Пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека i класса, и его применение для лечения рака

ПЕПТИД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С МОЛЕКУЛОЙ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА I КЛАССА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Изобретение относится к пептиду, связывающемуся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека I класса, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, вектору экспрессии, клетке-хозяину, способу получения указанного пептида, активированному цитотоксическому Т-лимфоциту и способу его получения in vitro, a также к применению указанных Т-лимфоцита, пептида, нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии и клетки для лечения рака, где рак представляет собой рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Более конкретно, пептид по изобретению имеет общую длину от 10 до 14 аминокислот и содержит последовательность, которая выбирается из группы, включающей (а) последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 1;(b) вариант SEQ ID NO: 1, который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный вариант выбирается из группы последовательностей LFQILQGIVF, LYQILQGIVL, LYQILQGIVI,LFQILQGIVL и LFQILQGIVI.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE) 024497 Настоящее изобретение относится к пептидам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным эпитопам Т-клеток CD8+, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты композиций вакцины, стимулирующей противоопухолевые иммунные ответы. Настоящее изобретение относится к пептидам, образованным из молекул HLA класса I человеческих опухолевых клеток, которые могут быть использованы в вакцинных композициях в целях вызывания противоопухолевых иммунных ответов, в частности ответов цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ). Уровень техники Рак желудка является заболеванием, при котором злокачественные клетки формируются в слизистой оболочке желудка. Рак желудка может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и проникать в другие органы; в частности пищевод, легкие и печень. Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире, в 2002 г. этот диагноз был поставлен в 930000 случаев. Это заболевание связано с высокой смертностью (800000 случаев в год), из-за чего оно является второй по частоте причиной летального исхода от рака после рака легких. Оно более распространено среди мужчин и возникает чаще в странах Азии и развивающихся странах.(http://www.who.int/mediacentre/factsrieets/fs297/en/). На него приходятся ежегодно 2% (25500 случаев) всех новых случаев заболевания раком в США,однако данное заболевание больше распространено в других странах. Это самый распространенный вид рака в Корее, на который приходятся 20,8% всех злокачественных новообразований. В Японии рак желудка остается наиболее распространенным видом рака у мужчин. В США диагноз рак желудка ежегодно ставится около 13000 мужчин и 8000 женщин, большинству из которых больше 70 лет. Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире после рака легких, молочной железы, рака толстой и прямой кишки. Кроме того, рак желудка продолжает быть второй по частоте причиной летального исхода от рака. По прогнозу Американского общества по борьбе с раком число новых случаев заболевания в 2007 г. предположительно составило 1 млн, около 70% из которых приходится на развивающиеся страны и с ними связано около 800000 летальных исходов(http://www.cancer.org/downloads/STT/GlobalFactsandFigures2007rev2.pdf). В отношении частоты заболеваемости по всему миру существуют колоссальные географические различия. Наиболее высокий процент распространения заболевания приходится на Азию и части Южной Америки, наиболее низкий - на Северную Америку. Наиболее высокий уровень смертности зарегистрирован в Чили, Японии, Южной Америке и в странах бывшего Советского Союза. Зачастую диагноз рака желудка ставится на поздней стадии, так как скрининговое обследование не проводится в большинстве стран мира, за исключением Японии (и в ограниченной степени в Корее), где обнаружение зачастую происходит на ранней стадии. Таким образом, это продолжает оставаться наиболее сложной задачей для специалистов здравоохранения. Фактором риска для заболевания раком желудка является бактериальная инфекция Helicobacter pylori (H.pylori), курение, потребление соли в больших количествах и другие факторы, связанные с питанием. Небольшое число случаев рака желудка (1-3%) связаны с синдромом наследственной предрасположенности к раку желудка. Мутации гена Е-кадхерина происходят приблизительно у 25% семей с аутосомным доминантным геном предрасположенности к раку желудка диффузного вида. Этот подвид рака желудка получил название наследственный диффузный рак желудка. Целесообразным может быть проведение генетического консультирования и принятие во внимание профилактической гастрэктомии в юном возрасте при бессимптомном протекании усечения зародышевой линии. Стенки желудка состоят из трех слоев тканей: слизистого (глубинного) слоя, мышечного (среднего) слоя и серозного (крайнего) слоя. Рак желудка развивается в клетках, выстилающих слизистую оболочку,и распространяется во время роста во внешние слои. Применяются четыре стандартных способа лечения. Лечение рака желудка может включать хирургическую операцию, химиотерапию, лучевую терапию или химиолучевую терапию. Операция является основным способом лечения рака желудка. Целью операции является проведение полной резекции с отрицательным хирургическим краем (резекция типа R0). Однако приблизительно 50% пациентов, больных местно-распространенным раком желудка, не могут быть подвергнуты резекции типа R0. Тип R1 указывает на микроскопические признаки неполной резекции(положительные края); и R2 указывает на макроскопические признаки неполной резекции, но без отдаленного распространения заболевания. Исход для пациента зависит от стадии рака во время постановки диагноза (Руководство по клинической практике в онкологии Национальной онкологической сети США(NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology). Процент выживаемости в течение 5 лет в случае радикальной резекции составляет 30-50% для пациентов на II стадии заболевания и 10-25% для пациентов на III стадии заболевания. Для этих пациентов существует высокая вероятность появления локальных и системных рецидивов. Метастазы появляются у 80-90% лиц, больных раком желудка, а показатель шестимесячной выживаемости равен 65% для тех,кому диагноз был поставлен на ранних стадиях, и менее 15% для тех, кому диагноз был поставлен на поздних стадиях.-1 024497 Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения рака желудка, карциномы предстательной железы, карцином полости рта, плоскоклеточной карциномы полости рта (OSCC), острой миелоидной лейкемии (AML), вызываемом Н.pylori MALTлимфомы, карциномы толстого кишечника/колоректального рака, глиобластомы, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), карциномы шейки матки, рака молочной железы человека, рака предстательной железы, рака толстого кишечника, рака поджелудочной железы, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, рака яичника, почечно-клеточной карциномы, рака печени, опухолей головного мозга различных фенотипов; лейкемии, такой как острая лимфобластная лейкемия (ALL); рака легких, саркомы Юинга, эндометриального рака, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, эпителиального рака гортани, карциномы пищевода, карциномы ротовой полости, карциномы мочевого пузыря, карцином яичника, почечно-клеточной карциномы, атипической менингиомы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухолей головного мозга, карциномы слюнного протока, рака шейки матки, экстранодальных T/NK-клеточных лимфом, нехожкинской лимфомы и злокачественных солидных опухолей легких и молочной железы, а также других видов опухолей, в целях улучшения самочувствия пациентов без применения химиотерапевтических средств или же других препаратов, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты. В настоящее изобретение включены пептиды, которые стимулируют иммунную систему и выполняют функцию противоопухолевых препаратов неинвазивного способа воздействия. Краткое изложение сущности изобретения Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в природной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положительные Т-клетки(TCD8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, состоящими обычно из 8-10 аминокислотных остатков, образованных из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIP), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA). Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, встречающиеся на большинстве клеток, имеющих ядро. Молекулы МНС состоят из альфа-тяжелой цепи и бета-2-микроглобулина (рецепторы МНС класса I) или альфа- и бета-цепи (рецепторы МНС класса II) соответственно. Их трехмерная конформация образует связывающую бороздку, которая используется для нековалентного взаимодействия с пептидами. МНС класса I презентируют пептиды, образующиеся при протеолитическом расщеплении преимущественно эндогенных белков, продуктов DRIP и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК). В первую очередь, они презентируют пептиды экзогенных или трансмембранных белков,которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекул МНС I класса распознаются CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий Т-клеточный рецептор (ТКР), тогда как комплексы из пептида и молекул МНС II класса распознаются CD4-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1. Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, как правило,имеют 8-12 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якори") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "связывающий мотив", определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой. В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР). Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими ЦТЛ, т.е. их эпитопы, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессируются и по сравнению с не измененными клетками того же происхождения находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли.-2 024497 Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов (ТАА) включает следующие основные группы: а) раково-тестикулярные антигены: первые в истории идентифицированные ТАА, которые могут распознаваться Т-клетками, принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально "раковотестикулярные антигены" (СТ), так как его члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и, изредка, в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы HLA I и II класса,то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства MAGE или NY-ESO-1;b) антигены дифференциации: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них обнаружено в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но без ограничения, тирозиназу и Melan-A/MART-1 для меланомы или PSA для рака предстательной железы;c) гиперэкспрессированные ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в отличных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их гиперэкспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Her-2/neu, сурвивин, теломераза или WT1;d) опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются в результате мутаций нормальных генов (таких как -катенин, CDK4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены,как правило, способны вызвать сильные иммунные ответы, не вызывая риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев имеют отношение только к определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей;e) ТАА, образующиеся в результате аномальных посттрансляционных модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни гиперэкспрессированными в опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе посттрансляционных процессов, происходящих преимущественно в опухолях. Примеры для этого класса возникают в результате изменения характера гликозилирования, приводящего к появлению новых эпитопов в опухолях, как в случае MUC1, или при таких, как белковый сплайсинг во время деградации, который может или может не быть опухолеспецифическим;f) онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е 6 и Е 7, которые экспрессированы в клетках карциномы шейки матки. Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками и не экспрессироваться или экспрессироваться в сравнительно малом количестве здоровыми тканями. Далее желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, опосредованно опухолеассоциированными. Такие опосредованно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (SinghJasuja H., Emmerich N.P., Rammensee H.G., Cancer Immunol. Immunoether. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. По существу, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.-3 024497 Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены из крови пациентов или здоровых субъектов, или же они могут быть основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии между опухолевыми и нормальными тканями. Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Тклетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена посредством клонирования и способна к выполнению эффекторных функций ("эффекторная Т-клетка"). Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН 1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные комплексы из пептидов и МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Пример масс-спектра CDC2-001, демонстрирующий его презентацию на образце первичной опухоли GC2464.A. Анализ с помощью ЖХ-МС с системой ионизации в наноэлектроспрее (NanoESI-LCMS) производили на пептидном пуле, элюированном из образца ткани РЖ 2464. Масс-хроматограмма для m/z 597,35010,001 Да, z=2 показывает пик пептида со временем удержания 151,63 мин. В. Выявленный пик в масс-хроматограмме при 151,63 мин обнаружен сигналом для m/z 597,3501 на масс-спектре. С. Индуцированный столкновением масс-спектр затухания из выбранного предшественникаm/z 597,3501, записанный при эксперименте nanoESI-LCMS при заданном времени удержания, подтвердил присутствие CDC2-001 в опухолевом образце GC2464.D. Шаблон фрагментации синтетического контрольного пептида CDC2-001 записывали и сравнивали с шаблонами фрагментации генерированных природных пептидов TUMAP, представленных на фиг. 1 С для верификации последовательности. Фиг. 2. Профили экспрессии мРНК выбранных белков в нормальных тканях и 25 образцах тканей рака желудка:b) ASPM (Идентификатор набора проб: 219918sat). Фиг. 3. Отдельные результаты пептид-специфической иммуногенности in vitro пептидов TUMAP I класса. CD8+ Т-клетки примировали с помощью искусственных АПК, нагруженных релевантным (левая секция) и нерелевантным пептидами (правая секция) соответственно. После трех циклов стимуляции обнаружение клеток, реагирующих с пептидом, производилось с помощью двойного окрашивания релевантными и нерелевантными А 2402-мультимерами. Среди показанных клеток проводили гейтирование живых лимфоцитов CD8+, и цифрами на точках обозначена процентная доля мультимер-положительных клеток. Подробное описание изобретения Все термины, используемые в контексте данного изобретения, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Понятие "пептид" в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Предпочтительно, чтобы пептиды имели длину в 9 аминокислот, но они могут быть короче, длиной в 8 аминокислот, и длиннее - 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот в длину. Понятие "олигопептид" в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор,пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды, как правило, состоят примерно менее чем из 30 аминокислотных остатков в длину и более чем примерно 14 аминокислот в длину.-4 024497 Понятие "полипептид" обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от понятий "пептид" или "олигопептид", понятие "полипептид" введено для обозначения молекул, содержащих более чем приблизительно 30 аминокислотных остатков. Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий такую молекулу, является "иммуногенным" (и, таким образом, "иммуногеном" в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В контексте настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, "иммуноген" будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать Т-клеточный ответ. Для Т-клеточного "эпитопа" необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I класса, образующим трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид),который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, как правило, имеют длину в 8-14 аминокислот и, в особенности, как правило, длину в 9 аминокислот. У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют молекулы МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA:HLA-A, HLA-B и HLA-C. HLA-A01, HLA-A02 и HLA-A024 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов. Табл. 1: Частоты экспрессии F HLAA024 и наиболее частые серотипы HLAA02402. Частоты экспрессии выведены из частот гаплотипа Gf среди населения США, адаптированных из публикации (Moriet al. 1017-27) с использованием формулы Харди-Вейнберга F=1-(1-Gf)2. Более подробная информация представлена в работе (Chanock et al. 1211-23). Таблица 1 Частоты экспрессии HLA24 и серотипов А 2402 по всему миру Используемая в контексте данного описания ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Понятие"кодирующая область" относится к тому участку гена, который в естественных или обычных условиях кодирует продукт экспрессии того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему in vivo нативный продукта экспрессии гена. Кодирующая область может быть из не мутировавшего ("нормального"), мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам области синтеза ДНК. Понятие "нуклеотидная последовательность" относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов. Нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный пептид, олигопептид или полипептид,может быть встречающейся в природе или может быть синтезирована. В целом, сегменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для получения синтетического гена,который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробного или вирусного оперона. Понятие "продукт экспрессии" означает полипептид или белок, являющийся природным продуктом трансляции гена любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует эквиваленты, образующиеся в результате вырождения генетического кода и, таким образом, кодирует ту/те же самую(ые) аминокислоту(ы). Понятие "фрагмент", если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК,включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого, по существу,сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии полной кодирующей области. Понятие "сегмент ДНК" относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, выделенной по меньшей мере один раз, по существу, в чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и восстановление сегмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие сегменты предлагаются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслированными последовательностями или интронами, которые обычно присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут присутствовать по нисходящей от открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей. Понятие "праймер" означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК с получением свободного конца 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтез дезоксирибонуклеотидной цепи. Понятие "промотор" означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции. Понятие "выделенный" означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть выделены, так что такой вектор или композиция не являются частью своего естественного окружения. Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в "очищенной" форме. Понятие "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее оно предназначено для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, выделенные из библиотеки кДНК, как обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала от примесей по меньшей мере на один порядок величины, предпочтительно два или три порядка и более предпочтительно четыре или пять порядков величины определенно рассматривается в изобретении. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид,чистота которого составляет предпочтительно 99,999% или по меньшей мере 99,99 или 99,9% и даже желательно 99 мас.% или более. Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в "обогащенной форме". Используемый здесь термин"обогащенный" означает, что концентрация материала по меньшей мере приблизительно в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 мас.%, предпочтительно по меньшей мере около 0,1 мас.%. Рассматриваются также обогащенные препараты с концентрацией примерно 0,5, 1, 5, 10 и 20 мас.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут быть предпочтительно в обогащенной форме или выделенными.-6 024497 выделенными. Понятие "активный фрагмент" означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или факультативно с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно, "активный фрагмент" может также быть использован для инициации ответа Т-клетки in vitro. В контексте настоящего описания понятия "участок", "сегмент" и "фрагмент", если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз,таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент,фрагмент или участок, который, по существу, идентичен, если не в точности идентичен последовательности SEQ ID NO: 1 по 33, которая соответствует встречающимся в природе или "материнским" белкам последовательностей с SEQ ID NO: 1 по 33. При использовании по отношению к полинуклеотидам эти понятия относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз. В соответствии с настоящим изобретением понятие "процентная доля идентичности" или "идентичный с процентной долей", если оно относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после выравнивания сравниваемой последовательности ("Сравниваемая последовательность") с описанной или заявленной последовательностью ("Контрольная последовательность"). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле: Процентная доля идентичности = 100 [I - (C/R)],в которой "С" является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине выравнивания между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где:(i) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, и(iii) каждое выравненное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие;"R" - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине выравнивания со Сравниваемой последовательностью с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту. Если существует выравнивание между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчетам выше, приблизительного равна или выше установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать выравнивания, в которых подсчитанная здесь выше Процентная доля идентичности меньше, чем установленная Процентная доля идентичности. Исходные пептиды, раскрываемые в данном описании, могут быть модифицированы путем замены одного или нескольких остатков в различных, возможно отобранных, участках по длине пептидной цепи,если не заявлено иное. Такие замены могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замена аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замены аминокислот допускаются чаще, чем другие, и они часто связаны со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения "консервативных замен". Консервативные замены определены в контексте настоящего описания как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабополярные остатки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Asp, Asn, Glu, Gln); группа 3 - полярные, положительно заряженные остатки (His, Arg, Lys); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); группа 5 - крупные, ароматические остатки (Phe, Tyr, Trp). Менее консервативные замены могут охватывать замену одной аминокислоты другой, имеющей-7 024497 похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замены аланина остатком изолейцина. Высоконеконсервативные замены могут охватывать замену кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет основной характер. Такие "радикальные" замены не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замены могут неожиданно привести к благоприятным эффектам, не предсказуемых исходя из обычных химических принципов. Разумеется, в таких заменах могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычныхL-аминокислот. Таким образом, D-аминокислоты могут быть заменены L-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные R-группы (т.е. R-группы,отличающиеся от обнаруженных в повсеместно встречающихся 20 аминокислотах природных белков),могут быть также использованы в целях замены для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением. Если были произведены замены более чем на одной позиции с получением пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замен будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замен к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части замены должны производиться не более чем на 4 позициях внутри пептида одновременно. Понятие "Т-клеточный ответ" означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом in vitro или in vivo. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС I класса,эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней, нагруженных пептидом, нагруженных предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид; секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, TNF-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом; секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ, специфичные для пептида с SEQ ID NO: 1 по 33, были испытаны относительно замещенных пептидов; концентрация пептида, при которой замещенные пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно не более чем около 1 нМ, еще более предпочтительно не более чем около 100 пМ и наиболее предпочтительно не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещенный пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по меньшей мере двух и более предпочтительно трех индивидов. Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем 4 остатками от контрольного пептида при условии, что они имеют, по существу,идентичную антигенную активность. Иммунотерапевтические подходы в лечении. Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной,исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Отдельные элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови позволяет предположить, что такие клетки играют важную роль в природной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положительные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), связанные с пептидами, имеющими обычно 8-12 аминокислотных остатков, образованных из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIP), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека также являются человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA). Молекулы МНС I класса могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, DRIPS, и более крупных пептидов. Однако пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС I класса. Этот неклассический способ презентации классом I в литературе называется "кросспрезентацией". Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. Далее желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифи-8 024497 ческие и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. В дополнение также нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом,косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. В основном любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу. Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании различных профилей транскрипции или различном характере экспрессии пептидов опухолевыми и нормальными тканями (Lemmel et al. 450-54; Weinschenk et al. 5818-27). Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции конкретным антигеном может быть клонирована и способна выполнять эффекторные функции ("эффекторная Т-клетка"). Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН 1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих комплексы опухолеассоциированный пептид/МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, эпитопы опухолеассоциированных пептидов Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и синергически, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов,распознаваемых как CD8-положительными ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и CD4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому задачей настоящего изобретения является предложение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса. Ввиду серьезных побочных эффектов и расходов, связанных с лечением рака, крайне необходимы улучшенные методы прогнозирования и диагностики. Поэтому существует необходимость в идентификации других факторов, представляющих собой биомаркеры рака вообще и рака желудка, в частности. Кроме того, существует необходимость в идентификации факторов, которые могут быть использованы при лечении рака вообще и рака желудка в частности. Более того, не существует стандартного способа лечения пациентов, больных раком желудка с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии, обычно вызываемым резидуальным остатком опухоли in situ при наличии локально прогрессирующего роста опухоли. Желательны были бы новые терапевтические подходы, которые бы сопровождались низкой смертностью с адекватной терапевтической эффективностью по сравнению с имеющимися на данный момент терапевтическими подходами. В настоящем изобретении предложены пептиды, которые пригодны для лечения рака желудка и других видов опухолей, которые гиперэкспрессируют пептиды по изобретению. Как показал массспектрометрический анализ образцов первичного рака желудка человека, эти пептиды презентировались в естественных условиях молекулами HLA(см. пример 1 и фиг. 1). Исходный ген, из которого образованы пептиды, был представлен в гиперэкспрессированном состоянии при раке желудка, почечно-клеточной карциноме, раке толстой кишки, немелкоклеточной карциноме легких, аденокарциноме, раке предстательной железы, доброкачественных новообразованиях и злокачественной меланоме по сравнению с нормальными тканями (см. пример 2 и фиг. 2), демонстри-9 024497 рующие высокую степень взаимосвязи пептида с опухолью, т.е. эти пептиды в большом количестве презентируются на опухолевой ткани, но не на нормальных тканях. Связанные с HLA пептиды могут распознаваться иммунной системой, специфически Т-лимфоцитами/Т-клетками. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс HLA/пептид; к примеру, опухолевые клетки рака желудка, презентирующие полученные пептиды. Все пептиды настоящего изобретения, которые были совместимы с методикой валидации, см. пример 3, как было показано, в состоянии стимулировать Т-клеточные ответы (см. пример 3 и фиг. 3). Таким образом, эти пептиды пригодны для генерирования иммунного ответа в организме пациента для уничтожения опухолевых клеток. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществ-предшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т.е. адъювантом). От иммунного ответа, вызванного такой терапевтической вакцинацией, может ожидаться, что он будет высоко специфическим против опухолевых клеток, так как целевые пептиды настоящего изобретения не презентируются на нормальных тканях со сравнимыми количествами копий, предотвращая, тем самым, риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента. Кроме того, пептиды настоящего изобретения пригодны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из клеток рака желудка, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для диагностики наличия рака. Присутствие заявленных пептидов на тканевых биоптатах может помочь патоморфологу в постановке диагноза рака. Выявление конкретных пептидов с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать знать патоморфологу, что ткань является злокачественной или воспаленной или же пораженной заболеванием вообще. Присутствие групп пептидов может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей. Выявление пептидов на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о целесообразности терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного контроля. Таким образом, присутствие пептидов показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками. Пептиды могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов против этих пептидов, таких как Т-клеточные ответы или ответы антител против пептида или пептида в комплексе с молекулами МНС. Такие иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивным переносом лимфоцитов. В условиях, когда проводится генная терапия, в целях оценки побочных эффектов могут быть проанализированы ответы лимфоцитов на пептиды. Мониторинг реакций лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований после трансплантации, к примеру, для выявления реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина". Пептиды могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть "нацеливание" радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как PET (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точной локализации пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для подтверждения диагноза рака, поставленного патологом, на основании биоптата. В табл. 2 описан пептид в соответствии с настоящим изобретением, соответствующая емуSEQ ID NO и исходный белок, из которого может быть образован данный пептид. Указанный пептид связывается с аллелями HLA-A024. Таблица 2 Пептид настоящего изобретения Белок цикла клеточного деления 2 (CDC2). Сериновая/треониновая киназа CDC2, также известная как Cdk1 (циклин-зависимая киназа 1), играет ключевую роль в контроле клеточного цикла. Он известен как основной регулятор перехода от G2 к- 10024497 фазе М. В конце интерфазы он связывается с циклинами А-типа. После разрушения ядерной оболочки циклины А-типа заменяются циклином В, который образует фактор стимуляции митоза (MPF) с Cdc2.MPF необходим для прохождения клетками фазы митоза. Функция белка Cdc2 в митозе не является избыточной и не может быть компенсирована активностью других Cdks, таких как Cdk2, 4 и 6. Напротив, об Cdc2 сообщалось, что он задействован в других фазах клеточного цикла, таких как переход G1-S, и он способен заменить Cdks периода интерфазы. Таким образом, как было предложено, Cdc2 является единственным Cdk, незаменимым для клеточного цикла. Гиперэкспрессия Cdc2 была обнаружена при нескольких видах рака и часто соотносилась с плохим прогнозом. Среди них находятся карцинома предстательной железы, карциномы ротовой полости, плоскоклеточные карциномы ротовой полости (OSCC), острая миелоидная лейкемия (AML) (Qian et al.,2009), H.pylori-индуцированная MALT-лимфома (Banerjee et al., 217-25) и карцинома толстой кишки(Yasui et al., 36-41). При раке желудка сообщалось о гиперэкспрессии и/или повышенной активности, и это может быть его причиной. Ингибиторы Cdc2 и другие белки Cdks рассматривали в качестве кандидатов для лекарственных средств для леченияя рака (Shapiro, 1770-83). Настоящее изобретение поэтому относится к пептиду, связывающемуся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса, обладающему общей длиной от 10 до 14 аминокислот, содержащему последовательность, которая выбирается из группы, включающей:(b) вариант SEQ ID NO: 1, выбранный из группы последовательностей LFQILQGIVF,LYQILQGIVL, LYQILQGM, LFQILQGIVL и LFQILQGIVI. Настоящее изобретение далее относится к пептидам, описанным ранее, где пептид включает непептидные связи. Настоящее изобретение далее относится к пептидам, описанным ранее, где пептид является частью слитого белка, в частности, включающим N-терминальные аминокислоты HLA-DR антигенассоциированной инвариантной цепи (Ii). Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей описанные ранее пептиды. Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, описанной ранее, которая является ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинациями. Настоящее изобретение далее относится к вектору экспрессии, включающему описанную ранее нуклеиновую кислоту. Настоящее изобретение далее относится к пептиду, описанному ранее, к нуклеиновой кислоте, описанной ранее, или к вектору экспрессии, описанному ранее, для применения в медицине. Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту,описанную ранее, или вектор экспрессии, описанный ранее. Настоящее изобретение далее относится к описанной клетке-хозяину, которая является антигенпрезентирующей клеткой. Настоящее изобретение далее относится к описанной клетке-хозяину, где антигенпрезентирующая клетка является дендритной клеткой. Настоящее изобретение далее относится к способу получения описанного пептида, причем способ включает культивирование описанной клетки-хозяина и выделение пептида из клетки-хозяина или из культуральной среды. Настоящее изобретение далее относится к способу получения активированных цитотоксических Тлимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, причем способ включает обеспечение контактирования ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человеческого МНС I класса, экспрессированными на поверхности описанной ранее антигенпрезентирующей клетки в течение периода времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, где указанный антиген является любым описанным пептидом. Настоящее изобретение далее относится к описанному способу, где антиген нагружен на молекулы МНС I класса, экспрессированные на поверхности описанной ранее антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой. Настоящее изобретение далее относится к описанному способу, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии, экспрессирующий описанный ранее пептид. Настоящее изобретение далее относится к активированным цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ),полученным описанным способом, которые селективно распознают ранее описанный пептид. Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) для лечения рака путем уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клеткимишени аберрантно презентируют любой из ранее описанных пептидов. Причем лечение включает введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в соответствии с определением.- 11024497 Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного пептида для лечения рака,такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы,легких или почек. Более конкретно, указанный пептид может быть включен в состав вакцины. Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанной нуклеиновой кислоты для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного вектора экспрессии для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Настоящее изобретение далее относится к применению описанной ранее клетки для лечения рака,такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы,легких или почек. Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного пептида получения антител, специфических к комплексу МНС/пептид, включающему указанный пептид. Белки, кодируемые генами ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, СЕАСАМ 1, СЕАСАМ 5,СЕАСАМ 6, СЕАСАМ 6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, ЕРНА 2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAR HMMR,HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R,NUF2, OLFM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, HIF1A и PTK2, как было описано в литературе, экспрессируются в избытке клетками рака желудка по сравнению с нормальными тканями желудка или другими жизненно важными тканями (к примеру, печени, почек, сердца). Было показано, что белки, кодируемые генами ABL1, ADAM10, ADAM8, AHR, ASPM, ATAD2,CCDC88A, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDC6, CDK1, СЕАСАМ 1, СЕАСАМ 5, СЕАСАМ 6, СЕАСАМ 6,CLCN3, COL6A3, ЕРНА 2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAR HIF1A, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, IQGAP3,ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NFYB,NUF2, OLFM4, PBK, PLK4, PPAP2C, PROM1, PTK2, RRM2, SIAH2, THY1, TOP2A, TPX2, TSPAN1,TSPAN8, UBE2S, UCHL5 и WNT5A, играют важную роль в онкогенезе, так как они задействованы в злокачественной трансформации, клеточном росте, пролиферации, ангиогенезе или инвазии нормальной ткани. Также существуют некоторые доказательства активности, связанной с заболеванием раком, у белков, кодируемых генами DNAJC10, EIF2S3, EIF3L, POLD3, PSMC2, PSMD14 и TMPRSS4. Было показано, что белки, кодируемые генами PROM1, WNT5A, SMC4, РРАР 2 С, GPR38, OLFM4 иTHY1, экспрессируются в избытке и/или являются функционально важными в стволовых клетках и/или раковых стволовых клетках. PROM1 был предложен в качестве маркера стволовых клеток рака желудка,хотя данные противоречивы. Раковые стволовые клетки являются субпопуляцией опухолевых клеток с потенциалом самообновления, что необходимо для постоянного роста опухоли. Эти клетки находятся в специализированных и высокоорганизованных структурах, так называемых нишах раковых стволовых клеток, которые требуются для сохранения потенциала самообновления раковых стволовых клеток. Было показано, что гиперэкспрессия белков AHR, ASPM, ATAD2, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDK1HIF1A, HMMR,HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, LMNB1, MET,MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NUF2, OLFM4, PBK, PPAP2C, PROM1, PTK2, TMPRSS4,TPX2, TSPAN1 и WNT5A в опухолях связана с поздними стадиями заболевания и плохим прогнозом для пациентов. Идентификация животного, предпочтительно человека, который, скорее всего, болен раком желудка включает определение уровня по меньшей мере одного из белков MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 в опухолевом образце животного субъекта. Образец может изыматься методом радикальной хирургии или методом игольной биопсии. Если уровень MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6, как установлено,в клетках выше на 20% или более относительно уровня, установленного в доброкачественных эпителиальных клетках того же самого образца, то у животного субъекта, скорее