Моноклональные антитела, связывающие b7h6, и их применение

Предложены моноклональные антитела, специфически связывающие молекулу В 7 Н 6 семейства В 7, включая антитела, способные подавлять взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30. Также предложены конъюгаты антитела против В 7 Н 6 с лекарственными средствами, содержащие моноклональное антитело против В 7 Н 6, конъюгированное с терапевтическим веществом. Данные антитела против В 7 Н 6 и конъюгаты антител с лекарственными средствами применимы для оказания терапевтических эффектов против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, а также в диагностических приложениях для детекции В 7 Н 6 или экспрессирующих В 7 Н 6 клеток.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИНСТИТУТ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛА САНТ ДЕ ЛА РЕШЕРШЕ МЕДИКАЛЬ (FR) Родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США 61/285018 поданной 9 декабря 2009 г., описание которой включено в данную заявку во всей полноте посредством отсылки. Область техники Данное изобретение относится к антителам, в частности моноклональным антителам, связывающим лиганд опухолевых клеток, обозначаемый как В 7 Н 6. Также изобретение относится к способам применения данных антител. Уровень техники Семейство В 7. Положительные и отрицательные ко-стимуляторные сигналы играют решающую роль при регуляции активности лимфоцита. Показано, что опосредующие такие сигналы молекулы являются эффективными мишенями для иммунорегуляторных агентов. Например, связывание лигандов В 7-1 или В 7-2 на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС) с CD28, ко-стимуляторным рецептором наивных Тлимфоцитов, обеспечивает сигнал к пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцита в ответ на связывание Т-клеточного рецептора (TcR). В то же время, связывание рецептора CTLA4, гомологичного CD28,приводит к ингибированию пролиферации и эффекторных функций Т-клеток. (См. Chambers et al., Ann.Rev. Immunol, 19:565-594, 2001; Egen et al, Nature Immunol, 3:611-618, 2002.) В последнее время активно изучается роль ряда молекул, гомологичных семейству В 7, в процессе активации лимфоцитов (Abbas et al., Nat. Med, 5:1345-6, 1999; Coyle et al, Nat. Immunol, 2: 203-9, 2001;Carreno et al., Annu. Rev. Immunol, 20: 29-53, 2002; Liang et al., Curr. Opin. Immunol, 14: 384-90, 2002). Такими новыми ко-стимуляторными контррецепторами являются молекулы B7h2, PD-L1, PD-L2, В 7-Н 3 и В 7-Н 4. Экспрессия известных на настоящий момент молекул семейства В 7 в основном ограничена антиген-презентирующими клетками. По современным данным на лимфоидных клетках эти молекулы выступают в роли контррецепторов, взаимодействующих с соответствующими им рецепторами на лимфоцитах и обеспечивающих, таким образом, позитивные или негативные ко-стимуляторные сигналы, играющие решающую роль в регуляции клеточного иммунного ответа. НК-клетки и рецептор NKp30 Натуральные киллеры (НК-клетки) являются важной субпопуляцией лимфоцитов и составляют в среднем около 15% от мононуклеарной фракции клеток периферической крови у человека. Впервые, НКклетки были функционально описаны в 1971 г. на основе экспериментов по изучению отторжения клеток костного мозга (ВМС) трансплантируемых от мышей других линий или от мышей родительской линии летально облученным мышам (см. Cudowicz and Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102, 1971; Cudowicz andBennett, J. Exp. Med. 135:1513-1528, 1971). Cudowicz и Bennett в своих экспериментах наблюдали отторжение ВМС от родительской гомозиготной линии Н 2 (А или В), трансплантированных гетерозиготным гибридам первого поколения линии Н 2 (АВ). Это наблюдение шло в разрез с классическими законами трансплантологии того времени, согласно которым считалось, что тканевые антигены наследуются кодоминантно и потомки, полученные в результате скрещивания, будут, таким образом, толерантны к родительским антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС) (см. Cudowicz and Bennett, J. Exp.Med. 134:83-102, 1971). Ответственные за описанный процесс клетки были радиологически устойчивы и идентичны лимфоидным клеткам, для которых позднее, в 1975 г., была показана цитотоксическая активность против клеток опухоли in vitro, осуществляемая по МНС-независимому пути (см. Herberman andOrtaldo, Science, 214:24-30, 1981; Ortaldo and Herberman, Annu. Rev. Immunol. 2:359-394, 1984; Trinchieri,Adv. Immunol. 47:187-376, 1989; Murphy et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:1475-1482, 1993). Дальнейшие доказательства того, что НК-клетки сами по себе могут опосредовать отторжение костномозгового трансплантата были получены в 1987 году, когда было показано, что у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (линия SCID), у которых нет Т- и В-лимфоцитов, функция НК-клеток в норме (см.Murphy et al., J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987). В настоящее время считается, что НК-клетки являются важной составляющей системы врожденного иммунитета и играют основную роль при борьбе иммунной системы с опухолевыми и вирусинфицированными клетками. Однако, до активации НК-клетки не способны выполнять свои функции,даже если присутствуют в достаточном количестве. Сниженная активность НК-клеток ассоциирована с развитием онкологических и инфекционных заболеваний (См. Yamazaki et al., Oncology Reports 9:359363, 2002; Rosenberg et al., Cancer Research 51:5074-5079 (suppl.), 1991; Britteenden et al., Cancer 77:12261243, 1996; U.S. Patent Nos. 5082833 и 4883662). В то же время, как сказано выше, НК-клетки опосредуют острое отторжение аллогенных трансплантатов ВМС. Таким образом, различные уровни активности НКклеток, по-видимому, играют важную роль в развитии заболеваний, обусловленных нарушениями функций иммунной системы. В норме активность НК-клеток регулируется посредством взаимодействия между молекулами МНСI-типа с ингибиторными и активационными рецепторами НК-клеток (см., например, Barao and Murphy,BBMT 9:727-741, 2003). Гипотеза "неправильный свой" ("missing self) изначально основана на наблюдении, что опухолевые клетки, не несущие на своей поверхности молекул MHC-I, убиваются НК-1 024629 клетками (см. Ljunggren and Karre, Immunol. Today 11:237-244, 1990; Ohlen et al., J. Immunol. 145:52-58,1990). Кроме того, было показано, что человеческие НК-клетки способны лизировать трансфецированные вирусом Эпштейна-Барр клетки В-лимфобластоидных линий не экспрессирующие МНС (Storkus etal., Proc. Natl. Acad. Set. USA 86:2361-2364, 1989). Также было показано, что трансфекция генами MHC-I клеток, дефектных по MHC-I, приводит к частичной или полной устойчивости данных клеток к лизису,опосредуемому НК-клетками (см. Storkus et al., supra; Shimizu and DeMars, Eur. J. Immunol, 19:447-451,1989). Однако присутствия молекул MHC-I на поверхности целевых клеток не всегда достаточно для устойчивости к лизису НК-клетками, равно как распознавание молекул MHC-I на поверхности целевых клеток не всегда предотвращает их лизис НК-клетками (Barao and Murphy, ранее). В последние годы были открыты разнообразные МНС-I-специфичные ингибиторные и активирующие рецепторы, а также активационные рецепторы, специфичные к другим молекулам. Такие рецепторы задействуются в различных терапевтических подходах, например при аллогенной трансплантации ВМС и противораковой терапии (См. id.) Активирующие рецепторы, специфичные к не-МНС-I молекулам, опосредующие цитотоксичность НК-клеток против МНС-I-дефектных или MHC-I-негативных целевых клеток, представляют собой специфичное для НК-клеток гетерогенное семейство иммуноглобулин-подобных молекул, называемых рецепторами цитотоксичности НК-клеток (см., например, Moretta et al., Annu. Rev. Immunol. 19:197-223,2001; Diefenbach and Raulet, Immunol. Rev., 181:170-184, 2001). При отсутствии экспрессии на клеточной поверхности молекул MHC-I (например, на опухолевых или вирус-инфицированных клетках) связывание таких активирующих рецепторов НК-клеток с лигандами запускает механизм лизиса целевой клетки. Одним из таких рецепторов является рецептор NKp30, селективно и конститутивно экспрессирующийся на зрелых НК-клетках. Сигналинг такого рецептора, inter alia, включает в себя взаимодействие с субъединицей CD3 (См. Barao and Murphy, ранее) Лиганд для рецептора NKp30, экспрессирующийся на поверхности целевой клетки, до настоящего времени не был определен. Данная система врожденного распознавания НК-клетками является потенциально мощным инструментом для клинических приложений при аллогенной трансплантации ВМС, противоопухолевой терапии или терапии других заболеваний, связанных с нарушением функционирования НК-клеток. (См., например, Barao and Murphy, ранее) Например, стимулиряция или ингибирование активации NKp30 может применяться для изменения активности НК-клеток и терапии заболеваний или расстройств, связанных с НК-клеточной активностью. В частности, повышение активности НК-клеток за счет связывания NKp30 было бы применимо при терапии заболеваний или расстройств, характеризующихся недостаточной активностью НК-клеток, таких как рак или инфекционные заболевания. Ингибирование НК-клеточной активности за счет блокировки NKp30 было бы применимо при терапии расстройств, опосредуемых НКклетками, например отторжения трансплантата при аллогенной трансплантации ВМС. Недавно открытый и охарактеризованный член семейства В 7 - В 7 Н 6, является контр-партнером рецептора NKp30, который селективно экспрессируется на зрелых НК-клетках и функционирует в качестве активирующего рецептора при осуществлении НК-клетками своих функций (Brandt et al., J. Exp. Med.,206(7): 1495-1503, 2009). Молекула В 7 Н 6 экспрессируется на опухолевых клетках человека и не экспрессируется нормальными клетками тканей. Таким образом, существует необходимость в поиске антител, способных ингибировать взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30. Терапевтический потенциал применения таких антител основывается на их способности регулировать ко-стимуляторные сигналы и, таким образом, иммунный ответ. Кроме того, распознающие В 7 Н 6 антитела, конъюгированные с цитотоксическими веществами, могут применяться против целевых клеток, экспрессирующих В 7 Н 6. Такое применение, а также другие способы применения данных антител, являются весьма актуальными. Данное изобретение охватывает композиции и способы их применения, а также другие способы применения, очевидные для экспертов в данной области на основе сведений, приводимых в данной заявке. Сущность изобретения Объектом данного изобретения являются выделенные моноклональные антитела, специфически связывающиеся с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2). В одном варианте исполнения антитела содержат определяющие комплементарность участки (CDR) тяжелой и легкой цепей или последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, продуцируемого гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242). В другом исполнении антитела содержат определяющие комплементарность участки (CDR) тяжелой и легкой цепей или последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, продуцируемого гибридомным клоном 17 В 1.3(депозитный номер CNCM I-4245). В определенных вариантах исполнения описанные выше моноклональные антитела против В 7 Н 6 являются мышиными антителами, гибридными антителами, гуманизированными антителами или человеческими антителами. В некоторых вариантах исполнения антитела способны конкурировать за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека и ингибировать взаимодействие В 7 Н 6 человека с NKp30. Ингибирование может быть полным или частично блокирующим, и может нейтрализовать или понизить силу взаимодействия. Подходящими антителами также являются одноцепочечные антитела. Другие варианты исполнения включают антитела, содержащие Fc фрагмент, обладающий, по крайней мере, одной из ADCC- или CDC-активностей. В некоторых из таких вариантов, Fc-фрагмент является одноцепочечным (scFc). Каждое из используемых моноклональных антител, которые связывают В 7 Н 6 человека, может входить в состав композиции, содержащей антитело и фармацевтически приемлемое средство доставки. Такие антитела применимы для диагностических наборов, где определяется связывание данного антитела. Другим объектом настоящего изобретения является коньюгат антитела с лекарственным средством,в котором моноклональное антитело, специфически связывающееся с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2), связано с цитотоксическим агентом. В некоторых вариантах исполнения антитело, являющееся частью коньюгата с лекарственным средством, представляет собой антитело, способное конкурировать за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2), с антителом,продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245). Данное моноклональное антитело может быть, например, мышиным антителом, гибридным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом. Подходящими антителами, так же, являются простые одноцепочечные антитела. В некоторых вариантах исполнения антитело содержит Fc-фрагмент, обладающий, по крайней мере, одной из ADCC- или CDC-активностей. В некоторых вариантах таких исполнений Fc-фрагмент представляет собой одноцепочечный Fc-домен (scFc). Цитотоксический агент может быть, к примеру,антитубулиновым агентом, веществом, связывающимся с малой бороздкой в спирали ДНК, веществом,алкилирующим малую бороздку ДНК, дуокармицином или пуромицином. Подходящим антитубулиновым агентом может быть, к примеру, доластатин, винкаалкалоид, подофиллотоксин, таксан, производное баккатина, криптофизин, майантозиноид или комбретастатин. В некоторых вариантах исполнения антитело связано с лекарственным средством через линкер, и в некоторых случаях линкер расщепляется под действием внутриклеточных условий. Применимые расщепляемые линкеры включают пептидные линкеры, включающие те, которые расщепляются внутриклеточной протеазой. Любые варианты исполнения конъюгатов антитела с лекарственным средством подходят для использования в составе композиций,включающих коньюгат антитела с лекарственным средством и фармацевтически приемлемый носитель. К объектам данного изобретения также относятся способы снижения активности натуральных киллеров (НК-клеток) против клеток, экспрессирующих В 7 Н 6 человека, путем подавления взаимодействия В 7 Н 6 человека с человеческим NKp30. Такие способы обычно включают взаимодействие экспрессирующей В 7 Н 6 человека клетки, в присутствии НК-клетки человека, с эффективным количеством моноклональных антител, конкурирующих за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242) или с антителом,продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер. CNCM I-4245), где антитело ингибирует взаимодействие В 7 Н 6 человека с человеческим NKp30. Также объектом данного изобретения являются способы применения антитела или его антигенсвязывающей части для лечения отторжения аллотрансплантата клеток костного мозга (ВМС) с помощью ингибирования взаимодействия В 7 Н 6 человека с человеческим NKp30. Такие способы обычно включают прием в эффективном для ингибирования активности НК-клеток количестве и, таким образом, лечения острого отторжения аллотрансплантанта клеток костного мозга, моноклонального антитела, конкурирующего за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242) или продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245), когда антитело ингибирует взаимодействие В 7 Н 6 человека с человеческим NKp30. Также объектом данного изобретения является композиция для лечения отторжения аллотрансплантата клеток костного мозга (ВМС) у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую и фармацевтически приемлемый носитель. Способ снижения активности человеческих НК-клеток и способ применения для лечения отторжения аллотрансплантанта клеток костного мозга включают определенные варианты исполнений, в которых антитела являются человеческими или гуманизированными моноклональными антителами. Эти способы также включают варианты исполнения, где антитело является одноцепочечным. Также к объектам данного изобретения относятся способы уничтожения или подавления роста В 7 Н 6-экспрессирующих клеток внутри клеточной популяции, с помощью конъюгатов антител с лекарственным средством. Эти способы обычно включают взаимодействие В 7 Н 6-экспрессирующих клеток с эффективным количеством коньюгата антитела с лекарственным средством, включающего (а) антитело,конкурирующее за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242); антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номерCNCM I-4245); и (b) цитотоксическим агентом, конъюгированным с антителом. Также к объектам данного изобретения относятся способы применения коньюгата антитела с лекар-3 024629 ственным средством для лечения В 7 Н 6-экспрессирующей опухоли. Эти способы обычно включают введение эффективного количества коньюгата антитела с лекарственным средством, содержащего (а) антитело, конкурирующее за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245); и (b) цитотоксический агент, конъюгированный с антителом. Включены исполнения, в которых опухоль представляет собой рак толстой кишки, печени, шейки матки, легких,поджелудочной железы или простаты. Другими подходящими для терапии В 7 Н 6-экспрессирующими опухолями являются, к примеру, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкоз, лимфома Беркитта и хронический миелолейкоз. Для способа уничтожения или подавления роста В 7 Н 6-экспрессирующих клеток и/или для способа терапии В 7 Н 6-экспрессирующей опухоли применимы человеческие или гуманизированные моноклональные антитела в качестве антител, входящих в состав коньюгата антитела с лекарственным средством. Для обоих способов также применимы одноцепочечные антитела, в качестве антител, входящих в состав коньюгата антитела с лекарственным средством. Также к объектам данного изобретения относятся способы применения моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части для лечения В 7 Н 6-экспрессирующей опухоли. Данный способ обычно включает введение эффективного количества моноклонального антитела, конкурирующего за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательностиSEQ ID NO:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I4245); когда антитело содержит Fc-фрагмент, обладающий ADCC- и/или CDC-активностью. Применимыми моноклональными антителами являются также человеческие антитела, гуманизированные антитела и одноцепочечные антитела. В некоторых вариантах исполнения Fc-фрагмент является одноцепочечным (scFc). В 7 Н 6-экспрессирующие опухоли, поддающиеся лечению, включают, к примеру, рак толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы или простаты, поддаются лечению. Другие подходящие опухоли, экспрессирующие В 7 Н 6, включают, к примеру, прогемоцитарную лейкемию, Вклеточную лимфому, моноцитарную лимфому, эритролейкоз, лимфому Беркитта и хронический миелолейкоз. Также объектом данного изобретения является композиция для лечения В 7 Н 6-экспрессирующией опухоли у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть или конъюгата антитела с лекарственным средством и фармацевтически приемлемый носитель. Также к объектам настоящего изобретения относятся способы определения клеточной экспрессии В 7 Н 6, где связывание антитела указывает на присутствие В 7 Н 6 на поверхности клетки. В общем, этот способ включает (1) взаимодействие биологического образца, содержащего человеческие клетки с моноклональными антителами, конкурирующими за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека(аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245); и (2) определение связывания антитела, при этом связывание указывает на присутствие В 7 Н 6 на поверхности клетки и показывает экспрессирует ли клетка В 7 Н 6. В некоторых вариантах исполнения биологические образцы для исследования представляют собой интактные человеческие клетки или мембранную фракцию клеток. В некоторых вариантах исполнения используются антитела с детектируемыми метками. Подходящие метки включают радиоизотопы, флуоресцентные метки, хемилюминисцентные метки, ферментные метки или биолюминисцентные метки. К объектам настоящего изобретения также относятся также способы диагностики больных с подозрением на опухоль, клетки которой экспрессируют В 7 Н 6. Этот способ обычно включает (1) введение больному моноклональных антител, конкурирующих за связывание с внеклеточным доменом В 7 Н 6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM I-4242); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 9G9.2 (депозитный номер CNCM I-4243); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 10 Е 2.9 (депозитный номер CNCM I-4244); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245), конъюгированных с детектируемой меткой; и (2) определение распределения антител в организме пациента. Подходящие применения включают диагностику рака толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы или простаты. Другим объектом настоящего изобретения являются следующие клетки продуцирующие антитела: гибридомный клон 4 Е 5.5 (депозитный номер. CNCM I-4242); гибридомный клон 9G9.2 (депозитный номер CNCM I-4243); гибридомный клон 10 Е 2.9 (депозитный номер CNCM I-4244); гибридомный клон 17 В 1.3 (депозитный номер CNCM I-4245). Подробное описание изобретенияI. Обзор Настоящее изобретение относится к области идентификации и характеристики антител против В 7 Н 6, которые связываются с клеточным поверхностным белком семейства В 7, в частности моноклональных антител против В 7 Н 6 человека. Полипептид В 7 Н 6 был впервые описан как контррецептор для рецептора NKp30 человека - селективно экспрессирующегося на зрелых НК-клетках активирующего рецептора, связанного с цитотоксическими функциями НК-клеток (см. US Patent Application Publication No/20090220502), приводимый здесь во всей полноте посредством отсылки. Нуклеотидная последовательность, кодирующая В 7 Н 6 человека,показана здесь как SEQ ID NO:1, а кодируемый ею полипептид показан как SEQ ID NO:2. Полипептид В 7 Н 6 последовательности SEQ ID NO:2 включает в себя внеклеточный домен размером около 242 аминокислотных остатков (остатки 25-266 последовательности SEQ ID NO:2), трансмембранный домен размером около 18 аминокислотных остатков (остатки 267-284 последовательности SEQ ID NO:2) и внутриклеточный домен размером около 158 аминокислотных остатков (остатки 285-454 последовательности(остатки 142-238 последовательности SEQ ID NO:2). Кроме того, в последовательности В 7 Н 6 выделяют несколько потенциальных сигнальных мотивов, расположенных во внутриклеточной части молекулы,такие как мотив ITIM (SaYtpL, аминокислотные остатки 293-298 последовательности SEQ ID NO:2), мотив связывания SH2 (YqlQ, аминокислотные остатки 229-332 последовательности SEQ ID NO:2) и мотив связывания SH3 (PdaPilPvsP, аминокислотные остатки 418-427 последовательности SEQ ID NO:2). Настоящее изобретение касается получения моноклональных антител мыши против В 7 Н 6 человека и характеристики свойств этих антител. С помощью гибридомной технологии были получены пять мышиных моноклональных антител с изотипом IgG1 против В 7 Н 6 человека. Полученные антитела обозначены как 4 Е 5.5, 5 Е 1.4, 9G9.2, 10 Е 2.9 и 17 В 1.3. С помощью конкурентных анализов было показано, что данные антитела связываются с разными эпитопами молекулы В 7 Н 6. Антитела 17 В 1.3 и 4 Е 5.5 частично блокируют взаимодействие между NKp30 и В 7 Н 6, о чем свидетельствует ингибирование связыванияNKp30Fc и активации DOMSP30. Результаты этих экспериментов приводят в соответствие структуру и функцию и описаны в Примерах. Эти разные моноклональные антитела, как было показано, могут быть использованы для биохимических и диагностических анализов, а также имеют терапевтическое значение. Таким образом, настоящее изобретение охватывает моноклональные антитела, связывающие мембранный белок В 7 Н 6 человека с такой же или схожей специфичностью и другими характеристиками как МКА 4 Е 5.5, 5 Е 1.4, 9G9.2, 10 Е 2.9 и/или 17 В 1.3. Как описано в данной заявке, были получены мышиные моноклональные антитела и показана их способность связываться с различными эпитопами. Таким образом, одним объектом данного изобретения являются антитела, способные конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с описанными антителами (например, антитела, способные связывать те же самые эпитопы, что и антитела 4 Е 5.5, 9G9.2, 10 Е 2.9 и 17 В 1.3). Кроме того, для некоторых из этих антител показана способность воздействия на взаимодействие B7H6-NKp30. В соответствии с этим в некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека, описанные в настоящем изобретении, ингибируют активацию NKp30 опосредованную В 7 Н 6. Настоящее изобретение охватывает также гуманизированные антитела, полученные из анти-В 7 Н 6 антител других организмов (напр. гуманизированные антитела мыши), нейтрализующие антитела, моноклональные антитела человека, а также антиген-связывающие фрагменты перечисленных антител. Типичными фрагментами антител являются F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и минимальные единицы узнавания. Нейтрализующие антитела связываются с В 7 Н 6 таким образом, что снижается сила или вовсе блокируется связывание В 7 Н 6 с NKp30. Также к области данного изобретения относится моноклональное антитело, конкурирующее за место связывания с внеклеточным доменом В 7 Н 6, которое может быть использовано для ингибирования иммунного ответа, обусловленного НК-клетками, например, при остром отторжении трансплантата ВМС, когда данное антитело вводится в терапевтически эффективных количествах для блокирования активности НК-клеток. В соответствии с данным изобретением, анти-В 7 Н 6 антитела также могут быть использованы для воздействия против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, в частности против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток опухоли. Конъюгаты моноклональных антител против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством оказывают положительный клинический эффект против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток при введении субъекту, имеющему В 7 Н 6-положительную опухоль. Такое антитело в основном вводится отдельно, однако может применяться и в комбинации с другими терапевтическими агентами. В наиболее распространенном варианте применения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека конъюгированы с цитотоксическим агентом, в результате чего такой конъюгат при связывании или интернализации экспрессирующей В 7 Н 6 клеткой (например, В 7 Н 6-экспрессирующей клеткой опухоли) оказывает цитотоксический или цитостатический эффект. Таким образом, некоторые объекты данного изобретения включают конъюгаты моноклональных антител против В 7 Н 6 человека с лекарственными средствами. Часть такого конъюгата, представляющая собой антитело, будет связывать клеточный поверхностный белок человека В 7 Н 6 с такой же или сходной специфичностью и другими характеристиками, как и описанные здесь. Часть конъюгата, представ-5 024629 ляющая собой лекарственное средство будет оказывать терапевтическое воздействие (является терапевтическим агентом). Такой конъюгат анти-В 7 Н 6 антитела с лекарственным средством будет оказывать положительный клинический эффект на В 7 Н 6-экспрессирующие клетки при введении субъекту с опухолью, клетки которой экспрессируют В 7 Н 6. Обычно часть такого конъюгата, которая является лекарственным средством, является цитотоксическим агентом и будет оказывать цитотоксический или цитостатический эффект на клетки, экспрессирующие В 7 Н 6. В таких конъюгатах часть, являющаяся антителом,будет распознавать конкретные эпитопы молекулы В 7 Н 6. Отдельные варианты таких конъюгатов влияют на взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30. Например, в некоторых вариантах исполнения, конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, в соответствии с настоящим изобретением, подавляет активацию НК-клеток за счет NKp30. В других вариантах исполнения моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека содержит Fcфрагмент с эффекторной функцией, применяемый для активизации антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) против клеток, экспрессирующих В 7 Н 6. Настоящее изобретение включает моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека, содержащие Fc-фрагмент, обладающий ADCC-активностью, для применения в качестве индукторов ADCC. В таком применении обычно В 7 Н 6-экспрессирующие клетки взаимодействуют с эффективным количеством содержащих Fc-фрагмент моноклональных антител против В 7 Н 6 человека в присутствии экспрессирующих Fc-рецептор эффекторных иммунных клеток, обладающих цитолитической активностью. Эффекторными клетками иммунной системы, экспрессирующими Fc-рецепторы, вызывающие цитолитическую активность, являются, например, НК-клетки, а также отдельные субпопуляции CD8+ Тклеток. В вариантах исполнения, когда моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека, содержащиеFc-фрагмент с CDC-активностью, используются для индукции CDC, обычно, В 7 Н 6-экспрессирующие клетки взаимодействуют, в присутствии белков системы комплемента, с эффективным количеством содержащих CDC-активный Fc-фрагмент моноклональных антител против В 7 Н 6 человека. В 7 Н 6 экспрессирующие клетки, которые могут являться мишенями для цитолиза с помощью антител и способов, заявляемых в данной заявке на изобретение, включают, например опухолевые клетки, такие как,например, клетки рака толстой кишки, клетки рака печени, клетки рака мочеиспускательного канала,клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака простаты, клетки прогемоцитарной лейкемии, клетки В-клеточной лимфомы, клетки моноцитарной лимфомы, клетки эритролейкемии, клетки лимфомы Беркитта, клетки хронического миелолейкоза и многие другие. Эти и другие объекты изобретения станут очевидны при последующем детальном описании. Кроме того, различные ссылки указываются ниже и включаются в данное описание во всей их полноте посредством отсылки.II. Определения Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе,имеют то же общепринятое значение, которое применяется специалистами в данной области по отношению к описываемым способам и композициям. При использовании в данной заявке следующие термины и выражения имеют принятое для них значение, если не указано иное. Термин "полипептид" подразумевает собой полимер из аминокислот, соединенных пептидной связью, независимо натурального или синтетического происхождения. Полипептиды, состоящие менее чем из 10 аминокислотных остатков, традиционно обозначаются термином "пептиды". Термин "белок" означает макромолекулу, состоящую из одной или более полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, например углеводные группы. Углеводные группы и другие заместители непептидной природы могут вноситься в белковую молекулу системами клетки, в которой синтезируется белок, и, таким образом, будут различаться в зависимости от типа клеток. В данном документе белки называются по структуре их аминокислотного скелета; такие заместители, как углеводные группы, в основном не указываются, хотя могут присутствовать. Выражение "очищенный полипептид" обозначает полипептид, практически полностью очищенный от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие белковые примеси,ассоциированные с данным полипептидом в естественных условиях. Обычно препарат очищенного полипептида содержит наиболее очищенную фракцию данного полипептида, т.е. с чистотой не менее 80%,не менее 90%, не менее 95%, более 95%, с чистотой 96, 97 или 98% или с большей степенью чистоты или с чистотой более 99%. Единственный способ демонстрации, что конкретный препарат полипептида содержит выделенный полипептид, - электрофореграмма данного препарата, полученная с помощью электрофореза в полиакриамидном геле в денатрурирующих условиях (ДСН-ПААГ-электрофорез) с окрашиванием красителем Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue), на которой присутствует только одна полоса белковой природы. Однако термин "очищенный" не исключает присутствия того же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные формы или производные. Термины "N-концевой" и "С-концевой" применяются в данной заявке для обозначения положения внутри полипептидов. Там где позволяет контекст, эти термины используются с указанием конкретной последовательности или фрагмента полипептида для обозначения близости или относительности распо-6 024629 ложения. Например, определенная последовательность, расположенная с С-конца относительно референсной последовательности внутри полипептида, может быть расположена проксимально от С-конца референсной последовательности, но не обязательно на С-конце последовательности всего полипептида. Термин "экспрессия" обозначает биосинтез продукта гена. Например, в случае структурного гена экспрессия подразумевает транскрипцию последовательности структурного гена в последовательность мРНК и трансляцию этой мРНК в одну или более полипептидных цепей. Используемый в данной заявке термин "иммуномодулятор" включает цитокины, ростовые факторы стволовых клеток, ко-стимуляторные молекулы, факторы гемопоэза и подобные им, а также синтетические аналоги данных молекул. Используемый в данном документе термин "антитело" означает иммуноглобулиновые полипептиды и иммунологически активные части иммуноглобулиновых полипептидов, т.