Антитела против c-kit и их применение

Изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с внеклеточным доменом Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с внеклеточным доменом c-Kit человека, фармацевтическим композициям, включающим эти антитела, и их применению в лечении заболеваний или нарушений, связанных с экспрессией и/или активностью c-Kit, таких как опухоль, рак и/или нарушение пролиферации клеток.c-Kit представляет собой рецепторную тирозинкиназу, также известную как, например, рецептор фактора стволовых клеток (ФСК, SCF) или CD-117. c-Kit и ее лиганд, ФСК, опосредуют различные биологические функции, включая гемопоэз, меланогенез, эритропоэз, сперматогенез, карциногенез, фиброз,воспаление, дифференцировку и пролиферацию тучных клеток и иммунологические процессы. ГЛИВЕК (иматиниб мезилат) и СУТЕНТ (сунитиниб малат) представляют собой одобренные и доступные на рынке фармацевтические низкомолекулярные продукты, которые ингибируют многочисленные рецепторные тирозинкиназы, включая c-Kit. Однако в настоящий момент очевидно, что польза от таких средств терапии при применении по одобренным назначениям обычно ограничена, поскольку опухолевые клетки часто имеют или быстро приобретают обусловленную мутациями устойчивость к лекарственным средствам. Известны антитела против c-Kit человека. Однако применение известных антител против c-Kit в лечении рака менее желательно, поскольку они ингибируют интернализацию c-Kit, стимулируют агонистическую активность c-Kit, например фосфорилирование c-Kit в опухолевых клетках, или лишены других свойств, являющихся оптимальными для их эффективного применения в качестве терапевтических противоопухолевых агентов. Например, в заявке WO 2007/127317 раскрыты гуманизированные антитела против c-Kit и данные,относящиеся к ним, связанные в первую очередь с влиянием антител на тучные клетки, гемопоэз, меланогенез и сперматогенез. Следует отметить, что сообщается, что антитела, описанные в заявкеWO 2007/127317, "эффективно ингибируют опосредуемые ФСК фосфорилирование и интернализациюc-Kit в клетках Mo7e". Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает альтернативные моноклональные антитела,специфически нацеленные на внеклеточный домен (ВКД) с-Kit человека. Настоящее изобретение обеспечивает также моноклональные антитела, специфически нацеленные на ВКД c-Kit человека, способные индуцировать интернализацию и/или деградацию c-Kit, связанной с плазматической мембраной, не индуцируя при этом активность агонистов c-Kit, например фосфорилирование c-Kit в опухолевых клетках,и/или обладающие другими клиническими свойствами (например, улучшенной растворимостью, стабильностью in vitro или in vivo или другими фармакокинетическими свойствами), которые являются полезными для их эффективного применения в качестве терапевтических противораковых агентов. Ожидается, что такие антитела будут более эффективными в лечении рака и замедляют или предотвращают возникновение опосредованной мутациями лекарственной устойчивости и/или излечивают типы рака,устойчивые к известным средствам терапии, что является преимуществом. Таким образом, антитела против c-Kit, описанные в настоящем изобретении, удовлетворяют важную потребность, существующую в данной области техники. Один аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи(HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1,CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собойDASSLES (SEQ ID NO: 5) и CDRL3 представляет собой CQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6). Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей антитело, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 иCDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO: 3), CDRL1 представляет собой RASQGISSALA (SEQ ID NO: 4), CDRL2 представляет собой DASSLES (SEQ ID NO: 5) и CDRL3 представляет собой CQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6) вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или вспомогательным веществом. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1),CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой(SEQ ID NO: 6), для применения в терапии. Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает антитело, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1),CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой(SEQ ID NO: 6), для применения в лечении рака. Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает применение антитела, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIGCQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6), для изготовления медицинского препарата для лечения рака, опухоли и/или нарушения пролиферации клеток. Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ лечения рака у человека, нуждающегося в лечении, включающий введение указанному человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 иCDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO: 3), CDRL1 представляет собой RASQGISSALA (SEQ ID NO: 4), CDRL2 представляет собой DASSLES (SEQ ID NO: 5) и CDRL3 представляет собой CQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6). В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака у человека, нуждающегося в лечении, включающий введение указанному человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое специфически связывается с внеклеточным доменом c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 иCDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO: 3), CDRL1 представляет собой RASQGISSALA (SEQ ID NO: 4), CDRL2 представляет собой DASSLES (SEQ ID NO: 5) и CDRL3 представляет собой CQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6), в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного другого терапевтического агента. В предпочтительных вариантах реализации другой терапевтический агент представляет собой противораковый агент. Другие аспекты настоящего изобретения предусматривают изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению, экспрессирующие векторы, включающие молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяева, содержащие указанные молекулы нуклеиновой кислоты. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показан результат анализа методом вестерн-блоттинг тотальной с-Kit, присутствующей в тотальных лизатах клеток линии клеток опухоли человека Mo7e и GIST882, до и после обработки клетокin vitro МАТ против c-Kit CK6. МАТ против с-Kit CK6 резко времязависимым образом индуцировали деградация c-Kit, экспрессируемой клетками опухоли человека. На фиг. 2 показан результат анализа методом вестерн-блоттинг тотальной с-Kit, присутствующей в тотальных лизатах клеток линии клеток опухоли человека GIST882, с МАТ против c-Kit CK6 и без него. Не наблюдали значительной времязависимой индукции деградации c-Kit, экспрессируемой опухолевыми клетками человека GIST882, под действием МАТ против c-Kit CK6. На фиг. 3 показан результат анализа методом вестерн-блоттинг тотальной с-Kit, присутствующей в тотальных лизатах клеток линии клеток опухоли человека Mo7e, с МАТ против c-Kit CK6 и без него. Не наблюдали значительной времязависимой индукции деградации c-Kit, экспрессируемой опухолевыми клетками человека Mo7e, под действием МАТ против c-Kit CK6. На фиг. 4 показан результат анализа методом вестерн-блоттинг тотальной с-Kit, присутствующей в тотальных лизатах клеток линии клеток опухоли человека Malm-3 М, с МАТ против c-Kit CK6 и без него. Не наблюдали значительной времязависимой индукции деградации c-Kit, экспрессируемой опухолевыми клетками человека Malm-3 М, под действием МАТ против c-Kit CK6. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с ВКД c-Kit человека, которые можно применять, например, в лечении заболеваний или нарушений, связанных с экспрессией и/или активностью c-Kit, таких как опухоли, рак и/или нарушения пролиферации клеток. Термин "антитело" в настоящем описании относится к моноклональному антителу, если не указано иное. Термин "моноклональное антитело" и его аббревиатура "МАТ" обозначают антитела, происходящие от единичной копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, при помощи которого они были получено. Антитело в соответствии со значением этого термина в настоящем описании может представлять собой интактное антитело (включающее полный или полноразмерный Fc-участок), или его часть, или его фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, например Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент или F(ab')2-фрагмент, который связывается с ВКД c-Kit человека, состоящий из последовательности аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 20. Например, фрагменты антитела, способные связываться с ВКД c-Kit и охватываемые настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются перечисленными, бивалентные фрагменты, такие как (Fab')2 с сохраненными внутрицепочечными дисульфидными связями, моновалентные фрагменты, такие как FabLCVR-CL и HCVR-СН 1 и не содержащим шарнирной области тяжелой цепи (например, полученные в результате расщепления папаином), Fab-фрагменты, которые содержат шарнирную область тяжелой цепи, Facb (например, полученные в результате расщепления плазмином), F(ab')2, Fab', который лишен дисульфидных связей, pFc' (например, полученные в результате расщепления пепсином или плазмином), FdPharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York,p. 269-315, 1994). Предполагается, что фрагменты антител включают также, например, антитела с удаленными доменами, линейные антитела, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, мультивалентные одноцепочечные антитела, мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител,включая диатела, триатела и т.п., которые специфически связываются с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20. Подразумевается, что независимо от того, обозначены ли отдельно антигенсвязывающие фрагменты или части, термин "антитело" в настоящем описании включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы, если не указано иное. Легкая цепь может включать одну вариабельную область (которая в настоящем описании сокращенно обозначается LCVR) и/или константную область (которая в настоящем описании сокращенно обозначается CL). Легкие цепи антител человека (иммуноглобулинов) представляют собой легкие цепи каппаили легкие цепи лямбда . Выражение "LCVR" в настоящем описании включает вариабельные области как легких цепей каппа-типа (V), так и легких цепей лямбда-типа (V). Тяжелая цепь может также включать одну вариабельную область (которая в настоящем описании сокращенно обозначается HCVR) и/или в зависимости от класса или изотипа антитела три или четыре константных домена (CHI, СН 2, СН 3 и СН 4; для обозначения их всех в рамках настоящего изобретения используют общую аббревиатуру СН). IgG1 человека представляет собой предпочтительный изотип антител согласно настоящему изобретению. Три области, именуемые гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность (CDR), присутствуют в каждой из LCVR и HCVR; они поддерживаются менее вариабельными участками, именуемыми каркасными (которые в настоящем описании сокращенно обозначаютсяFR). Аминокислоты относят к конкретному CDR области или домену в соответствии с правилом KabatInterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242 (1991. Каждая из HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Части антитела, состоящие из областей LCVR и HCVR, обозначаются Fv (вариабельный фрагмент) и образуют антигенсвязывающий сайт. Одноцепочечный Fv (scFv) представляет собой фрагмент антитела, содержащий областьLCVR и область HCVR на одной полипептидной цепи, где N-конец одного домена и С-конец второго домена связаны гибким линкером. Термин "антитело человека" в настоящем описании включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевой линии человека (как описано Kabat с соавт., см. выше). Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Специфичность антител согласно настоящему изобретению в отношении c-Kit можно определить на основании аффинности и/или авидности. Аффинность, выражаемая равновесной константой диссоциации антигена с антителом (KD), является мерой связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим сайтом. Для измерения кинетики связывания и аффинности антител, раскрытых в настоящем изобретении, можно использовать Биосенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР, SPR), такой как BIAcore 3000. Система BIAcore использует оптические свойства ППР для обнаружения изменения концентрации белка взаимодействующих молекул в декстрановой матрице биосенсора. Кинетику связывания моноклональных антител против c-Kit, включая значения KD, можно определить при помощи биосенсора на основе ППР, сущность которого описана в примере 4 ниже. Фраза "специфически связывает" применительно к аффинности антитела против c-Kit к ВКД c-Kit,если не указано обратное, обозначает в настоящем описании значения KD ниже приблизительно 210-10 М, предпочтительно между приблизительно 210-10 М и приблизительно 210-12 М в соответствии с определением обычными способами, известными в данной области техники, включая применение биосенсора на основе ППР, который, по существу, описан в настоящем документе. Один аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой(SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению включают LCVR, причем аминокислотная последовательность LCVR представляет собойSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 13) и HCVR,при этом аминокислотная последовательность HCVR представляет собой(SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению включают тяжелую цепь и легкую цепь, причем аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собойSEQ ID NO: 9 и аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 15. В других вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению включают две тяжелые цепи и две легкие цепи, причем аминокислотная последовательность каждой из тяжелых цепей представляет собой SEQ ID NO: 9 и аминокислотная последовательность каждой из легких цепей представляет собой SEQ ID NO: 15. Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой(SEQ ID NO: 6), при этом указанное антитело обладает по меньшей мере одним свойством, которое выбрано из 1) ингибирования связывания c-Kit человека с ФСК человека; 2) полного антагонизма с-Kit человека; 3) ингибирования ФСК-зависимых сигнальных путей; 4) ингибирования ФСК-независимой активации c-Kit человека; 5) индукции интернализации c-Kit человека; 6) индукции деградации c-Kit человека; 7) ингибирования роста опухолевых клеток in vitro; 8) ингибирования роста опухолевых клеток invivo и 9) связывания с ВКД c-Kit человека со значением KD ниже приблизительно 210-10 М. В предпочтительном случае такое антитело обладает по меньшей мере двумя свойствами, выбранными из пп. (1)(9). В более предпочтительном случае такое антитело обладает по меньшей мере тремя свойствами, выбранными из пп.(1)-(9). В более предпочтительном случае такое антитело обладает по меньшей мере четырьмя свойствами, выбранными из пп.