Способ лечения гиперсекреции слизи

1 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение имеет, в общем,отношение к области лечения легких. В частности, настоящее изобретение относится к ингибированию гиперсекреции слизи в легких и дыхательных путях посредством введения антагониста рецепторов эпидермального фактора роста (EGF-R). В дополнение к этому, настоящее изобретение относится также к методам разработки либо оценки подходящих средств, способных ингибировать гиперсекрецию слизи в легких. Предпосылки создания изобретения Реснитчатый эпителий в воздухоносных путях дыхательной системы выполняет роль основного механизма защиты, удаляющего пылевые частицы, проникшие вместе с вдыхаемым воздухом, либо возбудителей заразных болезней из дыхательных путей легких. Наряду с этим вещества, присутствующие в жидкостях дыхательных путей, ограничивают токсичность пылевых частиц и инактивируют возбудителей заразных болезней. Физический механизм кашля помогает удалять слизь из каналов дыхательных путей (см., например, "Foundations of Respiratory Care", под редакцией Пирсон (Pierson) и Какмарек (Kacmarek), (1992), компания Churchill Livingstone Inc., Нью-Йорк, штат НьюЙорк; "Harrison's Principles of Internal Medicine",под редакцией Фоси (Fauci) и других, (1997), 14 е издание, компания McGraw Hill, Нью-Йорк,штат Нью-Йорк). В состав реснитчатого эпителия входят реснитчатые эпителиальные клетки, эпителиальные бокаловидные клетки, а также серозные и мукоидные клетки, находящиеся в железах,расположенных под слизиcтoй оболочкой. Реснички окружены водным слоем (перицилиарная жидкость), выделяемым в просвет каналов дыхательных путей вследствие активного переноса хлоридов и пассивного перемещения воды через эпителий. Реснички соприкасаются со слизью,плавающей на поверхности упомянутого водного слоя, и посредством однонаправленного движения обеспечивают перемещение упомянутой слизи в направлении голосовой щели (Пирсон(Рierson) и Какмарек (Kacmarek), см. выше, и Фоси (Fauci) и другие, смотри выше). Слизь продуцируется эпителиальными бокаловидными клетками и клетками желез, расположенных под слизистой оболочкой, и выделяется в просвет дыхательных путей после дегрануляции. Несмотря на то, что слизь, как правило,облегчает выведение пылевых частиц, попавших вместе с вдыхаемым воздухом, либо возбудителей заразных болезней из дыхательных путей, гиперсекреция слизи в дыхательных путях может вызывать прогрессирующую обструкцию дыхательных путей. В периферических дыхательных путях кашель не эффективен для удаления выделений. Кроме того, мелкие дыхательные пути, в которых находится большое 2 количество бокаловидных клеток, в силу их небольших размеров оказываются особо уязвимыми при закупорке дыхательных путей слизью. Гиперсекрецией дыхательных путей страдает большое количество людей; упомянутое явление наблюдается при различных заболеваниях легких, таких как хронический бронхит,бронхиальная астма, муковисцидоз и бронхоэктаз. Гиперсекреция слизи представляет собой основной симптом у пациентов с хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD) и определяет это состояние (т.е. хронический кашель и образование мокроты). Одним этим заболеванием, вызывающим прогрессирующую потерю трудоспособности и смерть, поражено 14 миллионов американцев. По приблизительным оценкам астмой болеет как минимум 4% населения США, что является причиной как минимум 2000 смертных случаев ежегодно(Пирсон (Pierson) и Какмарек (Kacmarek), смотри выше). При остром астматическом приступе стенки бронхов набухают, объем слизи увеличивается, гладкие мышцы бронхов сокращаются, вследствие чего происходит сужение дыхательных путей. Как следствие гиперсекреции при остром приступе астмы, обширная слизистая пробка может быть основной причиной заболеваемости и смертности. Гиперсекреция причастна также к муковисцидозу, который представляет собой одно из наиболее распространенных смертельных генетических заболеваний в мире. Муковисцидоз представляет собой аутосомное рецессивное заболевание, вследствие которого клетки слизистой дыхательных путей становятся нечувствительными к цАМФ-зависимой протеинкиназной активации мембранных каналов ионов хлоридов(Пирсон (Pierson) и Какмарек (Kacmarek), смотри выше, и Фоси (Fauci) и другие, см. выше). Последующее нарушение водно-солевого баланса снижает уровень гидратации слизи дыхательных путей, следствием чего является образование крайне вязкой слизи в легких людей,больных муковисцидозом. Гиперсекреция вызывает обструкцию дыхательных путей больных муковисцидозом, что еще более ухудшает функционирование легких. К числу других заболеваний, включающих гиперсекрецию, относится хроническое обструктивное заболевание легких (COPD). Окислительная (оксидантная) нагрузка играет значительную роль в патогенезе COPD. Сигаретный дым, вызывающий образование свободных радикалов кислорода, преимущественно подразумевается в патогенезе. На месте воспаления при хроническом обструктивном заболевании легких часто наблюдаются нейтрофилы, и, что представляет интерес, известно, что нейтрофилы в процессе активации выделяют свободные радикалы кислорода. 3 Механическая интубация часто оказывается необходимой для обеспечения вспомогательной вентиляции легких у пациентов с различными заболеваниями легких. Интубационная трубка вводится через ротовую часть глотки и помещается в трахее. Для предотвращения утечки воздуха по периметру интубационной трубки, вокруг нее, в нижней части трахеи, надувают баллон, который может сдирать эпителий и вызывать метаплазию бокаловидных клеток. При ранениях эпителия происходят процессы репарации, которые приводят к обильным слизистым выделениям. Длительная интубация трахеи может вызвать вредные явления, обусловленные гиперсекрецией. Как следствие высоких уровней слизи в легких пациентов с гиперсекреторными легочными заболеваниями снижается очистка (клиренс) слизистой оболочки. Патологические факторы, такие как бактерии, например, Pseudomonas aeruginosa, часто образуют колонии в слизи,следствием чего являются частые инфекционные болезни легких. Классические способы лечения людей, пораженных гиперсекрецией дыхательных путей,включают антибиотикотерапию, применение бронхолитических средств (например, метилксантинов, симпатомиметических средств с сильными 2 адренергическими стимулирующими свойствами,антихолинергических средств), применение системных либо ингаляционных кортикостероидов, главным образом при астме, разжижение слизи посредством перорального введения отхаркивающих средств,например, гвайфенезина, и аэрозольная доставка(Harrison's, смотри выше). Более новым способом лечения муковисцидоза является введение дезоксирибонуклеазы для целенаправленного воздействия на слизь или мокроту с высоким содержанием ДНК (Шек (Shak) и другие, (1990),Ргос. Natl. Acad. (США) 87:9188-9192; Хаббард Р.К. (Hubbard R.C.) и другие, (1991), N. Engl. J.Med., 326:812). В дополнение к этому, способы физиотерапевтического воздействия на грудную клетку, заключающиеся в поколачивании, вибрации и дренаже, также используются для облегчения очистки от вязкой слизи. Конечным вариантом решения для пациентов с тяжелыми нарушениями функции легких может оказаться их трансплантация. Таким образом, необходимы более эффективные либо альтернативные терапевтические методы для целенаправленного воздействия на слизистые выделения. Конкретно, необходим специфический способ лечения,снижающий образование слизистых выделений в дыхательных путях. Источники, относящиеся к данному вопросу Применение ингибиторов эпидермального фактора роста (EGF) для блокирования роста раковых клеток рассматривают ЛевицкийCell. Endocrin., 117:53-58. Краткое изложение сущности изобретения Гиперсекреция слизи в дыхательных путях является неблагоприятным симптомом целого ряда различных заболеваний легких. Секреция является следствием дегрануляции бокаловидных клеток, пролиферация которых активизируется стимулированием рецепторов эпидермального фактора роста (EGF-R). В соответствии с настоящим изобретением, лечение легочной гиперсекреции осуществляется посредством введения терапевтических количеств антагонистов эпидермального фактора роста (EGF), в предпочтительном варианте ингибиторов киназы. Упомянутые антагонисты могут быть в форме небольших молекул, антител либо частей антител, которые связываются с EGF либо его рецептором. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предоставляются invitro и in vivo способы прогнозирования терапевтического потенциала подходящих средств для подавления гиперсекреции слизи. Основной целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения заболеваний, вовлекающих в патологический процесс гиперсекрецию слизи в легких. Другой целью настоящего изобретения является предоставление лекарственных форм,пригодных для лечения заболеваний, следствием которых является гиперсекреция слизи. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа анализа invitro для отбора подходящих средств, которые угнетают гиперсекрецию слизи, где упомянутый способ включает этапы (i) контактирования модели пролиферации бокаловидных клеток invitro с эпидермальным фактором роста либо его функциональным эквивалентом; (ii) последующего контактирования упомянутой модели invitro с подходящим средством; и (iii) оценки пролиферации бокаловидных клеток, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала упомянутого подходящего средства. Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа анализа in vivo для отбора подходящих средств, которые угнетают гиперсекрецию слизи, где упомянутый способ включает этапы(i) создания животной модели гиперсекреторного легочного заболевания посредством индуцирования EGF-R, например, с помощью альфа-фактора некротизации опухолевых клеток(ii) стимулирования упомянутого индуцированного EGF-R с помощью его лиганда, например, трансформирующего альфа-фактора роста (TGF-) либо EGF, с целью продуцирова 5 ния бокаловидных клеток, продуцирующих муцин;(iv) оценки пролиферации бокаловидных клеток либо выделения слизи, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток либо выделения слизи является показателем терапевтического потенциала упомянутого подходящего средства. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способов анализа invitro и in vivo для отбора антагонистов EGF-R,которые угнетают гиперсекрецию слизи. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно предоставляет средства для предотвращения чрезмерного образования слизи в легочных дыхательных путях. Отличительная особенность настоящего изобретения заключается в том, что целый ряд антагонистов различного типа может использоваться для блокирования эффектов EGF и/илиTGF- и их взаимодействия с EGR-R. Аспектом настоящего изобретения является получение лекарственных форм антагонистовEGF для снижения образования слизи в дыхательных путях пациента-млекопитающего, в предпочтительном варианте пациента, которым является человек. Другой целью настоящего изобретения является способ доставки антагониста EGF в легкие для уменьшения слизистых выделений в дыхательных путях пациента-млекопитающего,в предпочтительном варианте пациента, которым является человек. Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения ряда различных заболеваний, симптомом которых является чрезмерное образование слизистых выделений в дыхательных путях. К числу таких заболеваний относятся, хотя ими и не ограничиваются, хронический бронхит, бронхиальная астма, муковисцидоз, бронхоэктаз, хроническое обструктивное заболевание легких, гиперсекреция в результате повреждения эпителия, такого как аллергическое раздражение или механические царапины, и назальная гиперсекреция. Эти и другие цели, преимущества и отличительные особенности настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области при прочтении подробного описания способов лечения, а также способов анализа in vitro иin vivo, которое представлено далее. Краткое описание рисунков На фиг. 1 А представлен анализ EGF-R в клетках NCI-H292 и А 431 методом вестернблоттинга. На фиг. 1 В представлены результаты иммуногистохимических анализов с помощью анти-EGF-R антитела в культурах клеток NCIH292. На фиг. 1 С представлен анализ EGF-R в клетках NCI-H292 методом назерн-блоттинга. Фиг. 2. Окрашивание клеток NCI-H292 алцианом голубым/периодной кислотой - Шиффо 004316 6 вым основанием (AB/PAS) для идентифицирования муциновых гликопротеинов. Фиг. 3. Анализ экспрессии MUC5 гена в клетках NCI-H292 методом назерн-блоттинга. Фиг. 4 А и фиг. 4 В. Иммуногистохимический анализ EGF-R с помощью анти-EGF-R антитела у апатогенных крыс. Фиг. 4 А, крысы,обработанные TNF-. Фиг. 4 В, крысы, сенсибилизированные овальбумином. На фиг. 5 изображен график, представляющий эффект ингибитора EGF-R тирозинкиназы (BIBX 1522) на продуцирование бокаловидных клеток (выраженный в виде процента окрашенной площади эпителия дыхательных путей, занятой клетками, позитивно окрашенными алцианом голубым/периодной кислотойШиффовым основанием (AB/PAS). Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения Предоставлены композиции и способы лечения гиперсекреции слизи в дыхательных путях посредством введения терапевтических количеств антагонистов EGF, в предпочтительном варианте ингибиторов киназы. Упомянутые антагонисты могут быть представлены в форме небольших молекул, антител либо фрагментов антител, которые связываются с EGF, либо с его рецептором. При гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей, например, хроническом бронхите, бронхоэктазе, муковисцидозе,бронхиальной астме, хроническом обструктивном заболевании легких и т.п., синтез муцина в дыхательных путях повышен и происходит гиперсекреция слизи. Выделенная слизь вызывает обструкцию дыхательных путей, что является причиной смерти при этих заболеваниях. Как показано в описании к настоящему изобретению, несколько причин повреждения и воспаления дыхательных путей индуцируют экспрессию рецептора эпидермального фактора роста в клетках эпителия дыхательных путей. После индуцирования EGF-R, результатом его последующей стимуляции посредством как лигандзависимых, так и лиганднезависимых механизмов является продуцирование муцина как на уровне экспрессии гена, так и на уровне белка. Избирательные ингибиторы EGF-R тирозинкиназы демонстрируют блокирование упомянутой экспрессии муцинового гена и белка. Без ограничения объема настоящего изобретения предполагается, что в основе эволюционной последовательности продуцирования бокаловидных клеток лежит экспрессия EGF-R. Стимулирование с помощью TNF- вызывает интенсивное EGF-R окрашивание негранулированных секреторных клеток; их последующая активация лигандами EGF-R вызывает прогрессирующее окрашивание гликоконъюгатов слизи в цитоплазме и упомянутые клетки превращаются вначале в "клетки-предшественники бока 7 ловидных клеток", затем в "бокаловидные" клетки. Полученные данные позволяют предположить, что активация EGF-R усиливает избирательную дифференциацию клеток, но не их пролиферацию. Бокаловидные клетки явно образуются из негранулированных секреторных клеток, которые экспрессируют EGF-R и стимулируются лигандами EGF-R к продуцированию муцинов. Наряду со стимулированием цитокинами,EGF-R может стимулироваться другими сигнальными медиаторами. Например, длительное курение сигарет связывают с прогрессирующими патологическими изменениями в периферических дыхательных путях, включая гиперплазию бокаловидных клеток. Показано, что предвоспалительные цитокинактивированные нейтрофилы и сигаретный дым вызывают синтез муцина в эпителиальных клетках бронхов человека через посредство лиганднезависимого активирования EGF-R, что позволяет предположить, что рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым являются регуляторами дифференциации эпителиальных клеток, следствием чего является патологическое индуцирование муцинпродуцирующих клеток в дыхательных путях. Нейтрофилы, активированные различными стимулами, в том числе IL-8 (интерлейкином-8),N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином,TNF-, сигаретным дымом либо Н 2 О 2, активируют экспрессию муцина в эпителиальных клетках, синтез которого угнетается ингибиторами EGF-R. Нейтрофилы, кроме того, обладают способностью продуцировать лиганды EGFR, EGF и TGF-. Наряду с этим, эпителиальные клетки являются источниками лигандов EGF-R. Механическое повреждение эпителия дыхательных путей также может вызвать гиперсекрецию и быть ответственным за закупорку слизью. Ингибиторы EGF-R тирозинкиназы используются для предотвращения гиперсекреции слизи после интубации трахеи. Повреждение эпителия является общей характерной чертой при обследовании пациентов даже с легкими формами астмы и упомянутое повреждение все в большей степени связывается с ухудшением клинических симптомов. Повреждение эпителия, вызванное аллергической реакцией, вызывает активацию EGF-R, следствием которой является патологическое продуцирование бокаловидных клеток. EGF-R причастен к повреждению эпителия, например, при"реструктурировании дыхательных путей", происходящем при астме, репарации и заживлении ран. Механическое повреждение эпителия и повреждение эпителия при астме может вовлекать сходный EGF-R каскад, следствием которого является патологический рост секреторных клеток эпителия. Гиперсекреция также является важным проявлением воспалительных заболеваний носа. 8 В случае "провоцирования" назальных бокаловидных клеток индуцированном дегрануляции бокаловидных клеток посредством нейтрофилзависимого механизма, происходит сильная активация экспрессии EGF-R и муцинов. Эти события связывались с регрануляцией бокаловидных клеток. В случае, когда воспаление, такое как стимулирование инфильтрации нейтрофилов, вызывает дегрануляцию бокаловидных клеток и секрецию муцина, эпителий дыхательных путей повторно снабжается муцинами вследствие позитивной регуляции и активации EGF-R. Прежде чем будет приведено описание способов лечения и лекарственных форм, соответствующих настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и лекарственными формами, поскольку таковые могут, естественно, изменяться. Следует понимать также, что терминология, применяемая в настоящем описании, использована с целью описания только конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, и не должна рассматриваться в качестве ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения. При отсутствии иных определений, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют то же самое значение, которое традиционно подразумевается средним специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что при практическом осуществлении либо испытании настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные либо эквивалентные описанным здесь,далее представлено описание предпочтительных способов и материалов. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки для раскрытия сущности и описания способов и/либо материалов в связи с упомянутыми публикациями. Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, предоставлены исключительно для раскрытия их сущности перед датой подачи настоящей заявки. В настоящем описании ничто не должно рассматриваться в качестве признания того, что настоящее изобретение не правомочно датировать такую публикацию задним числом в силу более раннего изобретения. В дополнение к этому, приведенные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении. Определения Упомянутый термин "эпидермальный фактор роста" или "EGF" обозначает белок либо его часть, обладающую биологической активностью, характеризующейся митогенным воздействием на эпителиальные клетки (например,Коуэн (Cohen) (1986), Biosciences Reports 6 (12):Factors and Cancer", Science (1991) 254:11461153). Примером является человеческий эпидермальный фактор роста, описание которого представлено, например, Эрдеа (Urdea) и другими (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. 80:7461-7465. Особый интерес для целей настоящего изобретения представляет митогенная активность EGF в отношении бокаловидных клеток. В приведенное определение включаются также белки либо их фрагменты, которые являются функциональным эквивалентом EGF с точки зрения биологической реакции, вызываемойEGF. Упомянутый термин "рецептор эпидермального фактора роста" или "EGF-R" обозначает белок либо его часть, обладающую способностью связывания белка EGF либо его части. Примером является рецептор человеческого эпидермального фактора роста (см., УльрихNM005228). В предпочтительном варианте связывание упомянутого лиганда EGF активирует EGF-R (следствием чего является, например, активация внутриклеточной митогенной индукции, аутофосфорилирование EGF-R). Специалисту в данной области понятно, что другие лиганды, кроме EGF, могут связываться с EGF-R и активировать EGF-R. Примеры таких лигандов включают, однако, ими не ограничиваются, TGF-, бетацеллюлин, амфирегулин,гепаринсвязывающий EGF (HB-EGF) и нейрегулин (известный также как гергулин) (ШонBook: Protein Tyrosine Kinases" (1995), под редакцией Гарди (Hardie) и других, издательствоAcademic Press, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). Упомянутый термин "антагонист EGF-R" обозначает любое средство, способное прямо либо косвенно ингибировать эффект EGF-R, в частности, эффект EGF-R на пролиферацию бокаловидных клеток либо гиперсекрецию слизи бокаловидными клетками. EGF-R может быть активирован через посредство лигандзависимых и лиганднезависимых механизмов, следствием чего является аутофосфорилирование либо перефосфорилирование, соответственно. Представляющие интерес антагонисты EGF-R могут ингибировать любой из или оба эти механизма. Например, следствием связывания TNF- сEGF-R является лигандзависимое фосфорилирование, которое может быть блокировано антителом, связывающим EGF-R, чем предотвращается взаимодействие EGF с лигандом, который мог бы активировать упомянутый рецепторEGF. Примеры таких антител приведены Гольдштейном (Goldstein) и другими (1995),Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Лоримером(1996), Вг. J. Cancer 74:853-862. Небольшие молекулы ингибиторов тирозинкиназы также эффективны как антагонисты EGF-R. В соответствии с альтернативным вариантом показано, что соединения, такие как свободные радикалы кислорода, стимулируют перефосфорилирование EGF-R, следствием чего является лиганднезависимая активация упомянутого рецептора. Другие средства активирования EGF-R посредством перефосфорилирования включают ультрафиолетовую и осмотическую нагрузку, стимулирование рецептора, связанного с G-белком, эндотелином-1, лизофосфатидную кислоту и тромбин, ml мускариновый ацетилхолиновый рецептор и соматотропный гормон человека. Антагонисты этого лиганднезависимого механизма включают антиоксиданты,такие как пероскид-дисмутаза, диметилсульфоксид (DMSO), диметилмочевина (DMTU) аскорбиновая кислота и подобные им. Антагонистом EGF-R может быть антитело, которое связывается с фактором, стимулирующим продуцирование EGF либо продуцирование EGF-R, тем самым ингибируя стимулирование пролиферации бокаловидных клеток EGF(например, ингибитор каскада фосфорилирования, который фосфорилирует EGF-R). Например, гибридный белок TGFэкзотоксина Pseudomonas 40, описание которого приведено Артега (Arteaga) и другими (1995), Cancer Res. 54:4703-4709. В предпочтительном варианте осуществления упомянутый антагонист EGF-R является ингибитором тирозинкиназной активности EGFR, в частности, мелкомолекулярные ингибиторы, обладающие избирательным действием наEGF-R, по сравнению с другими тирозинкиназами - предпочтительные мелкие молекулы блокируют естественный рецептор EGF у млекопитающего, в предпочтительном варианте человека, и имеют молекулярную массу менее 1 кДа. К ингибиторам EGF и EGF-R относятся,однако ими не ограничиваются, ингибиторы тирозинкиназы, например, хиназолины, такие как PD 153035, 4-(3-хлоранилин)хиназолин либо СР-358774, пиридопиримидины, пиримидопиримидины, пирролопиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706, и пиразолопиримидины (Шон (Shawn) и Шовер (Shawver),см. выше), 4-(фениламино)-7 Н-пирроло[2,3-d] пиримидины (Тракслер (Traxler) и другие,(1996) J. Med. Chem. 39:2285-2292), куркуминarayana) и другие, (1995), Carcinogen 16:17411745),4,5-бис(4-фторанилино)фталимид (Бахдангер (Buchdunger) и другие, (1995),Clin. Cancer Res. 1:813-821; Динни (Dinney) и другие, (1997), Clin. Cancer Res. 3:161-168); тирфостины, в состав которых входят нитротиофеновые составляющие (Брантон (Brunton) и другие, (1996), And Cancer Drug Design 11:265 11 295); упомянутый ингибитор протеинкиназыZeneca); все включены в настоящее описание как ссылка; либо антисмысловые молекулы. Упомянутый термин "ингибирование" означает снижение, нейтрализацию, ослабление либо предотвращение пролиферации бокаловидных клеток, дегрануляции бокаловидных клеток либо гиперсекреции слизи бокаловидными клетками. Упомянутые термины "лечение", "лечить" и т.п. используются в данном описании в общем значении достижения необходимого фармакологического и/или физиологического эффекта. Упомянутый эффект может быть профилактическим с точки зрения полного либо частичного предотвращения заболевания либо его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного либо полного излечения заболевания и/или неблагоприятного эффекта, связанного с упомянутым заболеванием. Упомянутый термин "лечение", использованный в данном описании, обозначает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности, человека, и включает:(a) предотвращение возникновения заболевания либо симптома у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию либо симптому, но который, однако, еще не был диагностирован как имеющий его;(b) подавление заболевания либо симптома, т.е. остановку его развития; или(c) облегчение заболевания либо симптома,т.е. побуждение обратного развития упомянутого заболевания либо симптома. Настоящее изобретение направлено на лечение пациентов с заболеванием легких либо дыхательных путей и, в частности, направлено на лечение гиперсекреции слизи у пациентов, т.е. предотвращение,ингибирование либо облегчение процесса гиперсекреции слизи. С точки зрения лечения симптомов, настоящее изобретение направлено на снижение содержания слизи либо мокрот в дыхательных путях, подавление инфицирования патологическими микроорганизмами, облечение кашля и предотвращение гипоксии вследствие закупорки дыхательных путей. Более конкретно, упомянутый термин "лечение" означает предоставление терапевтически обнаружимого и благоприятного эффекта пациенту, страдающему от заболевания легких,включающего гиперсекрецию слизи."лечение" обозначает предотвращение, облегчение и/или ингибирование гиперсекреции слизи с помощью соединения, выбранного из группы,включающей антагонисты EGF и/или EGF-R,такие как антитела, ингибиторы протеинтирозинкиназы, антисмысловые молекулы и т.п. Альтернативный способ лечения может включать предотвращение экспрессии EGF-R в дыхательных путях, блокируя тем самым дыхательные пути на более ранней стадии. Например,реактивы, блокирующие связывание TNF- с его рецептором, могут предотвращать активирование EGF-R. Лечение включает предотвращение либо подавление инфекционных заболеваний, обусловленных патологическими агентами, вызванных и/или связанных с гиперсекрецией слизи. Упомянутый термин "антитело" обозначает иммуноглобулиновый белок, способный связывать антиген. Термин "антитело", использованный в настоящем описании, обозначает фрагменты антитела, например, F(аb')2, Fab',Fab, способные связывать упомянутый антиген либо представляющий интерес фрагмент антигена. В предпочтительном варианте связывание антитела с антигеном угнетает активность EGF либо EGF-R. Упомянутый термин "гуманизированное антитело" используется здесь для описания полных молекул антитела, т.е. состоящих из двух полных легких цепей и двух полных тяжелых цепей, а также антител, включающих лишь фрагменты антител, например. Fab Fab', F(аb')2 иFv, где упомянутые гипервариабельные участки получают из источника, не относящегося к человеческому роду, в то время как остальную часть упомянутой Ig молекулы либо ее фрагмент получают из человеческого антитела, в предпочтительном варианте полученном из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческое антитело. Упомянутые термины "человеческое антитело" и "гуманизированное антитело" используются здесь для описания антитела, все части молекулы которого получены из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческое антитело. Такие человеческие антитела являются наиболее желательными для использования в методах лечения антителами,поскольку такие антитела вызывают незначительную либо вообще не вызывают иммунной реакции у пациента-человека. Упомянутый термин "химерное антитело" используется здесь для описания молекулы антитела, а также фрагментов антитела, описание которых приведено ранее в определении упомянутого термина "гуманизированное антитело". Объем понятия упомянутого термина "химерное антитело" включает гуманизированные антитела. Химерные антитела имеют как минимум одну часть последовательности тяжелой или 13 легкой цепи аминокислоты, полученной от первого вида млекопитающих, и другую часть последовательности тяжелой или легкой цепи аминокислоты, полученной от второго, отличающегося вида млекопитающих. В предпочтительном варианте переменную область получают от вида млекопитающих, не относящихся к человеку, в то время как постоянную область получают от человеческого вида. В частности,упомянутое химерное антитело в предпочтительном варианте получают из нуклеотидной последовательности от млекопитающего, не относящегося к человеческому виду, кодирующей переменную область, и нуклеотидной последовательности от человека, кодирующей постоянную область антитела. Упомянутое выражение "специфически связывается" означает высокоавидное и/или высокоаффинное связывание антитела со специфическим полипептидом. Связывание антитела со своим эпитопом на специфическом полипептиде является более сильным, чем связывание того же самого антитела с любым другим эпитопом, в частности, с теми из них, которые могут быть представлены на молекулах, находящихся в связи с либо в той же самой пробе,что и представляющий интерес специфический полипептид. Антитела, которые специфически связываются с представляющим интерес полипептидом, могут обладать способностью к связыванию с другими полипептидами на слабом,однако поддающемся обнаружению уровне, например, 10% или менее от связывания, демонстрируемого с упомянутым представляющим интерес полипептидом. Такое слабое или фоновое связывание легко отличается от специфического связывания антитела с представляющим интерес соединением либо полипептидом, например, с помощью соответствующих контролей. Упомянутое выражение "поддающееся обнаружению меченое антитело", "поддающийся обнаружению меченый анти-EGF" либо "поддающийся обнаружению меченый фрагмент анти-EGF" означает антитело (либо фрагмент антитела, сохраняющий специфичность связывания), имеющее присоединенную к нему поддающуюся обнаружению метку. Упомянутая поддающаяся обнаружению метка присоединяется, как правило, посредством химической конъюгации, однако в том случае, когда упомянутой меткой является полипептид, в соответствии с альтернативным вариантом, он может присоединяться методами генной инженерии. Способы получения поддающихся обнаружению меченых белков хорошо известны в данной области. Поддающиеся обнаружению метки могут выбираться из разнообразных подобных меток, известных в данной области, однако в качестве упомянутых обнаружимых меток используются, как правило, радиоактивные изотопы, флуорофоры, ферменты, например, пероксидаза хрена, либо другие составляющие или 14 соединения, которые либо испускают поддающийся обнаружению сигнал (например, радиоактивность, флуоресценция, цвет), либо испускают поддающийся обнаружению сигнал после воздействия на упомянутую метку ее субстрата. В данной области хорошо известны различные пары поддающейся обнаружению метки/субстрата (например, пероксидаза хрена/диаминобензидин, авидин/стрептавидин, люцифераза/ люциферин), способы мечения антител и способы использования меченых антител для обнаружения антигена (см., например, Antibodies: ALaboratory Manual, под редакцией Харлоу (Harlow) и Лейна (Lane), (1988), издательство ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк). Терапевтические методы Настоящее изобретение предоставляет способ лечения легочной гиперсекреции посредством введения терапевтических количеств антагонистов EGF-R. Любое заболевание и, в частности, любое заболевание легких, характеризующееся гиперсекрецией слизи либо накоплением патологических уровней слизи, может лечиться с помощью способов, описание которых здесь предоставляется. Примерами легочных гиперсекреторных заболеваний, которые могут лечиться этим способом, являются, однако ими не ограничиваются, хронические обструктивные заболевания легких, такие как хронический бронхит, воспалительные заболевания, такие как астма, бронхоэктаз, фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, заболевания назальной гиперсекреции,например, назальные аллергии, и другие гиперсекреторные заболевания. Сюда же включаются и генетические заболевания, такие как муковисцидоз, триада Картагенера, альфа-1-антитрипсиновая недостаточность, семейное уплотнение слизи в дыхательных путях, не являющееся муковисцидозом. Предпочтение отдается антагонистам, непосредственной мишенью для которых являетсяEGF или EGF-R. Однако специалисту в данной области понятно, что любой фактор либо клетка, вовлеченные в упомянутый биологический каскад, следствием которого является активирование пролиферации бокаловидных клеток EGFR, могут выступать в качестве мишеней для ингибирования, например антагонисты TGF-. He связывая себя теорией, авторы изобретения полагают, что каскад начинается во время воспалительной реакции, когда клетки, такие как тучные клетки либо нейтрофилы выделяют TNF-,который в последующем активирует экспрессию EGF-R. Стимулирование EGF-R, например,его лигандом EGF, в свою очередь запускает пролиферацию бокаловидных клеток. Таким образом, любые клетки либо факторы, вовлеченные в упомянутый каскад, например, в кас 15 кад реакций TNF-, могут явиться мишенью для активности антагониста. Упомянутый антагонист EGF-R, введенный в упомянутый терапевтический способ,может быть представлен в любой форме. Например, упомянутый антагонист EGF-R может быть в форме небольшой молекулы (например,антисмысловой олигонуклеотид, ингибитор тирозинкиназы и т.п.), антитела либо части антитела, связанных с EGF, TGF- либо EGF-R. Мелкомолекулярные антагонисты EGF-R В данной области известны ингибиторы тирозинкиназы, воздействующие на рецепторEGF и отличающиеся избирательностью в отношении EGF-R, которые могут быть использованы в представленных способах. Описание примеров было приведено ранее, и к числу таковых может быть отнесен BIBX 1522 (компания Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Германия); CGP 59326 В (компания Novartis Corporation, Basel, Швейцария); 4-аминохиназолиновые ингибиторы EGF-R (описаны в патенте США 5,760,041); замещенные стирольные соединения,которые также могут быть нафталином, инданом либо бензоксазином, включая нитрильные и молононитрильные соединения (описаны в патенте США 5,217,999); ингибиторы, раскрытые в патенте США 5,773,476; ингибитор картофельной карбоксипептидазы (PCI), ингибитор 39-аминокислотной протеазы с тремя дисульфидными мостиковыми связями (БланкоАпарисио (Blanco-Aparicio) и другие, (1988), J.Biol. Chem. 273 (20):12370-12377); бобмезиновый антагонист RC-3095 (Цепешази (Szepeshazi) и другие, (1997), Ргос. Natl. Acad. Sci. USA,94:10913-10918) и т.д. К числу других ингибиторов тирозинкиназы относятся хиназолины,такие как PD 153035, 4-(3-хлоранилин)хиназолин либо СР-358774, пиридопиримидины, пиримидопиримидины, пирролопиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706, и пиразолопиримидины (Шон (Shawn) и Шовер(Laxmin arayana), (1995), Carcinogen 16:17411745); и т.д. Предпочтительные ингибиторы тирозинкиназы являются избирательными в отношении рецептора EGF, т.е. упомянутый EGF-R подавляется в большей степени, чем другие рецепторы клеточной поверхности, обладающие тирозинкиназной активностью. Избирательность усиливается способами получения лекарственных форм и доставки лекарственного средства,например, когда упомянутый ингибитор предпочтительно доставляется в воспаленные дыхательные пути, и т.д. 16 Типичные дозы для системного введения колеблются от 0,1 мкг до 100 мг на килограмм массы субъекта на введение. Специалистам в данной области понятно, что величина дозы может изменяться в зависимости от конкретного соединения, тяжести симптомов и восприимчивости субъекта к побочным эффектам. Некоторые из специфических соединений являются более сильнодействующими, чем другие. Предпочтительные дозы данного соединения легко определяются специалистами в данной области различными способами. Предпочтительным способом является определение физиологической активности данного соединения, например,с помощью тестов in vitro и in vivo, описание которых здесь приводится. Антитела как антагонисты EGF-R Антитела как антагонисты EGF-R представляют собой особый интерес (например, Вилориа (Viloria) и другие, American Jorunal ofPathology 151:1523). Антитела к EGF либо EGFR продуцируются посредством иммунизации ксеногенного иммунокомпетентного хозяинамлекопитающего, в том числе из семейства мышиных, грызунов, зайцеобразных, овечьих,свиных, бычьих и т.