Способ лечения болезни сердца, способ лечения недостаточности периферических сосудов и способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к генотерапии, в частности, к связанной с вирусами и к иным формам генотерапии, а также к определенным аденовирусным конструкциям, применяемым для доставки желаемых генов. Более конкретно изобретение касается доставки с помощью аденовирусов генов, применяемых для стимуляции ангиогенеза в сердце, а также способов лечения заболеваний периферических сосудов и заболеваний сердца, например ишемии миокарда, с помощью этих векторов. Настоящее изобретение было выполнено при государственной поддержке - ГрантыHL0281201 и HL1768218, полученные от Национальных Институтов Здоровья. Уровень техники Американская Ассоциация Сердца (Статистическое приложение 1995) представила данные о том, что 60 млн. взрослого населения Соединенных Штатов страдают сердечнососудистыми заболеваниями, в том числе 11 млн. имеют коронарную болезнь сердца. Сердечно-сосудистые заболевания обусловливают ежегодно почти миллион смертей в Соединенных Штатах, составляя более 40% от всех смертей. В 1995 г. 1,5 миллионам взрослых людей в Соединенных Штатах был поставлен диагноз стенокардии (грудной жабы), что выражается в периодической ишемии миокарда, приводящей к боли в грудной клетке. Каждый год в Соединенных Штатах появляется 350000 новых пациентов со стенокардией. Ишемия миокарда появляется, когда сердечная мышца не получает адекватного снабжения кровью, что лишает ее необходимого уровня снабжения кислородом и питательными веществами. Наиболее распространенной причиной ишемии миокарда является атеросклероз,который является причиной блокирования кровеносных сосудов (коронарных артерий), которые доставляют кровь к сердечной мышце. Известные способы лечения включают фармакологическую терапию, шунтирование коронарной артерии и подкожную реваскуляризацию такими способами, как, например, баллонная ангиопластика. Стандартная фармакологическая терапия основана на стратегиях, которые включают усиление кровоснабжения сердечной мышцы или снижение потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах. Повышение кровоснабжения миокарда достигается с помощью таких агентов, как блокаторы кальциевых каналов или нитроглицерин. Считается,что эти агенты увеличивают диаметр пораженных артерий, вызывая расслабление гладкой мускулатуры клеток артерий. Снижение потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах получают при использовании агентов, которые снижают гемодинамическую нагрузку на сердце, например артери 001616 2 альных вазодилататоров, или агентов, которые уменьшают сократительную реакцию сердца на данную гемодинамическую нагрузку, например антагонисты -адренергических рецепторов. Хирургическое лечение ишемической болезни сердца основано на шунтировании пораженных сегментов артерии с помощью стратегически расположенных обходных сосудистых шунтов(обычно трансплантатов подкожной вены ноги или внутренней артерии молочной железы). Подкожная реваскуляризация основана на применении катетеров с целью уменьшения сужения пораженных коронарных артерий. Все эти стратегии применяют для уменьшения количества или для устранения ишемических участков,но все они имеют различные ограничения. В предварительных публикациях описано развитие новых сосудов в сердце посредством прямой инъекции ангиогенных белков или пептидов для лечения ишемии миокарда. Некоторые члены семейства фактора роста фибробластов (FGF) (кислый фактор роста фибробластов,aFGF; основной фактор роста фибробластов,bFGF; фактор-5 роста фибробластов, FGF-5 и другие) участвуют в регуляции ангиогенеза в течение роста и развития. Роль белка aFGF в стимуляции ангиогенеза у взрослых животных,например, была предметом недавней публикации, где описано, что белок aFGF в матриксе с коллагеновой оболочкой был помещен в брюшинную полость взрослых крыс. Это привело к образованию хорошо васкуляризованной структуры с нормальным кровообращением (Thompson, et al., PNAS, 86, 7928-7932, 1989). Инъекция белка bFGF в коронарные артерии взрослых собак при коронарной окклюзии приводила к снижению дисфункции миокарда, снижению размеров инфарктов миокарда и повышению васкуляризации в области риска (YanagisavaMiva, et al., Science, 257, 1401-1403, 1992). Подобные результаты были получены на животных - моделях ишемии миокарда при использовании белка bFGF (Harada et al., J. Clin. Invest.,94, 623-630, 1994, Unger et al., Am. J. Physiol.,266, H1588-H1595, 1994). Условием для достижения ангиогенного эффекта с помощью этих белков, однако, была необходимость повторной или длительной доставки белка, что ограничивало возможность применения этих белков для стимуляции ангиогенеза в клинике. Другими словами, для успешной терапии человека потребовалось бы непрерывное и длительное вливание одного или более этих ангиогенных пептидов или белков, которые сами по себе являются дорогими средствами, а для их доставки были бы необходимы катетеры, помещенные в коронарные артерии, что еще более повышает стоимость и трудность лечения. Недавно в различных публикациях было показано использование переноса генов для лечения или профилактики заболеваний, в томCardiovascular Disease"' Circulation, 88,19371942, 1993. В другой публикации, Leiden et al.,Международная заявкаPCT/US 93/11133 под названием "Перенос генов с помощью аденовирусов в гладкую мускулатуру сердца и сосудов" описано применение переноса генов с помощью аденовирусов с целью регуляции функций в клетках сердечно-сосудистой гладкой мускулатуры. Leiden et al. устанавливают, что рекомбинантный аденовирус, несущий последовательность ДНК, которая кодирует продукт гена, может быть доставлена в клетку гладкой мускулатуры сердца или сосудов и что клетка поддерживается, пока экспрессируется продукт гена. Согласно Leiden et al., функция мышечных клеток регулируется изменением транскрипции генов и изменениями в образовании продукта транскрипции гена, например полинуклеотида или полипептида. Полинуклеотид или полипептид, как пишут Leiden et al., взаимодействуют с клеткой сердца или гладкой мускулатуры и регулируют функцию этой клетки. Leiden et al. показывают, что эта регуляция может быть осуществлена в клетке in vitro, in situ или invivo. Leiden et al. описывают способ переноса генов, предусматривающий получение аденовирусной конструкции, содержащей продукт гена,при котрансфекции аденовируса типа 5 с инсерцией продукта гена и дефектом репликации (с промотором цитомегаловируса (ЦМВ в клетки 293 вместе с плазмидой, несущей полный аденовирусный геном, например плазмидой JM17; размножение полученной аденовирусной конструкции в клетках 293 и доставку аденовирусной конструкции в клетки сердечной мышцы или гладкой мускулатуры сосудов при прямой инъекции вектора в клетки. Для успешного переноса генов в сердце с помощью аденовирусных векторов существуют препятствия, например, инсерция трансгенной конструкции в популяцию быстро делящихся клеток приведет к значительному уменьшению периода экспрессии гена. Примеры таких клеток включают эндотелиальные клетки, которые образуют внутренний слой всех кровеносных сосудов, и фибробласты, которые имеются во всех тканях сердца. Получение направленности трансгена, чтобы только целевые клетки получали и экспрессировали его и он не распространялся системно, также подвергается критически важным возражениям. Если это не выполнятся,появляется системная экспрессия трансгенной конструкции и связанные с этим проблемы. На 001616 4 пример, после переноса генов с помощью аденовирусов в печени были зафиксированы воспалительные инфильтраты (Yang et al., Proc. Natl.Acad. Sci. (U.S.A.), 91, 4407, 1994), Наконец, в связи с переносом гена FGF-5 с помощью аденовируса для стимуляции in vivo ангиогенеза мы обнаружили, что инъецированный вирусный материал может индуцировать серьезные угрожающие жизни сердечные аритмии. Данная заявка является частичным продолжением заявки США 08/485472 от 7 июня 1995 г., которая является частичным продолжением заявки США 08/396207 от 28 февраля 1995 г. На основании этих заявок испрашивается конвенционный приоритет заявки. Описанное и заявленное здесь изобретение обращено и преодолевает эти и иные проблемы,связанные с известными способами. Сущность изобретения Настоящее изобретение касается генотерапевтического подхода, применяемого при лечении болезней сердца, в частности ишемии миокарда, и болезней периферических сосудов. Одним из объектов изобретения является способ лечения болезни сердца, в котором ангиогенный белок или пептид, предпочтительно FGF-5, продуцируется на терапевтически значимом уровне в миокарде непрерывно в течение длительных периодов времени посредством направленности на сердце с помощью векторной конструкции,несущей ген указанного ангиогенного белка или пептида, предпочтительно аденовирусной конструкции с дефектом репликации, доставляемой интракоронарной инъекцией, предпочтительно через катетер, введенный значительно ниже (в норме не менее чем на 1 см) входа одной или обеих коронарных артерий или одной или более бедренных вен или трансплантатов внутренней артерии молочной железы. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения болезни сердца путем стимуляции развития коронарных коллатеральных сосудов у пациента с ишемией миокарда,который предусматривает доставку аденовирусного вектора с инсерцией трансгена и дефектного по репликации в миокард пациента при интракоронарной инъекции, предпочтительно однократной инъекции вектора, непосредственно в одну или обе коронарные артерии (или трансплантаты) с целью трансфекции миоцитов сердца в пораженном миокарде. Указанный вектор содержит трансгенную конструкцию, кодирующую ангиогенный белок или пептид, например,FGF-5, aFGF, bFGF или VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), и экспрессирует трансгенную конструкцию в сердце, стимулируя таким образом ангиогенез в пораженном участке миокарда. При инъекции векторной биомассы,не содержащей вирус дикого типа, глубоко в полость одной или обеих коронарных артерий(или трансплантатов), предпочтительно в обе правые или левые коронарные артерии (или 5 трансплантаты) и предпочтительно в количестве 107-1013 вирусных частиц, определенном оптической денситометрией (более предпочтительно 109-1011 вирусных частиц), возможна локальная трансфекция желаемого числа клеток, особенно миоцитов сердца в пораженном миокарде, генами, кодирующими ангиогенный белок или пептид. Это обеспечивает максимум терапевтической эффективности переноса гена при минимуме нежелательного ангиогенеза во внесердечной области и минимальной возможности воспалительной реакции на вирусные белки. Использование промотора, специфичного для вентрикулярных миоцитов, например промотора, который более избирательно осуществляет экспрессию, ограниченную миоцитами сердца,позволяет избежать потенциально вредных эффектов ангиогенеза в несердечных тканях, таких как сетчатка. С другой стороны, настоящее изобретение представляет инъекционный препарат фильтрованного аденовирусного вектора, который содержит рекомбинантные вирусные частицы с конечным вирусным титром 107-1013 вирусных частиц. Этот вектор не содержит вирус дикого типа, но содержит частичную последовательность аденовируса, из которой удалены один или более необходимых аденовирусных генов,несущих репликационную компетентность, например, гены Е 1 А/Е 1 В, и трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, например ангиогенные aFGF, bFGF и VEGF, направляемые промотором, фланкированным частичной аденовирусной последовательностью, а также фармацевтически приемлемый носитель. При использовании этого аденовирусного векторного препарата для инъекций возможно проведение эффективного переноса гена FGF-5 с помощью аденовируса с целью лечения клинической ишемии миокарда или недостаточности периферических сосудов без нежелательных эффектов. Следующим аспектом настоящего изобретения является способ получения штамма вируса, содержащего рекомбинантный вектор, способный экспрессировать ангиогенный белок или пептид in vivo в миокарде. Способ предусматривает стадии клонирования трансгена, предпочтительно кодирующего ангиогенный белок или пептид, такие как FGF-5, aFGF, bFGF иVEGF, в плазмиду, содержащую промотор и полилинкер, фланкированные частичными аденовирусными последовательностями левого конца генома аденовируса 5 человека, из которой удалены один или более генов аденовируса,несущих репликационную компетентность, например, гены Е 1 А/Е 1 В, и котрансфекции указанной плазмиды в клетки млекопитающих,трансформированные утраченными необходимыми для репликации генами, плазмидой, которая содержит полный геном аденовируса 5 человека и дополнительную инсерцию, делающую плазмиду слишком большой для инкапсидации. 6 При этом между трансгеном, введенным с помощью плазмиды, и плазмидой, имеющей полный геном аденовируса, происходит "спасающая" рекомбинация с образованием рекомбинантного генома, содержащего трансгенную конструкцию без необходимых для репликации генов. Этот рекомбинантный геном достаточно мал для инкапсидации. Затем проводят идентификацию успешных рекомбинантов в культурах клеток, размножение полученных рекомбинантов в клетках млекопитающих, трансформированных отсутствующими требующимися для репликации генами; очистку размножившихся рекомбинантов, как содержащих рекомбинантный вектор и не содержащих вирус дикого типа,и пропускание очищенного вектора через фильтр, предпочтительно фильтр 0,1 - 0,5 мкм,более предпочтительно фильтр 0,3 мкм. Согласно еще одному аспекту, рекомбинантный вирус, экспрессирующий ангиогенный пептид или белок, доставляется катетером в проксимальный участок бедренной артерии или артерий, таким образом осуществляя перенос гена в клетки скелетной мускулатуры с кровью,идущей от бедренных артерий. Это дает ангиогенный стимул, который выражается в ангиогенезе в скелетной мускулатуре ног и служит для лечения недостаточности периферических сосудов, болезни, которая характеризуется недостаточным кровоснабжением мускулатуры ног. Еще одним аспектом изобретения, дополнительно к лечению сердца и ног, является доставка трансгена с помощью аденовирусов и направленная экспрессия в других органах или тканях, что приводит к направленному на определенный участок переносу гена в желаемые органы или ткани. Таким образом изобретение предусматривает перенос генов с помощью аденовируса, направленный к любым ткани или органу, которые снабжаются кровью определенной артерией. Например, при доставке содержащего трансген аденовируса посредством глубокой инъекции (например, около 1 см) в полость желаемой артерии, например, в одну или более почечных артерий, питающих почки,или печеночной артерии, идущей в печень, может быть осуществлен перенос гена, ограниченный этими органами. Такой подход может быть использован во многих случаях применения,включая ангиогенез, лечение орган- или тканеспецифичных опухолей, лечение наследственных болезней обмена веществ и т.п. Глубина инъекции может изменяться в зависимости от целевого органа(ов) или тканей, анатомического строения артерий пациента и иных известных факторов. Предпочтителен выбор глубины и локализации инъекции, обеспечивающий локализованную, а не системную доставку рекомбинантного аденовируса. Опытный исследователь может определить эту глубину без проведения эксперимента.WTh) в области ишемии при стимуляции правой артерии (HR=200 ударов пульса в минуту), рассчитанное по измерению толщины стенки в конце диастолы (EDWTh) и толщины стенки в конце систолы (ESWTh) перед и через 141 день после переноса гена lacZ (контрольный ген) и FGF-5. Функционирование ишемического участка повышается в 2,6 раза после переносаFGF-5 (р=0,0001), но не изменяется контрольным геном; фиг. 3 - коэффициент пика контраста (коррелирует со скоростью кровотока), выраженный как уровень пика видеоинтенсивности в области ишемии (ложе LCx), деленный на пик видеоинтенсивности в интравентрикулярной перегородке (IVS),определенные по видеоизображениям с помощью компьютерной программы видеоанализа во время артериальной стимуляции (пульс 200 ударов в минуту) перед и через 141 день после переноса гена, lacZ (контрольный ген) и FGF-5. Ток крови через ишемический участок повышался в 2 раза относительно нормы после переноса гена FGF-5(р=0,0018), но сохранялся в объеме 50% от нормы после переноса контрольного гена; фиг. 4 - диаграммы, соответствующие контрастным эхокардиограммам миокарда (не приведены). Белые участки означают контрастное усиление (увеличенный кровоток), а темные участки означают пониженный кровоток. На фиг. 4 а показана острая окклюзия LCx у нормальных свиней, на фиг. 4 б показаны результаты, полученные через 141 день после переноса гена lacZ, а на фиг. 4 в показаны результаты,полученные через 141 день после переноса гена FGF-5; фиг. 5 - соотношение числа капилляров к числу волокон, определенное микроскопическим анализом в ишемических и неишемических областях после переноса гена FGF-5 и lacZ. После переноса гена FGF-5 отмечен повышенный ангиогенез (р 0,038); фиг. 6 - в графической форме регионарную сократительную функцию у леченых животных; фиг. 7 - в графической форме регионарный кровоток в миокарде леченых животных; фиг. 8 - в графической форме оценку числа сосудов у леченых животных. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Трансгены, кодирующие ангиогенные белки и пептиды. В настоящем изобретении могут быть использованы различные белковые или пептидные факторы роста, способные улучшать кровоток в миокарде к ишемическим участкам сердца (или скелетной мускулатуры в случае болезней периферических сосудов). В качестве экспресси 001616 8 руемых ангиогенных белка или пептида могут быть приведены примеры ангиогенных белков или пептидов aFGF, bFGF и FGF-5. Ангиогенная активность семейства FGF достоверно установлена в ряде белковых вливаний (YanagisawaMiva et al., Science, 257, 1401-1403, 1992, Haradaal., Am. J. Physiol., 266, H1588-H1595, 1994). Возможно применение гена VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия), сильного стимулятора роста новых сосудов. Успешный подход к переносу генов требует как синтеза продукта гена, так и его секреции из трансфицированных клеток. С этой точки зрения, предпочтителен ген, кодирующий FGF-5, который предпочтительно отселектирован с введением последовательности, кодирующей сигнальный пептид, что обусловливает накопление экспрессированного продукта гена в интерстициальной ткани сердца(или скелетной мускулатуры) с индукцией ангиогенеза. Система хелпер-независимого аденовируса 5 человека, дефектного по репликации. В общем случае желаемый ген переносят в сердце (или скелетную мышцу), в том числе миоциты сердца (или скелетные миоциты) invivo и направляют конститутивную продукцию кодируемого белка. Осуществимы несколько различных подходов к переносу гена. Предпочтительной является система хелпернезависимого аденовируса 5 человека, дефектного по репликации. При использовании этой системы мы продемонстрировали трансфекцию более 60% клеток миокарда in vivo при однократной внутрикоронарной инъекции (Giordanoand Hammond, Clin. Res., 42. 