(1)-(9). В еще более предпочтительном случае такое антитело обладает по меньшей мере пятью свойствами, выбранными из пп.(1)-(9). В наиболее предпочтительном случае такое антитело обладает свойствами по пп.(1)-(9). В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20, со значением KD, измеренным методом ППР при 25 С, ниже приблизительно 210-10 М,-4 023665 предпочтительно между приблизительно 210-10 М и приблизительно 210-12 М, более предпочтительно между приблизительно 100 и приблизительно 5 пМ и еще более предпочтительно между приблизительно 100 и приблизительно 10 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 75 и приблизительно 25 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 75 и приблизительно 50 пМ и наиболее предпочтительно между приблизительно 70 и приблизительно 60 пМ. В некоторых вариантах реализации изобретение предусматривает антитело, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20, где связывание антитела с ВКД c-Kit вызывает интернализацию c-Kit. Предпочтительно связывание антитела с ВКД рецептора c-Kit вызывает интернализацию по меньшей мере 50% c-Kit, экспрессированного на поверхности опухолевых клеток, после обработки опухолевых клеток приблизительно 1 мкг/мл указанного антитела в течение приблизительно 1 ч при 37 С, что определяют методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) в анализе интернализации c-Kit in vitro, сущность которого описана в примере 6 ниже. Более предпочтительно связывание антитела с ВКД рецептораc-Kit вызывает интернализацию по меньшей мере 75% c-Kit, экспрессированного на поверхности опухолевых клеток, после обработки опухолевых клеток приблизительно 1 мкг/мл указанного антитела в течение приблизительно 6 ч при 37 С, что определяют методом FACS в анализе интернализации c-Kit invitro, сущность которого описана в примере 6 ниже. В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20, где связывание антитела с ВКД c-Kit вызывает разрушение связанной с плазматической мембраной c-Kit, экспрессируемой опухолевыми клетками. Предпочтительно связывание антитела с ВКДc-Kit вызывает деградацию по меньшей мере 50% связанной с плазматической мембраной c-Kit, экспрессируемого опухолевыми клетками, после обработки опухолевых клеток 100 нг/мл указанного антитела в течение приблизительно 12 ч при 37 С, что определяют в анализе деградации c-Kit in vitro, сущность которого описана в примере 7 ниже. Более предпочтительно связывание антитела с ВКД c-Kit вызывает деградацию по меньшей мере 75% связанной с плазматической мембраной с-Kit, экспрессируемой опухолевыми клетками, после обработки опухолевых клеток 100 нг/мл указанного антитела в течение приблизительно 24 ч при 37 С, что определяют в анализе деградации c-Kit in vitro, сущность которого описана в примере 7 ниже. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20, где связывание антитела с ВКД c-Kit ингибирует индуцированное ФСК фосфорилирование c-Kit и/или MAPK в анализе на опухолевых клетках in vitro. Предпочтительно антитело против с-Kit ингибирует индуцированное ФСК фосфорилирование c-Kit и/или MAPK в анализе на опухолевых клетках in vitro со значением IC50 ниже приблизительно 1 нМ, более предпочтительно между приблизительно 1 нМ и приблизительно 1 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 500 и приблизительно 5 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 500 и приблизительно 10 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 500 и приблизительно 100 пМ, еще более предпочтительно между приблизительно 500 и приблизительно 250 пМ или наиболее предпочтительно приблизительно 300 пМ. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20, где связывание антитела с ВКД c-Kit ингибирует рост опухолевых клеток в анализе in vivo, который проводят, по существу, как описано в примере 11 ниже. В предпочтительном случае связывание антитела с ВКД c-Kit ингибирует рост опухолевых клеток по меньшей мере на 30% в анализе in vivo, который проводят, по существу, как описано в примере 11 ниже. Более предпочтительно связывание антитела с ВКД c-Kit ингибирует рост опухолевых клеток по меньшей мере на 50% в анализеin vivo, который проводят, по существу, как описано в примере 11 ниже. Еще более предпочтительно связывание антитела с ВКД c-Kit ингибирует рост опухолевых клеток лейкоза, мелкоклеточного рака легкого, меланомы, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ), саркомы Юинга, рака почки и/или нейробластомы по меньшей мере приблизительно на 30% или еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60% в анализе in vivo, который проводят, по существу, как описано в примере 11 ниже. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения нарушения, связанного с повышенной лигандзависимой или лиганднезависимой активностью c-Kit; причем указанный способ включает введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности,соответствующей SEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIGCQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6). В одном варианте реализации указанное нарушение представляет собой рак."Нарушение" или "заболевание" представляет собой любое состояние, на которое лечение с применением антитела или способа согласно настоящему изобретению оказывает благотворное действие. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включающие патологические состояния,которые предрасполагают человека к возникновению нарушения, о котором идет речь. Например, нарушения, которые можно лечить с использованием антител согласно настоящему изобретению, включают злокачественные и доброкачественные опухоли, карциному, лейкемию, бластому и саркому, включая, но не ограничиваясь ими, лейкемию, мелкоклеточный рак легкого, меланому, СОЖКТ, саркому Юинга, рак почки и нейробластому. Предпочтительно нарушения, которые можно лечить при помощи антител согласно настоящему изобретению, включают c-Kit-зависимые злокачественные и доброкачественные опухоли, cKit-зависимые карциному, лейкемию, бластому и саркому, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лейкемию, мелкоклеточный рак легкого, меланому, СОЖКТ, саркому Юинга, рак почки и нейробластому. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения рака у человека, включающему введение указанному человеку, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению, причем рак выбирают из группы, состоящей из лейкоза,мелкоклеточного рака легкого, меланомы, СОЖКТ, саркомы Юинга, рака почки и нейробластомы. Предпочтительно рак является c-Kit зависимым. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую одно или более антител против c-Kit согласно настоящему изобретению вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или вспомогательным веществом. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело против c-Kit, описанное в настоящем документе, для применения в терапии. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает любое из антител против c-Kit, описанных в настоящей заявке, для применения в лечении рака. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает любое из антител против c-Kit, описанных в настоящей заявке, для применения в лечении рака, где рак выбирают из группы, состоящей из лейкоза,мелкоклеточного рака легкого, меланомы, СОЖКТ, саркомы Юинга, рака почки и нейробластомы. В предпочтительном случае рак является c-Kit зависимым. В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение антитела против c-Kit, описанного в настоящей заявке, в изготовлении лекарственного средства для лечения рака, опухоли и/или нарушения пролиферации клеток. В предпочтительном случае рак является c-Kit зависимым. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы, включающие введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Kit, описанного в настоящей заявке, вместе с эффективным количеством другого терапевтического агента (такого как антиангиогенезный агент, другое антитело, химиотерапевтический агент, цитотоксический агент, иммуносупрессорный агент, цитокин, цитотоксическая радиотерапия, кортикостероид или противорвотное средство). Например, антитело противc-Kit, описанное в настоящей заявке, можно применять в комбинации с одним или более из различных противораковых и/или противоангиогенезных агентов в лечении различных опухолевых и неопухолевых состояний. В различных вариантах реализации антитело против c-Kit согласно настоящему изобретению можно вводить до, во время, по существу одновременно с или после начала лечения с использованием одного или более других терапевтических агентов, таких как другие противораковые агенты. Предпочтительно по меньшей мере один из других противораковых агентов выбирают из группы, состоящей из иматиниба, сунитиниба, цитарабина (araC), дакарбазина (DTIC), цисплатина и этопосида. Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любое из вышеупомянутых антител против c-Kit, экспрессирующим векторам, включающим указанные молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяевам, включающим указанные молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение также обеспечивает способы очистки любого из вышеупомянутых антител против c-Kit. Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собой(SEQ ID NO: 6) и где связывание антитела вызывает интернализацию c-Kit и/или вызывает деградацию Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собойCQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6), при этом связывание антитела ингибирует рост опухолевых клеток invitro и/или уменьшает рост опухолевых клеток in vivo. Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с ВКД c-Kit человека, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующейSEQ ID NO: 20; причем указанное антитело включает HCVR и LCVR, где HCVR включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и LCVR включает аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1 представляет собой SYWIG (SEQ ID NO: 1), CDRH2 представляет собой IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2), CDRH3 представляет собойCQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6), и при этом связывание антитела вызывает интернализацию и/или деградация c-Kit и/или уменьшает фосфорилирование c-Kit и/или MAPK, ингибирует рост опухолевых клетокin vitro и/или уменьшает рост опухолевых клеток in vivo. Предпочтительные клетки-хозяева для трансформации векторами и экспрессии в них антител согласно настоящему изобретению представляют собой клетки млекопитающих, например клетки NS0 (не секретирующие (0) клетки миеломы мыши), клетки 293, SP20 и СНО и другие линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. В качестве альтернативы можно использовать других хозяев-эукариаот, таких как дрожжи."Изолированное" антитело применительно к антителу против c-Kit представляет собой антитело,которое было идентифицировано и выделено и/или извлечено из компонентов его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой материалы, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие растворимые вещества белковой или небелковой природы. В предпочтительных вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению является очищенным(1) до степени более 95 мас.% антитела, определенной методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности, подтвержденной методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, окрашивания серебром. Термин "изолированный" в отношении антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению может включать антитело in situ в рекомбинантных клетках, при условии что по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела не присутствует. Антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению могут быть изолированы (выделены) и очищены любым способом, известным в данной области техники, включая преципитацию сульфатом аммония или сульфатом натрия с последующим диализом против солевого раствора, ионообменную хроматографию, аффинную или иммуноаффинную хроматографию, включая,но не ограничиваясь ими, аффинную хроматографию с белком А, а также гель-фильтрацию или зонный электрофорез. Настоящее изобретение также обеспечивает экспрессирующие векторы, включающие ранее описанные полинуклеотидные последовательности, функционально связанные с регуляторной последовательностью, такой как последовательность экспрессии, промоторная и/или энхансерная последовательность. Разработано множество экспрессирующих векторов для эффективного синтеза полипептида антитела в прокариотических системах, таких как бактерии, и в эукариотических системах, включающих, но не ограничивающихся ими, системы культур клеток дрожжей и млекопитающих. Векторы согласно настоящему изобретению могут включать сегменты последовательностей хромосомной, нехромосомной и синтетической ДНК. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантные клетки-хозяева, включающие рекомбинантные векторы, описанные выше. Антитела согласно настоящему изобретению можно экспрессировать в клеточных линиях, отличных от гибридомы. Нуклеиновые кислоты, которые включают последовательность, кодирующую антитело согласно настоящему изобретению, можно применять для трансформации подходящих клеток-хозяев млекопитающих. Особенно предпочтительные клеточные линии выбирают на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии целевого белка и минимального загрязнения белками хозяина. Клеточные линии млекопитающих, пригодные для использования в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области техники и включают множество иммортализованных клеточных линий, таких как (но не ограничиваясь ими) клетки COS-7, клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки почки новорожденного хомяка (BHK) и многие другие, включая клеточные линии лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения роста опухоли и/или рака у человека путем введения человеку эффективного количества антитела против с-Kit, описанного в настоящем документе. Подходящие состояния, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, характеризуются присутствием клеток, экспрессирующих c-Kit человека. Без намерения ограничить изобретения какими-либо конкретным механизмам, настоящие способы предназначены для лечения роста раковых клеток, включая, например, те клетки, в которых злокачественный рост является c-Kitзависимым. Термин "лечение" или "лечить" в контексте настоящего изобретения относится к терапевтическому лечению, включающему ингибирование, замедление, уменьшение или обращение прогрессирования основного состояния или нежелательных физиологических изменений, связанных с заболеванием или нарушением, к улучшению клинических симптомов состояния или к предупреждению возникновения клинических симптомов состояния. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, облегчение симптомов, снижение степени заболевания или нарушения, стабилизацию заболевания или нарушения (т.