Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения

СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ АНТИТЕЛА, ПРОИЗВОДНЫЕ АНТИТЕЛ И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ, КОТОРЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD154,И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к связывающим белкам, включающим антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с белком CD154 (CD40L). Также данное изобретение относится к химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу, производному антитела и фрагменту антитела, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный фрагмент Fab, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2. CD154-связывающие белки по данному изобретению могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым анти-CD154-антителом. CD154-связывающие белки по данному изобретению могут быть пригодными для диагностических и терапевтических способов, например при лечении и профилактике заболеваний, в том числе таковых, которые включают нежелательные иммунные реакции, опосредуемые взаимодействиями CD154-CD40.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК. (US); ЮСБ ФАРМА С.А. (BE) По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 60/920495, поданной 27 марта 2007, предварительной заявке на патент США 60/919938, поданной 22 марта 2007, и предварительной заявке на патент США 60/919816, поданной 22 марта 2007. Содержание заявок США 60/920495, 60/919938 и 60/919816 в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к связывающим белкам, включающим антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с белком CD154 (CD40L). Также данное изобретение относится к химерному, гуманизированному и полностью человеческому антителу, производному антитела или фрагменту антитела, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный Fab-фрагмент, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2. CD154-связывающие белки по данному изобретению могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым анти-CD154-антителом. CD154-связывающие белки по данному изобретению пригодны для диагностических и терапевтических способов, например при лечении и профилактике заболеваний, включая таковые, в развитии которых принимают участие нежелательные иммунные ответные реакции, которые опосредуются взаимодействиями CD154-CD40. Уровень техники Генерация гуморальных и клеточных иммунных реакций регулируется взаимодействием активированных Т-клеток-хэлперов с антигенпрезентующими клетками ("АРС") и эффекторными Т-клетками. Активация Т-клеток-хелперов зависит не только от взаимодействия с антигенспецифическим рецептором Т-клеток ("TCR") с его родственным пептидом-лигандом МНС, но также необходимо скоординированные связывание и активация под действием ряда адгезии клеток и костимулирующих молекул; см., например, Salazar-Fontana L.I. и Bierer B.E., 2001, Curr. Opin. Hemat. 8:5. Одной критической костимулирующей молекулой является CD154, трансмембранный белок типа II,который экспрессируется на поверхности CD4+ Т-клеток зависимым от активации, ограниченным во времени образом. CD154 также экспрессируется после активации на субпопуляции CD8+ Т-клеток, базофилах, тучных клетках, эозинофилах, природных клетках-киллерах, В-клетках, макрофагах, дендритных клетках и тромбоцитах. Противорецептором CD154, т.е. CD40, является мембранный белок типа I, который конститутивно и на высоком уровне экспрессируется на поверхности клеток многих типов, включая АРС; см., например, Foy T.M. et al., 1996, Ann. Rev. Immunol., 14:591. Сигнальный путь через CD40 с участием CD154 инициирует каскад событий, которые приводят к активации клеток, несущих CD40-рецептор, и оптимальному CD4+ Т-клеточному праймированию. Конкретнее, связывание CD154 с CD40 стимулирует дифференцировку В-клеток в секретирующие антитела клетки и В-клетки памяти; см., например, Burkly L.C., 2001, In Adv. Exp. Med. Bio., vol. 489., D.M. Monroe et al., eds., Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 135 (далее по тексту "Burkly, выше"). Кроме того,взаимодействие CD154-CD40 стимулирует развитие клеточных иммунных реакций посредством активации макрофагов и дендритных клеток и продукцию природных клеток-киллеров и цитотоксических Тлимфоцитов; см., например, Burkly, выше. Важная роль CD154 в регуляции функции гуморальных и клеточных иммунных реакций вызвала большой интерес к применению ингибиторов данного пути для терапевтической иммуномодуляции. Было показано, что анти-CD154-антитела обладают целительными свойствами на широком ряде моделей иммунного ответа на другие терапевтические белки или генную терапию, аллергены, при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации; см., например, патент США 5474771, Burkly, выше. Было показано, что взаимодействие CD40-CD154 является важным при нескольких индуцированных в эксперименте аутоиммунных заболеваниях, где было установлено, что индукцию заболевания можно блокировать антагонистами CD154 во время введения антигена (Burkly, выше). Также было показано подавление развития заболевания с использованием антагонистов CD154 на моделях спонтанного аутоиммунного заболевания на животных; см., например, Burkly, выше. В настоящее время существует потребность в усовершенствованных анти-CD154-антителах с более высокой аффинностью связывания и меньшими нежелательными побочными эффектами. Повышенные"эффекторные функции", такие как прямая цитотоксичность, комплементзависимая цитотоксичность("CDC"), антителозависимая цитотоксичность ("ADCC") и аномальная продукция антител, представляют собой нежелательные побочные эффекты, которые могут быть связаны с применением терапевтических антител. Несколько эффекторных функций антител опосредуются, по меньшей мере, частично Fcрецепторами (FcR), которые связываются с Fc-областью антитела в константном домене типичного иммуноглобулина. Существует ряд Fc-рецепторов, которые являются специфическими для различных классов иммуноглобулинов. Данные классы иммуноглобулинов включают IgG, IgE, IgA, IgM и IgD. Классы иммуноглобулинов дополнительно подразделяют на подклассы: IgG разделяют на четыре подкласса(IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и IgA подразделяют на два подкласса (IgA1 и IgA2). Существует три известных рецептора для IgG: FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). Каждый подкласс FcR кодируется двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК приводит к образованию множества транскриптов и широкому разнообразию изоформ FcR. Как правило, иммуноглобулины представляет собой молекулы Y-образной формы, содержащие две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи. Дисульфидные связи связывают вместе пары тяжелой и легкой цепей, в также две тяжелые цепи. Каждая цепь состоит из одного вариабельного домена, который варьирует по последовательности и является ответственным за связывание с антигеном; эти домены известны как VH- и VL-домены для тяжелой и легкой цепей соответственно. В легкой цепи имеется один константный домен (CL) и в тяжелой цепи находится три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Молекулы, содержащие все вариабельные и константные домены, можно отнести к целым антителам. Остатки в вариабельных доменах антитела обычно нумеруют согласно системе, разработанной Kabat et al. Данная система была представлена в Kabat et al., 1987 в Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далее по тексту "Kabat et al., выше"). Данная система нумерации используется в этом документе, за исключением тех случаев, когда указано иначе. Следует отметить, что обозначение остатков согласно системе Kabat не всегда непосредственно соответствует линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или, напротив, больше аминокислот по сравнению со строгой нумерацией по Kabat, соответствующей укорочению или вставке структурного компонента, каркасной области или определяющей комплементарность области (CDR) основной структуры вариабельного домена. Правильную нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела выравниванием гомологичных остатков в последовательности антитела со "стандартной", нумерованной по Kabat последовательностью. В вариабельных доменах имеются три области, которые являются гипервариабельными по последовательности в четырех более консервативных каркасных областях. Данные гипервариабельные области CDR в основном ответственны за распознавание антигена. Области CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены в остатках 31-35 (CDR-H1), остатках 50-65 (CDR-H2) и остатках 95-102 (CDR-H3) согласно системе нумерации Kabat. Однако согласно системе Chothia (Chothia С. and Lesk A.M., J. Mol.Biol., 1987, 196:901-917) петля, эквивалентная CDR-H1, распространяется от остатка 26 до остатка 32. Таким образом, "CDR-H1", в том смысле, в котором этот термин используется в данном документе, также включает CDR, расположенный в остатках 26-35, как описано при сочетании системы нумерации поKabat и топологического определения петли по Chothia. Области CDR вариабельного домена легкой цепи расположены в остатках 24-34 (CDR-L1), остатках 50-56 (CDR-L2) и остатках 89-97 (CDR-L3) согласно системе нумерации Kabat. Несмотря на то что природные антитела в виде целых антител или в виде фрагментов, сохраняющих специфические связывающие свойства, первоначально были получены от одного вида, генноинженерные антитела могут происходить от более чем одного вида животных, например химерные антитела. К настоящему времени, главным образом, были получены химерные мышиные/человеческие антитела и мышиные/антитела приматов, отличных от человека, хотя возможны другие видовые гибридные комбинации. В настоящее время известны многие другие конфигурации природных и генно-инженерных полипептидов антител, их производных и фрагментов. Общим свойством для всех является то, что полипептид или полипептиды сохраняют специфичность связывания антигена посредством одного или более доменов, связывающихся с эпитопом. Помимо связывания с эпитопом функциональные свойства полипептида антитела могут различаться в зависимости от того, какие другие последовательности присутствуют, например Fc-домены или другие последовательности, которые активируют эффекторные функции и/или взаимодействуют с другими клеточными путями.CD154-связывающие белки, которые содержат эпитопсвязывающие домены (такие как областиCDR или вариабельные домены), включенные в остов или каркас, отличные от иммуноглобулинов (см.,например, Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257-1268; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27), могут проявлять сниженные эффекторные функции. Желательно иметь новые связывающие белки, которые специфически препятствуют связываниюCD154 с CD40 и снижают или элиминируют в прямом направлении функции комплекса CD154-CD40. Было бы желательным иметь CD154-связывающие белки, такие как анти-CD154-антитела, с пониженными эффекторными функциями по сравнению с известными анти-CD154-антителами. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к решению данных и других проблем получением связывающего белка, такого как выделенное, рекомбинантное или синтетическое антитело, или его фрагмент или производное, которые специфически связываются с белком CD154, который может представлять собой человеческий белок CD154. Анти-CD154-антитела по изобретению, включая их фрагменты и производные,могут представлять собой моноклональные, поликлональные, мышиные, химерные, приматизированные,гуманизированные или полностью человеческие антитела. Анти-CD154-антитела по изобретению могут быть мультимерными, гетеродимерными, гемидимерными, моновалентными, бивалентными, тетравалентными, биспецифическими и могут включать одноцепочечные антитела и их производные. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки, например анти-CD154-2 019636 антитела, по настоящему изобретению обладают высокой селективностью по отношению к CD154 и в некоторых вариантах осуществления также обладают одной или более сниженными эффекторными функциями по сравнению, например, с анти-CD154-антителом 5 с 8 (продуцированным гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, как описано в патенте США 5474771; или гуманизированное антитело 5 с 8). Некоторые из CD154-связывающих белков, например анти-CD154 антитела, по изобретению являются моновалентными в отношении связывания с CD154.CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению являются пригодными для ингибирования связывания CD154 с CD40 и делают это с высокой специфичностью, например, со значением IC50 в пределах от 20 пкМ до 1,5 мкМ включительно. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки, например анти-CD154-антитела, по изобретению могут иметь значение IC50 в пределах от 20 до 500 пкМ, 50 до 500 пкМ или от 100 до 500 пкМ. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению, по существу, не оказывают агонистического действия на активность CD40. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к CD154-связывающим белкам, например анти-CD154-антителам, которые проявляют высокую аффинность к человеческомуCD154. Например, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например антиCD154-антитело, диссоциирует от человеческого CD154 (человеческого CD40L) со значением KD в пределах от 50 нМ до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например,Biacore). Например, KD для человеческого CD154 может составлять от 50 до 1 пкМ, от 20 до 1 пкМ или даже от 10 до 1 пкМ. В некоторых вариантах осуществления KD для человеческого CD154 составляет менее чем 20 пкМ. В других вариантах осуществления KD для человеческого CD154 составляет менее чем 10 пкМ. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, который, когда находится в насыщающих концентрациях или выше для связывания с CD154, основываясь на его аффинности связывания, способен блокировать связывание антитела 5 с 8 с CD154, в том случае, когда его добавляют к CD154 первым, и также способен вытеснять антитело 5 с 8, связанное с CD154, в том случае, когда его добавляют к CD154 после антитела 5 с 8. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (Н) тяжелой цепи, выбранных из CDR-H1 (SEQ IDCD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). В еще одних вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR H, которые представляют CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) и CDR-H3(SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (L) легкой цепи, выбранных из CDR-L1 (SEQ IDCD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). В еще одних вариантах осуществления CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR L, выбранных из CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) и CDR-L3 (SEQID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154 и который содержит или состоит из одной или нескольких из CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 8),и где связывающий белок или антитело дополнительно содержит или состоит из CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности VH, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белкомCD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности тяжелой цепи, выбранной из SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности VL, выбранной из SEQ ID NO: 2 и SEQ IDNO: 14. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку,-3 019636 например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности VL, выбранной из SEQ ID NO: 2 и SEQ IDNO: 11. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку,например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 15 и последовательности тяжелой цепи, выбранной из SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В других вариантах осуществленияCD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи SEQID NO: 15 и последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 13. В других вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (Н) тяжелой цепи, выбранных из CDR-H1 (SEQ IDNO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). В дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). В еще одних вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR Н, которые представляют CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) иCDR-H3 (SEQ ID NO: 44). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком CD154, где связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (L) легкой цепи, выбранных из CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). В дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ IDNO: 47). В еще одних дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR L, которые представляют CDR-L1 (SEQ IDNO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело по настоящему изобретению содержит комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких CDR легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно приведенных выше, или комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или несколькихCDR тяжелой цепи CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок или антитело по данному изобретению содержит или состоит из CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 44) иCDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, где связывающий белок или антитело содержит или состоит из следующих последовательностей трех CDR L: CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDRL3 (SEQ ID NO: 47) и где связывающий белок или антитело дополнительно содержит или состоит из следующих последовательностей трех CDR H: CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) иCDR-H3 (SEQ ID NO: 44). В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку,например антителу, который специфически связывается с CD154 и который содержит или состоит из последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 54. Также изобретение относится к CD154-связывающему белку или анти-CD154-антителу, которые содержат или состоят из последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело по изобретению может содержать или состоять из последовательности VL SEQ ID NO: 54 и последовательности VH SEQ ID NO: 56. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, который специфически связывается с CD154, где CD154 связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (H) тяжелой цепи, выбранных из CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). В дополнительных вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-H1(SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). В еще одних вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR, которые представляют CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDRH3 (SEQ ID NO: 50). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к CD154-связывающему бел-4 019636 ку, например анти-CD154-антителу, который специфически связывается с белком CD154, где CD154 связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких CDR (L) легкой цепи, выбранных из CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). В дополнительных вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух CDR, выбранных из CDR-L1(SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). В еще одних вариантах осуществления CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR L, которые представляют CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDRL3 (SEQ ID NO: 53). В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например анти-CD154 антитело, по настоящему изобретению содержит комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких CDR легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно приведенных выше, или комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких CDR тяжелой цепи CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит или состоит из CDR Н, выбранных из CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDR-H3 (SEQ IDNO: 53). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, где CD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR L, которые представляют CDR-L1 (SEQ ID NO: 51),CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), и где связывающий белок, например антитело, дополнительно содержит или состоит из последовательностей всех трех CDR H, которые представляютCDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к CD154 связывающему белку, например анти-CD154-антителу, который специфически связывается с CD154, гдеCD154-связывающий белок или анти-CD154-антитело содержит или состоит из последовательности VLSEQ ID NO: 58. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит или состоит из последовательности VH SEQ ID NO: 60. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит или состоит из последовательности VH SEQ ID NO: 60 и последовательности VL SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 62 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 65. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 63 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 71. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 69 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 72. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок содержит по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72. Последовательности CDR SEQ ID NO: 3-8 получены из крысиного моноклонального антитела 342. В альтернативном варианте осуществления изобретения анти-CD154-антитело представляет собой крысиное антитело 342, содержащее последовательность VH-домена SEQ ID NO: 29 и последовательностьVL-домена SEQ ID NO: 30. Также изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32. Дополнительно предоставляется вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. Также изобретение относится к CD154-связывающим белкам, например анти-CD154-антителам, которые селективно связываются с тем же самым эпитопом, что и любое из анти-CD154-антител, раскрытых в данном документе (например, антитела 342, 381 и 338 и их связывающиеся с эпитопом последовательности). В частности, антитела 342 и 338 по настоящему изобретению проявляют аналогичные связывающие CD154 свойства, когда используются в качестве первого или второго антител в конкурентных тестах с анти-CD154-антителом 5 с 8, как описано в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к CD154 связывающим белкам и анти-CD154-антителам, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 12 или SEQ IDNO: 13 и содержащее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 15 (Fab- и Fab'-фрагменты 342), и которое проявляет аналогичные связывающие CD154 свойства в том случае, когда используются в качестве первых или вторых антител в конкурентных тестах с анти-CD154-антителом 5 с 8, как описано в данном документе. В других вариантах осуществления изобретение относится к CD154-связывающим белкам и анти-CD154-антителам, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность VL-домена SEQ ID NO: 58 и последовательность VH-доменаSEQ ID NO: 60 (вариабельные последовательности антитела 338), и которые проявляют аналогичные связывающие CD154 свойства в конкурентных тестах с анти-CD154-антителом 5 с 8, как описано в данном документе. В любом из описанных выше вариантов осуществления, относящихся к CD154-связывающему белку по изобретению, связывающий белок может быть ПЭГилирован. В вариантах осуществления, в которых CD154-связывающий белок является анти-CD154-антителом, полипептидом антитела или его фрагментом или производным, антитело может быть ПЭГилировано в тяжелой цепи, легкой цепи или обеих цепях. Также настоящее изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение также относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 и SEQ IDNO: 73. В еще одних вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 41. Также данное изобретение относится к вектору, который содержит любую из молекул выделенной,рекомбинантной и/или синтетической ДНК по данному изобретению. В одном варианте осуществления вектор содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 41. В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК,содержащей или состоящей из обеих последовательностей SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 57. В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК,содержащей или состоящей из обеих последовательностей SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 61. В любом из вариантов осуществления изобретения, относящихся к CD154-связывающим белкам и анти-CD154-антителам, которые содержат последовательности, вносящие свой вклад в обеспечение эффекторных функций, указанные связывающие белки и анти-CD154-антитела могут быть дополнительно выбраны или сконструированы для проявления пониженной эффекторной функции по сравнению с антиCD154-антителом с Fc-областью, как описано в данном документе. Например, CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела, которые не содержат последовательностей Fc-области или константной области или у которых отсутствуют последовательности функциональных Fc-области или константной области, могут быть выбраны для использования по данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела по изобретению являются моновалентными в отношении связывания с CD154 и предпочтительно проявляют пониженные эффекторные функции при введении субъекту по сравнению с CD154-связывающим белком сравнения, таким как бивалентное анти-CD154-антитело. В некоторых других вариантах осуществления последовательности Fc-области или константной области, если они присутствуют в CD154-связывающем белке, например полипептиде анти-CD154 антитела, могут быть выбраны или сконструированы для содержания одной или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок, аддуктов или делеций), что приводит к снижению или элиминации одной или более эффекторных функций по сравнению с контрольным анти-CD154-антителом, содержащим нативные, исходные или немодифицированные последовательности Fc-области или константной области. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения Fc-область, в том случае, когда она имеется, представляет собой Fc-область из или полученную из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 антитела. В некоторых вариантах осуществления можно использовать гибридные Fc-области, т.е. IgG1/IgG4 гибридные Fc-последовательности. В конкретных вариантах осуществления Fc-область содержит Fcпоследовательности IgG4 или она получена из IgG4-антитела. Необходимо понимать, что можно использовать любую гибридную комбинацию между различными Fc-областями, которая приводит к снижению одной или более эффекторных функций по данному изобретению. В некоторых других вариантах осуществления уменьшают или элиминируют гликозилирование Fcобласти антитела или изменяют профиль гликозилирования антитела, как описано далее в данном документе. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок или полипептид анти-CD154-6 019636 антитела содержит CH2-домен с Fc-областью, содержащей модификацию с модификацией в или вблизи консервативного сайта N-связанного гликозилирования. Модификация в консервативном сайте Nсвязанного гликозилирования может включать мутацию в или вблизи сайта гликозилирования тяжелой цепи, где мутация снижает, изменяет или предупреждает гликозилирование в сайте. В дополнительных вариантах осуществления модификация включает мутацию N298Q (N297 при использовании EU нумерации Kabat). В некоторых вариантах осуществления модификация включает удаление гликанов в CH2 домене или их фрагментах. Внекоторых альтернативных вариантах осуществления модификация предупреждает образование зрелого N-гликана в сайте гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, содержащему последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 5, 44 и 50, и вариантную Fc-область, где вариантная Fc-область содержит первый аминокислотный остаток и сайт N-гликозилирования, где первый аминокислотный остаток модифицирован изменением боковой цепи или аминокислотной заменой для достижения повышенного стерического размера или повышенного электростатического заряда по сравнению с немодифицированным первым аминокислотным остатком, со снижением тем самым уровня или изменением иным образом гликозилирования в сайте N-гликозилирования. В некоторых из данных вариантов осуществления вариантная Fcобласть придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с контрольной, невариантной Fcобластью. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к CD154-связывающему белку, например анти-CD154-антителу, содержащему последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную изSEQ ID NO: 5, 44 и 50, и вариантную Fc-область, где вариантная Fc-область содержит первый аминокислотный остаток и сайт N-гликозилирования, где первый аминокислотный остаток содержит тиол цистеин со снижением тем самым уровня или изменением иным образом гликозилирования в сайте Nгликозилирования, где вариантная Fc-область придает пониженную эффекторную функцию. В некоторых вариантах осуществления первый аминокислотный остаток и сайт Nгликозилирования анти-CD154-антител, содержащиих вариантные Fc-области, описанные выше, находятся вблизи или в мотиве N-связанного гликозилирования. В дополнительных вариантах осуществления мотив N-связанного гликозилирования содержит аминокислотную последовательность NXT или NXS. В некоторых вариантах осуществления мотив N-связанного гликозилирования содержит аминокислотную последовательность NXT. В некоторых вариантах осуществления сайт N-гликозилирования расположен в аминокислоте 297 по системе нумерации Kabat. В дополнительных вариантах осуществления первый модифицированный аминокислотный остаток представляет аминокислоту 299 по системе нумерацииKabat. В некоторых из описанных выше вариантов осуществления пониженная эффекторная функция,проявляемая любым из антител или фрагментов антител, содержащих связывающие белки, описанные в данном документе, представляет пониженное связывание с Fc-рецептором (FcR). В некоторых вариантах осуществления Fc-рецептор (FcR) выбран из FcRI, FcRII и FcRIII и одного или более их подтипов,например, таких как FcRIIa. В некоторых вариантах осуществления связывание с FcR ниже по меньшей мере примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более, примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более,примерно в 8 раз или более, примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более, примерно в 15 раз или более, примерно в 50 раз или более или примерно в 100 раз или более. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например анти-CD154 антитело, по изобретению с одной или более пониженными эффекторными функциями, описанными в данном документе, не связывается со специфическим эффекторным рецептором или подтипом эффекторного рецептора. В некоторых из данных вариантов осуществления CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, не связывается с FcRIIa. В некоторых вариантах осуществления пониженная эффекторная функция, проявляемая любым одним из антител, описанных в данном документе, представляет пониженное связывание с белком комплемента. В некоторых вариантах осуществления белок комплемента представляет C1q. В некоторых вариантах осуществления связывание с белком комплемента ниже по меньшей мере примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более, примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более, примерно в 8 раз или более,примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более, примерно в 15 раз или более. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения CD154-связывающий белок,например анти-CD154-антитело, по изобретению содержит одну или более модификаций или вариацийFc-области, не гликозилирован и проявляет одну или более пониженных эффекторных функций при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например анти-CD154 антитело, по изобретению вызывает меньше тромбоэмболических осложнений по сравнению с введением анти-CD154-антитела 5 с 8 при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированный первый аминокислотный остаток CD154-связывающих белков или анти-CD154-антител, содержащих вариантные Fcобласти, описанные в данном документе, связан с функциональной группой. В дополнительных вариантах осуществления функциональная группа представляет блокирующую группу, детектируемую группу,диагностическую группу или терапевтическую группу или их комбинации. Блокирующая группа в некоторых вариантах осуществления может представлять, например, цистеиновый аддукт, смешанный дисульфид, полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. Детектируемая группа в некоторых вариантах осуществления может представлять, например, флуоресцентную группу, люминесцентную группу или изотопную группу. В вариантах осуществления, в которых используется диагностическая группа, эта диагностическая группа может быть способной выявлять наличие состояния, заболевания или нарушения. В других вариантах осуществления можно использовать терапевтическую группу, например, такую как противовоспалительное средство, противоопухолевое средство, средство для лечения нейродегенеративного заболевания, антитело, которое является селективным для молекулы, отличной отCD154, или противоинфекционное средство. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, содержит модифицированный аминокислотный остаток, где модификация обеспечивает сайт-направленное конъюгирование белка или антитела с функциональной группой, такое как сайт-направленное пэгилирование. В некоторых вариантах осуществления модифицированный аминокислотный остаток представляет остаток цистеина, модифицированный цистеиновым или смешанным дисульфидным аддуктом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок представляет полипептид анти-CD154-антитела, который пэгилирован по модифицированному аминокислотному остатку, например по остатку цистеина или лизина. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело является Fab- или Fab'-фрагментом, пэгилированным ПЭГ-малеимидом. Также данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, например последовательностям ДНК,кодирующим CD154-связывающие белки, например анти-CD154-антитела, по изобретению. Последовательности ДНК по настоящему изобретению могут включать синтетическую ДНК, например, полученную химической обработкой, кДНК, геномную ДНК или любую их комбинацию. Данное изобретение дополнительно относится к клонирующим или экспрессирующим векторам, содержащим одну или более нуклеиновых кислот, например последовательности ДНК по настоящему изобретению. Также изобретение относится в некоторых вариантах осуществления к вектору, содержащему любую из синтетических, выделенных и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот, описанных выше. Данное изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей последовательность ДНК или вектор по изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу полученияCD154-связывающего белка, например анти-CD154-антитела, включающему культивирование клеткихозяина, содержащей любой из векторов, описанных выше, в условиях, подходящих для продукцииCD154-связывающего белка или анти-CD154-антитела клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления способ включает выделение CD154-связывающего белка или анти-CD154-антитела из культуры клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, анти-CD154-антитело или нуклеиновую кислоту по данному изобретению метят детектируемым маркером, который может представлять собой радиоактивный изотоп, фермент, краситель или биотин. В некоторых других вариантах осуществления антитело по данному изобретению конъюгируют по меньшей мере с одним другим терапевтическим средством, которое, например, может представлять радиоактивный изотоп, радионуклид, токсин, токсоид, полипептид или фрагмент не специфического к CD154 антитела (например, получив при этом биспецифическое или мультиспецифическое антитело) или химиотерапевтическое средство. В еще одних вариантах осуществления антитело по данному изобретению конъюгируют с визуализирующим агентом, который может представлять группу для мечения. Агент для мечения также может представлять биотин, флуоресцентную или люминесцентную группу, радиоактивную группу, гистидиновую метку или пептидную метку. Также настоящее изобретение относится к вариантам последовательностей CD154-связывающих белков, например анти-CD154-антител, описанных в данном документе, последовательностям нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Варианты последовательностей по изобретению предпочтительно обладают по меньшей мере 90, 91, 92, 93 или 94% идентичностью с полипептидом по изобретению или с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует его. Более предпочтительно вариант последовательности обладает по меньшей мере 95, 96, 97 или 98% идентичностью на уровне аминокислот или нуклеиновых кислот. Наиболее предпочтительно вариант последовательности по изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере 99, 99,5, 99,9% идентичностью с полипептидом по изобретению или с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует его. Следовательно, настоящее изобретение относится к выделенному белку, содержащему последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 или SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления полипептид химерного, гуманизированного или человеческого анти-CD154-антитела по изобретению представляет, например, dAb, Fab, Fab', scFv, Fv, связанный через дисульфид Fv, или содержит один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как VH- илиVL-домен, который является специфическим или моновалентным в отношении связывания CD154. Некоторые CD154-связывающие белки, например полипептиды химерных, гуманизированных или человеческих анти-CD154-антител по изобретению, содержат одну, две или более областей CDR по изобретению и альтернативный остов или универсальные каркасные последовательности. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела по изобретению содержат единственный вариабельный домен, выбранный из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL). Также изобретение относится к CD154-связывающему белку, например полипептиду химерного,гуманизированного или человеческого анти-CD154-антитела, которое является моновалентным в отношении связывания с CD154, которое конъюгировано с функциональной группой, которая приводит к повышению его времени полужизни в условиях in vivo по сравнению с тем же полипептидом без функциональной группы. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа включает или состоит из полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа включает или состоит из молекулы альбумина, такого как человеческий сывороточный альбумин. Следовательно,изобретение относится к связанному с ПЭГом CD154-связывающему белку, например связанному с ПЭГом полипептиду химерного, гуманизированного или человеческого анти-CD154-антитела, которое специфически и моновалентно связывается с CD154, и который имеет увеличенное время полужизни в условиях in vivo по сравнению с тем же полипептидом без связанного полиэтиленгликоля. Также данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, по настоящему изобретению,которая может в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно дополнительно содержать дополнительное биологически активное соединение или терапевтическое средство, например,такое как иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение или средство, или диагностическое средство. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит терапевтически эффективное количество пэгилированного анти-CD154-Fab'-антитела, обладающего специфичностью к эпитопу анти-CD154-антитела 342 или 338, описанных в данном документе. Дополнительно настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояния,нарушения, заболевания у человека, опосредованного в целом или частично сигнальным путем с участием CD40, или симптома любого из упомянутого выше, где способ включает стадию введения субъекту,нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, по настоящему изобретению,таким образом, что обеспечивается лечение или профилактика состояния, заболевания или нарушения. Также данное изобретение относится к способу ингибирования или профилактики иммунной, аутоиммунной или воспалительной ответной реакции, опосредованной в целом или частично сигнальным путем с участием CD40, или симптома любого из упомянутого выше, где способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, по настоящему изобретению, таким образом, что обеспечивается терапевтическая или профилактическая ответная реакция. В некоторых вариантах осуществления способ используют для лечения субъекта, имеющего симптомы или которому поставлен диагноз системной красной волчанки (SLE). В других вариантах осуществления способ используют для лечения субъекта, имеющего симптомы или которому поставлен диагноз ревматоидного состояния, например, такого как ревматоидный артрит (RA). Данное изобретение относится к полипептиду человеческого антитела, который является моновалентным в отношении связывания с CD154. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела, который является моновалентным в отношении связывания с CD154, когда находится в насыщающих концентрациях или выше для связывания с CD154, основываясь на его аффинности связывания, блокирует связывание антитела 5 с 8 с CD154 в том случае, когда его добавляют к CD154 первым, и вытесняет антитело 5 с 8, связанное с CD154, в том случае, когда его добавляют после антитела 5 с 8. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела связан с ПЭГом. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела не содержит Fc-домена. В некоторых из описанных выше вариантов осуществления CD154-связывающий белок или полипептид человеческого антитела не вытесняет CD154, связанный с CD40. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к пэгилированному анти-CD154Fab'-антителу, которое является моновалентным в отношении связывания с CD154 и дополнительно от-9 019636 носится к способам лечения или профилактики одного или более симптомов артрита, такого как ревматоидный артрит, или системной красной волчанки (SLE), включающим стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей пэгилированное анти-CD154-Fab'-антитело, таким образом, что обеспечивается терапевтическая или профилактическая ответная реакция. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена таблица с аминокислотными последовательностями определяющих комплементарность областей (CDR) анти-CD154-антител 342, 381 и 338. На фиг. 2 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями VH- и VL-доменов крысиного анти-CD154-антитела 342. Подчеркнутые последовательности соответствуют нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный (т.