д., EGF, EGF-R либо их фрагментами. В качестве иммуногена в предпочтительном варианте используют EGF, EGFR либо их фрагменты. Выбор конкретного хозяина является, главным образом, вопросом удобства. Иммунизацию осуществляют в соответствии с традиционными методами, где упомянутый иммуноген может вводиться животному-хозяину подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрисосудисто и т.д. Как правило, в качестве иммуногена через день внутрибрюшинно вводят от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг EGF или EGF-R. Инъекции могут производиться с или без адъюванта, например, полного либо неполного адъюванта Фрейнда, спекола, квасцов и т.п. После завершения схемы иммунизации, антисыворотка может собираться в соответствии с традиционными способами с получением поликлональных антисывороток, специфичных для EGF илиEGF-R. От иммунизированных животных получают моноклональные либо поликлональные антитела, в предпочтительном варианте моноклональные антитела. Поликлональные антисыворотки могут собираться из сыворотки животных традиционными способами после завершения схемы иммунизации. Для получения моноклональных антител лимфоциты собирают из соответствующей лимфоидной ткани, например,селезенки, посредством дренирования лимфатических узлов и т.п., с последующей гибридизацией с соответствующим гибридизационным партнером, как правило, линией клеток миеломы, с получением гибридомы, секретирующей специфическое моноклональное антитело. Отбор клонов гибридом по представляющей инте 17 рес антигенной специфичности осуществляют в соответствии с традиционными методами. Особый интерес представляют антитела, в предпочтительном варианте моноклональные антитела, которые связываются с EGF-R либоEGF с тем, чтобы подавить связывание EGF сEGF-R, например, антитело, которое специфически связывается с внеклеточной областьюEGF-R, предотвращая тем самым связываниеEGF. Такие антитела могут быть получены с помощью традиционных способов, описание которых было представлено выше, либо они являются коммерчески доступными. Примерами антител, которые могли бы функционировать как антагонисты EGF, являются, однако, ими не ограничиваются, нейтрализующее анти-EGF-R моноклональное антитело С 225 (Кавамото (Kawamoto) и другие, (1983), Ргос. Nat'l. Acad. Sci.(USA), 80:1337-1341: Пти (Petit) и другие,(1997), J. Path., 151:1523-153, производимое компанией ImClone Systems New York, штат Нью-Йорк) и анти-EGF-R моноклональное антитело EMD55900 (именуемое также Mab 425),(компания Merck, Дармштадт, Германия). Представленные антитела могут производиться с одной цепью, вместо нормальной мультимерной структуры. Одноцепочечные антитела описываются Джостом (Jost) и другими,(1994), J. В. С., 269:26267-73, и другими. Последовательности ДНК, кодирующие переменную область тяжелой цепи и переменную область легкой цепи, лигируются спейсером, кодирующим как минимум около 4 аминокислот из небольших нейтральных аминокислот, включая глицин и/или серин. Белок, кодируемый посредством упомянутого слияния, обеспечивает возможность сборки функционально переменной области, которая сохраняет специфичность и аффинность исходного антитела. Способы гуманизации антител известны в этой области. Гуманизированное антитело может быть продуктом животного, имеющего гены константной области трансгенного человеческого иммуноглобулина (см., например, международные заявки WO 90/10077 и WO 90/04036). В соответствии с альтернативным вариантом представляющее интерес антитело может быть получено методами рекомбинантных ДНК для замещения СН 1, СН 2, СН 3, шарнирных областей и/или остатков остова соответствующей человеческой последовательностью (смотри WO 92/02190). Использование Ig кДНК для генно-инженерного конструирования химерных иммуноглобулиновых генов также известно в данной области (Лю (Liu) и другие, (1987), Р. N. A. S.,84:3439 и (1987), J. Immunol., 139:3521). мРНК выделяют из гибридомы или другой клетки,продуцирующей антитело, и используют для продуцирования кДНК. Полученная представляющая интерес кДНК может амплифицироваться посредством полимеразно-цепьевой ре 004316 18 акции с использованием специфических праймеров (патенты США 4,683,195 и 4,683,202). В соответствии с альтернативным вариантом получают библиотеку, которую подвергают скринингу для выделения представляющей интерес последовательности. После этого последовательность ДНК, кодирующая переменную область упомянутого антитела,сливается с человеческими последовательностями, кодирующими постоянную область. Упомянутые последовательности человеческих генов постоянных областей можно найти в работе Кабат (Kabat) и других, (1991), Sequencesof Proteins of Immunological Interest, публикация Национального института здоровья (N.I.H.) США 91-3242. Человеческие гены постоянной области легко доступны из известных клонов. После этого химерное гуманизированное антитело экспрессируют традиционными способами. Фрагменты антител, например, Fv, F(аb')2 иFab, могут быть получены посредством расщепления интактного белка, например, с помощью протеазы либо посредством химического расщепления. В соответствии с альтернативным вариантом конструируется усеченный ген. Например, химерный ген, кодирующий часть фрагмента F(ab')2, должен был бы включать последовательности ДНК, кодирующие область СН 1 и шарнирную область тяжелой цепи, за которыми следует стоп-кодон трансляции, для получения усеченной молекулы. Пациенту, страдающему заболеванием,связанным с гиперсекрецией слизи, могут вначале вводиться количества антагониста EGF-R в пределах от приблизительно 20 мг до приблизительно 400 мг на килограмм массы пациента дважды в день, например, посредством ингаляции. Антисмысловые молекулы как антагонистыEGF-R В другом варианте осуществления представленными терапевтическими средствами являются антисмысловые молекулы, специфические для человеческих последовательностей,кодирующих EGF или EGF-R. Вводимым терапевтическим средством могут быть антисмысловые олигонуклеотиды, в частности синтетические олигонуклеотиды, полученные посредством химических модификаций нативных нуклеиновых кислот, либо генно-инженерные конструкции на основе нуклеиновых кислот, которые экспрессируют такие антисмысловые молекулы, как РНК. Упомянутая антисмысловая последовательность является комплементарной к упомянутой мРНК таргетированных генов EGF или EGF-R и угнетает экспрессию продуктов упомянутого таргетированного гена (см., например, Найс (Nyce) и другие, (1997), Nature,385:720). Антисмысловые молекулы ингибируют экспрессию гена посредством уменьшения количества мРНК, доступного для трансляции, 19 путем активации рибонуклеазы Н либо стерического несоответствия. Может вводиться одна антисмысловая молекула либо комбинация антисмысловых молекул, причем в состав упомянутой комбинации могут входить многочисленные различные последовательности одного таргетированного гена либо последовательности,которые дополняют несколько различных генов. Предпочтительным геном-мишенью является EGF-R или EGF. Доступ к последовательности гена может обеспечиваться через общественные базы данных (человеческий эпидермальный фактор роста, внесенный в каталог Генбанка подК 01166; человеческая мРНК для предшественника рецептора эпидермального фактора роста, внесенная в каталог Генбанка подХ 00588). Упомянутая антисмысловая последовательность обычно будет иметь те же самые исходные виды, что и животное-хозяин. Антисмысловые молекулы могут быть получены посредством экспрессии всей либо части последовательности упомянутого генамишени в подходящем векторе, причем упомянутый вектор вводят и экспрессируют в упомянутых таргетированных клетках. Инициация репликации ориентируется таким образом, что упомянутая антисмысловая цепочка продуцируется как молекула РНК. Полученная антисмысловая РНК гибридизуется с эндогенной смысловой цепочкой мРНК, блокируя тем самым экспрессию упомянутого таргетированного гена. Может быть использована нативная инициирующая область транскрипции либо экзогенная инициирующая область транскрипции. Промотор может вводиться рекомбинантными методами in vitro либо в результате гомологичной интеграции упомянутой последовательности в хромосому. В данной области известно множество сильных промоторов, активных в мышечных клетках, например, промотор -актина,ранние и поздние промоторы SV-40, промотор человеческого цитомегаловируса, ретровирусные длинные конечные повторы и т.п. Векторы транскрипции имеют, как правило, удобные сайты рестрикции, расположенные возле промоторной последовательности, для обеспечения вставки последовательностей нуклеиновых кислот. Могут быть получены транскрипционные кластеры, включающие инициирующую область транскрипции, ген-мишень либо его фрагмент и терминирующую область транскрипции. Упомянутые транскрипционные кластеры могут вводиться в различные векторы,например, плазмиду; ретровирус, например,лентивирус; аденовирус и т.п., причем упомянутые векторы могут сохраняться в клетках периодически либо постоянно, как правило, в течение как минимум приблизительно одного дня,чаще в течение как минимум приблизительно нескольких дней. В качестве альтернативы в предпочтительном варианте осуществления антисмысловая 20 молекула представляет собой синтетический олигонуклеотид. Антисмысловые олигонуклеотиды включают, как правило, от приблизительно 7 нуклеотидов до 500 нуклеотидов, обычно от приблизительно 12 нуклеотидов до 50 нуклеотидов, чаще от приблизительно 20 нуклеотидов до 35 нуклеотидов, причем длина обусловливается эффективностью ингибирования, специфичностью, включая отсутствие перекрестной реактивности и т.п. Было установлено, что короткие олигонуклеотиды, от 7 оснований до 8 оснований длиной, могут быть сильными и избирательными ингибиторами экспрессии генаBiotechnology, 14:840-844). Специфическую область либо области эндогенной последовательности смысловой цепочки мРНК выбирают таким образом, чтобы они дополнялись антисмысловой последовательностью. Было показано, что 5'-конечная область мРНК отличается особой восприимчивостью к антисмысловому ингибированию. Недавно полученные данные свидетельствуют,однако, о том, что анализ вторичной структуры мРНК может иметь значение для доступности сайтов ингибирования. При выборе специфической последовательности для олигонуклеотида можно пользоваться эмпирическим способом,когда несколько подходящих последовательностей анализируются на ингибирование экспрессии гена-мишени на моделях in vitro либо на животных моделях. Может использоваться также комбинация последовательностей, где для антисмысловой комплементарности может отбираться несколько участков упомянутой последовательности мРНК. Антисмысловые олигонуклеотиды могут синтезироваться химическим путем с помощью способов, известных в данной области, (Вагнер(Wagner) и другие, (1993), см. выше, и Миллиган (Milligan) и другие, смотри выше). Предпочтительные олигонуклеотиды получают посредством химической модификации нативной фосфодиэфирной структуры для повышения их внутриклеточной стабильности и сродства к связыванию. В литературе был описан ряд таких модификаций, которые изменяют химизм остова, сахаров либо гетероциклических оснований. Олигонуклеотиды могут дополнительно включать таргетирующую составляющую, которая усиливает поглощение упомянутой молекулы клетками. Упомянутая таргетирующая составляющая представляет собой специфические связывающие молекулы, например, антитело либо его фрагмент, который распознает молекулы, присутствующие на поверхности эпителиальных клеток легких, в частности, эпителиальных клеток, в состав которых входитEGF-R. В данной области известны биспецифические антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела. Соответствующим образом 21 полученные антитела, не относящиеся к человеческому роду, могут гуманизироваться различными путями. Соединение между олигонуклеотидом и таргетирующей составляющей может осуществляться любым удобным способом, например, с помощью дисульфидных, амидных либо тиоэфирных связей, в зависимости от химизма олигонуклеотидного остова. В предпочтительном варианте упомянутая связь будет расщепляться внутри клетки для высвобождения олигонуклеотида. Олигонуклеотиды могут конъюгироваться с гидрофобными остатками, например, холестерином, для защиты от нуклеаз и для улучшения переноса через клеточные мембраны. В качестве альтернативы конъюгирование с поли-L-лизином либо другими полиаминами может также улучшать доставку в клетку. Дополнительной модификацией, которая может осуществляться,является добавление интеркаляционного компонента, такого как акридин, способный внедряться в мРНК-мишень и стабилизировать получаемый в результате гибрид. Антисмысловые олигонуклеотиды могут трансфицироваться в сочетании с ферментом(-ами), которые будут разрушать комплексы антисмысловой мРНК в клетке, например, с рибонуклеазой-Н. Подобным же образом может быть использован любой белок либо фермент, который может предпочтительным образом разлагать либо разрушать упомянутую двухцепочечную антисмысловую мРНК. В качестве альтернативы антисмысловым ингибиторам, для ингибирования экспрессии генов могут использоваться каталитические соединения нуклеиновых кислот, например, рибозимы, антисмысловые конъюгаты и т.п. Рибозимы могут синтезироваться in vitro и вводиться пациенту, либо кодироваться на экспрессирующем векторе, из которого упомянутый рибозим синтезируется в клетке-мишени (см., например,международную заявку WO 95/23225, и Бейгельман (Beigelman) и другие, (1955), Nucl. Acids Res., 23:4434-42). Примеры олигонуклеотидов с каталитической активностью описаны вWO 95/06764. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов с металлическим комплексом,например, терпиридилCu(II), способные опосредовать гидролиз мРНК, описаны БашкинымBiotechnol., 54:43-56. Фармацевтические лекарственные формы Антагонисты EGF-R могут предоставляться для введения в виде раствора либо в любой другой фармакологически приемлемой форме,такой как липосомная суспензия. Соответствующие антитела либо анти-EGF иной формы включаются в состав лекарственной формы для введения способом, обычным для введения таких материалов. К типичным лекарственным формам относятся лекарственные формы, приведенные в справочнике Remington's Pharma 004316ceutical Sciences, последнее издание, Mack Publishing Company, Easton, штат Пенсильвания. Путь введения будет выбираться исходя из соединения, предназначенного для введения, статуса пациента и заболевания, которое подвергается лечению. В случае гиперсекреции слизи соединение может вводиться различными путями, в зависимости от тяжести заболевания, например, ургентные ситуации могут потребовать внутривенного введения, острые, но не представляющие опасности для жизни ситуации могут потребовать перорального введения, в то время как в случае хронического лечения соединение может вводиться в форме аэрозоля. Для терапевтического применения при назальных заболеваниях и заболеваниях дыхательных путей предпочтение отдается местной доставке. Доставка посредством ингаляционных либо инсуффляционных аэрозолей обеспечивает концентрации лекарственного препарата высокого уровня, по сравнению с концентрацией,абсорбируемой системным путем. В качестве альтернативы антагонист EGF может вводиться инъекционным путем, включая внутримышечную, внутривенную, подкожную либо брюшинную инъекцию, причем наибольшее предпочтение отдается внутривенным и местным инъекциям. Могут, однако, использоваться и другие пути введения, при условии доступности средств, обеспечивающих введение антагонистаEGF-R в систему кровообращения, такие как чресслизистые либо чрескожные лекарственные формы, которые могут применяться в виде суппозиториев, кожных пластырей либо интраназально. Соответствующим образом может быть использована любая подходящая лекарственная форма, которая обеспечивает попадание антагониста EGF-R в систему кровообращения либо локально в легкие. К числу лекарственных форм, предназначенных для инъекций, относятся, как правило,водные растворы либо суспензии, в которых используется физиологический раствор, сбалансированный солевой раствор Хенкса или другие буферы, в состав которых факультативно включаются стабилизаторы либо другие второстепенные компоненты. Могут использоваться также липосомные препараты и другие формы микроэмульсий. Антагонист EGF-R может предоставляться также в лиофилизированном виде либо восстановленным для введения. В состав лекарственных форм для чресслизистого либо чрескожного введения входят, как правило,агенты, облегчающие прохождение через слизистый либо кожный барьер, такие как желчь, соли, фузидиевая кислота и ее аналоги, различные детергенты и т.п. Возможно также пероральное введение, при условии включения в состав лекарственной формы подходящих энеросолюбильных покрытий, обеспечивающих возможность прохождения антагонистом EGF-R пищеварительного тракта. 23 Природа лекарственной формы будет в некоторой степени зависеть от природы выбранного антагониста EGF-R. Подходящую лекарственную форму получают с помощью известных способов и принципов получения лекарственных форм, хорошо известных специалистам в данной области. Процентное количество антагониста EGF-R, включенное в состав конкретного фармацевтического препарата, будет также зависеть от природы лекарственной формы; процентное количество антагониста EGF-R, которым является антитело, будет, как правило,колебаться в широких пределах от приблизительно 1% (мас.) до приблизительно 85% (мас.). В данной области известно большое количество способов доставки, обеспечивающих усиления поглощения нуклеиновых кислот клетками. К числу пригодных систем доставки относятся системы доставки вирус Сендайлипосома (Рапапорт (Rapaport) и Шай (Shi),(1994), J. Biol. Chem., 269:15124-15131), катионные липосомы, полимерные доставочные гели либо матрицы, пористые баллонные катетеры(раскрытые Шай (Shi) и другими, (1994), Circulation, 90:955-951: и Шай (Shi) и другими,(1994), Gene Therapy, 1:408-414), векторы экспрессии на основе ретровирусов и т.