е. когда заболевание или нарушение не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или нарушения, улучшение или временное ослабление заболевания или нарушения и ремиссию (частичную или полную) заболевания или нарушения, обнаруживаемые или необнаруживаемые. Лечение также может означать увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни без получения лечения. Лица, нуждающиеся в лечении, представляют собой лиц, уже имеющих заболевание. В одном варианте реализации настоящее изобретение можно применять в качестве лекарственного средства. В способах согласно настоящему изобретению терапевтически эффективное количество антитела согласно настоящему изобретению вводят человеку, нуждающемуся в этом. Дополнительно фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению. Термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективная доза" относится к количеству, эффективно обеспечивающему желаемый терапевтический результат при введении необходимых доз и в течение необходимого периода времени. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол и масса субъекта и способность антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у субъекта. Другие факторы включают введение, участок-мишень, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые медицинские препараты, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, для которого любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешивает терапевтически благоприятный эффект. Хотя антитела против c-Kit, описанные в настоящем документе, на практике применяют для введения людям; они могут быть введены другим млекопитающим также в терапевтических целях. Режим введения доз можно изменять для обеспечения оптимального желаемого ответа (например,терапевтического или профилактического ответа). Дозы при лечении могут быть определены с применением рутинных методов, известных специалисту в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности. Режим введения доз обычно будет варьировать от единичной болюсной дозы или продолжительной инфузии до многократных введений в день (например, каждые 4-6 ч) или в соответствии с указаниями лечащего врача и состоянием пациента. Количество и частоту введения доз определяет врач, лечащий пациента. Однако необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничено какойлибо конкретной дозой. Антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению могут быть введены в комбинации с противоопухолевым агентом, включающим, но не ограничивающимся ими, цитарабин (т.е. araC), дакарбазин(DTIC), цисплатин или этопосид. В настоящем изобретении любой подходящий способ или путь может быть применен для введения антител против c-Kit согласно настоящему изобретению и дополнительно для совместного введения противоопухолевых агентов и/или антагонистов других рецепторов. В комбинированной терапии согласно настоящему изобретению антитело против c-Kit может быть введено до, во время, по существу одновременно с или после начала терапии лечения другим агентом. Антитела против c-Kit согласно настоящему изобретению при применении для целей терапевтического лечения являются предпочтительно приготовленными в виде фармацевтических композиций. Такие фармацевтические композиции и способы их приготовления хорошо известны в данной области техники. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al, eds., 21st ed., Mack Пример 1. Моноклональные антитела человека против c-Kit человека. Аминокислотные последовательности участков CDR моноклональных антител против c-Kit человека CK6 приведены в табл. 1. Таблица 1HCVR, LCVR, тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) MAT CK6 и кодирующие их последовательностей кДНК, представлены в табл. 2. Таблица 2 Последовательность включает аминокислотную последовательность секреторного сигнального пептида.Последовательность включает нуклеотидную последовательность, кодирующую секреторный сигнальный пептид. Пример 2. Экспрессия и очистка моноклональных антител в формате IgG1 человека против c-Kit человека. Последовательности кДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи МАТ против c-Kit, можно амплифицировать методом ПЦР для клонирования в экспрессирующие векторы в соответствии с процедурами, известными в данной области техники. Например, кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (например, SEQ ID NO: 8), можно объединить в рамке считывания с последовательностью кДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи гамма 1 иммуноглобулина человека, в векторе рЕЕ 6.1 (Lonza Biologies plc, Слоуг, Беркшир, Великобритания). кДНК, кодирующую полную легкую цепь человека (например, SEQ ID NO: 16), можно клонировать непосредственно в вектор рЕЕ 12.1 (Lonza Biologies PLC, Слоуг, Беркшир, Великобритания). Сконструированные векторы, экспрессирующие иммуноглобулины, можно стабильно трансфицировать в клетки миеломы NS0 путем электропорации и затем культивировать трансфектанты в селекционной среде с глутаминсинтетазой. Стабильные клоны можно подвергать скринингу по экспрессии антитела в анализе методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на специфическое связывание с c-Kit человека. Положительные клоны можно культивировать для продукции антител в бессывороточной культуральной среде во флаконах с перемешиванием или в биореакторах. Полноразмерное антителоIgG1 может быть очищено посредством белковой аффинной хроматографии (Poros A, PerSeptiveBiosystems Inc., Фостер Сити, Калифорния) и элюировано в нейтральном буферном солевом растворе. В альтернативном варианте последовательности кДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи МАТ против c-Kit человека (например, SEQ ID NO: 8 и 14 соответственно), можно клонировать и объединить в рамке считывания с последовательностью кДНК,кодирующей константную область тяжелой цепи гамма 1 иммуноглобулина человека, в экспрессирующем векторе GS (глутаминсинтетаза). Сконструированные векторы, экспрессирующие иммуноглобулины, можно стабильно трансфицировать в клетки СНО. Можно осуществить проверку экспрессии антитела, которое специфически связывается с c-Kit человека, у стабильных клонов. Положительные клоны можно выращивать в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Полноразмерное антитело IgGl может быть очищено аффинной хроматографией с белком А и элюировано в нейтральном буферном солевой раствор. Пример 3. Связывающая и блокирующая активность моноклонального антитела против c-Kit человека CK6 in vitro. Активность связывания блокирования у очищенных МАТ против c-Kit можно определить c-Kit invitro, используя иммунологические количественные методики, известные в данной области техники, такие как например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Вкратце, 96-луночные микротитрационные планшеты покрывают по 100 мкл/лунка раствором 1 мкг/мл рекомбинантного белка с-Kit человека (rh-c-Kit) (RD Systems, Миннеаполис, Миннесота) при комнатной температуре (20-25 С) и ин-9 023665 кубируют в течение 1 ч. После промывки лунки блокируют 3% раствором ФБР/сухое молоко. Затем в лунки, покрытые rh-c-Kit, добавляют различные разведения очищенных МАТ против c-Kit, обычно начиная с 1,5 мкг/мл или 100 нМ, и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После нескольких промывок (3-5) добавляют антитела против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена(ПХ) (Jackson ImmunoResearch, Вест Гроув, Пенсильвания) в разведении 1:1000, и планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают, в каждую лунку добавляют субстрат ПХ и инкубируют до развития синей окраски. Добавляют раствор для остановки реакции и измеряют поглощение при 450 нм. Связывание моноклонального антитела CK6 с белком rh-c-Kit изучали методом ELISA, как описано