е. полипептиды иммуноглобулинового семейства или их фрагменты, содержащие сайт связывания антигена, который иммуноспецифически связывается со специфическим антигеном (например, внеклеточным доменом В 7 Н 6). Термин "антиидиотипическое антитело" означает антитело, связывающее вариабельный домен иммуноглобулина. В данном контексте, антиидиотипическое антитело связывается с вариабельным участком моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека. Таким образом, антиидиотипическое антитело является миметиком эпитопа молекулы В 7 Н 6. Термин "фрагмент антитела" означает часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab и подобную им. Независимо от структуры фрагмент антитела связывает тот же антиген, который распознается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека связывает эпитоп на молекуле В 7 Н 6. Термин "антитело" также охватывает интактные антитела, полученные генно-инженерным путем,или их фрагменты. Например, химерные антитела, гуманизированные антитела, Fv-фрагменты, состоящие из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, полипептиды состоящие из вариабельного домена легкой цепи, рекомбинантные одноцепочечные антитела, у которых вариабельные домены легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером ("scFv"-белки), минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые являются миметиками гипервариабельной области, а также схожие молекулы, также как синтетические антиген-связывающие пептиды и полипептиды. Термин "химерное антитело" означает рекомбинантный белок, содержащий вариабельные домены и определяющие комплементарность участки (CDR) из антитела грызуна, в то время как остальная часть молекулы антитела получена от антитела человека. Термин "гуманизированые антитела" означает рекомбинантные белки, у которых участки, определяющие комплементарность и происходящие от моноклонального антитела другого, чем человек, организма (например, мыши), перенесены с вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей исходного антитела на вариабельный домен антитела человека. Создание гуманизированных антител, являющихся производными антител других, кроме человека организмов (например, мыши), и связывающих или нейтрализующих белки человека, для терапевтического применения у человека является сферой деятельности экспертов в соответствующей области. Термины "Fc-фрагмент", "Fc-область" или "Fc-домен", используемые в данной заявке, являются синонимами и означают часть антитела, которая ответственна за связывание с рецепторами для антител на клетках и с компонентом C1q системы комплемента. Fc означает "кристаллиновый фрагмент" - фрагмент антитела, который легко кристаллизуется, при получении кристалла белка. Отдельные белковые фрагменты, которые изначально были описаны с помощью протеолитического анализа, определяют общую структуру иммуноглобулинов. Согласно принятым в литературе определениям, Fc-фрагмент состоит из связанных дисульфидной связью шарнирных областей тяжелых цепей, а также Сн 2 и Сн 3 доменов. Однако в последнее время данный термин употребляется для обозначения одной цепи, состоящей из Сн 3, Сн 2 и по меньшей мере части шарнирной области, достаточной для формирования димера за счет дисульфидной связи со второй цепью такой же структуры. Литературный обзор по структуре и функциям иммуноглобулинов доступен по данной ссылке: Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc.,1987), pp. 49-140; и Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. При использовании в данном документе термин "Fc" включает варианты природных последовательностей. Термины "одноцепочечный Fc", "одноцепочечный Fc-домен" и "scFc" при использовании в данном документе синонимичны и означают фьюжн-полипептиды, содержащие мономеры Fc-доменов, соединенные посредством гибкого линкера таким образом, что два мономера Fc способны димеризоваться и формировать функциональный димерный Fc-домен, способный связываться с Fc-рецепторами. Одноцепочечные Fc-полипептиды более подробно описаны в международной патентной заявке No. WO 08/0131242, озаглавленной "Single Chain Fc, Methods of Making, and Methods of Treatment", и описание которых включается в данную заявку во всей полноте посредством отсылки. Термин "Fc-область обладающая ADCC-активностью" используемый в данной заявке, означает Fcфрагмент, способный обуславливать реакции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) посредством связывания с цитолитическим Fc-рецептором (например, FcRIII) на цитолитической эффекторной иммунной клетке экспрессирующей данный Fc-рецептор (например, НК-клетке или CD8+ Т-7 024629 клетке). Обобщающий термин "система комплемента" означает компоненты нормальной сыворотки, которые при взаимодействии с комплексами антиген-антитело на поверхности клетки способны осуществлять лизис клеток. Система комплемента состоит из группы сывороточных белков, которые последовательно функционируют в единой системе для осуществления лизирующего эффекта. Термины "классический путь активации системы комплемента" и "классическая система комплемента", используемые в данной заявке, являются синонимами и означают определенный каскад реакций для активации системы комплемента. Для осуществления данного пути активации необходимо присутствие комплексов антиген-антитело для инициации последовательного каскада взаимодействий девяти основных компонентов, называемых С 1-С 9. В результате некоторых стадий процесса активации образуемым продуктом является фермент, катализирующий реакцию последующей стадии. Данный каскад обеспечивает умножение сигнала и активацию большого количества компонентов системы комплемента при относительно слабом инициирующем сигнале. Термин "Fc-фрагмент обладающий CDC-активностью", используемый в данной заявке, означает Fcфрагмент, способный обуславливать реакции комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) посредством связывания белка C1q системы комплемента и инициации классического пути активации системы комплемента. Термин "агент", используемый в данной заявке, означает элемент, вещество или другое молекулярное формирование, включающее, например, фармацевтическое, терапевтическое или фармакологическое вещество. Агенты могут быть естественными или синтетическими или являться их комбинацией. "Терапевтическим агентом" является агент, который оказывает терапевтический (например, положительный) эффект на клетку или ткань (например, на клетку или ткань экспрессирующую В 7 Н 6, такую как В 7 Н 6 экспрессирующую клетку опухоли), либо отдельно, либо в комбинации с другим агентом (например,комбинация неактивного лекарственного средства с активирующим его ферментом). В отдельных областях данного изобретения "терапевтический агент" представляет собой агент, конъюгированный с антителом с получением конъюгата, применимого для терапии. Примерами терапевтических агентов являются лекарственные средства, токсины, иммуномодуляторы, соединения бора, фотоактивные агенты или красители, радиоизотопы. В некоторых вариантах исполнения терапевтическим агентом для конъюгации с антителом является агент, обладающий цитотоксическим или цитостатическим эффектом. Термин "цитотоксический эффект" по отношению к эффекту, оказываемому агентом на клетку, означает уничтожение клетки. Термин "цитостатический эффект" означает ингибирование пролиферации клетки. Термин "цитотоксический агент" означает вещество, которое оказывает цитотоксический или цитостатический эффект на клетку, таким образом, соответственно, снижая численность или ингибируя рост клеток в клеточной популяции."Детектируемой меткой" является молекула или атом, которые могут быть конъюгированы с носителем в форме антитела, с образованием молекулы, применимой для диагностики. Примерами детектируемых меток являются хелаторы, фотоактивные вещества, радиоизотопы, флуоресцентные вещества,парамагнитные ионы и другие маркеры подвижных носителей. Термин "аффинная метка", применяемый в данной заявке, означает полипептидный фрагмент, который может быть присоединен ко второму полипептиду для детекции или очистки второго полипептида, или для образования сайтов связывания второго полипептида с субстратом. Принципиально любой пептид или белок, для которого доступно антитело или другой специфический связывающий агент, могут быть использованы в качестве аффинной метки. Аффинными метками могут являться полигистидиновый тракт, белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991),глутатион-S-трнсфераза (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), аффинная метка Glu-Glu Grussenmeyer etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952, 1985), вещество Р, пептид FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204,1988), стрептавидин-связывающий пептид и другие антигенные эпитопы или связывающие домены. См. общий обзор Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95, 1991. Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки доступны у коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Термин "свободное антитело" означает полноразмерное, по сравнению с фрагментом, антитело, не конъюгированное с каким-либо терапевтическим агентом. Свободные антитела могут быть поли- и моноклональными, а также являться некоторыми видами рекомбинантных антител: химерными или гуманизированными. Термин "моноклональное антитело" означает антитело, имеющее происхождение от одного клона клеток, включая любые, прокариотические или эукариотические, клетки, а также фаговые клоны, и не обозначает способ их получения. Таким образом, термин "моноклональное антитело" при применении в данной заявке не ограничен только антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Термин "иммуноконъюгат" означает конъюгат антитела с терапевтическим агентом или детектируемой меткой. Термин "эпитоп" относится к любой белковой последовательности, способной специфично связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, аминокислот или углеводных боковых цепей,-8 024629 и чаще всего обладают специфической пространственной структурой, а также специфическим распределением зарядов. Более определенно, термин "В 7 Н 6" эпитоп, используемый в данной заявке, относится к части полипептида В 7 Н 6, обладающего антигенной или иммуногенной активностью у животных, предпочтительно у млекопитающих, а наиболее предпочтительно - у мыши или человека. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида В 7 Н 6, которая вызывает иммунный ответ у животных. Эпитопом, обладающим антигенной активностью является часть В 7 Н 6 полипептида, с которой иммуноспецифически связываются антитела, что определяется любым методом, принятым и известным в соответствующей области деятельности, например: с помощью различных иммуноанализов. Антигенные эпитопы могут не являться иммуногенными. "Прерывистые эпитопы" представляют собой конформационные эпитопы сформированные по меньшей мере из двух удаленных в первичной последовательности белка друг от друга фрагментов последовательности В 7 Н 6. В присутствии денатурирующих растворителей (например, при Вестерн-блот анализе) конформационные эпитопы теряют способность специфически связываться с распознающей их молекулой. Термин "НК-клеточная активность", используемый в данной заявке, означает цитолитическую активность НК-клеток. Разработано большое количество тестов, которые хорошо известны специалистам в данной области, для детекции и/или мониторинга активности такого рода, включая, но не ограничиваясь,тестами, описанными в примерах в данной заявке. Используемая в данной заявке фраза "взаимодействие В 7 Н 6 и NKp30" относится к прямому физическому взаимодействию (например, связыванию) и/или другому непрямому взаимодействию функционального рецептора В 7 Н 6 и NKp30 на поверхности НК-клетки, которое приводит к стимуляции рецептора В 7 Н 6 и/или NKp30 и передаче сигнала внутрь клетки. Используемый в данной заявке термин "блокирующее антитело" относится к антителам, препятствующим (т.е. ингибирующим) взаимодействию В 7 Н 6 и NKp30 и/или препятствующим активации НКклеток с помощью В 7 Н 6, например, по результатам определения цитотоксической активности. Ингибирование может не являться полным и быть "частичным", т.е. выражаться в снижении или ограничении активности по отношению к стандартной величине или величине контрольного эксперимента. Выражение "заболевание или расстройство характеризуемое присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток", используемое в данной заявке, относится к любому заболеванию или расстройству, в развитии которых принимают участие, по меньшей мере частично, клетки экспрессирующие В 7 Н 6. Такими патогенными клетками, например, могут являться клетки определенных видов опухолей. В соответствии с этим, типичными заболеваниями или расстройствами, характеризуемыми присутствием В 7 Н 6 экспрессирующих клеток, являются определенные виды рака. Такие заболевания и расстройства особенно поддаются определенным способам лечения, направленным против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток,что описано далее в данной заявке. Выражения "заболевание или расстройство, опосредованное NKp30-экспрессирующими клетками" и "заболевание или расстройство, характеризующееся повышенной активностью NKp30 экспрессирующих клеток" используются в данной заявке в качестве синонимичных выражений по отношению к заболеваниям или расстройствам, патология которых опосредована, по крайней мере отчасти,цитолитической активностью NKp30-экспрессирующих клеток. В некоторых случаях заболевания или расстройства, обусловленные NKp30-экспрессирующими клетками и патогенез которых опосредован, по крайней мере частично, цитолитической активностью НК-клеток, являются "заболеваниями или расстройствами, обусловленными НК-клетками". Примером таких заболеваний или расстройств является острое отторжение аллотрансплантатов клеток костного мозга (ВМС). Такие заболевания и расстройства особенно поддаются определенным способам лечения, направленным против В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, что описано далее в данной заявке. Термин "эффективное количество" в контексте описания в данной заявке лечения заболевания или расстройства опосредуемого NKp30-экспрессирующими клетками посредством введения субъекту блокирующих анти-В 7 Н 6 антител, или в контексте описания лечения заболевания или расстройства, характеризующегося присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, посредством введения анти-В 7 Н 6 антител или конъюгатов антитела с лекарственным средством субъектом, относится к такому количеству молекул, которого достаточно для подавления патогенеза или облегчения состояния по одному или более клиническим или диагностическим симптомам данного заболевания или расстройства у субъекта. Эффективное количество терапевтического агента вводится в соответствии со способами, описанными в настоящем изобретении, в режиме "эффективного дозирования". Термин "эффективное дозирование" относится к сочетанию вводимого количества терапевтического агента и частоты введения, подходящих для осуществления лечения или профилактики данного заболевания или расстройства. Вследствие недостаточной точности стандартных аналитических методов молекулярные веса и линейные размеры полимеров следует понимать как аппроксимированные значения. Когда такое значение указывается как "около" X или "примерно" X, величину данного значения следует понимать как указанную с точностью 10%.III. Антитела к белкам В 7 Н 6 Одним из объектов данного изобретения являются моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека, специфически связывающиеся с эпитопом В 7 Н 6 человека (к примеру, с полипептидным фрагментом аминокислотной последовательности, содержащейся в остатках 25-266 последовательности SEQ IDNO:2). В некоторых вариантах исполнения данные моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека способны ингибировать взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30. Ингибирование не обязательно является полным блокированием взаимодействия В 7 Н 6 с NKp30, возможно снижение активности по сравнению с показаниями контроля или стандарта. В определенных вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека в соответствии с данным изобретением способны конкурировать за связывание с В 7 Н 6 человека с антителом, продуцируемым одним из гибридомных клонов: 4 Е 5.5 (депозитный номер CNCM(депозитный