Антитела против эндоглина
Формула / Реферат
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93, где
указанная вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (G) на аланин (А) или серин (S) в положении 49; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 51; замены лизина (K) на аргинин (R) или аспарагин (Q) в положении 52b; замены лейцина (L) на валин (V) в положении 78 согласно системе нумерации по Kabat; и
вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены метионина (М) на лейцин (L) в положении 4; замены аланина (А) на валин (V) в положении 19; замены треонина (Т) на серин (S) в положении 22; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 48 и замены треонина (Т) на серин (S) в положении 51 согласно системе нумерации по Kabat.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 или 92; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 или 103.
4. Антигенсвязывающий фрагмент по п.1, представляющий собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, одноцепочечный связывающий полипептид, Fd-фрагмент, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или dAb-фрагмент.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, дополнительно связанные с противоопухолевым агентом или ингибитором ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и с тем и с другим.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является токсином, который представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является лекарственным средством, которое представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является радионуклидом, который представляет собой радиоактивный металл.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является цитокином, который представляет собой трансформирующий фактор роста (TGF)-β, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является фотодинамическим агентом, который представляет собой порфирин или его производное.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный лиганд представляет собой биотин.
12. Композиция для лечения связанного с ангиогенезом заболевания, которая связывает эндоглин, содержащая эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2 и приемлемый носитель или эксципиент.
13. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2.
14. Способ лечения связанного с ангиогенезом заболевания у субъекта, включающий введение композиции по п.12.
15. Способ по п.14, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связаны с противоопухолевым агентом или ингибитором ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и с тем и с другим.
16. Способ по п.14, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом/неоваскуляризацией, диабетическую нефропатию, воспалительное заболевание кишечника (IBD), ревматоидный артрит, остеоартрит, рак или метастаз.
17. Способ по п.16, где глазное заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна.
18. Способ по п.16, где глазное заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.
19. Способ по п.16, где рак представляет собой солидную опухоль.
20. Способ по п.16, где рак представляет собой эпителиальную опухоль.
21. Способ по п.16, где рак выбран из рака легкого, гинекологической злокачественной опухоли, меланомы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака матки, колоректального рака, рака предстательной железы, рака почки, рака головы, рака поджелудочной железы, рака печени, рака шеи, саркомы, миеломы и лимфомы.
22. Способ по п.14, дополнительно включающий введение одного или более ингибиторов ангиогенеза.
23. Способ по п.22, где ингибитор ангиогенеза представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор рецептора VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), ингибитор VEGF или их комбинацию.
24. Способ по п.14, где композицию вводят в количестве примерно 0,01, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175 или примерно 200 мг/кг массы тела пациента.
25. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является токсином, который представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
26. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является лекарственным средством, которое представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин.
27. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является радионуклидом, который представляет собой радиоактивный металл.
28. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является цитокином, который представляет собой трансформирующий фактор роста (TGF)-β, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
29. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является фотодинамическим агентом, который представляет собой порфирин или его производное.
30. Способ по п.15, где указанный лиганд представляет собой биотин.
31. Способ по п.23, где ингибитор рецептора VEGF выбран из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба, афлиберцепта, сунитиниба, сорафениба, акситиниба, пегаптаниба и пазопаниба.
Текст
Изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают эндоглин. Один из аспектов изобретения относится к композиции для лечения связанного с ангиогенезом заболевания, содержащей эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. Другой аспект относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Другой аспект относится к способу лечения связанного с ангиогенезом заболевания, включающему введение композиции по изобретению. 025174 Родственные заявки В данной заявке заявлен приоритет предварительной заявки США 61/247290, поданной 30 сентября 2009 г., и безусловной заявки США 12/751907, поданной 31 марта 2010 г.; описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Предшествующий уровень техники Эндоглин, среди прочего также известный как CD105 или edg-1, представляет собой гомодимерный мембранный гликопротеин I типа, который экспрессируется с высокими уровнями в пролиферирующих эндотелиальных клетках сосудов (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634). Таким образом,эндоглин главным образом представляет собой ассоциированный с пролиферацией маркер эндотелиальных клеток, подвергающихся активному ангиогенезу. Однако наблюдается ограниченная экспрессия эндоглина сосудистым эндотелием нормальных тканей (Burrows et al., выше; Wang et al., 1993, Int. J.Cancer, 54: 363-370). Известно, что человеческий эндоглин специфически связывается с трансформирующим фактором роста- (TGF-), и выведенная аминокислотная последовательность эндоглина имеет строгую гомологию с -гликаном, типом рецептора TGF-. Эндоглин (EDG) был мишенью в основанных на антителах способах сокращения сосудистой сети опухоли, поскольку EDG представляет собой ассоциированный с пролиферацией антиген эндотелиальных и лейкозных клеток. Его экспрессия активируется в опухолеассоциированном сосудистом эндотелии, и EDG является существенным для ангиогенеза. Ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящее к неоваскуляризации, а также поддержанию существующей сосудистой сети. Он представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, в том числе опосредованную эндотелиальными клетками деградацию базальной мембраны сосудов и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками. Описано несколько антител против эндоглина, в частности моноклональные антитела ("mAb") против эндоглина. mAb SN6 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей смесями гликопротеинов клеточных мембран лейкозных клеток человека (Haruta and Seon, 1986, Proc.Natl. Acad. Sci. 83: 7898-7902). SN6 представляет собой мышиное mAb, которое распознает человеческий эндоглин. mAb 44G4 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей цельноклеточными суспензиями пре-В лейкозных клеток человека (Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141: 1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265: 8361-8364). 44G4 также представляет собой мышиное mAb, которое распознает человеческий эндоглин. mAb MJ7/18 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации крыс кусочками воспаленной кожи мышей (Ge and Butcher, 1994, выше). Кроме того,MJ7/18 представляет собой mAb, которое распознает мышиный эндоглин. mAb Тес-11 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей эндотелиальными клетками пупочной вены человека (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634). Tec-11 представляет собой мышиное mAb с реактивностью, ограниченной человеческим эндоглином. Антитела против эндоглина представляют важную область для разработки терапий для лечения множества заболеваний и состояний, которые вовлекают ангиогенез, подвержены влиянию или воздействию ангиогенеза. Ангиогенез представляет собой физиологический процесс, посредством которого из уже существующих сосудов развиваются новые кровеносные сосуды (Varner, et al., Cell Adh. Commun. 1995, 3: 367374; Blood, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1032: 89-118; Weidner, et al., J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84: 1875-1887). Предполагают, что ангиогенез играет роль как в нормальных, так и в патологических процессах. Например, ангиогенные процессы вовлечены в развитие сосудистых систем органов и тканей животных. Эти процессы также вовлечены в транзисторные фазы ангиогенеза, например, во время менструального цикла, при беременности и при заживлении ран. С другой стороны, известно, что некоторые заболевания ассоциированы с нарушением регуляции ангиогенеза. При некоторых патологических состояниях происходит стимуляция ангиогенеза как средства для обеспечения адекватного снабжения кровью и питательными веществами клеток в пораженной ткани. Во многие из этих патологических состояний вовлечена аберрантная клеточная пролиферация и/или регуляция. Поэтому ингибирование ангиогенеза является потенциально полезным подходом к лечению заболеваний, которые характеризуются развитием новых кровеносных сосудов. Например, ангиогенез вовлечен в патологические состояния, включающие различные формы глазных или неглазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболевания (например,IBD (воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака, солидных опухолей и метастазов, и тому подобное.-1 025174 Изложение сущности изобретения Согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93. Также согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89, и вариабельную область легкой цепи,имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93, где указанная вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (G) на аланин (А) или серин (S) в положении 49; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 51; замены лизина (K) на аргинин (R) или аспарагин (Q) в положении 52b; замены лейцина (L) на валин (V) в положении 78 согласно системе нумерации по Kabat; и вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены метионина (М) на лейцин (L) в положении 4; замены аланина (А) на валин (V) в положении 19; замены треонина (Т) на серин (S) в положении 22; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 48; и замены треонина (Т) на серин (S) в положении 51 согласно системе нумерации по Kabat. В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 или 92; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 или 103. В еще одном воплощении антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, одноцепочечный связывающий полипептид, Fd-фрагмент, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или dAb-фрагмент. Кроме того, согласно данному изобретению предложены композиции для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, содержащие эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данной заявке, и приемлемый носитель или эксципиент. Кроме того, согласно данному изобретению предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке. В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению дополнительно мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент или ингибитор ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку,гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и тем и другим. Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ лечения связанного с ангиогенезом заболевания у субъекта, включающий введение композиции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке. В одном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент или ингибитор ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и тем и другим. В еще одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом/неоваскуляризацией, диабетическую нефропатию, воспалительное заболевание кишечника (IBD),ревматоидный артрит, остеоартрит, рак или метастаз. В более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретениию осуществляется, когда глазное заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна. В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда глазное заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию. В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак представляет собой солидную опухоль. В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак представляет собой эпителиальную опухоль. В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак выбран из рака легкого, гинекологической злокачественной опухоли, меланомы, рака-2 025174 молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака матки, колоректального рака, рака предстательной железы, рака почки, рака головы, рака поджелудочной железы, рака печени (гепатоцеллюлярного рака), рака шеи, саркомы, миеломы и лимфомы. В одном воплощении способ по настоящему изобретению дополнительно включает введение одного или более ингибиторов ангиогенеза. В предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда ингибитор ангиогенеза представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор рецептора VEGF(фактор роста сосудистого эндотелия), ингибитор VEGF или их комбинацию. В одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют, когда композицию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента вводят в количестве примерно 0,01, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40,примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175 или примерно 200 мг/кг массы тела пациента. В еще одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент, где указанный противоопухолевый агент представляет собой токсин, лекарственное средство, фермент, цитокин,радионуклид или фотодинамический агент. В предпочтительном воплощении вышеуказанный токсин представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанное лекарственное средство представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный радионуклид представляет собой радиоактивный металл. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный цитокин представляет собой трансформирующий фактор роста (TGF)-, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный фотодинамический агент представляет собой порфирин или его производное. В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению меченны репортерной молекулой, представляющей собой лиганд, где указанный лиганд представляет собой биотин. В еще одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент, где указанный противоопухолевый агент представляет собой токсин, лекарственное средство, фермент, цитокин, радионуклид или фотодинамический агент. В предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда вышеуказанный токсин представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный анатоксин,стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанное лекарственное средство представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный радионуклид представляет собой радиоактивный металл. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный цитокин представляет собой трансформирующий фактор роста (TGF)-, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный фотодинамический агент представляет собой порфирин или его производное. В еще одном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению меченны репортерной молекулой, представляющей собой лиганд, где указанный лиганд представляет собой биотин. Включение посредством ссылки Все публикации и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в данное изобретение посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки во всей своей полноте,если конкретно не указано иное. Эта заявка содержит ссылки на аминокислотные последовательности,которые приведены вместе с ней в виде текстового файла с перечнем последовательностей "35882-706202-SeqList.txt", с размером файла 67843 килобайт (кБ), созданного 30 марта 2010 г. Вышеупомянутый перечень последовательностей тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте в соответствии с 1.52(e)(5) главы 37 C.F.R. (Свод федеральных нормативных документов (Code of Federal Regulations.