой пригодной для использования среде, такой, например, как RPMI. При осуществлении заявляемого способа везикулы, нагруженные суперантигеном, приводятся в контакт с иммунореактивными Т-лимфоцитами в присутствии А-клеток, и оценивается активация Тлимфоцитов. Измерение активации Т-лимфоцитов может быть осуществлено в соответствии с различными методиками, такими как высвобождение цитокинов, синтез белков, лизис иммунореактивных клеток и тому подобное. В предпочтительном воплощении активация Т-лимфоцитов измеряется с помощью определения продуцирования цитокинов в среде, более конкретно, продуцирования в среде интерлейкина-2. Как правило, IL-2 измеряется с помощью ELISA. В настоящем способе могут быть нагружены суперантигеном мембранные везикулы сами по себе или клетки, продуцирующие мембранные везикулы (полученные в результате везикулы затем соприкасаются с суперантигеном). В предпочтительном воплощении в контакт с суперантигеном приводятся везикулы. В конкретном воплощении в этом функциональном анализе суперантиген SEE сначала инкубируют вместе с экзосомами, приготовленными из супернатанта культуры клеток с помощью ультрафильтрации,центрифугирования в градиенте плотности и диафильтрации в препарате буфера. Выделенные экзосомы могут использоваться свежими или могут также храниться замороженными при -80 С в PBS. Комплексы экзосом и SEE затем отделяются от несвязанного SEE путем аналитического зонального центрифугирования с использованием, например, Optiprep. Optiprep (также известный как йодиксанол) представляет собой йодированные среды для создания градиента плотности (Nycomed), которые предоставляют возможность для количественного извлечения комплексов экзосома/SEE из свободного SEE. Эта стадия является, таким образом, важной при биологическом анализе, для количественного анализа каждой полученной партии экзосом. Выделенные комплексы используются дляиндуцирования активации Т- 25005425 лимфоцита в присутствии клеток Raji в качестве А-клеток. Признаком активации Т-лимфоцитов является секреция IL-2 клетками Jurkat. Конкретными преимуществами настоящего способа приготовления по сравнению с известными методиками седиментации с использованием последовательных стадий центрифугирования являются следующие. Продолжительность обработки: обработка с помощью седиментации является более длительной по сравнению с ультрафильтрацией и ультрацентрифугированием. 4 л супернатанта культуры ткани потребовали бы как минимум 12 ч для обработки с помощью седиментации, в то время как сочетание ультрафильтрации и одного захода ультрацентрифугирования заняло бы 6-7 ч, как это и происходит в настоящее время. Замкнутая система - совместимость с GMP: единственная стадия центрифугирования в процессе осуществляется с использованием малого объема и может быть реализована в доступных в настоящее время герметичных пробирках (емкость ротора - 6 пробирок, по 33 мл каждая). Это устраняет проблему,которая возникла бы, если бы стадия центрифугирования осуществлялась на большом объеме (несколько литров). В настоящее время не существует герметичных пробирок для центрифугирования, предназначенных для такого большого объема. Центрифугирование должно производиться в открытых пробирках,которые не являются одноразовыми и не соответствуют существующим ограничивающим предписаниям. Осветление, ультрафильтрация и стерильная фильтрация, все вместе, выполняются в биологически безопасном боксе и рассматриваются как закрытая, по существу, система. Ультрацентрифугирование теперь осуществляется также и в закрытых пробирках, что устраняет проблемы, которые могли бы возникнуть из-за загрязнения в открытой пробирке. Ультрафильтрация сред: повторная обработка сред, таких как AIM V, для удаления агрегированного белка является важной стадией в общей схеме процесса очистки. Предварительное удаление белков,которые выделяются вместе с