номер CNCM I-4245). Данные четыре гибридомы депонированы в Национальную коллекцию культур микроорганизмов ( CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция) 18 ноября 2009 г. от имени Национального института здравоохранения и медицинских исследований (INSERM). Были идентифицированы, охарактеризованы и описаны пять мышиных моноклональных антител против В 7 Н 6 человека. При характеристике антител показано, что определенные моноклональные антитела распознают различные эпитопы белка В 7 Н 6, что показано с помощью анализов конкурентного связывания и описано в данной заявке. В дальнейшем, при характеристике антител показано, что два из них,по крайней мере частично, блокируют взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30. Группирование антител по эпитопам может быть использовано для идентификации антител, которые попадают в область заявленного изобретения. Под группировкой антител по эпитопам понимается использование анализов конкурентного связывания для идентификации пар антител, которые способны или неспособны одновременно связывать белок В 7 Н 6, таким образом, идентифицируя пары антител,связывающихся с теми же или перекрывающимися эпитопами белка. Эксперименты по группированию антител по эпитопам демонстрируют существование эпитопов с различной иммуногенностью. Для идентификации или "картирования" эпитопов на специфической аминокислотной последовательности белка В 7 Н 6 требуются дополнительные данные. Конкуренцию за связывание можно оценить для любых пар антител или фрагментов. К примеру,при использовании соответствующих реактивов для детекции, специфичность связывания антител или связывающих фрагментов из любого источника можно сравнить со специфичностью связывания описанных в данной заявке моноклональных антител. Группировка антител по эпитопам на основе конкуренции за связывание может быть выполнена с "выделенными антителами" или с супернатантами клеточных культур. Часто группировка по эпитопам выполняется для супернатантов клонов первого раунда, с целью выбора клонов для дальнейшего культивирования. Сравниваемые антитела должны обладать в значительной мере однородными доменами, связывающими антиген. В случае "биспецифических" или "бифункциональных" антител оценка специфичности связывания двух различных центров связывания или сортировка должны проводится независимо. Специфичность связывания антител, описываемых в данном изобретении, может быть исследована любым известным в соответствующей области деятельности способом. Многие различные форматы анализов конкурентного связывания могут быть использованы для группировки по эпитопам. Набор иммунноанализов, которые могут быть использованы, включает, но не ограничивается следующими видами: системы конкурентных анализов, использующие такие методики, как вестерн блоттинг, радиоимунноанализы, ИФА, "сендвич"-иммунноанализы, иммуннопреципитационные анализы, преципитиновые анализы, гель-диффузионные преципитиновые анализы, иммуннорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком А и реакции связывания комплемента. Такие способы являются потоковыми и хорошо известны в соответствующей области (см., к примеру, Ausubel et al., eds,1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wileysons, Inc., New York). Кроме того могут быть использованы такие обычные перекрестные конкурентные анализы, как описаны в Antibodies, ABIACORE (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) - один из множества вариантов форматов анализа поверхностного плазмонного резонанса, используемый для построения сгруппированных панелей моноклональных антител по эпитопам. По другим ссылкам, к примеру, The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996, описаны альтернативные способы,которые могут быть использованы для связывания антител и, как ожидается, могут дать сопоставимую информацию о специфичности связывания антител с лигандом В 7 Н 6. При использовании системыBIACORE эксперименты по группировке по эпитопам проводятся с растворимыми, нативными или рекомбинатными антигенами. Такие исследования могут быть выполнены на системе BIACORE1000(GE Healthcare, Piscataway, NJ). Для управления анализом может быть использовано программное обеспечение BIAlogue v. 1.2. К примеру, для группирования мышиных моноклональных антител полученных против В 7 Н 6 человека по аффинности связывания, козьи поликлональные антитела против IgG-Fc мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) могут быть ковалентно иммобилизированы на сенсорном чипе BIACORE CM5 и использованы для связывания (захвата) первичных моноклональных антител в тесте. Незанятые сайты связывания Fc-фрагментов на чипе затем блокируются с использованием поликлональных IgG-Fc-фрагментов (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Затем в систему вводится белок В 7 Н 6, который специфически связывается с иммобилизованными первичными моноклональными антителами. Прибор BIACORE измеряет массу белка, связавшегося с сенсорным чипом; связывание как первичного антитела, так и антигена В 7 Н 6 может быть измерено для каждого цикла. После связывания первичных антител и антигена с чипом, в систему вводятся растворимые вторичные антитела, которые связываются с предварительно связанным антигеном. Если вторичные моноклональные антитела способны связывать антиген В 7 Н 6 одновременно с первичными моноклональными антителами,такое связывание определяется BIACORE. Если, однако, вторичные моноклональные тела не способны связывать антиген В 7 Н 6 одновременно с первичными моноклональными антителами, дополнительное связывание не детектируется. Для каждого моноклонального антитела проводится отрицательный контроль относительно себя самого, с целью установления уровня фонового сигнала (отсутствие связывания). Формат конкурентного ИФА без метки (LFC-ELISA) также может использоваться для группировки антител по эпитопам. В этом способе, описанном Nagata и соавторами, J. Immunol. Methods 292:141-155,2004, используются биотинилированные молекулы В 7 Н 6. Например, для группирования мышиных моноклональных антител, полученных против В 7 Н 6, лунки планшета для микротитрования заполняют 100 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мл козьих специфических антител против IgG-Fc- мыши (JacksonImmunoResearch), разведенными в буфере В для ИФА (фосфатно-солевой буфер, 0.1% Tween 20, 1% бычий сывороточный альбумин). После связывания этих антител с подложкой в течении 3 часов при комнатной температуре, каждую кондиционированную среду содержащую моноклональные антитела разводят в буфере В для ИФА до концентрации моноклональных антител приблизительно 0,5 мкг/мл, и инкубируют в течение на ночи при 4 С с подготовленным планшетом для связывания с козьими антимышиными IgG (mAbl). Параллельно второй набор кондиционированных сред (mAb2) разводят в пробирках из полистирола до концентрации приблизительно 0,5 мкг/мл моноклональных антител в буфере В для ИФА, смешивают с 50 нг/мл биотилированного В 7 Н 6 и инкубируют в течение ночи при 4 С. После инкубации mAbl с антителами, сорбированными на подложке, планшет блокируется какими-либо не относящимися к эксперименту антителами, чтобы заполнить свободные центры связывания на планшете. Смеси mAb2 с биотинилированным В 7 Н 6 добавляют в планшет и инкубируют. В качестве контроля(отсутствие конкуренции) 50 нг/мл биотинилированного В 7 Н 6 добавляют непосредственно (без предварительной инкубации с mAb2) в лунки, содержащие иммобилизированный mAbl. После инкубации с комплексом биотинилированного В 7 Н 6 с mAb2 в планшет добавляют 0,5 мкг/мл конъюгата стрептавидин-HRP (Pierce, Rockford, 111.). Количество связанного конъюгата в лунке визуализируется с помощью реакции с ТМВ-субстратом (BioFX Laboratories, Owings Mills, Md.) и измерения поглощения при длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов (Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, Calif.). Если mAbl связывается с отличным от mAb2 эпитопом, комплекс биотинилированного В 7 Н 6 с mAb2 будет связываться с планшетом, приводя к высокому уровню сигнала поглощения. Если mAbl связывается с тем же эпитопом, что и mAb2, комплекс биотинилированного В 7 Н 6 сmAb2 не будет связываться с планшетом, приводя к низком уровню сигнала поглощения. В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека, описанные в настоящей заявке, способны ингибировать взаимодействие В 7 Н 6 с человеческим NKp30; такие антитела применимы, к примеру, для ингибирования клеточных или других физиологических событий, связанных с взаимодействием В 7 Н 6 с NKp30, включая, к примеру, В 7 Н 6- и/или NKp30-опосредованный внутриклеточный сигналинг и ассоциированная с ним эффекторная функция (например, NKp30-опосредованная цитолитическая активность). Антитела к В 7 Н 6 могут быть получены, например, с использованием в качестве антигена продукта экспрессионного вектора для наработки В 7 Н 6 или В 7 Н 6, выделенного из природного источника В частности применимые моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека специфически связывают В 7 Н 6. Антитела считаются специфически связывающими, если обладают хотя бы одним из следующих двух свойств: (1) антитела связывают В 7 Н 6 с пороговым значением активности связывания, и (2) антитела не обладают значительной кросс-реактивностью по отношению к полипептидам, относящимися к В 7 Н 6. В отношении первой характеристики антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом В 7 Н 6, пептидом или эпитопом с аффинностью связывания (Ка) 106 М-1 или более, а наиболее предпочтительно - 109 М-1 или более. Аффинность связывания антитела может быть легко определена с помощью одного из обычных способов, применяемых в соответствующей сфере, например, с помощью анализа Скэтчарда (Scatchard, Ann. NY Acad. Set. 51:660, 1949). В отношении второй характеристики антитела не обладают значительной кросс-реактивностью по отношению к иным полипептидам,например, если при вестерн-блоттинге данные антитела детектируют В 7 Н 6 и не реагируют с известными в настоящее время полипептидами. Примеры известных полипептидов, относящихся к анализу, включа- 11024629 ют известные белки семейства В 7. Моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека могут быть получены с помощью антигенных эпитоп-содержащих пептидов и полипептидов. Пептиды и полипептиды, несущие антигенные эпитопы обычно содержат последовательность, содержащую не менее девяти или 15-30 аминокислот из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. Однако для индукции выработки антител, которые связывают В 7 Н 6, также применимы пептиды и полипептиды включающие большую часть аминокислотной последовательности, описываемой в данной заявке, 30 до 50 аминокислотных остатков, или любой длины вплоть до полноразмерной последовательности полипептида В 7 Н 6. Желательно, чтобы аминокислотная последовательность пептида, несущего эпитоп выбиралась так, чтобы обеспечить достаточную растворимость в водном растворе (к примеру, последовательность включает относительно гидрофильные остатки, в то время как гидрофобные остатки обычно избегают). Кроме того, аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина также желательны для получения антител. Потенциальные антигенные сайты связывания В 7 Н 6 могут быть идентифицированы с помощью метода Джеймсона-Вульфа, Jameson and Wolf (CABIOS 4:181, 1988), как это реализовано в программеPROTEAN (версия 3.14) LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI). Для данного анализа могут использоваться параметры по умолчанию. Метод Джеймсона-Вульфа предсказывает потенциальные антигенные детерминанты с помощью комбинирования шести основных подпрограмм для предсказывания структуры белков. К примеру, метод Хоппа-Вудса (см. Норр et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824, 1981) может быть использован для идентификации областей аминокислотной последовательности с наибольшей локальной гидрофобностью(параметр: усреднение по 7 остаткам). На второй стадии может применяться метод Эмини (см. Emini etal., J. Virology 55:836, 1985) для подсчета поверхностных вероятностей (параметры: порог принятия решения по поверхности (0.6) = 1). На третьей стадии может быть использован метод Карплюса-Шульца,Karplus и Schultz (Naturwissenschaften 72:212, 1985) для предсказания гибкости цепи скелета (параметры: порог гибкости (0.2) = 1). На четвертой и пятой стадиях анализа к полученным данным могут применяться предсказания вторичной структуры с помощью метода Чоу-Фасмана (см. Cbou, "Prediction of ProteinMol. Biol. 120:97, 1978) (параметры метода Чоу-Фасмана: таблица конформаций = 64 белка; порог дляобласти = 103; порог дляобласти = 105; параметры метода Гарниера-Робсона:иконстанты решения = 0). На шестом шаге анализа могут быть комбинированы параметры гибкости и факторы гидрофобности и доступности остатков растворителю для определения значения профиля поверхности, называемого "антигенный индекс". Наконец, функция расширения пиков может быть применена к антигенному индексу, которая увеличивает основные пики поверхности путем добавления, например, 20, 40, 60 или 80% от соответственного значения пика, чтобы учесть дополнительную свободную энергию, возникающую из подвижности поверхностных участков по сравнению с внутренними участками. Эти вычисления,однако, обычно не применяют к любым основным пикам, которые располагаются в спиральных участках, поскольку спиральные участки имеют тенденцию к снижению гибкости. Способы получения моноклональных антител обычно известны. К примеру, моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам в данной области, (см., например, Kohler et. al., Nature 256:495, 1975; Coligan et. al. (eds.), Current Protocols(Glover et al., eds., Oxford University Press 1995). В определенных вариантах исполнения моноклональные антитела получают вводя мышам композицию, содержащую продукт гена В 7 Н 6 (например, полипептид,содержащий или состоящий из остатков 25-266 последовательности SEQ ID NO:2), после чего проверяют наличие антител, отбирая образец плазмы, выделяют селезенку для получения В-лимфоцитов, после чего проводят слияние В-лимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, затем клонируют гибридомы, отбирают положительные клоны, продуцирующие антитела к антигенам, культивируют клоны для наработки антител к целевому антигену и выделяют антитела из культур гибридом. Моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека также могут быть человеческими антителами или производными этих антител. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены, к примеру,из трансгенных мышей, продуцирующих человеческие антитела в ответ на иммунизацию антигеном. В данной методике элементы локуса тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека введены в геном линий мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, содержащих целевые делеции локусов эндогенных тяжелой и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела специфические для человеческих антигенов, такие мыши могут использоваться для получения гибридом, секретирующих человеческие антитела. Способы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны, к примеру, Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856,1994; and Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994. Альтернативные способы получения или селекции моноклональных антител включают, к примеру,- 12024629 презентацию белка В 7 Н 6 или пептида лимфоцитам in vitro и последующий выбор антител из фаговых или сходных библиотек, кодирующих антитела (к примеру, с помощью иммобилизированного или меченого белка В 7 Н 6 или пептида). Методики создания и скрининга таких библиотек, кодирующих антитела,известны в соответствующей области (см, к примеру, U.S. Patent Nos. 5580717; 5885793; 5969108 and 6040136). Моноклональные антитела могут быть выделены из клеточных культур и очищены с помощью широкого набора хорошо разработанных методик. Такие методики выделения включают, к примеру, аффинную хроматографию на белок-А-сефарозе, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию (см.,например, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)," in Methods in Molecular Biology (Vol. 10) 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992. Аминокислотная последовательность моноклонального антитела может быть изменена с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, структура антител может быть изменена для получения необходимых характеристик. Модифицированные антитела могут обладать, например, лучшей стабильностью и/или терапевтической эффективностью относительно их немодифицированных форм. Возможных вариантов много и они варьируют от замены одной или нескольких аминокислот до почти полной перестройки, например, вариабельной или константной области. Изменения в константной области будут в основном осуществляться для того, чтобы улучшить или изменить такие характеристики, как связывание компонентов системы комплемента, взаимодействие с мембранами и другие эффекторные функции. Обычно изменения в вариабельной области могут осуществляться для того чтобы улучшить характеристики связывания антигена, повысить стабильность вариабельной области или снизить риск иммуногенности. Также могут быть использованы методики фагового дисплея (см., например, Huse et al.,Science 246:1275-1281, 1989; Ladner et al., U.S. Patent No. 5571698). В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека являются фрагментами антител, содержащими антиген-связывающие домены интактного (полноразмерного) антитела. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, с помощью протеолитического расщепления антител. Фрагменты антител могут быть получены с помощью расщепления пепсином или папаином интактных антител стандартными способами. В качестве примера, фрагменты антител могут быть получены с помощью ферментативного расщепления антител пепсином с получением 5S фрагмента,обозначаемого F(ab')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с помощью тиолвосстанавливающего агента с получением одновалентных 3.5S Fab'-фрагментов. Опционально реакция расщепления может быть проведена с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся при расщеплении дисульфидных связей. Как альтернативный вариант, ферментативное расщепление с использованием пепсина напрямую приводит к образованию двух одновалентных Fabфрагметов и Fc-фрагмента. Эти способы описаны, например, в U.S. patent No. 4331647 to Goldenberg;Methods in Enzymology (vol. 1) 422 (Academic Press 1967); and Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей для получения одновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или использование других ферментных, химических или генетических методик, также могут быть использованы, до тех пор,пока фрагменты связывают антиген, распознаваемый интактным антителом. К примеру, Fv фрагменты содержат комплекс VH и VL цепей. Такой комплекс может быть нековалентным, как описано у Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659, 1972. В другом случае, вариабельные цепи могут быть связаны межмолекулярной дисульфидной связью или сшиты посредством таких химических соединений как глутаральдегид (см., например, Sandhu, Cnt. Rev. Biotech. 12:437, 1992).Fv-фрагменты могут содержать VH и VL цепи, связанные посредством пептидного линкера. Эти одноцепочечные белки, связывающие антигены (scFv), получают при помощи сборки структурных генов,содержащих последовательности ДНК, кодирующие VH и VL домены, связанных между собой олигонуклеотидом. Структурный ген встраивается в экспрессионный вектор, который затем вводится в клеткухозяина, например Е. coli. Полученные рекомбинантные клетки синтезируют единую полипептидную цепь с пептидным линкером, связывающим два V домена. Способы получения scFv описаны, к примеру,в Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991 (см., также Bird et al., Science 242:423, 1988; U.S. Patent No. 4,946,778 to Ladner et al.; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993, andSandhu, выше.) Например, scFv может быть получен скринингом библиотеки scFv (к примеру фаговых библиотек scFv) на специфическое связывание с В 7 Н 6 (к примеру, иммобилизированного или меченного белка В 7 Н 6 или пептида). Другой формой фрагмента антитела является пептид, образующий участок определяющий комплементарность (CDR). CDR-пептиды ("минимальные единицы узнавания") могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих CDR антител, представляющих интерес. Такие гены получают, к примеру, используя полимеразную цепную реакцию для наработки ДНК вариабельных областей антител,используя РНК клеток, продуцирующих антитела, (см., например, Larrick et al. Methods: A Companion toAntibodies: Principles and Applications 137 (Birch et al., eds., Wiley-Liss, Inc. 1995. Также моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека могут быть "гуманизированными" моноклональными антителами против В 7 Н 6, полученными из антител других организмов. Гуманизированные моноклональные антитела получают переносом участков, определяющих комплементарность тяжелых или легких вариабельных цепей антител других организмов (к примеру, мышиных), в вариабельные домены человеческих антител. Типичные аминокислотные остатки в каркасных участках человеческих антител являются, таким образом, замещенными на соответствующие остатки антител других организмов. Использование гуманизированных моноклональных антител устраняет проблему иммуногенности константных доменов мыши. Основные методики для клонирования вариабельных доменов иммуноглобулинов мыши описаны, например Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Методики получения гуманизированных моноклональных антител описаны, например, Jones et al., Nature 321:522, 1986;al., eds., John WileySons, Inc. 1996) и в U.S. Patent No. 5,693,762 to Queen et al. В отдельных вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека содержат Fcфрагмент, содержащий домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig) и обычно часть шарнирной области иммуноглобулина. Fc-фрагмент отвечает за два очень желательных свойства IgG: активацию эффекторных функций и длительный период полужизни в плазме. Способность уничтожать целевые клетки, к которым прикрепляются антитела, связана с активацией эффекторных клеток иммунной системы (ADCC) и путей активации комплемента (CDC) за счет связывания Fc-фрагмента с Fc-рецептором и комплементарным белком C1q соответственно. Связывание опосредовано остатками, содержащимися преимущественно в участках, расположенных ниже шарнирной области и выше домена CH2. (см., например, Wines et al., J. Immunol. 164:5313, 2000; Woof and Burton, Nature Reviews 4:1, 2004.) Длительный период полужизни в плазме для IgG связан с рН зависимым взаимодействием между аминокислотами в доменах CH2 и CH3 и неонатальным Fc рецептором - FcRn. (см., например, Getie and Ward, ImmunologyToday 18:592, 1997; Petkova Wines et al., Int. Immunol. 18:1759, 2006.) Таким образом, в некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека содержат Fc-фрагмент, обладающий ADDC и/или CDC активностями. Такие антитела весьма применимы для уничтожения целевых клеток, экспрессирующих В 7 Н 6, таких как, к примеру, раковые или вирус-инфицированные клетки. В других вариантах исполнения моноклональные антитела против B7 Н 6 человека содержат Fc-фрагмент, у которого отсутствуют одна или более эффекторные функции (например, отсутствуют ADCC и/или CDC-активности). Fc-фрагменты с отсутствующей или значительно пониженной эффекторной функцией, могут быть получены, к примеру, включением одной или более аминокислотных замен в нативную последовательность Fc-фрагмента, так что Fc-фрагмент не связывается или гораздо слабее связывается с цитолитическими Fc-рецепторами и/или с белком Clq системы комплемента. В соответствующей области знаний описаны различные модификации Fc-фрагментов с отсутствующей или сильно ограниченной эффекторной функцией. В частности применимые Fc-фрагменты, не обладающие или обладающие сильно сниженной эффекторной функцией включают, к примеру, варианты Fc-фрагментов как описано в US Patent Application Publication2009/0220502. В некоторых вариантах исполнения, включающих Fc-фрагмент, данный Fc-фрагмент представляет собой одноцепочечный Fc (scFc), состоящий из двух мономеров Fc-фрагмента, связанных гибким линкером, так что два Fc мономера способны к димеризации с образованием функционального димерного Fcфрагмента. Например, в нескольких вариантах моноклональных антител против В 7 Н 6 человека, содержащих scFc, антитела содержат одноцепочечные Fv (scFv), слитые с scFc-фрагментом, при этом scFvфрагмент специфически связывается с В 7 Н 6. Одноцепочечные Fc-полипептиды, включающие фъюжнполипетиды, содержащие scFc и один или более антиген-связывающих доменов (например, scFv), описаны подробнее в International PCT Patent Application PublicationWO 08/0131242 "Single Chain Fc, Methods of Making, and Methods of Treatment", и описание которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством отсылки. Также моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека или фрагменты антител, описанные в данной заявке, могут быть пегилированы с помощью способов, используемых в данной сфере и описанных в данной заявке. Моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека могут быть конъюгированы с детектируемыми метками с образованием иммуноконьюгатов против В 7 Н 6. Подходящие детектируемые метки включают,например, радиоизотопы, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, ферментные метки, биолюминесцентные метки или коллоидное золото. Способы создания и детекции таких меченых иммуноконьюгатов, широко известны специалистам в данной области, и ниже описаны более подробно. Детектируемая метка может быть радиоизотопной, детектируемой с помощью авторадиографических методов. Изотопами, которые в основном применимы для целей, описываемых в настоящем изобре- 14024629 тении, являются 3 Н, 125I, 131I, 35S and 14C. Иммуноконьюгаты против В 7 Н 6 могут быть мечены флуоресцентными соединениями. Присутствие антител с флуоресцентной меткой детектируется облучением иммуноконьюгатов светом с нужной длиной волны и регистрацией результирующей флуоресценции. Соединения, используемые в качестве флуоресцентных меток, содержат флуоресцентный изоцианат, родамин, фикоцианин, аллофикоцианин, флалальдегид и флуорескамин. Кроме того, иммуноконьюгаты против В 7 Н 6 могут быть мечены хемилюминесцентными соединениями. Присутствие иммуноконьюгатов, меченых хемилюминесцентными метками, определяют по возникновению люминесценции, нарастающей в течение химической реакции. Примеры соединений, применяемых в качестве хемилюминесцентных меток, включают люминол, изолюминол, ароматический эфир акридина, имидазол, акридиновую соль и эфир щавелевой кислоты Также биолюминисцентные соединения, могут быть использованы в качестве меток для иммунокольюгатов против В 7 Н 6, описанных в данном изобретении. Биолюминесценция - это вид хемилюминесценции найденный в биологических системах, при котором каталитические белки увеличивают эффективность хемилюминисцентных реакций. Присутствие биолюминесцентых белков определяют по появлению люминесценции. Биолюминисцентные соединения, применимые в качестве меток, включают люциферин, люциферазу и акворин. Кроме того, иммуноконьюгаты против В 7 Н 6 могут быть помечены ферментом, связанным с моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека. Когда такой коньюгат фермента с антителом против В 7 Н 6 инкубируется в присутствии подходящегосубстрата, ферментативная часть конъюгата реагирует с субстратом с образованием вещества, которое может быть детектировано, например, спектрофотометрически, флуорометрически или визуально. Примерами ферментов, используемых в качестве ферментной метки для полиспецифических иммуноконьюгатов, являются Р-галоктосидаза, глюкозооксидаза, пероксидаза и щелочная фосфатаза. Специалистам в данной области будут известны другие применимые метки, которые могут использоваться в соответствии с данной заявкой. Связывание маркеров с моноклональными антителами против В 7 Н 6 человека может быть выполнено с помощью стандартных способов, известных в данной области. Типичная методология в этой области описана в Kennedy et. al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et. al.,Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et. al., Int'U. Cancer 46:1101, 1990; Stein et. al., Cancer Res. 50:1330, 1990;and Coligan, выше. Кроме того, воспроизводимость и гибкость иммунохимической детекции может быть увеличена за счет использования конъюгатов моноклональных антител против В 7 Н 6 человека с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, Wilchek et. al., (eds.), "Avidin-Biotin Technology,"Methods In Enzymology (vol. 184) (Academic Press 1990); Baye et. al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," in Methods In Molecular Biology (vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992 Способы проведения иммуноанализов хорошо разработаны (см., например, Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role ofIV. Конъюгаты анти-В 7 Н 6 моноклональных антител с лекарственными средствами Другим объектом изобретения данной заявки является конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством. Выражение "конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством" в данной заявке означает моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека (как описано в разделе III, выше) конъюгированное с каким-либо терапевтическим агентом. Такие конъюгаты оказывают положительные терапевтические эффекты на экспрессирующие В 7 Н 6 клетки при введении субъекту, например, с В 7 Н 6-экспрессирующей опухолью. Обычно положительный клинический эффект достигается при приеме конъюгата отдельно, но также может использоваться комбинация конъюгата с другими терапевтическими агентами. В обычных вариантах исполнения конъюгат состоит из моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека и цитотоксического агента, таким образом, такой конъюгат обладает цитотоксическим или цитостатическим эффектом по отношению к В 7 Н 6-экспрессирующим клеткам (например, В 7 Н 6 экспрессирующим клеткам опухоли) при контакте с клеткой или интернализации. В частности, применимыми веществами для конъюгации с антителами являются хемотерапевтические агенты, ферменты,активирующие неактивные лекарственные средства, радиоактивные изотопы или соединения, токсины. Например, моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека может быть конъюгировано с хемотерапевтическим агентом (см. ниже) или токсином (например, цитостатическое или цитотоксическое вещество,к примеру, абрин, рицин А, экзотоксин из бактерий рода Pseudomonas, дифтерийным токсином). Дополнительные примеры веществ, которые могут быть использованы для конъюгирования с моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека, приводятся ниже. В других исполнениях моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека конъюгируется с фермен- 15024629 том, конвертирующим пролекарство. Такой фермент может быть соединен с антителом посредством технологии рекомбинвантных ДНК или химически конъюгирован с антителом с помощью известных способов. Типовыми ферментами, конвертирующими пролекарство, являются карбокиспептидаза G2, глюкуронидаза, пенициллин-V-амидаза, пенициллин-G-амидаза, -лактамаза, -глюкозидаза, азотредуктаза и карбоксипептидаза А. Методики, применяемые для конъюгирования терапевтических веществ с белками, в частности, с антителами, хорошо известны (См., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Также, см., например, РСТ publication WO 89/12624.) В определенных вариантах исполнения в соответствии со способами, описанными в данной заявке,конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека и лекарственного средства интернализуется и накапливается внутри В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, против которых оказывает терапевтический эффект (цитотоксический или цитостатический). Способы детекции накопления и определения скорости накопления описаны, например, в WO 2004/010957, озаглавленном "Drug Conjugates and Their Use forTreating Cancer, an Autoimmune Disease or an Infectious Disease." В типичных вариантах исполнения, при использовании моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека конъюгированного с терапевтическим веществом (например, лекарственным средством или ферментом, конвертирующим пролекарство), данное вещество преимущественно проявляет активность при интернализации целевыми В 7 Н 6-экспрессирующими клетками (например, клетками В 7 Н 6 экспрессирующей опухоли). В других вариантах исполнения, моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека конъюгированное с лекарственным средством не интернализуется клеткой, а лекарственное средство оказывает терапевтический эффект (например, уничтожение или подавление роста В 7 Н 6 экспрессирующих клеток) при связывании с клеточной мембраной. Для минимизации активности терапевтического вещества вне В 7 Н 6-экспрессирующих клеток (например, В 7 Н 6-экспрессирующих клеток опухоли), конъюгирование терапевтического вещества с антителом, чаще всего, производится таким образом, чтобы активность терапевтического вещества в составе конъюгата была ограничена до тех пор, пока терапевтическое вещество не будет отщеплено от антитела(например, вследствие гидролиза или под действием отщепляющего агента). В таких исполнениях терапевтическое вещество соединяется с антителом с помощью расщепляемого в условиях внутриклеточной среды В 7 Н 6-экспрессирующих клеток линкера, достаточно устойчивого к действию внешней среды, так что конъюгат антитела с терапевтическим веществом расщепляется при интернализации В 7 Н 6 экспресирующей клеткой (например, в эндосомах клетки или, например, за счет рН-чувствительности или чувствительности к действию протеаз в лизосомах или в мембранных ямках клетки). (См. РазделIV(А), ниже). Далее в определенных вариантах исполнения конъюгат антитела с лекарственным средством содержит заряженное относительно плазматической мембраны терапевтическое вещество, что тем самым еще более снижает способность терапевтического вещества проникать через плазматическую мембрану будучи интернализованным клеткой. Используемое в данной заявке выражение "заряженный агент" означает, что агент (а) поляризован, т.