-3 025174 Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлена гуманизированная вариабельная область (VL) легкой цепи O2-V1-39, имеющая CDR из VL моноклонального мышиного химерного TRC105 (подчеркнуты), привитые между каркасными участками (FR) 1-3 человеческой последовательности O2-V1-39 и каркасным участком 4 из человеческой последовательности J4 (SEQ ID NO: 4) (все выделены жирным шрифтом). Вариации, которые могут быть внесены в человеческие FR, отмечены в положениях 1, 3, 4, 5, 36, 46, 47, 60, 70, 71, 100 и 106 данной последовательности (последовательность раскрыта в SEQ ID NO: 86) согласно системе нумерации по Kabat (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). На фиг. 2 представлена гуманизированная вариабельная область (VH) тяжелой цепи VH3-15, имеющая CDR из VH моноклонального мышиного химерного TRC105 (подчеркнуты), привитые между каркасными участками (FR) 1-3 человеческой последовательности VH3-15 и каркасным участком 4 из человеческой последовательности JH4 (SEQ ID NO: 42) (все выделены жирным шрифтом). Одна или более вариаций, которые могут быть внесены в человеческие FR, отмечены в положениях 49, 76, 77, 78, 82 а, 89,94, 108, 109 и 113 последовательности (последовательность раскрыта в SEQ ID NO: 87) согласно системе нумерации по Kabat (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). На фиг. 3 представлена диаграмма сигнального пути TGF-/ALK5. TGF-/ALK5-путь (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции. TGF-/ALK1-путь (В) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и миграцию и требует CD105 (эндоглин) для передачи сигнала через ALK1. Пунктирные линии обозначают неактивные или заблокированные пути. Стрелка, выделенная жирным шрифтом, обозначает стимуляцию сигнального пути.TGF-/ALK5-путь передачи сигнала (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции. TGF-/ALK1-путь (В) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и миграцию и требуетCD105 (эндоглин) для передачи сигнала через ALK1. На фиг. 4 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей типичной мышиной и гуманизированных VK-цепей (соответственно SEQ ID NO 1-5, в порядке появления) и VH-цепей (соответственно SEQ ID NO 39-43, в порядке появления), полученных согласно изобретению, изложенному в данном описании. На фиг. 5 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей типичной мышиной и супергуманизированных VK-цепей (соответственно SEQ ID NO 1 и 69-72, в порядке появления) и VHцепей (соответственно SEQ ID NO 39 и 73-75, в порядке появления), полученных согласно изобретению,изложенному в данном описании. На фиг. 6 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей и сравнение типичной мышиной и гуманизированных и супергуманизированных VK-цепей (соответственно SEQ ID NO 1, 3 и 70, в порядке появления) и VH-цепей (соответственно SEQ ID NO 39, 41 и 74, в порядке появления), полученных согласно изобретению, изложенному в данном описании. На фиг. 7 проиллюстрировано связывание конструкций гуманизированных вариантов с эндоглином в конкурентном ELISA-анализе. Фиг. 8. Анти-CD105 конкурентный ELISA с использованием гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител. Каждое антитело в различных концентрациях смешивали с биотинилированным эталонным антителом против CD105 в фиксированной концентрации (6,25 нг/мл) и осуществляли связывание с CD105 (100 нг/мл), захваченным на планшете Nunc MaxiSorp. Связывание определяли с помощью стрептавидин-HRP и субстрата ТМВ. Поглощение (OD) при 450 нм измеряли на планшет-ридере и строили график его зависимости от концентрации тестируемого антитела. На фиг. 9 проиллюстрированы данные анализа связывания для варианта VK1AAVH1A и VK2 содержащих контролей. На фиг. 10 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK1AAVH1 А 2 и VK2AAVH1 А 2. На фиг. 11 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK2AAVH1Q. На фиг. 12 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK2AAVH1R. На фиг. 13 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK1AAVH1 А 2. На фиг. 14 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK1AAVH1Q. На фиг. 15 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK1AAVH1R. На фиг. 16 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с VK2AAVH1 А 2. На фиг. 17 проиллюстрирована преимущественная гуманизированная деиммунизированная вариабельная область тяжелой цепи, где CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты (последователь-4 025174 ность, раскрытая в SEQ ID NO: 89). Вариации, которые могут быть сделаны, показаны в идентифицированных положениях последовательности с использованием системы нумерации по Kabat (последовательность, раскрытая в SEQ ID NO: 116) (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). Вариации могут быть сделаны в виде единственной мутации или в виде более чем одной мутации, и вариации могут быть сделаны с использованием мутаций в любой комбинации. На фиг. 18 проиллюстрирована преимущественная гуманизированная деиммунизированная вариабельная область легкой цепи, где CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты (последовательность,раскрытая в SEQ ID NO: 93). Вариации, которые могут быть сделаны, показаны в идентифицированных положениях последовательности с использованием системы нумерации по Kabat (последовательность,раскрытая в SEQ ID NO: 117) (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). Вариации могут быть сделаны в виде единственной мутации или в виде более чем одной мутации, и вариации могут быть сделаны с использованием мутаций в любой комбинации. На фиг. 19 проиллюстрирован анализ участков тяжелой цепи (SEQ ID NO: 41) с использованиемiTope. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р 1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как "О", если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как "X", если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке "iTope", темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные(promiscuous), связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках "общее" и "высокая аффинность". Потенциальные р 1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке "Последовательность". На фиг. 20 проиллюстрирован анализ вариантов участков тяжелой цепи (SEQ ID NO: 118) с использованием iTope. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р 1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как "О", если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как "X", если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке "iTope", темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках "общее" и "высокая аффинность", и показана разница в связывании. Потенциальные р 1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке "Последовательность", и аминокислотные различия в данных вариантах заключены в рамку. На фиг. 21 проиллюстрирован анализ участков легкой цепи (SEQ ID NO: 3) с использованиемiTope. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р 1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как "О", если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как "X", если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке "iTope", темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные,связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках "суммарно" и "высокая аффинность". На фиг. 22 проиллюстрирован анализ вариантов участков легкой цепи (SEQ ID NO: 101) с использованием iTope. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р 1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как "О", если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как "X", если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке "iTope", темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны промискуитентные, связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках "суммарно" и "высокая аффинность", и показана разница в связывании. Потенциальные р 1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке "Последовательность",и аминокислотные различия в данных вариантах заключены в рамку. На фиг. 23 проилллюстрирована частота встречаемости аллотипов МНС класса II у населения мира и в исследуемой популяции. Фиг. 24. Химерное антитело против эндоглина, гуманизированное антитело против эндоглинаVK1VH1 и гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина VK1AAVH1A2 тестировали в Т-клеточных анализах динамики EpiScreen, используя РВМС от 20 доноров. На 5-е, 6-е, 7-е и 8-е-5 025174 сутки отбирали образцы смешанных культур РВМС, инкубированных с тестируемыми антителами, и импульсно обрабатывали 3 Н-тимидином. Клетки собирали, и включение радиоактивности измеряли путем подсчета импульсов на сцинтилляционном счетчике. Результаты для каждого взятого в трех повторах образца усредняли и нормализовали путем преобразования в индекс стимуляции (SI). SI для каждой временной точки с учетом каждого донора показан выше для химерного антитела TRC105 (фиг. 24 А),VK1VH1 (фиг. 24 В) и VK1AAVH1A2 (фиг. 24 С). Порог отсечения для определения положительных ответов с SI2 выделен пунктирной линией, а значимые ответы (р 0,05 согласно критерию Стьюдента) указаны как . Подробное описание изобретения Следует понимать, что данная заявка не ограничивается конкретными композициями или параметрами способов, поскольку они, разумеется, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология применяется только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения. Кроме того, очевидно, что различные способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящих изобретений. Согласно настоящей заявке могут быть использованы традиционные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК, известные в данной области техники. Такие методы подробно разъяснены в литературе; см., например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press,(1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); каждый из которых конкретно включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Были получены мышиные моноклональные антитела (mAb) против эндоглина, которые модулируют активность эндоглина и посредством этого ингибируют ангиогенез и/или ингибируют вазодилатацию малых кровеносных сосудов. Эти мышиные антитела описаны в патентах США 5928641, 6200566,6190660 и 7097836, которые таким образом включены во всей своей полноте. Кроме того, была продемонстрирована эффективность ex vivo и in vivo некоторых таких антител; моноклональные антитела,которые связывают эндоглин, представляют интерес в качестве эндоглин-модулирующих соединений. Однако терапевтическое применение этих мышиных антител является недопустимым, поскольку их введение имеет ряд ограничений, включая иммуногенность, например, в форме человеческих антимышиных антител (НАМА). Гуманизированные антитела призваны устранить эти реакции. В данной заявке описаны гуманизированные антитела, связывающие эндоглин, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Кроме того,для устранения проблем, ассоциированных с мышиными антителами, в данной заявке описаны гуманизированные антитела, связывающие эндоглин и уменьшающие и/или ингибирующие ангиогенез, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Эти гуманизированные антитела против эндоглина полезны для диагностики и лечения различных состояний и заболеваний, а также для очистки и детекции эндоглина.I. Антитела против эндоглина. Согласно данному изобретению предложены гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин. Эндоглин можно обнаружить на клетках, которые содержат и поддерживают существующую сосудистую сеть, а также в клетках, которые стимулируют рост новой сосудистой сети и становятся ее частью. Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут связывать эндоглин и тем самым ингибировать ангиогенез, ингибировать существующую сосудистую сеть или поддержание существующей сосудистой сети и/или ингибировать дилатацию малых сосудов. В дальнейшем в этом документе ссылку на термины "антитело" или "антитела" следует рассматривать как включающую любой из антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, и такие термины являются взаимозаменяемыми, где это применимо. В дополнение к их применению для очистки эндоглина, эти антитела полезны для очистки, детекции и диагностических целей, а также терапевтических целей. Антитела, предложенные в данной заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственных средств для лечения различных состояний и заболеваний, в способах лечения указанных состояний и заболеваний и способах детекции или диагностики. Как использовано в данной заявке, ангиогенез вовлечен в рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (что также обозначается как неоваскуляризация), дилатацию малых сосудов, чрезмерный или продолжительный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети. Ангиогенные состояния и заболевания относятся к таким заболеваниям и состояниям, которые связаны с ангиогенезом, вызваны ангиогенезом или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают, например, различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна,CNV, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболе-6 025174 вания (например, IBD), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака (первичные опухоли и метастазы). А. Терминология по антителам. Как использовано в данной заявке, термин "антитело" относится к иммуноглобулину (Ig), независимо от того, является ли он природным или получен частично или полностью синтетическим путем. Термин также охватывает любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который представляет собой антигенсвязывающий домен или гомологичен ему. Кроме того, данный термин включает в себя "антигенсвязывающие фрагменты" и другие взаимозаменяемые термины для сходных связывающих фрагментов, таких как описано ниже. Антитела с привитыми участками, определяющими комплементарность (CDR) (от англ. complementary determining regions), и другие гуманизированные антитела(включая модификации CDR и модификации каркасных участков) также охвачены этим термином. Нативные антитела и нативные иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких(L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. В типичном случае каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен ("VH"), за которым следует ряд константных доменов("CH"). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен ("VL") и константный домен("CL") на своем другом конце; константный домен легкой цепи соответствует первому константному домену тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. Термины "синтетический полинуклеотид", "синтетический ген" или "синтетический полипептид",как использовано в данной заявке, означают, что соответствующая полинуклеотидная последовательность или ее участок, либо аминокислотная последовательность или ее участок, происходит из последовательности, которая была сконструирован, или синтезирована de novo, или модифицирована по сравнению с эквивалентной природной последовательностью. Синтетические полинуклеотиды (антитела или антигенсвязывающие фрагменты) или синтетические гены могут быть получены способами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, химический синтез нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей. Синтетические гены обычно отличаются от природных генов либо на аминокислотном, либо на полинуклеотидном уровне (или на обоих уровнях) и обычно расположены в контексте синтетических последовательностей, контролирующих экспрессию. Например, синтетические генные последовательности могут включать аминокислотные или полинуклеотидные последовательности, которые были изменены, например, путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот либо одного или более нуклеотидов, посредством чего обеспечивают аминокислотную последовательность или полинуклеотидную кодирующую последовательность антитела, которая отличается от исходной последовательности. По сравнению с природным геном, синтетические генные полинуклеотидные последовательности не обязательно могут кодировать белки с различными аминокислотами; например, они также могут охватывать синтетические полинуклеотидные последовательности, которые включают разные кодоны, но которые кодируют одну и ту же аминокислоту (т.е. нуклеотидные изменения представляют собой молчащие мутации на аминокислотном уровне). Что касается антител, то термин "вариабельный домен" относится к вариабельным доменам антител, которые используются в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена в пределах вариабельных доменов антител. Точнее, она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (также известными как CDR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются "каркасными участками" или "FR". Каждый из вариабельных доменов немодифицированных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR (FR1, FR2, FR3 и FR4), в основном имеющие -складчатую конфигурацию, разделенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть складчатой структуры. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга благодаря FR-участкам и вместе с CDR другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Иммунологический Interest, 5th Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), с. 647-669). Термины "гипервариабельный участок" и "CDR", когда они используются в данной заявке, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. CDR содержат аминокислотные остатки из трех участков последовательности, которые связываются комплементарным образом с антигеном и известны как CDR1, CDR2 и CDR3 для каждой из VH- и VL-цепей. В вариабельном домене легкой цепи CDR обычно соответствуют приблизительно остаткам 24-34 (CDRL1), 50-56(CDRL2) и 89-97 (CDRL3), а в вариабельном домене тяжелой цепи CDR обычно соответствуют прибли-7 025174 зительно остаткам 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDRH3) в соответствии с Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Следует понимать, что CDR различных антител могут содержать вставки, поэтому нумерация аминокислот может отличаться. Система нумерации по Kabat учитывает такие вставки, используя схему нумерации, согласно которой к конкретным остаткам добавляют буквы (например, 27 А,27 В, 27 С, 27D, 27 Е и 27F из CDRL1 в легкой цепи), чтобы показать любые вставки в нумерациях среди разных антител. Альтернативно, в соответствии с Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи CDR обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (CDRL1),50-52 (CDRL2) и 91-96 (CDRL3), а в вариабельном домене тяжелой цепи CDR обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) и 96-101 (CDRH3). Как использовано в данной заявке, "каркасный участок" или "FR" относится к каркасным аминокислотным остаткам, которые образуют часть антигенсвязывающего кармана или углубления. В некоторых воплощениях каркасные остатки образуют петлю, которая является частью антигенсвязывающего кармана или углубления, и аминокислотные остатки в этой петле могут контактировать или не контактировать с антигеном. Каркасные участки обычно представляют собой участки, расположенные междуCDR. В вариабельном домене легкой цепи FR обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-23(FRL1), 35-49 (FRL2), 57-88 (FRL3) и 98-109, а в вариабельном домене тяжелой цепи FR обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-30 (FRH1), 36-49 (FRH2), 66-94 (FRH3) и 103-133 в соответствии сof Health, Bethesda, Md. (1991). Как обсуждалось выше в отношении нумерации по Kabat для легкой цепи, в тяжелой цепи также аналогичным образом учитываются вставки (например, 35 А, 35 В из CDRH1 в тяжелой цепи). Альтернативно, в соответствии с Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи FR обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (FRL1), 3349 (FRL2) 53-90 (FRL3) и 97-109 (FRL4), а в вариабельном домене тяжелой цепи FR обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (FRH1), 33-52 (FRH2), 56-95 (FRH3) и 102-113 (FRH4)."Петлевые" аминокислоты FR могут быть оценены и определены в результате изучения трехмерной структуры тяжелой цепи антитела и/или легкой цепи антитела. Трехмерную структуру можно проанализировать в отношении доступных для растворителя аминокислотных положений, поскольку такие положения, вероятно, образуют петлю и/или обеспечивают контакт с антигеном в вариабельном домене антитела. Некоторые из этих доступных для растворителя положений могут допускать разнообразие в аминокислотной последовательности, а другие (например, структурные положения), как правило, являются менее разнообразными. Трехмерная структура вариабельного домена антитела может быть определена на основании кристаллической структуры или белкового моделирования. Константные домены (Fc) антител не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий, например, с Fc-рецепторами (FcR). Fc-домены также могут увеличивать биодоступность антитела в кровотоке после введения пациенту. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи(Fc), которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются соответственно , , , и . Хорошо известны субъединичные структуры и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов."Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа или ( или "K") и лямбда или , на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. Термины "антигенсвязывающий участок антитела", "антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающий домен", "фрагмент антитела" или "функциональный фрагмент антитела" используются в данной заявке взаимозаменяемо для обозначения одного или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры фрагментов антитела, охватываемых такими терминами, включают, но не ограничиваются этим, (1) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (2) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области;(3) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (4) Fv-фрагмент, содержащий VL- и VH-домены одного плеча антитела; (5) dAb (однодоменное антитело) фрагмент (Ward et al. (1989) Nature, 341: 544-546), который содержит VH-домен; и (6) выделенный CDR. Кроме того, в это определение включены "половинки" антител, содержащие одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также охвачены данным описанием. Группировки "F(ab')2" и "Fab"' могут быть получены путем обработки Ig протеазой, такой как пепсин и папаин, и включают фрагменты антитела, полученные в результате переваривания иммуноглобу-8 025174 лина вблизи дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей. Например, папаин расщепляет IgG выше дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антитела, в которых легкая цепь, состоящая из VL и CL (константная область легкой цепи), и фрагмент тяжелой цепи, состоящий из VH и CH1 (1 область в константной области тяжелой цепи), соединены по их С-концевым областям посредством дисульфидной связи. Каждый из этих двух гомологичных фрагментов антитела называется Fab'. Пепсин также расщепляет IgG ниже дисульфидных связей,находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием фрагмента антитела несколько большего размера по сравнению с фрагментом, в котором два вышеупомянутых Fab' соединены в шарнирной области. Этот фрагмент антитела называется F(ab')2.Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что на карбоксильном конце CH1 домена тяжелой цепи добавлено несколько остатков, включающих один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данной заявке Fab'-SH представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, которые содержат между собой "шарнирные" цистеины. Также известны и другие химические сочетания фрагментов антитела."Fv" относится к фрагменту антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной или ковалентной ассоциации (в данной области были описаны Fv, соединенные дисульфидными связями, Reiter et al.(1996) Nature Biotechnology, 14: 1239-1245). Его конфигурация такова, что три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера VHVL. В совокупности, комбинация одного или более CDR из каждой из VH- и VL-цепей придает антигенсвязывающую специфичность антителу. Например, будет очевидно, что, например, CDRH3 и CDRL3 могут быть достаточными для придания антигенсвязывающей специфичности антителу, когда они перенесены на VH- и VL-цепи реципиентного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и эта комбинация CDR может быть протестирована в отношении связывания, аффинности и т.д. с использованием любого из методов, описанных в данной заявке. Даже единичный вариабельный домен (или половина Fv,содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя вероятно с меньшей аффинностью, чем когда он объединен со вторым вариабельным доменом. Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента (VL и VH) кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который позволяет получить их в виде единой белковой цепи, в которой VL- и VH-области объединяются в пару с образованием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечный FvscFv могут быть связаны с кДНК или геномными последовательностями Fc-области с целью создания экспрессирующих векторов, кодирующих полные молекулы Ig (например, IgG) или другие изотипы. VH ИVL также могут быть использованы в создании Fab, Fv или других фрагментов Ig с использованием либо методов белковой химии, либо технологии рекомбинантных ДНК."Одноцепочечные Fv" или "sFv" антительные фрагменты содержат VH- и VL-домены антитела, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В некоторых воплощениях полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, который позволяет sFv образовывать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор sFv см., например, у Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315(1994). Термин "АВИМЕР" относится к классу терапевтических белков человеческого происхождения,которые не относятся к антителам и фрагментам антител и состоят из нескольких модульных и многократно используемых связывающих доменов, обозначенных как А-домены (также известных как модуль класса А, повтор комплементарного типа или домен класса А рецептора LDL (липопротеины низкой плотности. Они были разработаны на основе человеческих внеклеточных рецепторных доменов с помощью перетасовки экзонов in vitro и фагового дисплея (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23: 14931494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24: 220). Полученные белки могут содержать многочисленные независимые связывающие домены, которые могут демонстрировать улучшенную аффинность (в некоторых случаях, на субнаномолярном уровне) и специфичность по сравнению с белками, связывающими один эпитоп; см., например, публикации заявок на патент США 2005/0221384, 2005/0164301,2005/0053973 и 2005/0089932, 2005/0048512 и 2004/0175756, каждая из которых таким образом включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Каждый из известных 217 А-доменов человека содержит примерно 35 аминокислот (примерно 4-9 025174 кДа); и эти домены отделены друг от друга линкерами, длина которых в среднем составляет пять аминокислот. Нативные А-домены быстро и эффективно сворачиваются в однородную стабильную структуру,достигаемую главным образом посредством связывания с кальцием и образования дисульфидных связей. Для такой общей структуры необходим консервативный каркасный мотив лишь из 12 аминокислот. Конечным результатом является одиночная белковая цепь, содержащая многочисленные домены, каждый из которых осуществляет отдельную функцию. Каждый домен этих белков связывает независимо, и энергетические вклады каждого домена суммируются. Эти белки были названы "АВИМЕРами", исходя из авидности мультимеров. Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). В результате использования линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами в одной и той же цепи, эти домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993). Антигенсвязывающие полипептиды также включают димеры тяжелых цепей, такие как, например,антитела верблюдов и акул. Верблюжьи и акульи антитела содержат гомодимерную пару двух цепей изV-подобного и С-подобного доменов (ни одна из которых не имеет легкой цепи). Поскольку VH-областьIgG у верблюдов, представляющего собой димер тяжелых цепей, не должна вступать в гидрофобные взаимодействия с легкой цепью, эта область в тяжелой цепи, которая обычно контактирует с легкой цепью,у верблюда подвергается замене на гидрофильные аминокислотные остатки. VH-домены IgG в виде димера тяжелых цепей называются VHH-доменами. Акульи Ig-NAR (новые антигенные рецепторы усатой акулы-няньки; от англ. nurse shark (new) antigen receptors) содержат гомодимер одного вариабельного домена (названного доменом V-NAR) и пяти С-подобных константных доменов (доменов C-NAR). Разнообразие репертуара антител у верблюдов определяется CDR 1, 2 и 3 в VH- или VHH-областях. CDR3 вVHH-области верблюда характеризуется своей относительно большой длиной, в среднем составляющей 16 аминокислот (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129). Это отличает его от CDR3 участков антител многих других видов. Например, CDR3 из VH мыши имеет в среднем 9 аминокислот. Библиотеки вариабельных областей верблюжьих антител, которые поддерживают разнообразие in vivo вариабельных областей верблюда, могут быть созданы, например, методами, описанными в заявке на патент США с серийным 20050037421."Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител включают химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого Ig. В основном, гуманизированные антитела представляют собой человеческие Ig (реципиентное антитело), в которых один или более CDR реципиента заменены на CDR антитела (донорного антитела) из видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющего желаемую специфичность, аффинность и связывающую функцию. В некоторых случаях один или более аминокислотных остатков FR человеческого Ig заменяют на соответствующие нечеловеческие аминокислотные остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны с целью улучшения функциональных характеристик антител, если будет необходимо. Гуманизированное антитело может содержать, по существу, все или по меньшей мере один и в некоторых случаях два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные участки соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все FR представляют собой участки последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно также может включать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Для подробной информации см. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann etal., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Гуманизированное антитело также включает антитела, в которых часть или все CDR тяжелой и легкой цепи происходят из нечеловеческого моноклонального антитела, при этом, по существу, все остальные участки вариабельных областей происходят из человеческой вариабельной области (как тяжелой,так и легкой цепи), и константные области происходят из человеческой константной области. В одном воплощении участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и легкой цепей происходят из нечеловеческого антитела. В еще одном другом воплощении по меньшей мере один CDR (например, CDR3) тяжелой и легкой цепей происходит из нечеловеческого антитела. Различные комбинации CDR1, CDR2 и CDR3 могут происходить из нечеловеческого антитела и рассматриваются в данной заявке. В одном неограничивающем примере один или более участков CDR1, CDR2 и CDR3 каждой тяжелой и легкой цепей происходят из клона мышиного химерного моноклонального антитела TRC105. Термин "моноклональное антитело", как использовано в данной заявке, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными,- 10025174 направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам традиционных (поликлональных) антител, которые могут включать различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным в Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США 4816567). В некоторых воплощениях моноклональные антитела можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методик, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Антитела могут быть выделены и очищены из культурального супернатанта или асцитов, как упомянуто выше, путем осаждения насыщенным сульфатом аммония, методом эуглобулинового осаждения,методом с использованием капроновой кислоты, методом с использованием каприловой кислоты, с помощью ионообменной хроматографии (DEAE или DE52) или аффинной хроматографии с использованием анти-Ig-колонки или колонки с белком A, G или L, таких как описано более подробно ниже. Типичными антителами для применения в композициях и способах, описанных в данной заявке, являются интактные иммуноглобулиновые молекулы, такие как, например, гуманизированное антитело или те участки молекулы гуманизированного Ig, которые содержат антигенсвязывающий сайт (т.е. паратоп) или одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, в том числе те участки, которые известны в данной области как Fab, Fab', F(ab)', F(ab')2, Fd, scFv, вариабельный домен тяжелой цепи, вариабельный домен легкой цепи, вариабельный NAR-домен, биспецифический scFv, биспецифический Fab2, триспецифическийFab3 и одноцепочечные связывающие полипептиды, и другие, которые также обозначаются как антигенсвязывающие фрагменты. При конструировании иммуноглобулиновой молекулы или ее фрагментов вариабельные области или их участки могут быть слиты, соединены или иным образом присоединены к одной или более константным областям или их участкам с получением любого из антител или их фрагментов, описанных в данной заявке. Это может быть осуществлено различными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, методы молекулярного клонирования или прямой синтез нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы. Типичные неограничивающие способы конструирования этих молекул также можно найти в примерах, описанных в данной заявке. В одном типичном воплощении в заявке предложен одноцепочечный связывающий полипептид,имеющий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, который связывает эндоглин и возможно имеет Fc-область иммуноглобулина. В одном типичном воплощении в заявке предложен одноцепочечный связывающий полипептид, имеющий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, который связывает эндоглин и ингибирует ангиогенез и возможно имеет Fc-область иммуноглобулина. Такая молекула представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент, возможно обладающий эффекторной функцией или имеющий увеличенный период полувыведения благодаря присутствию Fc-области иммуноглобулина. Способы получения одноцепочечных связывающих полипептидов известны в данной области (например, заявка на патент США 2005/0238646). Термины "генные сегменты зародышевой линии" или "последовательности зародышевой линии" относятся к генам из зародышевой линии (гаплоидные гаметы и те диплоидные клетки, из которых они образуются). Зародышевая ДНК содержит множество генных сегментов, которые кодируют одну тяжелую или легкую цепь Ig. Эти генные сегменты содержатся в зародышевых клетках, но они не могут транскрибироваться и транслироваться в тяжелые и легкие цепи, пока не будут организованы в функциональные гены. В процессе дифференцировки В-клеток в костном мозге эти генные сегменты случайным образом перетасовываются под действием динамической генетической системы, способной генерировать более 108 видов специфичности. Данные о большей части этих генных сегментов опубликованы и собраны в базах данных по зародышевым линиям. Как использовано в данной заявке, "иммунореактивный" относится к связывающим агентам, антителам или их фрагментам, которые специфичны к последовательности аминокислотных остатков ("сайт связывания" или "эпитоп"), и даже если обладают перекрестной реактивностью в отношении других пептидов/белков, являются нетоксичными в концентрациях, приготовленных для введения людям. Термин"связывание" относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например, ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включающих такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики, и любые другие традиционные способы связывания. Термин "предпочтительно связывается" означает, что связывающий агент связывается с сайтом связывания с более высокой аффинностью, чем он связывается с неродственными аминокислотными последовательностями. Предпочтительно, чтобы такая аффинность была по меньшей мере в 1 раз выше, по меньшей мере в 2 раза выше,по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей- 11025174 мере в 9 раз выше, 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность связывающего агента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины "иммунореактивный" и "предпочтительно связывается" используются в данной заявке взаимозаменяемо. Как использовано в данной заявке, термин "аффинность" относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов и выражается в виде KD. Аффинность связывания белка с лигандом,такая как аффинность антитела в отношении эпитопа, может составлять, например, от примерно 100 до примерно 0,1 нМ, от примерно 100 нМ до примерно 1 пМ или от примерно 100 нМ до примерно 1 фМ. Как использовано в данной заявке, термин "авидность" относится к устойчивости комплекса из двух или более агентов к диссоциации после разведения. Кажущиеся аффинности могут быть определены такими способами, как иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), или любым другим методом, известным специалисту в данной области. Авидности могут быть определены такими методами, как анализ Скэтчарда, или любым другим методом, известным специалисту в данной области. Термин "эпитоп" относится к той части антигена или другой макромолекулы, которая способна создавать связывающее взаимодействие со связывающим карманом вариабельной области антитела. Такие связывающие взаимодействия могут проявляться в виде межмолекулярного контакта с одним или более аминокислотными остатками одного или более CDR. В связывание с антигеном могут быть вовлечены,например, CDR3, или пара CDR3, или в некоторых случаях взаимодействия вплоть до всех шести CDRVH- и VL-цепей. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (т.е. "непрерывную") или может состоять из прерывистых аминокислотных последовательностей (т.