123A, 1994). Нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные векторы используют, в частности, для трансфицирования коронарного эндотелия и миоцитов сердца, что обеспечивает высоко эффективную трансфекцию после интракоронарной инъекции. Этот эффект распространяется на трансфекцию желаемых клеток системы периферических сосудов. Рекомбинантные аденовирусные векторы на основе аденовируса 5 человека (Virology,163, 614-617, 1988) утрачивают основные ранние гены из генома аденовируса (обыкновенно Е 1 А/Е 1 В), вледствие чего они не способны к репликации до культивирования в линиях пермиссивных клеток, обеспечивающих продукты утраченных генов in trans. Желаемая трансгенная конструкция может быть клонирована вместо утраченных аденовирусных геномных последовательностей и экспрессирована в ткани/клетках, инфицированных аденовирусом,дефектным по репликации. Хотя перенос генов с помощью аденовируса не приводит к интеграции трансгенной конструкции в геном хозяина(менее 0,1% трансфекций с помощью аденовируса приводят к инкорпорации трансгена в ДНК хозяина) и поэтому не является стабильным, 9 аденовирусные векторы могут размножаться с высоким титром и трансфицировать нереплицирующиеся клетки. Хотя трансгенная конструкция не проходит в дочерние клетки, она приемлема для переноса гена в миоциты зрелых скелетных мышц и сердца, которые не делятся. Ретровирусные векторы обеспечивают стабильный перенос гена, и в настоящее время получают высокие титры при ретровирусном псевдотипировании (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci(USA), 90, 8033-8037, 1993), но ретровирусные векторы не способны эффективно трансдуцировать нереплицирующиеся клетки (миоциты зрелых скелетных мышц и сердца). В дополнение отметим, что потенциальная опасность инкорпорации трансгенной конструкции в ДНК хозяина не оправдывается, если достаточен перенос гена на короткое время. В действительности мы открыли, что ограниченная временем экспрессия ангиогенного белка является достаточной для существенного ангиогенеза, а временный перенос гена при сердечно-сосудистых заболеваниях и недостаточности периферических сосудов терапевтически адекватен. Клетки человека 293, которые являются эмбриональными клетками почек человека,трансформированными генами аденовируса Е 1 А/Е 1 В, представляют применяемые линии пермиссивных клеток. Однако могут быть использованы другие линии клеток, которые обеспечивают размножение в них аденовирусных векторов, дефектных по репликации, в том числе клетки HeLa. Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов. Все аденовирусные векторы, использованные в настоящем изобретении могут быть сконструированы способом "спасающей" рекомбинации, описанной Graham, Virology, 163, 614617, 1988. Коротко говоря, желаемую трансгенную конструкцию клонируют в челночный вектор, который содержит промотор, полилинкер и частичные фланкирующие аденовирусные последовательности, из которых удалены гены Е 1 А/Е 1 В. Примером челночного вектора может быть плазмида рАС 1 (Virology, 163, 614-617,1988) (или ее аналог), которая кодирует части левого конца генома аденовируса 5 человека(Virology, 163, 614-617, 1988) за исключением последовательностей Е 1 А и Е 1 В, кодирующих ранний белок и важных для репликации вируса,а также плазмида ACCMVPLPA (J. biol. Chem.,267, 25129-25134, 1992), которая содержит полилинкер, промотор ЦМВ (цитомегаловируса) и сигнал полиаденилирования SV40, фланкированный частичными аденовирусными последовательностями, из которых удалены гены Е 1 А/Е 1 В. Применение плазмид рАС 1 или АССМVРLPА облегчает процесс клонирования. Затем челночным вектором котрансфицируют вместе с плазмидой, содержащей полный геном аденовируса 5 человека со слишком большой 10 для инкапсидации длиной, клетки 293. Котрансфекцию проводят осаждением фосфатам кальция или липофекцией (Biotechniques,15, 868-872, 1993). Плазмида JM17 кодирует полный геном аденовируса 5 человека и части вектора pBR322, включая ген устойчивости кампициллину (4,3 кб). Хотя JM17 кодирует все аденовирусные белки, необходимые для создания зрелых вирусных частиц, она слишком велика для инкапсидации (40 кб против 36 кб дикого типа). В маленьком субсете котрансфицированных клеток "спасающая" рекомбинация между содержащим трансгенную конструкцию челночным вектором, таким как плазмида рАС 1,и плазмидой, имеющей полный геном аденовируса 5, например плазмидой pJM17, приводит к образованию генома без последовательностей Е 1 А/Е 1 В, который содержит желаемую трансгенную конструкцию, но вторично утратил дополнительную последовательность, такую как последовательности pBR322, во время рекомбинации, и поэтому имеет достаточно маленький размер для инкапсидации (см. фиг. 1). Относительно описанного выше способа мы опубликовали удачные результаты (Giordano et al., Circulation, 88, 1-139, 1993 и Giordano and Hammond,Clin. Res., 42, 123A, 1994). Аденовирус, кодирующий бета-галактозидазу, направляемую ЦМВ, HCMVSP1lacZ (Clin. Res., 42, 123A, 1994) может быть использован для оценки эффективности переноса гена с помощью обработки Xgal. В исходном способе переноса генов используют аденовирусные векторы, как описано выше. Преимущества этих векторов заключаются в способности обеспечивать высокую эффективность переноса гена (более 60% клеток целевых органов, трансфицированных in vivo), простоте получения высокого титра вирусных штаммов и способности этих векторов осуществлять перенос генов внутрь клеток, таких как миоциты сердца, которые не делятся. Тканеспецифичные промоторы. Настоящее изобретение касается также применения клеточной направленности не только для доставки трансгенной конструкции в коронарную артерию или бедренную артерию,например, но и применения тканеспецифичных промоторов. При слиянии, например, тканеспецифичных последовательностей контроля транскрипции левой легкой цепи-2 вентрикулярного миозина (MLC2v) или тяжелой цепи миозина (МНС) с трансгеном, таким как генFGF-5, в аденовирусной конструкции, экспрессия трансгена ограничивается вентрикулярными сердечными миоцитами. Эффективность генной экспрессии и степень специфичности, обусловленная промоторами MLC2v и МНС с lacZ была установлена с использованием рекомбинантной аденовирусной системы настоящего изобретения. Кардиоспецифичная экспрессия была ранее описана Lee et al. (J. Biol. Chem., 267, 15875 11 15885, 1992). Промотор MLC2v содержит 250 пар оснований и легко располагается внутри упаковывающих конструкций аденовируса-5. Промотор тяжелой цепи миозина, известный как сильный промотор транскрипции, является приемлемым альтернативным кардиоспецифичным промотором и состоит из менее 300 пар оснований. Другие промоторы, такие как промотор тропонина-С, несмотря на высокую эффективность и достаточно маленький размер не обеспечивают адекватную тканевую специфичность. Считается, что при использовании промоторовMLC2v или МНС и доставке трансгенной конструкции in vivo только миоциты сердца (без сопутствующей экспрессии в эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры и фибробластах, находящихся в сердце) обеспечивают адекватную экспрессию ангиогенного белка,например FGF-5, для стимуляции ангиогенеза. Ограничение экспрессии миоцитами сердца имеет также преимущество, касающееся применения переноса гена для лечения клинической ишемии сердца. При ограничении экспрессии областью сердца удается избежать потенциально вредного эффекта ангиогенеза в несердечных тканях, например в сетчатке. При этом добавим,что из всех клеток сердца миоциты более вероятно обеспечивают наиболее длительную экспрессию трансгена. Поскольку в этих клетках не происходит быстрой замены, экспрессия не снижалась бы при делении и гибели клеток, как это было бы в случае эндотелиальных клеток. Для этой цели имеются также специфичные к эндотелию промоторы (Lee et al. J. Biol. Chem.,265, 10446-10450,1990). В настоящем изобретении касательно лечения болезни сердца направленность на сердце с помощью интракоронарной инъекции с высоким титром вектора и трансфекция всех типов клеток в данное время предпочтительна. Размножение и очистка аденовирусных векторов. Удачные рекомбинантные векторы могут быть выделены из бляшек (вирусных колоний) стандартными способами. Полученные вирусные векторы размножают на клетках 293, которые обеспечивают функции Е 1 А и Е 1 В in trans,до предпочтительного уровня титра 1010-1012 вирусных частиц/мл. Клетки могут быть инфицированы при слиянии 80% и собраны через 48 ч. После 3 циклов замораживания-оттаивания клеточный дебрис осаждают центрифугированием, а вирус очищают ультрацентрифугированием в градиенте CsCl (предпочтительно двойное ультрацентрифугирование в градиентеCsCl). Перед инъекцией in vivo вирусную биомассу обессоливают гель-фильтрацией с использованием колонок с сефарозой, например,Sephadex G25. Затем продукт фильтруют через фильтр 0,3 мк, снижая таким образом вредные эффекты интракоронарной инъекции нефильтрованного вируса (угрожающие жизни сердеч 001616 12 ные аритмии) и стимулируя эффективный перенос гена. Полученный вирусный штамм имеет конечный титр вируса в пределах 1010-1012 вирусных частиц/мл. Рекомбинантный аденовирус должен быть высокоочищенным и не содержать вирус дикого типа (потенциально реплицирующийся). Неочищенные конструкции могут вызывать сильную иммунную реакцию у животных-хозяев. С этой точки зрения размножение и очистку