Модуляторы функций рецепторов семейства рецепторов tnf/ngf и других белков

1 Область изобретения Настоящее изобретение в целом касается рецепторов, относящихся к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, и контроля их биологических функций. Надсемейство рецепторовTNF/NGF включает рецепторы, такие как рецепторы р 55 и р 75 факторов некроза опухолей(TNF-R: здесь и далее они обозначаются как(также обозначаемые как FAS/AP01 или FAS-R: здесь и далее будет обозначаться как FAS-R) и другие. Конкретно настоящее изобретение касается новых белков, которые связываются с другими белками, которые сами по себе связываются напрямую или опосредованно с членами рецепторного семейства TNF/NGF и другими внутриклеточными белками-модуляторами. Более конкретно, оно касается одного такого белка, здесь и далее обозначаемого как(взаимодействующий с рецепторами белок) и обладает способностью модулировать или опосредовать функции RIP, тем самым будучи способным модулировать или опосредовать, как напрямую, так и косвенно, функции других белков, которые связываются с RIP прямо или опосредованно. Связывающиеся с RAP-2 белки являются модуляторам/медиаторами функцийRAP-2. Предпосылки изобретения Фактор некроза опухолей (TNF-) и лимфотоксин (TNF-) (здесь и далее аббревиатураTNF относится и к TNF-, и к TNF-) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, в основном, вырабатываемыми мононуклеарными фагоцитами, которые характеризуются многосторонним влиянием на клетки (D. Wallach, 1986, In Interferon 7, ed. I.Gresser, Acad. Press, London, pp. 83-122; BeutlerCerami, 1987) . И TNF-, и TNF- проявляют свою активность путeм связывания на специфических поверхностно-клеточных рецепторах. Некоторые из их эффектов, по-видимому, являются ценными для организма: например, они могут разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки и способствовать противобактериальной активности гранулоцитов. В этом смысле TNF участвует в защите организма против опухолей и инфекционных агентов, а также играет роль в восстановлении после повреждений. Следовательно, TNF может быть использован в качестве противоопухолевого агента, при применении которого он связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток, тем самым инициируя процессы, приводящие к гибели этих опухолевых 2 клеток. Также TNF может быть использован в качестве противоинфекционного агента. Однако, кроме того и TNF-, и TNF- проявляют и отрицательные эффекты. Имеется подтверждение того, что избыточная выработкаTNF- может играть существенную патогенную роль в патогенезе некоторых заболеваний. Например, известно, что влияние TNF-, в первую очередь, на сосудистую систему организма является основной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1986). При некоторых заболеваниях TNF может обусловливать черезмерное снижение массы тела (кахексию) в результате подавления активности адипоцитов и вследствие обусловливания анорексии, из-за чего TNF- также называют кахектином. Также он был описан как медиатор повреждения тканей при ревматоидных заболеваниях (BeutlerCerami, 1987) и как основной медиатор повреждений, выявляемых при реакции трансплантат против хозяина (Piquet et al., 1987). Кроме того,TNF известен как участник воспалительных процессов и многих других заболеваний. Два дифференцированных и независимо друг от друга экспрессируемых рецептора - р 55 и р 75 TNF-R, причeм оба связывающиеся сTNF- и TNF-, - инициируют и (или) опосредуют упоминавшиеся выше биологические активности TNF. Эти два рецептора характеризуются наличием структурно разных внутриклеточных доменов, что подтверждает дифференцировку обслуживающих их сигнальных системSchall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al.,1990; Heller et al., 1990). Однако, клеточные механизмы, например, различные белки и возможные иные факторы, которые вовлечены во внутриклеточную передачу сигналов TNF-рецепторам р 55 и р 75, пока не установлены. Это тот внутриклеточный сигнальный механизм, который имеет место обычно после связывания лиганда, т.е. TNF ( и ), на его рецепторе, который отвечает за включение каскада реакций,неизбежно приводящий к выявляемой реакции клетки на данный TNF. Что касается упоминавшегося выше цитоцидного действия TNF, то в большинстве исследованных к настоящему времени клеток такой эффект в основном опосредуется рецепторомTNF-R р 55. Антитела, специфичные в отношении внеклеточного домена (т.е. лигандсвязываюшего домена) рецептора TNF-R р 55,сами могут опосредовать цитоцидный эффект(см. европейскую патентную заявку 412486),что коррелирует с эффективностью перекрeстного сшивания этих рецепторов антителами, что, как считается, является первым этапом в формировании внутриклеточного сигнального каскада. Далее, мутационный анализ (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) показал, 3 что биологические функции TNF-R р 55 зависят от целостности его внутриклеточного домена. Соответственно, было подтверждено, что инициация внутриклеточного сигнала ведeт к цитоцидному проявлению рецептора TNF-R р 55. Более того, TNF ( и ) встречается в виде гомотримера, а раз так, то было подтверждено,что он индуцирует внутриклеточные сигналы через TNF-R р 55 за счeт его способности связываться молекулами рецепторов и образовывать с ними перекрeстные сшивки, т.е. приводить к агрегации этих рецепторов. Другим представителем надсемейства рецепторов TNF/NGF является FAS-рецептор(FAS-R), который также называют FAS-антигеном, являющийся поверхностно-клеточным белком, экпрессированным в различных тканях и характеризующийся гомологией с рядом поверхностно-клеточных рецепторов, включаяTNF-R и NGF-R. Рецептор FAS-R опосредует гибель клеток в процессе апоптоза (Itoh et al.,1991) и, по-видимому, является негативным селективным фактором аутореактивных Тлимфоцитов: т.е. в процессе созревания Тлимфоцитов FAS-R опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих собственные антигены. Также было установлено, что мутации в гене FAS-R (мутации lpr) обусловливают лимфопролиферативные синдромы у мышей,которые сходны с системной красной волчанкой, являющейся аутоиммунным заболеванием человека (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Лигандом рецептора FAS-R, по-видимому, является ассоциируемая с клеточными поверхностями молекула, находящаяся, помимо других клеток,на Т-киллерах (или цитотоксических Тлимфоцитах - CTL): следовательно, когда такие клетки CTL контактируют с клетками, несущими FAS-R, они оказываются способными индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих рецептор FAS-R. Кроме того, были сформированы моноклональные антитела, которые специфичны по отношению к FAS-R, при том,что такие моноклональные антитела способны индуцировать гибель клеток, несущих FAS-R,по механизму апоптоза, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, включающей ген FAS-R человека (Itoh et al., 1991). Заявителями был предпринят ряд попыток(см., например, европейские патентные заявки 186833, 308378, 398327 и 412486) проконтролировать нежелательные эффекты TNF за счeт подавления связывания TNF с их рецепторами, используя для этой цели антитела к TNF или цитоплазматические рецепторы TNF с целью обеспечения конкуренции по связываниюTNF-R. Кроме того, с учeтом того, что связывание TNF с их рецепторами является необходимым для проявления TNF-индуцируемых клеточных эффектов, заявители пытались (см., например, европейскую патентную заявку 568925) 4 обеспечить модуляцию влияния TNF путeм изменения активности рецепторов TNF-R. Вкратце, заявка ЕР 568925 касается способа модулирования передачи сигнала и (или) отщепления от TNF-R таким образом, чтобы пептиды или иные молекулы могли взаимодействовать с рецептором либо сами, либо опосредованно через эффекторные пептиды, взаимодействующие с этим рецептором, что тем самым должно модулировать нормальные функцииTNF-R. В заявке ЕР 568925 описывается конструкция и дана характеристика различных мутантных рецепторов TNF-R р 55, несущих мутации во внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах TNF-R р 55. В этом случае в упомянутых выше доменах были идентифицированы сегменты, которые являются ключевыми в обеспечении функций рецептора TNF-R р 55,т.е. функций связывания с лигандом и последующей передачи сигнала и включения внутриклеточного сигнального пути, что обеспечивает в конечном счeте наблюдаемые эффекты действия TNF на данные клетки. Кроме того, также описывается ряд подходов к выделению и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными участками упомянутых выше доменовTNF-R, при том, что эти белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модулировании активности TNF-R. Также в заявку ЕР 568925 включeн ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; к конструированию экспрессирующих векторов,необходимых для выработки данных белков и пептидов; и к формированию антител или их фрагментов, которые бы взаимодействовали сTNF-R или с упомянутыми выше белками и пептидами, которые связываются с различными участками TNF-R. Однако в заявке ЕР 568925 не конкретизируются реальные белки и пептиды,которые бы связывались с внутриклеточными доменами рецептора TNF-R (например TNF-R р 55), а также не описан двухгибридный подход к выделению и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R. Также в заявке ЕР 568925 не представлены белки или пептиды,способные связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Хотя и известно, что рецепторы фактора некроза опухолей (TNF) и структурно родственный им рецептор FAS-R обусловливают в клетках путм стимуляции вырабатываемых лейкоцитами лигандов деструктивную активность,приводящую к их собственной гибели, тем не менее механизмы такого опосредования пока понятны не до конца. Мутационный анализ показывает, что сигнальные пути рецепторов FASR и TNF-R р 55, направленный на цитотоксичность, вовлекают различные участки их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992;Tartaglia et al., 1993, ItohNagata, 1993). Эти участки (т.н. гибельные домены) характеризуются сходством аминокислотных последовательностей. Имеется тенденция к самоассоциируемости гибельных доменов у FAS-R и p55R. Такая самоассоциируемость, по-видимому,обусловливает агрегацию рецепторов, являющуюся необходимой для инициации сигнального пути (см. Song et al., 1994; Wallach et al.,1994; Boldin et al., 1995), а при интенсивной экспрессии этих рецепторов она может приводить к обусловливанию не зависящих от лигандов сигналов (Boldin et al., 1995). Как и при других эффектах, обусловливаемых рецепторами, индукция клеточной гибели рецепторами TNF и FAS-R обеспечивается рядом межбелковых взаимодействий, простирающихся от связывания лиганда на рецепторе до заключительной активации каталитических эффекторных функций, которые в анализируемом случае определяют некаталитические межбелковые взаимодействия, которые инициируют сигнал гибели клеток: связывание тримерных молекул TNF или лиганда FAS-R с соответствующими рецепторами, последующие взаимодействия с другими внутриклеточными доменами (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993;ItohNagata, 1993), определяемые способностью последовательностей доменов гибели к самоассоциированию (Boldin et al., 1995a), и индукция связывания двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами этих рецепторов - белка MORT-1 (или FADD) с FASR (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995;FAS-R и p55-R по их участку гибельного домена, вовлечeнному в индукцию гибели клеток под влиянием этих рецепторов в результате гетерологической ассоциации гомологичных участков, и которые также способны опосредовать клеточную гибель, были идентифицированы в процедуре скрининга, называемой двойной гибридизацией дрожжей. Один из этих белков MORT-1 (Boldin et al., 1995b) - также известен как белок FADD (Chinnaiyan et al., 1995), который специфически связывается с рецепторомal., 1995) - связывается и с FAS-R, и с p55-R. Помимо связывания с FAS-R и p55-R, эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивается функциональный обмен между FAS-R и p55-R. Такое связывание происходит по консервативному участку последовательности - модулю домена гибели, - являющемуся общим для этих рецепторов и связываемых с ними белков. Более того, хотя в двухгибридном дрожжевом тесте было показано, что 6 белок MORT-1 связывается с FAS-R спонтанно,в клетках млекопитающих такое связывание имеет место только после стимуляции данного рецептора: это подтверждает, что MORT-1 участвует в начальном событии сигнального путиFAS-R. Белок MORT-1 не включает каких-либо мотивов, характерных для проявления каталитической активности: следовательно, его способность опосредовать гибель клеток, как предполагается, не основана на собственной активности MORT-1, а скорее всего связана с активацией другого(их) белка(ов), которые связываются с MORT-1 и действуют по следующим этапам этого сигнального каскада. При клеточной экспрессии мутантного MORT-1, лишeнного Nконцевой части молекулы, как было показано,происходит блокировка индукции цитотоксичности под действием FAS/APО 1 (FAS-R) илиp55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996): это указывает на то, что этот N-концевой участок передаeт сигналы о цитоцидном влиянии обоих этих рецепторов через некие белокбелковые взаимодействия. Таким образом, мотивы доменов гибели в составе рецепторов p55-R и FAS-R, равно как и три ассоциированных с ними белка MORT-1,RIP и TRADD, по-видимому, являются сайтами таких межбелковых взаимодействий. Три белкаMORT-1, RIP и TRADD взаимодействуют с внутри-клеточными доменами рецепторов p55R и FAS-R за счт связывания их доменов гибели с таковыми же в составе рецепторов, а гибельные домены и RIP, и TRADD самоассоциируются (хотя в этом отношении белокMORT-1 отличается тем, что его гибельный домен в самоассоциациях не участвует). Более того, белки MORT-1 и TRADD дифференцированно связываются с p55-R и FAS-R и также связываются друг с другом. Более того, иRIP. Следовательно, можно предположить, что взаимодействие между тремя белками MORT-1,RIP и TRADD является важным компонентом общего процесса модуляции внутриклеточного сигнала, опосредуемого этими белками. Нарушение взаимодействия между этими тремя внутриклеточными белками будет обусловливать модуляцию эффектов, определяемых таким взаимодействием. Например, подавление связывания белка TRADD с MORT-1 может модулировать взаимодействие FAS-R-p55 TNF-R. Таким же образом, подавление RIP дополнительно к упомянутому выше подавлению связыванияTRADD с MORT-1 может дополнительно изменить взаимодействие FAS-R-p55 TNF-R. Моноклональные антитела, против домена гибели p55-R, в частности, в отношении связывающего сайта TRADD и RIP, также могут быть использованы для подавления или предотвращения связывания этих белков, тем самым обусловливая модуляцию взаимодействия между FAS-R и p55-R. 7 Также недавно было установлено, что, помимо упоминавшейся выше активности по индукции гибели клеток и еe модуляции, опосредуемых различными рецепторами и связывающимися с ними белками, включая FAS-R, p55-R,MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4 и G1, ряд этих рецепторов и связывающихся с ними белков также вовлечены в модуляцию активности ядерного транскрипционного фактора NF-B,который является ключевым медиатором жизнеспособности или выживания клеток, будучи ответственным за контроль экспрессии значительного числа генов, связанных с иммунитетом и воспалительными процессами. Например, было установлено, что TNF- может эффективно стимулировать активацию фактора NF-B: тем самым TNF- способен индуцировать два типа сигналов в клетках - один из них опосредует гибель клеток, а другой защищает клетки от индукции гибели за счeт включения экспрессии генов под контролем NF-B (см. BegBaltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al.,1996). Сходный двойной эффект также был описан и для рецептора FAS-R (см. отсылки к такому эффекту в упомянутой выше статье VanAntwerp et al., 1996). Следовательно, можно предположить существование тонкого баланса между гибелью клеток и выживанием клеток в результате стимуляции различных типов клеток действием TNF- и (или) лиганда FAS-R, при том, что конечный результат стимуляции зависит от того, по какому внутриклеточному механизму имела место более сильная стимуляция, в результате чего в итоге либо имеет место гибель клетки (обычно по типу апоптоза), либо сохраняется жизнеспособность клетки благодаря активации фактора NF-B. Кроме того, недавно заявителями настоящего изобретения был дополнительно установлен вероятный механизм, по которому члены семейства рецепторов TNF/NGF активируютNF-B (см. Malinin et al., 1997 и различные библиографические ссылки, имеющиеся в этой публикации, а также тематически связанные заявки на патент ИзраиляIL-117800 и IL119133). Вкратце, было установлено, что некоторые члены семейства рецепторов TNF/NGF способны активировать NF-B опосредованно через общий белок-адаптер - TRAF2. Впервые установленная протеинкиназа, обозначенная какNIK (см. цитировавшиеся выше Malinin et al.,1997 и заявки IL-117800 и IL-119133), способна связываться с белком TRAF2 и стимулировать активность фактора NF-B. Действительно, было показано (см. упоминавшиеся публикациюMalinin et al. и израильские заявки), что экспрессия в клетках дефицитных по киназе NIK мутантов обусловливает неспособность этих клеток обусловливать стимуляцию NF-B по нормальному эндогенному механизму, а также блокировку в этих клетках индукции активно 004062 сти NF-B под действием TNF через FAS-R и блокировку индукции NF-B белками TRADD,RIP и MORT-1 (которые являются белкамиадаптерами, связывающимися с этими рецепторами p55-R и/или FAS-R). Все рецепторы p55-R,p75-R, FAS-R и их адаптерные белки MORT-1,TRADD и RIP связываются с белком TRAF2 напрямую или опосредованно, а он, в свою очередь, благодаря способности связываться с киназой NIK модулирует индукцию NF-В. Среди упоминавшихся выше белковадаптеров, вовлечeнных в поддержание тонкого баланса между гибелью клеток и выживанием клеток после стимуляции FAS-R и (или) p55-R,белок RIP, как представляется, играет наиболее важную роль. В С-концевой части белка RIP(см. Stanger et al., 1955; также Malinin et al.,1997) имеется участок, который обеспечивает индукцию цитотоксичности независимым образом, а также за счeт ассоциации с гибельными доменами MORT-1, p55-R, FAS-R и TRADD. Также белок RIP включает протеинкиназный домен в своей N-концевой части, а