е. быть"конформационным" или "дискретным"). Антитело может распознавать одну или более аминокислотных последовательностей; поэтому эпитоп может определять более чем одну дискретную аминокислотную последовательность. Эпитопы, распознаваемые антителами, могут быть определены методами пептидного картирования и анализа последовательности, хорошо известными специалисту в данной области. Связывающие взаимодействия проявляются в виде межмолекулярных контактов с одним или более аминокислотными остатками CDR. TRC105 представляет собой химерное антитело, которое имеет такую же вариабельную аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело, описанное как Y4-2F1 или SN6j в патентах США с номерами 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836. Эпитопы, распознаваемыеY4-2F1 и SN6j и, следовательно, TRC105, были идентифицированы ранее. Термин "специфический" относится к ситуации, при которой антитело не будет демонстрировать какого-либо значительного связывания с молекулами, отличными от антигена, содержащего эпитоп, распознаваемый антителом. Термин также применим, когда, например, антиген-связывающий домен специфичен к конкретному эпитопу, который имеется у многих антигенов, в этом случае антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будут способны связываться с различными антигенами, несущими этот эпитоп. Термины "предпочтительно связывается" или "специфически связывается" означают, что антитела или их фрагменты связываются с эпитопом с более высокой аффинностью, чем с неродственными аминокислотными последовательностями, и если обладают перекрестной реактивностью в отношении других полипептидов, содержащих данный эпитоп, то являются нетоксичными в концентрациях, приготовленных для введения людям. В одном из аспектов такая аффинность по меньшей мере в 1 раз выше,по меньшей мере в 2 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, в 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность антитела или его фрагмента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины "иммунореактивный", "связывается", "предпочтительно связывается" и "специфически связывается" используются в данной заявке взаимозаменяемо. Термин "связывание" относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например, ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включает такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики и любые другие традиционные способы связывания. Фраза "консервативная аминокислотная замена" относится к распределению аминокислот по группам на основе определенных общих свойств. Функциональный способ определения общих свойств среди индивидуальных аминокислот заключается в анализе нормированных частот аминокислотных изменений среди соответствующих белков гомологичных организмов (Schulz, G.E. and R.H. Schirmer, Principles ofProtein Structure, Springer-Verlag). В соответствии с такими анализами можно определить группы аминокислот, где аминокислоты в пределах группы предпочтительно заменяются друг на друга и поэтому сходны друг с другом по своему влиянию на общую структуру белка (Schulz, G.E. and R.H. Schirmer,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Примеры групп аминокислот, определенных таким обра- 12025174 зом, включают:(1) с заряженной группой, состоящих из Glu и Asp, Lys, Arg и His,(2) с положительно заряженной группой, состоящих из Lys, Arg и His,(3) с отрицательно заряженной группой, состоящих из Glu и Asp,(4) с ароматической группой, состоящих из Phe, Tyr и Trp,(5) с азотсодержащей кольцевой группой, состоящих из His и Trp,(6) с большой алифатической неполярной группой, состоящих из Val, Leu и Ile,(7) со слабополярной группой, состоящих из Met и Cys,(8) с небольшой группой остатка, состоящих из Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln и Pro,(9) с алифатической группой, состоящих из Val, Leu, Ile, Met и Cys и(10) с небольшой гидроксильной группой, состоящих из Ser и Thr. Помимо групп, представленных выше, каждый аминокислотный остаток может образовывать свою собственную группу, и такая группа, образованная индивидуальной аминокислотой, может быть обозначена просто с помощью одно- и/или трехбуквенного сокращения для такой аминокислоты, обычно используемого в данной области, как описано выше."Консервативный остаток" представляет собой аминокислоту, которая является относительно инвариантной во всем диапазоне сходных белков. Зачастую консервативные остатки будут отличаться только тем, что они будут заменены на сходную аминокислоту, как описано выше для "консервативной аминокислотной замены". Символ "х" или "хаа", который использован в данной заявке в аминокислотных последовательностях, предназначен для указания на то, что в этом положении может быть осуществлена замена на любую из двадцати стандартных аминокислот, если конкретно не указано иное. Для задач конструирования пептидомиметиков, "х" или "хаа" в аминокислотной последовательности может быть заменен имитатором аминокислоты, присутствующей в последовательности-мишени, или аминокислота может быть заменена спейсером, по существу, любой формы, которая не оказывает влияния на активность пептидомиметика. Гомология", или "идентичность", или "сходство" относится к сходству последовательностей двух пептидов или двух молекул нуклеиновой кислоты. И гомология, и идентичность каждая может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которое может быть выравнено в целях сравнения. Когда эквивалентное положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или одной и той же аминокислотой, тогда эти молекулы являются идентичными по такому положению; когда эквивалентный сайт занят тем же или сходным аминокислотным остатком(например, сходным по стерической и/или электронной природе), тогда эти молекулы могут быть названы гомологичными (сходными) по такому положению. Выражение гомологии/сходства или идентичности в виде процента имеет отношение к функции количества идентичных или сходных аминокислот в положениях, являющихся общими для сравниваемых последовательностей. Последовательность, являющаяся "неродственной" или "негомологичной", имеет менее 40% идентичности, предпочтительно даже менее 25% идентичности с последовательностью по настоящему изобретению. При сравнении двух последовательностей, отсутствие остатков (аминокислот или нуклеиновых кислот) или присутствие дополнительных остатков также снижает идентичность и гомологию/сходство. Термин "гомология" описывает математически обоснованное сравнение сходства последовательностей, которое применяют для идентификации генов или белков со сходными функциями или мотивами. Нуклеиновокислотные (нуклеотидные, олигонуклеотидные) и аминокислотные (белковые) последовательности по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска относительно опубликованных баз данных, например, с целью идентификации других представителей семейства, родственных последовательностей или гомологов. Такие поиски могут быть проведены с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) из Altschul,et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. BLAST-поиски нуклеотидов могут быть выполнены с использованием программы NBLAST, (балл = 100, длина слова = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. BLAST-поиски аминокислот могут быть выполнены с использованием программы XBLAST (балл = 50, длина слова = 3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. Для получения выравниваний с брешами в сравнительных целях можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST иGapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и BLAST) (см. www.ncbi.nlm.nih.gov). Как использовано в данной заявке, "идентичность" означает процент идентичных нуклеотидных или аминокислотных остатков в соответствующих положениях двух или более последовательностей,когда эти последовательности выравнивают с целью максимизации соответствия последовательностей,т.е. принимая в расчет бреши и вставки. Идентичность можно легко рассчитать известными методами,включая, но не ограничиваясь этим, методы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.,- 13025174York, 1991; и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Методы определения идентичности разработаны с целью получения максимального соответствия между тестируемыми последовательностями. Кроме того, методы определения идентичности систематизированы в общедоступных компьютерных программах. Методы с использованием компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются этим, пакет программGCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984, BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul,S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) и Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402 (1997. Программа BLAST X является общедоступной программой от NCBI и из других источников (BLAST Manual,Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990. Для определения идентичности также можно использовать хорошо известный алгоритм СмитаУотермана. Термин "выделенный" (используемый взаимозаменяемо с термином "по существу, чистый") при применении к полипептидам означает полипептид или его участок, который в соответствии с его происхождением или процедурой: (1) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии участка экспрессирующего вектора; или (2) связан с белком или другой химической группировкой, отличными от тех, с которыми они связаны в природе; или (3) не встречается в природе, например, белок, который подвергается химической обработке путем присоединения или добавления по меньшей мере одной гидрофобной группировки к данному белку, с тем чтобы данный белок находился в форме, не обнаруженной в природе. Под "выделенным" также подразумевают белок, который: (1) синтезирован химическим путем; или (2) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от сопутствующих и загрязняющих белков. Как правило, этот термин означает полипептид, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он существует в природе. Предпочтительно, чтобы полипептид также был отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки. Как использовано в данной заявке, термины "ингибирующий ангиогенез", "ангиогенезингибирующий" или "антиангиогенный" включают ингибирование васкулогенеза (образование и развитие сосудов) и предназначены для обозначения влияния на уменьшение степени, величины или скорости неоваскуляризации. Влияние на уменьшение степени, величины или скорости пролиферации эндотелиальных клеток или миграции в ткани представляет собой конкретный пример ингибирования ангиогенеза. Термин "ангиогенез-ингибирующая композиция" относится к композиции, которая ингибирует ангиогенез-опосредованные процессы, такие как миграция, пролиферация эндотелиальных клеток, образование трубочек, и впоследствии приводит к ингибированию образования новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов и, таким образом, влияет на ангиогенез-зависимые состояния. Как использовано в данной заявке, термин "ангиогенез-зависимое состояние" предназначен для обозначения состояния, при котором процесс ангиогенеза или васкулогенеза поддерживает или усиливает патологическое состояние или оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы. Поэтому лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез поддерживает патологическое состояние, могло бы приводить к подавлению заболевания, в то время как лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы, могло бы приводить, например, к усилению нормального процесса. Ангиогенез представляет собой образование новых кровеносных сосудов из уже существующих капилляров или посткапиллярных венул. Васкулогенез является результатом образования новых кровеносных сосудов, возникающих из ангиобластов, которые являются предшественниками эндотелиальных клеток. Оба процесса приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включены в значение термина "ангиогенез-зависимые состояния". Подразумевается, что термин "ангиогенез", как использовано в данной заявке, включает в себя образование сосудов de novo, например, которые возникают в результате васкулогенеза, а также тех, которые возникают в результате разветвления и прорастания существующих сосудов, капилляров и венул. Ангиогенез также может быть вовлечен в индукцию ALK1-сигнального пути и фосфорилирования и/или сигнального пути, родственного Smad 1/5/8. Кроме того, известно, что"Индукция иммунного ответа хозяина" означает, что пациент испытывает облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни и конкретно включает в себя, без ограничения, продление выживаемости. В некоторых предпочтительных воплощениях способов по изобретению CD8+ IFNпродуцирующая Т-клетка активируется для индукции цитотоксического Т-лимфоцитарного (CTL) иммунного ответа у пациента, которому вводят антагонист. В некоторых воплощениях способов по изобретению CD4+ IFN-продуцирующая Т-клетка активируется для индукции хелперного Т-клеточного иммунного ответа у пациента, которому вводят композицию. Эти активированные CD4+ IFNпродуцирующие Т-клетки (т.е. хелперные Т-клетки) обеспечивают необходимую иммунологическую- 14025174 помощь (например, путем высвобождения цитокинов) для индукции и поддержания не только CTL-, но также гуморального иммунного ответа, опосредованного В-клетками. Таким образом, в некоторых воплощениях способов по изобретению у пациента, которому вводят композицию, активируется гуморальный ответ на антиген. В одном аспекте для усиления иммунного ответа к композиции может быть добавлен адъювант. Адъюванты хорошо известны в данной области. Активация CD8+ и/или CD4+ Т-клеток означает стимуляцию Т-клеток, которые обладают способностью продуцировать цитокины (например, IFN- (интерферон-гамма), действительно продуцировать один или более цитокинов или увеличивать продуцирование ими одного или более цитокинов. "Индукция CTL-ответа" означает стимуляцию потенциально цитотоксических Т-лимфоцитов демонстрировать антигенспецифическую цитотоксичность. "Антигенспецифическая цитотоксичность" означает цитотоксичность против клетки, презентирующей антиген, который ассоциирован с антигеном, ассоциированным с раком, которая оказывается выше, чем для антигена, не ассоциированного с раком. "Цитотоксичность" относится к способности цитотоксического Т-лимфоцита вызывать гибель клетки-мишени. Такая антиген-специфическая цитотоксичность может быть по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 10 раз выше, по меньшей мере примерно в 100 раз или более выше, чем цитотоксичность против клетки, не презентирующей антиген, не ассоциированный с раком. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) также включает активацию природных киллерных клеток ("NK клеток"), которые опосредуют клеточный киллинг посредством связывания с антителом. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут опосредовать ADCC черезNK клетки посредством связывания эндоглина. Как использовано в данной заявке, термины "пролиферативное расстройство" и "пролиферативное состояние" означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной пролиферацией. Термины "клеточное пролиферативное расстройство" и "клеточное пролиферативное состояние" означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной клеточной пролиферацией, а также включающее состояния, характеризующиеся нежелательной или неблагоприятной клеточной пролиферацией или клеточным выживанием (например, вследствие недостаточного апоптоза), состояния, характеризующиеся аберрантным или недостаточным апоптозом, а также состояния,характеризующиеся аберрантным или нежелательным либо неблагоприятным клеточным выживанием. Термин "расстройство дифференцировки" означает любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или недостаточной дифференцировкой. Пролиферативные расстройства или расстройства дифференцировки, подлежащие лечению, включают заболевания и непатологические физиологические состояния, доброкачественные и неопластические, характеризующиеся аномальным или нежелательным числом клеток, клеточным ростом или клеточным выживанием. Поэтому такие расстройства или состояния могут представлять собой болезненное состояние и включать все типы раковых опухолей или онкогенных процессов, метастатических тканей или трансформированных в злокачественные клеток, тканей или органов, или могут представлять собой непатологическое, т.е. отклонение от нормального, но которое обычно не ассоциировано с заболеванием. Конкретным примером непатологического состояния, которое может быть подвергнуто лечению согласно изобретению, является возобновление роста ткани после заживления раны, которое приводит к образованию рубца. Клетки, характеризующие пролиферативное расстройство или расстройство дифференцировки, могут быть агрегированы в клеточную массу или рассеяны. Термин "солидная опухоль" относится к новообразованиям или метастазам, которые обычно агрегируют вместе и образуют массу. Конкретные примеры включают висцеральные опухоли, такие как рак желудка или толстой кишки, гепатомы, почечные карциномы, опухоли/виды рака легкого и головного мозга. Термин "несолидная опухоль" относится к новообразованиям гематопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или новообразованиям, которые являются диффузными по своей природе, поскольку обычно они не образуют твердой массы. Конкретные примеры лейкозов включают, например, острую и хроническую лимфобластную,миелобластную и множественную миелому. Такие расстройства включают новообразования или виды рака, которые могут поражать фактически любой тип клеток или тканей, например карциному, саркому, меланому, метастатические расстройства или гематопоэтические неопластические расстройства. Метастатическая опухоль может возникать из множества типов первичных опухолей, включая, но не ограничиваясь этим, опухоль молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, головного мозга, лимфоидной ткани, желудочнокишечного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки), мочеполового пути (матки, яичника, шейки матки, мочевого пузыря, яичка, полового члена,предстательной железы), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышцы, кожи и т.д. Карциномы относятся к злокачественным новообразованиям эпителиальной или эндокринной ткани и включают карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Типичные карциномы включают карциномы, про- 15025174 исходящие из шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки, печени и яичника. Термин также включает в себя карциносаркомы, например, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани или в которой опухоль образует железистоподобную структуру. Глазная ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, ретинальную ткань пациента с диабетической ретинопатией, дегенерацией желтого пятна или неоваскулярной глаукомой, и ангиогенез,подлежащий ингибированию, представляет собой ангиогенез в ретинальной ткани, где происходит неоваскуляризация ретинальной ткани. Раковая ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, эндотелиальную ткань, экспрессирующую аномальный уровень эндоглина. Как использовано в данной заявке, термин "трансформированные клетки" относится к клеткам, которые спонтанно превратились в состояние неограниченного роста, т.