п. Использование липосом в качестве доставочного носителя является представляющим интерес способом для использования с антагонистами EGF-R. Липосомы сливаются с клетками сайта-мишени и доставляют содержимое полости внутриклеточно. Липосомы удерживаются в контакте с упомянутыми клетками в течение периода времени, достаточного для слияния, с помощью различных средств и способов сохранения контакта, таких как выделение, связывающие агенты и т.п. Можно получать липосомы с очищенными белками либо пептидами,которые опосредуют слияние мембран, такими,например, как вирус Сендай либо вирус гриппа,и т.п. В качестве липидов могут быть использованы любые пригодные комбинации известных образующих липосомы липидов, в том числе катионные липиды, такие как фосфатидилхолин. В качестве остающегося липида, при нормальных условиях, могут быть использованы нейтральные липиды, такие как холестерин,фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и т.п. Для получения липосом может использоваться процедура, описанная Като (Kato) и другими,(1991), J. Biol. Chem., 266:3361. В предпочтительном варианте осуществления антагонист EGF-R капсулируется в стерически стабилизированные "скрытые" липосомы,например, полиэтиленгликолизированные липосомы. В случае внутривенного впрыскивания таких липосом они остаются в системе кровообращения в течение длительных периодов времени. При воспалении дыхательных путей открываются места соединений посткапиллярных венул, что обеспечивает возможность накопления 24 жидкости и позволяет молекулам, например,комплемента, кининогена, проникать в ткани,инициируя воспалительные каскады. Такое воспаление позволяет липосомам и их содержимому избирательно откладываться в воспаленных тканях (Жанг (Zhang) и другие, (1998), Pharm.Res., 15:455-460). Антагонисты EGF-R могут вводиться пораженному пациенту с помощью фармацевтической системы доставки ингаляционным путем. Упомянутые соединения могут включаться в состав лекарственной формы, пригодной для введения посредством ингаляции. Упомянутая фармацевтическая система доставки относится к числу пригодных для респираторной терапии путем местного введения антагонистов EGF-R на слизистую выстилку бронхов. Это изобретение может использовать систему, зависящую от энергии сжатого газа, для выталкивания антагонистов EGF-R из емкости. С этой целью может использоваться аэрозольная упаковка либо упаковка, находящаяся под повышенным давлением. Упомянутый термин "аэрозоль", применяемый в настоящем описании, используется в своем традиционном смысле как обозначающий крайне мелкие частицы жидкости либо твердого вещества, переносимые газообразным пропеллентом к месту терапевтического применения. В случае использования в этом изобретении фармацевтического аэрозоля, в состав упомянутого аэрозоля входит терапевтически активное соединение, которое может растворяться, суспендироваться либо эмульгироваться в смеси жидкого носителя и пропеллента. Упомянутый аэрозоль может быть в форме раствора, суспензии, эмульсии, порошка либо полутвердого препарата. Аэрозоли, используемые в настоящем изобретении, предназначены для введения мелких частиц твердого вещества либо жидкости в виде тумана через дыхательные пути пациента. Могут использоваться пропелленты различных типов, известные специалисту в данной области. Примерами подходящих пропеллентов являются, однако, ими не ограничиваются, углеводороды либо другой пригодный газ. В случае аэрозоля, находящегося под повышенным давлением, стандартная дозировочная единица может определяться посредством предоставления объема для доставки определенного количества. Настоящее изобретение может осуществляться также с помощью распылителя, представляющего собой устройство, образующее чрезвычайно мелкие частицы жидкости по существу однородной величины в газе. В предпочтительном варианте жидкость, содержащая антагонисты EGF-R, диспергируется в виде капель. Мелкие капли могут выноситься потоком воздуха через выходную трубку распылителя. Образующийся туман проникает в дыхательные пути пациента. 25 Млекопитающему, нуждающемуся в лечении, может вводиться порошковая композиция,в состав которой входят антагонисты EGF-R либо их аналоги с/без смягчающего компонента,носителя либо пропеллента. Этот вариант осуществления настоящего изобретения может быть реализован с помощью традиционного устройства для введения порошковой фармацевтической композиции посредством ингаляции. Например, порошковая смесь упомянутого соединения и соответствующей порошковой основы, такой как лактоза либо крахмал, может быть представлена в стандартной дозированной лекарственной форме, например, в виде капсул либо патронов, например, желатиновых, или же в виде вытяжных прозрачных упаковок, из которых упомянутый порошок может вводиться с помощью ингалятора. Для лечения гиперсекреторного легочного заболевания могут использоваться комбинированные терапевтические методы. В частности,антагонисты EGF-R могут комбинироваться с традиционными лекарственными средствами для облегчения гиперсекреции, такими как бронхолитические средства, кортикостероиды,отхаркивающие средства, муколитические средства и т.п., для облегчения очистки реснитчатого эпителия. В зависимости от состояния пациента предпочтение может отдаваться доставке лекарственной формы, соответствующей настоящему изобретению, посредством впрыскивания (например, внутривенного) либо посредством ингаляции. Пациенты, имеющие в легких большие количества слизи, не могут, в общем, лечиться вначале посредством ингаляций. Это обусловлено тем, что легкие пациента закупорены в такой степени, что ингаляционная доставка аэрозолированной лекарственной формы может оказаться не особо эффективной. Однако после лечения посредством инъекций, либо в качестве альтернативы для длительного поддержания,или в ситуациях, когда легкие пациента сильно не закупорены, предпочтительным может оказаться введение путем ингаляций. Введение путем ингаляций оказывается предпочтительным,потому что небольшие дозы могут доставляться локально к конкретным клеткам, которые испытывают наибольшую необходимость в лечении. Благодаря доставке малыми дозами исключаются либо существенно снижаются любые неблагоприятные побочные эффекты. Благодарядоставке непосредственно к клеткам, которые испытывают наибольшую потребность в лечении,эффект лечения будет реализован быстрее. Существует несколько способов ингаляции различных типов, которые могут использоваться в связи с настоящим изобретением. Антагонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав ингаляционных лекарственных форм в основном трех различных типов. Во-первых, антагонисты, соответст 004316 26 вующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав лекарственных форм с пропеллентами, имеющими низкую температуру кипения. Такие лекарственные формы вводятся, как правило, с помощью традиционных дозирующих ингаляторов (MDI). Традиционные ингаляторы, однако, могут модифицироваться таким образом, чтобы повысить возможность получения повторных доз посредством использования технологии, которая позволяет измерять объем вдыхаемого воздуха и скорость потока воздуха у пациента, как обсуждается в патентах США 5,404,871 и 5,542,410. В качестве альтернативы агонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав водных либо этаноловых растворов и доставляться с помощью традиционных распылителей. В более предпочтительном варианте, однако, подобные лекарственные формы в виде растворов аэрозолируются с помощью устройств и систем, таких как были раскрыты в патентах США 5,497,763;5,544,646;5,718,222 и 5,660,166. И, наконец, соединения-агонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав сухих порошковых лекарственных форм. Такие лекарственные формы могут вводиться простым ингалированием упомянутой сухой порошковой лекарственной формы после превращения ее в аэрозольный порошковый туман. Описание технологии осуществления упомянутого приведено в патенте США 5,775,320, который был выдан 7 июля 1988 г., и в патенте США 5,740,794, который был выдан 21 апреля 1998 г. В отношении каждого из вышеупомянутых патентов, заявители указывают, что в этих патентах цитируются другие публикации, посвященные внутрилегочной доставке лекарственных препаратов, и к подобным публикациям можно обращаться для выяснения конкретной методики, устройств и лекарственных форм,которые могли бы использоваться в связи с доставкой агонистов, соответствующих настоящему изобретению. В дополнение к этому, каждый из упомянутых патентов включен в настоящее описание как ссылка в полном объеме с целью раскрытия лекарственных форм, устройств,упаковок и методов доставки агонистических лекарственных форм, соответствующих настоящему изобретению. Отборочные анализы Подходящие лекарственные средства Отборочные анализы могут использоваться для идентифицирования биоактивных подходящих средств, являющихся антагонистамиEGF. Особый интерес отборочные анализы представляют для средств, имеющих низкую токсичность для человеческих клеток. С этой целью могут использоваться многочисленные разнообразные анализы, включая анализы in 27 определению смещения электрофоретической подвижности, иммунологические анализы связывания белков и т.п. Очищенный EGF и EGF-R белок может также использоваться для определения объемной кристаллической структуры; эти данные могут использоваться для моделирования межмолекулярных взаимодействий,функций переносчика и т.п. Упомянутый термин "средство", использованный в этом описании, означает любую молекулу, например, белковую либо фармацевтического лекарственного средства, способную изменять либо угнетать физиологическую функцию EGF либо EGF-R. В общем, параллельному испытанию с различными концентрациями средства подвергается большое количество экспериментальных смесей для получения дифференцированной реакции на различные концентрации. Одна из этих концентраций, как правило, используется в качестве отрицательного контроля, т.е. при нулевой концентрации либо ниже уровня обнаружения. Подходящие средства представлены многочисленными химическими классами, хотя, как правило, это органические молекулы, в предпочтительном варианте небольшие органические соединения, имеющие молекулярную массу более 50 Да и менее приблизительно 2500 Да. Подходящие средства включают функциональные группы, необходимые для структурного взаимодействия с белками, в частности, водородную связь, и, как правило, включают как минимум амино-, карбонильную, гидроксильную либо карбоксильную группу, в предпочтительном варианте как минимум две упомянутые функциональные химические группы. В состав подходящих средств часто входят циклические углеродные либо гетероциклические структуры и/или ароматические либо полиароматические структуры, замещенные одной либо несколькими вышеупомянутыми функциональными группами. Подходящими средствами могут быть также биомолекулы, в том числе пептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, их производные, структурные аналоги либо комбинации. Подходящие средства получают из самых разнообразных источников, в том числе из библиотек синтетических либо природных соединений. Например, имеются многочисленные способы произвольного либо прямого синтеза разнообразных органических соединений и биомолекул, включая экспрессию рандомизированных олигонуклеотидов и олигопептидов. В качестве альтернативы являются доступными либо легко получаются библиотеки природных соединений в виде экстрактов бактериального,грибкового, растительного либо животного происхождения. В дополнение к этому, библиотеки и соединения, полученные естественным либо синтетическим путем, легко модифицируются с помощью традиционных химических, 004316 28 физических и биохимических способов и могут использоваться для получения комбинаторных библиотек. Известные фармакологические средства могут подвергаться прямым либо произвольным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, эстерификация,амидирование и т.п. для получения структурных аналогов. В том случае, когда в качестве отборочного анализа используется анализ связывания, одна либо несколько молекул могут соединяться с меткой, причем упомянутая метка может прямо либо косвенно обеспечивать поддающийся обнаружению сигнал. К многочисленным существующим меткам относятся радиоизотопы,флуоресцирующие вещества, хемилюминесцирующие вещества, ферменты, специфические связывающие молекулы, частицы, например,магнитные частицы и т.п. Специфические связывающие молекулы представляют собой пары,такие как биотин и стрептавидин, дигоксин и антидигоксин и т.п. В случае специфических связывающих членов, комплементарный член должен, как правило, метиться молекулой,обеспечивающей обнаружение в соответствии с известными способами. Отборочному анализу может подвергаться большое количество других реагентов. К их числу относятся такие реагенты, как соли, нейтральные белки, например, альбумин, детергенты и т.д., которые используются для облегчения оптимального связывания белков и/или снижения объема неспецифических либо фоновых взаимодействий. Могут использоваться реактивы, повышающие эффективность упомянутого анализа, такие как ингибиторы протеаз, ингибиторы нуклеаз, противомикробные средства и т.д. Смесь компонентов добавляется в любом порядке, обеспечивающем необходимое связывание. Инкубирование осуществляют при любой приемлемой температуре, как правило, в пределах от 4 до 40 С. Продолжительность инкубирования подбирают для обеспечения оптимальной активности, однако, ее можно также оптимизировать для облегчения проведения ускоренного высокопроизводительного отбора. Достаточным, как правило, оказывается промежуток времени от 0,1 до 1 ч. Соединения, имеющие необходимую фармакологическую активность, могут вводиться в физиологически приемлемом носителе хозяину для лечения гиперсекреторного заболевания в лекарственных формах, описание которых здесь приводится. В зависимости от способа введения, упомянутые соединения могут включаться в состав лекарственных форм различными способами, описание которых здесь приводится. Концентрация терапевтически активного соединения в лекарственной форме может колебаться от приблизительно 0,1 до 100 мас.%. Схема приема лекарственного средства 29 Соответствующая дозировка будет также изменяться в зависимости от ряда факторов, в том числе от природы субъекта, подлежащего лечению, конкретной природы гиперсекреторного состояния, подлежащего лечению, и его тяжести, природы антагониста EGF-R, используемого в качестве активного ингредиента, способа введения, лекарственной формы и решения лечащего врача. Например, в случае введения самих антител, таких как анти-EGF либо EGF-R,в виде лекарственной формы для инъекций, разовые дозы будут составлять в пределах от 20 до приблизительно 40 мг/кг. Может потребоваться повторное введение в течение нескольких дней либо введение посредством внутривенного вливания может быть непрерывным. При хронических состояниях введение может продолжаться в течение более длительных периодов времени,в зависимости от потребности. Эффективность схемы приема лекарственного средства будет определяться посредством оценки улучшения функционирования легких у пациента. Эта оценка может включать определение упруговязкостных свойств мокроты,улучшения функционирования легких, включая повышение объема форсированного выделения мокрот и максимальной средней скорости выдыхаемого потока воздуха. Упомянутая лечебная схема может быть осуществлена в сочетании со вспомогательными методами лечения,такими как применение антибиотиков, дезоксирибонуклеазы I, или другими терапевтическими методами, используемыми в настоящее время для лечения гиперсекреторного легочного заболевания. Если антибиотики вводятся одновременно как часть лечебной схемы, количественное определение микрофлоры после завершения курса лечения может использоваться для оценки его эффективности по снижению бактериального роста, свидетельствующего о снижении вязкости слизи либо мокроты и повышении выведения слизи или мокроты из легких. Опытным специалистам в данной области известны функциональные пробы легких, а также диагностические тесты для определения клинического прогрессирования легочного гиперсекреторного заболевания. Стандартные функциональные пробы легких включают определение сопротивления дыхательных путей(AR); форсированной жизненной емкости легких (FVC); индекса форсированного выдоха в 1 с (FEV(1; средней форсированной скорости потока выдыхаемого воздуха; и пикового значения скорости потока выдыхаемого воздуха(PEFR). К числу других функциональных проб легких относятся: анализ газа крови; реакции на лекарственные средства; провокационная проба и нагрузочная проба (тест на переносимость физической нагрузки); определение силы дыхательных мышц; волоконно-оптическое исследование дыхательных путей и т.п. Некоторые основные процедуры исследования свойств слизи 30 включают определение реологических свойств,например, с помощью магнитного микрореометра; адгезивных свойств для определения сил притяжения между липкой поверхностью и адгезивной системой путем измерения краевого угла между каплей слизи и поверхностью. Перенос слизи ресничками может исследоваться с помощью традиционных способов, а также путем непосредственного измерения, например,коэффициента очищения слизи in situ. Разность трансэпителиальных потенциалов, т.е. суммарный результат активности системы переноса ионов легочным эпителием, может измеряться с помощью соответствующих микроэлектродов. Для определения состояния поверхности эпителия могут использоваться количественные морфологические методы. Пациентом, подлежащим лечению, может быть примат, такой как человек, или же любое другое животное, демонстрирующее описанные симптомы. Несмотря на то, что способ, соответствующий настоящему изобретению, в особой степени приспособлен для лечения пациентачеловека, следует понимать, что настоящее изобретение также применимо и в ветеринарии. Отборочные анализы in vitro В другом варианте осуществления настоящего исследования анализы in vitro используются для оценки терапевтического потенциала подходящих средств по угнетению пролиферации бокаловидных клеток, т.