всего, имеется рак желудка. Чем выше уровень различных белков группы, включающей MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6, тем выше вероятность того, что будет установлено, что у животного субъекта имеется рак желудка. Осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB илиMUC6 производится in situ. Осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 также может производиться in vitro. Осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 также может производитьсяin vivo. Или осуществление определения уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 может производиться методом лазерной захватывающей микроскопии вместе с анализом- 12024497 Определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 производится с помощью антитела, специфического для MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6. Или осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9,UQCRB или MUC6 производится с помощью ПЦР с праймером, специфическим для мРНК, кодирующейMST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6. Или осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 производится с помощью нуклеотидного зонда, специфического для мРНК, кодирующей MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C,AVL9, UQCRB или MUC6. Или осуществление определение уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,РРАР 2 С, AVL9, UQCRB или MUC6 производится с помощью анализа Northern blot. Или осуществление определения уровня MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 производится методом анализа с помощью защиты от рибонуклеазы. Осуществление для выявления полипептидовMST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 в жидкой пробе организма (такой как кровь, сыворотка, мокрота, моча или перитонеальная жидкость) могут быть использованы такие иммунологические методы, как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ(RIA) и иммунный блоттинг (Western blot). Биоптаты, тканевые и клеточные образцы (такие как из яичника, лимфатических узлов, соскобы эпителиальных клеток с поверхности яичника), биоптаты легких,биоптаты печени и любые жидкостные пробы, содержащие клетки (такие как перитонеальная жидкость,мокрота и плейральный секрет), могут быть проанализированы посредством дезагрегации и/или растворения ткани или клеточного образца и проведения иммуноанализа на присутствие полипептида, такого как ELISA, RIA или иммунного блоттинга (Western blotting). Такие клеточные или тканевые образцы могут быть также проанализированы методами на основе нуклеиновых кислот, к примеру, полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с амплификацией, гибридизации Нозерн-блоттинг или слот- или дот-блоттинг. Для визуализации распределения опухолевых клеток в образцах тканей для выявления полипептидных маркеров рака желудка или мРНК, соответственно, могут быть применены диагностические тесты, которые сохраняют структуру ткани, например, иммуногистологическое окрашивание, in situ гибридизация РНК или in situ ОТ-ПЦР. Для локализации опухолевой массы in vivo могут применяться методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) посредством введения в субъект антитела, которое специфически связывается с полипептидами MST1R, UCHL5,SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 (в особенности полипептидом, находящимся на клеточной поверхности), где антитело конъюгировано или по-другому связано с парамагнитным индикатором (или другой подходящей выявляемой единицей в зависимости от используемого метода визуализации); альтернативно локализацию не меченого опухолевого маркер-специфического антитела можно определить с помощью вторичного антитела, связанного с выявляемой единицей. Кроме того, описаны химерные/слитые белки/пептиды, включающие полипептиды MST1R, UCHL5,SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 и их фрагменты, включая функциональные, протеолитические и антигенные фрагменты. Партнер по слиянию или сегменты гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4+ Т-клетки. Стимулирующие эпитопы CD4+ хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в столбнячном токсине. В еще одном предпочтительном варианте осуществления пептид является слитым белком, в частности, включающим N-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ii) HLA-DR. В одном варианте осуществления пептид по изобретению является усеченным белком человека или слитым белком белкового фрагмента и другого полипептидного участка при условии, что человеческий участок включает одну или более аминокислотную последовательность по изобретению. Кроме того, могут быть получены антитела к полипептидам MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6, к химерным/слитым белкам, включающим полипептиды MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6, в равной степени как и фрагменты полипептидов MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6, включая протеолитические и антигенные фрагменты, и к химерным/слитым белкам/пептидам, включая эти фрагменты, которые могут быть использованы в способах прогнозирования заболевания раком и рака желудка. Антитела по настоящему изобретению могут быть поликлональными антителами, моноклинальными антителами и/или химерными антителами. Бессмертные линии клеток, которые вырабатывают моноклональное антитело по настоящему изобретению, являются также частью настоящего изобретения. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что в некоторых частных случаях более высокая экспрессия MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 в качестве опухолевого гена-маркера будет указывать на худший прогноз для субъекта, имеющего рак желудка. Например, относительно более высокие уровни экспрессии MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9,UQCRB или MUC6 могут указывать на относительно крупную первичную опухоль, более высокую тяжесть заболевания (к примеру, больше метастазов) или относительно более злокачественный фенотип опухоли. Чем больше различных белков группы, включающей MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C,AVL9, UQCRB и MUC6, экспрессированы в избытке, тем хуже прогноз.- 13024497 Диагностические и прогностические способы охватывают использование известных способов, к примеру, основанных на антителах способов выявления полипептидов MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6, а также способов, основанных на гибридизации и/или амплификации нуклеиновых кислот для выявления мРНК MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB иMUC6. Кроме того, в связи с тем, что быстрое уничтожение опухолевых клеток часто приводит к образованию аутоантител, опухолевые маркеры рака желудка по изобретению могут использоваться в серологических анализах (например, в тесте ELISA для сыворотки субъекта) для обнаружения аутоантител против MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 у субъекта. Уровни полипептидспецифического аутоантитела для MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, РРАР 2 С, AVL9, UQCRB и MUC6, которые по меньшей мере приблизительно в 3 раза выше (и предпочтительно по меньшей мере в 5 или 7 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 или 20 раз выше), чем в контрольном образце, являются признаком рака желудка. Находящиеся на поверхности клетки, внутриклеточные и секретируемые полипептиды MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 могут быть также все использованы в анализе биоптатов, например, ткани или клеточных образцов (включая клетки, полученные из жидкостных образцов, таких как перитонеальная жидкость), для определения, содержит ли тканевый или клеточный биоптат клетки рака желудка. Биоптат может быть проанализирован как интактная ткань или образец цельной клетки, или же ткань или клеточный образец могут быть дисагрегированы и/или растворены,как это необходимо для конкретного вида используемого диагностического анализа. Например, биоптаты или образцы могут подвергаться цельнотканевому или цельноклеточному анализу для определения уровня полипептида или мРНК MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 in situ,например используя иммуногистохимический метод, гибридизацию мРНК in situ или ОТ-ПЦР in situ. Опытному специалисту известно, как приготавливать ткани или клетки к анализу для определения уровня полипептида или мРНК с использованием иммуногистохимических методов, таких как ELISA, иммунный блоттинг или равноценные методы, или же методов анализа уровня мРНК посредством аналитических методов, основанных на нуклеиновых кислотах, таких как ОТ-ПЦР, нозерн-гибридизация или слот- или дот-блоттинг. Диагностические наборы для измерения уровней экспрессии MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6. Кроме того, существует оборудование для обнаружения повышенного уровня экспрессии MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 в качестве гена-маркера рака желудка у субъекта. Набор для выявления полипептидного маркера рака желудка предпочтительно содержит антитело,которое специфически связывается с выбранным полипептидным маркером рака желудка. Набор для выявления мРНК-маркера рака желудка предпочтительно содержит одну или более нуклеиновых кислот(к примеру, один или более олигонуклеотидный праймер или зонд, зонды ДНК, зонды РНК или матрицы для синтеза зондов РНК), которые специфически гибридизируются с мРНК MST1R, UCHL5, SMC4,NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6. В частности, набор на основе антител может использоваться для выявления присутствия и/или определения уровня полипептида MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, РРАР 2 С, AVL9, UQCRB и MUC6, который специфически связан с антителом или его иммунореактивным фрагментом. Набор может включать антитело, активное по отношению к антигену, и реагент для выявления продукта реакции антитела с антигеном. Такой набор может быть комплектом ELISA и может содержать контроль (например, специфицированное количество конкретного полипептидного маркера рака желудка), первичные и вторичные антитела, когда это целесообразно, и любые другие необходимые реагенты, такие как выявляемые элементы, субстраты ферментов и цветные реагенты, как описывалось выше. Диагностический набор альтернативно может быть набором для иммуноблоттинга, как правило включающим компоненты и реагенты, описываемые в настоящем изобретении. Набор на основе нуклеиновой кислоты может использоваться для выявления и/или определения уровня экспрессии MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 посредством выявления и/или определения количества мРНК MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB иMUC6 в образце, таком как тканевый или клеточный биоптат. Например, набор для проведения ОТ-ПЦР для выявления повышенной экспрессии MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB иMUC6 предпочтительно содержит олигонуклеотидные праймеры, которых достаточно для проведения обратной транскрипции мРНК-маркера рака желудка до кДНК и амплификацию кДНК-маркера рака желудка посредством ПЦР, и будет также предпочтительно содержать матричные молекулы и праймеры для проведения соответствующих контрольных ПЦР-реакций, а также внутреннего контроля для количественного определения. Средний специалист в данной области в состоянии отобрать подходящие праймеры для проведения реакций обратной транскрипции и ПЦР, а также соответствующие контрольные реакции, которые необходимо провести. Такое руководство приводится, например, в работе F. Ausubel etal., Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, New York, N.Y., 1997. Многочисленные разновидности ОТ-ПЦР известны из уровня техники. Целенаправленная доставка иммунотоксинов вMST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, РРАР 2 С, AVL9, UQCRB и MUC6 как до терапевтических мишеней может осуществляться как метод лечения или профилактики рака желудка. Например, молекула антитела,которая специфически связывается с находящимся на поверхности клетки полипептидом MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6, может быть конъюгирована с радиоизотопом или другим токсическим соединением. Конъюгаты антител вводят в субъект, так что связывание антитела с родственным ему полипептидом рака желудка приводит к нацеленной доставке терапевтического соединения в клетки рака желудка, тем самым производя лечение рака яичника. Терапевтическим элементом может быть токсин, радиоизотоп, лекарственное, химическое средство или белок (см., например, Bera et al. "Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent(1999. Например, антитело может быть связано или конъюгировано с бактериальным токсином (например, токсин дифтерии, экзотоксин псевдомонас А, холерный токсин) или растительным токсином (например, рициновый токсин) для нацеленной доставки токсина к клетке, экспрессирующей MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6. Этот иммунотоксин может быть доставлен в клетку, и при соединении с находящимся на поверхности клетки полипептидным маркером рака желудка токсин, конъюгированный с антителом, специфическим для маркера рака желудка, будет доставлен в клетку. Кроме того, для любого полипептида MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB иMUC6, для которого существует специфический лиганд (например, лиганд, который связывается с находящимся на поверхности клетки белком), может быть использован лиганд вместо антитела для нацеливания токсичного соединения на клетки рака желудка, как описывалось выше. Понятие "антитело" используется в контексте данного изобретения в широком смысле и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина в понятие "антитела" включены также фрагменты или полимеры таких молекул иммуноглобулина и гуманизированные версии молекул иммуноглобулина при условии, что они проявляют одно из желаемых свойств (например, специфически связываются с полипептидным маркером рака желудка,доставляют токсин к клетке рака желудка, экспрессирующей раковый ген-маркер рака желудка на повышенном уровне и/или ингибируют активность ракового полипептида-маркера), описанных в настоящем изобретении. Если возможно, антитела могут быть куплены в коммерческих источниках. Антитела могут быть также получены при использовании хорошо известных методов. Опытному специалисту будет понятно,что для получения антител могут использоваться как полипептидные маркеры рака желудка полной длины, так и их фрагменты. Полипептид, необходимый для получения антитела, может быть частично или полностью очищенным из природного источника или же может быть получен с использованием методики рекомбинантной ДНК. Например, кДНК, кодирующая полипептид MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB,PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 или его фрагмент, может быть экспрессирована в прокариотических клетках (например, бактерий) или эукариотических клетах (например, клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих), после чего рекомбинантный белок может быть очищен и использован для получения препарата из моноклонального или поликлонального антитела, которое специфически связывается с полипептидным маркером рака желудка, использованным для получения антитела. Специалисту данной области будет известно, что получение двух или более различных наборов моноклональных или поликлональных антител увеличивает вероятность получения антитела со специфичностью и аффинностью, необходимыми для предназначенного для него использования (например,ELISA, иммуногистохимия, визуализация in vivo, терапия на основе иммунотоксина). Антитела испытаны на желаемую для них активность с помощью известных методов в соответствии с целью применения антител (например, ELISA, иммуногистохимия, иммунотерапия и т.