Применение комплекса гиалуроната цинка для лечения пептической язвы

1 Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, обладающим активностью против пептической язвы и содержащим ассоциат (комплекс) цинка гиалуроновой кислоты, а также к способу их получения. Далее данное изобретение относится к применению ассоциата (комплекса) цинка гиалуроновой кислоты, т.е. гиалуроната цинка, для получения фармацевтических композиций, обладающих активностью против пептической язвы, и к способу лечения и профилактики пептической язвы. Данное изобретение также относится к применению гиалуроната цинка для профилактики реинфекции после заживления пептической язвы. Макромолекула, известная как гиалуроновая кислота, обычно встречающаяся в виде ее натриевой соли, представляет собой соединение, известное более 50 лет. Meyer et al. (J. Biol.Chem., 107, 629 (1934 впервые описали, что гиалуроновая кислота представляет собой высоковязкий нативный глюкозаминогликан, содержащий попеременно 1-3 глюкуроновую кислоту и остатки 1-4 глюкозамина, ее молекулярная масса составляет от 50000 до нескольких миллионов. Гиалуроновая кислота встречается в соединительных тканях всех млекопитающих; в наибольшем количестве она находится в коже,стекловидном теле глаза, синовиальной жидкости, пуповине, а также в хрящевой ткани. До последнего времени гиалуроновая кислота применялась в виде натриевой соли для лечения, главным образом в офтальмологии,дерматологии, хирургии, суставной терапии, а также в косметике. Соли гиалуроновой кислоты,образованные со щелочью, щелочной землей,магнием, алюминием, аммонием и замещенными ионами аммония, могут служить как носители для стимулирования абсорбции лекарственных средств (см. описание к Бельгийскому патенту 904547). Соли тяжелых металлов гиалуроновой кислоты, включая соль серебра, применяют в виде фунгицидов, в то время как соли золота могут быть использованы для лечения ревматоидного артрита (см. описание к заявкеWO 87/05517). Однако известны тяжелые побочные реакции соединений серебра и золота,т.е. их действие на иммунную систему, органы кроветворения и нервную систему (М. Shinogi,S. Maeizumi: "Effect of preinduction of metallothionein on tissue distribution of silver and hepatic lipid peroxidation", Biol. Pharm. Bull. (Japan), Apr. 1993, 16 (4), p. 372-374; С. Masson etal.,: Rev. Med. Interne (France), May-June 1992,13 (3), p. 225-232 (1992. Ассоциаты (комплексы) гиалуроновой кислоты с удаленным протоном с ионами металлов 3d 4-го периода Периодической Таблицы,такие как гиалуронаты цинка и кобальта, обладающие лечебным действием, особенно против язв на ногах, пролежней и т.п., раскрыты в опи 002134 2 сании к венгерскому патенту 203372 (которому соответствует WO-A-9010020) с подтверждением наружного применения. В настоящее время было обнаружено, что ассоциат (комплекс) цинка гиалуроновой кислоты, т.е. гиалуронат цинка, обладает существенной гастрозащитной активностью, поэтому он может быть использован для профилактики и лечения пептических язв, включая язвы, вызванные Helicobacter pylori. Пептическая язва - это сложное и многофакторное заболевание, наблюдающееся у большой части цивилизованного населения. Множество вопросов, касающихся точного патогенеза этого заболевания, ждут своих ответов. В течение последних пяти лет возник новый подход благодаря "повторному открытию" Helicobacter pylori. Общеизвестно, что развитие пептической язвы у людей связано с инфицированием Helicobacter pylori, однако, с другой стороны, Н. pylori не может отвечать за все причины возникновения пептической язвы. До настоящего времени лечение пептической язвы существенно не изменилось: по-прежнему блокаторы Н 2 и ингибиторы протонного насоса являются наиболее важными средствами терапевтического арсенала, в то время как в литературе преобладают возможные терапевтические способы умерщвления бактерий Н. pylori. Кроме того, лечение гастродуоденальных повреждений, вызванных нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами, заняло центральное место. Пептическая язва, возникшая по любой причине, может быть охарактеризована нарушением баланса, существующего в здоровых условиях между агрессивными факторами, вызывающими развитие язвы, и защитными факторами, защищающими желудок от возникновения язвы. Таким образом, язва развивается в каждом случае, когда усиление агрессивных факторов выходит за определенные рамки и/или защитные факторы ослабевают. Защитные факторы включают такие факторы, как сопротивляемость слизистой оболочки желудка, достаточное кровоснабжение слизистой оболочки желудка и образование слизи (Н. Shay: Etiologyof peptic ulcer. Am. J. Dig. Dis.,6, 29-49 (1961. Среди агрессивных факторов ведущими факторами являются секреция соляной кислоты и пепсина, а также все факторы, стимулирующие секрецию любого из этих веществ. Секреция кислоты может быть также усилена патологическим вагусным раздражителем или повышенным образованием гастрина аутоиммунным механизмом и, в некоторых случаях, гормональным действием. Кроме того, равновесие между агрессивными и защитными факторами может быть также нарушено повреждениями, затрагивающими весь организм. Таким образом, пептическая язва является многофакторным заболеванием. Средства, применяемые для лечения 3 язв, предназначены для снижения роли агрессивных факторов и/или усиления роли защитных факторов. До последнего времени фармакологические исследования были направлены на ослабление действия агрессивных факторов,таким образом, первичной целью являлось сдерживание выработки кислоты и пепсина. Лекарственные средства, применяемые для лечения язв, в первую очередь, были направлены на нейтрализацию кислоты (антациды, такие как двууглекислый натрий или гидроокись алюминия) либо на ингибирование ее секреции (блокаторы H2, например, циметидин, фамотидин, ингибиторы протонного насоса, например, омепразол). Только в последнее время большее значение приобрело исследование агентов, усиливающих роль защитных факторов, помимо развития монотерапии, применяемой для умерщвления Helicobacter pylori. Однако существует ограниченное количество композиций, усиливающих защитные факторы, при этом они обладают побочным действием. Такими композициями являются коллоидный субцитрат висмута (CBS, DeNOL), сукралфат и мизопростол. CBS содержит висмут,вызывающий токсикологические проблемы. Сукралфат, основная соль алюминия сульфатированной сахарозы, вызывает некоторые побочные реакции, например, тошноту, рвоту, интоксикацию алюминием и т.