е. активны ли такие средства как антагонисты EGF. В общем, такие анализы будут включать следующие этапы: (i) контактирование модели пролиферации бокаловидных клеток in vitro с EGF либо его функциональным эквивалентом; (ii) последующее контактирование упомянутой модели in vitro с подходящим средством; и (iii) оценка пролиферации бокаловидных клеток, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала подходящего средства. Упомянутый анализ в предпочтительном варианте осуществляется с двумя контролями,где вторая группа клеток не контактирует ни с каким соединением, а третья контактирует сEGF, но не контактирует с упомянутым подходящим средством. После этого производится сравнение с целью определения степени воздействия EGF и упомянутого подходящего средства на клетки. Может использоваться любая модель пролиферации бокаловидных клеток in vitro. В качестве примера, клетки трахеи крыс могут выделяться и культивироваться в соответствии с описанием, приведенным Газманом (Guzman) и другими, (1995), 217:412-419. Вкратце, клетки трахеи крыс высеваются на полупроницаемые мембраны, покрытые коллагеновым гелем; вначале упомянутые клетки культивируются с погружением в питательную среду, затем удерживаются на поверхности раздела воздух/жид 31 кость. Примерами клеток in vitro являются клетки бронхов зародыша человека (доступные от компании Clonetics, San Diego); клетки NCIH292 (Американская коллекция типовых культур (АТСС CRL-1848; и клетки А 431 (Американская коллекция типовых культур (АТССCRL-1555. Упомянутая культура in vitro контактирует с EGF и с подходящим средством. Упомянутое подходящее средство может контактировать с культурой перед, одновременно либо после добавления EGF в зависимости от конечной точки,подлежащей оценке, и природы упомянутого подходящего средства. Культивируемые клетки оцениваются на угнетение пролиферации бокаловидных клеток относительно контролей. Для оценки пролиферации бокаловидных клеток могут использоваться различные молекулярные либо биохимические маркеры. Примерами молекулярных либо биохимических маркеров, которые могут использоваться, являются, однако, ими не ограничиваются, характеристики экспрессии генов либо белков бокаловидных клеток. Некоторые муциновые гены,например, MUC5B (Дессин (Desseyn) и другие,(1997), J. Biol. Chem., 272:3168-3178) экспрессируются в дыхательных путях и имеют генный продукт, представленный в значительных количествах в слизи. Экспрессия муциновых генов обеспечивает подходящий маркер для определения продуцирования слизистого секрета. Экспрессия муцинового гена может оцениваться с помощью традиционных методов,таких как метод назерн-блоттинга, полимеразно-цепьевая реакция (PCR), исследование промотора муцинового гена либо анализ in situ. В соответствии с альтернативным вариантом муциновые белки оцениваются с помощью традиционных методов, таких как метод вестернблоттинга, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунохимический метод и т.п., используя поддающиеся обнаружению меченные антитела. Для определения наличия либо отсутствия бокаловидных клеток в культуре могут использоваться также морфологические критерии, такие как окрашивание на муцины с помощью алциана голубого/периодной кислоты-Шиффова основания (AB/PAS) (Лу (Lou) и другие, (1998), Am. J. Respir. Crit. Care Med.,157:1927-1934). Антитела к муцину могут исследоваться с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Поскольку стимулирование EGF-R лигандом, например,EGF, TGF-, индуцирует фосфорилирование специфической киназы рецептора EGF и вызывает продуцирование бокаловидных клеток,фосфорилирование EGF-R может оцениваться как отражение индуцирования бокаловидных клеток (Донато (Donato) и другие, (1984), J. Biol.Chem., 264-20474-20481). Снижение молекулярных или биохимических маркеров, связанное с пролиферацией бо 004316 32 каловидных клеток, является показателем терапевтического потенциала антагониста. Модели in vivo В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, животные модели in vivo используются для оценки терапевтического потенциала подходящих средств по угнетению пролиферации бокаловидных клеток. В общем, такой анализ включает следующие этапы:(i) получение животной модели гиперсекреторного легочного заболевания посредством индуцирования экспрессии EGF-R;(iv) оценка пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи является показателем терапевтического потенциала подходящего средства. Может использоваться любая модель гиперсекреторного легочного заболевания in vivo. В качестве примера может быть приведена астматическая мышиная модель, соответствующая описанию, приведенному Теманн (Temann) и другими, (1977), Am. J. Respir. Cell. Biol.,16:471-478, и показанная в примерах, приведенных в настоящем описании. В соответствии с альтернативным вариантом может быть использована крысиная модель, соответствующая описанию, приведенному Такеямой (Takeyama) и другими, (1988), Am. J. Physiol. Примерами других животных моделей, которые могут быть использованы, являются, однако, ими не ограничиваются, морские свинки (виды, конституционально экспрессирующие бокаловидные клетки) и крысы. Ткань легких либо ткань трахеи животных моделей может исследоваться с помощью тех же самых молекулярных и биохимических маркеров, описание которых было приведено для модели in vitro. Снижение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала упомянутого антагонистаEGF-R. Приведенные далее примеры представлены для того, чтобы снабдить среднего специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, как осуществить и использовать настоящее изобретение, и они не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают как свое изобретение,они также не служат свидетельством того, что приведенные эксперименты являются всеми либо единственно проведенными. Были предприняты усилия по обеспечению точности использованных цифровых данных (например,количество, температура), однако, следует учитывать возможность некоторых экспериментальных погрешностей и отклонений. При от 33 сутствии иных указаний части являются массовыми частями, молекулярная масса является взвешенным средним значением молекулярной массы, температура приведена в градусах Цельсия и давление соответствует либо является близким к атмосферному. Экспериментальная часть Пример 1. Система EGF регулирует продуцирование муцина в дыхательных путях. Гиперплазия бокаловидных клеток происходит при различных гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей, однако, поскольку неизвестны лежащие в основе механизмы, не существует и эффективных способов лечения. В здоровых дыхательных путях наблюдается небольшое количество бокаловидных клеток, в то время как при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей происходит гиперплазия бокаловидных клеток. Изучали линию бронхиальных клеток человека (NCI-H292). Эти клетки экспрессируют EGF-R конституционально; экспрессия гена EGF-R была дополнительно стимулирована альфа-фактором некротизации опухолевых клеток (TNF-). Лиганды EGF-R повышали синтез муцинов, и этот эффект усиливался при совместном инкубировании с TNF-. Эпителиальные клетки дыхательных путей апатогенных крыс экспрессировали незначительное количество EGF-R белка, однако интратрахеальная инстилляция TNF- (200 нг) индуцировала EGF-R в базальных клетках,клетках-предшественниках бокаловидных клеток и бокаловидных клетках, но не в реснитчатых эпителиальных клетках; TNF-, EGF либоTGF- самостоятельно не индуцировали продуцирования бокаловидных клеток. Однако инстилляция TNF-, с последующим введением лигандов EGF-R, вызывала повышение числа бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, поразительное усиление позитивного окрашивания алцианом голубым/периодной кислотой-Шиффовым основанием (AB/PAS) (отражавшее гликоконъюгаты слизи) и экспрессии муцинового генаMUC5. У сенсибилизированных крыс следствием введения овальбумина являлось продуцирование бокаловидных клеток и экспрессия EGF-R в эпителии дыхательных путей. В клетках NCIH292, у крыс, стимулированных TNF- с последующим введением лигандов EGF-R, и у астматической крысиной модели предварительная обработка ингибитором тирозинкиназы EGF-R(BIBX 1522) предотвращала продуцирование бокаловидных клеток в дыхательных путях. Эти данные демонстрируют роль ингибиторов каскада EGF-R при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей. Методы исследования in vitro Культура клеток. Линию клеток слизеобразующего плоскоклеточного рака легких чело 004316 34 века, NCI-H292, выращивали в питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% сыворотки зародыша крупного рогатого скота, пенициллин(100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), при температуре 37 С в 5% СО 2-инкубаторе с водяной рубашкой. После слияния клетки инкубировали с EGF (рекомбинантный человеческийTNF-, 20 нг/мл, компания Genzyme), EGF (25 нг/мл) плюс TNF- (20 нг/мл) либо TGF- (25 нг/мл) плюс TNF- (20 нг/мл) в течение 12 ч, 24 ч либо 48 ч. При исследовании ингибирования ингибитором тирозинкиназы EGF-R, BIBX 1522(10 мкг/мл, любезно предоставленным компанией Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Германия), клетки предварительно обрабатывалиBIBX 1522 за 30 мин до добавления факторов роста. После инкубирования клетки, которые выращивались в матрасе Т-75, использовали для полного экстрагирования РНК либо экстрагирования белка, и для визуализации муцина посредством окрашивания AB/PAS использовали 8-камерные предметные стекла. Вестерн-блоттинг. Клетки, выращивавшиеся в матрасах Т-75, лизировали и соскребали в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), содержащий 1% Тритона X, 1% диоксиколата натрия и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (10 мг/мл). Общее количество белка определяли с помощью аналитического белкового реактива ВСА (компания Pierce,Rockford, штат Иллинойс). Клеточные лизаты кипятили с трициновым буфером для образца и 2% -меркаптоэтанола (МЕ) при температуре 95 С. Белки отделяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в 8% акриламидных гелях. Полученные гели уравновешивали в гибридизационном буфере: 25 мМ Трис-буфер-HCl, 192 мМ глицин, 20% (в объемном отношении) метанол, рН 8,3. После этого полученные белки посредством электрофореза переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После этого упомянутые мембраны инкубировали в течение 1 ч в 5% снятом обезжиренном молоке в PBS, содержащем 0,05% Твин 20. Затем упомянутые мембраны инкубировали с моноклональным мышиным анти-EGF-R антителом (1:100) при температуре 4 С в течение ночи. Визуализацию связанных антител осуществляли по стандартным протоколам метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза (набор АВС, компания VectorLaboratories). В качестве позитивного контроля для EGF-R использовали клеточные лизаты клеток А 431 (20). Иммуноцитохимическая локализация EGFR в клетках NCI-H292. Клетки, выращенные на 35 8-камерных предметных стеклах, фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 1 ч. При окрашивании на EGF-R, в качестве разбавителя для антитела использовали PBS, который включал 0,05% Твин 20, 2% нормальную козью сыворотку и 2 мМ левамизол. Гистологические срезы инкубировали с мышиным моноклональным антителом к EGF-R (1:250) в течение ночи при температуре 4 С, после чего трижды промывали PBS для удаления излишка основного антитела. После этого клетки инкубировали с биотинилированным лошадиным антимышиным иммуноглобулином (компания Vector Laboratories, Burlingame, штат Калифорния) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Визуализацию связанных антител осуществляли по стандартным протоколам метода с использованием комплекса авидин-биотинщелочная фосфатаза (набор АВС, компанияVector Laboratories, Burlingame, штат Калифорния). Зонды. Экспрессию мРНК EGF-R определяли с помощью линеаризованного pTRI-EGFR-мРНК-зонда человека (компания Ambion,Austin, штат Техас). В состав этого зонда входит 360 п.н. фрагмент кДНК человеческого генаEGF-R, который стягивает экзоны 12-14. Экспрессию гена MUC5 определяли с помощью человеческого зонда MUC5AC, в состав которого входит 298 п.н. фрагмент кДНК человеческого гена MUC5AC (любезно предоставленный доктором Карол Басбаум (Carol Basbaum. Назерн-блоттинг. Общую РНК экстрагировали из клеток NCI-H292, выращенных в матрасе Т-75 для культивирования тканевых культур,с помощью реактива Tri-Reagent (компанияMolecular Research Ctr, Cincinnati, штат Огайо) в любом состоянии. Общую РНК (10 мкг) подвергали электрофорезу на 1% агарозно/формальдегидном геле и посредством гибридизации путем пассивной диффузии в капиллярах переносили на нейлоновую мембрану (компания Amersham,Arlington Heights, штат Иллинойс). Полученные зонды метили с помощью 32 Р, используя наборRandom Primed DNA labeling kit (компания Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, штат Индиана). Блоты подвергали предварительной гибридизации при температуре 42 С в течение 4 ч с последующей гибридизацией при температуре 42 С в течение 16 ч с 32 Р-меченым специфическим кДНК зондом. В состав гибридизационного раствора входил 250 мМ Трис-буфер-НСl (рН 7,5), 5% додецилсульфат натрия, 1% сывороточный альбумин крупного рогатого скота(BSA), 1% поливинилпирролидон, 1% фиколл и 0,5% пирофосфат натрия. После гибридизации упомянутые мембраны дважды промывали 2xSSC (цитрат Na+NaCl) с 0,1% додецилсульфата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре, затем дважды промывали 2xSSC(цитрат Na+NaCl) с 0,1% додецилсульфата натрия в течение 30 мин при температуре 50 С и 36 прополаскивали 1xSSC с 0,1% додецилсульфата натрия. Мембраны экспонировали на рентгеновскую пленку. Исследования in vivo Протокол проведения экспериментов на животных был одобрен Комитетом по проведению исследований на животных (Committee onAnimal Research) Калифорнийского университета, Сан-Франциско. Специальных апатогенных крыс-самцов линии F344 Fisher массой 230-250 г (компания Simonsen Laboratories, Gilroy, штат Калифорния) содержали в помещении с контролируемой температурой (21 С) со свободным доступом к стандартному лабораторному корму и воде. Здоровые крысы. Крыс анестезировали метогекситалом натрия (бревитал натрия, 50 мг/кг,внутрибрюшинно; компания Eli LillyCo., Indianapolis, штат Индиана) при спонтанном дыхании. Для определения, активирует ли TNFEGF-R в дыхательных путях, TNF- (200 нг, 100 мкл) вводили малыми дозами в трахею и животных забивали через 24 ч. Для проверки, индуцировались ли бокаловидные клетки в эпителии дыхательных путей с помощью EGF либоTNF-, EGF (600 нг, 100 мкг) либо TGF- (синтетический крысиный TGF-, 250 нг, 100 мкл; компания Sigma, St. Louis, штат Миссури) вводили малыми дозами в трахею самостоятельно либо через 24 ч после введения TNF- (200 нг,100 мкл) малыми дозами, и животных забивали через 48 ч. При проведении каждого эксперимента в трахею в качестве контроля малыми дозами вводили стерильный PBS (100 мкг). Для подтверждения того, что продуцирование муцина было вызвано активацией EGF-R, нами было проверено воздействие ингибитора тирозинкиназы EGF-R, BIBX 1522 (доза определялась по результатам исследований с использованием упомянутого ингибитора для предотвращения роста раковой опухоли). Крыс предварительно обрабатывали BIBX 1522 (3 мг/кг, 10 мг/кг либо 30 мг/кг, внутрибрюшинно) за 1 ч до и через 24 ч после введения TGF-. Трахеи и легкие удаляли для проверки через 48 ч после введенияTGF-. Сенсибилизированные крысы Сенсибилизация. Крыс сенсибилизировали на 0 день и 10 день посредством внутрибрюшинного впрыскивания овальбумина (10 мг, V класс чистоты, компания Sigma, St. Louis, штат Миссури) в комплексе со 100 мг гидроксида алюминия в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. После этого крысы находились в покое в течение 10 дней. На 20 день овальбумин вводили непосредственно в трахею; животных трижды (20 день, 22 день и 24 день) провоцировали (интратрахеальная инстилляция) 100 мкл 0,1% раствора овальбумина в физиологическом растворе. Крыс забивали либо без постановки провокационной пробы (20 день), либо 37 через 48 ч после постановки третьей провокационной пробы (26 день). Следствием этой процедуры явилась метаплазия бокаловидных клеток. Для блокирования гиперплазии бокаловидных клеток, сенсибилизированных крыс предварительно обрабатывали ингибитором тирозинкиназы EGF-R, BIBX 1522. В дни овальбуминовой провокационной пробы (20 день, 22 день и 24 день) сенсибилизированных крыс предварительно обрабатывали BIBX 1522 (10 мг/кг,внутрибрюшинно, за 1 ч до постановки провокационной пробы), после чего BIBX 1522 вновь вводили малыми дозами в трахею вместе с овальбумином (BIBX 1522, 10-5 М, 100 мкл). Кроме того, BIBX 1522 впрыскивали крысам внутрибрюшинно через каждые 24 ч до дня забоя животных. После того как животные были забиты, трахеи удаляли через 48 ч после третьей провокационной пробы. Подготовка тканей. В предварительно определенные моменты времени в процессе анестезирования осуществляли перфузию системы кровообращения 1% раствором параформальдегида в PBS, обработанном диэтилпирокарбонатом (DEPC) при давлении 120 мм рт.ст. После этого трахею удаляли и выдерживали в 4% растворе параформальдегида в течение 24 ч. После завершения фиксирования трахеи и легкие заливали JB-4 плюс мономерный раствор А для анализа клеток либо составом О.С.Т. (компанияSakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, штат Калифорния) для проведения иммуногистохимических исследований и для гибридизации in situ. Из залитых тканей получали поперечные гистологические срезы (толщиной 4 мм) и помещали их на предметные стекла. Анализ клеток. Мы производили подсчет общего количества эпителиальных клеток путем подсчета ядер эпителиальных клеток на 2 мм собственной пластинки слизистой оболочки с помощью иммерсионных объективов (1000 х увеличение). Линейную длину собственной пластинки слизистой оболочки под каждым участком эпителия, подвергавшимся анализу, определяли посредством записи контура оцифрованного изображения собственной пластинки слизистой оболочки. После инстилляции стимулирующих агентов возникают "проявляющиеся" бокаловидные клетки. Эти клетки имеютAB/PAS-позитивные гранулы, однако размер гранул небольшой и количество цитоплазматических гранул незначительно. Мы называем эти"проявляющиеся" бокаловидные клетки "клетками-предшественниками бокаловидных клеток", эта стадия предшествует превращению упомянутых клеток в зрелые бокаловидные клетки. Бокаловидные клетки высокие, кубоидные, имеют форму от бокаловидной до низкостолбчатой и включают большое количествоAB/PAS-окрашенных гранул, заполняющих большую часть цитоплазмы между ядром и поверхностью полости. Клетки-предшественники 38 бокаловидных клеток определяются как клетки с меньшей площадью окрашенной слизи (1/3 высоты в эпителии от базальной мембраны до поверхности просвета) либо с рассеянными и слегка AB/PAS-окрашенными гранулами небольшого размера. Реснитчатые эпителиальные клетки распознаются по их реснитчатым краям,слегка окрашенной цитоплазме и большим круглым ядрам. Негранулированные секреторные клетки имеют столбчатую форму и протягиваются от просвета до собственной пластинки слизистой оболочки. Цитоплазма окрашивается в светло-розовый цвет и в ней наблюдается несколько крошечных PAS-позитивных и АВнегативных гранул. Базальные клетки представляют собой небольшие уплощенные клетки с крупными ядрами, расположенные непосредственно над собственной пластинкой слизистой оболочки, но не достигающие просвета дыхательных путей. Количественное определение продуцируемых бокаловидных клеток. Продуцирование бокаловидных клеток определяли по объемной плотности окрашенных алцианом голубым/PAS слизистых субстанций на слизистой поверхности эпителия, используя полуавтоматическую систему отображения, описание которой было приведено в литературных источниках (Вебер(Weber) и другие, (1984), Science, 224:294-297). Мы измеряли площадь, позитивно окрашенную алцианом голубым/PAS, и общую площадь эпителия, и выражали полученные данные в виде процента от общей площади, окрашенной алцианом голубым/PAS. Анализ производили с помощью находящейся в государственной собственности программы Image Национального института здоровья США (разработанной в Национальном институте здоровья США и общедоступной из сети Интернет по протоколу FTP по адресу zippy.nimh.gov. либо на гибком диске от компании National Technical InformationEGF-R в эпителии крыс. Локализацию EGF-R проверяли посредством иммуногистохимического окрашивания антителом к EGF-R (компания Calbiochem, San Diego, штат Калифорния) на замороженных гистологических срезах трахеи крыс. После перфузии 1% раствором параформальдегида в PBS, ткани выдерживали в 4% растворе параформальдегида в PBS в течение 1 ч, после чего помещали в 30% раствор сахарозы для криозащиты в течение ночи. Трахеи заливали составом О.