следует проводить для исключения загрязнения вирусом дикого типа, например,идентификацией успешных рекомбинантов с помощью ПЦР с использованием подходящих праймеров, проведением двух циклов выделения из бляшек и двойным ультрацентрифугированием в градиенте CsCl. Дополнительно мы обнаружили, что проблемы, связанные с сердечными аритмиями, индуцируемыми у пациентов инъекцией аденовирусного вектора могут быть преодолены фильтрацией рекомбинантного аденовируса через фильтр подходящего размера перед интракоронарной инъекцией. Эта стратегия, очевидно, также значительно улучшает перенос и экспрессию гена. Доставка рекомбинантных аденовирусных векторов. Вирусный штамм может быть в форме инъекционного препарата, который содержит фармацевтически приемлемый носитель, например солевой раствор, при необходимости. Конечный титр вектора в инъекционном препарате предпочтительно составляет 107-1013 вирусных частиц, что обеспечивает эффективный перенос гена. Другие фармацевтические носители, препараты и дозы описаны ниже. Аденовирусные трансгенные конструкции доставляются в миокард прямой интракоронарной (или внутрь сосудистого трансплантата) инъекцией на основе способов с использованием стандартного подкожного катетера под флуороскопическим контролем в количестве, достаточном для экспрессии трансгена на уровне, обеспечивающем высоко эффективную терапию. Инъекцию следует проводить глубоко в полость (около 1 см в полость артерии) коронарных артерий (или сосудистого трансплантата), предпочтительно в обе коронарные артерии, поскольку рост коллатеральных кровеносных сосудов значительно различается у отдельных пациентов. При инъекции материала прямо в полость коронарной артерии с помощью коронарных катетеров возможно направить ген очень эффективно и снизить до минимума потерю рекомбинантных векторов в проксимальной части аорты при инъекции. Мы обнаружили, что экспрессия гена, доставленного таким образом, не происходит в гепатоцитах, а вирусная РНК не обнаруживается в моче в любое время после интракоронарной инъекции. В настоящем изобретении может быть использован любой вариант коронарного катетера или перфузионный катетер Стака. Дополнительно могут быть использованы другие 13 известные способы переноса генов к артериальной стенке. Для лечения болезни периферических сосудов, характеризующейся недостаточным кровоснабжением ног, рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий ангиогенный пептид или белок доставляется посредством катетера, который вводят в проксимальный участок бедренной артерии или артерий, что приводит к переносу гена в клетки скелетных мышц, получающих кровь из бедренных артерий. Это создает ангиогенный стимул, выражающийся в ангиогенезе в скелетных мышцах ног. Для лечения других органо- или тканеспецифичных заболеваний рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий терапевтический пептидили белок, например ангиогенный пептид или белок, доставляют с помощью катетера или подобного устройства, который вводят достаточно глубоко в проксимальный участок питающей орган или ткань артерии или артерий. При этом происходит перенос гена только в клетки целевого органа или ткани. Модельное животное для ишемии миокарда. Важными требованиями для успешных исследований в области генотерапии являются создание модельного животного, которое может быть использовано для клинической ишемии миокарда и которое может обеспечить получение полезных результатов относительно механизмов ангиогененза при ишемии миокарда, и точная оценка эффектов переноса генов. С этой точки зрения, ни одно из предыдущих исследований не является удовлетворительным. Мы использовали свиней в качестве модели ишемии миокарда, которая имитирует клиническое заболевание коронарной артерии. Помещение амероидного (кругового) зажима вокруг левой огибающей (LCx) коронарной артерии приводит к постепенному полному закрытию (в течение 7 дней после зажатия) с минимальным появлением инфаркта (1% левого желудочка, 4-1% ложаInvest., 92, 2644, 1993). Функция миокарда и кровоток в остальном являются нормальными на участке, ранее снабжавшемся кровью зажатой артерией (который называют ишемический участок), благодаря развитию коллатеральных сосудов, но обратный кровоток недостаточен для предотвращения ишемии, когда требуется повышение уровня кислорода в миокарде. Таким образом, ложе LCx является участком возникновения эпизодической ишемии, аналогичной клинической грудной жабе (стенокардии). Развитие коллатеральных сосудов и связи кровоток-функция стабильны в течение 21 дня после наложения зажима и сохраняются неизменными в течение четырех месяцев (Roth et al.,Circulation, 82, 1778, 1990; Roth et al., Am. J.Physiol., 235, H1279, 1987; White et al., Circ. Res.,71, 1490, 1992). С помощью телеметрии было документировано, что животные имеют периодическую дисфункцию в области риска в течение дня, связанную с внезапными усилениями сердечной частоты во время кормления, вмешательств персонала и т.д. (неопубликованные данные). Таким образом, модель имеет область со стабильными, но неадекватными коллатеральными сосудами и является объектом, подвергающимся периодической ишемии. Другим ощутимым преимуществом модели является то,что она имеет нормально снабжающийся кровью и функционирующий участок (ложе LAD),прилежащий к аномально снабжающемуся кровью и функционирующему участку (ложе LCx),что обеспечивает контрольный участок у каждого животного. Контрастную эхокардиографию миокарда применяли для оценки регионарного кровоснабжения миокарда. Контрастный материал состоит из микроаггрегатов галактозы и повышает эхогенность (белизну) изображения. Микроаггрегаты распределяются внутри коронарных артерий и стенок миокарда пропорционально уровню кровотока (Skyba et al., Circulation,90, 1513-1521, 1994). Было показано, что пик интенсивности контраста тесно коррелирует с кровотоком в миокарде, что было измерено с помощью микросфер (Skyba et al., Circulation,90, 1513-1521, 1994). Для документирования того, что эхографические изображения, применяемые в настоящем изобретении, точно идентифицировали ложе LCx и что контрастная эхокардиогарфия миокарда могла быть использована для оценки кровотока миокарда гидравлический манжеточный блокатор помещали вокруг проксимального участка LCx, прилежащего к амероиду. В настоящем исследовании после умерщвления животных их сердца были перфузионно фиксированы (глутаральдегид, физиологическое давление, in situ) для того, чтобы количественно оценить рост капилляров с помощью микроскопии. ПЦР использовали для детекции ДНК и мРНК ангиогенного белка в миокарде животных, которым проводили перенос гена. Дополнительно, как описано ниже, через две недели после переноса гена образцы миокарда, полученные из всех пяти инфицированных lacZ животных показывали значительную активность галактозидазы при гистологическом исследовании. Наконец, при использовании поликлональных антител к ангиогенному белку была продемонстрирована экспрессия ангиогенного белка в клетках и миокарде животных, которым проводили перенос гена. Стратегия терапевтических исследований включала определение времени доставки трансгена, способ введения трансгена и выбор ангиогенного гена. В амероидной модели ишемии миокарда перенос гена проводили после ста 15 бильного, но несущественного развития коллатеральных сосудов. Предварительные исследования с использованием амероидной модели включали доставку ангиогенных пептидов во время закрывания амероида до развития ишемии и коллатеральных сосудов. Однако эта стратегия не была применена по ряду причин. Во-первых, предыдущие исследования не подходят для близкого повторения условий, которые были бы при лечении клинической ишемии миокарда, при которых перенос гена проводился бы при симптомах ишемии миокарда; предыдущие исследования аналогичны введению пептида перед приступом ишемии и поэтому менее соответствуют действительности. Во-вторых, на основе предварительных исследований в культуре клеток предполагалось, что ишемический стимул вместе с пептидом были бы оптимальным сочетанием для стимуляции ангиогенеза. Это могло бы быть оптимально получено доставкой трансгена в то время, когда ишемия уже развилась. В связи с этими заключениями был проведен выбор способа доставки трансгена. То ограничение, что способ должен быть применим для последующего лечения пациентов с болезнью сердца, обусловило непригодность некоторых подходов (непрерывное вливание пептида в коронарную артерию, прямое введение плазмиды в сердце, создание вокруг сердца оболочки из смолы, содержащей пептид, для получения длительного медленного выхода). В конечном счете свиньи как модель обеспечили прекрасное средство для изучения кровотока и функции крови до и после доставки гена. Использование контрольных животных, которые получали ту же самую рекомбинантную аденовирусную конструкцию, содержащую репортерный ген, обеспечило контроль для этих исследований. Опытные исследователи поймут, что результаты,описанные ниже для свиней, являются прогностическими для человека. Свинья имеет нативную коронарную систему кровообращения очень похожую на таковую человека, включая отсутствие нативных коронарных коллатеральных сосудов. Терапевтическое применение. Векторы на основе рекомбинантного аденовируса с дефектом репликации настоящего изобретения позволяют осуществить высокоэффективный перенос гена in vivo без цитопатического эффекта или воспаления в областях экспрессии гена. Из этих результатов, описанных далее в примерах, видно, что достигнута