е. они приобрели способность расти вследствие неопределенного числа делений в культуре. Трансформированные клетки можно охарактеризовать такими терминами, как неопластический, анапластический и/или гиперпластический в отношении утраты ими контроля роста. Для целей данного изобретения подразумевается, что термины "трансформированный фенотип злокачественных клеток млекопитающих" и "трансформированный фенотип" охватывают, но не ограничиваются этим, любой из следующих фенотипических признаков, ассоциированных с клеточной трансформацией клеток млекопитающих: иммортализацию, морфологическую трансформацию или трансформацию роста и онкогенность, выявляемые по продолжительному росту в клеточной культуре, росту на полутвердых средах или онкогенному росту в иммунонекомпетентных или сингенных животных. Термин "антиген опухолевых клеток" определен в данной заявке как антиген, который присутствует в более высоких количествах на опухолевой клетке или в жидкостях организма, чем на не имеющих к нему отношения опухолевых клетках, нормальных клетках или в нормальной жидкости организма. Присутствие антигена можно определить любым из множества анализов, известных специалистам в данной области, и они включают без ограничения, отрицательную и/или положительную селекцию с помощью антител, например ELISA-анализ, радиоиммуноанализ или вестерн-блоттинг. Термин "апоптоз" или "программируемая гибель клеток" относится к физиологическому процессу,посредством которого нежелательные или непригодные клетки удаляются в процессе развития и других нормальных биологических процессов. Апоптоз представляет собой тип клеточной смерти, который происходит в нормальных физиологических условиях, и клетка является активным участником своей собственной гибели ("клеточный суицид"). Это очень часто происходит в процессе нормального обновления клеточной популяции и тканевого гомеостаза, эмбриогенеза, индукции и поддержания иммунологической толерантности, развития нервной системы и зависимой от эндокринной системы атрофии ткани. Клетки, подвергающиеся апоптозу, демонстрируют характерные морфологические и биохимические признаки. Эти признаки включают агрегацию хроматина, ядерную и цитоплазматическую конденсацию,разделение цитоплазмы и ядра на ограниченные мембранами везикулы (апоптотические тельца), которые содержат рибосомы, морфологически интактные митохондрии и ядерный материал. In vivo, эти апоптотические тельца быстро распознаются и фагоцитируются макрофагами, дендритными клетками или прилегающими эпителиальными клетками. Благодаря этому эффективному механизму удаления апоптотических клеток in vivo не индуцируется воспалительный ответ. In vitro, апоптотические тельца, а также оставшиеся клеточные фрагменты в конце концов набухают и в итоге лизируются. Эта конечная фаза гибели клеток in vitro была названа "вторичным некрозом". Апоптоз можно определять методами, известными специалистам в данной области, такими как фрагментация ДНК, воздействие аннексина V,активация каспаз, высвобождение цитохрома С и т.д. Клетка, гибель которой была индуцирована, называется в данной заявке "апоптотической клеткой"."Апоптоз-индуцирующий агент" определяют в данной заявке как индуцирующий апоптоз/программируемую гибель клеток и включающий, например, облучение, химиотерапевтические агенты или рецептор-связывающие агенты, где клетки, например опухолевые клетки, индуцируются к программируемой клеточной смерти. Типичные апоптоз-индуцирующие агенты описаны более подробно ниже. Апоптоз можно определять, используя стандартный анализ апоптоза с помощью аннексина V: клетки NIH (Национальный институт здравоохранения CLUA):OVCAR-3 (рак яичников; от англ. ovarian cancer) выращивают в 6-луночных планшетах (NUNC) и облучают или обрабатывают антагонистом (или в комбинации с другим противораковым лекарственным средством) в течение 4-48 ч, промывают и окрашивают с помощью аннексин V-FITC (флуоресцеинизотиоцианат) (BD-Pharmingen) в течение 1 ч. Клетки анализируют с помощью проточной цитометрии (Becton-Dickinson, CellQuest), подвергают контрастному окрашиванию йодидом пропидия и снова анализируют на проточном цитометре. В. Способы получения и экспрессии гуманизированных антител против эндоглина. Было разработано химерное моноклональное антитело, которое связывает эндоглин. Это антитело обозначено TR105 (также известно как с-SN6j). В одном аспекте антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, были созданы путем гуманизации последовательностей VL и VH химерного моноклонального антитела TRC105(SEQ ID NO 1 и 39 соответственно). Гуманизированные иммуноглобулины, в том числе гуманизированные антитела, были сконструированы посредством генетической инженерии. Большинство гуманизированных иммуноглобулинов, которые были описаны ранее, содержат каркас, идентичный каркасу конкретной человеческой иммуноглобулиновой цепи (т.е. акцепторной или реципиентной) и три CDR из нечеловеческой (т.е. донорной) иммуноглобулиновой цепи. Как описано в данной заявке, гуманизация также может включать критерии,согласно которым ограниченное число аминокислот в каркасе гуманизированной иммуноглобулиновой цепи идентифицируют и выбирают такими же, как и аминокислоты в этих положениях в доноре, а не в акцепторе, для увеличения и поддержания аффинности антитела, содержащего гуманизированную иммуноглобулиновую цепь. Настоящее изобретение отчасти основано на модели, что двумя причинами, способствующими потере аффинности в предшествующих способах получения гуманизированных антител (с использованием в качестве примеров мышиных антител в качестве источника CDR), являются следующие: (1) когда мышиные CDR объединяют с человеческим каркасом, тогда аминокислоты в каркасах вблизи CDR становятся человеческими вместо мышиных. Без связи с какой-либо теорией, эти измененные аминокислоты могут несколько деформировать CDR (например, они могут создавать другие электростатические или гидрофобные силы, нежели в донорном мышином антителе, и такие деформированные CDR не смогут создавать эффективные контакты с антигеном, как это делали CDR в донорном антителе); (2) кроме того,аминокислоты в исходном мышином антителе вблизи CDR, но не являющиеся их частью (т.е. все еще являющиеся частью каркаса), могут создавать контакты с антигеном, которые вносят вклад в аффинность. Эти аминокислоты утрачиваются, когда антитело подвергается гуманизации, поскольку, как правило, все каркасные аминокислоты создаются человеческими. Чтобы обойти эти ограничения и получить гуманизированные антитела, имеющие очень высокую аффинность в отношении желаемого антигена,можно конструировать гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, используя один или более из следующих далее принципов. Один из неограничивающих принципов заключается в том, что, например, в качестве акцептора для гуманизации используют каркас из конкретного человеческого иммуноглобулина, который обычно гомологичен донорному иммуноглобулину, или в качестве акцептора используют консенсусный каркас из многих человеческих антител. Например, сравнение последовательности вариабельной области тяжелой(или легкой) цепи мыши с вариабельными областями тяжелой (или легкой) цепи человека в банке данных (например, в Ресурсе идентификации белков Национального фонда медико-биологических исследований (National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resourse) или базе данных по белковым последовательностям Национального центра биотехнологической информации - NCBI) показывает,что степень гомологии в разных человеческих участках может сильно варьировать, например, от примерно 40 до примерно 60, примерно 70, примерно 80% или более. Благодаря выбору в качестве акцепторного иммуноглобулина одной из вариабельных областей тяжелых цепей человека, которая наиболее гомологична вариабельной области тяжелой цепи донорного иммуноглобулина, будет изменено меньшее количество аминокислот при переходе от донорного иммуноглобулина к гуманизированному иммуноглобулину. Благодаря выбору в качестве акцепторного иммуноглобулина одной из вариабельных областей легких цепей человека, которая наиболее гомологична вариабельной области легкой цепи донорного иммуноглобулина, будет изменено меньшее количество аминокислот при переходе от донорного иммуноглобулина к гуманизированному иммуноглобулину. Как правило, с использованием таких методов уменьшается шанс изменения аминокислоты вблизи одного или более CDR, которое деформирует их конформацию. Кроме того, точная общая конфигурация гуманизированного антитела, содержащего гуманизированную иммуноглобулиновую цепь, может иметь более близкое сходство с конфигурацией донорного антитела, тем самым также уменьшая шанс деформации CDR. Кроме того, в качестве акцепторных последовательностей также можно использовать легкие и тяжелые цепи из одного и того же человеческого антитела для повышения вероятности того, что гуманизированные легкие и тяжелые цепи создадут благоприятные контакты друг с другом. Альтернативно, в качестве акцепторных последовательностей также можно использовать легкие и тяжелые цепи из разных последовательностей зародышевой линии человеческих антител; когда используют такие комбинации,можно легко определить, связывают ли VH и VL интересующий эпитоп, используя традиционные анализы (например, ELISA). В одном примере будет выбрано человеческое антитело, в котором последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, взятые вместе, в целом наиболее гомологичны последовательностям донорных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей. Иногда последовательности тяжелой цепи будут придавать большую массу. Независимо от того, какой акцепторный иммуноглобулин будет выбран, в некоторых случаях можно добиться более высокой аффинности путем выбора небольшого числа аминокислот в каркасе гуманизированной иммуноглобулиновой цепи такими же, как и аминокислоты в этих положениях в доноре, а не в акцепторе. Способы созревания аффинности известны в данной области. Гуманизированные антитела обычно имеют по меньшей мере три потенциальных преимущества по сравнению с мышиными или химерными антителами для применения в терапии человека. Поскольку- 17025174 эффекторная область антитела является человеческой, считают, что она лучше взаимодействует с другими частями иммунной системы человека (например, разрушает клетки-мишени более эффективно посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC. Кроме того, иммунная система человека не должна распознавать каркас или константную область гуманизированного антитела как чужеродную, и поэтому антительный ответ против такого инъецируемого антитела обычно должен быть более слабым, чем против полностью чужеродного мышиного антитела или частично чужеродного химерного антитела. И наконец, известно, что мышиные антитела имеют период полувыведения из кровотока человека намного более короткий, чем период полувыведения человеческих антител. Гуманизированные антитела предположительно могут иметь период полувыведения более приближенный к природным человеческим антителам, что позволяет вводить меньшие дозы и с меньшей частотой. Гуманизацию антител и их антигенсвязывающих фрагментов можно осуществить различными методами, известными в данной области и описанными в данной заявке. Аналогично, получение гуманизированных антител также можно осуществить методами, известными в данной области и описанными в данной заявке. Методы модификаций каркасных участков известны в данной области и рассматриваются в данной заявке. Выбор одного или более релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению, зависит от множества критериев. Один из критериев выбора релевантных аминокислот в каркасе,подлежащих изменению, может представлять собой относительное различие в аминокислотных остатках каркаса между донорной и акцепторной молекулами. С использованием этого подхода выбор релевантных положений в каркасе, подлежащих изменению, имеет то преимущество, что позволяет избежать любых субъективных ошибок при определении остатков или любых ошибок при определении вклада каждого такого остатка CDR в аффинность связывания. Другим критерием, который может быть использован для определения релевантных аминокислотных положений, подлежащих изменению, может быть, например, выбор каркасных остатков, которые,как известно, важны или вносят вклад в конформацию CDR. Например, для конформации и/или структуры CDR важными являются канонические каркасные остатки. Ориентация на канонический каркасный остаток в качестве релевантного положения, подлежащего изменению, может быть использована для идентификации более приемлемого аминокислотного остатка в смысле ассоциированной с ним донорной последовательности CDR. Частота встречаемости аминокислотного остатка в конкретном положении в каркасе представляет собой другой критерий, который может быть использован для выбора релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению. Например, сравнивая выбранный каркас с другими каркасными последовательностями в пределах его подсемейства, можно обнаружить остатки, которые присутствуют с минимальной частотой встречаемости в конкретном(ых) положении или положениях. Положения, несущие менее часто встречающиеся остатки, аналогичным образом подходят для выбора в качестве подлежащего изменению положения в акцепторном каркасе вариабельной области. Релевантные аминокислотные положения, подлежащие изменению, также могут быть выбраны, например, исходя из близости к CDR. В некоторых смыслах, FR остатки могут принимать участие в конформации CDR и/или в связывании с антигеном. Кроме того, этот критерий аналогично можно использовать для ранжирования релевантных положений, выбранных согласно другим критериям, описанным в данной заявке. Поэтому установление различия между остатками, проксимальными и дистальными по отношению к одному или более CDR, представляет собой один из путей уменьшения числа релевантных положений, подлежащих изменению. Другие критерии для выбора релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению, включают, например, остатки, которые, как известно или прогнозируется, расположены в трехмерном пространстве вблизи поверхности раздела антиген-CDR, или как прогнозируется, они модулируют активность CDR. Аналогично, можно выбрать каркасные остатки, которые, как известно или прогнозируется, образуют контакты на поверхности раздела между вариабельными доменами тяжелой(VH) и легкой (VL) цепей. Такие положения в каркасе могут влиять на конформацию и/или аффинностьCDR путем модулирования CDR-связывающего кармана, взаимодействия с антигеном (эпитопом) или взаимодействия между VH и VL. Поэтому выбор этих аминокислотных положений с целью конструирования разнообразной популяции для скрининга связывающей активности можно использовать для идентификации каркасных изменений, в результате которых происходит замена остатков, оказывающих неблагоприятные эффекты на конформацию CDR, или компенсация неблагоприятных эффектов остатков,присутствующих где-либо еще в каркасе. Другие каркасные остатки, которые могут быть выбраны для изменения, включают аминокислотные положения, являющиеся недоступными для растворителя. Такие остатки обычно "погружены" в вариабельную область и поэтому способны влиять на конформацию CDR или на взаимодействия между VH И VL. Доступность для растворителя можно предсказать, например, на основании относительной гидрофобности окружения, создаваемого аминокислотными боковыми цепями полипептида и/или на основании известных данных по трехмерной структуре.- 18025174 После выбора релевантных аминокислотных положений в донорных CDR, а также любых релевантных аминокислотных положений в каркасных участках, в которых желательно выполнить изменения, в нуклеиновые кислоты, кодирующие акцепторный каркас вариабельной области и донорные CDR,могут быть включены изменения, соответствующие аминокислотным изменениям в некоторых или во всех выбранных положениях. Измененные каркасные или CDR-последовательности могут быть получены и протестированы по отдельности или могут быть последовательно или одновременно объединены и протестированы. Разнообразие в любом или во всех измененных положениях может характеризоваться диапазоном от нескольких до большинства разных аминокислотных остатков, включая все двадцать природных аминокислот или их функциональных эквивалентов и аналогов. В некоторых случаях также могут рассматриваться неприродные аминокислоты, и они известны в данной области. Выбор числа и расположения аминокислотных положений, подлежащих изменению, является не жестким и может зависеть от предполагаемого применения и желаемой эффективности в отношении идентификации измененной вариабельной области, имеющей желаемую активность, например, по существу, такую же или более высокую аффинность связывания по сравнению с донорной вариабельной областью. В этом смысле, чем больше число изменений, внесенных в популяцию измененных вариабельных областей, тем с более высокой эффективностью можно будет идентифицировать по меньшей мере одну разновидность, которая демонстрирует желаемую активность, например, по существу, такую же или более высокую аффинность связывания, что и у донора. Альтернативно, если у пользователя имеются эмпирические или реальные данные относительно того, что определенные аминокислотные остатки или положения вносят непропорциональный вклад в аффинность связывания, то может быть желательно получить ограниченную популяцию измененных вариабельных областей, которая будет сфокусирована на изменениях в пределах или вокруг этих идентифицированных остатков или положений. Например, если желательны CDR-привитые вариабельные области, то большая разнообразная популяция измененных вариабельных областей может включать все неидентичные положения в каркасном участке между донорным и акцепторным каркасом и все изменения в одном аминокислотном положенииCDR. Альтернативно, популяция, характеризующаяся средним разнообразием, может включать подгруппы, например, только близко расположенных неидентичных положений в каркасе, подлежащих включению, вместе со всеми изменениями в одном аминокислотном положении CDR, например, для увеличения аффинности гуманизированных антител или антигенсвязывающих фрагментов. Разнообразие вышеупомянутых популяций также может быть увеличено, например, путем дополнительного включения всех попарных изменений аминокислотных положений в CDR. В отличие от этого, для скрининга и идентификации измененной вариабельной области антитела аналогичным образом могут быть сконструированы популяции, фокусирующиеся на предварительно установленных остатках или положениях, которые включают вариантные остатки минимум по одному аминокислотному положению в каркасе и/или вCDR. Как и в случае вышеупомянутых популяций, разнообразие таких фокусированных популяций также может быть увеличено путем дополнительного расширения положений, выбранных для изменения с целью включения других релевантных положений в один из двух или в оба каркасных и CDR участка. Имеются другие многочисленные комбинации в диапазоне от нескольких изменений до многочисленных изменений в одном из двух или в обоих каркасных участках и CDR, которые могут быть дополнительно использованы, которые все будут приводить к получению популяции измененных вариабельных областей, которые могут быть подвергнуты скринингу с целью идентификации по меньшей мере одной измененной CDR-привитой вариабельной области, имеющей желаемую активность, например, связывающую активность с эндоглином. Специалисты в данной области будут знать или смогут определить, какие выбранные положения остатков в каркасе или донорных CDR, либо их подгруппах, могут варьироваться с целью получения популяции для скрининга и идентификации измененного антитела по изобретению с учетом разъяснений и инструкций, приведенных в данной заявке. Кодоны, кодирующие аминокислоты,известны в данной области. Другой способ гуманизации антител включает способ, названный "супергуманизацией". Супергуманизация включает стадии получения пептидной последовательности для рассматриваемой вариабельной области, кодируемой геном нечеловеческого зрелого антитела, и идентификации первой группы типов канонической структуры CDR по меньшей мере для двух CDR в прееделах вариабельной области нечеловеческого антитела. Типы канонической структуры CDR представляют собой структурные типы,обозначаемые согласно Chothia (CITE). Chothia с соавт. обнаружил, что критические участки CDR из многих антител принимают почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Соответственно Chothia определил для каждого CDR в каждой цепи одну или несколько "канонических структур". Каждая каноническая структура определяет прежде всего набор торсионных углов пептидного остова для непрерывного сегмента аминокислотных остатков, образующих петлю. После идентификации типа канонической структуры CDR также получают библиотеку пептидных последовательностей для человеческих антительных вариабельных областей для человеческих антител. Эта библиотека содержит последовательности для вариабельных областей человеческой зародышевой- 19025174 линии, которые кодируются сегментами нуклеиновой кислоты зародышевой линии и могут включать последовательности зрелых человеческих антител. В любом случае способ включает идентификацию типов канонической структуры CDR (т.