д.; а мизопростол, синтетический аналог простагландина, вызывает усиленную интестинальную активность или тошноту. Из вышеизложенного следует, что существует дальнейшая потребность в эффективных и безопасных лекарственных средствах для лечения язв, не вызывающих повышенную секрецию кислоты. Такие композиции могут с успехом применяться в тех случаях, когда целью является предупреждение поражений желудка в результате раздражающего и повреждающего действия, например, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, таких как индометацин, аспирин, путем усиления защитного механизма слизистой. Количество пациентов, имеющих пептические язвы из-за употребления нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), может в будущем возрасти, если принять во внимание данные, показывающие, что ежедневно во всем мире употребляется более десяти миллионов таблеток нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, образующих группу наиболее часто употребляемых в настоящее время лекарственных препаратов. Усиление защитного механизма может быть также важным для язв, возникающих в результате инфицирования Helicobacter pylori,поскольку эти бактерии продуцируют множество токсинов и ферментов (уреаза, протеаза, каталаза, липаза), повреждающих слизистую обо 002134 4 лочку желудка и открывающих доступ кислоте и пепсину к эпителию желудка. Для удовлетворения вышеописанной потребности было выбрано лечение пептической язвы путем исследования предполагаемой гастрозащитной активности гиалуроната цинка, ассоциата (комплекса) цинка с гиалуроновой кислотой. В соответствии с результатами экспериментов гиалуронат цинка обладает существенным гастрозащитным действием и весьма подходит для вышеуказанных целей, т.е. для предупреждения (профилактики) возникновения пептической язвы и/или лечения возникшей язвы, соответственно. Таким образом, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, обладающим активностью против пептической язвы и содержащим ассоциат (комплекс) цинка с гиалуроновой кислотой, а также к способу его получения путем смешивания активного ингредиента, т.е. гиалуроната цинка (полученного известным способом), с терапевтически приемлемыми носителями и/или добавками и превращения смеси в фармацевтическую композицию. Далее данное изобретение относится к применению ассоциата (комплекса) цинка с гиалуроновой кислотой для получения фармацевтических композиций, обладающих активностью против пептической язвы, и способу лечения и профилактики пептической язвы. В литературе известны подобные по структуре гастрозащитные соединения. Действие солей цинка кислых полисахаридов, включая мукополисахариды, против язвы желудка описано в опубликованной японской заявке на патент 6-48950, где приводится перечень агара агропектина, полученного из водорослей морского происхождения, каррагинина, альгиновой кислоты в виде кислых полисахаридов; гиалуроновой кислоты, гепарина, сульфата хондроитина в виде мукополисахаридов; а также других соединений, таких как декстран сульфат,карбоксиметилцеллюлоза и т.п., и пектиновой кислоты растительного происхождения. Однако в соответствии с этой заявкой молекулярная масса кислых полисахаридов составляет приблизительно несколько тысяч, предпочтительно,приблизительно 20000. Цинковая соль гиалуроновой кислоты и ее фармакологическая активность вообще не упоминается в примерах. В патенте США 5514660 раскрывается противоязвенное действие фармацевтических композиций, содержащих активный ингредиент типа олигосахарида, а также содержит примеры исследования действия этих соединений на язву,вызванную Helicobacter pylori. Однако в этом описании не упоминается ни гиалуроновая кислота, ни ее цинковый ассоциат, равно как и их ранозаживляющее действие. Гастрозащитное действие гиалуроната цинка подтверждается различными фармакологическими исследованиями. Для этих исследо 5 6 массы. В случае с гиалуронатом цинка, а также всеми другими соединениями гиалуроновой кислоты, под "молекулярной массой" подразумевается средняя величина молекулярных масс смеси молекул с различной степенью полимеризации, установленная с помощью конкретного способа определения молекулярной массы. Для фармакологических экспериментов ассоциаты гиалуроната цинка растворяют в 1,0% водном растворе. Нижеследующие примеры описывают процедуру получения 1,0% раствора гиалуроната цинка. Если не указано иначе, процентные величины означают величины мас./об.%. Пример 1. Получение 1,0% раствора гиалуроната цинка. Гиалуронат натрия (1,0 г) подвергают набуханию в 30 мл воды при постоянном перемешивании, а затем после добавления 18,75 мл 0,1-молярного раствора хлорида цинка объем доводят до 100 мл дистиллированной водой. Характеристики гиалуроната натрия, используемые для получения растворов гиалуроната цинка с различными молекулярными массами и степенями чистоты, применяемых в наших фармакологических исследованиях, суммированы в нижеследующей таблице. ваний использовались растворы гиалуроната цинка в соответствии с венгерской заявкой на патент 203372. Также исследовались натрий гиалуронат и хлорид цинка, т.е. соединения, из которых получают гиалуронат цинка. В фармакологических экспериментах, проводившихся для подтверждения гастрозащитного действия гиалуроната цинка, также определялось, как изменяется эффективность при изменении его молекулярной массы и при различных степенях чистоты. Для этой цели исследовались растворы гиалуроната цинка (I), гиалуроната цинка (II) и гиалуроната цинка (III), молекулярная масса которых составляет 750000,900000 и 1200000, соответственно, имеющие высшую степень чистоты ("purissimum"). Гиалуронат цинка (М) имеет степень чистоты "purum", т.