е. сигнальный) пептид. На фиг. 3 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями человеческих акцепторных каркасных областей, использованных для получения гуманизированных анти-CD154-антител в примерах. На фиг. 4 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями VH- и VL-доменов, в которых CDR антитела 342 были пересажены в каркасные области,приведенные на фиг. 3. На фиг. 5 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями VH-доменов антитела 342 (VH3 gH1 и VH4 gH1), в которых CDR антитела 342 были пересажены в человеческие акцепторные каркасные области и в которых были сохранены некоторые ключевые донорные остатки. На фиг. 6 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями домена VL антитела 342 (VK1 gL1), в которых CDR антитела 342 были пересажены в человеческие акцепторные каркасные области и в которых были сохранены некоторые ключевые донорные остатки. На фиг. 7 представлена таблица с последовательностями для полной легкой цепи (вариабельной и константной областей легкой цепи) и областей тяжелой цепи антитела 342. Подчеркнуты последовательности, соответствующие сигнальному/лидерному пептидам. На фиг. 8 показана нуклеотидная последовательность экспрессирующих инсертов, которые использовали для получения вариантов Fab (SEQ ID NO: 28) и Fab' (SEQ ID NO: 41) пересаженного 342 gL4gH1. Подчеркнуты сигнальная/лидерная последовательности и выделены заглавными буквами и жирным шрифтом сайты рестрикции (использованные для клонирования в экспрессирующий вектор Е. coli, как описано в примере 2). На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотной последовательности легкой и тяжелой цепей крысиного анти-CD154-антитела 342 (донорного антитела) с человеческими каркасными (акцепторными) областями зародышевой линии, использованными при гуманизации антитела 342. "Легкая цепь антитела 342" представляет собой последовательность крысиного VL-домена. "Тяжелая цепь антитела 342" представляет последовательность крысиного VH-домена. Остатки CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Показаны акцепторная каркасная область легкой цепи (2 1 1 О 12; SEQ ID NO: 35) и тяжелой цепи (1-1 3-66; SEQ ID NO: 37 и 1-1 4-59; SEQ ID NO: 39). Также показаны только пересаженные CDR в человеческие акцепторные каркасные области зародышевой линии (VK1 gL3, VH3 gH7 и VH4 gH6). В некоторых гуманизированных тяжелых и легких цепях сохраняются донорные остатки антитела 342 в каркасной области и данные ключевые остатки донорной каркасной области выделены курсивом и жирным шрифтом. Донор VK1 gL4 представляет R38, Y71 и S85. Донор VH3 gH1 представляет V24, M48,G49, Т 83 и V78. Донор VH4 gH1 представляет М 48, R71 и V78. Приведены SEQ ID NO для легких цепей в порядке сверху вниз: SEQ ID NO: 30 ("342"), SEQ ID NO: 35 ("2 1 1 О 12"), SEQ ID NO: 14 ("342 gL3") иSEQ ID NO: 2 ("342 gL4"). Приведены SEQ ID NO для тяжелых цепей (пересаженные VH3) в порядке сверху вниз: SEQ ID NO: 29 ("342"), SEQ ID NO: 37 ("1-1 3-66"), SEQ ID NO: 10 ("342 gH7") и SEQ IDNO: 1 ("342 gH1"). Приведены SEQ ID NO для тяжелых цепей (пересаженные VH4) в порядке сверху вниз: SEQ ID NO: 29 ("342"), SEQ ID NO: 39 ("1-1 4-59"), вариант SEQ ID NO: 9 ("VH4 gH6" (SEQ ID NO: 74 и вариант SEQ ID NO: 11 ("VH4 gH1" (SEQ ID NO: 75. Варианты SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11,приведенные на фиг. 9, начинаются с аминокислоты "Е" (вместо "Q", как имеет место соответственно на фиг. 4 и 5) для экспрессии в Е. coli. Следовательно, нуклеотидные последовательности, которые соответствуют данным мутантным SEQ ID NO: 9 и 11, отличаются от нуклеотидных последовательностей SEQID NO: 19 и SEQ ID NO: 21 в том, что они начинаются с нуклеотида "g" вместо "с". На фиг. 10 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательностиVH- и VL-доменов анти-CD154-антитела 381. Подчеркнуты аминокислотные последовательности CDR. На фиг. 11 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательностиVH- и VL-доменов анти-CD154-антитела 338. Подчеркнуты аминокислотные последовательности CDR. На фиг. 12 представлена таблица с перечнем крысиных антител против человеческого CD154, выделенных методом отбора антител лимфоцитов (SLAM). В таблице приведены значения Kd и IC50, полученные для данных антител при постановке анализа Biacore, тестов со связыванием CD40 и тестов по активации ICAM-1. Выделены данные, полученные с антителом 342. На фиг. 13 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности легкой каппа-цепи агликозилированного анти-CD154-антитела hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4). На фиг. 14 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности тяжелой цепи агликозилированного анти-CD154-антитела hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4). Введенные мутации для получения агликозилированного варианта (S228P/T299A согласно EU номенклатуре Kabat; остатки 226 и 297) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом в последовательности зрелого белка. На фиг. 15 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности легкой каппа-цепи агликозилированного анти-CD154-антитела hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). На фиг. 16 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности тяжелой цепи агликозилированного анти-CD154-антитела hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). Введенные мутации для получения агликозилированного варианта (S228P/T299A согласно номенклатуре Kabat EU; остатки 226 и 297) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом в последовательности зрелого белка. На фиг. 17 приведены примерные Fab'-фрагменты и гель, показывающий сайт-направленное ПЭГилирование Fab'-фрагмента анти-CD154-антитела. Fab'-фрагмент пэгилировали взаимодействием ПЭГмалеимида с одним остатком цистеина в шарнирной области. На фиг. 18 представлена таблица со значениями Kd и IC50, полученными при постановке анализаBiacore, тестов со связыванием CD40, тестов по активации ICAM-1 и конкурентных тестов с CD40 для различных вариантов осуществления гуманизированного антитела 342 gL4gH1, включая Fab'-фрагменты и конъюгаты антитело-ПЭГ. На фиг. 19 приведено два графика значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) IgG как функция времени у макак циномолгус, которые получали контрольный физиологический раствор или различные дозы анти-CD154-антитела. На верхнем графике приведены значения титра IgG для периода 0-20 суток после введения антитела и заражения ТТ (первичный иммунный ответ) и на нижнем графике приведены значения для периода 30-50 суток после введения антитела и второго заражения ТТ на 30 сутки. На фиг. 20 приведен график значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) IgG как функцию времени у макак циномолгус, которые получали различные форматы анти-CD154-антител в однократной дозе (20 мг/кг для hu5c8, агликозильного антитела 5 с 8 и агликозильного антитела 342 и 40 мг/кг для 342Fab'-ПЭГ и 342 DFM-ПЭГ). DFM-ПЭГ представляет фрагмент антитела, в котором два Fab'-фрагмента сшиты пэгилированным дималеимидным мостиком. На фиг. 21 приведен график значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) IgM как функцию времени у макак циномолгус, которые получали контрольный физиологический раствор или различные дозы анти-CD154-антитела. На графике приведены значения титра IgM для периода 0-20 суток после стимуляции ТТ (первичный ответ). На фиг. 22 приведены сравнительные данные по фармакокинетике антитела 342 Fab'-ПЭГ и антитела hu5c8 у макак циномолгус. На фиг. 23 приведены результаты анализа проточной цитометрией перекрестного блокирования связывания меченого 342 Fab' с экспрессирующими CD154 клетками Jurkat D1.1, предварительно связанными с немеченым первым анти-CD154 Fab', как указано на каждой панели (23 А - А 33; 23 В - 338; 23C 402; 23D - 381; 23E - 300; 23F - 294; 23G - 335; 23 Н - 303) (см. пример 9). А 33 представляет подобранное по изотипу контрольное антитело, и показано, что в данном случае неспецифическое перекрестное блокирование отсутствует. На фиг. 24 приведены результаты анализа проточной цитометрией перекрестного блокирования связывания меченого Hu5c8 Fab' с экспрессирующими CD154 клетками Jurkat D1.1, предварительно связанными с немеченым первым анти-CD154-Fab', как указано на каждой панели (24 А - 338; 24 В - 402; 24C - 381; 24D - 303; 24E - 335; 24F - 300; 24G - 294; 24 Н - А 33) (см. пример 9). А 33 представляет подобранное по изотипу контрольное антитело, и показано, что в данном случае неспецифическое перекрестное блокирование отсутствует. На фиг. 25A-F приведены результаты анализа конкурентного связывания с использованиемBiacore различных форм антител 342 и hu5c8 с растворимым белком CD154 (ECD) или комплексомCD40:CD154. FL-полноразмерное антитело. CD40hFc - человеческий слитый белок CD40. На фиг. 26 приведен график, показывающий результаты теста агрегации тромбоцитов, описанного в примере 11 (тест 1), который был проведен с hu5c8 анти-CD154-антителом, 342 Fab'-ПЭГ анти-CD154 антителом и контрольным антителами. На первой панели приведены результаты, полученные с комплексами CD40L, образованными цельным IgG, и на второй панели комплексы, образованные Fab'-ПЭГ или ди-Fab'-ПЭГ. На третьей панели приведены результаты, полученные с три-Fab'-ПЭГ и агликозилированным анти-CD154-антителом hu342. На фиг. 27 приведен график, показывающий результаты теста агрегации тромбоцитов, описанного в примере 11 (тест 2), который был проведен с положительными и отрицательными контрольными антителами. Результаты показывают, что агрегация тромбоцитов специфически усиливается под действием комплексов положительного контрольного анти-CD154-антитела и рекомбинатного человеческого рас- 11019636 творимого CD40L (sCD154). На фиг. 28 показано выравнивание аминокислотных последовательностей человеческого (SEQ IDNO: 76) и мышиного растворимого CD40L (SEQ ID NO: 77). Различия между человеческими и мышиными последовательностями указаны красным цветом. Последовательности эпитопа Hu5c8 указаны синим цветом. Внутренние остатки отмечены чертой . Отобрано шесть областей (1-6) последовательности,где человеческие последовательности были введены в растворимый мышиный CD40L. На фиг. 29 приведены результаты постановки конкурентной ELISA для демонстрации перекрестного блокирования 342 Fab' и hu5c8 Fab' (см. пример 14). На фиг. 29 А приведены результаты титрования биотин-342 Fab' на CD154. Концентрация 1 нМ находится в линейной части кривой. На фиг. 29 В приведены результаты титрования биотин-hu5 с 8 Fab' на CD154. Концентрация 0,3 нМ находится в линейной части кривой. На фиг. 29 С показано перекрестное блокирование биотин-342 и биотин-5 с 8 под действием немеченого 342 Fab'. Ch342 Fab представляет собой химерный 342 Fab'. На фиг. 29D показано перекрестное блокирование биотин-342 под действием немеченого 5 с 8 Fab'. Подробное описание изобретения Для более полного понимания описанного в данном документе изобретения ниже приводится подробное описание. Если не указано иначе, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Ниже описаны примерные методы и материалы, хотя в практике настоящего изобретения также можно использовать методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, и они понятны специалистам в данной области. В данном изобретении имеются обращения к различным патентам, публикациям и литературным источникам. Раскрытие данных патентов, публикаций и литературных источников в полном объеме включено в данный документ для сведения. Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы технологии рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области, включают Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John WileySons, New York (1998 and Supplements to 2001); Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York(1991). Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы иммунологии,известные специалистам в данной области, включают Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999) и Roitt et al., Immunology, 3dEd., Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993). Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы медицинской физиологии и фармакологии, известные специалистам в данной области, включают Fauci et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-HillCompanies, Inc. (1998). Определения. В том смысле, в котором термин "CD154-связывающий белок" используется в данном документе,то он включает любую молекулу, в том числе антитело, которая специфически связывается или обладает антагонистическим действием по отношению к CD154. Таким образом, в том смысле, в котором данный термин используется в данном документе, то анти-CD154-антитело представляет один класс белков, специфически связывающихся с CD154. CD154-связывающий белок по изобретению может включать по меньшей мере одну, предпочтительно две, три или более CDR, раскрытых в данном документе. CD154 связывающий белок или другой такой антагонист CD154 может включать молекулы, которые не являются классическими фрагментами или производными антител, но которые, тем не менее, содержат аминокислотные последовательности и/или химические структуры, которые придают специфичность связывания с эпитопом CD154. Такие антагонисты CD154 можно получить, например, из альтернативных остовов (см., например, Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257-1268 и Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:1427). Такой CD154-связывающий белок или антагонист может быть слит с Fc-областью антитела, которая в функциональном отношении является недостаточной, или с гетерологичной функциональной группой,описанной в данном документе, в целях повышения времени полужизни и/или улучшения других in vivo свойств CD154-связывающего белка.CD154-связывающие белки могут содержать по меньшей мере одну из CDR, описанных в данном документе, включенную в биологически совместимую каркасную структуру. В одном примере биологически совместимая каркасная структура включает полипептид или его фрагмент, который является достаточным для образования конформационно стабильной структурной подложки или каркаса, или остова,который способен к размещению одной или более последовательностей аминокислот, которые связываются с антигеном (например, CDR, вариабельный домен и т.