е. вторую группу типов канонической структуры CDR) по меньшей мере для двух CDR для каждой последовательности в библиотеке последовательностей человеческих вариабельных областей. Из этой библиотеки выбирают подгруппу кандидатных последовательностей, сравнивая первую группу типов канонической структуры CDR со второй группой типов канонической структуры CDR (т.е. сравнивая типы канонической структуры мышиных CDR с типами канонической структуры человеческих CDR в соответствующих местах локализации в пределах вариабельной области) и выбирая те человеческие последовательности, где вторая группа типов канонической структуры CDR является такой же, как и первая группа типов канонической структуры CDR для последовательностей CDR в соответствующих местах локализации в пределах нечеловеческих и человеческих вариабельных областей соответственно. В данном способе эти кандидатные последовательности человеческих вариабельных областей используются в качестве основы для конструирования химерной молекулы,которая включает по меньшей мере две CDR последовательности из нечеловеческой вариабельной области (например, из мышиных CDR), объединенные с каркасныим участками из кандидатных последовательностей человеческих вариабельных областей. Результатом конструирования является то, что химерное антитело содержит каждую из нечеловеческих CDR последовательностей, замененную на каждую из человеческих CDR последовательностей в соответствующих местах локализации в вариабельных областях, так что каркасные последовательности в химерном антителе отличаются от кандидатных человеческих каркасных последовательностей. Сходство рассматриваемых CDR из кандидатных последовательностей человеческих антител оценивают для каждого домена на двух уровнях. В первую очередь отыскивают идентичные трехмерные конформации пептидных остовов CDR. Экспериментально определенные атомные координаты рассматриваемых CDR редко доступны, поэтому пространственное сходство аппроксимируют, определяя для рассматриваемых CDR типы канонической структуры согласно Chothia и исключая из дальнейшего рассмотрения кандидатов с другими каноническими структурами. Во вторую очередь учитывают гомологию "остаток-к-остатку" между рассматриваемыми CDR и остальными человеческими кандидатнымиCDR и выбирают кандидата с самой высокой гомологией. Выбор наиболее высокой гомологии основан на различных критериях, используемых для ранжирования кандидатных человеческих вариабельных областей, имеющих ту же каноническую структуру, что и рассматриваемые нечеловеческие вариабельные области. Критерий ранжирования представителей выбранной группы может быть основан на идентичности аминокислотных последовательностей или аминокислотной гомологии или на них обеих. Аминокислотная идентичность просто представляет собой балл для положения, определяемый числом совпадений положений аминокислотных остатков. Сходство по аминокислотной гомологии представляет собой положение, определяемое сходством положений в структуре или природе остатков. Гомология может быть оценена в баллах, например, согласно таблицам и процедурам, описанным в Henikoff and Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices from proteinHenikoff (1996). Эти стадии приведены ниже. а) Определить пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи рассматриваемого антитела. Их можно определить любым из нескольких методов, таких как ДНК секвенирование соответствующих генов после традиционного клонирования кДНК; ДНК секвенирование клонируемых продуктов, которые были амплифицированы в результате полимеразной цепной реакции из обратных транскриптов или ДНК рассматриваемой гибридомной линии; или пептидное секвенирование очищенного белка антитела. б) Применить систему нумерации по Kabat (Kabat и др., там же, 1991) к последовательностям тяжелой и легкой цепей рассматриваемого нечеловеческого антитела. Определить типы канонической структуры для каждого из CDR рассматриваемого нечеловеческого антитела. Это определение выполняется на основании изучения пептидной последовательности с учетом рекомендаций, рассмотренных Chothia и(1997). Отличительные признаки определения канонической структуры для каждого из CDR приведены ниже. Для CDR1 тяжелой цепи в настоящее время известны три типа канонической структуры. Распределение новой последовательности является простым, поскольку каждый тип канонической структуры имеет разное количество остатков. Как описано Al-Lazikani и др. (1997), если для данной последовательности задается нумерация по Kabat, то нумерация для остатков 31-35 будет такой, как она приведена ниже для соответствующих канонических структур: каноническая структура 1-го типа: 31, 32, 33, 34, 35. каноническая структура 2-го типа: 31, 32, 33, 34, 35, 35 а. каноническая структура 3-го типа: 31, 32, 33, 34, 35, 35 а, 35b. Для CDR2 тяжелой цепи в настоящее время известны четыре типа канонической структуры. Некоторые из них имеют уникальные количества остатков, и их легко отличить от их уникальной нумерации- 20025174 по Kabat для положений 52-56, а именно: каноническая структура 1-го типа: 52, 53, 54, 55, 56; каноническая структура 4-го типа: 52, 52 а, 52b, 52 с, 53, 54, 55, 56. Каноническая структура 2-го и 3-го типов для CDR2 тяжелой цепи имеет равное число остатков,поэтому необходимо различать по признакам в пределах их последовательности, как было рассмотреноChothia и др. (1992). Нумерация по Kabat сегмента, содержащего эти признаки, представляет собой: 52,52 а, 53, 54, 55. Каноническая структура 2-го типа имеет Pro или Ser в положении 52 а и Gly или Ser в положении 55, без ограничения по другим положениям. Каноническая структура 3-го типа имеет Gly, Ser,Asn или Asp в положении 54, без ограничения по другим положениям. В большинстве случаев этих критериев достаточно для получения правильного распределения. Кроме того, каркасный остаток 71 обычно представляет собой Ala, Val, Leu, Ile или Thr для канонической структуры 2-го типа и обычно Arg для канонической структуры 3-го типа.CDR3 тяжелой цепи характеризуется наибольшим разнообразием из всех CDR. Он образуется с помощью генетических процессов несколько случайного характера, уникального для лимфоцитов. Поэтому трудно предсказать канонические структуры для CDR3. В любом случае V-генные сегменты человеческой зародышевой линии не кодируют любую часть CDR3, поскольку V-генные сегменты заканчиваются в положении 94 по Kabat, в то время как CDR3 кодируется положениями 95-102. По этим причинам канонические структуры CDR3, как правило, не учитываются при выборе кандидатных человеческих последовательностей. Что касается CDR1 легкой цепи, то в настоящее время известны шесть типов канонической структуры для CDR1 в каппа-цепях. Каждый тип канонической структуры имеет разное количество остатков,поэтому соотнесение типа канонической структуры с новой последовательностью является очевидным из нумерации по Kabat для положений остатков 27-31. Каноническая структура 1-го типа: 27, 29, 30, 31. Каноническая структура 2-го типа: 27, 28, 29, 30, 31. Каноническая структура 3-го типа: 27, 27 а, 27b, 27c, 27d, 27e, 27f, 28, 29, 30,31. Каноническая структура 4-го типа: 27, 27 а, 27b, 27c, 27d, 27e, 28, 29, 30, 31. Каноническая структура 5-го типа: 27, 27 а, 27b, 27c, 27d, 28, 29, 30, 31. Каноническая структура 6-го типа: 27, 27 а, 28, 29, 30, 31. Что касается CDR2 легкой цепи, то известен только один тип канонической структуры для CDR2 в каппа-цепях, поэтому, кроме необычных рассматриваемых последовательностей антител, соотнесение осуществляется автоматически. Что касается CDR3 легкой цепи, то описано вплоть до шести типов канонической структуры для CDR3 в каппа-цепях, однако три из них встречаются редко. Три часто встречающиеся последовательности можно различить на основании их длины, как отражено в нумерации поKabat положенияй остатков 91-97: каноническая структура 1-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (также вместе с обязательным Pro в положении 95 и Gln, Asn или His в положении 90); каноническая структура 3-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 97; каноническая структура 5-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96 а, 97. После идентификации типов канонической структуры CDR рассматриваемого нечеловеческого антитела, человеческие гены цепи того же типа (тяжелой или легкой), которые имеют ту же комбинацию типов канонической структуры, что и рассматриваемое антитело, идентифицируют для образования кандидатной группы человеческих последовательностей. Большинство этих генных фрагментов описаны и уже соотнесены с типом канонической структуры (Chothia и др., 1992, Tomlinson и др., 1995). Что касается тяжелой цепи, то оценивают соответствие CDR1 и CDR2 типам канонической структуры мышиного антитела и исключают несоответствующие гены. Что касается легкой цепи, то сначала оценивают соответствие CDR1 и CDR2 каждой человеческой последовательности типам канонической структуры рассматриваемого антитела. Оценивают способность остатков 89-95 кандидатного гена V образовывать CDR3 того же типа канонической структуры, что и у рассматриваемого антитела, исходя из слияния данного гена с J-областью и применяя критерии определения типа канонической структурыCDR для CDR3 в этой слитой последовательности, и несоответствующие последовательности исключают. Альтернативно, когда вариабельный домен рассматриваемого антитела имеет тип канонической структуры, отсутствующий в человеческом геноме, то для сравнения рассматривают V-гены человеческой зародышевой линии, которые имеют трехмерные сходным, но не идентичные, типы канонической структуры. Такой случай часто имеет место для CDR1 каппа-цепи в мышиных антителах, включая два примера, описанных ниже. В мышиных антителах в этом CDR были обнаружены все 6 возможных типов канонической структуры, в то время как геном человека кодирует только канонические типы 2, 3, 4 и 6. В этих случаях для сравнения может быть выбран тип канонической структуры CDR, имеющий длину аминокислотных остатков в пределах двух длин аминокислотных остатков рассматриваемой нечеловеческой последовательности. Например, если в рассматриваемом антителе обнаружена каноническая струк- 21025174 тура 1-го типа, то для сравнения используют человеческие V -последовательности с канонической структурой 2-го типа. Если в мышином антителе обнаружена каноническая структура 5-го типа, то для сравнения используют человеческие V -последовательности с канонической структурой либо 3-го, либо 4-го типа. Для сравнения последовательностей можно рассматривать последовательности зрелых, перегруппированных человеческих антител. Такое рассмотрение может быть оправдано в ряде случаев, включая,но не ограничиваясь этим, примеры, когда зрелая человеческая последовательность (1) очень близка к зародышевой линии; (2) известна как неиммуногенная для людей; или (3) содержит тип канонической структуры, идентичный таковому для рассматриваемого антитела, но не обнаруженный в человеческой зародышевой линии. Что касается каждого из кандидатных V-генов с соответствующими типами канонической структуры, то идентичность и/или гомологию последовательностей по типу "остаток-к-остатку" в рассматриваемой последовательности также оценивают с целью ранжирования кандидатных человеческих последовательностей. Например, оцениваемые остатки являются следующими: (1) положения аминокислотных остатков CDR легкой цепи каппа (к) представляют собой CDR1 (26-32), CDR2 (50-52), CDR3 (91-96); и(2) положения аминокислотных остатков CDR тяжелой цепи представляют собой CDR1 (31-35) и CDR2(50-60). Кроме того, также можно рассматривать положения аминокислотных остатков 95-102 в CDR3 тяжелой цепи. Сначала оценивают в баллах гомологию "остаток-к-остатку" по количеству идентичных аминокислотных остатков между рассматриваемой последовательностью и кандидатными человеческими последовательностями. Человеческую последовательность, используемую для последующего конструирования преобразованного антитела, выбирают среди 25% кандидатов с самым высоким баллом. Если это целесообразно, например, когда несколько кандидатных последовательностей имеют аналогичные баллы в отношении идентичности, тогда можно дополнительно рассмотреть, при необходимости, сходство между неидентичными аминокислотными остатками. К указанным баллам добавляют совпадения между рассматриваемыми и целевыми остатками по типу "алифатический-с-алифатическим", "ароматический-сароматическим" или "полярный-с-полярным". В другом примере может быть проведена количественная оценка гомологии последовательностей с использованием матриц аминокислотных замен, таких как матрица BLOSUM62 от Henikoff и Henikoff. Целевую последовательность для каркасного участка, находящегося на С-конце последовательности CDR3, можно выбрать из набора известных J-сегментов человеческой зародышевой линии. Jпептидную последовательность выбирают по результатам оценки гомологии "остаток-к-остатку" для каждого J-сегмента для положений последовательности, по которым CDR3 и J перекрываются, используя критерии бальной оценки, установленные для оценки кандидатных V-генов, как упомянуто выше. Пептидную последовательность J-генного сегмента, используемую для последующего конструирования преобразованного антитела, выбирают среди 25% кандидатов с самым высоким баллом. В качестве примера химерная вариабельная цепь содержит по меньшей мере два CDR из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и каркасные последовательности из кандидатной человеческой последовательности. В другом примере химерная легкая цепь содержит три CDR из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и каркасные последовательности из кандидатной человеческой последовательности. В дополнительных примерах химерная тяжелая цепь содержит по меньшей мере два CDR из рассматриваемой тяжелой цепи и каркасную последовательность из кандидатной человеческой тяжелой цепи, или химерная тяжелая цепь содержит каждый из CDR из рассматриваемой тяжелой цепи и каркасные последовательности из кандидатной человеческой тяжелой цепи. В еще одном другом примере тяжелая цепь химерного антитела содержит CDR 1 и 2 из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и остатки 50-60 для CDR3 и остатки 61-65 для CDR из кандидатной человеческой тяжелой цепи вместе с каркасными последовательностями кандидатной человеческой последовательности. В другом примере последовательность химерной тяжелой цепи содержит каждый CDR из рассматриваемой нечеловеческой последовательности; каркасные последовательности 27-30 из рассматриваемой последовательности и каркасные последовательности из кандидатных последовательностей. Однако во всех случаях молекула химерного антитела содержит не более 10 аминокислотных остатков в каркасной последовательности, которые отличаются от остатков в каркасной последовательности кандидатной человеческой вариабельной области. Если желательно иметь гуманизированное антитело с повышенной аффинностью, то остатки в пределах CDR пребразованного антитела могут быть дополнительно заменены на другие аминокислоты. Обычно изменяют не более четырех аминокислотных остатков в CDR, и чаще всего будут изменены не более двух остатков в CDR, за исключением CDR2 тяжелой цепи, где могут быть изменены вплоть до 10 остатков. Изменения аффинности могут быть измерены традиционными способами, такими как способы,описанные в данной заявке (например, Biacore). Способы супергуманизации антител описаны более подробно в патенте США 6881557, который таким образом включен посредством ссылки во всей своей полноте.