е. получен из низкокачественного материала. Последней задачей является сравнение гиалуроната цинка и одного из наиболее часто используемых гастрозащитных соединений сукралфата. Специалисту в данной области очевидно,что смеси молекул с различными степенями полимеризации и молекулярными массами в очень широком диапазоне, например, соединений гиалуроновой кислоты, не могут быть охарактеризованы точной величиной молекулярной Характеристики гиалуроната натрия, используемые для растворов, содержащих Гиалуронат цинка Гиалуронат цинка Гиалуронат цинка Гиалуронат цинка(М) Содержание гиалуроната натрия Молекулярная масса Содержание белка Вязкость Поглощение УФ А 0,2% 260 нм Для исследований используемые дозы растворов, содержащих гиалуронат цинка с различными молекулярными массами и степенями чистоты, разбавляют дистиллированной водой и вводят в объеме, составляющем 10 мл/кг массы тела. Дозы сукралфата, используемого для сравнения, индометацин и порошок древесного угля суспендируют в 1-2 каплях Твин 80 и разбавляют физиологическим раствором до 5 мл/кг массы тела (0,9% вес./объем хлорида натрия). Используемые дозы N-этилмалеимида и метилового эфира NG-нитро-L-аргинина (L-NAME) разбавляют до 5 мл/кг массы тела. Фактор активации тромбоцитов (PAF) растворяют в 0,25% вес/объем альбумина бычьей сыворотки, приготовленной с 0,9% вес/объем раствора хлорида натрия. Используются вещества следующих производителей. Гиалуронат цинка (I), (II), (III) и (М), а также гиалуронат натрия (Gedeon Richter); хлорид цинка (Merck); сукралфат (UlcerlminR Chu(Sigma); альбумин бычьей сыворотки (Sigma); древесный уголь (Sigma). Фармакологическую активность ассоциата гиалуроната цинка исследуют, применяя следующие способы. 1. Ингибирование поражений желудка, вызванных подкисленным этанолом. Используют самок крыс RG-Wistar весом 120-150 г. Перед экспериментами животные голодают в течение 24 ч, но получают вволю воды. Эксперименты проводят в соответствии с методом, подобным методу, описанному A.Robert (Gastroenterology, 77, 7661 (1979. В качестве сильных раздражителей используют подкисленный этанол (смесь 50 мл абс. этанола и 1 мл концентрированной НСl). При внутрижелудочном введении доза подкисленного этанола составляет 0,5 мл/100 г массы тела. Исследуемые соединения вводят перорально за 30 мин до введения подкисленного этанола. При исследовании продолжительности действия указанного соединения исследуемый материал вводят за 60 или 120 мин до провоцирующего действия, вызванного подкисленным этанолом. Через час после введения подкисленного этанола крыс умерщвляют путем цервикального смещения. Желудки удаляют, раскрывают вдоль большой кривизны и осторожно промывают. Измеряют длину продольных геморрагических поражений. Величину ED50 определяют в виде дозы,вызывающей 50% снижение индекса язвы. Для изучения механизма действия исследуемого соединения роль эндогенной NO в развитии желудочного повреждения, вызванного подкисленным этанолом, также исследуют путем интраперитонеального введения метилового эфира L-NG-нитроаргинина (L-NAME). LNAME в дозе, составляющей 25 мг/кг, вводят в виде инъекции за 15 мин до исследуемого соединения. В последующих экспериментах вводят исследуемое соединение (перорально), LNAME (25 мг/кг, интраперитонеально), Lаргинин (400 мг/кг, внутривенно) за 30, 45 или 60 мин до перорального введения подкисленного этанола. Результаты суммированы в нижеследующих таблицах. Контрольная группа, включенная в таблицы, получала только носитель (дистиллированная вода) вместо гиалуроната цинка. Таблица 1 Действие гиалуроната цинка (I) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом Таблица 2 Действие гиалуроната цинка (II) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом 8 Таблица 3 Действие гиалуроната цинка (III) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом Таблица 4 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом Таблица 5 Действие гиалуроната натрия на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом Таблица 6 Действие хлорида цинка на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом Длина повреждения/ Ингибирова желудок ние, % ммS.E.M. Контроль 10 51,513,8 10 3,2 43,7 29,04,0 Хлорид 10 6,4 52,0 24,77,7 цинка 10 12,8 87,0 6,71,6 р 0,05 по сравнению с контрольной группой Таблица 7 Действие сукралфата на желудочный некроз,вызванный подкисленным этанолом Таблица 11 Действие метилового эфира NG-нитро-L-аргинина(L-NAME) на защитное действие хлорида цинка против желудочного повреждения, вызванного подкисленным этанолом Таблица 8 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом после увеличения времени предварительной обработки до 60 мин Таблица 9 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочное повреждение, вызванное подкисленным этанолом после увеличения времени предварительной обработки до 120 мин Таблица 10 Действие метилового эфира NG-нитро-L-аргинина(L-NAME) на защитное действие гиалуроната цинка Из результатов, представленных в табл. 1,2, 3 и 4, следует, что гиалуронат цинка, имеющий различные молекулярные массы и степени чистоты, обладает существенным гастрозащитным действием: после перорального введения он ингибирует, в зависимости от дозы, образование желудочного повреждения, вызванного подкисленным этанолом. Величины ЕD50 различных гиалуронатов цинка составляют: гиалуронат цинка (I) 15,9 мг/кг; гиалуронат цинка (II) 11,1 мг/кг; гиалуронат цинка (III) 33,2 мг/кг и гиалуронат цинка (М) 10,4 мг/кг. В отличие от ассоциатов гиалуроната цинка (I), (II), (III) и(М), гиалуронат натрия, вводимый перорально в дозе 100 мг/кг, оказывает защитное действие только на 36% желудочных повреждений, вызванных