также промежуточный домен, который, как считается,обеспечивает пересечение (связывание) с белком TRAF2, тем самым включая его в индукцию NF-B. Соответственно подробности,касающиеся параметров и последовательностей(в частности, Stanger et al., 1992), которые включены здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Также TNF является одним из цитокинов,участвующих в инициации и модуляции антивирусной активности организма-хозяина. Сходным образом в эволюции вирусов сформировалась экспрессия генов, белковые продукты которых регулируют активность таких цитокинов,и эти цитокин-регулирующие вирусные белки,как считается, обеспечивают проникновение данного вируса в организм животногореципиента. Одним из наиболее хорошо изученных примеров таких белков является белок Е 3-14.7-кД, представляющий аденовирусы-С человека типов 2 и 3, который активен как мощный антагонист цитолиза, опосредованногоTNF. С целью выделения молекулярных компонентов сигнального каскада TNF, который становится мишенью белка Е 3-17,4-кД в процессе вирусной инфекции, недавно с помощью двухгибридного скрининга был выделен белок Е 317,4-кД человека (белок FIP-2 - четырнадцать килодальнон/взаимодействующий/белок:Fourteen-K Interacting Protein: Y. Li et al., 1988). Было установлено, что белок FIP-2 сам по себе не является токсичным, и, в противоположность защитному эффекту Е-14,7-кД в отношении цитотоксичности, индуцируется сверхэкспрессией 9 двух вышеупомянутых белков. Было установлено, что белок FIP-2 характеризуется определнным уровнем гомологии с RAP-2 - белком по настоящему изобретению. Общий уровень сходства между RAP-2 и FIP2 весьма низок, на что указывает полное сопоставление аминокислотных последовательностей (фиг. 3). Однако гомология становится более существенной по конкретным участкам по направлению к Сконцевым частям этих белков, достигая почти полной идентичности для 30 С-концевых аминокислот. Также заслуживает внимания тот факт, что, помимо вышеупомянутого Сконцевого домена, предполагаемый мотив типа лейциновая молния в последовательностиFIP-2 в существенной степени консервативен для RAP-2 (за исключением замены изолейцина на аланин). Сходная последовательность, обозначенная HYPL, кодирующая белок, связанный с болезнью Гентингтона, который предположительно является обособленным гомологом RAP-2,недавно была внесена в базу данных GenBank под названием белок, взаимодействующий с гентингтином - HYPL (депозитарныйAF049614). Однако сообщений о функциях этого белка пока нет. В недавней статье Ямаоки с соавт. (S. Yamaoka et al., 1998) сообщается об идентификации гомолога RAP-2 мыши. Мышиный гомологNEMO (ключевой модулятор фактора NF-B) был идентифицирован при поиске молекул, которые бы регулировали активацию сигнального пути NF-B. Был охарактеризован клеточный вариант HTLV-1 Тах-трансформированных фибробластов крысы, обозначенный как 5R,который не реагировал ни на один из испытанных стимулов, активирующих NF-B (LPS,РМА, IL-1, TNF), и протестирован по его генетической комплементируемости. В результате этой процедуры была выделена кДНК, кодирующая белок NEMO с молекулярной массой 48 кД. Основываясь на этих данных, было установлено отсутствие данного белка в клетках 5R и его вхождение в высокомолекулярный IkВкиназный комплекс, необходимый для его формирования. В модели in vitro белок NEMO способен образовывать гомодимеры и напрямую взаимодействовать с IKK. В израильской патентной заявке 120485 представляется RIP-ассоциированный белок,обозначенный RAP, который специфически связывается с белком RIP и подавляет индукциюNF-В. Израильская патентная заявка 123758 и настоящая заявка касаются другого RIPассоциированного белка, обозначенного какRAP-2, который характеризуется такими же или сходными активностями. В соответствии с настоящим изобретением белок RAP-2 также обозначается как 303, илиRAP-303, или RAT-303. Для удобства далее здесь он будет обозначаться как RAP-2. Сущность изобретения Объектом настоящего изобретения является представление белка RAP-2, включая все его изоформы, аналоги, фрагменты и производные,способные связываться с белком RIP (здесь и далее обозначаемым просто RIP). ПосколькуRIP способен напрямую или опосредованно взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами воспаления, цитотоксичности и (или) гибели клеток, такими как p55-R и FAS-R, и с их адаптерными или модуляторными белками,такими как, например, MORT-1, TRADD, Mch4,MACH, G1 и другими, то новые белки по настоящему изобретению за счeт связывания с RIP таким образом оказываются способны подавлять внутриклеточный сигнальный каскад, инициируемый связыванием FAS-лиганда со своим рецептором, a TNF со своим рецептором (p55R), а раз так, то новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами опосредованного p55-R и FAS-R влияния на клетки. Также способен взаимодействовать с белкомTRAF2, тем самым будучи способен взаимодействовать напрямую или косвенно с NIK, а, поскольку RIP активен как модулятор воспалительного процесса и механизмов клеточной жизнеспособности, вовлекаемых в индукцию фактора NF-B, то новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами RIPассоциированного воспаления и активности по выживанию клеток. Таким же образом за счт способности рецепторов FAS-R, p55-R и их модуляторных белков MORT-1 и TRADD индуцировать NF-B и выживание клеток напрямую или опосредованно в результате связывания сRIP или связывания с TRAF2, с которым связывается RIP, белки по настоящему изобретению также могут являться медиаторами процессов поддержания жизнеспособности клеток за счeт активности в том же или близкородственном внутриклеточном сигнальном каскаде, в составе которого некоторые из упомянутых выше белков активны по обеспечению выживания клеток. Сходным образом, поскольку p75-R связывается с TRAF2, с которым связывается RIP, новые белки по настоящему изобретению также могут быть модуляторами RIP-связанного опосредования активности, обусловливаемой рецепторомp75-R. Другим объектом настоящего изобретения является представление антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ) упомянутых выше новых белков RAP-2, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных, которые могут быть использованы для подавления сигнальных путей или, что более конкретно, воспалительной цитотоксичности или механизмов выживания клеток, если это является желательным. 11 Ещe одним объектом настоящего изобретения является применение упомянутых выше белков RAP-2, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных с целью выделения и охарактеризования дополнительных белков или факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию рецепторной активности, например, других белков, которые связываются с белками RAP-2 и влияют на их активность, и (или) с целью выделения и идентификации других рецепторов,расположенных выше или ниже по сигнальной цепочке, в которой участвуют данные белки, их аналоги, фрагменты и производные, а, следовательно, в функционирование которых они также вовлечены. Также настоящее изобретение представляет RAP2-связывающиеся белки, которые способны модулировать/опосредовать функцииRAP-2. Ещe одним объектом настоящего изобретения является представление ингибиторов, которые могут быть внесены в клетки с целью связывания или взаимодействия с RAP-2 и вероятными изоформами RAP-2, при том, что эти ингибиторы могут подавлятьRIPассоциированную активность в процессах цитотоксичности, а, следовательно, когда это является желательным, повышать жизнеспособность клеток, или которые могут подавлять RIPассоциированную активность в процессах обеспечения выживания клеток, следовательно, тем самым, если это желательно, повышая уровень цитотоксичности. Более того, объектом настоящего изобретения является применение упомянутых выше новых белков RAP-2, их изоформ и аналогов,фрагментов и производных в качестве антигенов для получения поликлональных и (или) моноклональных антител к ним. Эти антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или линии трансформированных клеток. Далее, данные антитела могут быть использованы для целей диагностики, например,для идентификации заболеваний, связанных с аномальным функционированием клеточных процессов, опосредуемых p55-R, FAS-R и другими родственными рецепторами. Другим объектом настоящего изобретения является представление фармацевтических композиций, содержащих упомянутые выше белкиRAP-2, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, равно как и фармацевтические композиции, содержащие упомянутые выше антитела или другие антагонисты. В соответствии с настоящим изобретением был выделен новый белок RAP-2. RAP-2 способен связываться с RIP или взаимодействовать с ним, а, следовательно, он является модулятором или медиатором внутри-клеточной активности белка RIP. RIP вовлечeн в модуляцию или опо 004062 12 средование внутриклеточных сигнальных механизмов, например, механизмов, ассоциированных с цитотоксичностью или гибелью клеток, в которых RIP обладает собственной цитотоксичностью и в связи, прямой или опосредованной, с рядом других белков гибели клеток, такими как,например, MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1,p55-R и p75-R, с которыми RIP может связываться или иначе ассоциироваться напрямую или косвенно через мотив домена гибели,присутствующий в последовательности RIP и в составе всех других вышеперечисленных белков; другим механизмом является механизм воспаления, клеточной жизнеспособности или выживания, в которых RIP может принадлежать роль прямого или косвенного активатора благодаря наличию киназного мотива или домена в составе последовательности RIP и способностиRIP связываться с белком TRAF2, который может связываться с киназой NIK, которая, в свою очередь, напрямую вовлечена в активацию транскрипционного фактора NF-B, который играет ключевую роль в воспалениях и выживаемости клеток. Кроме того, рецептор p55-R также способен взаимодействовать с TRADD иTRAF2 (через TRADD) и также вовлечeн в активацию NF-B, тем самым участвуя в механизме выживания, а, следовательно, RIP за счeт способности связываться или взаимодействовать с FAS-R, TRADD и р 55-r (через TRADD),равно как и с TRAF2, также может быть вовлечeн в модуляцию воспаления и активации выживания клеток с участием этих белков. Соответственно RIP является модулятором или медиатором этих механизмов и сходным образом новый белок RAP-2 по настоящему изобретению за счeт связывания с RIP является модулятором или медиатором упомянутых внутриклеточных механизмов.RAP-2 был выделен и клонирован с использованием двухгибридной дрожжевой системы, секвенирован и охарактеризован: в соответствии с подробно описанным ниже, RAP-2 рассматривается как высокоспецифичный RIPсвязывающийся белок, следовательно, являющийся модулятором/медиатором RIP. RAP-2 не связывается с TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R иMACH. Кроме того, предполагается, что RAP-2 не включает характерного модуля или мотива гибельный домен, что соответствует тому, что сам по себе RAP-2 не обусловаливает цитотоксичности. По использованию на протяжении дальнейшего текста понятие RIP-активность призвано включить его активность по модуляции/опосредованию воспалений и механизмов гибели и выживания клеток. Эти активности определяются здесь выше и здесь ниже, равно как и во всех цитировавшихся публикациях и патентных заявках, полное содержание которых включено для сведения в виде библиографиче 13 ских ссылок. Подобным образом по использованию в данном тексте понятие активностьRAP-2 включает модуляцию/опосредование механизмов воспалений, гибели клеток и выживания клеток, в которые RIP вовлечeн напрямую или косвенно, а раз так, то такой RAP-2 может рассматриваться в качестве непрямого модулятора/медиатора всех перечисленных выше белков, а, по-видимому, и ряда других факторов,участвующих в воспалениях, гибели клеток или выживании клеток, с которыми связывается RIP,или с которыми RIP взаимодействует напрямую или опосредованно. Также настоящее изобретение представляет два новых RAP2-связывающихся белка,идентифицированных в двухгибридной дрожжевой системе с использованием в качестве наживки полноразмерной аминокислотной последовательности белка RAP-2. Применяя полноразмерный белок RAP-2 в качестве наживки в двухгибридной системе,был выявлен новый RAP2-взаимодействующий белок, обозначаемый в данном тексте как клон 10 (или 10-кодируемый белок, или RATсвязывающийся белок 10, или RBP-10). Последовательность выделенной кДНК была далее определена с помощью стандартных методов секвенирования, известных в данной области техники, в сторону 5' с выделением частичной открытой кодирующей рамки данного белка,лишeнной, однако, старт-кодона. Анализ в двухгибридной системе репертуара связывания клона 10 показал, что этот белок не только связывается с RAP-2, но также проявляет достаточно мощную аффинность в отношении TRAF2. Однако клон 10 не связывается с RIP, TRADD, MORT-1, MACH,TNFR-1, TIP60 и NIK, равно как и с некоторыми контрольными белками (например, ламином и циклином-D). Однако нельзя исключать, что связывание клона 10 с киназой NIK может быть обнаружено в клетках млекопитающих,исходя из параметров NIK в клетках дрожжей. Как было показано, клон 10 связывается сRAP-2 в пределах С-концевых 200 аминокислот последовательности последнего, т.е. участка,необязательно связывающегося с RIP, TIP60,NIK и IKK. Эта последовательность, однако,неточна, что привело к необходимости проведения нескольких кругов поиска базы данныхGen-Bank с целью идентификации гомологов клона 10. Единственным белком, проявившим существенную степень сходства с белком,кодируемым клоном 10, оказался белокC.elegans, для которой точная физиологическая роль пока не установлена. 14 Интересно, что F40F12.5, как было установлено, характеризуется определeнным сходством с некоторыми представителями высококонсервативного семейства контролируемых убиквитином протеаз. Эти ферменты уравновешивают деструктивные последствия активности убиквитиновой системы, которая, как известно,руководит большинством клеточных процессов разрушения белков. При том, что убиквитинлигазы обеспечивают прикрепление полиубиквитиновой структуры к предназначенному к разрушению белку, убиквитинпротеазы предотвращают эффективное разветвление этой структуры. Такое предположение о функцияхF40F12.5, основанное на сходстве упоминавшихся выше контролируемых убиквитином протеаз, однако остаeтся под вопросом, потому что не было исследовано возможное проявление этим белком какой-либо каталитической активности по отношению к полиубиквитину. Более того, ряд положений делают данное совпадение маловероятным:(а) аминокислотные остатки, которые, как считается, составляют основу каталитического участка в любом из подклассов убиквитинпротеаз, не являются консервативными ни в(б) за исключением их каталитических сайтов, ферменты, относящиеся к контролируемым убиквитином протеазам, происходящие от разных видов (от бактерий до человека), не проявляют сколько-нибудь существенного сходства последовательностей, в то время как F40F12.5 и клон 10 характеризуются наличием определeнного уровня гомологии. Таким образом, предполагается, что RAP-2 является специфичным RIP-связывающимся белком и, следовательно, модулятором/медиатором внутриклеточной активности RIP. RAP2 связывающиеся белки, благодаря их способности связываться с RAP-2, проявляют непрямое влияние на RIP и таким путeм также являются модуляторами/медиаторами внутриклеточной активности RIP. Таким образом, RAP-2 предположительно играет роль модулятора/медиатора активностей по воспалениям, выживанию клеток и (или) гибели клеток, в которые RIP вовлечeн напрямую или косвенно, особенно тех, которые связаны с цитотоксичностью и воспалительными процессами, обусловливаемыми или индуцируемыми различными стимулами, включая те, которые передаются рецепторами семейства рецепторовTNF/NGF, а также, возможно, и другими (по схеме участия RIP в таких внутриклеточных процессах, а, следовательно, участия RAP-2, см. фиг. 1 в публикации Malinin et al., 1997). Также RAP-2 может служить ингибитором цитотоксичности и воспалений за счeт его присутствия в качестве части комплекса с другими белками, например, RIP, и белками, связывающимися с RIP, а раз так, то он может нарушать 15 цитотоксичность или воспалительные проявления этих других белков (например, p55-R, FASR, MACH, Mch4, G1 и MORT-1), что в конечном счeте обусловливает подавление их цитотоксической активности или их воспалительной активности. Также RAP-2 может служить в качестве усилителя или индуктора цитотоксичности и воспаления, что обеспечивается активностью других белков, например, RIP и других связывающихся с RIP белков в соответствии с указанным выше, имеющей целью рекрутинг этих белков с участием RIP, при том, что такой рекрутинг служит для обеспечения цитотоксической активности с участием различных белков или для обеспечения их воспалительной активности. Также аналогичным образом RAP-2 может служить в качестве ингибитора или индуктора механизма выживания клеток в соответствии с отмеченным выше за счт вовлечения RIP в работу этого механизма. Соответственно настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, кодирующую RIP-ассоциированный белок (RAP-2),его изоформы, аналоги или фрагменты, способные связываться с RIP и модулировать или опосредовать внутриклеточную активность RIP,при том, что упомянутая внутриклеточная активность связана с модулированием/опосредованием воспалений и (или) гибели клеток, и (или) выживания клеток. В частности, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, выбираемую из группы, которая включает:(а) последовательность кДНК, производную от кодирующего участка нативного белка(б) последовательности ДНК, способные гибридизоваться с последовательностью (а) в условиях средней степени жeсткости, которые кодируют биологически активный белок RAP-2; и(в) последовательности ДНК, которые отличаются в результате вырожденности генетического кода от последовательностей ДНК, определeнных в (а) и (б), которые кодируют биологически активный белок RAP-2. Другим конкретным вариантом вышеупомянутой последовательности ДНК по настоящему изобретению является последовательность ДНК, включающая по крайней мере часть последовательности, кодирующей по крайней мере одну изоформу белка RAP-2. В другом варианте вышеупомянутой последовательностью ДНК является последовательность гена белка RAP-2 в соответствии с показанным на фиг. 1. Ещe в одном варианте