достаточно высокая степень переноса гена in vivo,которая вызывает функциональные измененияin vivo. В случае лечения болезни сердца перенос гена ангиогенного белка интракоронарной инъекцией будет стимулировать ангиогенез. Таким образом, лечение ишемии может быть осуществлено после того, как отмечены начальные приступы ишемии. В дополнение после переноса 16 гена число капилляров, кровоток и функция возрастают в области ишемии. Применение этих способов в клинике может принести большую пользу, особенно для пациентов с неоперабельной болезнью коронарной артерии и обессиленных стенокардией. Результаты настоящего изобретения демонстрируют, что перенос гена экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом фактора-5 роста фибробластов (FGF-5) эффективен для значительного снижения ишемии миокарда. Композиции или продукты изобретения могут быть легко получены в форме препаратов,пригодных для интракоронарного введения. Подходящий объем введения наилучшим образом может быть определен лечащим врачом индивидуально для каждого пациента. Подходящие фармацевтические носители и их состав описаны в справочниках препаратов, например,Remington's Pharmaceutical Sciences E.W.Martin,см. также Wang Y.J. and Hanson M.A. "Parental(1988). Векторы настоящего изобретения предпочтительно должны находиться в растворе с нейтральным рН, например, с рН около 6,5-8,5,более предпочтительно рН около 7-8, с наполнителем, обеспечивающим приблизительную изотоничность раствора, например, 4,5% маннита или 0,99% хлорида натрия, рН поддерживают известными буферными растворами, например фосфатом натрия, которые в основном считаются безопасными, вместе с приемлемым консервантом, например 0,1-0,75% метакрезолом, более предпочтительно 0,15-0,4%. Желаемая изотоничность может быть получена с использованием хлорида натрия или других фармацевтически приемлемых агентов, таких как декстроза,борная кислота, тартрат натрия, полиэтиленгликоль, полиолы (такие как маннит и сорбит) или иные неорганические или органические растворы. Хлорид натрия предпочтителен, особенно для буферов, содержащих ионы натрия. При желании растворы описанных выше композиций могут быть также приготовлены с целью увеличения срока хранения и стабильности. Терапевтически применяемые композиции изобретения готовят смешиванием ингредиентов с последующими в основном принятыми процедурами. Например, определенные компоненты могут быть смешаны с образованием концентрированной смеси, которую затем разводят до конечной концентрации и вязкости добавлением воды и/или буфера для контроля рН или дополнительным растворенным веществом для контроля тонуса. Для медицинского применения композиции должны быть приготовлены в дозированной форме, содержащей количество вектора изобретения, которое будет эффективным в одной или множестве доз для индукции ангиогенеза на 17 определенном уровне. Как известно исследователям, эффективное количество терапевтического агента будет различным в зависимости от многих факторов, включая возраст и массу пациента, физиологическое состояние пациента и уровень ангиогенеза, который должен быть получен, а также другие факторы. Эффективная доза соединений изобретения будет в типичном случае составлять не менее 107 вирусных частиц, предпочтительно 109 вирусных частиц и более предпочтительно около 1011 вирусных частиц. Число вирусных частиц может, но предпочтительно не должно превышать 1013. Как отмечено, точная доза для введения определяется лечащим врачом, но предпочтительно находится в 1 мл солевого раствора в фосфатном буфере. Предпочтительным в настоящее время способом введения в случае болезни сердца является интракоронарная инъекция в одну или обе коронарные артерии (или один или более трансплантатов подкожных вен или внутренних артерий молочной железы) с помощью подходящего коронарного катетера. Предпочтительным в настоящее время способом введения в случае болезни периферических сосудов является инъекция в проксимальный участок бедренной артерии или артерий с помощью подходящего артериального катетера. Предпочтительным в настоящее время способом введения в случае других целевых органов или тканей является также использование подходящего артериального катетера. Направленная экспрессия гена. Неожиданным открытием настоящего изобретения является то, что рекомбинантный аденовирус более эффективно поглощался в первом сосудистом ложе, чем он вытеснялся. Действительно, у модельного животного примера 4 эффективность поглощения вируса в сердце после интракоронарной инъекции была 98%. Это означает, что 98% вируса было удалено при первом прохождении вируса через сосудистое ложе миокарда. Более того, в сыворотке, взятой у животных во время инъекции, не вырастали вирусные колонии (Graham, Virology, 163, 614-617,1988) в разведениях до 200 раз, что указывает на наличие сывороточного фактора (или связывающего белка), который ингибирует размножение вируса. Эти два фактора (эффективное связывание вируса при первом прохождении и вероятность наличия сывороточного связывающего белка) могут совместно действовать, ограничивая экспрессию вируса первым сосудистым ложем, с которым сталкивается вирус. Для дальнейшей оценки степени, до которой перенос гена ограничивается сердцем после интракоронарного переноса гена была использована полимеразно-цепная реакция (ПЦР) для того, чтобы посмотреть, имеется ли доказательство присутствия вне сердца вирусной ДНК через две недели после переноса гена у двух лече 001616 18 ных животных (пример 4, см. ниже). У животных было показано присутствие вирусной ДНК в сердцах, но не в сетчатке, скелетных мышцах или печени. Чувствительность ПЦР такова, что одна последовательность ДНК/5000000 клеток была бы определена. Вследствие этого результаты показывают, что никакой вирусной ДНК нет в тканях вне сердца через две недели после доставки гена. Это открытие является чрезвычайно важным, поскольку оно согласуется с концепцией направленности трансгенной конструкции, обеспечивающей экспрессию в сердце, но нигде более. Это делает изобретение безопасным, что повышает его применимость при лечении пациентов, потому что оно имеет преимущество, заключающееся в неожиданном биологическом свойстве аденовируса, разрешая направленный на определенный участок перенос гена. Эти замечания важны, потому что,насколько заявителям известно, они не были ранее описаны и дают способу преимущество безопасности, которое не очевидно опытным исследователям. Это неожиданное открытие могло бы быть распространено на другие сосудистые ложа, таким образом обеспечивая доставку трансгенных конструкций относительно избирательным образом в определенные органы или ткани, снабжаемые специфичными артериями. Для помощи в понимании настоящего изобретения приведены следующие примеры, в которых описаны результаты серий экспериментов. Эксперименты, касающиеся изобретения, не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение, и такие варианты изобретения, которые известны в настоящее время или которые будут разработаны позднее и будут входить в сферу знаний опытного исследователя, рассматриваются, как входящие в изобретение, описанное здесь и представленное в заявленных пунктах формулы изобретения далее. Пример 1. Аденовирусные конструкции. Была использована система хелпернезависимого аденовируса 5 человека, дефектного по репликации. Целевыми генами былиlacZ и FGF-5. Полная кДНК FGF-5 человека была выделена из плазмиды pLTR122E (Zhen etECOR1, 1 кб, который содержит 981 пару оснований открытой рамки считывания гена, и клонирована в полилинкер плазмидыACCMVPLPA, которая содержит промотор ЦМВ и сигнал полиаденилирования SV40,фланкированный частичными аденовирусными последовательностями, из которых удалены гены Е 1 А и Е 1 В (важные для репликации вируса). Эта плазмида была котрансфицирована (липофекция) в клетки 293 с плазмидой JM17, которая содержала полный геном аденовируса 5 человека с дополнительной инсерцией 4,3 кб, делающей плазмиду pJM17 слишком большой для 19 инкапсидации. При гомологичной "спасающей" рекомбинации были получены аденовирусные векторы, содержащие трансген при отсутствии последовательностей Е 1 А/Е 1 В. Хотя эти рекомбинанты не были способны к репликации в клетках млекопитающих, они могли размножаться в клетках 293, которые были трансформированы Е 1 А/Е 1 В и получали продукты основных генов in trans. Мониторинг трансфицированных клеток проводили для доказательства цитопатического эффекта, который обычно проявляется через 10-14 дней после трансфекции. Для идентификации успешных рекомбинантов супернатант клеток, выделенных с чашек, где был показан цитопатический эффект, был обработан протеиназой К (50 мг/мл с 0,5% додецилсульфатом натрия и 20 Мм этилендиаминтетрауксусной кислотой) при 56 С в течение 60 мин,экстрагирован фенолом/хлороформом и осажден этанолом. Затем успешные рекомбинанты были идентифицированы с помощью ПЦР с использованием праймеров (Biotechniques, 15,868-872, 1993), комплементарными промотору ЦМВ и последовательностям полиаденилирования SV40 для амплификации вставки (ожидаемый фрагмент 1,1 кб) и праймеров (Biotechniques, 15, 868-872, 1993), созданных для сопутствующей амплификации аденовирусных последовательностей. Затем успешные рекомбинанты проходили два цикла очистки с помощью бляшек. Штаммы вирусов размножали в клетках 293 до титров 1010-1012 вирусных частиц и очищали двойным центрифугированием в градиенте CsCl перед использованием. Рекомбинантные аденовирусы, кодирующие -галактозидазу илиFGF-5, были