подкисленным этанолом (табл. 5). Величина ED50, относящаяся к хлориду цинка, составляет 4,5 мг/кг после перорального введения(табл. 6). Сукралфат, известный цитозащитный агент, используемый для сравнения, обладает меньшей активностью (величина ED50 составляет 112 мг/кг), чем исследуемые гиалуронаты цинка (табл. 7). Продолжительность действия определяют с применением ассоциата гиалуроната цинка(М). С увеличением времени предварительной обработки величина ED50 возрастает (табл. 8 и 9). Из представленных результатов следует, что гиалуронат цинка (М) не связывается со слизистой оболочкой желудка необратимым способом. Изучают связь между цитозащитным действием гиалуроната цинка и эндогенной NO,используя ингибитор окиси азота (II), в частности, метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина (LNAME). Учитывая, что гиалуронат цинка (II) и гиалуронат цинка (М) проявили одинаковую активность в тесте с применением подкисленного этанола, последний явился лишь предметом данного эксперимента. Из наших результатов (табл. 10) следует,что предварительная обработка при помощи LNAME существенно снижает гастрозащитную активность гиалуроната цинка (М); она замед 11 ляется в результате обработки L-аргинином, но не устраняется в результате предварительной обработки D-аргинином. С другой стороны, в этом тесте предварительная обработка при помощи L-NAME не влияет на защитное действие хлорида цинка (табл. 11). Гиалуронат натрия не сравнивали с L-NAME, потому что гастрозащитное действие этого вещества настолько слабое (табл. 5), что оно не может быть точно определено. Тот факт, что L-NAME существенно снижает защитное действие гиалуроната цинка,в то же время не влияя на хлорид цинка, вероятно,доказывает, что NO играет роль в развитии цитозащитного действия гиалуроната цинка (М). 2. Ингибирование поражений желудка, вызванных индометацином. Используют самок крыс RG Wistar весом 120-150 г. Перед экспериментами животные голодают в течение 24 ч, но получают вволю воды. Исследуемые соединения вводят перорально, через 30 мин животным подкожно вводят индометацин в дозе 40 мг/кг. Через 4 ч после раздражающего введения индометацина животных умерщвляют путем цервикального смещения. Желудки удаляют, раскрывают вдоль большой кривизны и подсчитывают количество геморрагических поражений на гландулярном желудке. Величина ED50 представляет дозу, на 50% защищающую желудок от повреждающего действия индометацина. Результаты представлены в нижеследующих таблицах. Контрольная группа, включенная в таблицы, получала только носитель (дистиллированная вода) вместо гиалуроната цинка. Таблица 12 Действие гиалуроната цинка (I) на желудочное повреждение, вызванное индометацином Таблица 13 Действие гиалуроната цинка (II) на желудочное повреждение, вызванное индометацином Контроль Гиалуронат цинка (II) Контроль Гиалуронат цинка (II) 12 Таблица 14 Действие гиалуроната цинка (III) на желудочное повреждение, вызванное индометацином Таблица 15 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочное повреждение, вызванное индометацином Таблица 16 Действие гиалуроната натрия и хлорида цинка на желудочное повреждение, вызванное индометацином Контроль Гиалуронат натрия Контроль Хлорид цинка Таблица 17 Действие сукралфата на желудочное повреждение,вызванное индометацином Количество повреждений/ Ингибиро желудок вание, % Из представленных результатов следует,что гиалуронаты цинка (I), (II), (III) и (М) эффективны против желудочных повреждений,вызванных индометацином (табл. 12, 13, 14 и 15). Из представленных результатов также очевидно, что гиалуронаты цинка ингибируют развитие желудочных поражений, вызванных индометацином, в зависимости от дозы. После перорального введения их величины ED50 составляют 2,8, 5,8, 10,2 и 6,2 мг/кг соответственно (см. табл. 12, 13, 14 и 15). Из данных, представленных в табл. 16,следует, что гиалуронат натрия и хлорид цинка не обеспечивают защиты слизистой желудка против повреждающего действия индометацина. Более того, из наибольшей величины ED50 (74,9 мг/кг) сукралфата (табл. 17) следует, что защитное действие гиалуроната цинка превышает действие сукралфата. 3. Ингибирование поражений желудка, вызванных стрессом. Используют самок крыс RG Wistar весом 120-150 г. Перед экспериментами животные голодают в течение 24 ч, но получают вволю воды. Эксперименты проводят в соответствии со способом, подобным способу, описанномуSenay et al. (1967). (Proc. Sоc. Ехр. Biol. Med.,124, 1221 (1967. Исходя из результатов тестов с подкисленным этанолом, где гиалуронат цинка (II) и гиалуронат цинка (М) проявили одинаковую активность, на стрессовой модели изучают только гиалуронат цинка (М). Исследуемые соединения вводят перорально. 30 мин спустя животных иммобилизуют в пластиковых фиксирующих камерах, а затем помещают в холодильник при температуре от 4 до -8 С. Спустя 4 ч животных удаляют из холодильника и фиксирующих камер и через час умерщвляют путем цервикального смещения. Желудки удаляют, раскрывают вдоль большой кривизны и геморрагические поражения оценивают баллами от 0 до 3: желудки, не имеющие повреждений, получают 0 баллов, желудки с небольшим количеством геморрагических повреждений получают 1 балл, желудки с более чем 10 поражениями получают 2 балла, и желудки с множеством повреждений получают 3 балла. Величину ED50 определяют как дозу, необходимую для снижения количества желудочных поражений на 50%. Результаты представлены в нижеследующих таблицах. Таблица 18 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочное повреждение, вызванное стрессом Контроль Гиалуронат цинка (М) 14 Таблица 19 Действие гиалуроната натрия и хлорида цинка на желудочное повреждение, вызванное стрессом Контроль Гиалуронат натрия Хлорид цинка Различные стрессовые ситуации, такие как холод и существенное ограничение движения,вызывают острые желудочные поражения у крыс. Из представленных результатов следует,что гиалуронат цинка (М) предотвращает стресс, вызванный холодом и ограничением движения, в зависимости от дозы с ED50 = 29,4 мг/кг при пероральном введении (табл. 18). С другой стороны, натрий гиалуронат и хлорид цинка оказывают лишь небольшое защитное действие на поражения желудка, вызванное холодом и ограничением движения (табл. 19). 