ними, приводит к получению более чистого продукта экзосом после обработки. В частности, установлено, что настоящее изобретение предоставляет возможность для получения композиций, которые являются по существу не содержащими агрегатов, то есть, когда агрегатов имеется меньше, чем 2-4% от всего белка. Более того, удаление гаптоглобина уменьшает нежелательные иммунные ответы. Потенциальное агрегирование экзосом после седиментации: седиментация экзосом приводит к очень высокой их локальной концентрации. Высокая концентрация экзосом в лепешке может приводить к образованию агрегированного продукта. Электронная микроскопия дает некоторые указания относительно того, что экзосомы образуют агрегаты после седиментации по сравнению со способом, использующим ультрафильтрацию. Во-вторых, видимо, ультрафильтрация экзосом приводит к меньшему количеству остатков, что можно увидеть с помощью электронного микроскопа. Температура обработки: Обработка, такая как диафильтрация, может выполняться на льду, то есть,при температуре в пределах примерно между 4 и 10 С. Это является преимуществом, так как равновесие между свободными пептидами и теми, которые связаны с экзосомами посредством MHCI, может подвергаться воздействию температуры, и поскольку такие температуры предотвращают воздействие гидролитических загрязняющих ферментов, таких как протеазы. Чистота экзосом: седиментация экзосом привносит риск загрязнения остатками клеток и примесями из сред. Удаление загрязняющих агрегированных белков является, в частности, важным из-за их высокой иммуногенности. Извлечение экзосом: окончательное извлечение составляет 60-75%, значительно больше, чем при исходном способе седиментации (в среднем, 15% из 9 экспериментов). Это означает, что доза, доступная для лечения пациента, может быть увеличена в 5 раз, если потребуется, или возникает возможность осуществления афереза на меньшем объеме крови и культивирования в 5 раз меньше клеток, что обуславливает значительное понижение стоимости процесса. Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующих примеров, которые должны рассматриваться в качестве иллюстративных и не ограничивающих. Примеры 1. Приготовление сред. Перед использованием культуральную среду (в этом примере AIM V клинического качества, бессывороточную культуральную среду для клеток от Life Technologies, Inc.) обрабатывают с помощью ультрафильтрации для удаления агрегированных белков, их удаление не влияет на рост клетки, но значительно способствует последующему выделению чистых декзосом. Ультрафильтрация сред осуществляется с использованием 500 кДа мембран в виде полого волокна(от A/G Technology, Needham, Mass или от поставщика, поставляющего родственный продукт). Этот размер мембраны удерживает агрегированный белок в удерживаемой фракции, в то же время давая возможность не агрегированным белкам проходить сквозь нее вместе с пермеатом. Пермеат собирают, фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр в бутылки и хранят при 4 С до тех пор, пока он не потребуется.- 26005425 В конкретном эксперименте для обработки 50 л AIM V используется картридж с полыми волокнамиUFP-500-C-35A (диаметр просвета 0,5 мм, площадь поверхности 14,5 кв.фут) от A/G technology. Входной поток имеет скорость потока 13 л/мин, что приводит к возникновению потока растворенного вещества 1 л/мин и входного и выходного давления 12-16 фунт/кв.дюйм и 10 фунт/кв.