представляется последовательность ДНК, показанная на фиг. 2. Настоящее изобретение представляет белки RAP-2, а также их аналоги, фрагменты или производные, кодируемые любой из вышеука 004062 16 занных последовательностей по настоящему изобретению, при том, что упомянутые белки,аналоги, фрагменты и производные способны связываться с RIP и модулировать/опосредовать его биологическую активность в отношении внутриклеточных механизмов гибели клеток и(или) выживания клеток. Конкретный вариант настоящего изобретения представляет белки RAP-2 и их аналоги,фрагменты и производные. Аминокислотная последовательность белка RAP-2, расшифрованная по последовательностям ДНК, показанным на фиг. 1 и 2, показана на фиг. 3. В другом варианте представлена любая изоформа белкаRAP-2, еe аналоги, фрагменты и производные. Также настоящим изобретением представляются компетентные по репликации экспрессионные системы, включающие упомянутую выше ДНК, при том, что эти компетентные по репликации экспрессионные системы способны экспрессироваться в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах; а также способ выработки белка RAP-2 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению путeм культивирования трансформированных клеток-хозяев в условиях,благоприятных для экспрессии упомянутых белка, его аналогов, фрагментов или производных, для осуществления посттрансляционных модификаций упомянутого белка, если это необходимо для получения упомянутого белка, и для экстрагирования упомянутого экспрессированного белка, его аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды упомянутых трансформированных клеток или из экстрактов упомянутых трансформированных клеток. Приведeнные выше определения призваны включить все изоформы белка RAP-2. В другом аспекте настоящее изобретение также представляет антитела или их активные производные или фрагменты, специфичные в отношении белка RAP-2, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению.Eщe в одном аспекте настоящего изобретения представляются различные пути применения упомянутых выше последовательностей ДНК или белков, которые они кодируют в соответствии с настоящим изобретением, при том,что, помимо других, могут быть такие пути применения:(1) Способ модулирования внутриклеточных механизмов воспаления, гибели клеток и(или) выживания клеток, модулируемых или опосредуемых белком RIP, RIP- модулирования внутриклеточных механизмов воспаления, гибели клеток RAP-2, их изоформ, аналогов,фрагментов или производных, способных связываться с RIP, при том, что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутых одного или нескольких белков, их изоформ, аналогов, 17 фрагментов или производных в форме, пригодной для проникновения их внутрь клетки, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутые один или несколько белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, включающего упомянутую последовательность, при том, что указанный вектор способен обеспечивать встраивание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким путeм, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках.(2) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых лигандами семействаTNF за счт влияния на клетки через воздействие на белок RIP в соответствии с п. (1), при том, что упомянутая обработка клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутых белка RAP-2 или его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для проникновения внутрь клетки, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК,кодирующей указанный белок RAP-2 или его изоформы, аналоги, фрагменты или производные, при том, что указанный вектор способен обеспечивать встраивание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким путм,чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках.(3) Способ,описанный в (2), где упомянутая обработка упомянутых клеток осуществляется путeм трансфекции упомянутых клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного, включающий следующие этапы:(а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую поверхностный вирусный белок (лиганд), который способен связываться на специфичном поверхностноклеточном рецепторе на поверхности клетки,несущей рецептор FAS-R или p55-R, а также вторую последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка RAP-2 и его изоформ,аналогов, фрагментов и производных, который,в случае экспрессии в упомянутых клетках, способен модулировать/опосредовать внутриклеточные механизмы воспалений, гибели клеток и(b) инфицирование упомянутых клеток упомянутым в (а) вектором.(4) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства TNF на клетки через воздействие на белок RIP, включающий обработку упомянутых клеток антителами или их активными фрагментами или производными в соответствии с настоящим изобретением, при том, что упомянутая обработка осуществляется с помощью подходящей композиции, содержащей упомянутые антитела, их активные фрагменты или произ 004062 18 водные, в отношении упомянутых клеток, при том, что, когда по крайней мере часть белкаRAP-2 попадает на внешнюю поверхность клетки, упомянутая композиция формируется для внеклеточного применения, а когда упомянутые белки RAP-2 являются полностью внутриклеточными, то упомянутая композиция формируется для внутриклеточного применения.(5) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства TNF на клетки через воздействие на белок RIP, включающий обработку упомянутых клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению по крайней мере к части последовательности белка RAP-2 по настоящему изобретению, при том, что упомянутая олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка RAP-2.(6) Способ, описанный (2), предназначенный для обработки опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток, или больных клеток другого типа, включающий:(а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок, способный связываться на специфичном рецепторе поверхности опухолевых клеток или на рецепторе поверхности ВИЧ-инфицированных клеток, или на рецепторе, находящемся на других больных клетках, а также последовательность, кодирующую белок,выбираемый из белка RAP-2, его аналогов,фрагментов и производных по настоящему изобретению, который, будучи экспрессирован в упомянутых опухолевых,ВИЧинфицированных или иных больных клетках,способен уничтожать упомянутую клетку через взаимодействие с белком RIP; и(б) инфицирование упомянутых опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток или иных больных клеток упомянутым в (а) вектором.(7) Способ модулирования механизмов гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства TNF на клетки через белок RIP, включающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор,кодирующий рибозимную последовательность,способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, которая кодирует белок RAP-2 по настоящему изобретению, вносят в упомянутые клетки в форме, которая обеспечивает экспрессию упомянутой рибозимной последовательности в упомянутых клетках, при том, что, когда упомянутая рибозимная последовательность экспрессируется в упомянутых клетках, она взаимодействует с упомянутой клеточной последовательностью мРНК и расщепляет упомянутую последовательность мРНК, в результате чего происходит подавление 19 экспрессии упомянутого белка RAP-2 в упомянутых клетках.(8) Способ, выбираемый из перечисленных выше способов по настоящему изобретению,при том, что упомянутая кодирующая последовательность белка RAP-2 включает по крайней мере любую одну из изоформ, аналогов, фрагментов и производных RAP-2 в соответствии с настоящим изобретением, которая способна связываться с RIP.(9) Способы выделения и идентификации белков в соответствии с настоящим изобретением, способных связываться с белком RIP, включающих применение двухгибридной дрожжевой системы, в которой последовательность, кодирующая указанный белок RIP входит в состав одного гибридного вектора, а последовательность из библиотеки кДНК или геномной клонотеки входит в состав второго гибридного вектора, при том, что эти векторы затем используются для трансформации дрожжевых клетокхозяев с выделением позитивно трансформированных клеток и последующей экстракцией упомянутого второго гибридного вектора для выделения последовательности, кодирующей белок, который связывается с упомянутым белком RIP.(10) Способ в соответствии с любым из перечисленных выше пп. (1)-(9), при том, что упомянутым белком RAP-2 являются любая из изоформ RAP-2, любой из его аналогов, фрагментов и производных.(11) Способ в соответствии с любым из перечисленных выше (1)-(10), при том, что белокRAP-2 или любая из его изоформ, аналогов,фрагментов или производных вовлечены в модуляцию клеточного проявления, опосредуемого или модулируемого с участием любого другого медиатора или индуктора, с которым упомянутые белок RAP-2, его изоформа, аналог,фрагмент или производное способны связываться напрямую или опосредованно. Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию, предназначенную для модулирования механизмов воспалений, гибели клеток и (или) выживания клеток,опосредуемых влиянием белков семейства TNF на клетки через воздействие на белок RIP или влиянием любого иного медиатора или индуктора на клетки в соответствии с указывавшимся выше, содержащую в качестве активного компонента одно из следующего:(2) рекомбинантный вектор на основе вируса животного, кодирующий белок, способный связываться на поверхностно-клеточном рецепторе, и кодирующий белок RAP-2 или биологические активные фрагменты или аналоги по настоящему изобретению;(3) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательности белка RAP-2 по настоящему изобретению, при том, что указанный олигонуклеотид может являться второй последовательностью в составе вышеупомянутого (2) рекомбинантного вектора на основе вируса животного. Также настоящее изобретение представляет:I. Способ модулирования воспаления,внутриклеточных механизмов гибели клеток и(или) выживания клеток,модулируемых/опосредуемых белком RIP, или влияния на клетки любого другого медиатора или индуктора, или любого иного индуктора или ингибитора транскрипционного фактора NF-B, включающий обработку упомянутых клеток в соответствии со способом по любому из приведeнных выше пп.(1)-(10) белками RAP-2, его изоформами, аналогами, фрагментами или производными или последовательностями, кодирующими белки RAP-2, его изоформы, аналоги или фрагменты, при том, что упомянутая обработка обусловливает усиление или подавление упомянутого RIP-опосредованного эффекта, а тем самым и эффекта, опосредованного FAS-R или p55-R,или упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором NF-B.II. Способ, такой же как указанный выше,при том, что упомянутые белок RAP-2, его аналог, фрагмент или производное являются той частью белка RAP-2, которая специфически вовлечена в связывание с RIP или с упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором NF-B, или упомянутая последовательность белка RAP-2 кодирует ту часть белка RAP-2, которая специфически вовлечена в связывание с RIP или с упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором NF-B.III. Способ, такой же как указанный выше,при том, что указанный белок RAP-2 представлен любой из изоформ RAP-2, при том, что упомянутые изоформы способны усиливать эффект действия RIP.IV. Способ, такой же как указанный выше,при том, что указанный белок RAP-2 является любой из изоформ RAP-2, при том, что упомянутые изоформы способны подавлять действиеRIP или действие на клетки другого медиатора или индуктора, тем самым также подавляя действие FAS-R или p55-R на клетки или действие на клетки иного цитотоксического медиатора или индуктора.V. Способ, такой же как указанный выше,при том, что упомянутые белок RAP-2, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны усиливать или подавлятьRIPассоциированное влияние на воспаление и ме 21 ханизм выживания клеток за счет прямого или опосредованного подавления NF-B или прямой или косвенной активации киназы JNK и р 38. Выделение белков RAP-2, их идентификация и охарактеризование могут быть осуществлены с применением любой из стандартных процедур, используемых для выделения и идентификации белков, например, двухгибридной дрожжевой системы, методов аффинной хроматографии и любых других хорошо известных стандартных процедур, применяемых для подобных целей. Еще в одном аспекте настоящего изобретения сам по себе белок RAP-2 или его изоформа, фрагмент или производное применяются в качестве приманки в двухгибридной дрожжевой системе для поиска белков, с ними связывающихся. Белки, которые связываются с RAP-2, его изоформами, фрагментами или производными,также входят в объем настоящего изобретения. Другие аспекты и варианты настоящего изобретения также представляются с учтом изложенного в нижеследующем подробном описании настоящего изобретения. Необходимо отметить, что при использовании на протяжении данного текста термины модуляция/опосредование RIP, или FASлиганда, или влияние TNF на клетки, а также любые другие, например модуляция/опосредование, используемые в описании, призваны охватить как обработку in vitro, так и in vivo, a также, помимо того, подавление или усиление/обусловливание. Краткое описание чертежей На фиг. 1 (А, В) (SEQ ID NO 1) показана нуклеотидная последовательность гена RAP-2: старт- и стоп-кодоны подчеркнуты. Стрелка указывает на начало 1500-нуклеотидного клона,полученного при двухгибридном скрининге. На фиг. 2 (А, В) (SEQ ID NO 2) показана нуклеотидная последовательность клона 41072 (см. пример 1): старт- и стоп-кодоны подчеркнуты. На фиг. 3 А (/1, /2) показаны расшифрованные аминокислотные последовательности сплайсинговых вариантов человека (полный 20.4 и Human shrt) и мыши (полный NEMO иMouse part) RAP-2, а В (/1, /2) показывает опубликованную последовательность FIP-1, сопоставленную на основе программы, полученной от ВСМ Search Launcher (Baylor Col. Med., Houston, NX). Гомологичные аминокислоты обведены, идентичные аминокислоты затенены. Звeздочки (В) обозначают предполагаемый мотив типа лейциновой молнии в последовательности FIP-2. На фиг. 4 проиллюстрирована молекулярная характеристика RAP-2. На А показаны данные Нозерн-блоттинга MTN Blot I (Clontech) человека с ДНК-фрагментом RAP-2. На В отображен анализ связывания RAP-2 с RIP, под 004062 22 робно описанный в примере 3. На С определено взаимодействие NIK/-RAP-2, как и на В, за исключением того, что антитела анти-FLAG были использованы в методе Вестерн-блоттинга с последующей иммунопреципитацией с антителом к гексагистидину. Стрелка обозначает положение иммунопреципитированных белков. На фиг. 5 показан график негативной регуляции активации NF-B и c-Jun действием различных стимулов под влиянием эктопической экспрессии RAP-2 в соответствии с описанным в примере 4. Клетки линии НЕК-293 Т были трансфицированы по перемежающемуся типу репортерной плазмидой (HIVLTR-Luc илиCMV-Luc для варианта с NF-KB и GAL4-Luc для варианта с c-Jun [В] тестов на активацию), экспрессирующим вектором для соответствующего индуктора и либо пустой плазмидой (pcDNA3 помечена на фигуре отдельно), либо плазмидой,кодирующей полноразмерный RAP-2 (pcRAP-2 помечена на фигуре плюсом). Уровень активации репортерного люциферазного гена выражали в относительных люциферазных единицах(R.L.U.). На фиг. 6 показано, что RAP-2 проявляет сходную репрессивную активность в отношенииNF-B и c-Jun в широком диапазоне концентраций. Белок TRAF2 был экспрессирован по перемежающемуся типу в клетках НЕК-293 Т наряду с различными указанными количествами конструкций либо pcRAP-2 (смысловая), либо pcRAP2-a/s (антисмысловая). Для оценки активацииpGAL4-Luc. Люциферазный тест проводили в соответствии с описанным для фиг. 5 в примере 4. На фиг. 7 показано, что RAP-2 обладает мощным потенциалом по сигналу к фосфорилированию c-Jun без нарушения уровня активации киназы JNK1/2.(A) Тотальные лизаты клеток НЕК-293 Т,трансфицированных указанными экспрессирующими конструкциями либо с pcDNA3 носителем, обозначенной на фигуре знаком минус (-), либо pcRAP-2, обозначенной на фигуре знаком плюс (+), были идентифицированы с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к фосфорилированному Jun в соответствии с описанным в примере 5. Контроль, показанный на нижнем рисунке, был повторно гибридизован с антителами к общему антигену c-Jun (NEB).(B) Активированную JNK1/2 из клеток НЕК-293 Т, трансфицированных либо pcDNA3,либо pcRAP-2, обработанных hrTNF- с целью увеличения периода времени, выявляли с помощью Вестерн-блоттинга тотальных лизатов с использованием антител к фосфорилированной киназе JNK, что подробно описано в примере 5.