4. Ингибирование поражений желудка, вызываемых фактором активации тромбоцитов(PAF). Используют самцов крыс RG-Wistar весом 200-250 г. Перед экспериментами животные голодают в течение 24 ч, но получают вволю воды. Эксперименты проводят в соответствии со способом, подобным способу, описанномуWallace and Whittle (1986). (Br. J. Pharmac., 89,415 (1986. Животных подвергают анестезии в результате интраперитонеального введения уретана в дозе, составляющей 1 г/кг и в объеме 10 мл/кг. Затем готовят бедренную вену и канюлируют для введения фактора активации тромбоцитов, вызывающего язвы. После операции фактор активации тромбоцитов вливают внутривенно со скоростью 0,1 мл/мин в течение 10 мин в дозе, составляющей 200 нг/кг/мин. Исследуемые соединения вводят за 30 мин до введения фактора активации тромбоцитов. Через час после вливания фактора активации тромбоцитов животных умерщвляют путем цервикального смещения, их желудки удаляют и раскрывают вдоль большой кривизны. Геморрагические эрозии оценивают системой баллов от 0 до 3. Желудки, не имеющие повреждений, получают 0 баллов, желудки с небольшим отличием от нормальных получают 1 балл, желудки с умеренными повреждениями получают 2 балла, а желудки с тяжелой диффузной гиперемией и/или кровотечением получают 3 балла. Фактор активации тромбоцитов (PAF) представляет собой эндогенный фосфолипид,который в настоящее время описан как наиболее сильное средство, вызывающее язву желудка. Его эндогенное выделение может играть роль в развитии некоторых форм пептической 15 язвы (Rosam et al. (1986); Wallace et al. (1986. Результаты представлены в нижеследующей табл. 20. Таблица 20 Действие гиалуроната цинка (М), гиалуроната натрия и хлорида цинка на фактор активации тромбоцитов,вызывает желудочное повреждение Степень повреждения Доза мг/кг Ингибирожелудка (бал- вание, % В соответствии с процедурами, описанными в стрессовой модели, в модели, индуцируемой фактором активации тромбоцитов, исследованию подвергался только гиалуронат цинка(М). Этот гиалуронат цинка сильно снижает вызывающее язву действие фактора активации тромбоцитов, в то время как гиалуронат натрия не оказывает такого действия. Хлорид цинка проявляет некоторое защитное действие против фактора активации тромбоцитов, однако, оно намного слабее действия, оказываемого гиалуронатом цинка (табл. 20). 5. Ингибирование хронической язвы желудка, вызываемой уксусной кислотой. Используют самок крыс RG Wistar весом 120-150 г. Перед операцией животные голодают в течение 24 ч, но получают вволю воды. Хроническую язву желудка получают в результате инъекции 25 мкл/животное 20%(об./об.) уксусной кислоты в стенку желудка под легкой анестезией эфиром в соответствии со способом, подобным способу, описанномуTakagi et al. (1969). Пероральное введение исследуемых соединений начинают через 5 дней после операции и продолжают по одному разу в сутки до 14-го дня. На 15-й день животных умерщвляют, а их желудки вскрывают. Тяжесть язвенного поражения определяют путем измерения диаметра язв и подсчитывают пораженную площадь. Заживляющее действие выражено в виде разницы процентных величин контрольной и исследуемой группы. Уксусная кислота раздражает стенку желудка и вызывает хорошо очерченную язву,очень похожую на человеческую язву как по форме, так и по микроскопическому изображению. Результаты представлены в нижеследующих таблицах. 16 Таблица 21 Действие гиалуроната цинка (II) на хроническую язву желудка, вызванную уксусной кислотой Площадь язвенного поражения мм 2S.E.M. 8,91,2 6,21,0 5,81,1 Таблица 22 Действие гиалуронатов цинка, имеющих различные молекулярные массы, на хроническую язву желудка,вызванную уксусной кислотой Площадь язДоза мг/кг венного поражения мм 2 Таблица 23 Действие сукралфата на язву желудка, вызванную уксусной кислотой Площадь язвенного поражения мм 2S.E.M. 5,71,2 6,71,5 9,21,6 4,31,3 Таблица 24 Действие гиалуроната цинка (М) на хроническую язву желудка, вызванную уксусной кислотой Площадь язвенного поражения мм 2S.E.M. 12,92,5 9,42,3 7,6 1,4 Гиалуронат цинка (II) ускоряет заживление хронической язвы желудка, вызываемой уксусной кислотой (табл. 21). Существенное (р 0,005) изменение наблюдается при дозе, составляющей 1 мг/кг, однако, заметное заживляющее действие наблюдается даже при дозе,составляющей 0,01 мг/кг. Ни гиалуронат цинка(I), ни гиалуронат цинка (III) не оказывают какого-либо действия на заживление xронической язвы при дозе, составляющей 1,0 мг/кг (табл. 22). Как следует из табл. 23, эталонный сукралфат также менее эффективен для ускорения заживления язвы желудка, чем гиалуронат цинка (II). Доза сукралфата должна быть увеличена до 500 мг/кг для увеличения лечебного действия на 53%. Гиалуронат цинка (М) также ускоряет заживление язвы, вызываемой уксусной кислотой,однако, это ускорение меньше, чем при использовании гиалуроната цинка (II). Гиалуронат цинка (М) также проявляет максимальную активность при дозе, составляющей 1 мг/кг, результат, подтверждающий наши вышеописанные наблюдения, т.е. что действие гиалуронатов цинка различного происхождения не сильно отличается одно от другого (табл. 24 и чертеж). 