д.; для получения дальнейшей информации по генерированию и испытанию антител см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Например, антитела могут быть испытаны с помощью анализов ELISA, метода иммунного блоттинга (Western-blot), иммуногистохимического окрашивания законсервированных формальдегидом образцов рака желудка или замороженных тканевых срезов. После их первоначальной характеристики in vitro антитела, предназначаемые для терапевтического или диагностического применения in vivo испытывают в соответствии с известными клиническими методами анализа. Понятие "моноклональное антитело" в контексте настоящего изобретения обозначает антитело, полученное, по существу, из гомогенной популяции антител, т. е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела в контексте настоящего изобретения специфически включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен с соответствующими последовательностями антител, полученных из конкретных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) с или гомологична(ы) с соответствующими последовательностями антител, полученных из других видов- 15024497 или относящихся к другому классу или подклассу антител, в равной степени, как и фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую антагонистическую активность (патент США 4816567). Моноклональные антитела могут быть получены при использовании гибридомного метода. В рамках гибридомного метода мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим веществом, чтобы инициировать лимфоциты, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Моноклональные антитела могут быть также получены с помощью методов с рекомбинантной ДНК, таких как описываемые в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть легко выделена и секвенирована с помощью стандартных методик (например,при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами,кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител).in vitro методы также подходят для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности Fab-фрагментов, может быть произведено при использовании стандартных техник, известных из уровня техники. К примеру, расщепление может производиться при использовании папаина. Примеры расщепления под воздействием папаина описываются в заявкеWO 94/29348, опубликованной 22.12.1994 г., и в патенте США 4342566. Расщепление антител под воздействием папаина обычно приводит к двум идентичным фрагментам, связывающимся с антигеном, называемым Fab-фрагментами, каждый из которых имеет отдельный антигенсвязывающий сайт и остаточный Fe-фрагмент. В результате воздействия пепсином получается фрагмент, который имеет два антигенкомбинирующих сайта и все еще способен к поперечной сшивке антигена. Фрагменты антитела, как связанные с другими последовательностями так и не связанные, могут также включать инсерции, делеции, замены или другие выбранные модификации конкретных участков или специфических аминокислотных остатков при условии, что активность фрагмента незначительно изменена или повреждена по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Данные модификации могут внести некоторые дополнительные свойства, такие как добавление/удаление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, увеличение их биологической стойкости, изменение их секреторных характеристик и т.д. В любом случае фрагмент антитела должен обладать свойством биоактивности, таким как активностью связывания, регуляцией связывания на связывающем домене и т.д. Функциональные или активные участки антитела могут быть идентифицированы при мутагенезе специфического участка белка с последующей экспрессией и контролем экспрессированного полипептида. Такие методы полностью очевидны для опытного специалиста данной области и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела. Антитела могут далее включать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab' или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (CDR) реципиента замещены остатками из CDR нечеловеческих видов (донорское антитело), таких как мыши,крысы или кролики, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки Fv-каркаса (FR) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированном CDR или каркасных последовательностях. Как правило,гуманизированное антитело будет включать по сути все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по сути все из участков FR являются таковыми консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Оптимально, чтобы гуманизированное антитело содержало также по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. В целом, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотный остаток, введенный в него из источника,являющегося нечеловеческим. Такие нечеловеческие аминокислотные остатки называются часто "импортированными" остатками, которые обычно берутся из "импортированного" вариабельного домена. Гуманизация может быть, по существу, произведена посредством замены участков CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США 4816567),где, по существу, менее чем один интактный человеческий вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью нечеловеческого вида. На практике гуманизированные антитела являются обычно человеческими антителами, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, остатки FR заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.- 16024497 Использоваться могут трансгенные животные (например, мыши), которые способны при иммунизации вырабатывать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка присоединения тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина клеток зародышевой линии человека в таких мутантных мышей зародышевой линии будет приводить к выработке человеческих антител с антигенной стимуляцией. Человеческие антитела могут быть также получены в библиотеках фагового дисплея. Антитела предпочтительно вводятся в субъект в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящее количество фармацевтически приемлемой соли обычно используется в составе для усиления изотонности состава. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Уровень рН раствора составляет предпочтительно от около 5 до около 8 и более предпочтительно от около 7 до около 7,5. Кроме того, носители включают препараты пролонгированного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых имеют вид профилированных изделий, к примеру, пленки, липосомы или микрочастицы. Для специалиста в данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости от, например, способа введения и концентрации вводимого антитела. Антитела могут вводиться в субъект, пациенту или клетку посредством инъекции (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) или другими способами, такими как вливание,которое гарантирует доставку к кровотоку эффективным образом. Антитела также могут вводиться внутритуморальными или перитуморальными способами, чтобы вызвать локальные, а также и системные терапевтические эффекты. Предпочтительными являются локальная или внутривенная инъекция. Эффективная дозировка и график введения антител могут быть определены эмпирически, а принятие таковых решений под силу специалисту данной области. Специалистам данной области будет понятно, что дозировка антител, которые должны быть введены, будет варьироваться в зависимости от, например, субъекта, которому будет вводиться антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других вводимых медикаментов. Типичная дневная дозировка антитела, используемого отдельно, может варьироваться от около 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг по весу тела или более в день, в зависимости от факторов, упоминаемых выше. После введения антитела для лечения рака желудка эффективность терапевтического антитела может быть оценена различными способами, известными компетентному специалисту в данной области. Например, размер, количество и/или распределение рака желудка у субъекта, проходящего лечение, может контролироваться с помощью стандартных методов визуализации опухоли. Введенное в терапевтических целях антитело, которое блокирует рост опухоли,приводит к уменьшению размера и/или предотвращает развитие новых опухолей в сравнении с течением болезни, которое бы имело место без введения антитела, и является эффективным антителом для лечения раковых заболеваний. Так как белки ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, СЕАСАМ 1, СЕАСАМ 5, СЕАСАМ 6,СЕАСАМ 6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, ЕРНА 2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAR HMMR, HSP90B1,IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NUF2, OLFM4,PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, HIF1A и PTK2, как было показано, высокоэкспрессированы, по меньшей мере, в подвиде тканей рака желудка в сравнении с нормальными тканями, ингибирование их экспрессии может быть интегрировано в любую терапевтическую стратегию для лечения или профилактики рака желудка. Принцип антисмысловой терапии основан на гипотезе, что последовательность-специфическое подавление генной экспрессии (посредством транскрипции или трансляции) может быть достигнуто при внутриклеточной гибридизации между геномной ДНК или мРНК и комплементарными антисмысловыми видами. Образование такого гибридного дуплекса нуклеиновых кислот интерферирует с транскрипцией геномной ДНК-мишени, кодирующей антиген, или процессингом/транспортом/трансляцией и/или стабильностью антигенной мРНК-мишени опухоли. Антисмысловые нуклеиновые кислоты могут быть доставлены с использованием различных подходов. Например, антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловая РНК могут вводиться непосредственно (например, внутривенной инъекцией) в субъект в форме, которая позволяет поглощение опухолевыми клетками. Альтернативно, в клетки могут вводиться вирусные или плазмидные векторы in vivo,которые кодируют антисмысловую РНК (или фрагменты РНК). Антисмысловые эффекты также могут быть вызваны смысловыми последовательностями; однако степень фенотипических изменений крайне различна. Фенотипические изменения, индуцированные эффективной антисмысловой терапией, оценивались в соответствии с изменениями, например, уровнями мРНК-мишени, уровнями белка-мишени и/или уровнями активности белка-мишени. В конкретном примере ингибирование функции опухолевого маркера рака желудка с помощью генной терапии с применением антисмысловых конструкций может быть выполнено посредством прямого введения антисмыслового РНК-маркера рака желудка в субъект. Антисмысловой опухолевый РНК- 17024497 маркер может быть получен и выделен с помощью любого стандартного метода, но наиболее просто его получить с помощью транскрипции in vitro с использованием антисмыслового опухолевого кДНКмаркера под контролем высокоэффективного промотора (например, Т 7-промотора). Введение антисмыслового опухолевого РНК-маркера в клетки может быть произведено любым способом для прямого введения нуклеиновых кислот, описываемых ниже. Альтернативная стратегия ингибирования функции MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9,UQCRB или MUC6 при использовании генной терапии включает внутриклеточную экспрессию антител к MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, РРАР 2 С, AVL9, UQCRB или MUC6 или участка антител к MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6. Например, ген (или фрагмент гена), кодирующий моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом MST1R, UCHL5,SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 и ингибирует его биологическую активность, помещают под транскрипционным контролем специфической (например, ткане- или опухолеспецифической) регуляторной последовательности генов внутрь вектора экспрессии нуклеиновой кислоты. Вектор вводится затем в субъект, так чтобы он поглощался клетками рака желудка или другими клетками, которые затем секретируют антитела к MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6 и, тем самым, блокируют биологическую активность полипептида MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C,AVL9, UQCRB и MUC6. Предпочтительно, если полипептиды MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C,AVL9, UQCRB и MUC6 присутствуют на внеклеточной поверхности клеток рака желудка. В способах, описываемых выше, которые включают введение и поглощение экзогенной ДНК в клетках субъекта (т.