дюйм, соответственно. Процесс завершается в пределах 1 ч. Пермеат фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр SartoPore или SartoBran (Sartorius Inc). Фиг. 3 и 4 демонстрируют пониженное содержание агрегатов в среде. Количественное определение гаптоглобина с помощью ELISA показывает, что более чем 99% агрегатов,связанных с гаптоглобином, удаляется путем ультрафильтрации. Более конкретно, УФ среды содержат меньше, чем примерно 5 нг/мл агрегированного гаптоглобина. В частности, анализ ВСА показывает, что ультрафильтрация сред AIM V удаляет 2-4% от всего белка в средах. Большая часть фракции удаленного белка представляет собой агрегаты. Концентрирование белка в средах не изменяет значительно процесс ультрафильтрации, только концентрацию частиц. Осаждение подвергнутой ультрафильтрованию AIM V (УФ AIM V) приводит к некоторому набору белков, по существу отличному от того, который наблюдается у сред AIM V, которые не подвергались ультрафильтрованию (смотри фигуру 3). Более того, осаждение подвергнутой ультрафильтрованию AIM V через 3 месяца после обработки не обнаруживает присутствия агрегированного белка, как показано с помощью SDS-PAGE (смотри фигуру 4), подтверждая, что обработанная среда может храниться в течение долгих периодов времени. Ультрафильтрация композиций на основе альбумина (например, hSA) также предоставляет возможность для приготовления нагретых продуктов hSA, содержащих менее, чем примерно 10 нг агрегированного гаптоглобина на мг hSA, то есть меньше, чем примерно 0,001% агрегированного гаптоглобина(масс). 2. Продуцирование и культивирование незрелых дендритных клеток. Предшественники дендритных клеток отбираются из периферической крови пациента после лейкофереза. Процедура культивирования клеток является бессывороточной и осуществляется в средах для культивирования клеток клинического качества, которые дополнительно подвергаются ультрафильтрованию для удаления агрегированного белка (или частиц), как определено в примере 1. Типичный выход от лейкофереза содержит примерно от 1 до 2 Е 10 клеток. Клетки промывают четыре раза в PBS, с добавлением 0,1% сывороточного альбумина человека (клиническая чистота), для удаления тромбоцитов. Затем клетки размещают в Т-образных колбах площадью приблизительно 100-150 см 2 при плотности клеток 200106 клеток/колба в бессывороточных средах, подвергнутых ультрафильтрованию. Очистка предшественников дендритных клеток от лейкоцитов в материале, полученном после лейкофереза, основывается на адгезивных свойствах моноцитов на заряженных полистирольных поверхностях, таких, как те, что имеются в стандартных коммерческих колбах для культур тканей. После двух часов инкубирования моноциты прилипают и удерживаются, в то время как оставшиеся не прилипающие клетки удаляют с помощью замены среды, с использованием сред, где имеется GM-CSF и IL-4 или IL-13, при концентрации 50 нг/мл, каждый, а также гамма интерферон. Прилипшие моноциты подвергаются дифференциации в присутствии GM-CSF и IL-4 или IL-13, превращаясь в незрелые дендритные клетки. В день 5 культивирования к этим клеткам добавляют дополнительно GM-CSF и IL-13 или IL-4. Интерферон гамма, при концентрации 500 ед/мл может быть добавлен к клеткам в порядке поддержания дендритных клеток в незрелом состоянии. 3. Процедура нагрузки антигеном в модельной системе. Проделываются предварительные эксперименты с целью оценки технических параметров для нагрузки антигенов на дендритные клетки. Для этой цели в незрелые дендритные клетки вводится пептидCMV в порядке получения декзосом, нагруженных пептидами. Затем декзосомы выделяются с помощью стандартных процедур, и их активность анализируется путем измерения высвобождения IFN- с помощью CMV-специфичного клона Т-лимфоцитов. Декзосомы, нагруженные пептидами CMV, специфично стимулируют клон анти-CMV Т-лимфоцитов и требуют присутствия дендритных клеток согласно с данными авторов с использованием анализа активности с использованием SEE (фиг. 2). Таким образом, при использовании модельной системы CMV пептид может быть включен в декзосомы путем добавления пептида к культуре DC в день 5. Кроме того, данные авторов о том, что декзосомы, нагруженные пептидом, требуют присутствия DC для их стимуляторного воздействия на Тлимфоциты, находятся в согласии с требованием включения Т-лимфоцитов, DC и декзосом в биологический анализ с использованием SEE, тем самым подчеркивая тесную взаимосвязь между поведением декзосом в этих двух анализах. 