6. Ингибирование кишечной язвы, вызываемой индометацином. Используют самок не голодавших крысRG-Wistar весом 120-150 г. Кишечную язву вызывают в результате перорального введения 15 мг/кг индометацина. Исследуемое соединение вводят животным 3 раза в течение 48 ч с интервалами, составляющими 24 ч. Через 60 мин после первого введения исследуемого соединения вводят разовую дозу индометацина. Животных умерщвляют через 72 ч после первого введения исследуемого соединения. Контрольные животные получают наполнитель вместо исследуемого соединения, а выражение "нормальные крысы" означает не голодавшие и не обработанные крысы. Небольшой сегмент кишечника от привратника до слепой кишки удаляют, помещают в 0,9% (вес/об.) раствор хлорида натрия при 37 С, и один из его концов через полиэтиленовую канюлю соединяют с записывающим устройством ВР. После лигирования обоих концов препарата давление внутри кишечника увеличивают до тех пор, пока на ослабленном участке стенки кишечника не появятся воздушные пузырьки. Это давление выражают в мм Нg и обозначают как предел прочности на растяжение(TS). Результаты представлены в нижеследующей табл. 25. Таблица 25 Действие гиалуроната цинка (II) на кишечную язву,вызванную индометацином Предел прочности стенки кишечника как индекс язвенного поражения мм рт.столбаS.E.M. Нормальные 7 227,11,6 Контроль 18 Наполнитель 16,76,0 Гиалуронат 7 3 х 1 27,98,9 цинка (II) 8 3 х 10 41,310,9 8 3 х 100 48,811,3 р 0,05 по сравнению с контрольной группой 18 Из экспериментальных результатов следует, что гиалуронат цинка (II) оказывает защитное действие на стенку кишечника против язвенного поражения, вызываемого индометацином. При дозах, составляющих 10 и 100 мг/кг,предел прочности стенки кишечника увеличивается почти в три раза по сравнению с контрольной группой. Однако увеличение предела прочности не сопровождается существенным снижением язвенного поражения (табл. 25). 7. Ингибирование желудочно-кишечной перистальтики в исследовании на проталкивание древесного угля. Помимо исследований гиалуронатов цинка на различных острых и хронических моделях,изучалось, может ли это вещество оказывать какое-либо действие на желудочно-кишечную перистальтику. Эксперименты проводят с использованием самок крыс RG-Wistar весом 120-140 г, голодавших в течение 24 ч, но получавших вволю воды. Экспериментальную процедуру осуществляют в соответствии со способом, подобным способу, описанному Р.A. Janssen and A.J.Jageneau (J. Pharm. Pharmacol. 9, 381 (1957. Исследуемые соединения вводят перорально в дозе, составляющей 100 мг/кг. Контрольные животные вместо исследуемых соединений получают физиологический солевой раствор. Через 30 мин перорально вводят 5%(вес/об.) суспензию древесного угля в объеме,составляющем 0,5 мл/животное. Через 60 мин после введения древесного угля животных умерщвляют путем цервикального смещения. Участок кишечника от привратника до слепой кишки удаляют и измеряют его длину, а также длину участка, занимаемого древесным углем. Перистальтику выражают в виде отношения длины суспензии древесного угля к длине всего кишечника. Результаты представлены в нижеследующих таблицах. Таблица 26 Действие гиалуронатов цинка (I), (II) и (III) на желудочно-кишечную перистальтику Проталкивание Длина Доза суспензиимг/к кишечника древесного г p.o. ммS.E.M. угля мм(III)р 0,05 по сравнению с контрольной группойотношение суспензии древесного угля ко всей части кишечника 19 Таблица 27 Действие гиалуроната цинка (М) на желудочнокишечную перистальтику Проталкивание Длина Доза суспензии Отношемг/кг кишечника древесного ние р.о. ммS.E.M. угля мм +(М)Отношение суспензии древесного угля ко всей части кишечника Из результатов экспериментов следует(табл. 26 и 27), что ни гиалуронат цинка (I) и(II), ни гиалуронат цинка (М) не оказывают никакого действия на перистальтику кишечника: отсутствие изменений активности показывает,что они не прилипают к слизистой желудка необратимым образом и, с другой стороны, они не раздражают кишечник, делая его гиперактивным. Сравнив эффективность гиалуронатов цинка с различной молекулярной массой в некотoрых исследованиях язвы, неожиданно было обнаружено, что между гастрозащитным действием и молекулярной массой существует определенная связь. Из предыдущих экспериментов следует, что наивысшая эффективность гиалуроната цинка, имеющего различную молекулярную массу в интервале 700000-1200000 Да, проявляется при молекулярной массе, составляющей приблизительно 900000 Да. Дальнейшее увеличение молекулярной массы не сопровождается усилением действия. В результате этого экспериментального наблюдения был сделан вывод, что молекулярная масса играет большую роль в достижении оптимального эффекта. Изучение активности против бактерийHelicobacter pylori. Эти эксперименты проводят на штаммахHelicobacter pylori, культивируемых из образцов биопсии желудков пациентов, страдающих от различных язв. В качестве образца используют 1% (вес/вес) раствора De-Nol (коллоидный субцитрат висмута). Используют агаровую среду,дополненную 10% бычьей крови. В качестве контроля используют чашки, не содержащие исследуемое вещество. Инокулированные чашки инкубируют при 37 С в атмосфере газа, содержащего 5% кислорода и 7-8% двуокиси углерода, в течение 3-5 дней. Величину минимальной ингибирующей концентрации (MIС) принимают за самую низкую концентрацию веществ, полностью ингибирующих рост (размножение) хорошо размножающихся бактерий на контрольных планшетах. Величины MIC ассоциата гиалуроната цинка и De-Nol, измеренные на исследуемых штаммах, представлены в нижеследующей таблице. 20 Признак штамма Гиалуронат цинка Из данных, представленных в вышеприведенной таблице, следует, что активность in vitro гиалуроната цинка против Helicobacter pylori соизмерима с активностью De-Nol, применяемого в терапии. Этот факт удивителен, посколькуDe-Nol является содержащим висмут соединением, побочным действием которого нельзя пренебречь (проблемы с токсичностью; его проглатывание неприятно для пациента), в то время как такое побочное действие не ожидается при использовании ассоциата гиалуроната цинка. Выводы. Данное исследование показывает, что гиалуронаты цинка с различными молекулярными массами обладают существенной гастрозащитной активностью. Их противоязвенное действие исследовалось на нескольких острых и хронических моделях язвы желудка и в большинстве случаев сравнивалось с хорошо известным гастрозащитным лекарственным препаратом, т.