д.) в локализованной области поверхности. Такие структуры могут представлять природный полипептид или "складку" полипептида (структурный мотив), или могут иметь одну или более модификаций, таких как добавления, делеции или замены аминокислот по сравнению с природным полипептидом или "складкой" полипептида. Данные остовы можно получить из полипептида от любого вида (или от более чем одного вида), такого как человек, другое млекопитающее, другое позвоночное, беспозвоночное, растение, бактерия или вирус. Как правило, биологически совместимые каркасные структуры основаны на белковых остовах или скелетах иных, чем иммуноглобулиновые домены. Например, можно использовать таковые на основе доменов фибронектина, анкирина, липокалина, неокарзиностатина, цитохрома b, CPI "цинкового пальца", PSTI, закрученной спирали, LACI-DI, Z-домена и домена тендамистата (см., например, Nygren andUhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469). В том смысле, в котором термин "антитело" используется по отношению к изобретению, то он включает выделенное, рекомбинантное или синтетическое антитело, конъюгат антитела или производное антитела. Термин "антитело" часто предназначается для включения фрагмента антитела, в том числе антигенсвязывающего фрагмента, если не указано иначе или понимается иначе по контексту. Антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание; см. в общемFundamental Immunology, Ch. 7 (Paul W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989. Антигенсвязывающие фрагменты можно получить методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты включают Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, однодоменные антитела (dAb), другие моновалентные и дивалентные фрагменты, определяющие комплементарность области (CDR), одноцепочечные антитела(например, scFv, scFab и scFabC), химерные антитела, диантитела (diabody), триантитела (triabody), миниантитела (minibody), наноантитела (nanobody) и полипептиды, которые содержат, по меньшей мере,фрагмент антитела, который является достаточным для придания способности к специфическому связыванию антигена с полипептидом; и слитые конструкции и производные описанного выше; см., например,Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23:1126-1136 (2005) и Hust et al., BMC Biotech., 7:14 (2007)."Fd-фрагмент" представляет фрагмент антитела, который состоит из VH и CH1-доменов; "Fvфрагмент" состоит из VL и VH-доменов одного плеча антитела; "scFv-фрагмент" представляет одноцепочечное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), соединенные пептидным линкером; "scFab-фрагмент" является одноцепочечным антителом,содержащим фрагмент трудный (Fd), соединенный с легкой цепью посредством пептидного линкера;"scFabС"-фрагмент представляет вариант scFab без цистеина (см., например, Hust et al., выше) и "dAbфрагмент" (однодоменное антитело) содержит один вариабельный домен (например, VH- или VL-домен)(Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989. Кроме того, сюда входят диантитела и триантитела. Диантитела и триантитела по настоящему изобретению включают, например, гомодимерные и гетеродимерные диантитела и триантитела. Например, в некоторых вариантах осуществления вариабельные домены, входящие в состав триантитела, могут связываться с тремя различными эпитопами или с идентичными эпитопами. Если не указано иначе или понимается иначе по контексту, то "антитело" по настоящему изобретению включает целые антитела и их любые антигенсвязывающие фрагменты, производные и варианты антител, которые могут содержать одну или более модификаций (например, аминокислотную вставку,делецию, замену, посттрансляционную модификацию или ее отсутствие и т.д.), включая конъюгаты антител (т.е. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные или связанные с функциональной группой). Производные антител, включая конъюгаты антител, могут быть основаны на или могут содержать антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, который специфически связывается сCD154. Кроме того, описанные выше варианты осуществления антител могут представлять мышиные антитела, антитела хомяка, козьи, кроличьи, химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела, их фрагменты, производные или конъюгаты. Очевидно, понятно, что в некоторых аспектах изобретения термин "антитело" может исключать один или более вариантов осуществления антитела,упомянутых выше; такие обстоятельства будут понятны специалистам в данной области. Термины "пэгилирование", "полиэтиленгликоль" или "ПЭГ" включают полиалкиленгликоль или его производное с или без применения сочетающих агентов или дериватизации сочетающими или активирующими группами (например, тиолом, трифлатом, трезилатом, азирдином, оксираном или предпочтительно малеимидом, например ПЭГ-малеимидом). Другие соответствующие полиалкиленгликоли включают, не ограничиваясь этим, малеимидомонометокси-ПЭГ, активированный ПЭГ пропиленгликоль, но также заряженные или нейтральные полимеры следующих типов: декстран, коломиновая кислота или другие полимеры на основе углеводов, полимеры аминокислот и биотин и другие производные аффинных реагентов. Термин "эффекторная функция" относится к функциональной способности Fc-области или константной области антитела связываться с белками и/или клетками иммунной системы. В данной области хорошо известны антитела с пониженной эффекторной функцией и методы конструирования таких антител (см., например, WO 05/18572, WO 05/03175 и патент США 6242195) и они подробно описаны в данном документе. Типичные эффекторные функции включают способность связываться с белком комплемента (например, белком комплемента C1q) и/или Fc-рецептором (FcR) (например, FcRI, FcRII,FcRIIa, FcRIII и/или FcRIIIb). Функциональные последствия способности связываться с одной или более указанных выше молекул включают, не ограничиваясь этим, опсонизацию, фагоцитоз, антигензависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и/или модификацию эффекторных клеток. Снижение эффекторной функции относится к снижению одной или более биохимической или клеточной активности, идуцированной, по меньшей мере, частично связыванием Fc с его близким рецептором или белком комплемента, или эффекторной клеткой, с одновременным сохранением антигенсвязывающей активности вариабельной области антитела (или его фрагмента),тем не менее, с пониженной, аналогичной, идентичной или повышенной аффинностью связывания. Конкретные антитела по изобретению проявляют пониженную эффекторную функцию. Снижение эффекторной функции, например связывания Fc-области с Fc-рецептором или белком комплемента, может выражаться в кратном снижении (например, снижении в 1,5 раза, 2 раза и т.п.) и его можно рассчитать, основываясь, например, на процентном снижении активности связывания по данным тестов оценки связывания, известных в данной области (см., например, заявку WO 05/18572). Если не требуется иначе по контексту, то термины в единственном числе будут включать термины во множественном числе, и термины во множественном числе будут включать термины в единственном числе. В данном описании и формуле изобретения слово "содержать" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", означают включение определенного целого числа или группы целых чисел, но не означает исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.CD154 известен в данной области под несколькими другими названиями, такими как лиганд CD40(CD40L), CD40 противорецептор (CD40CR), gp39, T-BAM, активирующая Т-клетки молекула, TRAF,TNF-связанный белок активации (TRAP) и член 5 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей(TNFSF5) (Gauchat et al., 1993, FEBS Lett., 315:259-266; Graf et al., Europ. J. Immun., 22:3191-3194; Hollenbaugh et al., 1992, EMBO J., 11:4313-4321). В изобретении данные термины используются взаимозаменяемо. CD154-связывающие белки, включая антитела, по данному изобретению специфически связываются с человеческим CD154 и могут перекрестно реагировать и, следовательно, специфически связываться с CD154 других видов. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки, включая антитела, по данному изобретению специфически связываются с человеческим CD154, мышинымCD154 или CD154 примата, не относящегося к человеку. Анти-CD154-антитела и CD154-связывающие белки. В том смысле, в котором термин "анти-CD154-антитело" используют в данном документе, он относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфически связываться с эпитопом в антигенеCD154. Анти-CD154-антитела могут представлять интактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и они могут представлять иммунореактивные участки интактных иммуноглобулинов. Как правило, антитела являются тетрамерами иммуноглобулиновых молекул. Следовательно, и это относится ко всем вариантам осуществления или способам по данному изобретению, "анти-CD154-антитело" включает (если не указано иначе или в случаях, когда это следует понимать иначе по контексту) моноклональное антитело, поликлональное антитело, мышиное антитело,антитело хомяка, козье антитело, кроличье антитело, химерное антитело, приматизированное антитело,гуманизированное антитело, (полностью) человеческое антитело, мультимерное антитело, гетеродимерное антитело, гемидимерное антитело, би-, три- или тетравалентное антитело, биспецифическое антитело, одноцепочечное антитело (например, scFv, scFab и scFabC), бис-scFv, диантитело, триантитело или тетрантитело, однодоменные антитела с одной областью и модифицированные Fab-фрагменты. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело является антителом, содержащим только один вариабельный домен иммуноглобулина. Следовательно, моновалентные антитела включают антитела,которые содержат только один вариабельный домен иммуноглобулина (т.е. одну вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи) и которые специфически связываются с CD154. Кроме того, анти-CD154 антитела по изобретению могут быть моновалентными, дивалентными или мультивалентными в отношении связывания с CD154. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например анти-CD154 антитело, с пониженной эффекторной функцией содержит любой фрагмент анти-CD154-антитела, который является достаточным для поддержания специфического связывания с антигеном CD154. Например,антитело может содержать только один вариабельный домен иммуноглобулина - VH- или VL-домен. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок, например антиCD154-антитело, является фрагментом антитела. Фрагменты антитела включают, например, Fabфрагмент, F(ab)2-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, F(ab')3-фрагмент, одноцепочечный F(v)фрагмент или Fv-фрагмент и связывающиеся с эпитопом фрагменты любого из указанных выше (см.,например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136). Фрагменты антител по настоящему изобретению более подробно описаны ниже. В одном примере CD154-связывающие белки или анти-CD154-антитела представляют антитела тивную или модифицированную шарнирную область. Описан ряд модифицированных шарнирных областей, например, в патенте США 5677425, заявках WO 99/15549 и WO 98/25971. В другом примере антитела по изобретению модифицированы в их константных областях, как, например, антитела, описанные в заявках WO 05/003169, WO 05/003170 и WO 05/003171. Любые из приведенных выше антиCD154-антител, производных антител или фрагментов антител можно использовать для получения конъюгатов антител по настоящему изобретению. Любые из приведенных выше антител, фрагментов или конъюгатов могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым антиCD154-антителом. Молекулы антител по изобретению могут происходить из любого класса (например, IgG, IgE, IgM,IgD или IgA) или подкласса молекул иммуноглобулинов. Домены константной области антитела, если они имеются, могут быть выбраны с учетом предполагаемой функции молекулы антитела. Например,домены константной области могут представлять домены IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, можно использовать домены константной области человеческого IgG, особенно IgG1, IgG2, IgG3 иIgG4. Изотипы IgG2 и IgG4 можно использовать в некоторых вариантах осуществления, где молекула антитела предназначается для терапевтических применений, при которых желательны пониженные или элиминированные эффекторные функции антитела. Альтернативно можно использовать изотипы IgG1 иIgG3, когда молекула антитела предназначается для терапевтических целей, для которых требуются эффекторные функции антитела. В некоторых вариантах осуществления одну или более CDR CD154-связывающего белка, например анти-CD154-антитела, по изобретению можно включить в одну или более иммуноглобулиновых доменов, универсальных каркасных структур, белковых остовов или других биологически совместимых каркасных структур на основе белковых остовов или иных каркасов, чем иммуноглобулиновые домены (NygrenUhlen, 1997, Curr. Opin. Strural. Biol., 7:463-469; Saragovi et al., 1992, Bio/Technology, 10:773-779;Skerra, 2000, J. Mol. Recognition, 13:167-187). В некоторых вариантах осуществления CDR анти-CD154 антитела включают в универсальную каркасную структуру (т.е. каркасную структуру, которую можно использовать для создания полной вариабельности функций, специфичностей и свойств, которые исходно поддерживаются большой коллекцией различных каркасов, см. патент США 6300064). В других вариантах осуществления можно использовать альтернативные остовы (см., например, Binz et al., 2005,Nat. Biotech., 23:1257-1268 Hosse и et al., 2006, Protein Science, 15:14-27) для создания CD154 связывающих белков по изобретению. Также термин "анти-CD154-антитело" включает синтетическое антитело или рекомбинантное антитело, которое получено с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например, такое как антитело, экспрессированное бактериофагом. Термин "анти-CD154-антитело" также следует понимать, как включающий антитело, которое получено синтезом молекулы ДНК, кодирующей антитело, и молекула данной ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где ДНК или аминокислотная последовательность получены с использованием технологии синтетической ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области. В одном варианте осуществления изобретение относится к "анти-CD154-антителу", которое является моноклональным антителом. Моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Прилагательное "моноклональное" указывает на природу антитела, как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и это не следует рассматривать как обязательное получение антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить гибридомным методом (с использованием мышиной или человеческой гибридомы), впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно получить методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Также следует понимать, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим одно или более различных моноклональных антител, которые специфически связываются с CD154, т.