С.Т. (компания Sakura FinetekU.S.A., Inc., Torrance, штат Калифорния) и замораживали. Замороженные гистологические срезы (5 мкм) разрезали и помещали на стеклянные предметные стекла (компания Superfrost Plus,Fisher Scientific, Pittsburgh, штат Пенсильвания). Иммунологическое окрашивание осуществляли 39 так же, как и при проведении исследований invitro. Получение зондов. кДНК для MUC5 крыс была щедро предоставлена доктором Карол Басбаум (Carol Basbaum). 320 п.н. фрагмент кДНК MUC5 крыс субклонировали в сайтеXba/hindIII упомянутого транскрипционного вектора, pBluescript-SK(-) (компания Stratagene,La Jolla, штат Калифорния). Для получения РНК-зондов для гибридизации in situ эту рекомбинантную плазмиду, в состав которой входил фрагмент кДНК MUC5 крыс, переводили в линейную форму и транскрибировали in vitro с Т 7 либо Т 3 полимеразой для получения антисмыслового либо смыслового зонда, соответственно. Упомянутые зонды для гибридизации in situ получали в присутствии [35S]UTP (уридин-5'трифосфат). После транскрибирования кДНК матрицу расщепляли с помощью дезоксирибонуклеазы, меченую радиоактивным изотопом РНК очищали на колонке Sephadex G-25 QuickSpinTM (компания Boehringer Mannheim, Indianapolis, штат Индиана) и осаждали в растворе этанола/ацетата аммония. Перед использованием РНК-зонды промывали 70% этанолом и разбавляли в 10 мМ DTT (дитиотреитол). Гибридизация in situ. Замороженные гистологические срезы (5 мкм) разрезали и помещали на положительно заряженные стеклянные предметные стекла (компания Superfrost Plus,Fisher Scientific, Pittsburgh, штат Пенсильвания). Гистологические срезы, нарезанные в непосредственной взаимной близости, использовали для гибридизации со смысловыми и антисмысловыми зондами. Чередующиеся гистологические срезы использовались для окрашивания алцианом голубым/PAS. Образцы повторно фиксировали в 4% растворе параформальдегида, регидратировали в 0,5xSSC, после чего ацетилировали в триэтаноламине с помощью уксусного ангидрида. Гибридизацию осуществляли с 25003000 имп/мкл антисмыслового либо смыслового зонда в смеси, включавшей 50% раствор деионизированного формамида, 0,3 М NaCl, 20 мМ Трис-буфера, 5 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты (EDTA), 1 храствор Денхардта,20 мМ дитиотреитола, 10% раствор сульфата декстрана, 0,5 мг/мл дрожжевой тРНК и 0,5 мг/мл обработанной ультразвуком ДНК молок лососевых при температуре 55 С в течение ночи. Постгибридизационная обработка включала промывки 2xSSC, 1 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты, 10 мМ -меркаптоэтанола при комнатной температуре, инкубирование с раствором рибонуклеазы (20 мг/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре, и дополнительные промывки в 0,lxSSC, 1 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты, 10 мМ меркаптоэтанола при температуре 55 С в течение 2 ч, затем в 0,5xSSC при комнатной температуре. Образцы дегидратировали, сушили наKodak NBT (компания Eastman Kodak,Rochester, штат Нью-Йорк) для авторадиографии. После экспонирования в течение 7-21 дня при температуре 4 С слайды проявляли, закрепляли и подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином (21). Статистика. Все данные выражены в виде среднего значениясредняя квадратическая ошибка среднего. Для определения статистически значимых различий между группами прибегали к однофакторному дисперсионному анализу. После определения статистической значимости в дисперсионном анализе, для корректирования на множественность сравнений использовали F-критерий Шеффа (Scheffe). Вероятность менее 0,05 для основной гипотезы принималась как свидетельство статистически значимого различия. РезультатыTNF- стимулирует продуцирование EGRR в клетках NCI-H292. Вначале мы определили,экспрессируют ли клетки NCI-H292 EGF-R конституционально. Анализ иммуноблотов методом вестерн-блоттинга позволил определить присутствие EGF-R белка в слившихся культурах клеток NCI-H292 (фиг. 1 А, справа). Клетки проверялись после начала слияния. Лизаты подвергались электрофорезу в 8% акриламидных гелях и блотировались анти-EGF-R антителом. Молекулярные массы маркерных белков приведены с правой стороны. В качестве положительного контроля EGF-R использовали белок клеток А 431 (фиг. 1 А, слева), который экспрессирует EGF-R конституционально (Вебер (Weber) и другие, см. выше). Иммуноцитохимические исследования с анти-EGF-R антителом выявили позитивное окрашивание, что было крайне неожиданно у делящихся клеток (фиг. 1 В, Иммуноцитохимический анализ культур клеток NCIH292 с помощью анти-EGF-R антитела). При слиянии наблюдалось позитивное окрашивание,наиболее сильно выраженное у делящихся клеток (стрелки, правая сторона). При отсутствии главного антитела окрашивание отсутствовалоEGF-R в клетках NCI-H292). Анализу подвергали общую РНК, экстрагированную из слившихся культур, инкубированных с TNF- (20 нг/мкл) в течение 12 ч либо 24 ч. Полученную РНК подвергали электрофорезу на формальдегид-агарозном геле, переносили на найлоновую мембрану и гибридизовали с 32 Р-меченым EGFR кДНК-зондом. После гибридизации упомянутую мембрану промывали и авторадиографировали. Лиганды EGF-R стимулируют экспрессию слизистых гликоконъюгатов и экспрессию генаMUC5 в клетках NCI-H292. EGF-R экспрессируются в клетках NCI-H292 конституционально,поэтому мы оценивали способность лигандовEGF-R (EGF, TGF-) индуцировать продуцирование слизистых гликоконъюгатов (Фиг. 2,верхняя колонка, окрашивание клеток NCI-H292 алцианом голубым/PAS для идентификации муциновых гликопротеинов). Верхняя колонка=инкубирование клеток без ингибитора; нижняя колонка=инкубирование в присутствии ингибитора тирозинкиназы EGF-R BIBX 1522 (10 мкг/мл). В случае, когда клетки инкубировались самостоятельно (контроль), наблюдалось некоторое PAS-позитивное окрашивание (стрелки,верхняя колонка); инкубирование только с TNF (20 нг/мл) не влияло на окрашивание; инкубирование с EGF (25 нг/мл) либо с TGF- (25 нг/мл) усиливало PAS-позитивное окрашивание(стрелки); инкубирование с TNF- плюс TGFзначительно усиливало окрашивание (стрелка,верхняя колонка). Наблюдалось окрашивание некоторых контрольных клеток; инкубирование только сTNF- (20 нг/мл) не влияло на окрашивание; инкубирование с EGF либо с TGF- (каждого по 25 нг/мл) усиливало PAS-позитивное окрашивание (стрелки); инкубирование с TNF- плюсTGF- усиливало окрашивание в значительно большей степени, чем самостоятельно с любым из лигандов. Таким образом, лиганды EGF-R индуцируют слизистые гликоконъюгаты в клетках NCI-H292. Для проверки экспрессии гена MUC5 осуществляли назерн-блоттинг (фиг. 3). Общую РНК (10 мкг) экстрагировали из упомянутых клеток, подвергали электрофорезу на формальдегид-агарозном геле, переносили на найлоновую мембрану и гибридизовали с 32 Р-меченымMUC5 кДНК-зондом. После гибридизации упомянутую мембрану промывали и авторадиографировали. Культуры были получены только с питательной средой (С); определяли воздействие EGF или TGF- (25 нг/мл), TNF- (20 нг/мл) либо комбинации TNF- плюс EGF либоTGF- в течение 12 ч (верхняя колонка) либо 24 ч (нижняя колонка) на экспрессию гена MUC5. Были также получены культуры с TNF- плюсEGF или TGF- после предварительного инкубирования с ингибитором тирозинкиназы EGFR (BIBX 1522; 10 мкг/мл; нижняя колонка); упомянутый ингибитор предотвращал экспрессию гена MUC5. Клетки NCI-H292 продемонстрировали некоторую степень экспрессии в контрольном состоянии (фиг. 3, нижняя левая колонка); в случае, когда упомянутые клетки инкубировались сEGF либо TGF-, экспрессия гена MUC5 едва распознавалась в 12 ч, однако была четко выражена в 24 ч. TNF- самостоятельно не влиял на экспрессию гена MUC5, однако, при добавлении 42 дами EGF-R, экспрессия гена MUC5 явно усилилась, превысив уровень, вызывавшийся только лигандом EGF-R (фиг. 3). Ингибитор тирозинкиназы EGF-R (BIBX 1522) предотвращает экспрессию гликоконъюгатов слизистого секрета и экспрессию генаMUC5 в клетках NCI-H292. Для проверки гипотезы, суть которой заключалась в том, что активация рецепторов EGF-R индуцирует экспрессию гена MUC5, клетки инкубировали с ингибитором тирозинкиназы EGF-R BIBX 1522. В случае предварительной обработки клеток NCIH292 BIBX 1522 (10 мкг/мл), PAS-позитивное окрашивание ингибировалось в контрольном состоянии, а повышенное окрашивание, происходившее с лигандами EGF-R, угнеталось в значительной степени (фиг. 2, нижняя колонка). В случае назерн-блоттинга экспрессия генаMUC5, которая была значительно повышена комбинацией TNF- плюс EGF либо плюс TGF, полностью угнеталась в случае предварительного инкубирования с BIBX 1522 (фиг. 3,нижняя колонка). Эти результаты свидетельствуют о причастности активации EGF-R к индукции муцинового гена и слизистых гликопротеинов в клетках NCI-H292.TNF- стимулирует продуцирование EGFR у крыс. Исследованию подвергали апатогенных крыс (которые конституционально имели незначительное количество бокаловидных клеток в эпителии дыхательных путей), начиная с роли TNF-. В контрольном состоянии эпителий трахей имел незначительное количествоEGF-R-положительных клеток (фиг. 4 А, слева). Однако интратрахеальная инстилляция TNF(200 нг) индуцировала EGF-R белок у клеток различных типов в эпителии трахей (фиг. 4 А,справа). EGF-R-позитивное окрашивание наблюдалось у бокаловидных клеток (G), клетокпредшественников бокаловидных клеток (P-G),негранулированных секреторных клеток (S) и у базальных клеток (Ва), однако отсутствовало у реснитчатых эпителиальных клеток. Таким образом, TNF- индуцирует продуцирование EGFR белка. Роль лигандов EGF-R в продуцировании слизистых гликоконъюгатов и экспрессии генаMUC5 у крыс. В контрольном состоянии в эпителии трахеи находилось незначительное количество бокаловидных клеток и клетокпредшественников бокаловидных клеток. Интратрахеальная инстилляция лигандов EGF-R,EGF (600 нг; не показано) либо только TGF(250 нг; табл. 1), не влияла на продуцирование эпителием слизистых гликоконъюгатов. Однако в том случае, когда первым вводился TNF(200 нг), с последовавшим через 24 ч введениемEGF или TGF- (табл. 1), и животных забивали через 48 ч, окрашивание алцианом голубым/PAS значительно усиливалось и количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток значительно возрастало без изменения общего количества клеток либо количества реснитчатых эпителиальных клеток(табл. 1). При гибридизации in situ экспрессии гена MUC5 у контрольных животных не наблюдалось. При интратрахеальной инстилляцииEGF-R либо только стимуляция лигандами EGFR была недостаточной для индуцирования метаплазии бокаловидных клеток либо для продуцирования слизистых гликоконъюгатов. Однако после индуцирования EGF-R с помощью TNF-,инстилляция лигандов EGF-R вызвала существенную стимуляцию метаплазии бокаловидных клеток. Таблица 1. Анализ клеток эпителия трахеи Сенсибилизация овальбумином контроль только внутривнутрибрюшинно Бокаловидные клетки Клетки-предшественники 7,81,3 12,81,6 бокаловидных клеток Секреторные клетки 82,02,0 72,24,0 Реснитчатые эпителиальные 49,62,0 54,62,3 клетки Базальные клетки 57,82,6 56,82,3 Неопределенного типа 1,40,5 2,00,4 Итого 201,42,2 204,23,3% AB/PAS-окрашенной 2,40,8 6,81,9 площади Таблица 1. Влияние медиаторов и сенсибилизации овальбумином на эпителиальные клетки трахеи у крыс. Клетки анализировали,как описано в разделе "Методы"; пять крыс на группу. При определении свойств прибегали к окрашиванию алцианом голубым (AB)/PAS (последнее сочетание окрашивает слизистые гликоконъюгаты). В дополнение к подсчету клеток,определяли процент AB/PAS-окрашенной площади от общей площади эпителия. В контрольных дыхательных путях и дыхательных путях,стимулированных только TGF- (250 нг), находилось небольшое количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток; наблюдалось незначительное окрашивание AB/PAS. Результатом введения TNF(200 нг) с последующим введением TGF- явилось повышенное количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, а также увеличение площади, занятой AB/PAS-окрашенными клетками. Сенсибилизация крыс овальбумином (OVA) внутрибрюшинно (ip) не влияла ни на распределение клеток, ни на AB/PAS-окрашивание, однако, в том случае, когда вначале OVA вводили внутрибрюшинно, а затем осуществляли интратрахеальную инстилляцию, наблюдалось весьма интенсивное возрастание числа бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, а также резкое увеличение AB/PASокрашенной площади (%). Сенсибилизация крыс овальбумином индуцирует EGF-R и продуцирование бокаловидных клеток. Поскольку, как сообщается, смерть от острого астматического приступа наступает вследствие закупорки дыхательных путей слизью, модель астмы воспроизвели на апатогенных крысах. Инъекции овальбумина (10 мг,внутрибрюшинно) на 0 день и 10 день не стимулировали гиперплазии бокаловидных клеток(табл. 1). Однако в случае, когда за этим следовали три интратрахеальные инстилляции овальбумина (0,1% в 100 мкл) на 20 день, 22 день и 24 день и животных забивали на 26 день, количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток было значительно увеличено; количество реснитчатых эпителиальных клеток и базальных клеток осталось неизменным (табл. 1, правая сторона). Иммуногистохимические исследования с антиEGF-R антителом продемонстрировали отсутствие окрашивания в контрольных трахеях. У животных, сенсибилизированных как внутрибрюшинно, так и интратрахеально, наблюдалось избирательное окрашивание EGF-R (фиг. 4 В,слева) в клетках, которые положительно окрашивались AB/PAS (фиг. 4 В, справа). После трех интратрахеальных инстилляций овальбумина(0,1%, 100 мл) иммунореактивность EGF-R была сильно выраженной у бокаловидных клеток и у клеток-предшественников бокаловидных клеток (внизу слева), т.е. у тех же самых клеток,которые положительно окрашивались алцианом голубым/PAS (внизу справа). Таким образом,овальбуминовая модель астмы продемонстрировала пролиферацию бокаловидных клеток в клетках, которые продуцировали EGF-R. Ингибитор тирозинкиназы EGF-R (BIBX 1522) предотвращает продуцирование бокаловидных клеток, индуцированное инстилляциейTNF- плюс лиганды EGF-R и сенсибилизацией овальбумином у крыс. Поскольку BIBX 1522 предотвращал продуцирование муцина культивированными клетками, влияние этого ингибитора исследовали на апатогенных крысах. Окрашивание алцианом голубым/PAS, усиливавшееся интратрахеальной инстилляцией TNF- с последующим введением лиганда EGF-R TGF, угнеталось дозозависимым образом в случае предварительной обработки BIBX 1522 (3-30 мг/кг, внутрибрюшинно; фиг. 5 А). Следствием интратрахеальной инстилляции TNF- (для индуцирования EGF-R) и последующего введения лиганда EGF-R TGF- явилась весьма интенсивная метаплазия бокаловидных клеток. У крыс, сенсибилизированных овальбумином, предварительная обработка BIBX 1522 (10 мг/кг, внутрибрюшинно) полностью подавляла продуцирование бокаловидных клеток (оценивалось по окраске алцианом голубым/PAS; фиг. 5 В). У животных, которым овальбумин вводили внутрибрюшинно, наблюдалось незначительноеAB/PAS-позитивное окрашивание бронхиального эпителия. У животных, вначале сенсибилизированных OVA внутрибрюшинно, с тремя последующими интратрахеальными инстилляциями OVA, наблюдалось явно выраженное усиление AB/PAS-положительного окрашивания. Результаты этих исследований показывают, что EGF-R, будучи стимулированным лигандами EGF-R, индуцирует продуцирование бокаловидных клеток in vitro и in vivo. т.