е. сукралфатом. Результаты подтверждают, что все виды гиалуронатов цинка являются сильными цитозащитными агентами, поскольку они предохраняют слизистую оболочку желудка от повреждающего действия подкисленного этанола. Из вышеприведенных результатов может быть сделан вывод, что гиалуронаты цинка, имеющие молекулярную массу 700000-1200000 Да, являются эффективными цитозащитными агентами независимо от качества сырого материала ("purum" или "puriss"), используемого для их получения. Максимальная эффективность достигается при молекулярной массе, составляющей 900000 Да. При увеличении времени предварительной обработки цитозащитное действие снижается всего лишь в небольшой степени, факт, означающий продление активности, не сопровождаемой нежелательными, необратимыми изменениями. Наши эксперименты, предназначенные для прояснения механизма действия (которые проводились с применением гиалуроната цинка качества "purum", основанного на вышесказанных), подтверждают, что гиалуронат цинка оказывает свое гастрозащитное действие с помощью механизма, не характерного ни для хлорида цинка, ни гиалуроната натрия. Нашей целью было прояснить этот механизм путем исследования роли эндогенной NO. Эксперименты показали, что NO, вероятно, играет роль в развитии цитозащитного действия гиалуроната цинка. Это является важным, поскольку в последнее время все больше внимания уделяется возможной связи между развитием гастрозащиты и эндогенной NO. Существует мнение(Konturek et al., 1994), что NO, который биосинтезируется из L-аргинина (Moncada et al., 1991), 21 способствует гастрозащитному действию различных противоязвенных лекарственных препаратов, например, алюминийсодержащих антацидов. Кроме того, было установлено, что эндогенная NO играет регулирующую роль в кровотоке слизистой оболочки желудка (Lippe et al.,1992), а также в реактивности тучных клеток(Salvemini et al., 1994). Из вышеописанных экспериментов также очевидно, что степень гастрозащитного действия гиалуронатов цинка на порядок превышает действие сукралфата, который является характерным противоязвенным лекарственным средством. Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) вызывают желудочные поражения или, в более серьезных случаях, язвы желудка, возникающие в результате их прямого повреждения слизистой оболочки желудка, местного раздражения и их косвенного действия, которое является следствием системного ингибирования синтеза простагландинов. Гиалуронат цинка (I), (II), (III) и (М) также доказали свою эффективность против желудочных повреждений, вызываемых индометацином. При сравнении эффективности гиалуроната цинка(II) с активностью гиалуроната цинка (М) можно сделать вывод о том, что величины их ED50 почти одинаковы (5,8 и 6,2 мг/кг соответственно), а также предположение, что (вместе с результатами исследования поражений желудка,вызванных подкисленным этанолом) гиалуронаты цинка, независимо от источника, из которого они были получены ("purum" или "puriss"), обладают одинаковой гастрозащитной активностью. Результаты исследований с применением индометацина также поддерживают вывод о том, что гиалуронат цинка - это нечто большее,чем просто физико-химический барьер между просветом и слизистой оболочкой желудка, поскольку его действие проявляется не только после перорального (см. исследование с применением кислого спирта), но также и после подкожного введения. Можно сделать вывод о том, что гиалуронаты цинка защищают слизистую оболочку желудка от повреждающего действия индометацина. Более того, защитное действие гиалуронатов цинка также превосходит действие сукралфата. Результаты исследований на стрессовой модели предоставляют дальнейшее доказательство гастрозащитного действия гиалуроната цинка. Эти исследования очень важны, поскольку одной из основных причин язв, вызываемых стрессом, может быть повышенное выделение гистамина из тучных клеток, и нельзя исключить тот факт, что существенное гастрозащитное действие гиалуроната цинка против поражений, провоцируемых стрессом, вероятно, связано с его гипотетическим стабилизирующим действием на тучные клетки. 22 Результаты исследований желудочных повреждений, вызываемых фактором активации тромбоцитов, еще более поддерживают наблюдение, подтверждаемое острыми моделями, что гиалуронат цинка обладает необычным гастрозащитным действием, поскольку гиалуронат цинка защищает слизистую оболочку желудка от повреждающего действия на фактор активации тромбоцитов. Кроме того, результаты исследований предоставляют дальнейшие подтверждения того, что гиалуронат цинка обеспечивает не только физико-химический барьер для слизистой оболочки желудка, защищающий ее от повреждающего действия химических веществ местного действия, но и активирует защитные механизмы слизистой оболочки желудка. Самым важным для результатов, полученных на модели хронической язвы, вызванной уксусной кислотой, является доказательство того, что в отличие, например, от блокаторовH2, гиалуронат цинка проявляет активность не только на острых моделях, но и на моделях хронических язв. Исходя из этих результатов, можно предположить, что гиалуронат цинка стимулирует реэпителизацию и таким образом способствует заживлению язвы. Из результатов вышеописанной модели также следует, что относительно эффективности существует значительное различие между гиалуронатами цинка, имеющими различные молекулярные массы. Оказалось, что гиалуронат цинка, имеющий молекулярную массу 900000 Да, более эффективен, чем гиалуронат цинка,имеющий более высокую или более низкую молекулярную массу, что выявляет связь между молекулярной массой и активностью. Результаты экспериментов на модели язвы желудка, вызываемой индометацином, показывают, что гиалуронат, помимо своего выдающегося гастрозащитного действия, также оказывает защитное действие на кишечник, в то время как сукралфат в этом испытании совсем неэффективен. Наличие такого действия еще больше поддерживает наш вывод о том, что