4. Осветление. 4 л супернатанта культуры ткани собирают и фильтруют через 3/0,8 мкм Sartoclean СА (площадь поверхности 500 см 2) (Sartorius Inc) при скорости потока 250 мл/мин. Давление на входе фильтра не превосходит 10 фунт/кв.дюйм (фиг. 5). 5. Концентрирование.- 27005425 4 л осветленной среды культуры ткани концентрируют до 100 мл с помощью картриджа с полыми волокнами UFP-500-C-4A (площадь поверхности 0,7 кв.фут.; диаметр просвета 0,5 мм) от A/G technology. Скорость потока пермеата составляет между 225 и 275 мл/мин, а входное и выходное давление 4-7 фунт/кв.дюйм и 3-6 фунт/кв.дюйм, соответственно. Скорость потока пермеата при этих условиях находится в пределах между 40 и 60 мл/мин. Процесс требует для завершения приблизительно 60-80 мин (фиг. 6). 6. Диафильтрация. В конкретном примере концентрат экзосом подвергают диафильтрации вместе с 5 объемами PBS(то есть 100 мл концентрата декзосом, подвергающегося диафильтрации, против 500 мл PBS). Результаты SDS-PAGE концентрированных декзосом до и после диафильтрации приведены на фиг. 7. Эта стадия,а также все последующие стадии, выполняются в условиях охлаждения (примерно между 4 и 10 С). 7. Разделение в градиенте плотности (прерывистый градиент). В конкретном примере концентрированная и диафильтрованная культуральная среда, содержащая экзосомы, а также в тех примерах, когда в экзосомы вводится антиген (антигены), очищается с помощью(ультра)центрифугирования в градиенте плотности следующим образом: концентрат экзосом (приблизительно 100 мл) в равных аликвотах помещается в пробирки для центрифугирования поверх 4 мл буфера сахароза/Трис D2O. Градиент плотности с применением D2O состоит из 25-30% сахароза/20 мМ ТрисD2O (мас./мас.%) (значение рН 7,5-7,7). Плотность изменяется в пределах между 1,18 и 1,21 г/мл. Пробирки герметизуются для обеспечения замкнутости системы. Фиг. 9 а изображает результаты SDS-PAGE образца до и после ультрацентрифугирования, а также содержимого области выше градиента плотности в плотной части градиента или в осадке. Как показано,большая часть белка не седиментирует в область плотной части градиента плотности сахароза/Трис D2O. Это дополнительно подтверждается на фиг. 9b, которая демонстрирует, что по меньшей мере 90% экзосом извлекаются в область плотной части градиента плотности. 8. Приготовление и кондиционирование. Очищенные экзосомы подвергаются замене буфера путем диафильтрации с помощью 500 кДа картриджа для ультрафильтрации в виде полого волокна, идентичного по формату тому, который использовался ранее для концентрирования и/или диафильтрации (смотри примеры 5 и 6). Картридж предварительно кондиционируется с помощью hSA (например, 100 мкг/мл) в течение, как минимум, 15 мин перед диафильтрацией, и его размер подгоняется для обработки 10-20 мл среды. Типичные результаты SDSPAGE для образца декзосом при 1/2800 от его исходного объема приведены на фиг. 10. Приготовленные экзосомы фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм шприцевой фильтр(Millex GV (шприц 25 мм. Количество агрегированного гаптоглобина, присутствующего в препарате экзосом (200-кратное концентрирование от исходной среды), кондиционированном в буфере PBS, измеряется с помощьюELISA и, как определено, является по существу более низким, чем примерно 0,1 нг/мл, более конкретно 0,091 нг/мл или 0,044 нг/мл для двух исследованных препаратов. Для сравнения, содержание агрегированного гаптоглобина в препарате экзосом, полученном в соответствии с опубликованными ранее способами, после идентичного 200-кратного концентрирования, как обнаружено с помощью ELISA, составляет 400 мкг/мл. Это соответствует количественному извлечению агрегированного гаптоглобина, присутствующего в неочищенной среде AIM V (2 