(C) Клетки НЕК-293 Т были котрансфицированы пустым вектором, pcDNA3 и pcRIP в различных сочетаниях вместе с плазмидой, экспрессирующей HA-JNK1. Затем JNK1 иммунопреципитировали по его N-концевому маркeру НА, а еe способность фосфорилировать бактериальный очищенный химерный антиген GSTJun определяли в киназном тесте in vitro. Продукты этой реакции анализировали методом электрофореза в SDS-ПААГ. Стрелкой отмеченGST-Jun. На фиг. 8 показано, что RAP-2 не конкурирует с NF-B и АР-1 за связывание с ДНК. Клетки НЕК-293 Т были трансфицированы указанными белками либо по отдельности (-), либо вместе с pcRAP-2 (+). Ядерные экстракты, полученные из этих клеток, инкубировали с 32 Рпомеченными олигонуклеотидами, включающими классические распознавательные последовательности для АР-1 (А) или для NF-B (В). Продукты реакции анализировали электрофоретически в неденатурирующем ПААГ. На фиг. 9 показано, что RAP-2 подавляет исходный уровень NF-B в клетках НЕК-293 Т иHeLa, непостоянно трансфицированных различным количеством либо RAP-2 (смысловая), либоRAP-2-a/s (антисмысловая). Все манипуляции были осуществлены в соответствии с описанным для фиг. 6 в примере 4. На фиг. 10 (А, В) (SEQ ID NO 3) показано частичная нуклеотидная последовательность клона 10. На фиг. 11 отображены функциональные свойства последовательных делеций RAP-2. На А дано схематическое представление последовательных С-концевых делеций в RAP-2. Все варианты укорочения сохраняют полностью Nконцевую часть RAP-2, в то время как их Сконцевые участки обозначены стрелками. Участки связывания RIP, NIK, IKK и TIP60 подчеркнуты. Три заштрихованных области соответствуют предполагаемым мотивами типа лейциновой молнии. На В показан эффект сверхэкспрессии делеционных конструкций,описанных в А, на активацию NF-B в клетках НЕК-293 Т под действием RelA, TRAF2, TNF иNIK с использованием для NF-B репортерной люциферазной плазмиды HIV-LTR-Luc. Уровень активации репортерного люциферазного гена выражали в относительных люциферазных единицах (R.L.U.). На фиг. 12 показано картирование функциональных и связывающих участков в RAP-2:(А) Различные делеции в составе RAP-2 были протестированы по их способности связывать указанные белки в трансфицированных клетках дрожжей (нечетные столбцы) и клетках млекопитающего НЕК-293 Т (четные столбцы). В двух расположенных с правого края столбцах показана способность одних и тех же делеций,трансфицированных в клетки НЕК-293 Т в 24 большом объеме, что подробно описано в примере 9, подавлять активацию NF-B и обусловливать гиперфосфорилирование c-Jun в ответ на обработку TNF-. Выпуклость перекрестий пропорциональна интенсивности данного эффекта. Стрелки указывают на то, что наблюдаемые эффекты помеченных конструкций в отношении стимуляции RelA дифференцированы(В) Обобщающая схема, представляющая расположение связывающих (верхняя часть) и функциональных (нижняя часть) участков RAP2 в соответствии с данными делеционного анализа, показанного на (А), на протяжении осевой структуры данного белка. Заштрихованные участки указывают на возможное положение границ соответствующих минимальных сегментов. На фиг. 13 показано, что остаток серина 148 в последовательности RAP-2 существен для его способности индуцировать гиперфосфорилирование по остатку серина-63. Показан Вестерн-блот, в котором wt обозначает дикий тип, S148F обозначает замену серина на аланин в 148-м положении, а vector соответствует контрольному (пустому) вектору. Подробное описание изобретения В одном из своих аспектов настоящее изобретение касается новых белков RAP-2, которые способны связываться с белком RIP, тем самым опосредуя или модулируя внутриклеточную активность RIP, особенно тогда, когда RIP вовлечен в модуляцию или опосредование механизмов воспалений, гибели клеток и (или) выживания клеток, что подробно было описано выше. Таким образом, RAP-2 может подавлять активность RIP в механизмах гибели клеток,воспалений и выживания клеток, RAP-2 может усиливать активность RIP в механизмах воспалений, гибели или выживания клеток, или же он усиливает активность RIP в одном из этих механизмов, подавляя его в других механизмах. Более конкретно, в соответствии с настоящим изобретением представляется новый белокRAP-2. Белок RAP-2 был секвенирован и охарактеризован, и было установлено, что RAP-2 является RIP-связывающимся белком, характеризующимся специфичностью в отношении RIP,но не проявляет свойств связывания в отношении ряда белков, для которых известно участие во внутриклеточных сигнальных механизмах,которые связаны с воспалительными процессами, гибелью клеток или выживанием клеток. Также RAP-2, по-видимому, не имеет в свом составе доменов, обычных для белков, которые активны в каком-либо из этих механизмов, т.е.RAP-2 не включает мотива или модуля домена гибели, он не включает киназного мотива или домена и он не включает протеазного мотива или домена. Установленная последовательностьRAP-2 также является уникальной последовательностью в отношении использовавшихся для 25 сравнения последовательностей из ряда баз данных, включая GeneBank и базы данных Human Genome level 1 и dbest. Как уточнялось выше (также со ссылкой на все упоминавшиеся публикации и патентные заявки) RIP вовлечен во внутриклеточные механизмы воспаления,гибели клеток и выживания клеток. Следовательно, регуляция или контроль активности RIP могут влиять на любой из этих механизмов или на все эти механизмы тогда, когда они инициируются, например, в ответ на связывание TNF или FAS-лиганда на своих рецепторах (в частности, на p55-R, как рецепторе TNF). RIP может играть ключевую роль в определении того, какой механизм активируется в большей степени,что определяется способностью к связыванию с рядом цитотоксических белков, включающих в своей последовательности гибельные домены,а также с рядом белков, обладающих киназной активностью. Соответственно, такие белки как белок RAP-2 по настоящему изобретению, которые могут специфически связываться с RIP,могут играть важную роль в модулировании активности RIP, тем самым модулируя степень индукции одного из указанных механизмов по сравнению с другими. Следовательно, белокRAP-2 по настоящему изобретению представляет собой важнейший модулятор или медиатор внутриклеточных сигнальных путей. В дополнение к полноразмерному белкуRAP-2 по настоящему изобретению были клонированы более короткие кДНК, для которых было установлено наличие блоков последовательностей, производных от некоторых взаимоудалнных участков полной кДНК, причиной чего может являться альтернативный сплайсинг того же самого гена. Мышиный гомолог генаRAP-2 человека был идентифицирован в аналогичном скрининге пула маркров EST мыши. Как было установлено, частичная последовательность кДНК мыши по сути идентична своему гомологу человека на участке кодирующей рамки. Физиологическое значение взаимодействия RIP/RAP-2 было дополнительно подтверждено при трансфицировании клеток линий НЕК-293 Т и HeLa. Однако образование такого комплекса не приводило к каталитической активности RIP, на что указывало отсутствие фосфорилирования RAP-2 при сверхэкспрессииRIP. Эксперименты по трансфекции в клетках НЕК-293 Т млекопитающего также подтвердили образование стабильного комплекса белковRAP-2, по-видимому, является ключевым элементом передачи сигналов в цепи факторовNF-KB и c-Jun, поскольку он связывается с NIK,IKK и TIP60 (ацилтрансфераза гистонов) и модулирует транскрипцию, зависимую от NFB и c-Jun. Действительно, усиленная эктопиче 004062 26 ская экспрессия RAP-2 обусловливает подавление связанного с NF-B ответа, в то время как удаление этого белка из клетки с применением антисмысловой конструкции обусловливает усиление трансактивации NF-B и с-Jun. Также было установлено, что RAP-2 обладает потенциалом по гиперфосфорилированиюc-Jun, которое не опосредуется активностью киназы JNK. RAP-2 не подавляет связывание cJun и RelA с ДНК. Связывающие и функциональные домены в составе RAP-2 были идентифицированы при секвенировании делеционных вариантов. Эти исследования позволили установить, что участки связывания RIP, NIK и TIP60 перекрываются и находятся в районе аминокислотных остатков 95-264 последовательностиRAP-2. Последующие функциональные эффекты, опосредуемые белком RAP-2, однако, как было выяснено, связаны с N-концевым доменом данного белка, охватываемого аминокислотами 1-264. С точки зрения высказанного выше, RAP2, по-видимому, является ключевым элементом процессов регуляции сигналов в механизме реакции на стрессы: эктопическая экспрессия смысловой конструкции подавляет ответ, в то время как антисмысловая конструкция усиливает такой ответ. Действительно, RAP-2 также известен в лаборатории, в которой работают заявители, как белок RAT (белок-аттенюаторRIP): поэтому в данном тексте он также обозначается как RAT и (или) RAT-303, и (или) клон 303. Существование множественных сплайсинговых вариантов указывает на то, что, по крайней мере отчасти, разветвлeнный эффект действия RAP-2 при конкретных условиях, повидимому, определяется присутствием нескольких блоков последовательностей, которые являются необходимыми для связывания, мечения, перемещения и модификации данного белка в виде его преобладающей изоформы. Например, если, действительно, связывание RAP-2 с TIP60 определяется ядерной локализациейRAP-2 с утраченным при сплайсинге сигнале ядерной локализации (NLS) могут превращаться в дефектные, или, с другой стороны, чрезвычайно активные в подавлении NF-B/AP-1 варианты. Проведeнное секвенирование не показало того, что RAP-2 включает несколько кластеров положительно заряженных аминокислот (глутаминовая кислота, лизин и аргинин), характерных для большинства известных сигнальных мотивов NLS. Связывание RAP-2 с RIP было установлено по тому участку белка RAP-2, который начинается на аминокислотах 177-218 и заканчивается на 264-й аминокислоте. RIP-связывающий домен в составе RAP-2 не перекрывается ни с сай 27NIK. Связывание с TIP60, являющимся членом семейства ядерных белков, определяемых как ацетилтрансферазы гистонов, картируется на участке, соответствующем аминокислотам 95264. Участок, вовлечeнный в гомодимеризацию,был установлен на аминокислотах 217-264. Накопленные данные подтверждают, что все функциональные проявления RAP-2 (а именно подавление NF-B и индукция гиперфосфорилирования с-Jun) картируются на одном и том же участке. Белок, кодируемый клоном 10, повидимому, связывается на участке, начинающемся между аминокислотами 218-309 и заканчивающемся на аминокислоте 416, а, следовательно, его связывающий сайт может включать перекрывающиеся участки сайтов связывания сRIP, NIK, IKK и TIP60. Далее, возможно, что участок, существенный в связи с эффективной модуляцией сигналов, обусловливаемых всеми индукторами, находится в N-концевом участке данного белка. Участок, покрываемый аминокислотами 95-416, обладает некоторым эффектом, который, однако, существенно слабее по сравнению с тем, который обусловливается полноразмерным белком, что, следовательно, может определяться усиленной агрегацией эндогенного белкаRAP-2. Более того, за исключением RelA, все индуцированные в проведнных заявителями экспериментах эффекты могут быть вызваны по минимуму приблизительно сотней N-концевых аминокислот последовательности белка RAP-2. Действительно, даже фрагмент с аминокислотами 1-102 обусловливает отчетливый эффект,хотя и весьма средний по силе. С другой стороны, подавление RelAопосредованного эффекта требует присутствия большей части белка RAP-2. В связи с этим заявителями были определены границы такого участка в составе аминокислот 1-264, который, повидимому, придает аминокислотам участка 157264 некоторые специфичные связывающие свойства, ассоциированные с фактором RelA. С точки зрения описанных выше наблюдений предполагается следующее:(а) за исключением RelA, связывание RAP2 с RIP, клоном 10 и, что наиболее вероятно,с NIK и TIP60 не является обязательным для функционирования данного белка в качестве ингибитора сверхэкспрессии, индуцируемой фактором NF-B;(б) влияние RAP-2 на индуцируемую сверхэкспрессией RelA активацию, очевидно, по крайней мере отчасти, обусловливается отличающимися событиями связывания. По сути все упоминавшиеся выше белки могут определяться как факторы данной активности, на что указы 004062 28 вают данные экспериментов, проведнных к настоящему времени. Благодаря уникальной способности FAS-R и рецепторов TNF обусловливать гибель клеток,равно как и способности рецепторов TNF опосредовать различные тканеповреждающие эффекты, нарушение функций этих рецепторов может быть вредным для организма. Действительно, и избыточная, и недостаточная функция таких рецепторов, как было установлено, обусловливает патологические проявления при различных заболеваниях. Идентификация молекул,которые участвуют в сигнальных путях этих рецепторов, и обнаружение механизмов модулирования функций этих молекул представляет возможный ключ к новых терапевтическим приeмам в отношении таких заболеваний. С точки зрения предполагаемой важной роли RIP в проявлении токсичности рецепторами FAS-R и p55-R и, следовательно, важной регуляторной роли RAP-2 рецепторов FAS-R и p55-R через модуляцию RIP, представляется важным создать лекарственные средства, которые бы могли блокировать цитотоксические функции RIP, возможно, за счeт блокировки связывания RAP-2 сRIP или подавления каким-либо иным путм взаимодействия между RAP-2 и RIP при тех условиях, при которых RAP-2 выступает в качестве усилителя RIP-опосредованной цитотоксичности (как отмечалось выше, RIP является цитотоксичным сам по себе и в сочетании с другими белками, в последовательности которых имеются гибельные домены). Подобным же образом известно (см. выше), что рецепторы FAS-R и p55-R вовлечены в активацию транскрипционного фактора NF-B и тем самым в обеспечение жизнеспособности(выживание) клеток. Следовательно, когда желательным является уничтожение клеток, например,опухолевых клеток,ВИЧинфицированных клеток и подобного, то желательным должно быть усиление цитотоксического действия FAS-R и p55-R (и ассоциированных с ними белков, таких, как, например,MORT-1, MACH, Mch4, G1, TRADD), в то же время связанное с подавлением их способность индуцировать NF-B. Следовательно, когда взаимодействие или связывание RAP-2 с RIP обусловливает способствование вероятной функции RIP в усилении индукции NF-B (возможно, через белок TRAF2 и, по-видимому, через киназный домен и/или промежуточный домен белка RIP), то желательной может быть блокировка такого взаимодействия между RAP2 и RIP с целью подавления или, по крайней мере, для предотвращения способствования активации NF-В, тем самым добиваясь сдвига в балансе эффектов, индуцируемых TNF или лигандом FAS в сторону проявления цитотоксичности, которые в конечном счте приводили бы к гибели клеток. 29 Сходным образом при противоположной ситуации (по отношению к описанному выше),когда связывание RAP-2 с RIP реально обусловливает подавление воспалительных или цитотоксических эффектов FAS-R и p55-R и когда желательным является заблокировать их цитотоксическое действие, например, при воспалениях, различных аутоиммунных заболеваниях и при подобном, при которых нужна повышенная жизнеспособность клеток, то важным является создание лекарственных средств, которые бы усиливали взаимодействие между RAP-2 и RIP с целью усиления общего уровня подавления гибели клеток и сдвига в балансе в сторону выживания клеток. Также ясно, в свете сказанного выше, что при том, что взаимодействие RAP-2 сRIP обусловливает подавление функций RIP в отношении активации NF-B, то, когда желательным является сохранение жизнеспособности клеток, необходимой является блокировка данного взаимодействия между RAP-2 и RIP,что тем самым усиливает активность RIP по способствованию активации NF-B. В связи со всем сказанным выше, можно заключить, что RIP характеризуется ключевой ролью в поддержании баланса между индукцией и опосредованием механизмов воспаления, гибели клеток или выживания клеток: следовательно,RAP-2 обладает аналогично важной ролью, будучи модулятором белка RIP. Воздействие на взаимодействие/связывание RAP-2/RIP с использованием различных лекарственных средств или приемов в соответствии с описываемым выше и далее обеспечит возможность сдвига во внутриклеточных сигнальных механизмах от гибели клеток к выживанию клеток, и наоборот, если это представляется желательным. Также настоящее изобретение касается последовательности ДНК, кодирующей белокRAP-2, а также белков RAP-2, кодируемых такими последовательностями ДНК. Более того, настоящее изобретение дополнительно касается последовательностей ДНК,кодирующих биологически активные аналоги,фрагменты и производные белка RAP-2, а также сами аналоги, фрагменты и производные, ими кодируемые. Получение таких аналогов, фрагментов и производных осуществляется стандартными методами (см., например, руководство Sambrook et al., 1989), в которых в последовательности ДНК, кодирующей белок RAP-2,один или большее число кодонов могут быть делетированы, добавлены или заменены другими с получением аналогов, характеризующихся,по крайней мере, заменой одного аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком. Среди названных выше последовательностей ДНК по настоящему изобретению, которые кодируют белок RAP-2, его изоформу, аналог,фрагмент или производное, также, как вариант настоящего изобретения, включаются последо 004062 30 вательности ДНК, способные гибридизоваться с последовательностью кДНК, производной от кодирующего сегмента нативного гена белкаRAP-2, при том, что такую гибридизацию проводят в условиях средней степени жсткости, а гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активный белок RAP-2. Такие гибридизуемые последовательности ДНК,следовательно, включают последовательности ДНК, которые характеризуются относительно высоким уровнем гомологии с нативной последовательностью кДНК RAP-2, а раз так, то представляют собой RАР 2-подобные последовательности, которые могут являться, например,естественно производными последовательностями, кодирующими различные изоформыRAP-2. Кроме того, эти последовательности могут включать, например, ненативные синтезированные искусственным путм последовательности, которые сходны с нативной последовательностью кДНК RAP-2, но при этом включают ряд желательных модификаций. Такие синтетические последовательности, следовательно, включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные RAP-2, при том, что все они обладают активностью белка RAP-2. Для получения различных вышеупомянутых естественно встречающихсяRАР 2 подобных последовательностей стандартные процедуры скрининга и выделения нативных образцов ДНК или РНК из различных тканей могут быть применены с использованием нативной кДНК RAP-2 или ее фрагментов в качестве зонда (см. примеры стандартных процедур,описанных у Sambrook et al., 1989). Таким же образом для получения упоминавшихся выше различных синтетическихRAP-2 ряд стандартных методов может быть использован в соответствии с подробно описанным здесь ниже с целью получения таких аналогов, фрагментов и производных. Полипептид или белок, который в существенной степени соответствует белку RAP-2,включает не только сам белок RAP-2, но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами RAP-2. Аналоги, которые в существенной степени соответствуют белку RAP-2, являются теми полипептидами, в составе которых одна или большее число аминокислот нативной аминокислотной последовательности белка RAP-2 заменены на другие аминокислоты, делетированы и (или) добавлены, в результате чего получающийся в результате белок проявляет по сути такую же или более высокую биологическую 31 активность белка RAP-2, которому они соответствуют. С целью достижения существенного соответствия белку RAP-2 изменения в составе последовательности белков RAP-2, таких как его изоформы, должны быть, в принципе, небольшими. Хотя число таких изменений может превышать десять, предпочтительно, чтобы таких изменений было менее десяти, более предпочтительно - не более пяти, а наиболее предпочтительно - не более трeх таких изменений. При том, что любой метод может быть применeн для поиска потенциально биологически активных белков, которые бы соответствовали белкамRAP-2, одним из таких методов является применение стандартных приeмов мутагенеза в отношении ДНК, кодирующей данный белок, с получением в результате небольших модификаций. Эти белки, экспрессируемые такими клонами, затем могут быть подвергнуты скринингу по их способности связываться с RIP и модулировать активность RIP в отношении модулирования/опосредования внутриклеточных механизмов, описывавшихся выше. Консервативными заменами являются такие изменения, которые в связи с ожидаемыми последствиями не приведут к изменениям активности данного белка и которые обычно первыми подвергаются проверке потому, что они не обусловливают существенных изменений в размере, заряде или конНа Фигуреции данного белка, что, следовательно, как ожидается, не приведeт к изменению его биологических свойств. Консервативные замены белков RAP-2 включают аналог, при том, что по крайней мере один аминокислотный остаток в составе полипептида был по консервативному типу заменeн на отличающуюся аминокислоту. Такие замены предпочтительно выполняют в соответствии со следующим перечнем, показанным в табл. 1A,при том, что замены могут быть определены в рутинных опытах с целью обеспечения структурных и функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулы с сохранением той биологической активности, которая характерна для белка RAP-2. Таблица 1A Исходный остаток аланин аргинин аспарагин аспарагиновая кислота цистеин глутамин глутаминовая кислота глицин гистидин изолейцин лейцин лизин Пример замены глицин, серин лизин глутамин, гистидин глутаминовая кислота серин аспарагин аспарагиновая кислота аланин, пролин аспарагин, глутамин лейцин, валин изолейцин, валин аргинин, глутамин,глутаминовая кислота 32 метионин фенилаланин серин треонин триптофан тирозин валин лейцин, тирозин, изолейцин метионин, лейцин, тирозин треонин серин тирозин триптофан, фенилаланин изолейцин, лейцин С другой стороны, иная группа замен в белке RAP-2 представлена теми заменами, в результате которых по крайней мере один аминокислотный остаток в данном полипептиде удаляется, а отличающийся остаток встраивается на его место в соответствии с табл. 1B. Типы замен, которые могут быть произведены в составе данного полипептида, могут быть основаны на анализе частот аминокислотных замен при сравнении гомологичных белков у разных видов, таких, как те, которые показаны в табл. 1-2 у G.E.Schulz et al., 1978, Principles of ProteinCo., San Francisco, CA. Основываясь на подобном анализе, альтернативные консервативные замены определены здесь как замены в пределах одной из 5 групп. Таблица 1B 1. Небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: аланин, серин, треонин(пролин, глицин) 2. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: аспарагин, аспарагиновая кислота,глутаминовая кислота, глутамин 3. Полярные, положительно заряженные остатки: гистидин, аргинин, лизин 4. Крупные алифатические неполярные остатки: метионин, лейцин, изолейцин, валин (цистеин) 5. Крупные ароматические остатки: фенилаланин,тирозин, триптофан Три аминокислотных остатка, заключeнные в приведeнной выше таблице в скобки,играют специфическую роль в архитектуре белка. Глицин является единственным остатком, не имеющим боковой цепи и поэтому обеспечивающим гибкость цепочке. Это, однако, обусловливает тенденцию образования иной вторичной структуры, нежели -спиральной. Пролин, благодаря своей необычной геометрии,значительно уплотняет цепочку, обусловливая тенденцию образования структур типа изгибов, хотя в некоторых случаях цистеин может быть способен участвовать в формировании дисульфидных связей, которые играют важную роль в укладке и поддержании пространственной структуры белка (в его фолдинге) . Надо заметить, что в цитировавшейся выше публикации Schulz et al. приведeнные выше группы 1 и 2 объединены. Также надо заметить, что тирозин за счeт его способности образовывать водородные связи характеризуется существенным сходством с серином и треонином и т.д. 33 Консервативные аминокислотные замены в соответствии с настоящим изобретением, например, так, как отмечалось выше, известны в данной области техники, поэтому можно ожидать, что будут сохранены биологические и структурные свойства данного полипептида после такой аминокислотной замены. Большинство делеций или замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не приводят к резким изменениям в параметрах данного белка или полипептидной молекулы. Эти параметры определяются таким образом, чтобы учесть и изменения во вторичной структуре, например, таких как -спирали или -плоскости, и изменения в биологической активности, например, в связывании с RIP и(или) опосредовании влияния RIP на гибель клеток. Примерами произведения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов белков RAP-2 с целью их использования в соответствии с настоящим изобретением, включают любые известные методы, такие как представленные в патентах СШАRE-33653, 4959314,4588585 и 4737462, выданные Merk et al.,5116943, выданный Koths et al., 4965195, выданный Namen et al., 4879111, выданный Chong etal., и 5017691, выданный Lee et al.; а также замещeнные по лизину белки, представленные патентом США 4904584 (выдан Shaw et al.). Помимо консервативных замен, обсуждавшихся выше, которые в существенной степени не изменяют активности белка RAP-2,также либо консервативные замены, либо менее консервативные и в большей степени случайные замены, которые приводят к усилению биологической активности аналогов белков RAP-2, входят в масштаб настоящего изобретения. После того, как точный эффект замены или делеции подтверждн, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что такой эффект замены (замен), делеции (делеций) и т.п. должен быть оценен с применением рутинных тестов на связывание и гибель клеток. Скрининг на основе стандартного теста не будут включать каких-либо незапланированных дополнительных экспериментов. Приемлемыми аналогами RAP-2 являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, способность связываться с RIP, тем самым, как отмечалось выше, опосредуя активность RIP в отношении внутриклеточных механизмов, описывавшихся выше. В этом смысле могут быть получены аналоги, которые будут обладать т.н. доминантно-негативным проявлением, а именно такой аналог будет дефектным либо по связыванию с RIP, либо по последующей выработке сигнала, либо по любой другой активности, являющейся следствием такого связывания. Такие аналоги могут быть исполь 004062RIP или для подавления индукции NF-B (прямой или опосредованной), обусловливаемойRIP, что зависит от того, какая из этих активностей является основной из опосредуемых взаимодействием RAP-2 и RIP (см. выше), что будет обусловливаться такими аналогами за счет их конкуренции с нативным RAP-2 за связывание сRIP. На генетическом уровне такие аналоги обычно получают с применением метода направленного мутагенеза в отношении нуклеотидов в составе ДНК, кодирующей белок RAP-2,тем самым образуя ДНК, которая кодирует аналог, после чего синтезируют такую ДНК и экспрессируют полипептид в рекомбинантной клеточной культуре. Обычно такие аналоги проявляют такую же или повышенную биологическую активность по сравнению с нативным белком: Ausubel et al., 1987/1995, Current ProtocolsSpring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY. Получение белка RAP-2 в соответствии с изложенным здесь или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей такой же полипептид, но отличающейся от нативной последовательности из-за изменений, определяемых известной вырожденностью генетического кода, может быть осуществлено с применением метода направленного(сайтспецифичного) мутагенеза той ДНК, которая кодирует ранее полученный аналог или нативный вариант белка RAP-2. Метод направленного мутагенеза позволяет получать аналоги путем использования специфичных олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК, включающую желательную мутацию, равно как и достаточное количество соседних с ней нуклеотидов, с целью получения последовательности затравки необходимой длины и состава для получения стабильного дуплекса по обе стороны от имеющегося делеционного стыка. Обычно предпочтительными являются затравки, состоящие примерно из 20-25 нуклеотидов, при том, что по 510 комплементарных нуклеотидов на каждой стороне последовательности изменены. В целом, метод направленного мутагенеза хорошо известен в науке, примером чему может служить публикация Adelman et al., 1983, DNA, 2,183, содержание которой включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Как должно быть понятно, метод направленного мутагенеза обычно основан на использовании фагового вектора, который существует и в одноцепочечной, и в двухцепочечной формах. Обычными векторами, применяемыми в методе направленного мутагенеза, являются такие векторы, как фаг М 13, например, в соответствии с изложенным у Messing et al., 1981, In 35 3d Cleveland Symp. MacromoleculesRecombinant DNA, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam,содержание которой включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Этот фаг легко доступен на коммерческой основе и его использование, в принципе, хорошо известно специалистам в данной области техники. С другой стороны, плазмидные векторы, которые включают одноцепочечный сайт начала репликации (Veira et al., 1987, Meth. Enzymol., 153, 3),могут быть использованы для получения одноцепочечной ДНК. В целом, метод направленного мутагенеза в связи с описываемым в данном тексте осуществляют изначально путeм получения одноцепочечного вектора, который включает в своей последовательности последовательность ДНК,которая кодирует искомый полипептид. Олигонуклеотидную затравку, несущую желательным образом мутировавшую последовательность,получают синтетическим путeм с помощью автоматического полинуклеотидного синтеза. Затем эту затравку отжигают на одноцепочечный вектор, включающий кодирующую белок последовательность, и обрабатывают ферментами с ДНК-полимеразной активностью, такими как фрагмент Клнова ДНК-полимеразы I E.coli, с целью завершения синтеза цепи, включающей мутацию. Таким образом, мутантная последовательность и вторая цепь несут желательную мутацию. Такой гетеродуплексный вектор затем используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки E.coli штамма JM101, а после этого отбирают те клоны, которые несут рекомбинантные векторы, включающие желательную мутантную последовательность. После отбора такого клона мутантная последовательность белка RAP-2 может быть выделена и встроена в состав подходящего вектора- обычно трансферного или экспрессирующего вектора такого типа, который может быть использован для трансфекции подходящего организма-хозяина. Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок RAP-2, также может быть детектирован, получен и (или) модифицирован in vitro, in situ и (или) in vivo с применением известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как ПЦР и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР обеспечивает амплификацию (увеличение в количестве) конкретных последовательностей ДНК за счeт повторяющихся реакций полимеризации ДНК. Эта реакция может быть использована вместо клонирования: единственно что для этого требуется, это установление нуклеотидной последовательности. С целью осуществления ПЦР затравки конструируют таким образом, чтобы они были комплементарны представляющей интерес последовательности. Затем затравки получают путeм автоматического синтеза ДНК. Поскольку затравки могут быть выстроены таким образом, 004062 36 чтобы гибридизовать с любым участком данного гена, то могут быть выбраны такие условия,что могут возникать ошибки при спаривании комплементарных оснований. Амплификация этих ошибочных участков может приводить к синтезу мутантного продукта, в результате чего будет образовываться пептид, характеризующийся новыми свойствами (т.е. это и будет направленный мутагенез): см. также, например,Ausubel, цит. выше, глава 16. Также путeм сочетательного синтеза комплементарной ДНК(кДНК) с использованием обратной транскриптазы в ПЦР в качестве исходного материала может быть использована РНК для целей синтеза внутриклеточного домена рецептора пролактина без клонирования. Более того, ПЦР-затравки могут быть сконструированы таким образом, чтобы включать новые рестрикционные сайты или другие элементы, такие как стоп-кодоны, по концам генного сегмента, который будет амплифицироваться. Такое внесение рестрикционных сайтов по 5'- и 3'-концам амплифицированной генной последовательности обеспечит генному сегменту, кодирующему белок RAP-2 или его фрагмент, возможность лигирования на другие последовательности и (или) по сайтам клонирования в составе векторов. ПЦР и другие методы амплификации РНК и (или) ДНК хорошо известны в науке и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без дополнительных экспериментов, основываясь на представленной здесь информации. Известные методы амплификации ДНК и РНК включают, тем самым не ограничиваясь, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и сходные амплификационные процессы (см., например, патенты США 4683195, 4683202,4800159, 4965188, выданные Mullis et al.,4795699 и 4921794, выданные Tabor et al.,5142033, выданный Innis, 5122464, выданныйRingold, а также Innis et al., (eds.), PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) и опосредованную РНК амплификацию, в которой в качестве матрицы используется РНК, являющаяся антисмысловой по отношению последовательности-мишени, для целей синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5130238, выданный Malek et al.: торговая марка способаNASBA), и иммуно-ПЦР, в которой сочетается использование амплификации ДНК с мечением антител (Ruzicka et al., 1993, Science, 260, 487;Sano et al., 1992, Science, 258, 120; Sano et al.,1991, Biotechniques, 9, 1378), при том, что полное содержание этих патентов и научных публикаций включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. 37 Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков RAP-2 (например,любых RAP-2 или его изоформ) могут быть получены в соответствии с описанным выше в отношении аналогов белков RAP-2. Подходящими фрагментами белков RAP-2 являются те фрагменты, которые сохраняют активностьRAP-2 и которые могут модулировать или опосредовать биологическую активность RIP или других белков, ассоциирующихся с RIP напрямую или косвенно. Соответственно, могут быть получены такие фрагменты белков RAP-2, которые будут проявлять доминантно-негативный или доминантно-позитивный эффект так же, как было отмечено выше для аналогов. Необходимо отметить, что эти фрагменты представляют отдельный класс аналогов по настоящему изобретению, а именно они определяются как участки белков RAP-2, производные от полноразмерной последовательности белка RAP-2 (например,последовательности любого RAP-2 или их изоформ), при том, что каждый участок или фрагмент обладает любой из описывавшихся выше активностей. Такой фрагмент может быть, например, пептидом. Сходным образом производные могут быть получены с помощью стандартных модификаций боковых цепей одного или большего числа аминокислотных остатков в составе белкаRAP-2, его аналогов или фрагментов или путм соединения белка RAP-2, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в данной области техники. Соответственно, по использованию в данном тексте термин производные охватывает производные, которые могут быть получены на основе функциональных групп, которые имеются в составе боковых цепей остатков, находящихся наN- или С-концах, с применением известных в науке методов, и эти производные также попадают в объeм настоящего изобретения. Производные могут являться химическими составляющими, такими как остатки углеводов и фосфатов, образуя фракцию, которая будет обладать такой же или более высокой биологической активностью по сравнению с белками RAP-2. Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп,амиды карбоксильных групп за счeт реакции с аммонийной группой с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образуемые ацильными составляющими (например, алканоильными или карбоциклоароильными группами), или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп(например, у остатков серина или треонина),образуемые ацильными составляющими. Термин производные призван включить только те производные, в которых не происходит замен одной аминокислоты на другую ами 004062 38 нокислоту в пределах двадцати встречающихся в естественных условиях аминокислот.RAP-2 является белком или полипептидом,например, последовательностью, составленной остатками аминокислот. Полипептид, включающий более крупные последовательности,которыми является полная последовательность белка RAP-2 в соответствии с данными здесь определениями, попадает в объeм настоящего изобретения, если длина такого полипептида за счeт имеющихся вставок не обусловливает нарушения основных и новых параметров по настоящему изобретению, т.е. если он либо сохраняет, либо усиливает биологическую активность белка RAP-2, или же он может быть расщеплн с образованием белка или полипептида, обладающего биологической активностью белкаRAP-2. Таким образом, например, настоящее изобретение представляет химерные белки,включающие белок RAP-2 и другие аминокислоты или пептиды. Новый белок RAP-2, его аналоги, фрагменты и производные могут характеризоваться рядом путей использования, например:(1) белок RAP-2, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для модулирования функций белка RIP в отношении механизмов либо воспалений, либо гибели клеток, либо выживания клеток в соответствии с описанным выше. Например, если RAP-2 может модулировать влияние RIP на активацию транскрипционного фактора NF-B, JNK (киназы Jun) и киназы р 38, то такие эффекты RAP-2 будут приводить к усилению такого взаимодействияRAP-2/RIP, когда желательным будет использовать это в противоопухолевых, противо- и провоспалительных целях, против ВИЧ-инфекций и т.