сконструированы с использованием кДНК полной длины. Система, которая была использована для создания рекомбинантных аденовирусов, имела лимит упаковки 5 кб для инсерций трансгена. Целевые гены под контролем промотора ЦМВ и с последовательностями полиаденилирования SV40 содержали менее 4 кб и помещались в упаковывающих конструкциях. Рекомбинантные векторы были очищены с использованием бляшек по стандартным методикам. Полученные вирусные векторы размножали на клетках 293 до титров 1010-1012 вирусных частиц. Клетки были инфицированы при слиянии 80% и собраны через 36-48 ч. После циклов замораживания-оттаивания клеточный дебрис осаждали стандартным центрифугированием и проводили дальнейшую очистку вируса двукратным центрифугированием в градиентеCsCl (ступенчатый градиент 1,33/1,45 CsCl, цезий готовили в 5 Мм трис, 1 Мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН 7,8); 90000 хg (2 ч),105000 хg (18 ч). Перед инъекцией in vivo проводили обесcоливание вирусных штаммов гельфильтрацией через колонки с Сефарозой, например, Sephadex G25. Полученный вирусный штамм имел конечный титр вируса в пределах 1010-1012 вирусных частиц. Аденовирусная кон 001616 20 струкция была высокоочищенной и не содержала вирус дикого типа (потенциально реплицирующийся). Пример 2. Кардиомиоциты взрослых крыс в культуре клеток. Кардиомиоциты взрослых крыс получали перфузией по Лангендорфу с использованием коллагеназы, содержащей перфузат, в соответствии со стандартными способами. Палочковидные клетки культивировали на пластинках,покрытых ламинином и через 24 ч инфицировали их кодирующим -галактозидазу аденовирусом, полученным в примере 1, при множественности инфекции 1:1. Спустя 36 ч клетки фиксировали глутаральдегидом и инкубировали с Xgal. 70-90% зрелых миоцитов экспрессировали трансген -галактозидазы после инфекции рекомбинантным аденовирусом. При множественности инфекции 1-2:1 цитотоксичность не была отмечена. Пример 3. Миокард свиней in vivo. Аденовирусный вектор, кодирующий галактозидазу, который был получен в примере 1, размножали в пермиссивных клетках 293 и очищали ультрацентрифугированием в градиенте CsCl с получением конечного титра вируса 1,5 х 1010 вирусных частиц согласно способам примера 1. Свиньям массой 40 кг под наркозом и с искусственным дыханием делали торакотомию. Катетер размера 26 вводили в середину левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии и инъецировали вектор (1,5 х 1010 вирусных частиц) в объеме 2 мл. Грудную клетку зашивали и оставляли животное до выздоровления. На четвертый день после инъекции животное умерщвляли. Сердце фиксировали глутаральдегидом, делали срезы и инкубировали с Xgal в течение 16,5 ч. После фиксации и получения срезов ткань контрастно окрашивали эозином. Микроскопический анализ тканевых срезов (трансмуральные срезы ложа LAD через 96 ч после интракоронарной инъекции аденовируса, несущего lacZ) показал значительную величину переноса гена в коронарном ложе LAD,при этом многие тканевые срезы содержали более 50-60% клеток с положительным окрашиванием на -галактозидазу. Участки миокарда,удаленные от области, снабжаемой кровьюLAD, не показали окрашивания X-gal и служили отрицательным контролем, тогда как диффузная экспрессия гена была отмечена в миоцитах и эндотелиальных клетках. Большинство миоцитов показали -галактозидазную активность(синее окрашивание), в последующих исследованиях с использованием интракоронарной инъекции в закрытую грудную клетку подобная активность присутствовала через 14 дней после переноса гена (n=8). В областях экспрессии гена 21 не было получено доказательств воспалений или некроза. Пример 4. Моделирование ишемии на свиньях. Животные были представлены 18 домашними свиньями (30-40 кг). Торакотомию левой стороны проводили с использованием стерильного инструментария (Hammond et al., J. Clin.Invest., 92, 2644-2652 и Poth et al., J. Clin. Invest.,91, 939-949, 1993). Катетеры помещали в левое предсердие и аорту, что являлось средством для измерения регионарного кровотока и мониторинга давления. На левое предсердие пришивали проволоки для обеспечения записи ЭКГ и предсердной стимуляции. Наконец, амероид располагали вокруг проксимального участкаLCx. После того, как развивалась стабильная степень ишемии группе, которую лечили (n=11),вводили аденовирусную конструкцию, содержащую FGF-5 (ангиогенный ген) под контролем промотора ЦМВ. Контрольным животным (n=7) осуществляли перенос гена с помощью аденовирусной конструкции, содержащей репортерный ген lacZ под контролем промотора ЦМВ. Исследования были начаты через 353 дня после наложения амероида, когда развитие коллатеральных сосудов и индуцированная стимуляцией дисфункция были стабильными (Roth etet al., Circulation, 82, 1778-1789). Животных,находящихся в сознании, фиксировали повязками и записывали значения давлений в LV, LA и аорте и электрокардиограмму в цифровой форме (в состоянии покоя и во время стимуляции предсердия до 200 ударов пульса в минуту). Изображения в двух измерениях и М-форме были получены при использовании ультразвуковой системы получения изображения HewlettPackard. Изображения были получены от правого окологрудинного выхода на уровне средней папиллярной мышцы и записаны высокочувствительной системой (VHS). Изображения были записаны для животных, находящихся в нормальном состоянии и во время стимуляции правого предсердия (частота пульса = 200 ударов в минуту). Эти исследования были выполнены за день до переноса гена и повторены 141 день спустя. Результаты пульс-давление и давления левого предсердия были близкими в обеих группах до и после переноса гена, указывая на близость кислородной недостаточности миокарда и условий нагрузки. Эхокардиографические измерения были выполнены с использованием стандартных критериев (Sahn et al., Circulation,58, 1072, 1978). Толщина стенки в конце диастолы (EDWTh) и толщина стенки в конце систолы (ESWTh) были измерены в 5 последовательных сокращениях и усреднены. Был рассчитан процент утолщения стенки (% WTh) как[(EDWTh-ESWTh)/EDETh]X100. При анализе данных не было известно, какой ген был введен животному. Для демонстрации воспроизводи 001616 22 мости эхокардиографических измерений получали изображения для животных (n=5) в два последовательных дня и получили высокую корреляцию (r2=0,90; р=0,005). Через 353 дня после наложения амероида и после его закрытия, но перед переносом гена были выполнены эхокардиографические исследования с использованием контрастного материла (Levovist), который был инъецирован в левое предсердие во время его стимуляции (200 ударов пульса в минуту). Исследования повторили через 141 день после переноса гена. Пик интенсивности контраста был измерен с видеоизображений с помощью компьютерной программы видеоанализа (Color Vue II, NovaMicronics, Indianapolis, Indiana), что обеспечило объективность измерений видеоинтенсивности. При анализе исследований с применением контраста не было известно, какой ген введен животному. При завершении исследований животным под анестезией была проведена торакотомия по срединной линии. Была изолирована брахицефалическая артерия, введен катетер, а другие крупные сосуды лигированы. Животные получали внутривенно гепарин (10000 ед.) и папаверин (60 мг). Для индукции диастолической остановки сердца был введен хлорид калия, а аорта была перекрестно зажата. Солевой раствор вводили через катетер в брахицефалической артерии (давление 120 мм рт.ст.), снабжая таким образом коронарные артерии. Раствор глутаральдегида (6,25% 0,1 М какодилатного буфера) вводили (давление 120 мм рт.ст.) до хорошего фиксирования сердца (10-15 мин). Затем сердце вынимали, идентифицировали ложа, кодируя их цветными красителями, которые инъецировали спереди через левую переднюю нисходящую(LAD), левую огибающую (LCx) и правую коронарную артерии. Амероид исследовали, чтобы подтвердить закрытие. Образцы, взятые из участков с нормальным кровоснабжением и ишемических участков, были разделены на три части, эндокардиальные и эпикардиальные трети были помещены в пластмассу. Микроскопический анализ для подсчета числа капилляров проводили как описано ранее (Mathieu-Costelloet al., Am. J. Physiol., 359, H204, 1900). Четыре поперечных среза толщиной 1 мкм были взяты от образца каждого участка (эндокарда и эпикарда каждого участка), а для определения соотношения число капилляров/число волокон использовали подсчет в поле при увеличении 400 Х. Для одного участка образца было просчитано двадцать-двадцать пять полей высокого увеличения. В каждом участке соотношение числа капилляров к числу волокон было близким в эндокарде и эпикарде, поэтому по 40-50 полей/участок были усреднены и дали соотношение чисел трансмуральных капилляров и волокон. 