е. одна часть молекулы агента заряжена относительно плазматической мембраны, или (б) молекула агента имеет суммарный заряд относительно плазматической мембраны. А. Линкеры Чаще всего конъюгат антитела против В 7 Н 6 и лекарственного средства содержит соединительную область (линкер) между терапевтическим веществом и моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека. Как указано выше, в определенных исполнениях линкер может быть расщепляемым под действием внутриклеточных условий. Таким образом, такое расщепление линкера высвобождает терапевтическое вещество из конъюгата с антителом во внутриклеточной среде. Например, в некоторых исполнениях линкер является расщепляемым под действием расщепляющих агентов, присутствующих во внутриклеточной среде (например, внутри лизосом, эндосом или кавеол). Такой линкер может иметь пептидную природу и расщепляться под действием внутриклеточных пептидаз или протеаз, включая, но не ограничиваясь ими, лизосомные или эндосомные протеазы. Обычно, пептидный линкер состоит по меньшей мере из двух или трех аминокислотных остатков. Расщепляющими агентами могут являться катепсины В и D и плазмин, для которых описана способность гидролизовать дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клетки (см., например, Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67123, 1999). Наиболее типичными являются пептидные линкеры, расщепляемые ферментами, присутст- 16024629 вующими внутри В 7 Н 6-экспрессирующих клеток. Например, может использоваться пептидный линкер,расщепляемый катепсином В - тиолзависимой протеазой, экспрессирующейся на высоком уровне в опухолевой ткани (например, линкеры Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). Другие линкеры такого типа описаны в U.S. Patent No. 6214345. В специфических вариантах исполнения пептидным линкером, расщепляемым внутриклеточной протеазой, может быть линкер Val-Cit (валин-цитруллин) или Phe-Lys (фенилаланинлизин) (см., например, U.S. Patent No. 6,214,345, в которой описан синтез доксорубицина с линкером ValCit). Одно из преимуществ внутриклеточного высвобождения терапевтического вещества под действием проетолитических ферментов заключается, как правило, во временной инактивации терапевтического вещества в составе конъюгата с антителом и, как правило, в высокой стабильности таких конъюгатов в сыворотке. В других вариантах исполнения расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Обычно рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Часто может использоваться кислотно-лабильный линкер, расщепляемый в кислых условиях внутри лизосомы (таким линкером может быть, например, гидразон, полукарбазон, тиополукарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацетальный, кетальный или подобный им), (см., например,U.S. Patent Nos. 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999;Neville et al., Biol. Chem. 264:14653-14661, 1989). Такие линкеры относительно стабильны при нейтральном рН крови и нестабильны при рН ниже 5,5 или 5.0, приблизительно соответствующем рН внутри лизосомы. В определенных исполнениях гидролизуемым линкером является тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, соединенный с терапевтическим веществом посредством ацилгидразоновой связи (см., например, U.S. Patent No. 5622929. В других вариантах исполнения линкер является расщепляемым в восстанавливающих условиях(например, дисульфидный линкер). Существует большое количество дисульфидных линкеров, известных в соответствующей области, которое включает, например, линкеры, которые могут быть получены при использованииPatent No. 4880935). В других вариантах исполнения линкер представляет собой малонатный линкер (Johnson et al., Anticancer Res. 15:1387-93, 1995), малеимидобензоильный линкер (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3:1299-1304,1995) или 3'-N-амидный аналог (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3:1305-12, 1995). Как правило, линкер не обладает значительной чувствительностью к внеклеточным условиям. Используемое в данной заявке выражение "не обладает значительной чувствительностью к внеклеточным условиям" в контексте свойств линкера означает, что не более 20%, обычно не более 15%, часто не более 10%, еще более часто не более 5%, не более 3% или не более 1% линкера в образце конъюгата антитела с лекарственным средством, расщепляется под действием внеклеточной среды (например, в плазме крови). Определение, не обладает ли линкер значительной чувствительностью к внеклеточным условиям, может проводиться, например, с помощью инкубирования с плазмой независимо двух образцов: (а) тестируемого конъюгата антитела с лекарственным средством ("образец конъюгат антитела с лекарственным средством") и (б) эквимолярного количества неконъюгированного антитела или терапевтического средства("контрольный образец") в течение заранее определенного времени (например, 2, 4, 8, 16, или 24 ч) и последующего сравнения количества неконъюгированного антитела или терапевтического вещества, присутствующего в образце конъюгата антитела с лекарственным средством с количеством такого вещества в контрольном образце. Измерения количеств могут быть осуществлены, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения. В некоторых вариантах исполнения линкер способствует интернализации конъюгата клеткой. В определенных исполнениях такой линкер способствует (обеспечивает) интернализации клеткой при конъюгировании его с терапевтическим веществом (т.е. в составе линкер-терапевтическое вещество части конъюгата антитела с лекарственным средством). В других исполнениях такой линкер способствует(обеспечивает) интернализации при конъюгировании как с терапевтическим веществом, так и с антителом против В 7 Н 6 (т.е. в составе конъюгата антитело-лекарственное средство). Множество линкеров, которые могут быть использованы в представленных композициях и способы применения описаны, например, в WO 2004/010957, озаглавленной "Drug Conjugates and Their Use forTreating Cancer, an Autoimmune Disease or an Infectious Disease". В. Терапевтические агенты В соответствии с настоящим изобретением любое вещество, обладающее терапевтическим эффектом в отношении В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, может быть использовано как терапевтический агент для конъюгирования с моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека. В определенных вариантах исполнения, таких как применение для терапии В 7 Н 6-экспрессирующих опухолей, терапевтическое вещество является цитотоксическим агентом. Применяемые цитотоксические агенты включают, например, антитубулиновые агенты, ауристатины, вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК-дуплекса, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты (например, комплексы платины, такие как цис-платин, комплексы моно(платины),бис(платины) и триядерные комплексы платины и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, вещества, повышающие чувствительность к хемотерапевтическому воздействию,дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины,платинолы, предварительные соединения, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, вещества, повышающие чувствительность к радиоизлучению, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомераз, винкаалкалоиды или подобные. Характерными цитотоксическими агентами являются, например, андроген, антрамицин (АМС), аспарагиназа, 5-азацитидин, азатиоприн, блеомицин, бусульфан, бутионин, сульфоксимин, камптотецин,карбоплатин, кармустин (BSNU), СС-1065 (Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982), хлорамбуцил, цисплатин, колхицин, циклофосфамид, цитарабин, цитидина арабинозид, цитохалазин В, дакарбазин, дактиномицин (ранее актиномицин), даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, эстроген, 5 фтордезоксиуридин, этопсид фосфат (VP-16), 5-фосфоурацил, грамицидин D, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин (CCNU), мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митрамицин, митомицин С, митоксантрон, нитроимидазол, паклитаксел, пликамицин, прокарбизин, стрептозотоцин, тенопозид (VM-26), 6-тоигуанин, тиоТЕРА, топотекан, винбластин, винкристин и винорелбин. Наиболее применимыми цитотоксическими агентами являются, например, долостатины (например,ауристатин Е, AFP, MMAF, ММАЕ), вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК (например, энедины и лекситропсины), дуокармицины, таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел), пуромицины,винка алкалоиды, СС-1065, SN-38-(7-этил-10-гидроксикамптотеин), топотекан, морфолинодоксорубицин, ризоксин, цианоморфолинодоксорубицин, эхиномицин, комбрестатин, нетропсин, эпотилон А и В, эстрамустин, криптофизины, цемадотин, майтанзиноиды, дискодермолид, элеутеробин и митоксантрон. В отдельных вариантах исполнения цитотоксический агент представляет собой традиционное вещество для химиотерапии, например, доксорубицин, паклитаксел, мелфалан, винка алкалоиды, метотрексат, митомицин С или этопозид. Кроме того, потенциальные цитотоксические агенты, такие как аналоги СС-1065, каликеамицин, майтанзин, аналоги доластатина 10, ризоксин и палитоксин, могут быть соединены с антителом против В 7 Н 6 человека. В определенных вариантах исполнения цитотоксическим или цитостатическим агентом является ауристатин Е (также известный в соответствующей сфере как доластатин-10) или его производные. Обычными дериватами ауристатина Е является, например, эфир ауристатина Е и кето-кислоты. Например, может быть проведена реакция между ауристатином Е и параацетил бензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с получением АЕВ и AEBV, соответственно. Другими типичными производными ауристатина включают AFP (диметилвалин-валин-долаизолейнин-долапролин-фенилаланин-рфенилендиамин), MMAF (довалин-валин-долаизолейнин-долапролин-фенилаланин) и МАЕ (монометил ауристатин Е). Синтез и структура ауристатина Е и его производных описаны в U.S. Patent Applicationand U.S. Patent Nos. 6884869; 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; 4486414. В других вариантах исполнения цитотоксическим агентом является вещество, связывающееся с малой бороздкой ДНК. (См., например, U.S. Patent6130237). Например, в некоторых исполнениях, веществом, связывающимся с малой бороздкой ДНК, является соединение CBI. В других исполнениях, веществом, связывающимся с малой бороздкой ДНК, является вещество из группы энедиинов (например, калихеамицин). В определенных вариантах исполнения, конъюгат антитела с лекарственным веществом содержит анти-тубулиновый агент. Примерами антитубулиновых агентов являются, например, таксаны (например,Таксол (паклитаксел), Таксотере (доцетаксел), Т 67 (Туларик), винка-алкалоиды (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин) и доластатины (например, ауристатин Е, AFP, MMAF,ММАЕ, АЕВ, AEVB). Другими антитубулиновыми агентами являются, например, производные баккатина, аналоги таксана (например, эпотилоны А и В), нокодазол, колхицин и кольцимид, экстрамустин,криптофизины, цематодин, майтанзиноиды, комбрестатины, дискодермолид и элеутеробин. В некоторых исполнениях цитотоксическим агентом является вещество из группы других антитубулиновых агентов майтанзиноидов. Например, в определенных исполнениях веществами из группы майтанзиноидов являются майтанзин или DM-1 (ImmunoGen, Inc.; см. также Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992). В других вариантах исполнения цитотоксическим агентом является вещество-антиметаболит. Антиметаболитом может являться, например, пуриновый антагонист (например, азотиоприн или микофенолата мофетил), ингибитор дигидрофолатредуктазы (например, метотрексат), ацикловир, ганцикловир,зидовудин, видарабин, рибавирин, азидотимидин, цитидина арабинозид, амантадин, дидезоксиуридин,- 18024629 йоддезоксиуридин, поскарнет или трифлуридин. С. Получение конъюгатов моноклинального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным веществом Получение конъюгатов моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством может быть выполнено любым способом, известным специалистам в данной области. Схематично,конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством состоит из моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека, лекарственного средства и, необязательно, линкера, соединяющего лекарственное средство с антителом. Существует ряд реакций для ковалентного соединения лекарственных средств с антителами. Часто для таких реакций используют боковые группы аминокислотных остатков молекулы антитела, включая аминогруппы лизина, свободные карбоксигруппы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильные группы цистеина и различные группы ароматических аминокислотных остатков. Одним из наиболее применяемых неспецифических способов ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция для соединения карбокси (или амино) группы соединения с амино (карбокси) группами антитела. Также используются бифункциональные реагенты, такие как диальдегиды или имидоэфиры для соединения аминогруппы соединения с аминогруппами молекулы антитела. Также для соединения лекарственных средств с антителами может быть использована реакция образования оснований Шиффа. Данный способ подразумевает преийодатное окисление лекарственного средства, содержащего спиртовые или гидроксильные группы, с получением альдегида,который затем взаимодействует с молекулой антитела. Присоединение происходит за счет формирования основания Шиффа с аминогруппами молекулы антитела. Также для ковалентного присоединения лекарственного средства к антителам могут использоваться изотиоцианаты. Также существуют другие способы, известные специалистам в данной области и относящиеся к области данного изобретения. Не ограничивающий список таких способов описан, например, в патентах США 665358; 5643573 и 5556623. В некоторых вариантах исполнения интермедиат, который является предшественником линкера,взаимодействует с лекарственным средством при соответствующих условиях. В определенных вариантах исполнения используются реакционные группы лекарственного средства и/или интермедиата. Продукт такой реакции, производное лекарственного средства, затем, в соответствующих условиях, взаимодействует с моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека.D. Способы анализа цитотоксическоп и цитостатическоп активностей В определенных вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека содержит моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека конъюгированное с цитотоксическим агентом; таким образом, данный конъюгат обладает цитотоксическим или цитостатическим эффектом по отношению к клеткам, экспрессирующим В 7 Н 6 например, к экспрессирующим В 7 Н 6 клеткам опухоли). В качестве В 7 Н 6-экспрессирующих клеток для определения цитотоксического или цитостатического эффекта конъюгата моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством могут быть использованы клетки различных линий, например, перечисленные в табл. 5, ниже. После подтверждения цитостатического или цитотоксического эффекта по отношению к В 7 Н 6-экспрессирующим клеткам конъюгата моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, терапевтическое значение такого конъюгата может быть валидировано на соответствующей животной модели. В предпочтительных вариантах исполнения, конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством содержащий цитотоксический агент