е. оказывает воздействие, обусловленное активациейEGF-R, которое блокировалось ингибитором тирозинкиназы EGF-R. На овальбуминовой модели астмы упомянутый ингибитор также эффективно предотвращал продуцирование бокаловидных клеток. Наряду с описанием механизма индуцирования бокаловидных клеток, полученные результаты позволяют предположить возможную последовательность развития продуцирования бокаловидных клеток, исходя из экспрессииEGF-R: Стимуляция TNF- вызывает интенсивное окрашивание негранулированных секреторных клеток; их последующая активация лигандамиEGF-R вызывает прогрессирующее окрашивание слизистых гликоконъюгатов в цитоплазме и упомянутые клетки превращаются в "клеткипредшественники бокаловидных клеток", а затем в "бокаловидные клетки". ИнстилляцияEGF-R индуцирует продуцирование бокаловидных клеток, не изменяя общего количества эпителиальных клеток, что позволяет предположить, что активация EGF-R стимулировала избирательную дифференциацию клеток (не пролиферацию). Полученные данные позволяют сделать предположение, что бокаловидные клетки образуются из негранулированных сек 004316 46 реторных клеток, которые экспрессируют EGFR и стимулируются лигандами EGF-R к продуцированию муцина. У пациентов, умерших от острого астматического приступа, важными показателями являются гиперплазия бокаловидных клеток и закупорка слизистым секретом. В крысиной модели астмы сенсибилизация дыхательных путей происходит после повторной инстилляции овальбумина, следствием чего является явно выраженная гиперплазия бокаловидных клеток дыхательных путей. Мы показали, что EGFR, который не экспрессируется в эпителии дыхательных путей контрольных животных, экспрессируется у сенсибилизированных животных. Клетки, которые окрашивались, были клетками-предшественниками бокаловидных клеток и бокаловидными клетками, что позволяет предположить, что EGF-R был вовлечен в продуцирование бокаловидных клеток. Предварительная обработка ингибитором тирозинкиназы EGF-R (BIBX 1522) предотвращала продуцирование бокаловидных клеток в дыхательных путях, подтверждая роль активации EGF-R в продуцировании бокаловидных клеток при экспериментальной астме. Полученные результаты указывают на причастность каскада реакций EGF-R к гиперплазии бокаловидных клеток. Результаты ранее проведенных исследований показали, что различные стимулирующие агенты, например,озон, диоксид серы, вирусы, липополисахариды,фактор активации тромбоцитов и интерлейкин 4, активируют экспрессию и секрецию муцина. Настоящее изобретение предоставляет механизм оценки взаимосвязи этих воспалительных стимулирующих агентов и системы EGF-R. Астма используется в качестве примера терапевтической стратегии, соответствующей настоящему изобретению: в нормальном эпителии человеческих дыхательных путей на каждую бокаловидную клетку приходится 3-10 реснитчатых эпителиальных клеток. При астме количество бокаловидных клеток может быть равным либо превосходить количество реснитчатых эпителиальных клеток; у пациентов, умерших в status asthmaticus, наблюдалось 30 кратное увеличение площади (%), занятой бокаловидными клетками, по сравнению с соответствующим показателем у пациентов, умерших от неастматических респираторных заболеваний. Угнетение продуцирования бокаловидных клеток должно ликвидировать этот источник гиперсекреции. Поскольку жизненный цикл бокаловидных клеток неизвестен, время устранения гиперплазии бокаловидных клеток посредством лечения точно спрогнозировано быть не может. При отсутствии дополнительного воздействия аллергена, гиперплазия бокаловидных клеток у ранее сенсибилизированных мышей устранялась в течение пяти дней, наряду с другими проявлениями аллергического воспа 47 ления. Ингибирование активации EGF-R может ингибировать гиперплазию бокаловидных клеток намного быстрее, в зависимости от продолжительности жизни бокаловидных клеток. Недавно сообщили о высокоизбирательных АТФконкурентных ингибиторах тирозинкиназы. Ингибиторы тирозинкиназы EGF-R оценивались для лечения злокачественных опухолей, связанных с экспрессией EGF-R. Гиперсекреция является основным симптомом многих хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей. В настоящее время не существует эффективных лекарственных средств для облегчения симптомов и приостановки прогрессирования этих заболеваний. Полученные данные предоставляют механизм и стратегию лечения: продуцирование бокаловидных клеток предотвращается посредством ингибирования активации EGF-R. Ингибиторы активации EGF-R предлагаются в качестве лекарственного средства при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей. Пример 2. Роль оксидационного стресса в продуцировании бокаловидных клеток. Как полагают, длительное курение сигарет у людей связано с прогрессирующими патологическими изменениями периферических дыхательных путей, включая гиперплазию бокаловидных клеток. Подобным же образом, как было показано, экспериментальные модели курения сигарет вызывают у животных гиперплазию бокаловидных клеток в дыхательных путях. Однако механизм, посредством которого сигаретный дым может индуцировать синтез муцина,неизвестен. Приведенные далее данные демонстрируют, что предвоспалительные цитокинактивированные нейтрофилы и сигаретный дым вызывают синтез муцина MUC5AC в эпителиальных клетках бронхов человека через посредство лиганднезависимого активирования EGF-R. Эти результаты подразумевают рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым как регуляторы дифференциации эпителиальных клеток,следствием которой может быть патологическая индукция муцинпродуцирующих клеток в дыхательных путях. Методы Выделение нейтрофилов. Нейтрофилы человека очищали из периферической крови, полученной от здоровых доноров-людей. Выделение нейтрофилов осуществляли в соответствии со стандартным методом отделения градиентом фиколл-хайпак, осаждением декстраном и гипотоническим лизисом эритроцитов. 95% клеток,по результатам исключающего окрашивания трипановым синим, были, как правило, жизнеспособны. Для предотвращения загрязнения эндотоксином все растворы пропускали через 0,1 мкм фильтр. Культура клеток. Клетки NCI-H292 (линия клеток легочного слизеобразующего плоскокле 004316 48 точного рака человека) выращивали в питательной среде RPMI 1640, включающей 10% сыворотки зародыша крупного рогатого скота, пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и Гепес-буфер (25 мМ), при температуре 37 С в 5% СO2-инкубаторе с водяной рубашкой. Для культивирования клеток использовали 6-луночные культуральные планшеты либо 8-камерные предметные стекла. При достижении стадии слияния клетки инкубировали в течение 1 ч только с нейтрофилами (106 клеток/мл), только сLouis, штат Миссури), с TNF- плюс нейтрофилы, IL-8 плюс нейтрофилы, fMLP плюс нейтрофилы, пероксидом водорода (Н 2 О 2, 200 мкМ),раствором сигаретного дыма либо TGF- (рекомбинантный человеческий TGF-, 0,1-25 нг/мл, компания Calbiochem, San Diego, штат Калифорния). После этого упомянутые клетки промывали и инкубировали только со свежей питательной средой. Эксперименты были завершены в заранее определенное время (для мРНК, 6 ч и 12 ч; для белка, 24 ч). В качестве контроля клетки инкубировали только с питательной средой в течение таких же периодов времени. При проведении других исследований с нейтрофилами TNF- был выбран в качестве стимулирующего агента, поскольку он обладает наиболее мощным воздействием на синтезMUC5AC. Клетки NCI-H292 инкубировали в течение 1 ч либо с нейтрофилами, которые инкубировали с TNF- (20 нг/мл) в течение 1 ч,после чего промывали стерильным PBS во избежание загрязнения супернатантом (например,молекулами, которые были выделены нейтрофилами), либо только с супернатантом. При проведении исследований ингибирования ингибиторами тирозинкиназы EGF-R, клетки NCIH292 предварительно обрабатывали BIBX 1522(10 мкг/мл, любезно предоставленным компанией Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Германия) либо тирфостином AG1478 (10 мкМ, компания Calbiochem) за 30 мин до добавления стимулирующего агента. Исследовали также влияние избирательного ингибитора тирозинкиназы полученного из тромбоцитов рецептора соматотропина (тирфостин AG1295, 100 мкМ,компания Calbiochem) и отрицательный контроль для выявления тирфостинов (тирфостин А 1, 100 мкМ, компания Calbiochem). При проведении исследований ингибирования блокирующими антителами к лигандам EGF-R, супернатанты предварительно обрабатывали антиTGF- антителом (компания Calbiochem) либо анти-EGF антителом в течение 30 мин, после чего добавляли клетки NCI-H292. Роль свободных радикалов кислорода исследовали с помо 49 щью акцепторов свободных радикалов кислорода DMSO (1%, компания Sigma), 1,3-диметил-2 тиомочевины (DMTU, 50 мМ, компания Sigma) либо пероксид-дисмутазы (SOD, 300 Ед/мл,компания Sigma). Получение раствора сигаретного дыма. При проведении этого исследования использовали экспериментальные сигареты (код 2R1,изготовлены для университета штата Кентукки компанией Tobacco and Health Research Foundation). Раствор сигаретного дыма получали в соответствии с представленным ранее описанием(Дассер (Dusser) и другие, (1989), J. Clin. Invest.,84:900-906). Вкратце, сигаретный дым втягивали в полипропиленовый шприц (35 мл) со скоростью 1 клуб табачного дыма/мин (10 раз) и медленно барботировали в 20 мл среды RPMI 1640, включающей 50 мМ Гепес-буфер. После этого полученный раствор дыма титровали до рН 7,4 и использовали сразу же после получения. Визуализация слизистых гликоконъюгатов и MUC5AC белка в клетках NCI-H292. В конце экспериментов, клетки, выращенные на 8 камерных предметных стеклах, фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 1 ч,после чего либо окрашивали алцианом голубым/периодной кислотой-Шиффовым основанием (PAS) для визуализации слизистых гликоконъюгатов, либо использовали для иммуноцитохимических исследований MUC5AC. Для иммуноцитохимических исследований MUC5AC в качестве разбавителя для антитела использовалиPBS, содержащий 0,05% Твин 20, 2% нормальную козью сыворотку и левамизол (2 мМ). Клетки инкубировали с мышиным моноклональным антителом к MUC5AC (клон 45 M1,1:200, компания Neo Markers, Fremont, штат Калифорния) в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего трижды промывали PBS для удаления излишка основного антитела. После этого клетки инкубировали с биотинилированным лошадиным антимышиным IgG (компания Vector Laboratories Inc., Burlingame, штат Калифорния) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Визуализацию связанного антитела осуществляли по стандартному протоколу для метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза. Гибридизация in situ для получения человеческого гена MUC5AC. 298 п.н. фрагмент кДНК человеческого MUC5AC вставляли в клонирующий вектор ТА (компания Invitrogen, SanDiego, штат Калифорния). Получение РНКзондов и гибридизацию in situ осуществляли в соответствии с описанием, которое было приведено ранее. Иммунологический анализ MUC5AC белка. Количество MUC5AC белка определяли, как описывалось ранее. Вкратце, клеточные лизаты получали с PBS в виде кратных разведений и 50 мкл каждого образца инкубировали с бикарбо 004316Nunc, компания Fisher Scientific, Santa Clara,штат Калифорния) до высыхания. Планшеты трижды промывали PBS и блокировали 2% BSA(фракция V, компания Sigma) в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого планшеты вновь трижды промывали PBS, после чего инкубировали с 50 мкл мышиного моноклонального MUC5AC антитела (1:100), которое было разбавлено PBS, включающим 0,05% Твин 20. Через 1 ч лунки трижды промывали PBS и в каждую из них вносили конъюгат пероксидазы хрена-козьего антимышиного IgG (1:10000,компания Sigma). Через 1 ч планшеты трижды промывали PBS. Цветную реакцию проявляли с помощью раствора пероксидазы ТМВ (компания KirkegaardPerry Laboratories, Gaithersburg,штат Мериленд) и останавливали с помощью 2NH2SO4. Оптическую плотность определяли при 450 нм. Количественный анализ TGF- белка. Количество TGF- белка определяли с помощью коммерчески доступного набора для проведения твердофазного иммуноферментного анализа(ELISA) (компания Sigma) согласно инструкциям изготовителя. Супернатант, полученный после инкубирования нейтрофилов плюс TNF(20 нг/мл) в течение 1 ч, смешивали с лизисным буфером PBS, содержащим 1% Тритон Х-100,1% деоксихолата натрия и несколько ингибиторов протеаз, (Complete Mini, компания Boehringer Mannheim, Германия), после чего использования для определения количества TGF-. Иммунопреципитация для получения EGFR белка и иммуноблоттинг для фосфорилирования тирозина. Клетки выращивали на минимальной среде в течение 24 ч, после чего стимулировали TGF-, Н 2 О 2 или супернатантом активированных нейтрофилов в течение 15 мин. После стимулирования клетки лизировали и инкубировали в течение 30 мин в ротационном шейкере при температуре 4 С. Для удаления нерастворимого материала клеточные лизаты центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин при температуре 4 С. Аликвоты супернатантов, содержащие равные количества белка,иммунопреципитировали с анти-EGF-R антителом (поликлональное, Аb4, компания Calbiochem) и 20 мкл белка А-агарозы (Santa Cruz) в течение 2 ч при температуре 4 С. Преципитаты трижды промывали 0,5 мл лизисного буфера,суспендировали в буфере для образца с додецилсульфатом натрия (SDS) и кипятили в течение 5 мин. Белки отделяли SDS-PAGE в 8,0% акриламидном геле. Полученный гель уравновешивали в гибридизационном буфере: 25 мМ трис-Cl, 192 мМ глицин, 20% (в объемном отношении) метанол, рН 8,3. После этого белки переносили посредством электрофореза на нитроцеллюлозные мембраны (0,22 мкм), блокиро 51 вали 5% снятым обезжиренным молоком в PBS,содержащем 0,05% Твин 20, в течение ночи,после чего инкубировали с моноклональным антифосфотирозиновым антителом (1:100, SantaCruz) в течение 1 ч. Визуализацию связанного антитела осуществляли по стандартному протоколу для метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза (АВС kit,компания Vector Laboratories). Статистика. Все данные выражены в виде среднего значениясредняя квадратическая ошибка среднего. Для определения статистически значимых различий между группами, прибегали к однофакторному дисперсионному анализу. После определения статистической значимости в дисперсионном анализе, для корректирования на множественность сравнений использовали F-критерий Шеффа (Scheffe). Вероятность менее 0,05 для основной гипотезы принималась как свидетельство статистически значимого различия. Результаты Активированные нейтрофилы вызывают синтез муцина геном MUC5AC. Когда нейтрофилы плюс стимулирующие агенты, которые активируют нейтрофилы (IL-8, fMLP, TNF-),инкубировали с клетками NCI-H292 в течение 1 ч, синтез белка MUC5AC значительно возрастал в течение 24 ч, в то время как нестимулированные нейтрофилы (106/мл), только IL-8 либо только fMLP не оказывали воздействия на синтез MUC5AC; инкубирование только с TNFвызывало незначительно, несущественное увеличение синтеза MUC5AC. В случае, когда нейтрофилы предварительно инкубировали в течение 1 ч с TNF-, после чего упомянутые нейтрофилы и их супернатант отделяли, последующее инкубирование упомянутого супернатанта в течение 1 ч с клетками NCI-H292 активировало экспрессию гена MUC5AC в пределах 12 ч и стимулировало окрашивание как с помощью алциана голубого/PAS, так и с помощью антитела к MUC5AC белку в пределах 24 ч; покоящиеся клетки NCI-H292 демонстрировали незначительную экспрессию гена MUC5AC и незначительное, пятнистое окрашивание как алцианом голубым/PAS, так и белком MUC5AC. Синтез белка MUC5AC, индуцированный упомянутым супернатантом, значительно возрастал по сравнению с контролем; нейтрофилы, отделенные от упомянутого супернатанта после инкубирования, никакого воздействия не оказывали. Пришли к выводу, что активированные нейтрофилы быстро секретируют активный продукт, который вызывает синтез MUC5AC. Ингибиторы тирозинкиназы EGF-R предотвращают синтез MUC5AC, индуцированный супернатантом активированных нейтрофилов. Поскольку, как известно, лиганды EGF-R вызывают синтез MUC5AC в клетках NCI-H292 посредством активирования тирозинкиназы EGF 004316R, исследовали роль активации EGF-R в синтезеMUC5AC, индуцированном упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Предварительная обработка клеток NCI-H292 избирательными ингибиторами тирозинкиназы EGFR (BIBX 1522, AG1478) предотвращала синтез белка MUC5AC, который, обычно, индуцировался упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Избирательный ингибитор киназы рецептора полученного из тромбоцитов соматотропина (AG 1295) и отрицательный контроль тирфостинов (А 1) воздействия не оказывали. Эти результаты подразумевают активацию тирозинкиназы EGF-R в синтезе MUC5AC, индуцированном упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Роль лигандов EGF-R, секретированных в супернатант активированных нейтрофилов при синтезе MUC5AC. Для определения, зависит ли активация тирозинкиназы EGF-R от лигандовEGF-R(EGF и TGF-), мы прединкубировали упомянутый супернатант активированных нейтрофилов с нейтрализующими антителами к лигандам EGF-R. Предварительная обработка упомянутого супернатанта анти-TGF- антителом либо анти-EGF антителом не ингибировала синтеза MUC5AC, индуцированного упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Более того, TGF- не был обнаружен в упомянутом супернатанте. Таким образом, фосфорилирование тирозина EGF-R, вызванное упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов, было индуцировано механизмом,не зависящим от упомянутых лигандов EGF-R,EGF и TGF-. Сигаретный дым и свободные радикалы кислорода вызывают синтез MUC5AC. Сигаретный дым и свободный радикал кислорода,Н 2 О 2, активируют экспрессию гена MUC5AC в пределах 12 ч, так же, как это делает и TGF-. Подобным же образом, все стимулирующие агенты усиливали синтез белка MUC5AC и продуцирование гликоконъюгата слизистого секрета в пределах 24 ч; эти воздействия имели переменный по времени характер. Максимальный синтез MUC5AC в ответ на воздействие Н 2 О 2 был значительно меньшим, чем реакция наAG 1478 предотвращала усиление синтеза белкаMUC5AC, индуцированного всеми стимулирующими агентами, указывая на то, что все упомянутые стимулирующие агенты вызывают синтез муцина посредством активации тирозинкиназы EGF-R. Синтез MUC5AC, вызывавшийся супернатантом активированных нейтрофилов, сигаретным дымом и Н 2 О 2, значительно ингибировался предварительной обработкой акцепторами свободных радикалов (DMSO иDMTU) и SOD, в то время как DMSO и SOD не оказывали воздействия на синтез белка 53 Индуцирование фосфорилирования тирозина TGF-R супернатантом активированных нейтрофилов и Н 2 О 2. Распределение белка EGFR было одинаковым у контроля, выращенного на минимальной среде, и при всех стимулированных условиях (супернатант активированных нейтрофилов, сигаретный дым, Н 2 О 2 или TGF). Фосфорилирование общего белка тирозина происходило в пределах 15 мин после добавления супернатанта активированных нейтрофилов, сигаретного дыма, Н 2 О 2 либо TGF-; у контроля, выращенного на минимальной среде, эффекта не наблюдалось. TGFиндуцированное фосфорилирование общего белка тирозина было большим, чем эффект супернатанта активированных нейтрофилов, сигаретного дыма или Н 2 О 2. Для определения того, фосфорилировался ли EGF-R, осуществляли иммунопреципитацию с анти-EGF-R антителом. Все факторы, упомянутый супернатант активированных нейтрофилов, растворимые продукты сигаретного дыма и Н 2 О 2, индуцировали EGF-R-специфическое фосфорилирование тирозина в пределах 15 мин; этот эффект был подобен эффекту, вызванномуTGF-. Предварительная обработка клеток NCIH292 с помощью AG 1478 ингибировала фосфорилирование тирозина EGF-R всеми стимулирующими агентами. DMSO ингибировал фосфорилирование тирозина EGF-R, индуцированное супернатантом, сигаретным дымом и Н 2O2, однако, не оказывал воздействия на фосфорилирование тирозина EGF-R, индуцированное TGF-. Вышеприведенные результаты показывают, что нейтрофилы вызывают синтез муцинаMUC5AC в клетках NCI-H292, когда они активируются IL-8, fMLP либо TNF-. Более того,упомянутый супернатант, который собирали через 1 ч после инкубирования нейтрофилов сTNF-, вызывал синтез MUC5AC, т.