23 Для установления того, что улучшенные регионарная функция и кровоток обусловлены экспрессией трансгена, были использованы ПЦР и ПЦР с участием обратной транскриптазы (RTПЦР) с целью детекции ДНК и мРНК трансгенного FGF-5 в миокарде животных, которым был осуществлен перенос гена FGF-5. При использовании смыслового праймера к промотору ЦМВ [GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC] (SEQ IDNo 1) и антисмыслового праймера к внутренней последовательности FGF-5 [GAAAATGGGTAGAGATATGCT] (SEQ ID No 2) с помощью ПЦР был амплифицирован ожидаемый фрагмент из 500 пар оснований. При использовании смыслового праймера к началу последовательности[GAAAATGGGTAGAGATATGCT] (SEQ ID No 2) с помощью ПЦР был амплифицирован ожидаемый фрагмент из 400 пар оснований. Наконец при использовании поликлональных антител против FGF-5 (Kitaoka et al., Science, 35, 3198, 1994) экспрессия белка FGF-5 была продемонстрирована через 48 ч, а также через 141 день после переноса гена FGF-5 в клетках и миокарде животных, которым был осуществлен перенос гена FGF-5. Система хелпер-независимого аденовируса 5 человека с дефектом репликации, сконструированная в примере 1, была применена для получения векторов, содержащих трансген. Желаемые гены были представлены lacZ и FGF-5. Инъецируемый in vivo материал был высокоочищенным и не содержал аденовирус дикого типа (репликационно компетентный). Таким образом были сведены к минимуму аденовирусная инфекция и воспалительная инфильтрация. Инъекцией материала прямо в полость коронарной артерии или коронарных артерий возможно эффективно направить ген. При доставке таким образом не происходила экспрессия трансгена в гепатоцитах, а вирусная РНК не могла быть обнаружена в моче в любое время после интракоронарной инъекции. Введение конструкции (4,0 мл, содержащие около 1011 вирусных частиц аденовируса) было выполнено инъекцией 2,0 мл в обе левую и правую коронарные артерии (коллатеральный ток к ложу LCx, очевидно, шел от обоих сосудов). Животные находились под наркозом, а доступ к артериям достигался через правую сонную артерию посредством веносекции; при этом была помещена оболочка Cordis 5F. Для использования коронарных артерий был применен многоцелевой (А 2) коронарный катетер 5F. Закрытие амероида LCx было подтверждено инъекцией контраста в левую главную коронарную артерию. Кончик катетера был затем помещен на глубине 1 см в полости артерии, при этом минимальное количество материала могло бы уйти в проксимальную аорту во время инъ 001616 24 екции. Эту процедуру проводили с каждой из свиней. После осуществления переноса гена три стратегии были использованы для установления успешной инкорпорации и экспрессии гена. (1) Некоторые конструкции содержали репортерный ген (lacZ), (2) были взяты образцы миокарда из соответствующих участков и был проведен иммуноблоттинг для количественной оценки наличия FGF-5 и (3) ПЦР использовали для детекции мРНК и ДНК FGF-5. Данные, касающиеся регионарной сократительной функции на фиг. 2 показывают, что свиньи, получающие lacZ, имели близкую степень индуцированной стимуляцией пульса дисфункции с области ишемии до и через 141 день после переноса гена. Напротив, свиньи, которым был осуществлен перенос гена FGF-5, имели увеличение в 2,6 раза толщины стенки в области ишемии при стимуляции пульса(р=0,00001). Эти данные демонстрируют, что перенос гена FGF-5 в соответствии с изобретением был ассоциирован с улучшенным сокращением в области ишемии при стимуляции пульса. Утолщение стенки в области с нормальным кровоснабжением (интервентрикулярная перегородка) было нормальным во время стимуляции и не затрагивалось переносом гена (% утолщения стенки: Группа lacZ: перед переносом гена 5611%, после переноса гена 519%; Группа GFG-5: перед переносом гена 637%,после переноса гена 585%; никаких различий,дисперсионный анализ двумя способами). Данные, полученные различными способами определения, были в высокой степени воспроизводимыми (утолщение латеральной стенки:r2=0,90; р=0,005). Снижение процента функции,измеренное трансторокальной эхорадиографией,было очень близким снижению процента, измеренному сономикрометрией во время стимуляции предсердия в той же самой модели(Hammond et al., J. Clin. Invest., 92, 2644, 1993),что документирует точность эхокардиографии при оценке ишемической дисфункции. Столбики на фиг. 2 означают средние значения, доверительный интервал составляет 1 SE (средняя квадратическая ошибка). Фиг. 4 а-4 в являются диаграммами, соответствующими контрастным эхорадиограммам миокарда. Фиг. 4 а иллюстрирует острую окклюзию LCx у нормальных свиней, при которой кровоток не отмечался в ложеLCx (черный цвет), тогда как перегородка увеличивалась (белый цвет), подтверждая, что изображение точно идентифицировало ложе LCx и что пониженный кровоток был ассоциирован с пониженным усилением контраста. Фиг. 4 б иллюстрирует различие в усилении контраста между ложами IVS и LCx через 14 дней после переноса гена lacZ, указывая на различный кровоток в двух областях во время стимуляции предсердия (200 ударов в минуту). На фиг. 4 в усиление представляется эквивалентным в ложах IVS 25 и LCx через 14 дней после переноса ген FGF-5,указывая на близость кровотоков в двух областях после стимуляции предсердия. На фиг. 3 суммированы данные компьютерного анализа видеоинтенсивности в двух областях для всех животных. На фиг. 3 данные представлены в виде пика видеоинтенсивности(коррелирует с кровотоком в миокарде) в ишемическом участке (ложе LCx), деленного на пик видеоинтенсивности в интервентрикулярной перегородке (IVS, участок, получающий нормальное кровоснабжение через незакупоренную левую переднюю нисходящую коронарную артерию). Равные кровотоки в двух областях дали бы значение 1,0. Соотношение до переноса гена в среднем составляло 0,5, что указывает на значительно более низкий кровоток в ложе LCx,чем в перегородке. Фиг. 3 показывает, что животные, которым был осуществлен перенос генаlacZ, имели постоянную недостаточность кровотока в области ишемии. Животные, которым был осуществлен перенос гена FGF-5, показывали гомогенное усиление контраста в двух областях, это указывает на 2-кратное повышение кровотока в миокарде за счет улучшения кровотока в области ишемии (р=0,0018, дисперсионный анализ двумя способами). Столбики представляют средние значения, доверительный интервал составляет 1 SE. График на фиг. 5 суммирует данные микроскопического анализа, показывая повышение соотношения числа капилляров к числу волокон в ишемических и неишемических участках у животных, которым был осуществлен перенос гена FGF-5, в сравнении с теми же участками сердец животных, которым был осуществлен перенос гена lacZ. Столбики представляют средние значения по 5-6 животным в каждой группе. Доверительный интервал составляет 1SE, значение р получено при дисперсионном анализе двумя способами эффекта гена. При проведении анализа не было известно, какая группа является леченой. Электрофореграммы после амплификации с помощью ПЦР подтверждали наличие ДНКJM17-ЦMB-FGF-5 (ожидаемый фрагмент из 500 пар оснований) в ложах LAD и LCx у трех свиней через 14 дней после переноса гена FGF-5. Электрофореграмма после амплификации RTПЦР подтвердила присутствие сердечной мРНКFGF-5 (ожидаемый фрагмент из 400 пар оснований) в ложах LAD и LCx через 14 дней после переноса FGF-5, но не lacZ. В дополнение отметим, что через две недели после переноса гена образцы миокарда всех живых пяти lacZинфицированных животных показали значительную активность -галактозидазы при гистологическом исследовании. Наконец, данные иммуноблоттинга культуральной жидкости фибробластов, полученные с использованием поликлональных антител кFGF-5, подтвердили экспрессию белка и экстра 001616 26 целлюларную секрецию через 2 дня после переноса гена FGF-5 (n=4 чашки), но не после переноса гена lacZ. Экспрессия белка была также подтверждена в образцах миокарда 14+1 день после переноса гена FGF-5, но не после переноса гена lacZ (n=4). Описанный эксперимент был повторен на большем числе домашних свиней. Леченая группа (n=16) получала описанную выше аденовирусную конструкцию, которая содержалаFGF-5, направляемый промотором ЦМВ. Контрольным животным (n=7) осуществляли перенос гена с помощью описанной выше аденовирусной конструкции, которая несла репортерный ген lacZ6, направляемый промотором ЦМВ. Прогрессу пяти из леченых животных наблюдался в течение 12 недель после переноса гена. Результаты представлены на фиг. 6-8. На фиг. 6 в графической форме представлена регионарная сократительная функция у леченых животных. Двумерные и М-формы изображения были получены с помощью ультразвуковой системы получения изображенияHewlett Packard. Изображения были получены от правого окологрудинного выхода на уровне средней папиллярной мышцы и записаны с помощью VHS. Во время исследований животные,находящиеся в сознании, были в удобных повязках, сводящих к минимуму движения тела. Изображения были записаны для животных,находящихся в нормальном состоянии и во время стимуляции левого предсердия (частота пульса = 200 ударов в минуту). Эти исследования были выполнены за день до переноса гена и повторены 141 день спустя (левая панель, фиг. 6 а). Пять животных были снова исследованы через 12 недель после переноса гена FGF-5 для установления, был ли эффект улучшения функции устойчивым (правая панель, фиг. 6 б). Результаты пульс-давление и давления левого предсердия были близкими в обеих группах до и после переноса гена, указывая на близость кислородной недостаточности миокарда и условий нагрузки. Эхокардиографические измерения были выполнены с использованием стандартных критериев. Толщина стенки в конце диастолы (EDWTh) и толщина стенки в конце диастолы (ESWTh) были измерены в 5 последовательных сокращениях и усреднены. Был рассчитан процент утолщения стенки (% WTh) как[(EDWTh-ESWTh)/EDETh]X100. Для демонстрации воспроизводимости эхокардиографических измерений получали изображения для леченых животных (n=5) в два последовательных дня. Результаты отдельных определений были высоко воспроизводимыми (утолщение латеральной стенки: r2=0,90; р=0,005). Процент снижения функции, измеренный трансторакальной эхокардиографией и сономикрометрией в нашей лаборатории на этой модели, очень близок (Hammond et al., J, Clin. Invest., 