мкг/мл). Таким образом, способ по настоящему изобретению,по сравнению с известными ранее способами, приводит к уменьшению загрязнения агрегированным гаптоглобином препаратов экзосом в 5-10 миллионов раз (400 мкг/мл против 40-90 пг/мл). Так как ультрафильтрация сред понижает содержание агрегированного гаптоглобина с коэффициентом примерно пятьсот, дополнительные стадии ультрафильтрации, диафильтрации и/или центрифугирования в градиенте плотности также вносит очень значительный вклад в улучшение рабочих характеристик очистки. Эти результаты дополнительно иллюстрируют эффективность настоящих способов при удалении агрегированного гаптоглобина. 9. Дозирование экзосом. В конкретном воплощении разработан анализ на основе ELISA в порядке обеспечения количественного измерения экзосом в образце, композиции, жидкости и тому подобное. Фиг. 11 иллюстрирует измерение HLA-DR (то есть МНС II) (11b) и CD81 (11 а) в декзосомах. Анализ HLA/DR является как чувствительным, так и функционально представляющим активность декзосом. Этот анализ выбран в качестве анализа для количественного определения препарата декзосомы. Анализ подробно описывается ниже. Сигнал HLA/DR, измеряемый с помощью ELISA, используется для определения количества молекул МНС II, полученных из препарата декзосом. Количество МНС II, связанных с рядом типов клеток,описывалось ранее (Cella et al 1997). Эти значения приведены в табл. 2.- 28005425 Таблица 2. Приблизительные количества молекул МНС II на количество клеток (взято из Cella et al 997) Для количественного определения молекул HLA/DR лизат DC или лизат клеток Raji используются в качестве стандартов. Фиг. 11 показывает титрование анти-HLA/DR при фиксированной концентрации лизата незрелых DC. Из этого графика вычисляется количество HLA/DR молекул по отношению к незрелым дендритным клеткам, которое равно 5,8106 молекул/клетка, что находится в согласии с литературными данными, приведенными в табл. 1. Идентичный результат получен и для лизата клеток Raji(данные не показаны). Пример результатов анализа HLA/DR, полученных на препарате декзосом, приведен на фиг. 12 (А,В). Сигнал HLA/DR представлен на графике как функция от эквивалентного объема супернатанта. Количество молекул HLA/DR/мкл декзосом определено как равное 4,71010, после ультрацентрифугирования в градиенте плотности (то есть в УЦ-градиенте) и диафильтрации в препарате буфера. % извлечения для этого образца составляет 73% HLA/DR. Более конкретно, % извлечения является следующим: Стадия процесса Общий % извлечения Осветление через 0,8 мкм 100% 1 Ультрафильтрация - Концентрирование 100% 1 Ультрафильтрация - Диафильтрация 86+/-2% Градиент 2 Ультрафильтрация - Диафильтрация 85+/-2% Стерильная фильтрация, 0,2 мкм 75+/-3% В итоге, анализ ELISA для определения HLA/DR количественно определяет декзосомы в конечном продукте. Так как этот анализ может также измерять HLA/DR на дендритных клетках, этот анализ обеспечивает средства для соотнесения дозы HLA/DR на дендритную клетку и на объем выделенных декзосом. В этом отношении авторы, как правило, являются способными к генерации, как минимум, 100000HLA/DR молекул на одну незрелую DC после очистки (10-12 экспериментов). Подобный анализ осуществляется с использованием антител анти-класса I для иммобилизации, а именно антител, производимых клетками НС-10. Результаты представлены на фиг. 12(С,D). Согласно кривой титрования (12 С), количество молекул MHC-I может быть определено с помощью любого неизвестного препарата экзосом (12D). 10. Определение фенотипа экзосом. 5-10 мкл покрытых анти-HLA-DR магнитных сфер промывают в пробирке для микрофугирования вместе с 500 мкл PBS с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляют и к промытым сферам добавляют 25, 50 или 100 мкл концентрированного препарата экзосом (концентрация экзосом может быть вплоть до 1000 раз). Смесь инкубируют при 4 С в течение примерно 2 ч, на вращающемся столике. После инкубирования 500 мкл PBS добавляют к сферам со связанными экзосомами и сферы промывают с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляют и сферы со связанными экзосомами суспендируют в 200 мкл окрашивающего буфера. 