выше. Результаты показывают, что CK6 связывается с rh-c-Kit со значением EC50 приблизительно 310-11 М. Также может быть исследована способность очищенных МАТ блокировать связывание c-Kit с его лигандом. Вкратце, 96-луночные микротитрационные планшеты покрывают по 100 мкл/лунку раствором 1 мкг/мл лиганда c-Kit - фактора стволовых клеток (ФСК) (RD Systems) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки лунки блокируют 3% раствором ФБР/сухое молоко. Различные разведения МАТ (обычно начиная с 15 мкг/мл или 1,0 мкМ) предварительно инкубируют с rh-c-Kit(RD Systems) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем добавляют в лунки, покрытые ФСК, и дополнительно инкубируют планшеты при комнатной температуре в течение 2 ч. После нескольких промывок (3-5) добавляют антитела против IgG человека, конъюгированные с ПХ, в разведении 1:1000 и планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают 0,2% раствором Твин-ФБР, в каждую лунку добавляют субстрат ПХ и инкубируют до развития синего окрашивания. Добавляют раствор для остановки реакции и измеряют поглощение при 450 нм. Способность моноклонального антитела CK6 блокировать связывание c-Kit с лигандом изучали с помощью вышеописанного анализа. Результаты свидетельствуют, что CK6 блокирует взаимодействиеc-Kit-лиганд со значением IC50 приблизительно 410-11 М. Пример 4. Кинетика связывания моноклонального антитела против c-Kit CK6. Кинетику связывания моноклональных антител против c-Kit с rh-c-Kit можно определить с использованием биосенсора ППР, такого как BIAcore 3000 или BIAcore Т 100 (GE Health Care, Пискатавей,Нью-Джерси) в соответствии со способами, известными в данной области техники. Преимущественно моноклональные антитела против cKit можно изучать методом ППР с использованием BIAcore T100 и буфер HBS-EP (0,01 М HEPES-pH 7,4, 0,15 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% (об./об.) поверхностноактивного вещества Р 20) в качестве подвижного буфера при измерении аффинности связывания. Измерение проводят при 25 С. Количество rh-c-Kit (pH 5,0), соответствующее примерно 120 единицам ответа(RU), иммобилизуют на чипе СМ 5, используя стандартную процедуру аминного связывания. МАТ инжектируют в течение 180 с поверх иммобилизованного rh-c-Kit при скорости потока 30 мкл/мин с последующей 900-секундной диссоциацией с использованием буфера HBS-EP. Концентрации моноклональных антител против c-Kit могут представлять собой градиенты двукратных разведений по меньшей мере с тремя концентрациями на градиент и тремя градиентами на эксперимент. После диссоциации регенерацию поверхности rh-c-Kit осуществляют с помощью двух инжекций по 30 с 50 мМ НС 1 при скорости потока 30 мкл/мин. Для определения констант скорости используют программное обеспечение BIAcoreT100. Константу аффинности KD можно вычислить из соотношения констант скорости Koff/Kon. Величины взаимодействия "Kon, M-1c-1" и "Koff, с-1" используют для определения аффинности (KD, M) взаимодействия антитело/рецептор. Изучали кинетику связывания моноклонального антитела CK6 с белком c-Kit человека. Измерения проводили при 25 С. Величины KD, Kon и Koff для MAT CK6 представлены в табл. 3. Таблица 3 Пример 5. Видовая специфичность моноклонального антитела против c-Kit человека CK6. Видовую специфичность связывания МАТ против c-Kit человека можно определить путем измерения реактивности антител к белкам c-Kit человека, обезьяны Cynomolgus и мыши методом твердофазного ИФА (ELISA). Вкратце, 96-луночные микротитрационные планшеты покрывают по 100 мкл/лунка раствором 1 мкг/мл рекомбинантного белка c-Kit человека (rh-c-Kit) или рекомбинантным c-Kit мыши(cyno-c-Kit; Metl-His549, получен рекомбинантным способом) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки лунки блокируют 3% раствором ФБР/сухое молоко. Затем в лунки, покрытые rh-c-Kit, добавляют различные разведения МАТ человека против c-Kit человека и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После нескольких промывок добавляют антитела против IgG человека, конъюгированные с ПХ, в разведении 1:1000, планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре для детектирования связанных антител человека. Планшеты промывают, в каждую лунку добавляют субстрат ПХ и инкубируют до развития синей окраски. Добавляют раствор для остановки реакции и измеряют поглощение при 450 нм. Результаты указывают, что CK6 связывается сrh-c-Kit, c-Kit обезьяны Cynomologus (с EC50 5,710-11 М), но не связывается статистически значимо с рм-c-Kit (табл. 4). Таблица 4 Связывание AT CK6 с c-Kit человека и мыши (ELISA) Видовая специфичность МАТ против c-Kit может быть также изучена по их связыванию со связанной с плазматической мембраной c-Kit, экспрессируемой на поверхности клеток человека Mo7e и клеток мыши Р 815, в анализе методом проточной цитометрии (см., например, WO 2004/007735). Вкратце, целые живые клетки человека Mo7e и клетки мыши Р 815 культивируют в обедненной сывороткой среде в течение ночи, три раза промывают в холодном блокирующем буфере (5% эмбриональная бычья сывороткаc-Kit в концентрации 1,0 мкг/мл и инкубируют смесь в течение 30 мин при 4 С. Добавляют вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой (Jackson ImmunoResearch), в концентрации 1,0 мкг/мл для детектирования антител человека, связавшихся с поверхностью клеток, в анализе методом проточной цитометрии. Результаты указывают, что CK6 в анализе на клетках связывается со связанным с плазматической мембраной c-Kit человека, экспрессируемым опухолевыми клетками человека (т.е.Mo7e), но не связывается со связанной с плазматической мембраной c-Kit мыши (р 815), экспрессируемой опухолевыми клетками мыши (т.е. р 815). Таблица 6 Клеточные линии, экспрессирующие c-Kit человека и мыши (результаты FACS) Видовую специфичность МАТ против c-Kit можно также изучать, измеряя связывание МАТ со связанной с плазматической мембраной c-Kit, экспрессируемой на поверхности изолированных клеток костного мозга обезьяны Cynomolgus. Вкратце, костный мозг в суспензии фосфатно-солевого буфера Дульбекко наслаивают на градиент плотности Histopaque 1077 для разделения компонентов крови. После центрифугирования лимфоциты собирают с поверхности разделения и быстро промывают в лизирующем буфере ACK для удаления любых оставшихся эритроцитов. Изолированные лейкоциты затем метят при помощи CK6 с последующим взаимодействием со вторичными антителами против IgG человека, конъюгированными с фикоэритрином, и исследуют методом FACS. Таблица 7 Анализ методом FACS клеток костного мозга обезьяны Cynomolgus на наличие экспрессии c-Kit Анализ методом FACS клеток костного мозга обезьяны Cynomolgus на присутствие экспрессии cKit с использованием MAT CK6 свидетельствует, что CK6 связывается со связанной с плазматической мембраной c-Kit обезьяны Cynomolgus, экспрессируемой на поверхности клеток костного мозга. Пример 6. Анализ интернализации c-Kit in vitro. Анализ на клетках in vitro можно применять для измерения нейтрализующей активности МАТ против c-Kit, направленной против клеток, экспрессирующих c-Kit человека. Такой анализ может основываться на индуцированной МАТ интернализации c-Kit и может включать анализ методом сортировки активированных флюоресценцией клеток (FACS), как вкратце описано ниже. Клетки Mo7e, экспрессирующие c-Kit, культивируют в обеденной сывороткой среде в концентрации 1106 клеток/мл и инкубируют при 4 С в течение 1 ч. К клеткам добавляют антитела против c-Kit в концентрации 1 мкг/мл и инкубируют в течение различных промежутков времени при 4 и 37 С. Клетки три раза промывают в 200 мкл блокирующего буфера (5% эмбриональная бычья сыворотка в ФБР) для удаления любых не связавшихся антител. Клетки ресуспендируют в 100 мкл блокирующего буфера. Добавляют антитела против IgG-Fc-гамма человека, конъюгированные с фикоэритрином (JacksonImmunoResearch), для детектирования присутствия связанных антител; указанные антитела также добавляют к клеткам без предварительной обработки антителами в качестве отрицательного контроля. С этого момента, если это возможно, клетки держат в темноте. Клетки инкубируют в течение 30 мин при 4 С и промывают, как описано выше. Образцы клеток затем пропускают через систему анализа с многоцветным детектированием (например, Guava easyCyte System (Millipore, Биллерика, Миннесота, которая детектирует клетки с флуоресцентными метками. Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток соответствует количеству молекулc-Kit, которые остаются на поверхности клеток после обработки антителами против c-Kit. Результаты типичного эксперимента демонстрируют зависимое от времени снижение содержания c-Kit на поверхности клеток через 1, 6 или 24 ч инкубации клеток с МАТ против c-Kit CK6 при 37 С (см. табл. 8). Инкубация клеток с CK6 при 4 С приводила к незначительным изменениям содержания c-Kit (отрицательный контроль). Эти данные свидетельствуют, что МАТ против c-Kit CK6 вызывает значительную интернализацию c-Kit в клетках, экспрессирующих c-Kit, in vitro. Таблица 8 Индуцированная CK6 интернализация c-Kit in vitro Пример 7. Анализ деградации c-Kit in vitro. Анализ на клетках in vitro можно применять для измерения способности МАТ против c-Kit вызывать деградацию c-Kit, которую оценивают путем измерения количества тотальной c-Kit, обнаруженной в лизатах клеток после обработки опухолевых клеток МАТ против c-Kit при 37 С. Вкратце, линии клеток человека, экспрессирующие c-Kit (например, Mo7e и GIST882), высевают на 6-луночную чашку с плотностью 3106 клеток/мл в 3 мл бессывороточной среды. В лунки добавляют антитело CK6 (100 нг/мл) и инкубируют чашку при 37 С в течение 48, 24 и 12 ч. Одну лунку с клетками оставляют необработанной в качестве контроля. Немедленно после обработки клетки промывают холодным ФБР, лизируют в 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ Hepes pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ NaPPi, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз). После 10-минутной инкубации на льду клетки центрифугируют при 12000g в течение 15 мин при 4 С. Супернатант собирают и анализируют методом вестернблоттинга в восстанавливающих условиях. Блот обрабатывают антителами против c-Kit человека(Invitrogen, Карлсбад, Калифорния; каталожный 34-8800) для определения количества тотальной c-Kit в клетках до и после инкубации с CK6 в течение различных периодов времени. Результаты демонстрировали существенную деградацию c-Kit по сравнению с необработанными клетками через 12 ч инкубации с МАТ против c-Kit CK6 (табл. 9). Индуцированная CK6 деградация c-Kit увеличивается с течением времени. Как и предполагалось в предшествующих научных публикациях, деградация c-Kit не наблюдалась после обработки опухолевых клеток ФСК (100 нг/мл) в течение 12, 24 и 48 ч при 37 С (данные не показаны). Таблица 9 Индуцированная CK6 деградация c-Kit in vitro Пример 7 а. Анализ деградации c-Kit in vitro. Линии клеток человека, экспрессирующие c-Kit (например, GIST882, Mo7e и Malm-3 М), высевают на 6-луночную чашку при плотности 3106 клеток/мл в 3 мл бессывороточной среды для всех анализов,кроме одного анализа с Mo7e, для которого используют 10% сыворотку. В лунки добавляют антителоCK6 или ФСК в различных концентрациях и инкубируют чашку при 37 С в течение 24 или 48 ч. Одну лунку с клетками оставляют необработанной в качестве контроля. Немедленно после обработки клетки промывают холодным ФБР, лизируют в 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ Hepes рН 7,5, 150 мМNaCl, 10 мМ NaPPi, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз). После 10-минутной инкубации на льду клетки центрифугируют при 12000g в течение 15 мин при 4 С. Супернатант собирают и анализируют методом вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях. Блот обрабатывают антителами против c-Kit человека (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния; каталожный 34-8800 или Cell Signaling Technology, Данверс, Миннесота; каталожный 3308) для определения количества тотальной c-Kit в клетках до и после инкубации с CK6 или ФСК. Результаты демонстрируют существенную деградацию c-Kit по сравнению с необработанными клетками после инкубации с МАТ против c-KitCK6. Деградация c-Kit наблюдается после обработки опухолевых клеток Mo7e ФСК (1 мкг/мл и 100 нг/мл) в течение 24 ч при 37 С при использовании 0% сыворотки. Индуцированной ФСК деградации не наблюдается при использовании 10% сыворотки (повторы GIST882 = 1, Mo7e = 3 и Malm-3 М = 1). Чтобы продемонстрировать эквивалентную нагрузку белка блот повторно обрабатывали антителами против глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ) (Ambion, Карлсбад, Калифорния; каталожныйАМ 4300). Пример 8. Идентификация линий клеток c-Kit-зависимого рака человека. В связи с отсутствием экспрессии c-Kit в большинстве зрелых тканей обнаружение экспрессии c-Kit в опухоли обычно указывает на c-Kit-зависимый рост клеток. Полученные из опухолей клеточные линии человека можно исследовать на присутствие экспрессии c-Kit, используя анализ методом проточной цитометрии с последующим анализом c-Kit-опосредованного фосфорилирования и жизнеспособности клеток. Вкратце, для анализа экспрессии c-Kit методом проточной цитофлуориметрии 1,0106 интактных живых клеток выращивают в обедненной сывороткой среде в течение ночи, промывают три раза блокирующим буфером (5% эмбриональная бычья сыворотка в ФБР) и затем ресуспендируют в 100 мкл блокирующего буфера. Антитела против c-Kit или контрольные антитела добавляют в концентрации 1,0 мкг/мл и смесь инкубируют в течение 30 мин при 4 С. Клетки промывают, как описано выше, для удаления любого избытка антител или несвязавшихся антител. Клетки снова ресуспендируют в 100 мкл блокирующего буфера и затем инкубируют со вторичными антителами, связанными с флуоресцентной меткой, для детектирования первых антител, связавшихся с клетками. Клетки инкубируют в течение 30 мин при 4 С и выдерживают в темноте после добавления флуоресцентно меченного антитела. Клетки промывают, как описано выше, для удаления несвязавшихся антител и ресуспендируют в 100 мкл блоки- 13023665 рующего буфера. Образцы клеток, которые могут включать контрольные образцы посторонних антител,затем пропускают через систему анализа с многоцветным детектированием (например, Guava easyCyteSystem (Millipore, Биллерика, Миннесота, которая детектирует флуоресцентно меченые клетки. Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клетки отражает количество молекул c-Kit на поверхности клетки по сравнению с контролем посторонних антител. Для анализа экспрессии c-Kit методом вестерн-блоттинга 3,0106 клеток культивируют в обедненной сывороткой среде и затем промывают в холодном ФБР. Клетки лизируют в 100 мкл ледяного лизирующего буфера (50 мМ Hepes pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ NaPPi, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз) в течение 10 мин на льду. Клеточный дебрис осаждают центрифугированием при 12000 об/мин при 4 С в течение 15 мин. Супернатант собирают и анализируют методом вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях. Блот обрабатывают антителами против c-Kit человека (RD Systems) и соответствующими вторичными антителами, меченными ПХ, для обнаружения количества c-Kit, присутствующего в клетках. Статус c-Kit можно определять путем лизиса клеток, как описано выше, после обработки со стимуляцией лигандом c-Kit ФСК (Peprotech, Нью-Джерси) и без стимуляции. Лизат клеток исследуют методом вестерн-блоттинга, используя образцы антител, специфичных к фосфорилированному c-Kit. Наличие полос на мембране как для стимулированных, так и для нестимулированных клеток свидетельствует о том, что либо существует активирующая мутация в c-Kit, в результате чего c-Kit фосфорилируется даже в отсутствие его лиганда, либо клеточная линия продуцирует свой собственный лиганд в петле сверхэкспрессии. Клеточные линии, которые фосфорилирутся только в присутствии лиганда, представляют собой сверхэкспрессирующий дикий тип (ДТ). Таблица 10 Основываясь на анализе, проведенном, по существу, как описано в данном примере, было обнаружено, что 15 клеточных линий - производных клеток лейкоза, меланомы, МКРЛ, саркомы Юинга и СОЖКТ, являются c-Kit-зависимыми (см. табл. 10). Статус c-Kit для каждой клеточной линии был подтвержден литературным поиском и анализом последовательностей. Пример 9. Анализ фосфорилирования c-Kit и МАР-киназы in vitro. Взаимодействие ФСК с c-Kit вызывает димеризацию c-Kit, которая приводит к автофосфорилированию тирозиновых остатков цитоплазматического домена. Затем активируются многочисленные компоненты передачи сигнала, нижестоящие после с-Kit, включая фосфатидилинозитол-3-киназу, членов семейства Src, путь JAK/STAT и каскад Ras-Raf-MAP киназы (MAPK). Способность МАТ против c-Kit человека ингибировать фосфорилирование c-Kit и MAPK в ответ на ФСК можно определить в анализе на клетках in vitro согласно следующей процедуре. Вкратце, как описано выше в примере 8, c-Kit-зависимые клеточные линии культивируют в обедненной сывороткой среде в течение ночи. Затем их инкубируют с различными разведениями МАТ против c-Kit, обычно в диапазо- 14023665 не от 100 до 0,1 нМ, в течение 1 ч при 37 С. Клетки затем стимулируют с использованием 5 нг/мл ФСК(RD Systems или Peprotech) в течение 15 мин при 37 С. Клетки затем немедленно промывают в холодном ФБР и лизируют в 100 мкл ледяного лизирующего буфера (50 мМ Hepes рН 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМNaPPi, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз) в течение 10 мин на льду для экстракции клеточных белков. Клеточный дебрис осаждают центрифугированием при 12000 об/мин при 4 С в течение 15 мин. Супернатант собирают и исследуют методом вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях. Мембрану обрабатывают специфичными к фосфорилированию антителами против c-Kit или MAPK человека и подходящими вторичными антителом, меченными ПХ, для обнаружения уровня фосфорилирования c-Kit и МАР-киназы в экспериментальных условиях. Изучали способность моноклонального антитела CK6 ингибировать фосфорилирование c-Kit иMAPK в ответ на ФСК в клетках лейкоза Mo7e. Как установили в анализе ингибирования фосфорилирования, IC50 MAT CK6 составляет 300 пМ. Эти результаты свидетельствуют, что МАТ против c-Kit CK6 может эффективно блокировать активацию c-Kit и следующую за ней передачу сигналов. Пример 10. Анализ ингибирования роста опухолевых клеток in vitro. Ингибирование роста опухолевых клеток моноклональными антителами против c-Kit согласно настоящему изобретению можно оценивать в анализах in vitro, используя любой из множества коммерчески доступных наборов для анализа жизнеспособности клеток. Более конкретно, способность CK6 ингибировать рост опухолевых клеток изучали, используя коммерчески доступный набор для анализа жизнеспособности клеток (например, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega, Медисон, Висконсин, США) в соответствии с инструкцией производителя. Было установлено, что моноклональное антитело против c-Kit ингибирует жизнеспособность клеток Mo7e с IC50, равной приблизительно 300 пМ (данные не показаны), что было установлено с использованием CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit. Пример 11. Анализ ингибирования роста опухолевых клеток in vivo. Противоопухолевое действие антител против c-Kit согласно настоящему изобретению можно также исследовать в соответствующих моделях ксенотрансплантатов in vivo, которые, по существу, известны и широко используются в данной области техники. Вкратце, с линии клеток -Kit-зависимого рака человека выращивают в культуре и затем вводят подкожно в область спины бестимусным мышам nude (Charles River, Уилмингтон, Массачусетс) в количестве 2-10 млн клеток на мышь. МАТ против c-Kit разводят в ФБР, рН 7,2, и вводят внутривенной инъекцией в дозе 4 или 40 мг/кг. Когда опухоль достигает размера приблизительно 180-360 мм 3, мышей разбивают на группу контроля (которой вводят, например, солевой раствор согласно Фармакопее США,10 мкл/г) и группы лечения (которым вводят, например, MAT CK6 в дозе 4 или 40 мг/кг). Кроме того,группы лечения могут получать соответствующие хемиотерапевтические препараты или соответствующие ингибиторы рецепторных тирозинкиназ одни или в комбинации с антителами согласно настоящему изобретению. Антитела и солевой раствор (контроль) вводят три раза в неделю в течение четырех недель. Ингибирование роста опухолевых клеток определяют посредством трехмерного измерения объема опухоли при помощи штангенциркуля два раза в неделю в течение курса лечения. Объем опухоли можно рассчитать следующим образом: Объем опухоли (мм 3) = (длина опухоли)(ширина 2 опухоли)(/6),где длина опухоли представляет собой наибольший размер опухоли, измеренный параллельно поверхности кожи; ширина представляет собой наибольший результат измерения, проведенного перпендикулярно длине, параллельной поверхности кожи. Массу тела также можно неоднократно измерять в течение курса лечения для общей оценки токсичности. Значения Т/С% и Р рассчитывают при помощи RM ANOVA, где Т/С% = [(Объем после лечения/Начальный объем)/(Контрольный объем/Начальный объем)]100 и значение Р рассчитывают по отношению к солевому раствору. Данные по различным относящимся к c-Kit моделям ксенотрансплантатов с использованием CK6 в качестве лечения представлены в табл. 11-14.CK6 в качестве монотерапии в анализе с ксенотрансплантатами с использованием различных линий опухолевых клеток человекаCK6 в качестве моно- или комбинированной терапии в анализе с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии лейкоза человекаCK6 в качестве моно- или комбинированной терапии в анализе с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии лейкоза человекаCK6 в качестве моно- или комбинированной терапии в анализе с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии мелкоклеточного рака легкого человека Эти данные демонстрируют, что МАТ против c-Kit CK6 существенно ингибирует рост опухолевых клеток в различных связанных с c-Kit моделях с ксенотрансплантатами. Лечение с использованием CK6 демонстрировало более высокую противоопухолевую активность по сравнению со стандартными противораковыми агентами, такими как цитарабин (araC) и дакарбазин (DTIC), так же как цисплатин в комбинации с этопосидом. кроме того, комбинация CK6 с DTIC или AraC демонстрировала более высокую противоопухолевую активность по сравнению с монотерапией. Аналогично, комбинация CK6 с цисплатином и этопосидом демонстрировала более высокую противоопухолевую активность по сравнению с комбинацией только цисплатина и этопосида.