92, 26442652, 1993), что документирует точность эхора 27 диографии при оценке ишемической дисфункции. Утолщение стенки повышалось в области ишемии через две недели после переноса генаFGF-5 (левая панель, р=0,0001, дисперсионный анализ двумя способами), этот эффект сохранялся в течение двенадцати недель (правая панель, р=0,005). Столбики означают средние значения, доверительный интервал составляет 1 SE. При проведении анализа не было известно, какая группа является леченой. Фиг. 7 в графической форме представляет регионарный кровоток в миокарде леченых животных. Контрастный материал (микроаггрегаты галактозы) повышает эхогенность (белый цвет) изображения после инъекции в левое предсердие. Микроаггрегаты распространяются внутри коронарных артерий и стенок миокарда пропорционально уровню кровотока (Skyba etal., Circulation, 90, 1513-1521, 1994). Пик повышения интенсивности контраста коррелирует с кровотоком в миокарде, что было измерено с помощью микросфер (Skyba et al., Circulation,90, 1513-1521, 1994). Через 327 дней после наложения амероида и после его закрытия, но перед переносом гена были проведены эхокардиографические исследования с использованием контраста во время стимуляции предсердия (200 ударов пульса в минуту). Исследования были повторены 141 день после переноса гена и у пяти животных через 12 недель после переноса гена FGF-5. Пик интенсивности контраста был измерен с видеоизображений с помощью компьютерной программы видеоанализа (Color VueII, Nova Micronics, Indianapolis, Indiana), что обеспечило объективность измерений видеоинтенсивности. Данные выражали как соотношение пика видеоинтенсивности в области ишемии (ложе LCx), деленного на пик видеоинтенсивности в интервентрикулярной перегородке(IVS, область с нормальным кровотоком через незажатую нисходящую коронарную артерию левого предсердия). При анализе исследований с применением контраста не было известно, какой ген введен животному. Различия в регионарном кровотоке во время стимуляции предсердия, измеренные контрастной эхокардиографией, были близки к различиям, полученным при измерении с помощью микросфер, на той же модели в нашей лаборатории (Hammond etal., J. Clin. Invest., 92, 2644-2652, 1993), что документирует точность эхокардиографии для оценки регионарного кровотока в миокарде. У животных, которым осуществляли перенос гена LacZ, была постоянная недостаточность кровотока в области ишемии. У животных, которым был осуществлен перенос генаFGF-5, было показано гомогенное усиление контраста в двух областях, что указывает на улучшение кровотока в ишемической области(р=0,0001, дисперсионный анализ двумя способами), этот эффект сохранялся в течение 12 недель (р=0,001). Столбики означают средние зна 001616 28 чения, доверительный интервал составляет 1 SE. Для трех леченых животных контрастная эхокардиография не проводилась. При проведении анализа не было известно, какая группа является леченой. Фиг. 8 графически представляет оценку числа сосудов у леченых животных. Для выполнения исследований животных под наркозом проводили торакотомию по срединной линии. Была изолирована брахицефалическая артерия,введен катетер, а другие крупные сосуды лигированы. Животные получали внутривенно гепарин (10000 ед.) и папаверин (60 мг). Для индукции диастолической остановки сердца был введен хлорид калия, а аорта была перекрестно зажата. Солевой раствор вводили через катетер в брахицефалической артерии (давление 120 мм рт.ст.), снабжая таким образом коронарные артерии. Раствор глутаральдегида (6,25% 0,1 М какодилатного буфера) вводили (давление 120 мм рт.ст.) до хорошего фиксирования сердца(10-15 мин). Затем сердце вынимали, идентифицировали ложа, кодируя их цветными красителями, которые инъецировали спереди через левую переднюю нисходящую, левую огибающую(LCx) и правую коронарную артерии. Амероид исследовали, чтобы подтвердить закрытие. Образцы, взятые из участков с нормальным кровоснабжением и ишемических участков, были разделены на три части и трети эндокарда и эпикарда были помещены в пластмассу. Микроскопический анализ для подсчета числа капилляров проводили как описано ранее (Poole et al.,Am. J. Physiol., 259, Н 204, 1990). Четыре поперечных среза толщиной 1 мкм были взяты от образца каждого участка (эндокарда и эпикарда каждого участка), а для определения числа капилляров вокруг каждой миофибриллы использовали подсчет в поле. Для участка образца было просчитано двадцать-двадцать пять полей высокого увеличения (400 Х). На левой панели(фиг. 8 а) суммированы данные, показывающие увеличенное число капилляров в ишемичecкой и неишемической областях у животных, которым был осуществлен перенос гена FGF-5, по сравнению с теми же областями сердец животных, которым был осуществлен перенос генаlacZ. Более крупные сосуды имели тенденцию к увеличению после переноса гена FGF-5, этот эффект был специфичен для области ишемии(правая панель, фиг. 8 б) Доверительный интервал составляет 1 SE, значение р, которое получено при дисперсионном анализе двумя способами эффекта гена FGF-5. При выполнении анализов не было известно, какая группа является леченой. Список последовательностей(I) Заявитель: Зе Риджентс оф зи Юнивесити оф КэлифоньеATGAGCTTGT CCTTCCTCCTC ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения болезни сердца путем стимуляции развития коронарных коллатеральных сосудов у пациента с ишемией миокарда,включающий в себя доставку аденовирусного вектора, дефектного по репликации, в миокард пациента посредством интракоронарной инъекции, причем указанную интракоронарную инъекцию осуществляют непосредственно в одну или обе коронарные артерии, а указанный вектор содержит трансгенную конструкцию, кодирующую ангиогенный белок или пептид, и способен экспрессировать указанный белок или пептид в миокарде, таким образом стимулируя развитие коронарных коллатеральных сосудов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют однократную инъекцию вектора. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что инъецируют 107-1013 частиц вектора. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инъецируют 109-1012 частиц вектора. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что инъецируют 1011 частиц вектора. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессия ангиогенного белка или пептида регулируется промотором цитомегаловируса,входящим в состав вектора. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессия ангиогенного белка или пептида регулируется специфичным для вентрикулярных миоцитов промотором, входящим в состав вектора. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что специфичный для вентрикулярных миоцитов промотор представляет собой промотор легкой цепи-2 вентрикулярного миозина. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что специфичный для вентрикулярных миоцитов промотор представляет собой промотор тяжелой цепи миозина. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что ангиогенный белок или пептид выбирают из группы, содержащей aFGF, bFGF, FGF-5 иVEGF. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что ангиогенный белок представляет собой FGF-5. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что ангиогенный белок представляет собой aFGF. 31 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что ангиогенный белок представляет собой bFGF. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что ангиогенный белок представляет собой VEGF. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную интракоронарную инъекцию осуществляют на глубину приблизительно 1 см в полость левой и правой коронарных артерий. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют инъекцию на глубину приблизительно 1 см в полость трансплантата подкожной вены и/или трансплантата внутренней артерии молочной железы в дополнение к интракоронарной инъекции. 17. Способ лечения недостаточности периферических сосудов путем стимуляции их развития, включающий в себя доставку аденовирусного вектора, дефектного по репликации, в периферическую сосудистую систему пациента посредством инъекции, причем указанную инъекцию осуществляют непосредственно в бедренную артерию или обе бедренные артерии, а указанный вектор содержит трансгенную конструкцию, кодирующую ангиогенный белок или пептид, и способен экспрессировать указанный белок или пептид в периферической сосудистой системе, таким образом стимулируя развитие периферических сосудов. 32 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что осуществляют однократную инъекцию вектора. 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что инъецируют 107-1013 частиц вектора. 20. Способ по п.17, отличающийся тем, что инъецируют 109-1012 частиц вектора. 21. Способ по п.17, отличающийся тем, что инъецируют 1011 частиц вектора. 22. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанный ангиогенный белок или пептид выбирают из группы, содержащей aFGF, bFGF,FGF-5 и VEGF. 23. Способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре, заключающийся в том, что инъецируют рекомбинантный аденовирусный вектор, дефектный по репликации и содержащий данную конструкцию, через катетер в систему артериального сосудистого снабжения указанного органа или структуры, причем кaтeтeр вводят на глубину, по меньшей мере,около 1 см, а указанный вектор способен к экспрессии трансгенной конструкции в указанном органе или структуре. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанная трансгенная конструкция кодирует ангиогенный белок или пептид.