е. генную трансдукцию или трансфекцию), нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть в форме "обнаженной" ДНК, или же нуклеиновые кислоты могут быть в векторе для доставки нуклеиновых кислот к клеткам для ингибирования экспрессии белка-маркера желудочной опухоли. Вектор может представлять собой имеющийся в продаже препарат, такой как аденовирусный вектор (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Квебек, Канада). Доставка нуклеиновой кислоты или вектора к клеткам может производиться посредством различных механизмов. Например, доставка может производиться с помощью липосомы с использованием имеющихся в продаже липосомных препаратов,таких как LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT(Qiagen, Inc. Хильден, Германия) и TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), в равной степени как и других липосом, разработанных в соответствии со стандартными процедурами уровня техники. Кроме того, нуклеиновая кислота или вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть доставлен in vivo посредством электропорации, технология для которой имеется в наличии в компании"Genetronics, Inc." (San Diego, штат Калифорния, США), в равной степени как и с помощью устройства"SONOPORATION machine" (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, штат Аризона, США). Одним из примеров является доставка вектора посредством вирусной системы, такой как ретровирусная векторная система, которая способна упаковывать рекомбинантный ретровирусный геном. Рекомбинантный ретровирус может быть затем использован для инфицирования и, таким образом, доставки в инфицированные клетки антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессиюMST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB или MUC6. Точный способ введения измененной нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающего, разумеется, не ограничивается использованием ретровирусных векторов. Имеется широкий спектр других методик для данной процедуры, включая использование аденовирусных векторов, аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов, лентивирусных векторов, псевдотипичных ретровирусных векторов. Также может применяться методики физической трансдукции, такие как липосомная доставка и рецептор-опосредованные и другие эндоцитозные механизмы. Данное изобретение может быть использовано вместе с любым из этих или других, используемых обычно, способов генного переноса. Антитела могут также применяться для диагностических анализов in vivo. Как правило, антитело помечают радионуклеотидом (таким как 111In, 99 Тс, 14 С, 131I, 3 Н,32 Р или 35S), так что опухоль может быть локализована с помощью иммуносцинтиграфии. Антитела или их фрагменты связываются с внеклеточными доменами двух или более мишеней MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB иMUC6 при показателе аффинности (Kd) ниже чем 110 мкМ. Антитела для диагностического применения могут помечаться зондами, подходящими для обнаружения различными способами визуализации. Способы обнаружения зондов включают, но без ограничения, флуоресценцию, свет, конфокальную и электронную микроскопию; магнитно-резонансную томографию и спректроскопию; флюороскопию, компьютерную томографию и позитронно-эмиссионную томографию. Подходящие зонды включают, но без ограничения, родамин, эозин и другие флюорофоры,радиоизотопы, золото, гадолиний и другие лантаноиды, парамагнитное железо, фтор-18 и другие позитронно-активные радионуклиды. Более того, зонды могут быть би- или мультифункциональными и обнаруживаться более чем одним из приведенных способов. Данные антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно указанными зондами. Присоединение зондов к антителам включает ковалентное присоединение зонда, внедрение зонда в антитело и ковалентное присоединение комплексообразующего соединения для присоединения зонда, широко признанное среди прочих в данной области. Для иммуногистохимических исследований образец пораженной ткани может быть свежим или заморожен- 18024497 ным или может быть залит парафином и законсервирован таким консервантом, как формалин. Законсервированный или заделанный срез содержит образец, контактировавший с помеченным первичным антителом и вторичным антителом, где антитело используется для выявления экспрессии белков MST1R,UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB и MUC6 in situ. В настоящем изобретении предложен, таким образом, пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса, обладающий общей длиной от 10 до 14 аминокислот, содержащий последовательность, которая выбирается из группы, включающей:(b) вариант SEQ ID NO: 1, выбранный из группы последовательностей LFQILQGIVF,LYQILQGIVL, LYQILQGM, LFQILQGIVL и LFQILQGIVI, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом. Пептиды по изобретению обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I. В контексте настоящего изобретения понятие "гомологичный" относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упоминавшееся ранее понятие "гомология" определяется при сравнении двух последовательностей, выравниваемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности в контексте данного изобретения могут иметь инсерцию или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном выравнивании двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания выравнивания, например,по алгоритму ClustalW. Широко распространено программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Vector NTI, GENETYX или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных. Специалист в данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Fong et al., 880914); (Zaremba et al., 1805-14; Colombetti et al., 2730-38; Аррау et al., 4570-77)."Вариантом" данной аминокислотной последовательности авторы изобретения обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по 33. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по меньшей мере, сохранит,если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как HLA-A02 или -DR, и, таким образом, он, по меньшей мере, сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ. Данные ЦТЛ могут затем вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы (Rammensee et al., 1997) и банков данных (Rammensee et al., 213-19) конкретные позиции связывающихся с HLA пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими ключевую последовательность, подходящую к связывающему мотиву рецептора HLA, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей,образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 по 95, сохраняя известные якорные остатки, и будет в состоянии определить, сохранят ли такие варианты способность связываться с молекулами МНС I или II класса. Варианты настоящего изобретения сохраняют способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах настоящего изобретения. Те аминокислотные остатки, которые необязательно вносят вклад во взаимодействие с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы заменой на другую аминокислоту, включение которой, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связывание с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого авторы изобретения включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано. Более длинные пептиды также могут быть пригодными. Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-11 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно,чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, по существу, не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для выявления истинного эпитопа во время процессинга. Соответственно, в настоящем изобретении предложены также пептиды и варианты эпитопов МНС класса I, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину от 10 до 14. Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено способами, известными из уровня техники. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид состоит или по существу состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1."Состоящий по существу из" подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением,помимо последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1 или одним из ее вариантов, содержит дополнительные находящиеся на N- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются, по существу, формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС. Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид является слитым белком, который включает, например, 80 N-терминальных аминокислотHLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р 33, в дальнейшем "Ii"), как взятый из банка данных NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497. Кроме того, пептид или вариант может быть далее модифицирован для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают,например, введение реверсированных пептидных или непептидных связей. В реверсированной пептидной связи аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-CO-NH-), а пептидная связь реверсируется. Такие ретроинвертированные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работеMeziere et al. (1997), J. Immunol. 159, 3230-3237, включенной в описание путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere et al. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и ответов Т-хелперных клеток. Ретроинвертированные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, намного более устойчивы к протеолизу. Непептидной связью, являются, например, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -СН=СН-, -СОСН 2-,-СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-. В патенте США 4897445 предложен способ твердофазного синтеза непептидных связей (-CH2-NH) в полипептидных цепях, которые включают полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NaCNBH3. Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, дансильные или трет-бутилоксикарбонильные группы,могут быть добавлены к аминоконцам пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметоксикарбонильная группа может быть введена в аминные концы пептидов. Кроме того,гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа могут быть добавлены к карбоксильным концам пептидов. Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, может быть использован D-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида, а не обычный L-изомер. Более того по меньшей мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в- 20024497 природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению. Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции отдельных аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе R. Lundblad,Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, которая включена в описание путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но без ограничения, модификацию с помощью ацилирования, амидинирование, пиридоксилирование лизина, восстановительное алкилирование,тринитробензилирование аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), амидную модификацию карбоксильных групп и сульфгидрильную модификацию с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образование ртутных производных, образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцию с малеимидом, карбоксиметилирование йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилирование цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист в данной области может проконсультироваться в Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al., глава 15 (John WileySons, NY 19952000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков. Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион,с образованием аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. Веб-сайты компаний, таких как Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com), предоставляют информацию по специфическим веществам. Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и окислены во время тепловой обработки биофармацевтических средств.K-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. N-3-(Диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид может использоваться для образования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты. Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала. Реакция остатков лизина и других -аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или поперечной сшивке (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликозилировании белков. Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида,бромэтиламина и хлорамина Т. Тетранитрометан и N-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Поперечная сшивка через образование дитирозина может быть произведена с ионами перекиси водорода/меди. В последних исследованиях по модификации триптофана используются N-бромсукцинимид,2-гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3 Н-индол (BPNSскатол). Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с PEG (полиэтиленгликолем) часто связана с увеличением полупериода циркуляции при поперечной сшивке белков с глутаральдегидом,полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для получения гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия. Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным вариантом осуществления изобретения. Как правило, пептиды и варианты (по меньшей мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu et al. (1981) и в прилагающихся ссылках. Временная защита N-аминогруппы производится группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Повторное расщепление этой высокощелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в N,N-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина), где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты функциональности боковой амидоцепи используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бисакрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий- 21024497 агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотнолабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного N,N-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители включают этандитиол, фенол,анизол и воду, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезируемого пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, Bruckdorfer, Marder и Albericio, et al., 29-43 и прилагаемые ссылки). Трифторуксусную кислоту удаляют выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например вCalbiochem-Novabiochem (Великобритания) Ltd, Ноттингхэм, NG7 2QJ, Великобритания. Очистка может быть произведена любой методикой или комбинацией таких методик как рекристаллизация, эксклюзионная (по размеру) хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения в системе ацетонитрил/вода. Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами (FAB), a также масс-спектрометрического анализа MALDI и ESI-Q-TOF. В еще одном аспекте изобретения предлагается нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид),кодирующая пептид или вариант пептида по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК,кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; природными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может содержать или не содержать интроны при условии, что полинуклеотид кодирует пептид. Разумеется, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще в одном аспекте изобретения предложен вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Был разработан ряд способов для связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами,например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК. Синтетические линкеры, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические линкеры, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая InternationalBiotechnologies Inc, New Haven, CN, США. Желаемый способ модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто в работе (Saiki et al. (487-91. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при конструировании в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы. Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом,ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом раскрытых в данном описании идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают те, что раскрыты в патентах США 4440859, 4530901, 4582800, 4677063, 4678751, 4704362, 4710463,4757006, 4766075 и 4810 648 ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли поддержание в эписомальной или интеграционной- 22024497 форме. Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с соответствующей ориентацией и правильной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть соединена с адекватными нуклеотидными последовательностями, обеспечивающими координацию транскрипции и трансляции, распознаваемыми желательным хозяином, хотя такие контрольные элементы обычно имеются в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, которая кодирует выбранный признак в трансформированной клетке, такой как устойчивость к антибиотикам. В качестве альтернативы ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина. Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируют затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых в данном описании идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть выделен. Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.coli и Bacillus subtilis),дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus spec), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в АТСС Cell Biology Collection. Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор CMV или SV40 с подходящим концевым участком поли-А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является pSVL, имеющимся в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ,США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является pMSG, имеющийся также в наличии в Pharmacia. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются pRS403-406 и pRS413416, и они, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами(Ylps) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Ycps). Основанные на промоторе CMV векторы(например, из Sigma-Aldrich) обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазмическую экспрессию или секрецию и N-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях FLAG, 3xFLAG, c-myc или МАТ. Данные слитые белки позволяют выявление, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при выявлении. Сильный промоторный регуляторный участок цитомегаловируса человека (CMV) стимулирует конститутивные уровни белковой экспрессии, достигающие 1 мг/л в клетках COS. Для менее активных клеточных линий белковые уровни обычно составляют 0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликацииSV40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в подверженных репликации SV40 клеткахCOS. Векторы CMV, например, могут содержать точку начала для репликации рМВ 1 (производноеpBR322) в бактериальных клетках, ген b-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий,hGH polyA и точку начала f1. Векторы, содержащие лидерную последовательность препротрипсина(РРТ), могут направлять секрецию слитых белков FLAG в культуральную среду для очистки с использованием антител ANTI-FLAG, смол и чашек. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники. Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной конструкции настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и обычно являются штаммом Е.coli, таким как, например, Е.coli штамма DH5, имеющимся в наличии в Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD,США, и RR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур ("American Type CultureCollection" (АТСС, Rockville, MD, США (No. АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как CCL61, NIH эмбриональные клетки швейцарской мыши NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1658, почечные клетки обезьяны COS-1, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфицироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в пособии авторов Paulina Balbas и Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology- 23024497 другой литературе, известной специалисту в данной области. Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения производится при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, работу Cohen et al.Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается в работе Sherman et al. (1986), Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Beggs) (1978), Nature, 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция иTechnologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток,бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных. Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР Альтернативно, наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител. Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее,другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть с пользой использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на подходящие молекулы МНС. Таким образом, в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением. В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. Для АПК, нагруженных рекомбинантным слитым белком, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), сейчас проводятся исследования в целях лечения рака предстательной железы (Sipuleucel-T) (Small E.J. et al. 67-74;Rini et al. 3089-94). В другом аспекте изобретения предложен способ получения пептида или его варианта; причем способ включает культивацию клетки-хозяина и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды. В другом варианте осуществления пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.с.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшинной(i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительные способы введения пептидной инъекции включают s.c, i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительные способы введения инъекции ДНК включаютi.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. Вводиться могут, к примеру, дозы, объемом между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозировка в данных пределах успешно использовалась в предыдущих клинических исследованиях (Brunsviget al. 1553-64; Staehler et al. 2007). Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток in vitro, причем способ включает контактирование Т-клеток in vitro с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом Т-клетки,где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительно, если достаточное количество антигена применяется с антигенпрезентирующей клеткой. Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не имеется или имеется пониженный уровень или недостаточная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых нет пептидного транспортера ТАР, включают Т 2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, связанный с процессингом антигена. Не способная нагружать пептидом клеточная линия Т 2 человека имеется в наличии в American TypeCulture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговымCRL 1992; клеточная линия дрозофилы линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговымCRL 19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается в работе Karre et al. 1985. Предпочтительно, если указанная клетка-хозяин до трансфекции, по существу, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала костимуляции для Т-клеток, такую как любая из В 7.1, В 7.2, ICAM-1 и LFA 3. Последовательности нуклеиновых кислот многочисленных молекул МНС I класса и костимуляторных молекул общедоступны в банках данных GenBank и EMBL. Аналогично, в случае использования эпитопа МНС I класса в качестве антигена, Т-клетки являются- 24024497 Если антигенпрезентирующая клетка трансфицирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащийSEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 95 или их вариантную аминокислотную последовательность. Для получения ЦТЛ in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, в способах, описанных в работах Peoples et al. (1995) и Kawakami et al. (1992), используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты при получении ЦТЛ. Plebanski et al. (1995) для получения ЦТЛ используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Jochmus et al. (1997) описывают получение аутологичных ЦТЛ посредством нагрузки пептидом или полипептидом на дендритны клеток или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Hill et al. (1995) и Jerome et al. (1993) для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги, нагруженные, пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. S. Walter et al. (2003) описывают прайминг Т-клеток in vitro с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАПК), что является также подходящим способом получения Т-клеток против выбранного пептида. В данном исследовании, аАПК были получены при соединении преформированных комплексов МНС-пептид с поверхностью полистироловых частиц (микросферы) с помощью биохимического способа с биотином-стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на аАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Т-клеточные ответы с высокой эффективностью в пробах крови. Кроме комплексов МНС-пептид аАПК должны нести другие белки с костимуляторной активностью, такие как антитела к CD28, соединенные с их поверхностью. Кроме того, такая основанная на аАПК система часто требует добавления соответствующих растворимых факторов, к примеру, цитокинов, таких как интерлейкин-12. При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и способ для этого подробно описывается в патентной заявке WO 97/26328, включенном в контекст путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т 2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, работу Porta et al. (1994), в которой описывается развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивная система для презентации чужеродных пептидов). Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов по изобретению, пригодны для терапии. Таким образом, в другом аспекте изобретения предложены активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми способами по изобретению. Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа, будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, LFQILQGIVF, LYQILQGIVL, LYQILQGIVI, LFQILQGIVL или LFQILQGIVI. Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством ее ТКР с комплексом HLA/пептид (например, соединение). Т-клетки пригодны для способа уничтожения клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно,Т-клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. "Здоровым индивидом" авторы изобретения обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить. Клетками-мишенями для CD8-положительных Т-клеток in vivo в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса I) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса I(Dengjel et al., 4163-70. Т-клетки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, в изобретении предложен также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем способ включает введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше. Под понятием "аберрантно экспрессированный" авторы изобретения понимают, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальными уровнями экспрессии, или что ген является "молчащим" в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием"гиперэкспрессирован" авторы изобретения понимают, что полипептид представлен на уровне, который по меньшей мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно, по меньшей мере в 2 раза и, более предпочтительно, по меньшей мере в 5 или 10 раз выше уровня, пред- 25024497 ставленного в нормальной ткани. Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, к примеру, теми, что описаны выше. Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (Rosenberg et al., 850-54; Rosenberg et al., 2346-57; Dudleyet al., 2006). Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, пригодна для лечения нарушений, характеризующихся клетками, ускользающими от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами). Предпочтительно, если медикамент настоящего изобретения является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или системно i.