20 мкл раствора сфер со связанными экзосомами аликвотируют в пробирки для анализа, которые затем приводятся в контакт, каждая по отдельности, с одним из меченых антител, выбранных для анализов. Антитела инкубируют в течение примерно 30 мин при 4 С. Затем к пробиркам добавляют окрашивающий буфер и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляют и добавляют раствор фиксатива (0,5 мл) в каждую пробирку. Каждая пробирка для анализа отбирается и анализируется с помощью проточной цитометрии с использованием устройства FACSCalibur. Результаты, полученные для нескольких препаратов декзосом, представлены на фиг. 13. Эти результаты ясно демонстрируют эффективность и быстроту заявляемого способа для иммунологического определения фенотипа препаратов экзосом. 11. Функциональный анализ. Приблизительно 20 мкл выделенных декзосом требуется для каждого исследования. Декзосомы инкубируют вместе с SEE при концентрации 100 нг/мл (10 мкл исходного раствора из 1 мкг/мл SEE в PBS с 0,1% BSA) в конечном объеме 100 мкл, в течение 1 ч, при 37 С. После 1 ч инкубирования комплексы декзосом и SEE (декзосома/SEE) отделяют от несвязанного SEE путем зонального ультрацентрифугирования (2,2 мл) на двухступенчатом градиенте плотности, состоящем из растворов Optiprep (фиг. 14-16). Градиент Optiprep получают путем сначала добавления 1,7 мл 10% Optiprep (1,67 мл Optiprep плюс 8,33 мл RPMI) в каждую пробирку для анализа. Затем 100 мкл 20% Optiprep (3,33 мл Optiprep плюс 6,67 мл RPMI) добавляют в нижнюю часть каждой пробирки, с последующим добавлением 100 мкл 40%Optiprep (6,67 мл Optiprep плюс 3,33 мл RPMI) под 20% Optiprep. Затем образцы экзосома/SEE наслаивают поверх ступеньки, при конечном объеме 200 мкл, в 0,1% BSA в PBS. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин при 100000 об/мин при 4 С с использованием медленного ускорения и замедления в роторе с качающимися подвесками (TLS-55). 200 мкл образцов собирают со дна пробирки, которая содержит комплексы экзосома/SEE, освобожденные от несвязанного SEE. Свободный SEE остается в зональном слое (10% Optiprep), в то время как комплекс экзосома/SEE седиментирует в 20-40% области пробирки. Поскольку Optiprep, как обнаружено, вмешивается в определение с помощью ELISA, использование распределения плотности из D2O и сахарозы является предпочтительным, если такое определение потребуется. Клетки Raji, декзосома/SEE (или суррогат/SEE), а затем клетки Jurcat добавляют в лунки планшета(100 мкл (30000 клеток) каждого вида клеток используется для каждой лунки). Также добавляют положительный и отрицательный контроли: клетки Jurcat сами по себе (отрицательный контроль), Jurkat плюс 1 нг/лунка SEE (отрицательный контроль), Raji сами по себе (отрицательный контроль), Raji иJurkat плюс декзосомы, в которые не вводится SEE (фоновый контроль), Raji и Jurkat плюс 1 нг/лункаSEE (положительный контроль). Планшет инкубируют в течение 18 ч при 37 с 5% CO2. Супернатант культуры клеток собирают из каждой лунки планшета с помощью центрифугирования при 1200 об/мин(с использованием держателей для планшета) в течение 15 мин. 200 мкл супернатанта используются в анализе ELISA для измерения секреции IL-2. Анализ ELISA может быть осуществлен немедленно или позднее (в этом случае планшет может быть завернут в парапленку и заморожен до тех пор, пока он не будет использоваться). Анализ IL2 с помощью ELISA осуществляется с использованием набора ELISA IL-2 (набор DuoDY202, RD Systems) в планшетах Costar ELISA (Costar 2581), следуя инструкциям производителя. Результаты показывают зависимую от дозы связь между