е. эффект,который ингибировался избирательными ингибиторами тирозинкиназы EGF-R. Ингибирование тирозинкиназы EGF-R полностью блокировало синтез MUC5AC, вызванный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов; ингибитор тирозинкиназы не-EGF-R, избирательный ингибитор киназы рецептора соматотропина, полученного из тромбоцитов, (AG 1295) и отрицательный контроль тирфостинов(А 1), не оказывали воздействия, что подразумевает фосфорилирование тирозина EGF-R как сигнальный путь синтеза MUC5AC, индуцированного упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Для дополнительного анализа механизма,посредством которого супернатанты активированных нейтрофилов индуцируют фосфорилирование тирозина EGF-R, были исследованы как лигандзависимые, так и лиганднезависимые пути превращений EGF-R. Во-первых, мы определили количество TGF- в упомянутом супер 004316 54 натанте активированных нейтрофилов и установили, что упомянутый супернатант не содержит измеримых количеств TGF-. В предшествующих сообщениях было показано, что нейтрофилы содержали лишь низкие концентрации (2,5 пг/106) TGF-. Эффект супернатанта активированных нейтрофилов на синтез MUC5AC был столь же сильным, как и эффект 1 нг TGF-,которого было в 400 раз больше количестваTGF-, обнаруженного в нейтрофилах. Вовторых, мы провели исследования по блокировке нейтрализующими антителами лигандовEGF-R: предварительная обработка нейтрализующими антителами к EGF и TGF- не ингибировала синтез MUC5AC, вызванный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Эти результаты позволяют предположить, что синтез MUC5AC, индуцированный супернатантом нейтрофилов, не был вызван секрецией лигандов EGF-R (TGF- и EGF) нейтрофилами. Далее, мы исследовали лиганднезависимый путь: поскольку свободные радикалы кислорода, как известно, выделяются нейтрофилами во время активации, и они, как известно, вызывают трансактивацию тирозинкиназы EGF-R в различных клетках, мы предположили, что выделение свободных радикалов кислорода активированными нейтрофилами вызывает фосфорилирование тирозина EGF-R и последующий синтез MUC5AC в клетках NCIH292. Акцепторы свободных радикалов (DMSO и DMTU) и SOD ингибировали синтезMUC5AC, обусловленный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Сообщают, что TNF- вызывает оксидационный"взрыв" в суспензии нейтрофилов с максимальной реакцией в пределах 1 ч; представленные результаты демонстрируют подобное же развитие во времени. В настоящем исследовании экзогенный Н 2 О 2, основной продукт, выделяемый из нейтрофилов во время "оксидационного" взрыва,вызывает синтез MUC5AC в клетках NCI-H292. Однако максимальная реакция на Н 2 О 2 при синтезе MUC5AC составляла лишь половину реакции на TGF-. Значительным открытием в настоящем исследовании является тот факт, что сигаретный дым самостоятельно вызывает синтез MUC5AC. Это позволяет предположить, что сигаретный дым может вызвать синтезMUC5AC in vivo как через посредство прямого стимулирования, так и через посредство косвенного стимулирования, вызванного рекрутингом нейтрофилов. Точные молекулы сигаретного дыма, вызывающие синтез MUC5AC, все еще не установлены. Показано, что сигаретный дым включает многочисленные продукты (например,никотин, смолу, акролеин и оксиданты). В наших экспериментах DMSO и SOD частично ингибировали синтез MUC5AC, индуцированный сигаретным дымом. Таким образом, оксидант 55 ный стресс может быть одним из механизмов,вызывающих эту реакцию. Тот факт, что синтезMUC5AC, индуцированный сигаретным дымом,полностью блокировался ингибиторами тирозинкиназы EGF-R, указывает на то, что активация EGF-R играет основную роль в синтезеMUC5AC, индуцированном сигаретным дымом. При заболеваниях дыхательных путей нейтрофильное воспаление дыхательных путей является обычным симптомом; нейтрофилы рекрутируются и активируются цитокинами и сигаретным дымом. Результаты настоящих исследований показывают, что рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым также действуют как регуляторы дифференциации эпителиальных клеток, следствием чего является индукция муцин-продуцирующих клеток в дыхательных путях. Наиболее важным представляется то, что ингибирование активации EGF-R будет пригодным в качестве лекарственного средства при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей. Пример 3. Ранение эпителия дыхательных путей вызывает метаплазию бокаловидных клеток. Предположили, что агарозные пробки,введенные в дыхательные пути, будут постоянно находиться в бронхах, не закупоривая их, и что постоянные пробки вызовут воспаление,следствием которого явится метаплазия бокаловидных клеток. Показано, что агарозные пробки индуцируют явно выраженное местное продуцирование бокаловидных клеток, что демонстрируется положительным окрашиванием алцианом голубым/PAS и экспрессией муцинового гена MUC5AC, связанной с местным рекрутингом клеток зоны воспаления. Этот результат подразумевает активацию EGF-R в индуцированной пробками метаплазии бокаловидных клеток. Методы Животные. Протокол проведения экспериментов на животных был одобрен Комитетом по проведению исследований на животных (Committee on Animal Research) Калифорнийского университета, Сан-Франциско. Были использованы специальные апатогенные крысы-самцы линии F344 (масса 230-250 г; компания Simonsen Laboratories, Gilroy, штат Калифорния). Крыс содержали в апатогенных клетках BioClean с изолированными от окружающей среды вытяжными колпаками, обеспечивающими подачу ламинарного потока воздуха; животные имели свободный доступ к стерильному корму и воде. Лекарственные препараты. Были использованы лекарственные препараты из следующих источников: циклофосфамид (компания Sigma,St. Louis, штат Миссури), метогекситал натрияChicago, штат Иллинойс); BIBX 1522, избирательный ингибитор тирозинкиназы EGF-RIngelheim, Inc., Ingelheim, Германия), был растворен в следующем растворе: 2 мл полиэтиленгликоля 400 (компания Sigma, St. Louis, штат Миссури), 1 мл 0,1N НСl и 3 мл 2% раствора маннитола в воде (рН 7,0). NPC 15669 (ингибитор подвижности лейкоцитов) был любезно предоставлен компанией Scios Nova, Inc.,Mountain View, штат Калифорния. Агарозные пробки. Агарозные пробки(диаметром 0,7-0,8 мм) изготовляли из 4% агарозной питательной среды ЕЕО типа II (компания Sigma, St. Louis, штат Миссури) в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Для визуализации упомянутых агарозных пробок в ткани, после расплавления агарозы при температуре 50 С к ней добавляли 3% суспензию красителя монастрала голубого В(компания Sigma, St. Louis, штат Миссури). Протокол экспериментов. Исследования проводились нами на апатогенных крысах, поскольку в их дыхательных путях, как правило,находится небольшое количество бокаловидных клеток. Животных анестезировали метогекситалом натрия (бревитал, 25 мг/кг, внутрибрюшинно). Трахею асептически обнажали разрезом по средней линии и агарозные пробки вводили в бронхи с помощью иглы Angiocath20 (компания Becton Dikinson, Sandy, штат Юта), присоединенной к полиэтиленовой трубке (РЕ 90,внутренний диаметр 0,86 мм и наружный диаметр 1,27 мм, компания Clay Adams, Parsippany,штат Нью-Йорк), введенной в разрезанную трахею. Полиэтиленовую трубку изгибали под углом 30 для избирательного введения в соответствующий бронх. После введения пробок на разрез накладывали шов. Для оценки роли EGF-R в метаплазии бокаловидных клеток, индуцированной агарозными пробками, животных обрабатывали BIBX 1522 (80 мг/кг, внутрибрюшинно) за 1 ч до введения упомянутых агарозных пробок, и упомянутую обработку повторяли ежедневно (40 мг/кг, внутрибрюшинно, два раза в день). Животных забивали через 24, 48 или 72 ч после введения упомянутых агарозных пробок. Для оценки роли TNF- в метаплазии бокаловидных клеток, индуцированной агарозными пробками, животных обрабатывали TNFнейтрализующим антителом (компания Genzyme, Boston, штат Массачуссетс). Первую обработку (100 мкл в 0,2 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно) производили за 1 ч до введения агарозных пробок, и внутрибрюшинные инъекции повторялись ежедневно. В дополнение к этому TNF- нейтрализующее антитело вливали (10 мкл/ч) с помощью осмотического мининасоса (Alzet 2ML1, компанияAlza Corp., Palo Alto, штат Калифорния), имплантированного под кожу. Для оценки влияния нейтрофилов на метаплазию бокаловидных клеток, индуцированную агарозными пробками, крыс предварительно обрабатывали циклофосфамидом (ингибитор лейкоцитов костного мозга) либо комбинацией циклофосфамида плюс NPC 15669. Циклофосфамид (100 мг/кг, внутрибрюшинно) вводили за 5 дней до введения агарозных пробок, и вторую инъекцию циклофосфамида (50 мг/кг, внутрибрюшинно) производили за 1 день до введения пробок. В процессе исследований с NPC 15669,упомянутое лекарственное средство (10 мг/кг,внутрибрюшинно) впрыскивали за 1 ч до введения агарозных пробок, затем ежедневно в течение 3 последующих дней. Все лекарственные препараты (BIBX 1522,TNF- нейтрализующее антитело, циклофосфамид и NPC 15669) вводили внутрибрюшинно за 1 час до введения агарозных пробок, и дозы повторно вводили ежедневно в течение 3 дней. Получение тканей. Через различные промежутки времени после введения агарозных пробок, крыс анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг/кг, внутрибрюшинно) и осуществляли перфузию системы кровообращения раствором 1% параформальдегида в PBS, обработанном диэтилпирокарбонатом, при давлении 120 мм рт.ст. Правое легкое удаляли и правую каудальную долю использовали для гистологических исследований. Для получения замороженных срезов ткани удаляли и помещали в 4% параформальдегид на 1 ч с последующим помещением в 30% сахарозу для криозащиты в течение ночи. Упомянутые ткани заливали составом О.С.Т. (компания Sakura Finetek U.S.A.,Inc., Torrance, штат Калифорния). Для получения метилакрилатных срезов упомянутые ткани помещали в 4% параформальдегид на 24 ч, после чего дегидратировали градуированными концентрациями этанола и заливали метакрилатом JB-4 (компания Polysciences, Inc., Warrington, штат Пенсильвания). Тканевые срезы (толщиной 4 мкм) окрашивали алцианом голубым/PAS и контрастно окрашивали гематоксилином. Морфометрический анализ бронхиального эпителия. Процент окрашенной алцианом голубым/PAS площади слизистых гликоконъюгатов в эпителии определяли с помощью полуавтоматической системы анализирования изображений в соответствии с ранее опубликованными методами. Площадь эпителия и окрашенных алцианом голубым/PAS конъюгатов слизистого секрета в пределах эпителия очерчивали вручную и анализировали с помощью находящейся в государственной собственности программы Image Национального института здоровья США (разработанной в Национальном институте здоровья США и общедоступной из сети Интернет по протоколу FТР либо на гибком диске от компании National Technical Informa 004316tion Service, Springfield, штат Вирджиния, шифр компонента PB95-500195GEI). Данные выражены в виде процента от общей площади эпителия,занятой красителем алцианом голубым/PAS. Для полуколичественной оценки секреции слизистого секрета, процент длины поверхности эпителия, позитивно окрашенной алцианом голубым/PAS, определяли путем соотнесения позитивно окрашенной длины с общей длиной. Процент оголенного эпителия определяли посредством вычисления отношения длины оголенного эпителия к общей длине эпителия. Идентификация клеточных типов в метакрилатных срезах и анализ клеток. Общее количество эпителиальных клеток определяли путем подсчета ядер эпителиальных клеток на 2 мм собственной пластинки слизистой оболочки с помощью иммерсионных объективов (1000x увеличение). Линейную длину собственной пластинки слизистой оболочки под каждым участком эпителия, подвергавшимся анализу, определяли посредством записи контура оцифрованного изображения собственной пластинки слизистой оболочки. Эпителиальные клетки идентифицировались, как описывалось ранее. Вкратце, базальные клетки идентифицировались как небольшие уплощенные клетки с крупными ядрами, расположенные непосредственно над собственной пластинкой слизистой оболочки,но не достигающие просвета дыхательных путей. Цитоплазма окрашивалась в темный цвет,алциан голубой- либо PAS-положительные гранулы отсутствовали. Реснитчатые эпителиальные клетки распознавались по их реснитчатым краям, слегка окрашенной цитоплазме и большим круглым ядрам. Негранулированные секреторные клетки имели столбчатую форму и протягивались от просвета бронхов до собственной пластинки слизистой оболочки. После интрабронхиальной инстилляции агарозных пробок возникали "проявляющиеся" бокаловидные клетки (клетки-предшественники бокаловидных клеток). Эти клетки имели алциан голубой/РАSпозитивную окраску, гранулы были небольшими и сами клетки не были забиты гранулами; они включали небольшие участки, окрашенные слизью (1/3 высоты в эпителии от базальной мембраны до поверхности просвета), либо рассеянно и слегка окрашенные алцианом голубым/PAS гранулы небольшого размера. Клетки неопределенного типа определяются как профили клеток, не имеющие достаточных цитоплазматических характеристик для отнесения к соответствующей категории. Иммуногистохимическая локализацияEGF-R. Присутствие EGF-R определяли посредством иммуногистохимической локализации,используя моноклональное мышиное антитело кEGF-R (компания Calbiochem, San Diego, штат Калифорния). Предварительно полученные 4 мкм замороженные гистологические срезы 59 постфиксировались 4% параформальдегидом,обрабатывались 0,3% смесью Н 2 О 2/метанола. Ткани инкубировали с EGF-R антителом (разведение 1:250). Биотинилированный лошадиный антимышиный IgG (1:200; компания VectorLab., Burlingame, штат Калифорния), с последующей обработкой комплексом стрептавидинпероксидаза (АВС kit, компания Vector Lab.,Burlingame, штат Калифорния), использовали для визуализации комплексов антиген-антитело,окрашенных 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлоридом (компания Sigma, St. Louis, штат Миссури). Негативные контрольные предметные стекла инкубировали с исключением основного либо второстепенного антитела, замененного PBS. Гибридизация in situ. [35S]-меченые рибозонды получали из плазмиды, включающей 320 п.н. фрагмент кДНК крысиного MUC5AC, любезно предоставленного доктором Карол Басбаум (Carol Basbaum). Гистологические срезы гибридизовали с [35S]-мечеными РНК-зондами(2500-3000 имп/мкл гибридизационного буфера) и промывали с соблюдением жестких условий,включающих обработку рибонуклеазой А. После авторадиографирования в течение 7-21 дней,фотоэмульсию проявляли и полученные предметные стекла окрашивали гематоксилином. Подсчет нейтрофилов в эпителии дыхательных путей. Оценку притока нейтрофилов в бронхи производили путем окрашивания нейтрофилов 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлоридом с подсчетом количества нейтрофилов в просвете и в эпителии дыхательных путей; результаты выражали в виде количества окрашенных клеток на миллиметр длины собственной пластинки слизистой оболочки. Бронхоальвеолярный лаваж (BAL). Для определения лейкоцитарной формулы в каждой группе животных легкие промывали пять раз 3 мл аликвотами стерильного PBS, смывы объединяли и определяли объем. Клетки в BAL собирали посредством центрифугирования промывной жидкости при 1000 об/мин в течение 10 мин. После этого с помощью гемоцитометра просчитывали десять микролитров клеточной суспензии для определения количества клеток в промывной жидкости. Лейкоцитарную формулу определяли на цитоцентрифужных препаратах,окрашенных красителем Diff-Quik (компанияAmerican Scientific Products, McGaw Park, штат Иллинойс). Лейкоцитарную формулу определяли путем отбора как минимум 200 клеток на каждом цитоцентрифужном стекле. Статистический анализ. Данные представлены в виде среднего значения средняя квадратическая ошибка среднего. Для статистического анализа как подходящий был использован двухфакторный либо однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим применением t-критерия Стьюдента. Вероятность ме 004316 60 нее 0,05 была сочтена статистически значимым различием. Результаты Влияние на структуру эпителия дыхательных путей: Метаплазия бокаловидных клеток. Для определения, влияют ли агарозные пробки на структуру эпителия дыхательных путей, агарозные пробки вводили в правые бронхи 5 апатогенных крыс. В бронхиальном эпителии контрольных животных находилось небольшое количество бокаловидных клеток. Однако после местного введения агарозных пробок, окрашивание алцианом голубым/PAS показало изменяющееся со временем увеличение площади бокаловидных клеток, которая обнаруживалась уже к 24 ч и была наибольшей через 72 ч после введения агарозных пробок. Через 24 ч агарозные пробки вызвали значительное увеличение числа клеток-предшественников бокаловидных клеток и бокаловидных клеток, и через 48 ч обнаруживалось больше зрелых бокаловидных клеток (табл. 1). Через 72 ч агарозные пробки увеличили количество бокаловидных клеток(Р 0,01); количество базальных и реснитчатых клеток осталось неизменным (Р 0,05). Общее число эпителиальных клеток на мм собственной пластинки слизистой оболочки через 72 ч после введения агарозных пробок было слегка, но незначительно повышено (Р 0,05, табл. 1); высота эпителия (измеренная от базальной мембраны до поверхности эпителия в просвете) увеличилась от 16,01,2 мкм в контрольных дыхательных путях до 38,19,1 мкм через 72 ч после введения пробок (n=5, Р 0,01). В просвете дыхательных путей контрольных животных не наблюдалось окрашивания алцианом голубым/PAS. Однако в непосредственной близости от агарозных пробок в просвете наблюдалось окрашивание, свидетельствующее о имевшей место секреции гликоконъюгатов слизи. В дыхательных путях с агарозными пробками увеличение окрашенной площади носило переменный по времени характер. Процент общей длины эпителия, позитивно окрашеной алцианом голубым/PAS в дыхательных путях в непосредственной близости от пробок, увеличился от 0,10,1% у контрольных животных до 4,71,4%, 13,30,7% и 19,10,7% через 24 ч, 48 ч и 72 ч (n=5). Более того, агарозные пробки оголили эпителий закупоренных бронхов на 13,52,3%, 6,92,4% и 5,11,5% от общей площади через 24 ч, 48 ч и 72 ч, соответственно(n=5). Влияние агарозных пробок на экспрессию муцинового гена. В бронхах контрольных крыс не наблюдалось обнаружимого сигнала с антисмысловым зондом MUC5AC (n=4 на группу). В бронхах, в которые были вставлены пробки,наблюдался сигнал для MUC5AC, который возрастал в зависимости от времени от 24 до 72 ч