гиалуронат цинка - это нечто большее, чем физикохимический барьер между слизистой оболочкой и просветом кишечника. Помимо исследований эффективности гиалуронатов цинка на различных острых и хронических моделях желудка, нашей целью было выяснить, имеют ли они какое-либо нежелательное побочное действие, поэтому было проведено исследование перистальтики кишечника. Из экспериментальных результатов следует, что гиалуронат цинка не изменяет перистальтики кишечника. Это свойство, наряду с возрастанием величины ED50 на модели язвы желудка, вызываемой подкисленным этанолом,после увеличения времени предварительной обработки, дает возможность предположить, что гиалуронат цинка не прилипает к слизистой 23 оболочке желудка необратимо и, с другой стороны, он не раздражает кишечник, делая его гиперактивным. Резюме. Исходя из результатов, описанных и разъясненных выше, можно утверждать, что гиалуронат цинка может считаться сильным гастрозащитным веществом и что его эффективность превосходит эффективность сукралфата, обычно используемого для лечения пептических язв. Из исследований in vitro следует, что гиалуронат цинка ингибирует рост Helicobacterpylori. Можно сделать вывод о том, что гиалуронат цинка может быть также использован для лечения язв, вызываемых Helicobacter pylori. Благодаря своему гастрозащитному действию и одновременной активности против Helicobacter pylori гиалуронат цинка может быть использован в качестве дополнительной терапии при лечении язв, вызываемых Helicobacterpylori, или для профилактики реинфекции. В результате его применения количество антибиотиков, используемых против Helicobacter pylori,может быть снижено, а также агенты, используемые в настоящее время против Helicobacterpylori и вызывающие некоторое побочное действие, возможно, могут быть заменены. Гиалуронат цинка может быть превращен в фармацевтические композиции путем его смешивания с нетоксичными, инертными твердыми или жидкими носителями и/или другими вспомогательными средствами, обычно используемыми в терапии для энтерального введения. Подходящие носители включают, например,воду, желатин, лактозу, крахмал, пектин, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, растительные масла, такие как арахисовое масло,оливковое масло и т.п. Активный ингредиент может быть составлен в виде любой обычной фармацевтической композиции для перорального приема, полученной из порошка, получаемого известным способом, такой как таблетка, пилюля, капсула, раствор и т.п. Активное соединение предпочтительно вводят в виде концентрированного водного раствора, который может быть получен, как описано в примерах 1 и 4. Преимуществом состава в виде водного раствора является то, что для растворения активного вещества в желудочном соке не требуется времени, композиция может быть получена без добавок, а суточная доза может быть выбрана оптимально и точно. Композиции могут быть получены известным способом с применением обычной фармацевтической технологии и при желании они могут быть подвергнуты другим обычным операциям, например, стерилизации. Следующие примеры иллюстрируют композиции в соответствии с данным изобретением,а также их получение, не ограничивая наши притязания этими примерами. 24 Пример 2. Таблетки весом 200 мг, содержащие 10 мг активного ингредиента: Гиалуронат цинка Лактоза безводная Предварительно желатинизированный крахмал (Lycatos PGS) Кукурузный крахмал (Amylum maydis) Микрокристаллическая целлюлоза После обычного мокрого гранулирования активного ингредиента и добавок смесь прессуют в таблетки весом по 200 мг. Пример 3. Фармацевтическая композиция весом 200 мг, содержащая 10 мг активного ингредиента, в виде пилюль для использования в саше, флаконах или капсулах. Гиалуронат цинка Лактоза Микрокристаллическая целлюлоза Из активного ингредиента и добавок известным способом получают пилюли, например,в вихревом грануляторе. Пилюли используют в саше, флаконах или капсулах. Пример 4. Фармацевтическая композиция в виде 100 мл водного раствора, содержащая 1,0 г активного ингредиента. Гиалуронат цинка Дистиллированная вода,достаточное количество ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пероральная фармацевтическая композиция для лечения пептической язвы, включающая в качестве активного ингредиента комплекс гиалуроната цинка, имеющий молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да,в смеси с носителем и/или другими фармацевтически приемлемыми добавками. 2. Пероральная фармацевтическая композиция по п.1, включающая комплекс гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу 900000 Да. 3. Способ получения пероральной фармацевтической композиции для лечения пептической язвы, включающий смешивание в качестве активного ингредиента комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да, с носителем и/или другими фармацевтически приемлемыми добавками и превращение смеси в фармацевти 25 ческую композицию для перорального применения. 4. Применение комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да, для получения пероральной фармацевтической композиции для лечения пептической язвы. 5. Применение комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да, для лечения пептических язв, а также для предупреждения образования язв. 6. Применение комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да, для профилактики реинфекции после заживления пептической язвы, включающее введение пациенту, подлежащему профилактике, терапевтически эффективного количества комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале 500000-1200000 Да, отдельно или в виде пероральной фармацевтической композиции. 26 7. Способ лечения пептических язв, а также профилактики образования язв, включающий введение пациенту, подлежащему лечению, терапевтически эффективного количества комплекса гиалуроната цинка, имеющего молекулярную массу в интервале от 500000 до 1200000 Да, отдельно или в виде пероральной фармацевтической композиции.