секрецией IL2 и количеством экзосом на лунку,которое преобразуется в объем, эквивалентный объему исходного раствора для экзосом. Секреция IL2 является зависимой от SEE, поскольку экзосомы требуют SEE для стимулирования антигеннеспецифичных Т-лимфоцитов (например, Jurkat). Единица половины от максимального значения вводится как полуколичественная мера для титра декзосом в этом способе. Она определяется как объем экзосомы, при котором половина от максимальной секреции IL2 клетками Jurcat достигается при условиях,используемых в эксперименте. Чем меньшая единица половины от максимума измеряется, тем больше титр. 12. Непосредственная нагрузка пептидов. Этот пример описывает методологию непосредственной нагрузки, параметры, влияющие на нагрузку, конкуренцию при связывании, между пептидом сравнения и целевыми пептидами, с декзосомами и биологическую активность декзосом, нагруженных антигеном. Генерируется протокол, основывающийся на непосредственной нагрузке рестриктированного пептида HLA-A2. Такой же протокол может быть использован для рестриктированных пептидов HLA-A1. Также обсуждаются значение и преимущества непосредственной нагрузки декзосомы пептидами в клинических испытаниях при терапии. Этот пример показывает, что является возможным нагружать антигенные молекулы непосредственно на декзосомы, и что такие декзосомы с непосредственной нагрузкой являются способными к стимулированию клонов CTL. Результаты показывают, что непосредственная нагрузка может быть более эффективной, чем опосредованная нагрузка DC, так как необходимо более низкое количество пептидов. 12.1. Способы. Непосредственная нагрузка пептидов на экзосому в присутствии и отсутствие 2-m. Рестриктированный петид сравнения HLA-A2 FLPSDCFPSV, полученный из природного эпитопа антигена из ядра Hepatitis В, биотинилируется посредством цистеина. Он конкурирует с немеченым пептидом сравнения, что говорит о том, что биотинилированный пептид сохраняет свою способность к связыванию с молекулами HLA-A2. Для непосредственной нагрузки пептидами в присутствии экзогенного 2-m 100 мкл очищенных HLA-A2+ и HLA-A2- отрицательных декзосом обрабатывают с помощью равного объема лимонной кислоты или ацетатного буфера, значение рН 3,2-5,2, при 4 С, в течение 90 с, понижение значения рН способствуют элюированию связанных эндогенных пептидов. После обработки препарат немедленно нейтрализуют с помощью коктейля, значение рН 11, содержащего Трис, экзогенный пептид (конечная концентрация от 0,01 до 10 мкг/мл) и 2-m (конечная концентрация от 0 до 80 мкг/мл), и инкубируют при комнатной температуре для предоставления возможности преобразования тримолекулярного комплекса класса I, 2-m и пептида на поверхности декзосомы. Для непосредственной нагрузки в отсутствие экзогенного 2-m декзосомы сначала смешивают с экзогенным пептидом (конечная концентрация 10 или 100 мкг/мл), затем с равным объемом ацетатного буфера, значение рН 4,2-5,2, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Во время этого периода, осуществляется обмен пептидов, приводящий к связыванию экзогенного пептида, присутствующего в избытке. Экзогенный пептид может быть одним только биотинилированным пептидом или смесью меченого пептида с увеличенным количеством целевого пептида. Удаление несвязанного пептида и 2-m не является необходи
МПК / Метки
МПК: C07K 14/765, C12N 5/06, G01N 33/53, A61K 39/00
Метки: получения, мембранных, везикул, способы
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-5425-sposoby-polucheniya-membrannyh-vezikul.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способы получения мембранных везикул</a>
Предыдущий патент: Способы лечения связанного с bcl-2 нарушения с использованием bcl-2-антисмысловых олигомеров
Следующий патент: Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения
Случайный патент: Вращающееся устройство для создания давления