п. В этом случае белок RAP-2, его аналоги,фрагменты или производные, которые способны модулировать воспаления, усиливать цитотоксичность или блокировать эффект по поддержанию жизнеспособности клеток, могут быть внесены в клетки с помощью известных стандартных приeмов. Например, когда белок RAP-2 является внутриклеточным (как предполагается) и должен быть внесeн только внутрь тех клеток,на которые через RIP влияют FAS-лиганд илиTNF, или другие цитотоксичные белки, то необходимо использовать систему специфического внесения такого белка в такие клетки. Одним из путей решения этой проблемы является создание рекомбинантного вируса животного, например, производного от вируса коровьей оспы,к ДНК которого должны быть присоединены два следующих гена: ген, кодирующий лиганд,который связывается поверхностно-клеточными белками, специфически экспрессируемыми этими клетками, например, такой как белок gр 120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который специфически связывается на некоторых клетках (CD4-позитивные лимфоциты и родственные лейкозы), или любой иной лиганд, кото 39 рый специфически связывается с клетками, несущими рецепторы FAS-R или p55-R, в результате чего рекомбинантный вирусный вектор будет способен связываться на таких клетках,несущих рецепторы FAS-R или р 55-R; и ген,кодирующий белок RAP-2. Таким образом, экспрессия связывающегося на клеточной поверхности белка обеспечит вирусу специфичность в отношении опухолевой клетки или другой клетки, несущей рецепторы FAS-R или p55-R, как мишени, после чего последовательность, кодирующая белок RAP-2, будет внесена в клетки с помощью данного вируса, а после экспрессии в этих клетках произойдeт усиление опосредованного белком RIP влияния лиганда FAS-R илиTNF или независимого от RIP такого влияния. Конструирование такого рекомбинантного вируса животных основывается на стандартных процедурах (см., например, Sambrook et al.,1989). Другая возможность основана на внесении последовательностей белка RAP-2 (например, любого белка RAP-2 или их изоформ) в форме олигонуклеотидов, которые могут быть адсорбированы этими клетками с последующей их экспрессией внутри них.(2) Они могут быть использованы для подавления влияния лиганда FAS-R, TNF или родственного белка, опосредуемого белком RIP или независимого от RIP их влияния, например, в случаях повреждения тканей при септическом шоке, отторжении тканей при реакции трансплантат против хозяина или остром гепатите,при которых желательной является блокировка индуцируемых лигандом FAS-R или TNF сигналов через рецепторы FAS-R или p55-R, или их независимого от RIP влияния, или опосредуемого другими белками влияния при одновременном усилении механизма выживания клеток. В такой ситуации возможным является, например,внесение в клетки с помощью стандартных процедур олигонуклеотидов, включающих антисмысловые кодирующие последовательности белка RAP-2, которые бы эффективно заблокировали трансляцию мРНК, кодирующих белокRAP-2, тем самым блокируя его экспрессию и приводя к подавлению влияния лиганда FAS-R,TNF, RIP или других белков. Такие олигонуклеотиды могут быть внесены в клетки с использованием описанного выше подхода, основанного на рекомбинантных вирусах, при том, что второй последовательностью, включаемой в такой вирус, является данная олигонуклеотидная последовательность. Подобно описанному выше образом, в зависимости от природы взаимодействия междуRAP-2 и RIP, с применением описанных выше подходов (1) и (2) возможным может быть усилить или подавить клеточные механизмы воспаления и выживания, если это является желательным. Другая возможность определяется использованием антител, специфичных в отношении 40 белка RAP-2, с целью подавления его внутриклеточной сигнальной активности. Ещ одним путм подавления RIPопосредованных проявлений или независимых от RIP эффектов является применение недавно открытого рибозимного подхода. Рибозимы это каталитически активные молекулы РНК,которые специфически расщепляют другие РНК. Рибозимы могут быть выстроены искусственно так, чтобы расщеплять РНК-мишени по выбору, например, мРНК, кодирующие белокRAP-2 по настоящему изобретению. Такие рибозимы должны характеризоваться последовательностью, специфичной в отношении мРНК белка RAP-2, и должны быть способны взаимодействовать с ней (путм комплементарного связывания) с последующим расщеплением этой мРНК, в результате чего будет уменьшаться (или полностью утрачиваться) экспрессия белка RAP-2, при том, что степень такого уменьшения экспрессии будет зависеть от уровня экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для внесения рибозимов в выбранные клетки (например, клетки, несущие рецепторы FAS-R илиp55-R) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, векторы на основе вирусов животных (ретровирусов), которые обычно используются для этих целей (см. также описанный выше п.(1), в котором вирус в качестве второй последовательности будет включать кДНК, кодирующую данную выбранную рибозимную последовательность). (В качестве обзоров, описывающих рибозимные методы, см. Chen et al., 1992; ZhaoPick, 1993;Shore et al., 1993; JosephBurke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga,1993; Crisell et al., 1993; Koizumi et al., 1993). Такой подход применим тогда, когда взаимодействие RAP-2/RIP усиливает цитотоксичность в ситуациях, когда желательным является заблокировать эту цитотоксичность, или когда взаимодействие RAP-2/RIP подавляет активацию NF-B в такой же ситуации желательности блокировки такого подавления с целью интенсификации активации NF-KB, т.е. в обоих случаях желательным является повышение выживания клеток, как это описывалось в п.(2).(3) Белок RAP-2, его аналоги, фрагменты или производные также могут быть использованы для целей выделения, идентификации и клонирования других белков того же самого класса,т.е. тех белков, которые связываются с белкомRIP или на функционально родственных рецепторах или белках, участвующих во внутриклеточных сигнальных механизмах. В таком применении может быть использована упоминавшаяся выше двухгибридная дрожжевая система,или может быть использована недавно разработанная система, основанная на нежeстких условиях Саузерн-блот-гибридизации с последующим ПЦР-клонированием (Wilks et al., 1989). В публикации Уилкса с соавт. описывается иден 41 тификация и клонирование двух предполагаемых тирозинкиназ с применением нежeсткой гибридизации по Саузерну с последующим клонированием на базе ПЦР, основанных на известной последовательности киназного мотива т.е. заданной киназной последовательности. Такой подход может быть использован в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка RAP-2 с целью идентификации и клонирования родственных RIP-связывающихся белков.(4) Ещe один подход к использованию белка RAP-2 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению связан с их использованием в методах аффинной хроматографии, нацеленных на выделение и идентификацию других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например,других белков или факторов, вовлеченных во внутриклеточные сигнальные механизмы. В таком применении белок RAP-2, его аналоги,фрагменты или производные по настоящему изобретению могут быть по отдельности присоединены к матрицам для аффинной хроматографии и затем проконтактированы с клеточными экстрактами или изолированными белками или факторами, которые предположительно вовлечены во внутриклеточные сигнальные механизмы. По завершении процедуры аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые связываются с белком RAP-2 или с его аналогами, фрагментами или производными по настоящему изобретению, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.(5) Как отмечалось выше, белок RAP-2, его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению также могут быть использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для целей получения специфичных в отношении них антител. Такие антитела могут быть использованы для целей очистки белка RAP-2 (например самого RAP-2 или его изоформ) либо из клеточных экстрактов, либо из трансформированных клеточных линий, вырабатывающих белок RAP-2 или его аналоги или фрагменты. Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей в идентификации заболеваний, связанных с аномальным функционированием RIP-опосредованных систем лиганда FAS-R или TNF или не зависящих отRIP активностей, например, пониженных или повышенных клеточных эффектов, индуцируемых лигандом FAS-R или TNF, опосредуемых белком RIP или собственного влияния RIP на клетки. Таким образом, если такие заболевания связаны с нарушениями функционирования внутриклеточных сигнальных путей, вовлекающих белок RIP или различные другие упоминавшиеся выше RIP-связывающиеся белки или собственно белок RAP-2, то такие антитела будут служить в качестве эффективного диагностического средства.RAP-2 по настоящему изобретению могут быть осуществлены с использованием любой из известных в данной области техники стандартных процедур. Например, одна из таких процедур скрининга, а именно процедура на основе двухгибридной дрожжевой системы, подробно описанная ниже, была использована для идентификации белка RIP (см. Stanger et al., 1995) и затем- различных белков RAP-2 по настоящему изобретению (помимо ряда других новых белков,заявляемых упоминаемыми здесь выше и далее тематически связанными патентными заявками). Так же, как это описывалось выше и будет рассмотрено далее, другие процедуры, такие как аффинная хроматография, методы гибридизации ДНК и т.п., хорошо известные в данной области техники, могут быть применены для выделения, идентификации и охарактеризования белка RAP-2 по настоящему изобретению или для выделения, идентификации и охарактеризования дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.п., которые способны связываться с белками RAP-2 по настоящему изобретению. Как указывалось в данном тексте выше,белок RAP-2 может быть использован для получения антител, специфичных в отношении белков RAP-2, например, самого RAP-2 и его изоформ. Такие антитела или их фрагменты могут быть использованы в соответствии с подробно описанным здесь далее, и должно быть понятно,что в таких применениях антитела или их фрагменты - те, которые специфичны в отношении белков RAP-2. Основываясь на информации, полученной в соответствии с настоящим изобретением о том, что RAP-2 специфически связывается с RIP и вследствие этого является медиатором/модулятором RIP, а, следовательно, может опосредовать/модулировать активность белкаRIP в отношении механизмов воспалений, гибели клеток или выживания клеток, при том, чтоRIP функционирует сам по себе или во взаимодействии с другими белками (например, FAS-R,p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1 и TRADD в механизмах гибели клеток или с TRAF2 в механизмах выживания клеток), важным является создание лекарственных средств, которые могут усиливать или подавлять взаимодействие RAP2/RIP в соответствии с желаемым, в зависимости от того, какие из этих механизмов усиливаются/подавляются взаимодействием RAP-2/RIP. Известно много заболеваний, при которых такие лекарства могут оказать существенную помощь. Среди других заболеваний это острый гепатит,при котором острые поражения ткани печени,как представляется, отражают гибель печеночных клеток, опосредуемую лигандом рецептораFAS-R; индуцируемая аутоиммунитетом гибель клеток, такая как гибель -клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, как фак 43 тор диабета; гибель клеток при отторжении трансплантатов (например, пересаживаемых почек, сердца и печени); гибель олигодендроцитов в головном мозге при рассеянном склерозе; и подавляемая СПИДом Т-клеточная суицидальность, которая обусловливает воспроизведение вируса СПИД, а, следовательно, и сам синдром приобретенного иммунодефицита. Возможно, что белок RAP-2 или одна или несколько его изоформ могут служить в качестве естественных ингибиторов белка RIP в одном или нескольких упоминавшихся выше механизмов, а это, следовательно, можно использовать для специфического подавления RIP, о котором говорилось выше. Таким же образом другие субстанции, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т.п., могут быть подвергнуты скринингу с целью получения специфических лекарственных средств, которые бы были способны подавлять взаимодействие RAP2/RIP. Не являющийся в чeм-либо ограничивающим пример того, как пептидные ингибиторы взаимодействия RAP-2/RIP могут быть сконструированы и протестированы, основан на проведeнных исследованиях пептидных ингибиторов ICE или ICE-подобных протеаз, субстратной специфичности ICE и стратегий анализа эпитопов с использованием методов пептидного синтеза. Минимально необходимым для эффективного расщепления пептида под действием протеазы ICE было нахождение в нeм четырeх аминокислот от сайта такого расщепления при жeстком предпочтении остатка аспарагиновой кислоты в положении Р 1 и при достаточности наличия метиламина справа от сайта P1 (Sleathet al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al.,1992). Более того, флуорогенный пептидный субстрат, являющийся тетрапептидом, - ацетилAsp-Glu-Val-Asp-a-(4-метилкумарил-7-амид),сокращeнно обозначаемый как Ac-DEVD-AMC,- соответствует последовательности поли-АДФрибозополимеразы (ПРАП), расщепление которой обнаруживается в клетках вскоре после стимуляции рецептора FAS-R наряду с другими процессами апоптоза (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994), при том,что это расщепление эффективно осуществляется с участием СРР 32 (представитель семейства протеаз CED3/ICE) и протеаз МАСН (а также,по-видимому, и протеаз G1 - см., например, тематически связанную израильскую патентную заявку IL 120367). С учeтом того, что положение Р 1 должно быть занято остатком аспарагиновой кислоты,тетрапептиды, включающие в 4-м положении аспарагиновую кислоту и различные сочетания аминокислот в первых трeх положениях, могут быть подвергнуты оперативному тестированию на связывание с активным сайтом протеаз с применением, например, метода, разработанного Гейзеном (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987), в 44 котором большое число пептидов на тврдых подложках анализируют по специфическим взаимодействиям с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфичными пептидами может быть выявлено с помощью различных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как радиоактивное мечение протеаз G1 и т.п. В данном методе Гейзена, как было показано, возможно протестировать по крайней мере 4 тысячи пептидов за один рабочий день. Сходным образом точное положение участка связывания или участка гомологии, который определяет взаимодействие между RAP-2 иRIP, может быть установлено, после чего эти пептиды могут быть протестированы на потенциальную блокировку такого взаимодействия,например, пептиды, которые синтезированы таким образом, чтобы их последовательность характеризовалась сходством с участком связывания или была ему комплементарна, так, чтобы обеспечить конкуренцию нативному RAP-2 по связыванию с белком RIP. Лекарства или пептидные ингибиторы, которые способны подавлять воспалительную активность или активность RAP-2 по гибели клеток за счeт подавления взаимодействия междуRAP-2 и RIP, могут быть соединены или включены в комплексы с молекулами, которые облегчают проникновение внутрь клеток. В патенте США 5149782 заявляется соединение молекулы, которая предназначена для переноса через клеточную мембрану, с мембрано-проникающим агентом, таким как фузогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и жирные кислоты с длинными цепями, например, миристиновая кислота и пальмитиновая кислота. Эти мембрано-проникающие агенты вносят молекулярный конъюгат в липидный бислой клеточных мембран и облегчают тем самым его попадание в цитоплазму. В патенте США 5108921, выданномLow et аl., обобщены доступные способы трансмембранной доставки молекул, таких как, тем самым не исчерпываясь, белки и нуклеиновые кислоты, по механизму опосредованного рецепторами эндоцитоза. Такие рецепторные системы включают рецепторы, распознающие галактозу,маннозу, маннозо-6-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин B12), 2-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF). Авторами данного патента указывается на то, что пищевые рецепторы, такие как рецепторы биотина и фолатов, могут быть преимущественно использованы для интенсификации транспорта через клеточную мембрану, благодаря наличию и многочисленности биотиновых и фолатных рецепторов на поверхности плазмалеммы большинства типов клеток и существованием связанных с этими 45 рецепторами трансмембранных транспортных процессов. Таким образом, комплекс, образованный соединением, которое предназначено для доставки в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактируют с клеточной мембраной, несущей биотиновые или фолатные рецепторы с целью инициации опосредованного этими рецепторами механизма трансмембранного переноса, тем самым обеспечивая проникновение желательного соединения внутрь такой клетки. Кроме того, в науке известно, что соединение желательной пептидной последовательности с лидером (сигнальным сегментом последовательности) с получением химерного пептида сделает возможным транспортировку такого химерного пептида через клеточную мембрану с попаданием в цитоплазму. Как должно быть понятно специалисту в данной области техники, пептидные ингибиторы взаимодействия RAP-2/RIP в соответствии с настоящим изобретением включают в себя лекарства-пептидомиметики или ингибиторы, которые также могут быть оперативно протестированы по их связыванию с протеазой RAP2/RIP с целью получения по возможности наиболее стабильных ингибиторов. Также должно быть понятно, что аналогичный способ облегчения или повышения эффективности переноса пептидных ингибиторов через клеточные мембраны в соответствии с обсуждавшимся выше, также применим в отношении самих белка RAP-2 или его изоформ,равно как и других пептидов и белков, которые проявляют свое действие внутри клеток. Что касается антител, упоминающихся в настоящей заявке, то термин антитело призван включить в себя поликлональные антитела,моноклональные антитела (MAT), химерные антитела, антиидиотипические антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, равно как и их фрагменты, полученные с применением любого метода, такого как, тем самым не ограничиваясь, каталитического расщепления, пептидного синтеза или рекомбинантных методологий. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул иммуноглобулинов, производных от сыворотки животных, иммунизованных антигеном. Моноклональное антитело включает в существенной степени гомогенную популяцию антигенспецифичных антител, при том, что эта популяция несeт в существенной степени сходные сайты связывания эпитопа. Моноклональные антитела могут быть получены с применением методов, известных специалистам в данной области техники: см., например, KohlerMilstein, 1975,Nature, 256, 495-497; патент США 4376110;Immunology, Greene Publ. Assoc. and Wiley Intersci., NY: их полное содержание включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Такие антитела могут быть представлены иммуноглобулинами любого класса, включая IgG, IgM, IgE, IgG, GILD или любого их подкласса. Гибридома, вырабатывающая mAb по настоящему изобретению, может культивироваться in vitro, in situ или in vivo. Выработка высоких титров mAb in vivo или in situ делает эти варианты предпочтительными способами их получения. Химерные антитела - это молекулы, у которых различные сегменты являются производными от различных видов животных, такие как антитела, включающие вариабельные домены,производные от мышиных MAT, и константный домен иммуноглобулина человека. Химерные антитела, в первую очередь, используются с целью снижения иммуногенности в ответ на их применение и с целью повышения уровня их выработки, например, тогда, когда мышиныеMAT МАТ-стантный домен иммуноглобулина человека. Химерные антитела, в первую очередь, используются с целью снижения иммуногенности в ответ мышино-человеческие моноклональные антитела. Химерные антитела и способы их получения известны в науке (CabillyUSA, 81, 6851-6855; Boulianne et al., 1984, Nature, 312, 643-646; Cabilly et al., европейская патентная заявка 125023, опубликованная 14 ноября 1984 г.; Neuberger et al., 1985, Nature,314, 268-270; Taniguchi et al., европейская патентная заявка 171496, опубликованная 19 февраля 1985 г.: Morrison et al., европейская патентная заявка 173494, опубликованная 5 марта 1986 г.; Neuberger et al., патентная заявка РСТ 184187, опубликованная 13 марта 1986 г.;Kudo et al., европейская патентная заявка 184187, опубликованная 11 июня 1986 г.; Sahagan et al., 1986, J. Immunol., 137, 1066-1074;USA, 84, 214-218; Better et al., 1988, Science, 240,1041-1043; HarlowLine, Antibodies: A Laboratory Manual, цит. выше). Полное содержание этих публикаций включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Антиидиотипическое антитело - антитело,которое распознаeт уникальные эпитопы, в принципе,ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антиидиотипическое антитело может быть получено путeм иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, инбредной линии мышей) по отношению к источнику данного моноклонального антитела, к которому должно быть 47 получено антиидиотипическое антитело. Иммунизованное животное будет распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизующего антитела с выработкой антитела,специфичного в отношении этих идиотипов (т.е. антиидиотипическое антитело): см., например,патент США 4699880, который включн здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Само антиидиотипическое антитело может быть использовано в качестве иммуногена с целью индукции иммунного ответа ещe у одного животного с получением т.н. анти-антиидиотипического антитела. Анти-антиидиотипическое антитело может быть по эпитопам идентично исходному MAT, которое являлось индуктором антиидиотипического антитела. Следовательно, с использованием антител к идиотипическим детерминантам MAT возможным становится идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела, характеризующиеся идентичной специфичностью. Таким образом, моноклональные антитела,сформированные к белкам RAP-2, его аналогам,фрагментам или производным по настоящему изобретению, могут быть использованы для индукции антиидиотипических антител в подходящих животных, таких как мыши линииBALB/c. Клетки селезeнки таких иммунизованных мышей используются для выработки антиидиотипических гибридом, секретирующих антиидиотипические МАТ. Далее, антиидиотипические моноклональные антитела могут быть соединены с носителем, таким как гемоцианин молюска (KLH), и использованы для иммунизации мышей BALB/c дополнительно. Сыворотка таких мышей будут содержать антиантиидиотипические антитела, которые характеризуются связывающими свойствами с исходными MAT, специфичными в отношении эпитопа названных выше белка RAP-2 или его аналогов, фрагментов и производных. Таким образом, антиидиотипические моноклональные антитела имеют свои собственные идиотипические эпитопы - идиотопы, структурно сходные с оцениваемым эпитопом,таким как GRB белка-А. Термин антитело также призван включить и интактные молекулы, и их фрагменты,такие как, например, Fab и F(ab')2, которые способны связывать антиген. Фрагменты Fab иF(ab')2 лишены Fc-фрагмента из состава интактного антитела, легче выделяются из кровотока и могут проявлять меньший уровень неспецифического связывания по сравнению с интактным антителом (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med., 24,316-325). Должно быть понятно, что Fab и F(ab')2, и другие фрагменты антител, применимые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для детекции и количественного анализа белка RAP-2 в соответствии с 48 методами, заявленными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путeм протеолитического расщепления с применением таких ферментов, как папаин(для получения фрагментов F(ab')2). Про антитело говорится, что оно способно связываться с молекулой тогда, когда оно способно специфическим образом реагировать с данной молекулой так, чтобы связывать эту молекулу и это антитело. Термин эпитоп обозначает тот участок любой молекулы, который может быть связан антителом и который также может быть распознан таким антителом. Эпитопы, также называемые антигенными детерминантами, обычно включают химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислот или боковых цепей углеводов,и характеризуются специфической пространственной структурой, равно как характерными параметрами электрического заряда. Термин антиген - это молекула или часть молекулы, способная быть связанной антителом, которая дополнительно способна индуцировать выработку у животного антитела,способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может включать один или более одного эпитопа. В связи с названным выше специфическое реагирование обозначает то, что антиген будет реагировать в высокоизбирательной манере с соответствующим антителом, но не со множеством других антител,которые могут быть инициированы другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител,применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для качественной или количественной детекции белка RAP-2 в образце или для выявления присутствия клеток, которые экспрессируют белок RAP-2 по настоящему изобретению. Это может быть осуществлено с применением иммунофлуоресцентных методов,основанных на флуоресцентном мечении антител (см. далее) и методах детекции на световом микроскопе, с помощью проточной цитометрии или флуорометрии. Антитела или их фрагменты, применимые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы гистологически при проведении иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии для детекции insitu белка RAP-2 по настоящему изобретению. Детекция in situ может быть осуществлена путм взятия гистологической пробы от пациента и наложения на полученный образец помеченного антитела по настоящему изобретению. Антитело (или фрагмент) предпочтительно наносят путм накрытия биологического образца помеченным антителом (или фрагментом). С помощью использования такой процедуры возможным является определить не только присутствие белка RAP-2, но и его распределение в анализи 49 руемой ткани. На основании настоящего изобретения специалист в данной области техники легко сможет понять, что любой из широкого круга гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) могут быть модифицированы с целью обеспечения данной детекции insitu. Данные тесты на выявление белка RAP-2 по настоящему изобретению обычно включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт,свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были проинкубированы в культуре, в присутствие выявляемо помеченного антитела, способного идентифицировать белок RAP-2, с последующим выявлением данного антитела с применением любого из методов, хорошо известных в данной области техники. Биологический образец может быть обработан твeрдофазной подложкой или носителем,такими как нитроцеллюлоза, или другими тврдыми подложками или носителями, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложка или носитель могут затем быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой выявляемо помеченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, как это отмечалось выше. Твeрдофазная подложка или носитель могут быть затем промыты буфером во второй раз с целью удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на упомянутой твeрдой подложке или носителе затем может быть определено с применением стандартных методов. Под твeрдофазной подложкой,твeрдофазным носителем, твeрдой подложкой, твердым носителем, подложкой или носителем понимается любая подложка или носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирен, полипропилен, полиэтилен, декстран, нилонамилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. По своей природе такой носитель может быть растворимым в некоторой степени или нерастворимым вовсе,исходя из целей настоящего изобретения. Материал подложки виртуально может характеризоваться любой структурной конфигурацией,лишь бы связанная на нм молекула была способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, форма подложки или носителя может быть сферической, как у шарика, цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки или внешняя поверхность палочки. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как у пластинки, тест-полоски и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистироловые шарики. Специалисту в данной области техники должны быть извест 004062 50 ны и другие подходящие носители для связывания на них антитела или антигена или они могут подобрать их с помощью рутинных экспериментов. Активность по связыванию данного набора антител по настоящему изобретению, как они описывались выше, может быть определена в соответствии с хорошо известными процедурами. Специалисты в данной области техники смогут определить оперативный и оптимальный тест для каждого такого тестирования с применением рутинного экспериментирования. Другие этапы, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное могут быть включены в данные тесты в зависимости от желательности или необходимости исходя из конкретной ситуации. Одним из путей, по которому антитело по настоящему изобретению может быть выявляемо помечено, является связывание его с ферментом с применением его в ферментном иммунотестировании (ЕIА). В свою очередь, данный фермент, после того как он будет обработан соответствующим субстратом, будет реагировать с этим субстратом таким образом, что образуется химическая составляющая, которая может быть детектирована, например, спектрометрически, флуорометрически или визуально. Ферментами, которые могут быть использованы для выявляемого мечения антител, являются,тем самым не исчерпываясь, малатдегидрогеназа, нуклеаза стафилококка, изомераза 5 стероидов, алкогольдегидрогеназа дрожжей, глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза,аспарагиназа,глюкозоксидаза,галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза,глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Детекция может быть осуществлена с помощью колориметрических методов, в которых для данного фермента используется хромогенный субстрат. Также детекция может быть осуществлена путeм визуального сравнения степени каталитической реакции субстрата в сравнении со стандартами,приготовленными аналогичным образом. Детекция может быть осуществлена с использованием любого из других иммунологических тестов. Например, с помощью радиоактивного мечения антител или фрагментов антител возможным является выявление RPTP-азы путeм использования радиоиммунотестирования (RIA). Подробное описание метода RIA может быть найдено в лаборатории LaboratoryAn Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques, написанной Т. Chard: включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Радиоактивный изотоп может быть 51 детектирован с помощью таких способов, как использование счетчика сцинтилляций, или авторадиографически. Также возможным является мечение антитела в соответствии с настоящим изобретением с использованием флуоресцентного соединения. Когда флуоресцентно помеченное антитело облучают при необходимой длине волны, то его присутствие определяется благодаря флуоресценции. Среди наиболее часто применяемых флуоресцентных метящих соединений - флуоресцеина изотиоцианат, родамин, фикоэритрин,пикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин. Также антитело может быть выявляемо помечено с использованием эмиттирующих металлов, таких как изотоп 125 Е или другие лантаноиды. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с помощью групп-хелаторов таких металлов, таких как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Также антитело может быть помечено путeм его соединения с хемолюминесцентным соединением. Присутствие хемолюминесцентно помеченного антитела затем определяют по выявлению присутствия люминесценции, которая наблюдается в ходе химической реакции. Примерами конкретно применимых хемюминесцирующих метящих соединений являются люминол, изолюминол, тероматический эфир акридиния, имидазол, соли акридиния и щавелевый эфир. Также биолюминесцентное соединение может быть использовано для мечения антитела по настоящему изобретению. Биолюминесценция - это форма хемолюминесценции, имеющей место в биологических системах, в которых обладающие каталитическими свойствами белки повышают эффективность реакции хемолюминесценции. Присутствие биолюминесцентного белка определяется путм выявления присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями, пригодными для целей мечения, являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекула антитела по настоящему изобретению может быть адаптирована для применения в иммунометрическом тесте, также известном как двухсайтовый тест или сэндвичтест. В типичном иммунометрическом тесте некое количество непомеченного антитела (или фрагмента антитела) связывается с твeрдой подложкой или носителем, а некое количество выявляемого помеченного растворимого антитела добавляется так, чтобы обеспечить выявление и(или) количественное определение тройного комплекса, образуемого тврдофазным антителом, антигеном и помеченным антителом. Обычные и в то же время предпочтительные иммунометрические тесты включают форвард-тесты, в которых антитело, связанное на твердой подложке, вначале контактируют с об 004062 52 разцом, тестируемым на предмет экстракции антигена из данного образца путем образования двойного комплекса антиген-антитело в твердой фазе. После подходящего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца,включающего непрореагировавший антиген,если он там есть, и затем контактируют с раствором, содержащем неизвестное количество помеченного антитела (которое является репортерной молекулой). После второго периода инкубации, необходимого для соединения помеченного антитела с комплексом с антигеном,связанным на твердой подложке или носителе через непомеченное антитело, твердую подложку или носитель промывают во второй раз с целью удаления непрореагировавшего помеченного антитела. В другом варианте сэндвич-теста, который также может быть применн с в отношении антигенов по настоящему изобретению, используются так называемые одновременные и реверсные тесты. Одновременный тест включает единый этап инкубации, в котором антитело, связанное на твердой подложке или носителе, и помеченное антитело добавляют к образцу, который должен быть протестирован, в одно и то же время. По завершении инкубации твердую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца и не вошедшего в комплекс помеченного антитела. Присутствие помеченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем,затем определяют, как и в обычном форвардсэндвич-тесте. В реверсном тесте применяется последовательное добавление сначала раствора помеченного антитела к жидкому образцу с последующим добавлением непомеченного антитела,связанного с твердой подложкой или носителем после подходящего времени инкубации. После второй инкубации тврдую фазу промывают стандартным образом для освобождения ее от остатка тестируемого образца и раствора непрореагировавего помеченного антитела. Затем определение помеченного антитела, ассоциированного с твeрдой подложкой или носителем,проводят так же, как в одновременном и форвард тестах. Белки RAP-2 по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любой стандартной методики рекомбинантной ДНК (см.,например, Sambrook et al., 1989 и Ausubel et al.,1987-1995, цит. выше), в которых подходящие эукариотические или прокариотические клеткихозяева, хорошо известные в данной области техники, трансформируют с использованием подходящих эукариотических или прокариотических векторов, включающих последовательности, кодирующие белки. Соответственно, настоящее изобретение также касается таких экспрессирующих векторов и трансформированных 53 организмов-хозяев для целей выработки белков по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, эти белки также включают биологически активные аналоги, фрагменты и производные, а,следовательно, векторы, их кодирующие, также включают векторы, кодирующие аналоги и фрагменты данных белков, а трансформированные организмы-хозяева включают тех, которые вырабатывают такие аналоги и фрагменты. Производные этих белков, вырабатываемых данными трансформированными организмамихозяевами, являются производными, получаемыми с помощью стандартных модификаций белков или их аналогов или фрагментов. Также настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки RAP-2, при том,что такой вектор также кодирует поверхностный вирусный белок, способный связываться со специфическими поверхностными белками клетки-мишени (например, опухолевых клеток),что обеспечивает внесение последовательностей белка RAP-2 внутрь этих клеток. Дополнительно фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат в качестве активного компонента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности гена RAP-2, или (b) лекарственные средства, которые блокируют взаимодействие RAP2/RIP. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат количество активного компонента, достаточное для достижения поставленной задачи. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая наполнители и добавки, которые облегчают преобразование активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически, и которые могут стабилизировать такие препараты с точки зрения их введения пациенту в случае необходимости в этом, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Белок RAP-2 и его изоформы или изотипы,как предполагается, экспрессируются в различных тканях на отчетливо различающемся уровне и, по-видимому, также с различным составом изотипов по аналогии с параметрами экспрессии различных других белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных механизмах, что обсуждается в называвшихся выше тематически связанных патентных заявках. Эти различия, как предполагается, могут определять различия в ответах разных тканей на лиганд Fas/APO1 иTNF. Как и в случае с другими СЕD3/IСЕгомологами (Wang et al., 1994; Alnemri et al.,1995), заявители настоящего изобретения ранее показали (в упоминавшихся выше патентных заявках), что изоформы МАСН, которые вклю 004062 54 чают сегменты неполной гомологии с CED3/ICE(например, МАСН 3), как было показано, обладают ингибиторным влиянием на активность одновременно экспрессируемых молекулMACH1 или МАСН 2; также они блокируют гибель клеток, индуцируемую рецепторамиFas/-APO1 и p55-R. Экспрессия таких изоформингибиторов в клетках может участвовать в механизме клеточной самозащиты от цитотоксичности, опосредуемой Fas/APO1 и TNF. Сходный эффект ингибирования по крайней мере некоторых изоформ протеазы G1 также предполагается(G1 - недавно выделенный новый Mch4- и предположительно МАСН-связывающийся белок, а также MORT1-связывающийся белок, в составе которого имеется MORT-домен и протеазный домен: см. тематически связанную израильскую патентную заявку IL 120367). Значительная разнородность изоформ МАСН, а также предполагаемая столь же существенная гетерогенность изоформ G1, которые в значительной степени превосходят таковые, известные для других представителей протеазного семействаCED3/ICE, должна обеспечивать тонкую настройку функций активных изоформ МАСН, а по аналогии - и активных изоформ G1. Следовательно, как отмечалось выше, белки RAP-2 и его вероятные изоформы могут обладать дифференцированными эффектами в различных тканях с точки зрения их взаимодействия с белкомRIP и тем самым влиянием на баланс между механизмами активации гибели клеток или выживания клеток, о которых говорилось выше. Также является возможным, что некоторые из вероятных изоформ RAP-2 выполняют отличающиеся функции. Например, сам белок RAP2 или некоторые изоформы RAP-2 также могут выполнять роль депо-сайтов для молекул,которые участвуют в других, не связанных с цитотоксичностью, проявлениях рецепторовRIP или даже независимо от RIP. Благодаря уникальной способности рецепторов Fas/APO1 и TNF обусловливать воспаления, гибель клеток, равно как и способности рецепторов TNF обусловливать другие активности по повреждению тканей, нарушение функций этих рецепторов может, в частности, иметь отрицательные последствия для организма. Действительно, и избыточные, и дефектные функции этих рецепторов, как было показано,участвуют в патогенезе различных заболеваний(Vassalli, 1992; NagataGolstein, 1995). Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной активности рецепторов и обнаружение путей модулирования активности таких молекул может позволить найти новые терапевтические подходы. Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из нижеследующих примеров. Теперь настоящее изобретение будет более подробно охарактеризовано с помощью ниже 55 следующих, не являющихся в чем-либо ограничивающими примеров и сопровождающих чертежей. Необходимо отметить, что следующие процедуры:(1) двухгибридный скрининг и двухгибридный тест на экспрессию -галактозидазы; (2) индуцированная экспрессия, метаболическое мечение и иммунопреципитация белков; (3) связывание in vitro; (4) оценка цитотоксичности; иal., 1996) и 4, см. ниже, по отношению к MORT1 и МОRT1-связывающему белку (например,белку МАСН), равно как и нового выделенного белка G1 (см. заявку IL 120367), - в одинаковой степени применимы (с небольшими модификациями) для соответствующего выделения, клонирования и охарактризования белка RAP-2 и его вероятных изоформ по настоящему изобретению. Следовательно, эти процедуры могут быть истолкованы, как полное представление таких процедур, используемых для выделения,клонирования и охарактеризования RAP-2 в соответствии с настоящим изобретением, что подробно описано, например, в такой же или эквивалентной формах в тематически связанных израильских патентных заявках 114615,114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, равно как и соответствующей заявке РСТPCT/US 96/10521. Далее, что касается белка NIK и его роли в активации фактора NF-B, а, следовательно, и выживания клеток, а также ролиTRAF2 в этом механизме выживания клеток,например, за счт взаимодействия междуTRAF2 и RIP и другими белками, то они подробно описаны заявителями настоящего изобретения в тематически связанных израильских патентных заявках IL 117800 и IL 119133 и уMalinin et al., 1997. Пример 1. Клонирование и выделение белка RAP-2, который связывается с белком RIP. Двухгибридный скрининг, секвенирование и предварительный анализ. С применением двухгибридного скрининга с использованием в качестве наживки белкаRIP (см., например. FieldsSong, 1989, международная патентная заявка WO 96/18641) в библиотеке В-лимфоцитов был выделен клон размером примерно 1500 пар нуклеотидов. Этот 1500-нуклеотидный клон (см. стрелку на фиг. 1 и 2) использовали для скрининга фаговой библиотеки кДНК, получив в результате клон длиной примерно 2000 пар нуклеотидов, нуклеотидная последовательность которого показана на фиг. 1. Путем сопоставления EST-маркeров с последовательностью 1500-нуклеотидного клона был выделен EST-фрагмент, который представлял 3'-конец элемент I.M.A.G.E. клона 41072(Research Genet. Inst.). Из состава этого клона, 004062 56 происходящего из библиотеки плодного головного мозга, были опубликованы ранее только небольшие 3'- и 5'-концевые фрагменты последовательностей. После выделения этого клона он был секвенирован, и было выяснено, что даже небольшие опубликованные участки включали содержали ошибки. Как было установлено,секвенированный клон (фиг. 2) был идентичен клону, показанному на фиг. 1, по его кодирующему участку, но характеризовался отличиями по 5'-некодирующему сегменту. Таким образом,было предположено, что обе эти кДНК представляют собой продукты альтернативного сплайсинга транскрипта одного и того же гена. Анализ данной нуклеотидной последовательности показывает, что, как и белок RAP,белок RAP-2, по-видимому, не имеет домена гибели в свом составе, не имеет т.н. MORTмодуля, не имеет протеазного домена, характерного для членов семейства ICE, не имеет киназного домена, а также не включает TRAFдоменов (см. приводившиеся выше тематически родственные патентные заявки и различные библиографические ссылки, в частности, на работу Malinin et al., 1997, в связи с ролью различных доменов во внутриклеточных сигнальных механизмах). В составе данной последовательности не было выявлено сколько-нибудь значимых доменов, за исключением трх мотивов типа лейциновой молнии - подобные блоки равномерно распределены по длине кодирующей белок последовательности. Эти домены названы подобными лейциновым молниям потому, что в двух из них имеются замены лейцина на валин, метионин или изолейцин. Поскольку обычно эти домены высококонсервативны, пока неясно, сохраняют ли белку такие изменения в составе лейциновых молний его функциональную активность, а именно связывание с другими лейциновыми молниями. Анализ на связывание показал, что RAP-2 в существенной степени связывается с RIP, но RAP2 не способен связываться с белками TRADD,MORT-1, p55-R, p74-R и МАСН (в объeме исследований, проведeнных к настоящему времени). Полученные результаты подтверждают тот факт, что RAP-2, по-видимому, лишeн доменов гибели и MORT-модулей. Следовательно, считается, что RAP-2 является узкоспецифичным RIP-связывающим белком, который взаимодействует/связывается с белком RIP очень специфическим образом. Таким образом, RAP-2, по-видимому, является специфичным модулятором/медиатором внутриклеточной активности RIP, играющим важную роль в модуляции/опосредовании с участием RIP механизмов воспалений, гибели клеток и выживания клеток. Вкратце, клон RAP-2 был получен в процедуре двухгибридного скрининга библиотеки кДНК В-клеток человека с использованием в качестве наживки полноразмерного белкаRIP. Последовательность RIP была взята из предыдущих публикаций (например, Stanger et al.,1995), как депонированная в базу данных GenBank подU-25994, которая является последовательностью RIP человека (также подU25995 присутствует последовательность белкаRIP мыши). На основании этой информации о последовательностях затравки для ПЦР были сконструированы с помощью программного продукта OLIGO4, а фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей части гена RIP, был получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной на материале тотальной РНК библиотеки фибробластов человека (с помощью стандартных процедур). Этот кодирующий участок RIP затем был клонирован в состав вектора pGBT-9 (Clontech) и использован в качестве наживки в соответствии с отмечавшимся выше для двухгибридной тест-процедуры. При таком двухгибридном скрининге был выделен клон, кодирующий RIPсвязывающийся белок, который взаимодействует с RIP. Этот клон, как отмечено выше, был использован для скрининга фаговой библиотеки кДНК и базы данных по маркeрам EST. Как можно видеть из фиг. 1 и 2, кодирующие последовательности двух клонов идентичны, в то время как 5'-некодирующие участки различаются. Таким образом, предполагается, что они являются формами, образующимися в результате альтернативного сплайсинга. Длина клонов составляет примерно 2000 пар нуклеотидов, на долю ORF (открытой кодирующей рамки) приходится примерно 1500 пар нуклеотидов, а расчeтная молекулярная масса кодируемого ими белка составляет примерно 50 кД. Расшифрованная аминокислотная последовательность белка RAP-2 показана на фиг. 3. Анализ указанных выше последовательностей клона RAP-2 и последовательностей в базе данных dbest, базе данных проекта Геном человека (level 1) и базе данных GenBank показал, что последовательность RAP-2 является уникальной (новой) последовательностью, потому что ни одна из известных последовательностей не проявила сколько-нибудь существенной гомологии с этой последовательностьюRAP-2. После подачи израильской патентной заявки IL 123758, приоритет которой поддерживается настоящей заявкой, Ямаокой с соавт.(Yamaoka et al., 1998) было сообщено о характеристике мышиной кДНК, кодирующей белок с молекулярной массой 48 кД, который был обозначен как NEMO (функциональный модулятор фактора NF-B) (см. раздел Предпосылки для изобретения). Дополнительные поиски в базах данных (insilico) позволили идентифицировать белок FIP-2- белок с неизвестными функциями, исходно клонированный Ли с соавт. (Y. Li et al., 1998: см. раздел Предпосылки для изобретения). 58 Как можно видеть из полноразмерного сопоставления последовательностей RAP-2 и FIP2 (фиг. 3 В), степень общего сходства весьма низка (поэтому неудивительно, что эта последовательность не была найдена при использовании общих алгоритмов такого скрининга). Гомология между RAP-2 и FIP-2 возрастает по направлению к С-концевой части этих белков, достигая виртуальной идентичности по С-концевым 30 аминокислотам. Заслуживает внимания и то,что, помимо, последнего участка, предполагаемый мотив типа лейциновой молнии в составеFIP-2 в существенной степени консервативен и в RAP-2 (за исключением аминокислотной замены изолейцина на аланин). Дополнительно также была идентифицирована более короткая кДНК RAP-2 длиной 500 пар нуклеотидов (ID 1469996), которая была обозначена как Human shrt. Этот вариант включал в себя блоки кодирующей последовательности, происходящие от разных разобщнных участков полной кДНК длиной 1500 пар нуклеотидов, механизм возникновения которых, повидимому, связан с альтернативным сплайсингном одного и того же гена. Анализ методом Нозерн-блоттинга с реактивами Multiple Tissue Northern blot (Clontech) сBglII-фрагментом длиной 900 пар нуклеотидов кДНК RAP-2 подтвердил комплексный характер мРНК RAP-2. По крайней мере 5 дифференцированных мРНК длиной от менее 1000 нуклеотидов до более 7 тысяч нуклеотидов были выявлены при более или менее постоянном доминировании вариантов длиной 2500 и 6500 нуклеотидов (фиг. 4 А). Пример 2. Идентификация RAP-2 мыши. Сходный поиск в коллекции маркeровEST, сформированной в TIGR, позволил выделить частичную кДНК длиной 1600 нуклеотидов (Mouse part, ID 761011; фиг. 3), которая предположительно соответствует RAP-2 мыши,поскольку она виртуально идентична (95%) гомологичной последовательности человека по кодирующему сегменту (см. фиг. 3). Тем не менее различия между последовательностями RAP-2 и NEMO человека и мыши превышают тот уровень, который может быть принят для нормальной межвидовой дифференцировки. Действительно, промежуточный блок из 7 аминокислот (249-е положение в 20.4) в последовательности RAP-2 мыши и в последовательности NEMO и вставка 3 аминокислот(KLE в 111-м положении) в кодирующей рамке последовательности NEMO по сравнению с полноразмерным вариантом человека и с частичной последовательностью мыши являются лишь наиболее отчeтливыми примерами различий (фиг. 3). Однако это может быть результатом отражений функциональных активностей данного белка. Функциональные свойства, действительно подтверждeнные для белка NEMO,по-видимому, противоположны таковым у RAP 59 2 человека, хотя сообщeнные результаты фракционного анализа NEMO подтверждают его локализацию в связи с сигналосомой. Пример 3. Связывание RIP с RAP-2 в клетках млекопитающих. Дальнейшее подтверждение физиологического значения взаимодействия RAP-2/RIP было получено в трансфицированных клетках линий НЕК-293 Т и HeLa. Действительно, эти два белка могут быть легко копреципитированы из клеточных лизатов клеток НЕК-293 Т (АТССCRL-1573), трансфицированных так, как это указано ниже каждой дорожки на фиг. 4 В, и иммунопреципитированных с анти-FLAG моноклональным антителом (Kodak). Затем иммунокомплексы анализировали по присутствию в них HIS/RAP-2 с применением стандартного Вестерн-блоттинга с использованием антитела к гексагистидину (Sigma) (фиг. 4 В, а также данные не включены). Однако образование такого комплекса не обусловливает каталитической активности RIP: в той степени, в какой можно судить по данным теста на киназную активность иммунокомплексов in vitro, сверх-экспрессияRAP-2 (данные не показаны). Тесты на связывание были проведены с целью определения того, связывается ли RAP-2 с любым из других известных внутриклеточных сигнальных белков. В этих тестах белкиTRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH были протестированы по их способности связываться с белком RAP-2. Однако было установлено, чтоRAP-2 не способен связываться ни с одним из этих белков. Также RAP-2 не связывается с любым из тестированных контрольных белков,например, с ламином и циклином-D. Все приведeнные выше результаты, таким образом, указывают на то, что новый белокRAP-2, по-видимому, взаимодействует с RIP по высокоспецифичному типу, а раз так, то он является высокоспецифичным модулятором/медиатором RIP. Пример 4. Взаимодействие RAP-2 с NIK и модуляция им транскрипции, контролируемойNF-B и c-Jun. Хотя при проведении двухгибридных дрожжевых тестов не было взаимодействияRAP-2/NIK (см. выше), эксперименты по трансфекции клеток НЕК-293 Т млекопитающего показали стабильное образование такого комплекса. Взаимодействие RAP-2/NIK было выявлено в соответствии с описанным в примере 3, за исключением того, что анти-FLAG антитела были использованы в методе Вестерн-блоттинге с последующей иммунопреципитацией с антителами к гексагистидину (фиг. 4 С). Такое несоответствие между параметрами связывания в дрожжевых клетках и клетках млекопитающего не было удивительным, поскольку полноразмерная NIK имеет тенденцию терять свои свя 004062 60 зывающие свойства в случае экспрессирования в клетках дрожжей. С точки зрения того факта, что in vivo иRIP, и NIK, как предполагается, являются обязательными медиаторами TNF-индуцируемой активации транскрипционного фактора NF-B,заявители изучали то, способна ли избыточная экспрессия RAP-2 в клеточной культуре взаимодействовать с этим конкретным сигнальным механизмом. Исходный набор экспериментов был проведн на клетках НЕК-293 Т, по непостоянному типу трансфицированных репортерными плазмидами, включающими ген люциферазы, находящийся под контролем минимального промотора HIV-LTR. В близком наборе, в котором было установлено, что RAP-2 подвергается негативной регуляции, который возвращается почти на исходный уровень, активация репортера обусловливалась и сверхэкспрессией различных известных индукторов NF-B, вовлечнных в сигнальный путь TNF (NIK,TRAF2, RIP и др.), и обработкой клеток внешними стимулами (TNF и РМА: фиг. 5 А). Клетки НЕК-293 Т были по непостоянному типу трансфицированы репортерной плазмидой (активационные тесты с HIV-LTR-Luc или CMV-Luc дляNF-KB - 5 А; и GAL4-Luc для c-Jun - 5 В) и экспрессирующим вектором для конкретного индуктора, а также либо пустым носителем(pcDNA3), либо плазмидой, кодирующей полноразмерный белок RAP-2 (pcRAP-2). Нужно отметить, что тот факт, что RAP-2 способен проявлять свои эффекты на таком далком этапе сигнального пути, как фактор RelA, свидетельствует о том, что по крайней мере отчасти активность данного белка должна быть общей для разных, другими словами дивергировавших,сигнальных механизмов (см. далее). В то же время B-независимая (контролируемая ранним промотором CaMV) транскрипция люциферазы не нарушается (фиг. 5 А): следовательно, можно считать подтвержднной общую несогласованность базового механизма транскрипции/трансляции с участием RAP-2. Эти результаты были после этого подтверждены в анализе на клетках линии HeLa (данные не включены). Однако, в ходе проведения дальнейших тестов было установлено, что данное явление оказывается ещ более сложным. Действительно, когда TRAF2 был по перемежающемуся типу экспрессирован в клетках НЕК-293 Т наряду с различным количеством pcRAP-2, что отображено на фиг. 6, активность RAP-2 резко изменялась при его низких концентрациях (примерно 20 нг на 1 млн. клеток), усиливая эффектTRAF2/-NF-B-индукции транскрипции (см. фиг. 6 А). Более того, путем замены исходной вставки на вставку в противоположной ориентации был получен эффективный носитель, экспрессирующий антисмысловую последовательность RAP-2, и TRAF2 по перемежающемуся