- 22025174 Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть сконструированы и получены с использованием традиционных методов, известных в данной области. Кроме того, полученные рекомбинантным способом антитела часто могут продуцироваться в больших количествах, в частности,при использовании векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии. Антитела могут быть секвенированы с использованием традиционных методов, известных в данной области. В одном аспекте аминокислотные последовательности одного или более CDR встроены в синтетическую последовательность, например, каркаса человеческого антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) с целью создания человеческого антитела, которое могло бы ограничить неблагоприятные побочные реакции лечения пациента-человека нечеловеческим антителом. Аминокислотные последовательности одного или более CDR также могут быть встроены в синтетическую последовательность, например, в связывающий белок, такой как АВИМЕР, с целью создания конструкции для введения пациенту-человеку. Такие методы можно модифицировать в зависимости от вида животного, подлежащего лечению. Например, что касается применений в ветеринарии, то антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок могут быть синтезированы для введения субъекту, не являющемуся человеком (например, примату, корове, лошади и т.д.). В другом аспекте, используя принятые в данной области техники методы, такие как методы, предложенные и включенные в данное описание, можно встраивать нуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности одного или более CDR, например, с помощью рекомбинантных методов в сайтах рестрикции эндонуклеазами существующего полинуклеотида, который кодирует антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок. Что касается экспрессии, то экспрессирующая система представляет собой систему, в которой применяется GS-система (Lonza), использующая ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Кратко, трансфекцию осуществляют в клетках СНО путем электропорации (250 В) с помощью GSсистемы (Lonza), в которой используют ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Клетки СНО дикого типа выращивали в DMEM (Sigma), содержащей 10% диализованной фетальной телячьей сыворотки (FCS), с 2 мМ глутамином. 6107 клеток СНО подвергают трансфекции с помощью 300 мкг линеаризованной ДНК путем электропорации. После электропорации клетки ресуспендируют вDMEM с глутамином и высевают в 36 х 96-луночные планшеты (50 мкл/лунка) и инкубируют при 37 С в 5% СО 2. На следующие сутки добавляют по 150 мкл/лунка селективной среды (DMEM без глутамина). Приблизительно через 3 недели колонии подвергают скринингу с помощью ELISA (см. ниже), используя нерелевантное антитело в качестве отрицательного контроля. Все колонии, продуцирующие более 20 мкг/мл, переносят в 24-луночные планшеты и затем в дублирующие флаконы Т 25. Что касается продукции на высоком уровне, то широко используемая экспрессирующая система млекопитающих представляет собой систему, в которой используют процедуру амплификации генов,обеспечиваемую дефектными по дегидрофолатредуктазе ("dhfr-") клетками яичника китайского хомячка. Эта система хорошо известна специалистам в данной области. Система основана на гене дегидрофолатредуктазы "dhfr", который кодирует фермент DHFR, катализирующий превращение дегидрофолата в тетрагидрофолат. Для достижения высокого уровня продукции, dhfr- клетки СНО подвергают трансфекции экспрессирующим вектором, содержащим функциональный ген DHFR вместе с геном, который кодирует целевой белок. В этом случае целевой белок представляет собой тяжелую цепь и/или легкую цепь рекомбинантного антитела. При увеличении количества конкурентного ингибитора DHFR метотрексата (МТХ) рекомбинантные клетки развивают устойчивость посредством амплификации гена dhfr. В стандартных случаях размер используемой единицы амплификации гораздо больше размера гена dhfr и в результате тяжелая цепь антитела амплифицируется совместно. При крупномасштабном получении белка, такого как цепь антитела, желательно, чтобы в расчет принимался как уровень экспрессии, так и стабильность используемых клеток. В долгоживущей культуре популяции рекомбинантных клеток СНО утрачивают однородность в отношении продуцирования ими конкретного антитела в процессе амплификации, даже если они происходят из одного родительского клона. Согласно настоящему изобретению предложены выделенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота), кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в данной заявке, векторы,содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева и экспрессирующие системы для транскрипции и трансляции таких полинуклеотидов в полипептиды. Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов,транскрипционных или экспрессирующих кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше. Согласно настоящему изобретению также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более конструкций, упомянутых выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая любое антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, которая предложена как таковая, образует аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела или- 23025174 его антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, который включает экспрессию посредством этого кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессия удобно достигается путем культивирования в соответствующих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данную нуклеиновую кислоту. После продукции посредством экспрессии антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода, затем использовать соответствующим образом. Конкретные антитела, антигенсвязывающие фрагменты и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот и векторы, описанные в данной заявке, могут быть предложены выделенными и/или очищенными,например, из их естественного окружения, по существу, в чистой или гомогенной форме. В данном случае нуклеиновая кислота не содержит или по существу не содержит нуклеиновую кислоту или гены,имеющие происхождение, отличное от последовательности, кодирующей полипептид с необходимой функцией. Нуклеиновая кислота может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Способы очистки хорошо известны в данной области. Системы клонирования и экспрессии полипептида во многих различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают клетки бактерий, млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка, клетки HeLa, клетки почки новорожденного сирийского хомячка, клетки мышиной миеломы NS0 и многие другие. Самым распространенным бактериальным хозяином является Е. coli. Экспрессия антител и фрагментов антител в прокариотических клетках, таких как Е. coli, является общепринятой в данной области. В качестве обзора см., например, Pluckthun, A. Bio/Technology, 9: 545551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве варианта получения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, см. недавние обзоры, например, Raff, М.Е. (1993) Curr. Opinion Biotech., 4: 573-576; Trill J.J. et al.(1995) Curr. Opinion Biotech., 6: 553-560, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом, или фагмидными, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых кислот, для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, подробно описаны в Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition,Ausubel et al. eds., John WileySons, 1992. Методы, описанные Sambrook и др. и Ausubel и др., включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте и хорошо известны в данной области. Таким образом, в другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту,которая описана в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любой подходящий метод. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, DEAE-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса осповакцины, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага. После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию нуклеиновой кислоты,например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии данного гена. В одном из воплощений нуклеиновая кислота интегрирована в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые способствуют рекомбинации с геномом, согласно стандартным способам. Для максимизации экспрессии можно использовать Ig-энхансер, при необходимости. Согласно настоящему изобретению также предложен способ, включающий применение конструкции, как указано выше, в экспрессирующей системе для экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов, упомянутых выше. Настоящее изобретение также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, таким как рекомбинантные молекулы ДНК или клонированные гены либо их вырожденные варианты, мутанты, аналоги или их фрагменты, которые кодируют антитело или антигенсвязывающую последовательность, описанные в данной заявке, которые связывают эндоглин. В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, которые связывают эндоглин.- 24025174 В другом воплощении полная ДНК-последовательность рекомбинантной молекулы ДНК или клонированного гена антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке, может быть функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, которая может быть введена в подходящего хозяина. Данная заявка соответственно распространяется на одноклеточных хозяев, трансформированных клонированным геном или рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую VH и/или VL, или их участки, данного антитела. Другим признаком является экспрессия последовательностей ДНК, описанных в данной заявке. Как хорошо известно в данной области, последовательности ДНК могут экспрессироваться в результате функционального связывания их с контролирующей экспрессию последовательностью в соответствующем экспрессирующем векторе и применения такого экспрессирующего вектора для трансформации соответствующего одноклеточного хозяина. Такое функциональное связывание последовательности ДНК с контролирующей экспрессию последовательностью несомненно включает, если не часть последовательности ДНК, то обеспечение инициирующего кодона ATG в корректной рамке считывания выше последовательности ДНК. Полинуклеотиды и векторы могут быть предложены в выделенной и/или очищенной форме (например, не содержащей или по существу не содержащей полинуклеотидов, имеющих происхождение,отличное от полинуклеотида, кодирующего полипептид с необходимой функцией). Как использовано в данной заявке, термин "по существу, чистый" и "по существу, не содержащий" относится к раствору или суспензии, содержащему(ей) менее чем, например, примерно 20% или меньше примеси, примерно 10% или меньше примеси, примерно 5% или меньше примеси, примерно 4% или меньше примеси, примерно 3% или меньше примеси, примерно 2% или меньше примеси или примерно 1% или меньше примеси. Для экспрессии последовательностей ДНК по данному изобретению можно использовать целый ряд комбинаций хозяин/экспрессирующий вектор. Полезные экспрессирующие векторы, например, могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК. Подходящие векторы включают, но не ограничиваются этим, производные SV40 (обезьяний вирус 40) и известные бактериальные плазмиды, например плазмиды Е. coli col El, Pcr1, Pbr322, Pmb9 и их производные, плазмиды, такие как RP4; фаговые ДНК, например многочисленные производные фага А, напримерNM989, и ДНК другого фага, например М 13, и однонитевую ДНК нитчатого фага; дрожжевые плазмиды,такие как плазмида 2 и или ее производные; векторы, полезные в эукариотических клетках, такие как векторы, полезные в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, такие как плазмиды, которые были модифицированы для использования фаговой ДНК, или другие контролирующие экспрессию последовательности; и тому подобное. Кроме того, согласно данному изобретению предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более полинуклеотидных конструкций. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данной заявке, образуют аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который включает экспрессию с полинуклеотида. Экспрессия может достигаться, например, путем культивирования в подходящих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данный полинуклеотид. Затем антитело можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода и использовать соответствующим образом. Любая из широкого спектра контролирующих экспрессию последовательностей - последовательностей, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, функционально связанной с ней, может быть использована в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК. Такие полезные,контролирующие экспрессию последовательности включают, например, ранние или поздние промоторы, регуляторные участки белка оболочки фага fd, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Pho5), промоторы факторов спаривания дрожжей и другие последовательности, известные для регуляции экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации. Системы клонирования и экспрессии полипептида во многих различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают клетки бактерий, млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка, клетки HeLa, клетки почки новорожденного сирийского хомячка, клетки мышиной миеломы NS0 и многие другие. Самым распространенным бактериальным хозяином является Е. coli. Экспрессия антител или антигенсвязывающих фрагментов в прокариотических клетках, таких как Е. coli, является общепринятой в данной области. В качестве обзора см., например, Pluckthun, A.Bio/Technology, 9: 545-551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области (Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech., 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995)Curr. Opinion Biotech., 6: 553-560). Широкий спектр одноклеточных клеток-хозяев также полезен для экспрессии последовательностей- 25025174 ДНК. Эти хозяева включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки СНО, YB/20, NS0, SP2/0, R1.1, B-W и L-M, клетки почки африканской зеленой мартышки(например, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 и ВМТ 10), клетки насекомых (например, Sf9), человеческие клетки и растительные клетки в тканевой культуре. Следует понимать, что не все векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии последовательностей ДНК. Также не все хозяева будут одинаково хорошо функционировать с одной и той же экспрессирующей системой. Однако специалист в данной области будет способен выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев без чрезмерного экспериментирования, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора необходимо учитывать хозяина, поскольку вектор должен в нем функционировать. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков. Средний специалист в данной области может выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора учитывают хозяина, поскольку вектор в нем функционирует. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков. Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов,транскрипционных или экспрессирующих кассет, как описано в другом месте в данной заявке, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности,включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, селектируемые маркеры и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом,фагмидой, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых кислот,для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, подробно описаны в Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John WileySons,1992. Методы, описанные Sambrook и др. и Ausubel и др., включены в данное описание посредством ссылки. При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, обычно учитывают множество факторов. Они включают, например, относительную эффективность системы, ее регулируемость и ее совместимость с конкретной последовательностью ДНК или геном, подлежащими экспрессии, в частности, что касается возможных вторичных структур. Подходящие одноклеточные хозяева будут выбраны с учетом, например, их совместимости с выбранным вектором, особенностей их секреции, их способности к корректному сворачиванию белков и необходимых условий их ферментации, а также токсичности для хозяина продукта, кодируемого последовательностями ДНК, подлежащими экспрессии, и легкости очистки продуктов экспрессии. В другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотидов, описанных в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ введения таких одного или более полинуклеотидов в клетку-хозяина любым подходящим методом. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция,DEAE-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса (например, вируса осповакцины), или, для клеток насекомых,бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например,трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофагов. После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию одного или более полинуклеотидов, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии одного или более полипептидов с одного или более полинуклеотидов. Можно использовать индуцибельные системы и индуцировать экспрессию путем добавления активатора. В одном из воплощений полинуклеотиды могут быть интегрированы в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными способами. В другом воплощении нуклеиновая кислота сохраняется на эписомном векторе в клетке-хозяине. В данной заявке предложены способы, включающие применение конструкции, которая указана выше, в экспрессирующей системе с целью экспрессии конкретного полипептида. Учитывая эти и другие факторы, специалист в данной области сможет сконструировать ряд комбинаций вектор/последовательность, контролирующая экспрессию/хозяин, которые будут экспрессировать- 26025174 последовательности ДНК при ферментации или крупномасштабном культивировании клеток животных. Полинуклеотид, кодирующий антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок,может быть получен рекомбинантным методом/методом синтеза в дополнение к клонированию, или скорее, клонирован. Полинуклеотид может быть сконструирован с использованием подходящих кодонов для антитела, антигенсвязывающего фрагмента или связывающего белка. В общем случае для предполагаемого хозяина будут выбраны предпочтительные кодоны, если данная последовательность будет использована для экспрессии. Полный полинуклеотид можно собрать из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и собранных в полную кодирующую последовательность; см., например, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol.Chem., 259: 6311 (1984). Общий метод сайт-специфического включения неприродных аминокислот в белки описан в Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael С. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 (April 1989). Этот метод можно использовать для создания аналогов с неприродными аминокислотами. Как упомянуто выше, последовательность ДНК, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть получена методом синтеза, а не клонирована. Последовательность ДНК может быть сконструирована с использованием подходящих кодонов для аминокислотной последовательности антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В общем случае, для предполагаемого хозяина можно будет выбрать предпочтительные кодоны, если данная последовательность будет использоваться для экспрессии. Полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и собранных в полную кодирующую последовательность; см., например, статьи Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem.,259: 6311 (1984), каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. С. Анализ иммуногенности in silico. При необходимости, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке,могут быть оценены в отношении иммуногенности и по мере необходимости могут быть деиммунизированы (т.е. антитело делают менее иммунореактивным путем изменения одного или более Т-клеточных эпитопов). Анализ иммуногенности и Т-клеточных эпитопов, имеющихся в гуманизированных антителах против эндоглина и антигенсвязывающих фрагментах, описанных в данной заявке, может быть осуществлен с использованием программного обеспечения и специальных баз данных. Типичные программное обеспечение и базы данных включают iTope, разработанную Antitope (Кембридж, Англия). iTope представляет собой технологию in silico для анализа связывания пептидов с человеческими аллелями МНС класса II. Программное обеспечение iTope прогнозирует связывание пептидов с человеческими аллелями МНС класса II и тем самым обеспечивает первоначальный скрининг для локализации таких "возможных Т-клеточных эпитопов". Программное обеспечение iTope прогнозирует благоприятные взаимодействия между аминокислотными боковыми цепями пептида и специфическими связывающими "карманами" в пределах связывающих желобков 34 человеческих аллелей МНС класса II. Расположение ключевых связывающих остатков определяют, создавая in silico 9-мерные пептиды, которые перекрываются на одну аминокислоту, охватывая последовательность вариабельной области тестируемого антитела. Каждый 9-мерный пептид может быть протестирован относительно каждого из 34 аллотипов МНС класса II и оценен в баллах на основании их потенциального "соответствия" и взаимодействий со связывающим желобком молекул МНС класса II. Пептиды, которые дают высокий средний балл за связывание (более 0,55 согласно оценке в iTope) относительно более 50% аллелей МНС класса II, рассматриваются в качестве потенциальных Т-клеточных эпитопов. В таких участках анализируют коровую 9-аминокислотную последовательность в отношении пептидного связывания в пределах желобка молекул МНС класса II с целью определения остатков "кармана" (Р 1, Р 4, Р 6, Р 7 и Р 9) молекул МНС класса II и возможных принимающих участие в контакте остатков (Р-1, Р 2, Р 3, Р 5, Р 8) Т-клеточного рецептора (TCR). После идентификации всех Т-клеточных эпитопов с целью удаления идентифицированного Т-клеточного эпитопа могут быть произведены изменения, замены, вставки и/или делеции аминокислотных остатков. Такие изменения могут быть сделаны таким образом, чтобы сохранить структуру и функцию антитела, несмотря на удаление идентифицированного эпитопа. Типичные изменения могут включать, но не ограничиваются этим, консервативные аминокислотные замены. Стали применяться методы, в которых используются растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами. Эти реагенты и процедуры можно использовать для идентификации присутствия Т-клеточных клонов из образцов периферической крови субъектов: людей или экспериментальных животных, которые способны связывать определенные МНС-пептидные комплексы и не подходят для скрининга многочисленных возможных эпитопов в отношении широкого разнообразия аллотипов МНС. Биологические анализы Т-клеточной активации остаются лучшим практическим средством определения способности тестируемой пептидной/белковой последовательности вызывать иммунный ответ.- 27025174 Примеры этого вида подхода включают применение анализов Т-клеточной пролиферации для бактериального белка стафилокиназы с последующим картированием эпитопов с использованием синтетических пептидов для стимуляции Т-клеточных линий. Аналогично, анализы Т-клеточной пролиферации с использованием синтетических пептидов белка столбнячного токсина привели к определению иммунодоминантных эпитопных участков данного токсина. В одном из воплощений Т-клеточные эпитопы в тестируемом белке можно определить, используя выделенные подгруппы человеческих иммунных клеток,стимулируя их дифференцировку in vitro и культивируя клетки в присутствии представляющих интерес синтетических пептидов и измеряя любую индуцированную пролиферацию в культивируемых Т-клетках. Также можно использовать другие методы. Такой метод включает тщательное применение методов выделения клеток и клеточное культивирование с множественными добавками цитокинов с целью получения желаемых подгрупп иммунных клеток (дендритных клеток, CD4+ и/или CD8+ Т-клеток). В другом воплощении присутствие Т-клеточных эпитопов в антителе можно определить путем добавления данного антитела к выделенным подгруппам человеческих иммунных клеток и оценки их дифференцировки in vitro и измерения индуцированной пролиферации в культивируемых Т-клетках. Для определения лигандов МНС класса II для многочисленных, представляющих терапевтический интерес белков также можно применять методы in silico. Однако по причинам, таким как необходимость протеолитического процессинга и других физиологических стадий, приводящих к презентации иммуногенных пептидов in vivo, подгруппа полного репертуара пептидов, определяемых с использованием компьютеризированных схем, может иметь конечную биологическую значимость. Таким образом, анализы активации Т-клеток человека ex vivo можно использовать для идентификации участков в белковой последовательности полипептида, которые способны поддерживать активацию Т-клеток и поэтому являются наиболее биологически релевантными в отношении проблемы иммуногенности этого белка. Как использовано в данной заявке, "Т-клеточный эпитоп" относится к аминокислотной последовательности,которая способна связывать МНС класса II, способна стимулировать Т-клетки и/или также связывать (не обязательно с измеримой активацией) Т-клетки в комплекс с МНС класса II. Согласно способу, описанному в данной заявке, синтетические пептиды или целые антитела тестируют в отношении их способности вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых in vitro. Т-клетки присутствуют в слое мононуклеарных клеток периферической крови(РВМС), легко получаемом хорошо известными методами из образцов цельной крови. Кроме того, препарат РВМС содержит физиологических соотношения Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток и поэтому представляет собой хороший источник материалов, с которыми проводят псевдоиммунную (surrogate immune) реакцию in vitro. При проведении такого анализа индекс стимуляции, приближающийся или превышающий 2,0, является полезным показателем индуцированной пролиферации. Однако индекс стимуляции может отличаться в зависимости от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и может быть установлен с учетом исходного уровня для каждого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и соответствующей пептидной библиотеки. В одном из примеров такого тестирования индекс стимуляции (SI) может быть получен стандартно путем деления показателя пролиферации (например, числа импульсов, соответствующих радиоактивности, в минуту при использовании, например, включения 3 Нтимидина), измеренного для тестируемого пептида, на показатель, измеренный в клетках, не контактировавших с тестируемым пептидом. Пептиды, которые не индуцируют никакого ответа, могут давать SI = 1,0, хотя также могут встречаться значения SI в диапазоне 0,8-1,2. С целью обеспечения надежности регистрируемых количественных показателей при проведении таких анализов может быть использован ряд технических процедур. Обычно все определения выполняют по меньшей мере в трех повторах, и можно вычислить среднее значение показателя. Если вычисленные значения SI составляют не менее 2,0, то можно исследовать индивидуальные показатели, взятые в трех повторах, на наличие резко отклоняющихся значений. Тестируемые пептиды приводят в контакт с клетками по меньшей мере в двух разных концентрациях, и эти концентрации обычно охватывают как минимум двухкратное различие в концентрации. Такой диапазон концентраций обеспечивает отклонение для кинетического измерения в данном анализе и может быть полезен в случае проведения определения в одной временной точке, например, в сутки плюс 7. В некоторых анализах могут проводиться многочисленные определения в зависимости от времени, и это также может быть выполнено с использованием пептидного иммуногена, взятого как минимум в двух различных концентрациях. Аналогично, в каждый планшет для анализа могут быть введены контрольные пептиды, на которые, как ожидается, будет отвечать большинство образцов доноров РВМС. Пептид 307-309 гемагглютинина вируса гриппа с последовательностью PKYVKQNTLKLA (SEQID NO: 104) и пептидная последовательность KVVDQIKKISKPVQH (SEQ ID NO: 105) HSP 60 (белок теплового шока) хламидий являются примерами контрольных пептидов, используемых в таком анализе. Альтернативно или дополнительно, в анализах также может быть использован мощный целый белковый антиген, такой как гемоцианин лимфы улитки, в отношении которого, как можно было бы ожидать, все образцы РВМС будут демонстрировать SI значительно выше 2,0. Другие контрольные антигены для такого применения будут хорошо известны в данной области. Способы, описанные в данной заявке, могут обеспечить эпитопную карту антител или их антигенсвязывающих фрагментов, где карта релевантна в отношении широкого спектра возможных аллотипов- 28025174 МНС. Такая карта может быть достаточно репрезентативной для обеспечения конструирования или выбора модифицированного белка, для которого способность белка вызывать запускаемый Т-клетками иммунный ответ может быть устранена или, по меньшей мере, ослаблена у большинства пациентов, которым по всей вероятности будет введен данный белок. Ослабление может относиться к снижению иммунного ответа (т.е. уменьшенной иммуногенности) по сравнению с немодифицированным белком (например, примерно в 1,5 раза, примерно в 2 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз,примерно в 50 раз, примерно в 100 раз, примерно в 200 раз, примерно в 500 раз или более или в любом диапазоне, упомянутом здесь). Альтернативно, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты с уменьшенной иммуногенностью могут ссылаться на процент снижения их способности вызывать иммунный ответ по сравнению с немодифицированным белком (например, примерно на 1, примерно на 2,примерно на 3, примерно на 4, примерно на 5, примерно на 10, примерно на 20, примерно на 50, примерно на 100% и в любом диапазоне, упомянутом здесь). Соответственнно, при практическом применении процесса скрининга, происходящие из РВМС Т-клетки от интактных доноров собирают из пула доноров с достаточным иммунологическим разнообразием для получения образца, содержащего по меньшей мере более 90% репертуара МНС класса II (HLA-DR), существующего в настоящее время в человеческой популяции. Если на практике необходимо измерить ответ интактных Т-клеток, то заданный синтетический пептид (или антитело), пептид (или антитело) приводят в контакт с препаратами РВМС, полученными от многочисленных доноров отдельно; количества доноров (или размер "пула доноров") для практических целей, по-видимому, не должны быть меньше 20 неродственных индивидуумов, и все образцы в пуле доноров могут быть предварительно выбраны в соответствии с их гаплотипом МНС класса II. Как использовано в данной заявке, термин "интактный донор" относится к субъекту, который ранее не подвергался воздействию антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, ни в результате воздействия окружающей среды, ни в результате вакцинации или других способов,таких как, например, переливание крови. При скрининге Т-клеточных эпитопов могут быть получены Т-клетки из образца периферической крови от большого количества разных здоровых доноров, но тех, кто не получал данный белок терапевтически. При необходимости, образцы крови пациентов могут быть протестированы на присутствие конкретного полипептида с использованием традиционных анализов, таких как ELISA, в которых используются антитела для идентификации присутствия или отсутствия одного или более полипептидов. Анализ проводят, используя РВМС, культивируемые in vitro, с применением традиционных процедур, известных в данной области и включающих приведение РВМС в контакт с разновидностями синтетических пептидов, характерных для интересующего белка (т.е. с библиотекой), или целым белком, таким как антитело,и после подходящего периода инкубации измерение индуцированной Т-клеточной активации, такой как клеточная пролиферация. Измерение может быть выполнено с использованием любых подходящих средств и может быть проведено, например, с использованием включения 3 Н-тимидина, где накопление 3 Н в клеточном материале легко измеряют с помощью лабораторного оборудования. Степень клеточной пролиферации для каждой комбинации образца РВМС и синтетического пептида или целого белка может быть исследована в сравнении с таковой, наблюдаемой в необработанном образце РВМС. Сравнение также может быть сделано в отношении пролиферативного ответа, наблюдаемого после обработки пептидом или пептидами либо целыми белками, для которых существует ожидаемый пролиферативный эффект. В этом отношении предпочтительно использовать пептид или целый белок с известной широкой рестрикцией по МНС и особенно пептидные эпитопы с рестрикцией по МНС для изотипов DP или DQ,хотя изобретение не ограничивается применением таких рестриктированных пептидов или белков. Такие пептиды были описаны выше, например, в отношении гемагглютинина вируса гриппа и HSP60 хламидий. В одном неограничивающем примере Т-клеточные эпитопы картируют и затем модифицируют, используя способы, описанные в данной заявке. Для облегчения составления эпитопной карты получают библиотеку синтетических пептидов. Каждый из пептидов имеет длину 15 аминокислотных остатков и каждый перекрывает следующий пептид в этой серии на 12 аминокислотных остатков; т.е. каждый последующий пептид в этой серии шаг за шагом добавлял следующие 3 аминокислоты для анализа. Таким образом, любая заданная смежная пара пептидов картирует 18 аминокислот непрерывной последовательности. Один из способов определения Т-клеточной карты с использованием анализов интактных Тклеток проиллюстрирован ниже в Примерах. Предполагают, что каждый из пептидов, идентифицированных методом с использованием определения Т-клеточной карты, способен связывать МНС класса II и захватывать по меньшей мере один когнатный TCR с достаточной аффинностью для индукции пролиферативного "взрыва", детектируемого в аналитической системе. В другом неограничивающем примере оценивают способность антитела подвергаться процессингу с получением Т-клеточных эпитопов, которые связывают МНС класса II и захватывают по меньшей мере один родственный TCR с достаточной аффинностью для индукции пролиферативного "взрыва", детектируемого в аналитической системе. Молекулы, описанные в данной заявке, могут быть получены любым из нескольких путей, включающих использование рекомбинантных методов. Белковые последовательности и информация, предло- 29
МПК / Метки
МПК: A61K 39/395
Метки: против, эндоглина, антитела
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-25174-antitela-protiv-endoglina.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Антитела против эндоглина</a>
Антитела против c-kit и их применение
Номер патента: 23665
Опубликовано: 30.06.2016
Авторы: Аматулли Майкл, Паз Керен
МПК: C07K 16/28, A61K 45/06, A61K 39/395...
Метки: c-kit, антитела, применение, против
Формула / Реферат:
1. Антитело, которое специфически связывается с внеклеточным доменом (ВКД) с-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1...
Моноклональные антитела против ферропортина 1 и их применение
Номер патента: 20472
Опубликовано: 28.11.2014
Авторы: Льюнг Донмьенн Доэн Мун, Уитчер Деррик Райан, Луань Пэн, Манетта Джозеф Винсент, Тан Ин
МПК: A61K 39/395, C07K 16/28
Метки: моноклональные, ферропортина, антитела, применение, против
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат участки LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие аминокислотные последовательности:a) SEQ ID NO:37, 129, 22, 107, 118 и 120 соответственно;b) SEQ ID NO:37, 174, 22, 175, 176 и 120 соответственно;c) SEQ ID NO:37, 125, 22, 23, 110 и 19 соответственно;d) SEQ ID NO:37, 177, 22, 23, 112 и 19 соответственно илиe) SEQ ID NO:37, 122, 22, 23, 110 и 19...
Гуманизированные антитела против tl1a
Номер патента: 20886
Опубликовано: 27.02.2015
Авторы: Канакарадж Паланисами, Кукси Бриджет А., Рошке Виктор, Смит Роджер, Роузен Крейг
МПК: A61P 35/00, A61P 37/06, A61K 39/395...
Метки: антитела, против, гуманизированные
Формула / Реферат:
1. Выделенный антигенсвязывающий полипептид, специфично связывающийся с TL1A, который содержит:(а) вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, которая содержит:(1) CDR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7;(2) CDR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;(3) CDR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9;(b) вариабельную область легкой цепи...
Антитела против m-csf
Номер патента: 11669
Опубликовано: 28.04.2009
Авторы: Келлерманн Зирид-Аймее, Лоу Джозеф Эдвин, Хаак-Френдшо Мэри, Девалараджа Мадхав Нарасимха, Бедиан Вахе, Фолтц Ян, Мобли Джеймс Лесли
МПК: A61P 43/00, C07K 16/00, C12N 15/00...
Метки: антитела, против, m-csf
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с M-CSF, которые содержат a) тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,...
Композиции антитела против cd3
Номер патента: 14025
Опубликовано: 30.08.2010
Авторы: Деан Иянн, Коско-Вильбуа Мари, Элсон Грег
МПК: A61K 39/395, A61P 37/06, C07K 16/28...
Метки: композиции, против, антитела
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция антитела против CD3, по существу, состоящая из:a) pH-буферного средства в диапазоне 10-50 мМ, эффективного в диапазоне 5,0-6,0, где указанное pH-буферное средство представляет собой ацетат натрия;b) хлорида натрия в количестве 100-140 мМ;c) 0,02% вес./об. поверхностно-активного вещества иd) фармацевтически эффективного количества антитела против CD3.2. Фармацевтическая композиция антитела против CD3, по существу,...
Предыдущий патент: Улучшение суспендирующих характеристик инвертных эмульсий
Следующий патент: Устройство фотодинамической терапии для подачи фотоактивируемой композиции к месту лечения
Случайный патент: Способ получения пропиленгликоля