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток,полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфицированными, чтобы совместно экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или же вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker (1993. Пептид может быть также меченым или может быть слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды,последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Т-клетки CD4 или CD8. Тем не менее, стимуляция CD8 ЦТЛ более эффективна в присутствии поддержки, предоставляемой CD4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируютCD8 ЦТЛ, партнеры в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют CD4-положительные Т-клетки. CD4- и CD8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении. В одном аспекте вакцина включает по меньшей мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере один дополнительный пептид,предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять,одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС I класса. Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, к примеру, в работе (Pascolo et al. 117-22). Полинуклеотидные вакцины просто получить, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе коровьей оспы, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "генной пушки". Пептид или пептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, могут быть слитым белком, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гипервариабельного участка (CDR), как описывается выше. Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (TH) на антиген) и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но без ограничения, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, СР-870,893, CpG7909,CyaA, dSLIM, флагеллин или лиганды TLR5, полученные из флагеллина, лиганд FLT3, GM-CSF, IC30,IC31, имиквимод (ALDARA), резимиквимод, ImuFact IMP321, интерлейкины, такие как ИЛ-2, ИЛ-13,ИЛ-21, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX,иммуностимулирующие комплексы ISCOM, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, монофосфорил липид А, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V, Монтанид ISA-51, эмульсии "вода в мас- 26024497 ле" и "масло в воде", ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ONTAK, OspA, векторная система PepTel, основанные на поли(лактидкогликолиде) [PLG] и декстране микрочастицы, талактоферрин SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848, Бета-глюкан, Pam3Cys, стимулонAquila QS21, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Detox компании Ribi's,Quil или Superfos. Предпочтительными адъювантами являются такие, как адъювант Фрейнда или GMCSF. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфических для дендритных клеток, и их получение были описаны ранее (Allison and Krummel, 932-33). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были непосредственно соотнесены с влиянием на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, TNF-), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, GM-CSF, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США 5849589, отдельно включенный в описание во всей полноте путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, IFN-альфа, IFN-бета) (Gabrilovich 1996). Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах CpG также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, CpG-олигонуклеотиды при активации врожденной (не приобретенной) иммунной системы действуют с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR),в основном, TLR9. Вызванная CpG активация TLR9 усиливает антигенспецифические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к повышенной активации TH1-клеток и интенсивной выработке цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи CD4 Т-клеток. Активация ТН 1, вызванная стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют активации ТН 2- CpG-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся в организм вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или в подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена приблизительно на два порядка в сравнении с ответами антитела на полную дозу вакцины без CpG в некоторых экспериментах (Krieg, 471-84). В патенте США 6406705 В 1 описывается комбинированное применение CpG-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антигенспецифического иммунного ответа. Антагонистом CpG TLR9 является dSLIM (иммуномодулятор со структурой типа двуцепочечный стебель-петля) компании "Mologen" (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с TLR, такие как РНК, связывающаяся с TLR 7, TLR 8 и/или TLR 9. Другие примеры пригодных к использованию адъювантов включают, но без ограничения, химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), аналоги dsPHK, такие как поли(I:С) и их производные (например, AmpliGen, Hiltonol, поли-(ICLC), поли(IC-R), поли(I:С 1211), бактериальные ДНК или РНК, отличные от CpG, a также иммуноактивные малые молекулы и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб,темозоломид, темсиролимус, XL-999, СР-547632, пазопаниб, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, антиCTLA4, другие антитела, нацеленные на основные структуры иммунной системы (например, антитела кCD40, TGF-бета, рецептору TNF-альфа) и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъюванты. Количества и концентрации адъювантов и добавок, пригодных для использования в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются имиквимод, резимиквимод, GM-CSF, циклофосфамид,сунитиниб, бевацизумаб, интерферон-альфа, олигонуклеотиды CpG и производные, поли-(I:С) и производные, РНК, силденафил и составы из твердых частиц с PLG или виросомы. Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа. Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, сарграмостим), имиквимод и резиквимод. Адъювантом может являться имиквимод и резиквимод. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное,внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяют или суспендируют в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Кроме того, композиция может содержать такие вспомогательные вещества, как буферы, связующие агенты, раз- 27024497 рушающие агенты, разбавители, ароматизаторы, смазывающие вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список вспомогательных веществ, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из работы A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, изд. "AmericanPharmaceutical Association and pharmaceutical press". Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний. Отдельные примеры составов могут быть взяты, например, из ЕР 2113253. Кроме того, может быть медикамент, который пригоден для лечения рака, в частности рака желудка, почечно-клеточной карциномы, рака толстой кишки, немелкоклеточной карциномы легких, аденокарциномы, рака предстательной железы, доброкачественных новообразований и злокачественной меланомы. Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, глазной, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный способ. Предпочтительно, чтобы введение было s.c, и, наиболее предпочтительно, i.d. Введение может производиться инфузионным насосом. Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью последующих примеров, которые описывают его предпочтительные варианты осуществления, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Примеры Пример 1. Идентификация опухолеассоциированных пептидов, презентируемых на поверхности клетки. Образцы тканей. Опухолевые ткани пациентов были предоставлены Медицинским университетом префектуры Киото (KPUM), Киото, Япония, Школой медицины Осакского университета (OCU), Осака, Япония и Университетским госпиталем г. Тюбинген, Германия. Перед проведением хирургической операции было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции TUMAP-пептидов при -80 С. Выделение пептидов HLA из образцов тканей. Пулы комплексов пептид-HLA из подвергнутых шоковой заморозке образцов тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Falk et al. 1991; Seeger, F.H. et al. 1999) при использовании HLA-A, -В, -С-специфического антитела W6/32, HLA-A02-специфического антитела ВВ 7.2, CNBr-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации. Методы. Полученные пулы комплексов пептид-HLA были разделены в соответствии с их гидрофобностью ОФ хроматографией (nanoAcquity UPLC system, Waters) и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре LTQ-Orbitrap (ThermoFisher Scientific), снабженном источником ESI. Пулы пептидов загружали непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм внутр.д.250 мм) с материалом для обратнофазовой хроматографии 1,7 мкм С 18 (Waters) с применением скорости потока в 400 нл/мин. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока 300 нл/мин. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (PicoTip, New Objective) использовали для введения в источник нано-ESI. Масс-спектрометр LTQ-Orbitrap работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР 5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре Orbitrap (R=30000), за чем следовало сканирование MS/MS на Orbitrap(R=7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на SEQUEST с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную пептидную последовательность подтверждали сравнением генерированной картины фрагментации природного пептида с картиной фрагментации синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 представлен образец спектра, полученный из опухолевой ткани для пептида CDC2-001, ассоциированного с МНС класса I, и его профиля элюции на системе UPLC. Пример 2. Профили экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению. Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, вероятно, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания для опухоли, из которой они были получены. В целях идентификации- 28024497 таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации, авторы данного изобретения сосредоточили свое внимание на тех пептидах, которые получены из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей. Идеальный пептид может быть получен из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, близким к идеальному, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, соответственно, из которых они были образованы, и строили профили экспрессии этих генов. Источники и приготовление РНК. Хирургически удаленные образцы тканей были предоставлены различными клиническими центрами (см. пример 1) после получения письменной формы информированного согласия от каждого пациента. Образцы опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и гомогенизированы позже с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных образцов с использованием реагента TRI (Ambion, Дармштадт, Германия) с последующей очисткой на RNeasy (QIAGEN, Хильден, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей. Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (Ambion, Хантингдон, Великобритания; Clontech, Гейдельберг, Германия; Stratagene, Амстердам, Нидерланды; BioChain, Хейвард, Калифорния, США). РНК нескольких индивидов (от 2 до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равную массу. Лейкоциты были выделены из образцов крови 4 здоровых добровольцев. Качество и количество образцов суммарной РНК оцененивали на биоанализаторе Agilent 2100(Agilent, Вальдбронн, Германия) с использованием набора RNA6000 Pico LabChip Kit (Agilent). Эксперименты с микроматрицами Анализ экспрессии генов всех образцов РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микроматриц Affymetrix Human Genome (HG) U133A или HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством Affymetrix. Вкратце, двунитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием Superscript RTII (Invitrogen) и олиго-dT-Т 7 праймера (MWG Biotech, Эберсберг, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию in vitro производили с использованием набора для мечения РНКтранскриптов BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Фармингейл,Нью-Йорк, США) для матриц U133A или набора GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) для матрицU133 Plus 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидинфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Molecular Probes, Лейден, Нидерланды). Изображения сканировали на Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) или Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), а данные анализировали в программе GCOS (Affymetrix) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовались 100 служебных генов, предоставленных Affymetrix. Относительные значения экспрессии были подсчитаны из отношений зарегистрированных сигналов, полученных компьютерной программой, а значение для образца нормальной почки было произвольно задано значением 1,0. Профили экспрессии исходных генов, предложенных в настоящем изобретении, которые в высокой степени гиперэкспрессированы в клетках рака желудка, представлены на фиг. 2. Пример 3. Иммуногенность in vitro для пептидов, презентируемых МНС I класса, в IMA941. Для получения информации об иммуногенности пептидов TUMAP по настоящему изобретению были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных в работе (Walter, S., Herrgen, L., Schoor, О., Jung, G., Wernet, D., Buhring, H.J., Rammensee, H.G., andMHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 4974-4978). С использованием этой системы была показана положительная иммуногенность (т.е. размножение специфических Т-клеток) для 47 из 54 проанализированных пептидов TUMAP, рестриктированных по HLA-A2402, и для 3 из 3 проанализированных пептидов TUMAP по изобретению, рестриктированных по HLA-A0201, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют CD8+ Т-клеткипредшественники (табл. 4). Прайминг CD8+ Т-клеток in vitro. В целях проведения стимуляций in vitro искусственными антигенпрезентирующими клеткамиCD8 Т-клетки из свежего продукта лейкафереза HLA-A24 или из лейкоцитарной пленки HLA-A2 здоровых доноров, полученных из Банка крови г. Тюбингена, Германия.CD8 Т-клетки, непосредственно обогащенные либо из продукта лейкафереза, либо из РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) сначала выделяли с помощью среды градиентного разделения стандартной плотности (РАА, Кльбе, Германия). Выделенные CD8-лимфоциты или РВМС инкубировали до использования в Т-клеточной среде (ТСМ), состоящей из RPMI-Glutamax (Invitrogen, Карлс- 29