применяется для терапии В 7 Н 6 экспрессирующих опухолей. Типичные животные модели различных опухолей, которые могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности конъюгата моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, описаны в разделе V(B) и в примере X, ниже. Способы определения наличия цитостатической или цитотоксической активности определенного агента по отношению к клетке, в общем, известны в соответствующей области. Показательные примеры таких способов описаны ниже. Обнаружение любых из данных эффектов по отношению к В 7 Н 6 экспрессирующим клеткам показывает, что конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека применим для лечения или предотвращения развития заболеваний или расстройств, патология которых опосредуется, по крайней мере отчасти, нарушением роста или активации В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, например, В 7 Н 6-экспрессирующих опухолей. Для определения наличия цитостатической активности по отношению к В 7 Н 6-экспрессирующим клеткам конъюгата моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством может быть использован анализ на основе включения тимидина. Например, культуру В 7 Н 6-экспресирующих клеток, при плотности 5000 клеток/лунку, культивируют в течение 72 ч с последующим добавлением к среде 0,5 мкКи Н-тимидина в последние 8 ч инкубации. После этого измеряют внутриклеточное содержание 3 Н-тимидина в присутствии и в отсутствие исследуемого конъюгата моноклонального антитела с лекарственным средством. Для определения цитотоксической активности может быть измерена степень некроза или апоптоза(программируемой клеточной смерти) соответствующих клеток-мишеней. При некрозе обычно происходит повышение проницаемости мембраны клетки, разбухание клеток и разрывы мембраны. Апоптоз, как правило, характеризуется образованием пузырьков на мембране, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз. Жизнеспособность клеток может определяться по уровню поглощения клетками какого-либо красителя, например, нейтрального красного, трипанового синего или AlamarBlue (Trek DiagnosticSystems, Cleveland, ОН). Также, см., например, Page et al., Intl. J. of Oncology 3:473-476, 1993. При таком анализе исследуемые клетки инкубируются в среде, содержащей краситель, после чего суспензия клеток отмывается от красителя и спектрофотометрически измеряется количество оставшегося внутри клеток красителя, содержание которого отражает степень клеточного поглощения данного красителя. Также для определения степени цитотоксической активности может быть использован белок-связывающий краситель сульфодиамин В (SRB) (Skehan et al., J. Nat'l Cancer Inst. 82:1107-12, 1990). В качестве альтернативы, для измерения жизнеспособности и пролиферативной активности клеток млекопитающих используется тетразолиновая соль, например МТТ, для количественного калориметрического анализа, который позволяет отличать живые клетки от мертвых, см., например, J. Immunol.Methods 65:55-63, 1983). Степень апоптоза может быть количественно определена на основе измерения, например, степени фрагментации ДНК. Существуют коммерческие фотометрические методы для количественного определения степени фрагментации ДНК Примеры такого анализа, включая TUNEL (на основе определения уровня включения меченых нуклеотидов в молекулы фрагментированной ДНК) и анализы на основе ИФА, описаны в Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals). Также степень апопотоза может быть определена по морфологическим изменениям клетки. Например, при некрозе может определяться степень нарушения целостности мембраны за счет измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентные красители, такие как акридиновый оранжевый и бромистый этидий). Метод определения числа апоптотических клеток ранее описан Duke иCohen, Current Protocols In Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Исследуемые клетки окрашиваются ДНК-связывающим красителем (например, акридиновым оранжевым, бромистым этидием или пропидиум иодидом) и наблюдают за конденсацией и скоплением хроматина вокруг внутренней ядерной мембраны. Другими морфологическими изменениями, которые могут быть измерены для определения апоптоза, являются, например, конденсация цитоплазмы, повышенное образование мембранных пузырьков и сжимание клеток. Наличие апоптотических клеток может быть определено как для прикрепленных, так и для неприкрепленных частей культур. Например, обе части могут быть выделены путем удаления супернатанта,обработкой трипсином прикрепленных клеток с последующим объединением с клетками неприкрепленной фракции с помощью центрифугирования при удалении остатков среды (например, при 2000 об/мин в течение 10 мин), и последующего измерения количества апоптотических клеток (например, при измерении степени фрагментации ДНК). (См., например, Piazza et al., Cancer Research 55:3110-16, 1995).V. Способы применения А. Общее Другим аспектом настоящего изобретения являются способы изменения активности (например, цитолитической активности) NKp-30-экспрессирующих клеток, включая, например, натуральные киллеры(НК-клетки) и Т-клетки (например, CD8+ Т-клетки). Такие способы включают, например, способы терапии заболеваний и расстройств, связанных с повышенной активностью NKp30-экспессирующих клеток. Применимыми антителами являются антитела, способные конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителами, продуцируемыми гибридомными клонами из списка:(iv) гибридомный клон 17 В 1.3 (депозитныйCNCM I-4245). В отдельных вариантах антитела являются химерными или гуманизированными антителами, являющимися производными от антител, продуцируемых клонами гибридом (i)-(iv) из списка выше. В некоторых вариантах исполнения антитела, описываемые в данной заявке, используются для конкуренции за связывание при взаимодействии В 7 Н 6 с NKp30. В таком исполнении способ применения заключается во взаимодействии экспрессирующих функциональный В 7 Н 6 клеток, в присутствии NKp30 экспрессирующих клеток, с эффективным количеством моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека или другим агентом, способным конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с NKp30. Применимыми антителами являются антитела способные конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителами, продуцируемыми одним из гибридомных клонов: (i) либо гибридомным клоном 4 Е 5.5 (депозитныйCNCM I4242), либо (ii) гибридомным клоном 17 В 1.3 (депозитныйCNCM I-4245). В отдельных вариантах исполнения антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело, которое является производным от антител, продуцируемых гибридомными клонами (i) и (ii), выше. Такие способы могут осуществляться in vitro, ex vivo или in vivo. В отдельных предпочтительных вариантах исполненияNKp30-экспрессирующие клетки представляют собой НК-клетки. Такой способ изменения активности НК-клеток может быть применен, например, для лечения заболеваний или расстройств, связанных с по- 20024629 вышенной активностью НК-клеток. В других вариантах исполнения NKp30-экспрессирующими клетками являются Т-клетки (например, CD8+ Т-клетки). Такое применение или способ изменения активностиNKp30-экспрессирующих Т-клеток может быть применено для лечения заболеваний или расстройств,связанных с повышенной активностью NKp30-экспрессирующих Т-клеток. Было показано, что определенные Т-клетки, включая субпопуляцию CD8+ Т-клеток, экспрессируют NKp30 (см., например, Srivastava and Srivastava, Leuk. Res. 30:37-46, 2006.) Как упомянуто выше, в отдельных вариантах исполнения антитела, описываемые в данной заявке,применимы для лечения заболеваний или расстройств, связанных с повышенной активностью НКклеток. Например, в некоторых вариантах исполнения, данный способ применения антител включает введение эффективного количества моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека, которое способно конкурировать за взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30, пациенту, страдающему или имеющему высокий риск развития заболевания или расстройства опосредуемого НК-клетками (например, опосредованное НКклетками отторжение аллотрансплантата, такое как, например, опосредуемое НК-клетками отторжение аллотрансплантата ВМС). В данном изобретении осуществлен подход к супрессии опосредуемого НКклетками отторжения аллотрансплантата костного мозга с помощью моноклональных антител против В 7 Н 6 человека. Пересадка костного мозга (ВМТ) - принятый метод терапии при лечении различных гематологических опухолей. Однако эффективность аллогенной трансплантации костного мозга ограничена в связи с рядом трудностей, например, с отторжением трансплантата. Существует достаточное количество данных о том, что НК-клетки являются помехой для приживления аллотрансплантатов клеток костного мозга и способны сами по себе опосредовать специфичность отторжения трансплантатов костного мозга у мышей (см., например, Murphy et al., J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987; Murphy et al., J. Exp.Med. 166:1499-1509, 1987; Murphy et al., J. Immunol. 144:3305-3311, 1990; Murphy et al., Eur. J. Immunol. 20:1729-1734, 1990; Murphy et al., Immunol. Rev. 181:279-289, 2001). Клинически, резистентность по отношению к аллографту наблюдаемая у пациентов со SCID, получивших HLA-несоответствующий трансплантат ВМС с деплецией Т-клеток, без циторедуктивного кондиционирования, связана с высокой активностью НК-клеток донора. (See O'Reilly et al., Vox. Sang. 51:81-86, 1986 Соответственно, антитела против внеклеточного домена В 7 Н 6, способные ингибировать взаимодействие В 7 Н 6 с NKp30, как описано в данной заявке, могут быть использованы при пересадке костного мозга для подавления цитолитической активности НК-клеток против аллотрансплантата, и, таким образом, оказывать терапевтический эффект или предотвращать отторжение аллотрансплантата ВМС. В остальных вариантах исполнения моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека используется для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) против клеток, экспрессирующих В 7 Н 6, например, при лечении заболеваний или расстройств, характеризующихся наличием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток. Например, в некоторых вариантах исполнения, моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека используется для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксической активности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксической активности (CDC) против клеток опухоли, экспрессирующей В 7 Н 6. Применение антител особенно успешно при лечении опухолей, так как определенные опухоли либо обладают уникальными опухолеспецифичными антигенами, либо их антигены экспрессируются на значимо большем количественном уровне, чем у нормальных клеток. Экспериментальные данные свидетельствуют, что В 7 Н 6 экспрессируется на высоком, относительно нормальных тканей, уровне клетками многих видов рака, включая клетки рака толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы и простаты, а также клетки многих видов рака крови, таких как прогомоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркита, хронический миелолейкоз. Основываясь на этих данных,В 7 Н 6 является новым опухолеспецифичным или опухолеассоциированным антигеном. Моноклональные антитела против В 7 Н 6 человека могут применяться для противоопухолевой терапии. Одним из механизмов, связанных с противоопухолевой активностью терапии с помощью моноклональных антител, является антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). При этом процессе моноклональные антитела связываются с целевой клеткой (например, клеткой опухоли), тогда как определенные эффекторные клетки (например, НК-клетки, CD8+ Т-клетки) за счет определенного рецептора связываются с комплексом моноклонального антитела с целевой клеткой, что приводит к гибели целевой клетки. В соответствии с этим в некоторых вариантах исполнения моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека содержит Fc-фрагмент с эффекторными функциями для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент зависимой цитотоксичности (CDC) по отношению к В 7 Н 6-экспрессирующим клеткам. Способы индукции ADCC, в основном, заключаются в контакте В 7 Н 6 экспрессриующей клетки с эффективным количеством моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека обладающего Fc-областью с ADCC-активностью. При этом этап взаимодействия происходит в присутствии эффекторных иммунных клеток, экспрессирующих Fc-рецептор и обладающих цитолитическими функциями. Эффекторными клетками иммунной системы, экспрессирующими цитолитические Fcрецепторы (например, Fc RIII или CD16), являются, например, НК-клетки наряду с определенными субпопуляциями CD8+ Т-клеток. Способы индукции CDC в основном заключаются в контакте В 7 Н 6 экспрессирующих клеток с эффективным количеством моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека содержащего Fc-фрагмент с CDC-активностью в присутствии белков системы комплемента. В 7 Н 6 экспрессирующими клетками-мишенями для описанных способов цитолиза могут являться, например,опухолевые клетки, например клетки рака толстой кишки, клетки рака печени, клетки рака шейки матки,клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака простаты, клетки прогемоцитарной лейкемии, клетки В-клеточной лимфомы, клетки моноцитарной лимфомы, клетки эритролейкемии, клетки лимфомы Беркитта и хронического миелолейкоза и многих других типов рака. Применимыми антителами являются антитела, способные конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителами, продуцируемыми следующими гибридомными клонами: (i) гибридомный клон 4 У 5.5 (депозитныйCNCM I-4242); (ii) гибридомный клон 9G9.2 (депозитныйCNCM I-4243); (iii) гибридомный клон 10 Е 2.9 (депозитныйCNCM I-4244); и (iv) гибридомный клон 17 В 1.3 (депозитныйCNCM I-4245). В некоторых исполнениях антитело способно конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителом, продуцируемым клоном гибридомы (ii)-(iii) из списка выше. В отдельных вариантах исполнения антитело является химерным или гуманизированным производным от антитела, продуцируемого клоном гибридомы (i)-(iv) из списка выше или (ii)-(iii) из списка выше. В соответствующих исполнениях содержащее Fc-фрагмент с эффекторной функцией моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека, как описано в данной заявке, применяется для лечения В 7 Н 6 экспрессирующей опухоли у пациента. Такие способы обычно включают прием пациентом эффективного количества содержащего Fc-фрагмент, обладающий ADCC и/или CDC активностью, моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека. В 7 Н 6-экспрессирующими опухолями, в значительной степени отвечающими на лечение с использованием таких способов, являются, например, рак толстой кишки, печени,шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты, а также такие типы рака крови, как, например, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркитта или хронический миелолейкоз. В других вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством (см. раздел IV, выше) применяется для доставки терапевтического вещества к В 7 Н 6-экспрессирующей клетке, по отношению к которой терапевтическое вещество оказывает терапевтический эффект. Такие способы особенно применимы для лечения заболеваний или расстройств, характеризуемых присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток. В отдельных предпочтительных вариантах исполнения, использующих конъюгат моноклонального антитела с лекарственным средством, терапевтическое вещество является цитотоксином, оказывающим цитотоксический или цитостатический эффект по отношению к В 7 Н 6-экспрессирующей клетке, например В 7 Н 6-экспрессирующей клетке опухоли. Как описано выше, на основе экспериментальных данных показано, что В 7 Н 6 экспрессируется на высоком,по сравнению с нормальной тканью, уровне многими опухолевыми линиями клеток, включая линии клеток рака толстой кишки, печени, шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты, а также линиями клеток различных типов рака крови, таких как, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркитта или хронический миелолейкоз. Эти данные показывают, что В 7 Н 6 является новым опухолеспецифичным или опухолеассоциированным антигеном, применимым для целевой доставки веществ, обладающих терапевтической активностью в отношении опухоли, в частности для доставки цитотоксических веществ, которые способны элиминировать или остановить рост клеток опухоли. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, содержащий моноклональное антитело против В 7 Н 6 человека, конъюгированное с цитотоксическим веществом, применяется для лечения В 7 Н 6-экспрессирующих опухолей. Применимые конъюгаты антитела с лекарственным средством включают те, которые состоят из антитела, способного конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителами, продуцируемыми клонами гибридом из следующего списка: (i) гибридомный клон 4 Е 5.5CNCM I-4245). В некоторых исполнениях конъюгат антитела с лекарственным средством содержит антитело, способное конкурировать за связывание с В 7 Н 6 с антителом, продуцируемым клонами гибридом(ii)-(iii) из списка выше. В отдельных вариантах исполнения конъюгат антитела с лекарственным средством содержит химерное или гуманизированное антитело, являющееся производным от антитела, продуцируемого гибридомным клоном (i)-(iv) из списка выше или (ii)-(iii) из списка выше. В каждом варианте исполнения способов лечения, описанных в данной заявке, прием моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека или конъюгата моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, осуществляется в соответствии с общепринятыми способами, существующими для терапии того заболевания или расстройства, о лечении которого идет речь. В соответствии с описанием, приведенным в данной заявке, эффективное количество антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством вводится пациенту в течение того времени и в таких условиях, которые являются достаточными для профилактики или лечения данного заболевания или расстройства. Субъектами для введения описанных в данной заявке моноклональных антител или конъюгатов моноклональных антител с лекарственным средством являются пациенты с высоким, по сравнению с нормальным, риском развития заболевания или расстройства, опосредуемого NKp30-экспрессирующими клетками или характеризующиеся присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток, а также пациенты с развившимся заболеванием или расстройством. Определенные варианты исполнения используются для скрининга или диагностики у субъектов, у которых еще нет развитого заболевания или расстройства. Другие определенные варианты исполнения используются для лечения заболевания или расстройства у субъектов, у которых диагностировано данное заболевание или расстройство. Также возможно применение для мониторинга изменений в ходе лечения заболевания или расстройства (например, возрастания или снижения выраженности клинических симптомов данного заболевания или расстройства). При профилактических применениях фармацевтические композиции (медикаменты) вводятся пациенту с высоким риском развития или склонным к развитию данного заболевания, в количестве, достаточном для элиминации или снижения риска, или задержки развития данного заболевания. В терапевтических применениях композиции вводятся пациентам с диагностированным или с подозрением на данное заболевание, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, остановки развития симптомов данного заболевания и сопутствующих ему осложнений. Количество, достаточное для достижения данных целей называется терапевтически или фармацевтически эффективной дозой или количеством. Как в профилактическом, так и в терапевтическом режиме приема, антитело или конъюгат антитела с лекарственным средством, обычно принимается в нескольких дозировках до достижения достаточного эффекта (например, переключения соответствующей активности НК-клеток или ингибирования нежелательной активности НК-клеток). Обычно, дозу повторяют при снижении достигнутого желаемого эффекта. Для вариантов применения настоящего изобретения в целях диагностики или скрининга для оценки риска у пациента, не страдающего от заболевания или расстройства, опосредуемого NKp30 экспрессирующими клетками или характеризующегося присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток,результаты, полученные на биологическом образце, полученном от пациента сравниваются с результатами, полученными на образце здорового субъекта или с предварительно определенным базальным уровнем. Риск развития опухоли определяется на основе детекции более высокого уровня, полученного на образце пациента, по сравнению с таковым на сопоставимом образце здорового субъекта или базальным уровнем. Способы обнаружения композиций антител, описываемых настоящим изобретением, описаны в разделе V.C. Композиции и способы, описываемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для мониторинга прогресса терапии с использованием образцов, полученных от пациента через определенные временные интервалы после трансплантации ВМС или после начала противоопухолевой терапии. Уровень экспрессии В 7 Н 6 в биологическом образце пациента определяется перед началом терапии (Т 1) и сравнивается с биологическим образцом того же пациента, полученным после курса терапии (Т 2). Более высокий уровень экспрессии В 7 Н 6, как правило, характеризует прогресс развития заболевания, а более низкий - регресс. Для определения необходимости проведения для пациента скрининговых или терапевтических процедур в соответствии со способами, описанными в данном изобретении, могут быть применены подходящие способы скрининга для определения рисковых факторов, ассоциированных с определенными заболеваниями или расстройствами, опосредуемыми NKp30-экспрессирующими клетками или характеризующимися присутствием В 7 Н 6-экспрессирующих клеток. Также данные процедуры могут быть проведены для определения статуса уже диагностированного у пациента заболевания. Такие способы могут включать, например, выявление семейного анамнеза, т.е. наличия у пациента родственников, у которых диагностировано определенное заболевание. Также скрининговые методы могут включать, например,традиционные клинические обследования для определения семейного статуса определенного заболевания с известным наследуемым рисковым фактором (например, в случае трансплантации ВМС, по данным клинических исследований показано, что присутствие определенных аллелей HLA-C корреллирует с повышенным риском отторжения аллотрансплантата костного мозга (см., Scott et al., Blood 92:48644871, 1998), а также известно, что различные типы рака имеют определенные наследуемые рисковые факторы). Наследуемыми рисковыми факторами опухолей могут быть, например, мутации в различных генах, которые приводят к трансформации клетки (например, Ras, Raf, EGFR, cMet и другие), присутствие или отсутствие определенных молекул HLA и иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров (KIR), или механизмы, с помощью которых прямо или опосредованно опухолевые клетки способны регулировать иммунную супрессию клетками, подобными НК или Т-клеткам (см., например,Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). С этой целью могут стандартно применяться олигонуклеотидные пробы для идентификации индивидуумов, несущих в геноме генетические маркеры, ассоциированные с определенным изучаемым заболеванием. Кроме того, в соответствующей области хорошо известен широкий набор иммунологических методов, применимых для идентификации маркеров для определенных заболеваний. Например,доступны и широко известны в соответствующей области, различные иммуноанализы на основе ИФА, в которых применяются моноклональные антитела для детектирования антигенов, ассоциированных со специфическими опухолями. Скрининг может быть осуществлен в соответствии с симптоматологией,возрастными и рисковыми факторами и др. Данные методики позволяют на практике консультирующим врачам определять пациентов, которым необходимы описанные в данной заявке способы лечения. В соответствии с данными способами, регуляция активности НК-клеток может применяться в качестве независимой программы лечения или в качестве последующего, дополнительного или координированного с другими способа лечения. В. Противораковое лечение 1. Типы опухолей Как описано и показано по результатам исследований в данной заявке, антитела против В 7 Н 6 могут применяться для прямого уничтожения В 7 Н 6-экспрессирующих клеток путем активации каскадов ADCC или CDC за счет связывания Fc-фрагмента с Fc-рецептором и белком C1q системы комплемента. В других вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В 7 Н 6 человека с лекарственным средством, содержащий цитотоксическое вещество конъюгированное с моноклональным антителом против В 7 Н 6 человека, может использоваться для доставки цитотоксического вещества к В 7 Н 6 экспрессирующим клеткам опухоли, по отношению к которым цитотоксическое вещество оказывает терапевтический эффект путем уничтожения или торможения роста этих клеток. В табл. 4 ниже приведен список некоторых видов рака, поддающихся лечению в соответствии с настоящей заявкой. Список организован преимущественно по месту локализации. Таблица 4. Иллюстративный список типов рака Ниже более детально обсуждаются некоторые типы рака, из перечисленных выше, включая соответствующие животные модели для оценки эффективности антител против В 7 Н 6 или конъюгатов антител с лекарственным средством при терапии опухолей в соответствии с настоящим изобретением. а) Хронический миелейкоз Хронический миелейкоз (CML) - редкий вид рака, встречающийся наиболее часто у взрослых индивидуумов. Данный тип рака обусловлен гранулоцитами (предоминантный вид белых клеток крови). В ходе развития CML происходит образование и выход в кровоток большого количества незрелых и неспособных к нормальной функции гранулоцитов. Незрелые белые клетки крови известны как бласты. В ходе развития CML также нарушается продукция других видов клеток крови. В норме процессы восстановления и воспроизведения белых клеток крови упорядочены и строго контролируются, тогда как при хроническом миелейкозе этот процесс не контролируется и клетки продолжают делиться и пролиферировать аномально. Данное заболевание обычно развивается очень медленно, и рассматривается как хронический миелолейкоз. Вследствие медленного прогресса заболевания, CML сложно определять на ранних стадиях. Иногда его обнаруживают, только при анализе крови, выполняемом по другим причинам. Симптомы CML часто неопределенны, неспецифичны и вызваны увеличением числа аномальных белых клеток крови в костном мозге и снижением числа нормальных клеток крови, приводя к ощущению полноты и появлению болезненной шишки с левой стороны живота. При CML может увеличиваться селезенка. Опухоль селезенки может также давить на желудок, приводя к нарушению пищеварения, плохому аппетиту и анемии. Из-за низкого числа тромбоцитов в крови некоторые пациенты могут замечать, что кровотечения стали длительнее и легче образуются синяки. Ассоциированные с CML "петехии" являются особым видом синяков, когда мелкая кровяная сыпь обычно появляется на ногах или во рту. У женщин при CML могут более тяжело проходить менструации. Однако эти симптомы и признаки встречаются редко. Хронический миелейкоз может встречаться в любом возрасте, но более типичен у пациентов среднего возраста и у пожилых людей и редко встречается у детей (National Cancer Institute, "NIH Publication No. 08-3775" Rockville, MD, Sept. 2008). Терапевтический эффект моноклональных антител против В 7 Н 6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантанта опухоли человека, заключающейся в пересадке клеток CML человека к иммунодифецитным мышам (см., например, Ren, Leukemia and Lymphoma 8:1549-1561, 2002; Van Etten,Blood Cells Mol. Dis. 27:201-205, 2001; Wong and Witte, Oncogene 20:5644-5659, 2001).b) Множественная миелома Множественная миелома - вид рака, затрагивающий определенные белые клетки крови, называемые плазматическими клетками. При опухоли, затрагивающей плазматические клетки, данные клетки являются аномальными и идентичными и называются миеломными клетками. Миеломные клетки, как правило, накапливаются в костном мозге и плотном, наружном веществе костей. Иногда эти клетки накапливаются в только одной кости и образуют единую массу, или опухоль, называемую плазмоцитомой. В большинстве случаев, однако, миеломные клетки накапливаются в разных костях, часто формируя множественные опухоли и являясь причиной других проблем. При наступлении такой стадии данное заболевание называют множественной миеломой. Вследствие аномально большого количества идентичных плазматических клеток при множественной миеломе, у пациентов также вырабатывается избыток антител одного вида. Эти миеломные клетки и антитела могут вызывать ряд серьезных медицинских проблем, которые могут включать:(1) Увеличение количества миеломных клеток приводит к повреждению и ослаблению кости, вызывая боль и иногда переломы.(2) При повреждении костей происходит вымывание кальция, что может приводить к гиперкальцемии. Гиперкальцемия может вызывать потерю аппетита, тошноту, жажду, утомляемость, мышечную слабость, беспокойность и спутанность сознания.(3) Миеломные клетки препятствуют образованию в костном мозге нормальных плазматических клеток и белых клеток крови других типов, важных для иммунной системы.(4) Раковые клетки также препятствуют росту новых красных клеток крови, вызывая анемию.(5) У больных с множественной миеломой могут развиваться серьезные проблемы с почками. Избыток антител и кальция могут мешать должной очистке крови в почках. Симптомы заболевания зависят от степени прогресса. На ранних стадиях болезни симптомов может и не быть. При появлении симптомов заболевания у больного обычно присутствуют боли в костях, часто в костях спины и ребрах. Также у пациента могут присутствовать переломы костей, чувство слабости, утомляемости, потеря веса или частые инфекционные заболевания. На более поздних стадиях симптомами могут быть также тошнота, рвота, запоры, проблемы с мочеиспусканием, слабость или онемение ног (National Cancer Institute, "NIH Publication No. 08-1575" Rockville, MD, Sept. 2008). Терапевтический эффект моноклональных антител против В 7 Н 6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантата опухоли человека, иммунодефицитным мышам, как описано Miyakawa и соавторами, Biochem. Biophys. Res. Commun. 313:258-62, 2004. с) Неходжкинская лимфома Существует два основных типа лимфомы. Болезнь Ходжкина и неходжкинская лимфома. Описано около 20 видов неходжкинской лимфомы. В большинстве случаев болезни Ходжкина, в биоптатах обнаруживаются определенные клетки, называемые клетками Рида-Стенберга. Эти клетки, обычно не находят при других лимфомах, что приводит к различным терапевтическим подходам против Ходжкинских и неходжкинских лимфом. Часто первым признаком неходжкинской лимфомы является безболезненное опухание лимфатических узлов на шее, в подмышках или паху. Другими симптомами могут быть следующие: потение ночью или необъяснимый жар, потеря аппетита, необъяснимая потеря веса, сильная утомляемость; у детей может появиться кашель или одышка. Больные могут жаловаться на боль в животе или на сильный зуд кожи по всему телу, у детей может появиться шишка на животе, (National Cancer Institute, "NIH PublicationNo. 07-1567" Rockville, MD, Sept. 2007). Терапевтический эффект по отношению к опухоли моноклональных антител против В 7 Н 6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством можно оценить, на модели ксенотрансплантата неходжкинской лимфомы, схожей с описанной Ansell et.al., Leukemia 18:616-23, 2004. Наиболее часто используемая классификация неходжкинских лимфом - классификация REAL (Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664, 2001). Для классификации лимфом определены специфические иммунологические маркеры. Например, маркеры фолликулярной лимфомы включаютCD20+, CD3-, CD10+, CD5-; маркеры лимфомы из малых лимфоцитов включают CD20+, CD3-, CD10-,CD5+, CD23+; маркеры В-клеточной лимфомы краевой зоны включают CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; маркеры диффузной В-крупноклеточной лимфомы включают CD20+, CD3-; маркеры лимфомы из клеток майтийной зоны включают CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; маркеры периферийной Т-клеточной лимфомы включают CD20-, CD3+; маркеры первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы включают CD20+, CD3-, маркеры лимфобластной лимфомы включают CD20-, CD3+, Tdt+, и маркеры лимфомы Беркитта включают CD20+, CD3-, CD10+, CD5- (Decision Resourses, Non-Hodgkins Lymphoma, Waltham, MA., Feb. 2002). Клиническая классификация неходжкинских лимфом (NHL), предложенная в IWF (InternationalWorking Formulation) подразделяет заболевания на подтипы:(1) лимфома с низкой степенью злокачественности (неактивная), включающая лимфому из малых лимфоцитов, соответствующую хронической лимфоцитарной лейкемии (SC); фолликулярную, преимущественно из малых клеток с расщепленным ядром (FSC); фолликулярную смешанную, из малых клеток