е. композиции поликлональных антител, содержащих множество моноклональных антител с различными специфичностями к эпитопам. В другом варианте осуществления изобретения "анти-CD154-антитело" относится к антителу, которое является химерным антителом, или производному антитела или конъюгату или его антигенсвязывающему фрагменту. Как правило, химерные антитела содержат вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, включающие остатки CDR и каркасной области одного вида (как правило, мыши), слитые с константными областями другого вида (как правило, человека). Данные химерные мышиные/человеческие антитела содержат примерно 75% человеческих и 25% мышиных аминокислотных последовательностей. Человеческие последовательности представляют константные области антитела, в то время как мышиные последовательности представляют вариабельные области (и таким образом, со- 15019636 держат антигенсвязывающие сайты) антитела. В другом варианте осуществления CD154-связывающие белки, анти-CD154-антитела по данному изобретению включают антитела, производные антител и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельный домен, включающий каркасные области из одного антитела, и области CDR - из другого антитела. В более конкретном варианте осуществления CD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела по данному изобретению включают химерные антитела, содержащие каркасные области и области CDR из различных человеческих антител. Способы получения всех химерных антител, описанных выше, хорошо известны специалистам в данной области; см., например, патент США 5807715; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81(21):6851-5; Sharon et al., 1984, Nature, 309(5966):364-7; Takeda et al., 1985, Nature, 314(6010):452-4. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-CD154-антитело, которое связывается с CD154, получают методом отбора антител лимфоцитов (SLAM) (Babcook et al., 1996, Proc.Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques, 18:862-869), с помощью которых можно выделить клетки любого вида, продуцирующие высокоаффинные антитела во время иммунных ответов в условиях in vivo. Другие методы включают описанные de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 и Lagerkvist et al., 1995,BioTechniques, 18(5):862-869. Указанные выше методы основаны на выделении отдельных продуцирующих антитела клеток, которые затем подвергают клональной экспансии с последующим скринингом на клоны, которые продуцируют анти-CD154-антитела, с последующей идентификацией последовательности генов их вариабельной области тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL). Конкретный метод скрининга подробно описан в WO 04/051268. Таким образом, выделяют В-клетки, которые являются позитивными на антитела против CD154. В-клетки могут происходить от человека, мыши, крысы, хомяка, кролика,козы или другого вида млекопитающих. Гены антител в данных В-клетках можно клонировать и экспрессировать в клетке-хозяине, например, с использованием обычной технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином является Е. coli. Другие клетки-хозяева подробно описаны ниже. Антитела (которые включают фрагменты антител, такие как Fab'-фрагменты), экспрессированные в данных клетках, можно выделить обычными методами. Если антитела происходят из источника, отличного от человека, то их можно подвергнуть гуманизации обычными методами, такими как мутагенез их генов. Затем гуманизированные антитела можно экспрессировать в клетке-хозяине и затем можно выделить. Моноклональные антитела можно получить любым методом, известным в данной области, таким как гибридомный метод (KohlerMilstein, 1975, 256:495-497), триомный метод, метод человеческих Вклеточных гибридом (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) и EBV-гибридомный метод (Cole etal., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", р. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). В данной области хорошо известны методы создания и получения рекомбинантных антител (см., например, патент США 4816397; патент США 6331415; Simmons et al., 2002, Journal of Immunological Methods, 263, 133-147;(9)=1126-1136). Антитела по настоящему изобретению также можно получить с использованием различных методов фагового дисплея, известных в данной области, и они включают описанные Brinkman et al., 1995, J.Immunol., 57: 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982 и WO 95/20401; патенты США 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108. Также можно использовать трансгенных (например, генно-инженерных) мышей или другие организмы, включая других млекопитающих, для получения связывающих белков и антител по данному изобретению (см., например, патент США 6300129). Например, известно, что можно получить мышей с целью замещения только вариабельных областей мышиных иммунных локусов (сегменты V, D и J тяжелой цепи, сегменты V и J легкой цепи) на соответствующие человеческие вариабельные последовательности, для получения больших количеств высокоаффинных антител с человеческими вариабельными последовательностями (см., например, патент США 6586251; патент США 6596541 и патент США 7105348). В еще одном варианте осуществления данного изобретения "анти-CD154-антитело" относится к антителу, производному или конъюгату антитела либо антигенсвязывающему фрагменту, которые подверглись приматизации или гуманизации. Приматизированные и гуманизированные антитела, как правило, включают CDR тяжелой и/или легкой цепи из мышиного антитела, пересаженного в каркасную Vобласть антитела примата, отличного от человека, или человека, которые обычно дополнительно содержат человеческую константную область; см., например, Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; па- 16019636 тенты США 6054297; 5821337; 5770196; 5766886; 5821123; 5869619; 6180377; 6013256; 5693761 и 6180370. Логическим обоснованием применения таких приматизированных или гуманизированных антител является сохранение (человеческой) антигенной специфичности мышиного антитела, которую придают мышиные CDR, с одновременным снижением иммуногенности мышиного антитела (мышиное антитело будет вызывать иммунный ответ против него у видов, отличных от мыши) посредством использования как можно больше человеческих каркасных последовательностей. Такие антитела можно применять при лечении человека в целях сведения до минимума или устранения нежелательных побочных эффектов,таких как иммунные ответные реакции. Описаны антитела, содержащие донорные CDR, пересаженные из антиген-специфических антител, отличных от человеческих, на гомологичные акцепторные каркасные области от примата, отличного от человека, с пониженной имммуногенностью у людей (заявки на патент США 2005/0208625; 2002/0062009; патент США 7338658). Следовательно, гуманизированные формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), являются специфическими химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулинов или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другими антигенсвязывающими последовательностями антител), которые содержат последовательности, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей, отличных от человеческих, и человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. В своем большинстве гуманизированные антитела представляют человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющих комплементарность областей (CDR) реципиентного антитела замещены на остатки CDR от видов, отличных от человека (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, с желаемой специфичностью, аффинностью или емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной Fv-области (FR) человеческого иммуноглобулина замещают на соответствующие остатки FR, отличные от человеческих. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые невозможно найти ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или FR. Данные модификации проводят для дополнительной обработки и оптимизации функциональной способности антитела. В целом гуманизированное антитело может содержать, по существу, все по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или, по существу, все участки CDR соответствуют таковым в иммуноглобулине, отличном от человеческого, и все или, по существу, все остатки FR представляют таковые консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно может также содержать, по меньшей мере, участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, таковой человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело (которое включает, например, фрагменты антитела, производные или конъюгаты антитела) можно получить технологией рекомбинантной ДНК, в которой некоторые или все аминокислоты легкой и тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельного домена) используют для замены соответствующих аминокислот из легкой и тяжелой цепи близкого антитела, отличного от человеческого. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам в области антител; см., например, ЕР 239400; Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988,Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 86:10029; Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:3833; патент США 6180370 и ЕР 519596, в которых описано изменение антител через поверхностные остатки. Следовательно, в одном варианте осуществления данного изобретения анти-CD154-антитело относится к гуманизированному антителу (которое включает, без ограничения, гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент и производное или конъюгат гуманизированного антитела), которое получают трансплантацией мышиных или крысиных (или других нечеловеческих) CDR в человеческое антитело. Конкретнее, данную гуманизацию антитела проводят следующим образом: (1) выделяют кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, из гибридомы или В-клеток, которые секретируют антитело; (2) определяют секвенированием последовательности ДНК вариабельных доменов, включающих CDR; (3) ДНК, кодирующие CDR, переносят в соответствующие области последовательности,кодирующей вариабельные домены тяжелой и легкой цепи человеческого антитела сайт-направленным мутагенезом, и (4) добавляют сегменты гена человеческой константной области желаемого изотипа (например, 1 для СН идля CL). Наконец, гены гуманизированных тяжелой и легкой цепей коэкспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающих (например, клетках СНО или NSO) для получения растворимого гуманизированного антитела. Однако прямой перенос CDR в человеческую каркасную область приводит к потере аффинности связывания антигена у полученного связывающего белка или антитела. Потеря аффинности связывания антигена может иметь место, поскольку в некоторых близких антителах некоторые аминокислоты в константных областях взаимодействуют с CDR и, таким образом, оказывают влияние на аффинность связывания антигена у антитела в целом. В таких случаях специалист поймет, что будет критическим ввести"обратные мутации" в каркасные области акцепторного антитела для сохранения антигенсвязывающей активности близкого антитела. Общие подходы проведения обратных мутаций хорошо известны специа- 17019636 листам в данной области; см., например, Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:10029; Co et al.,1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:2869-2873; WO 90/07861; Tempest 1991, Biotechnology, 9:266-271. Примеры обратных мутаций антител по настоящему изобретению включают таковые остатки, показанные на фиг. 9, под названием доноры. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок или антитело по настоящему изобретению может содержать домен VH, который не является вариабельным доменом верблюжьего или мышиного иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления полипептид антитела содержит VHдомен, который не содержит одну или более аминокислот, которые являются специфическими для вариабельных доменов верблюжьего иммуногобулина по сравнению с человеческими VH-доменами. В одном варианте осуществления данного изобретения "анти-CD154-антитело" относится к антителу (которое включает антигенсвязывающий фрагмент и производное или конъюгат антитела), которое является полностью человеческим. Полностью "человеческое" антитело содержит полипептид антитела или вариабельный домен иммуноглобулина, который имеет последовательность, полученную из человеческого иммуноглобулина (например, полученную из кодирующей последовательности человеческого иммуноглобулина). Термин "человеческое антитело" включает, например, антитела с вариабельной и константной областями (если присутствуют), полученные из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. В том смысле, в котором термин "человеческие" используется в данном документе по отношению к антителу или фрагменту, такому как вариабельный домен, то он не включает антитело от другого вида, например мыши, которое было "гуманизировано" посредством переноса последовательностей человеческой константной области на полипептид антитела (т.е. замещением константных областей, отличных от человеческих, на человеческие константные области), или посредством переноса последовательностей человеческой каркасной области V-домена в вариабельный домен иммуноглобулина от млекопитающего, отличного от человека (например, замещением каркасных областей V-домена, отличных от человеческих, на человеческие каркасные области). Описаны способы гуманизации вариабельных областей иммуноглобулина посредством рациональной модификации определяющих комплементарность остатков (заявка на патент США 2006/0258852). В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела включают аминокислотные остатки,которые не кодируются человеческими иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом в условиях invitro, или соматической мутацией в условиях in vivo). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителу, содержащему вариабельную область с одной или более каркасными областями (например, FW1, FW2, FW3 и/или FW4), имеющими аминокислотную последовательность, которая является такой же, как аминокислотная последовательность соответствующей каркасной области, кодированной сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии, или аминокислотные последовательности одной или более указанных каркасных областей, в целом содержащих до 5 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью указанной соответствующей каркасной области, кодированной сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии. В дополнительных вариантах осуществления аминокислотные последовательности каркасных областей (FW1, FW2, FW3 и/или FW4) вариабельного домена являются такими же, как аминокислотные последовательности соответствующих каркасных областей, кодированных сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии, или последовательности FW1, FW2, FW3 и/или FW4 в целом содержат до 10 аминокислотных различий по сравнению с последовательностями соответствующих каркасных областей, кодированных сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии. Примерные сегменты гена антитела зародышевой линии включают, например, DP47, DP45, DP48 и DPK9 (заявка на патент США 2006/00627784) и сегменты, кодирующие акцепторные каркасные последовательности, описанные в примерах и приведенные на чертежах. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело (которое включает фрагмент антитела или последовательность вариабельного домена) имеет по меньшей мере 85% идентичность аминокислотной последовательности (в том числе, например, 87, 90, 93, 95, 97, 99% или выше идентичность последовательностей) с природным человеческим антителом. Полностью человеческие или человеческие антитела можно получить из трансгенных (например,генно-инженерных, таких как нок-ин) мышей, несущих гены человеческого антитела (несущие экзоны вариабельной области (V), разнообразия (D), соединения (J) и константной области (С или человеческие V-, D- и J-области из человеческих клеток. Например, в настоящее время возможно получить генноинженерных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный репертуар человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов (см.,например, Jakobovits et al., PNAS, 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Bruggermannet al., Year in Immune, 7:33, 1993 и Duchosal et al., Nature, 355:258, 1993). Можно получить трансгенную линию мышей (например, генно-инженерных, включая нок-аут, нок-ин, замещение генов и т.п.) с последовательностями генов из нереарранжированных генов человеческих иммуноглобулинов. Человеческие последовательности могут кодировать тяжелые и легкие цепи человеческих антител и они будут функционировать правильно у мышей, подвергаясь реарранжировке с получением широкого репертуара анти- 18019636 тел, аналогичных таковым у людей. Генно-инженерных мышей можно иммунизировать белкоммишенью (например, CD154, его фрагментами или клетками, экспрессирующими CD154) с получением широкого спектра специфических антител и кодирующих их РНК. Нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты цепей таких антител, затем можно клонировать из животного в векторный дисплей. Как правило, клонируют отдельные популяции нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности тяжелой и легкой цепей, и затем отдельные популяции рекомбинируют при вставке в вектор таким образом,чтобы любая данная копия вектора получала случайную комбинацию тяжелой и легкой цепей. Вектор сконструирован для экспрессии цепей антитела таким образом, чтобы их можно было собрать и расположить на внешней поверхности упаковки дисплея, содержащей вектор. Например, цепи антитела можно экспрессировать в виде слитых конструкций с белком оболочки фага с внешней поверхности фага. Затем упаковки дисплея можно подвергнуть скринингу для расположения антител, связывающихся с мишенью. Кроме того, человеческие антитела можно получить из библиотек фагового дисплея (Hoogenboomet al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991; Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309, 1996; патент США 6300064). Можно создать синтетические фаговые библиотеки, в которых используются рандомизированные комбинации V-областей синтетических человеческих антител. Можно провести отбор полностью человеческих антител с использованием антигена, в которых Vобласти по своей природе являются очень близкими к человеческим; см. патенты США 6794132,6680209, 4634666 и Ostberg et al., 1983, Hybridoma, 2:361-367. Получение человеческих антител также см. у Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156, 1997; Greenand Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495. Дополнительно человеческие антитела обсуждаются и описаны в патентах США 5939598 и 6673986; также см. патенты США 6114598, 6075181 и 6162963; также см. патенты США 6150584, 6713610, 6657103, заявки на патент США 2003/0229905 А 1, 2004/0010810 А 1, 2004/0093622 А 1, 2006/0040363 А 1, 2005/0054055 Al, 2005/0076395 Al и 2005/0287630 A1; также см. ЕР 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 98/24893. В альтернативном подходе другие авторы использовали "минилокусный" подход. При минилокусном подходе имитируют экзогенный локус Ig посредством включения участков (отдельных генов) из локуса Ig. Таким образом, один или более VH-генов, один или более DH-генов, один или более JH-генов,mu-генов константной области и второй константной области (предпочтительно константной гаммаобласти) формируют в конструкцию для вставки животному. Данный подход описан, например, в патентах США 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669,5612205, 5721367, 5789215 и 5643763; также см. патенты США 5569825, 5877397, 6300129, 5874299,6255458 и 7041871, раскрытие которых в полном объеме включено в данный документ для сведения; также см. ЕР 0546073, W0 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 92/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884; также см. Taylor et al. (1992, Nuc.Choi et al. (1993, Nature Genetics, 4:117); Lonberg et al. (1994, Nature, 368:856-859); Taylor et al. (1994, International Immunology, 6:579-591) и Tuaillon et al. (1995, J. Immunol., 154:6453-65), Fishwild et al. (1996,Nature Biotechnology, 14:845) и Tuaillon et al. (2000, Eur. J. Immunol., 10:2998-3005). В более конкретном варианте осуществления данного изобретения полностью человеческие антитела получают с использованием праймированных в условиях in vitro человеческих спленоцитов (Boerneret al., 1991, J. Immunol., 147:86-95). В более конкретном варианте осуществления данного изобретения полностью человеческие антитела получают клонированием репертуара (Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:2432-2436;Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods, 141:227-236). Кроме того, в патенте США 5798230 описано получение человеческих моноклональных антител из В-клеток человека, где человеческие В-клетки,продуцирующие антитела, иммортализуют заражением вирусом Эпштейна-Барра, или их производных,которые экспрессируют ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барра ("EBNA2"), белок, необходимый для иммортализации. Затем "отключают" функцию EBNA2, что приводит к повышению продукции антител. Другие способы получения полностью человеческих антител включают применение животных, отличных от человека, у которых имеются инактивированные локусы эндогенного Ig и которые являются трансгенными для нереарранжированных генов тяжелой и легкой цепи человеческого антитела. Таких трансгенных животных можно подвергнуть иммунизации активированными Т-клетками или белком D1.1(патенты США 5474771; 6331433 и 6455044) и гибридомы можно получить из В-клеток, полученных от них. В данной области подробно описаны эти методы; см., например, различные публикации/патенты,касающиеся трансгенных мышей, содержащих минилокусы человеческого Ig, включая патент США 5789650; различные публикации/патенты относительно мышей XENOMOUSE, включая патенты США 6075181, 6150584 и 6162963; Green, 1997, Nature Genetics, 7:13-21; Mendez, 1997, Nature Genetics,15:146-56, и различные публикации/патенты, касающиеся "трансомных" мышей, включая ЕР 843961 иCD154-связывающие белки и анти-CD154-антитела по настоящему изобретению также относятся к белкам или антителам, перекрестно блокирующим связывание, или связывающим белкам или антителам,которые связываются с одним и тем же эпитопом или которые связываются с очень близким или пере- 19019636 крывающимся эпитопом, что и любые антитела, описанные в данном документе. Белки или антитела,перекрестно блокирующие связывание, могут конкурентно ингибировать или блокировать связывание любого из антител, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к CD154-связывающим белкам и анти-CD154-антителам, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи SEQ IDNO: 12 или SEQ ID NO: 13 и содержащее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 15 (Fab- и Fab'фрагменты антитела 342), и которое проявляет аналогичные по отношению к CD154 связывающие свойства в конкурентных тестах с анти-CD154-антителом 5 с 8, описанным в данном документе. В других вариантах осуществления изобретение относится к CD154-связывающим белкам и анти-CD154-антителам,которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность VL-домена SEQ ID NO: 58 и последовательность VH-домена SEQ ID NO: 60 (последовательности вариабельной области антитела 338) и которые проявляют аналогичные по отношению кCD154 связывающие свойства в конкурентных тестах с анти-CD154-антителом 5 с 8, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения CD154-связывающий белок, например анти-CD154-антитело, проявляет высокую аффинность для человеческого CD154. Например, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок диссоциирует от человеческого CD154(человеческого CD40L) со значением Kd в пределах от 50 нМ до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например, Biacore). Например, Kd для человеческого CD154 может составлять от 25 до 1, от 10 до 1, от 5 до 1, от 1 до 1, от 0,5 до 1, от 0,1 нМ до 1 пкМ, от 75 до 1, от 50 до 1, от 20 до 1 или даже от 10 до 1 пкМ. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок по настоящему изобретению диссоциирует от человеческого CD154 со значением Kd в пределах от 500 до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например, Biacore). В некоторых вариантах осуществления Kd для человеческого CD154 равняется менее 50 пкМ. Например, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок диссоциирует от человеческого CD154 со значением Kd менее 20 пкМ. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок диссоциирует от человеческого CD154 со значением Kd менее 10 пкМ. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок связывается с CD154 с высокой аффинностью, но не вытесняет связанный CD154 от CD40. Аффинность антитела можно повысить способами, известными в данной области(см., например, Clark et al., 2006, Protein Sci., 15 (5):949-60, в данном источнике описано повышение аффинности антитела с использованием основанного на структуре компьютерного анализа, и Chao et al.,2006, Nat. Protoc, 1:755-768, в данном источнике описаны методы выделения и конструирования scFv с желаемыми свойствами с использованием дисплея на поверхности дрожжей). В тех случаях, когда желательно повысить аффинность антител по изобретению, содержащих одну или более указанных выше CDR, то такие антитела с повышенной аффинностью можно получить с использованием ряда протоколов созревания аффинности, включая, но не ограничиваясь этим, сохранениеCDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254:392-403, 1995), поворот цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779783, 1992), применение мутантных штаммов E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250:350-368, 1996), поворот ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al., J. Mol.Biol., 256:7-88, 1996) и ПЦР (Crameri et al., Nature, 391:288-291, 1998). Все данные методы созревания аффинности обсуждаются Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16:535-539, 1998). Таким образом, изобретение относится к вариантам последовательностей антител по изобретению, которые специфически связываются с CD154. Такие варианты последовательностей содержат одну или более полуконсервативных или консервативных замен в их последовательности, и такие замены предпочтительно не оказывают существенного влияния на желаемую активность полипептида. Замены могут быть естественными или их можно ввести, например, с помощью мутагенеза (например, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem.,253:6551). Например, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто можно заместить на другие аминокислоты (аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи). Из данных возможных замен предпочтительно, чтобы глицин и аланин использовали для замены на другую аминокислоту (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи) и чтобы валин, лейцин и изолейцин использовали для замены на другую аминокислоту (поскольку они имеют большие алифатические боковые цепи,которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые часто можно заменить на другую аминокислоту, включают, но не ограничиваются этим: фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи); аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислые боковые цепи); аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи) и цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи). Аффинность связывания CD154-связывающих белков, например анти-CD154-антител, по настоящему изобретению также можно представить в относительных показателях или при сравнении с аффинностью связывания второго антитела, которое также специфически связывается с CD154 (например, вто- 20019636 рого анти-CD154-антитела, которое является CD154-специфическим, которое можно отнести в данном документе ко "второму CD154-специфическому антителу"). В некоторых вариантах осуществленияCD154-специфическое антитело может представлять антитело 5 с 8 (продуцированное гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, описанной в патенте США 5474771) или гуманизированное антитело 5 с 8. В других вариантах осуществления второе CD154-специфическое антитело может представлять любое из антител по изобретению, такое как 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335,303 или 402 (фиг. 12). Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к анти-CD154-антителу, которое связывается с человеческим CD154 с более высокой аффинностью по сравнению с антителом 5 с 8 или с KD, которая ниже чем KD антитела 5 с 8. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по настоящему изобретению также ингибирует активность CD154 или блокирует взаимодействие CD154:CD40 в большей степени по сравнению со вторым CD154 специфическим антителом, таким как 5 с 8, в эквимолярных концентрациях. Относительную способность анти-CD154-антитела блокировать взаимодействие CD154:CD40 можно оценить любым доступным методом анализа, например, таким как тест позитивной регуляции ICAM-1, описанный в данном документе и в тестах конкурентного связывания. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления CD154-связывающие белки и анти-CD154 антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению являются пригодными для ингибирования связывания CD154 с CD40 и делают это с высокой специфичностью, например со значениемIC50 в пределах от 10 пкМ до 1,5 мкМ включительно. В некоторых вариантах осуществления CD154 связывающие белки, например анти-CD154-антитела, по изобретению могут иметь значение IC50 в пределах от 10 до 500, от 50 до 500, от 100 до 500, от 250 до 750 пкМ, от 500 до 1 мкМ или от 750 пкМ до 1,5 мкМ. В дополнительных вариантах осуществления анти-CD154-антитело, по существу, не обладает агонистическим действием в отношении активности CD40 или не активирует сигнальный путь с участиемCD40. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по настоящему изобретению оказывает антагонистическое действие на активность CD154 или CD40 либо обеих молекул. Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к CD154 связывающим белкам и анти-CD154-антителам, которые связываются с человеческим CD154 с более высокой или равной аффинностью по сравнению со вторым CD154-специфическим антителом (например, антителом 5 с 8 или гуманизированным антителом 5 с 8), или со значением KD, которое ниже или равно KD второго CD154-специфического антитела, где анти-CD154-антитело, по существу, не ингибирует взаимодействие CD154:CD40 по сравнению со вторым CD154-специфическим антителом. Такие антитела могут быть пригодными, например, для постановки теста связывания и в качестве диагностических реагентов. Примерные антитела, которые проявляют высокую аффинность для человеческого CD154, но обладают более низкой степенью ингибирования взаимодействия CD154:CD40 по сравнению со вторымCD154-специфическим антителом, являются антителами 381 и 338, описанными в данном документе. Например, настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителам, которые специфически связываются с человеческим CD154 с более высокой или равной аффинностью (по сравнению со вторым CD154 специфическим антителом, например, таким как гуманизированное антитело 5 с 8), но которое блокирует взаимодействие CD154:CD40 в меньшей степени, чем это делает второе CD154-специфическое антитело. В дополнительных вариантах осуществления данные анти-CD154-антитела, которые ингибируют связывание CD154 (CD40L) с CD40 в меньшей степени, чем это делает второе CD154-специфическое антитело, также, по существу, не оказывают агонистического действия в отношении активности CD40 или не активирует сигнальный путь с участием CD40. Например, такие антитела, если их применяют в тесте оценки эффективности в условиях in vitro, как описано в примере 7, могут не проявлять статистически значимого агонистического действия по сравнению с контрольной обработкой или могут проявлять агонистическое действие на уровне 1, 2, 3, 5 или 10% по сравнению с положительным контролем (например,лигандом CD154). Vidalain et al. (The EMBO Journal, 2000, 19:3304-3313) и Pearson et al. (International Immunology, 2001, 13:273-283) описывают сигнальный путь CD40 и также приводят тесты, которые можно использовать для определения того, блокируется или ингибируется, или нет, взаимодействиеCD154:CD40, и в какой степени. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителу,содержащему по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 5) и более предпочтительно все три данные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. В другом варианте осуществления анти-CD154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из CDR-L1 (SEQ ID NO: 6),CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), и более предпочтительно все три данные CDR-L1,CDR-L2 и CDR-L3. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три CDR-H1, CDR-H2 и CDRH3 (SEQ ID NO: 3-5) и все три CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 (SEQ ID NO: 6-8). В дополнительных вариантах осуществления анти-CD154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи одной из SEQ ID NO: 1, 9, 10 или 11 и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи одной из SEQ ID NO: 2 или 14. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителу,содержащему по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ IDNO: 43) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR,выбранные из CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 44), и более предпочтительно все три данные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. В другом варианте осуществления анти-CD154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), и более предпочтительно все три данные CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три CDR-H1, CDR-H2 и CDRH3 (SEQ ID NO: 42-44) и все три CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 (SEQ ID NO: 45-47). В дополнительных вариантах осуществления анти-CD154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 56 и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителу,содержащему по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ IDNO: 49) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR,выбранные из CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) и CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), и более предпочтительно все три данные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. В другом варианте осуществления анти-CD154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), и более предпочтительно все три данные CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат комплементарную последовательность,включающую одну или более CDR легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно приведенные выше, или комплементарную последовательность, включающую одну или более CDR тяжелой цепиCDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID(SEQ ID NO: 53). В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три CDR-H1, CDR-H2 и CDRH3 (SEQ ID NO: 48-50) и все три CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 (SEQ ID NO: 51-53). В дополнительных вариантах осуществления анти-CD154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и/или содержит последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 62 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 65. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 63 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 68 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 71. В других вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 69 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 72. В еще одних вариантах осуществления CD154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 или SEQ ID NO: 72. Данное изобретение также относится к связывающему CD154 белку, который предпочтительно обладает по меньшей мере 90, 91, 92, 93 или 94% идентичностью с CD154-связывающим белком по изобретению. Более предпочтительно CD154-связывающий белок обладает по меньшей мере 95, 96, 97 или 98% идентичностью. Наиболее предпочтительно CD154-связывающий белок обладает по меньшей мере 99,99,5, 99,9% идентичностью с CD154-связывающим белком по изобретению. CD154-связывающие белки по изобретению могут содержать последовательность вариабельного домена, по меньшей мере на 85% идентичную вариабельному домену SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 или SEQ ID NO: 60, или ее одной или более CDR. Другие варианты осуществления изобретения относятся к биспецифическим антителам. Биспецифические антитела являются моноклональными, предпочтительно человеческими или гуманизированными антителами, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере к двум антигенам. Их можно использовать самостоятельно или смешанными в композиции, содержащей поликлональные популяции. В настоящем изобретении одна из специфичностей связывания представляет таковую для антигена CD154, в то время как другая специфичность связывания является таковой для любого другого антигена и предпочтительно для белка или рецептора клеточной поверхности, или субъединицы рецептора. Например, другая специфичность связывания может быть лигандом, выбранным из человеческого сывороточного альбумина (HSA), TNF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-, CD2, CD4, CD8,CTLA4, LFA1, LFA3 и VLA4. В других вариантах осуществления настоящего изобретения анти-CD154-антитело содержит сайт связывания близкого лиганда. Близкий лиганд (например, полипептид) способен связываться с функциональными членами репертуара независимо от специфичности лиганда-мишени. Следовательно, близкий лиганд можно использовать для идентификации или отбора (например, при очистке или скрининге) функциональных членов репертуара (таких как панель или группа антител, независимо от специфичности связывания антигена у антитела). Близкие лиганды включают, например, протеин А, протеин G и протеин L. Предварительный отбор членов фаговой библиотеки с помощью близких лигандов описан в заявке WO 99/20749. Фрагменты антител. Также настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим или эпитопсвязывающим фрагментам анти-CD154-антитела. Все способы и реагенты, описанные выше, в отношении анти-CD154 антител можно в одинаковой степени использовать для получения и применения фрагментов антиCD154-антител по изобретению. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения фрагменты анти-CD154-антитела включают гетеродимерные комплексы антител и гибридные антитела, такие как биспецифические антитела, гемидимерные антитела, мультивалентные антитела (т.е. тетравалентные антитела) и одноцепочечные антитела. Гемидимерное антитело состоит из Fc-области и одного Fab-фрагмента. Одноцепочечное антитело состоит из вариабельных областей, связанных белковыми спейсерами, в одну белковую цепь. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения фрагменты анти-CD154-антитела по изобретению также могут включать белки, содержащие одну или более иммуноглобулиновых легких цепей и/или тяжелых цепей, таких как мономеры и гомо- или гетеромультимеры (например, димеры или тримеры) данных цепей, где данные цепи необязательно связаны дисульфидной связью или связаны иначе. Данные антитела могут быть способны связываться с одним или более антигенами. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает антигенсвязывающие фрагменты цельных антител, такие фрагменты антитела, как Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fv, Fd, dAb,диатела, минитела или нанотела. Также настоящее изобретение относится к фрагментам, содержащим только один вариабельный домен, такой как VH- или VL-домен, или фрагменту, содержащему только домен тяжелой цепи или легкой цепи. Фрагменты могут быть гуманизированными или полностью человеческими. Также настоящее изобретение включает антигенсвязывающие фрагменты, которые состоят из альтернативных остовов (см., например, Binz, выше и Hosse, выше) или которые содержат универсальный каркас. Также настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим любой антигенсвязывающий фрагмент или CD154-связывающий белок, который специфически связывается с CD154, конъюгированный ковалентно или нековалентно, прямо или опосредованно, с функциональной группой, например, такой как белок-носитель или ПЭГ. Анти-CD154-антитела по настоящему изобретению включают дивалентные антитела. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к фрагменту дивалентного анти-CD154 антитела, содержащему две тяжелых цепи антитела и по меньшей мере одну полимерную молекулу в ковалентной связи, где каждая тяжелая цепь ковалентно связана с другой, по меньшей мере, посредством одного мостика между цепями, отличного от дисульфидного, соединяющего атом серы остатка цистеина в одной цепи с атомом серы остатка цистеина в другой цепи, где остатки цистеина расположены вне домена вариабельной области каждой цепи, отличающемуся тем, что по меньшей мере один мостик между цепями, отличный от дисульфидного, содержит ковалентно связанную полимерную молекулу. В том смысле, в котором термин "отличный от дисульфидного" используется в данном документе, то он означает, что мостики S-S, например, типа обычно имеющегося в антителах, исключаются. Однако мостик между цепями типа имеющегося во фрагменте по изобретению может быть связанным с тяжелой цепью посредством связи S-S, описанной ниже. В общем каждая полимерная молекула во фрагменте дивалентного антитела по изобретению образует часть мостика между цепями. Каждый мостик служит для связывания двух тяжелых цепей и в каждой цепи он будет ковалентно связан с атомом серы остатка цистеина. Как правило, ковалентная связь будет представлять дисульфидную связь или в конкретных вариантах осуществления связь сера-углерод. Примерные структуры дивалентных антител см. в WO 99/64460 и WO 05/061005. Также изобретение относится к анти-CD154-антителу, которое является моновалентным антителом или моновалентным антигенсвязывающим фрагментом. В том смысле, в котором термин "моновалентный" используется в данном документе, то он означает, что данное антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, Fv, одноцепочечный scFv, dAb, Fab, Fab', Fd, scFab, scFabC и т.д.) могут связываться только с одной молекулой их мишени. Обычно природные антитела являются дивалентными в том отношении, что они имеют два антигенсвязывающих плеча, где каждое содержит VH- и VL-домен. Дивалентное антитело может связываться с двумя отдельными молекулами одного и того же антигена, в том случае когда не отсутствует стерическое препятствие. В противоположность "моновалентное" антитело имеет антигенсвязывающий сайт для мишени. Антигенсвязывающий домен моновалентного антитела может содержать VH- и VL-домен или может содержать только один иммуноглобулиновый вариабельный домен, т.е. VH- или VL-домен, который обладает способностью связываться с CD154 без необходимости в соответствующем VH- или VL-домене. Таким приведенным в качестве примера моновалентным антителом является Fd-фрагмент, который содержит один иммуноглобулиновый вариабельный домен и который может связываться только с одной молекулой CD154 антитела. У моновалентного антитела отсутствует способность перекрестно связываться с молекулами одного антигена. Данное изобретение относится к анти-CD154-антителу, где антитело специфически связывается с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный Fab- или Fab'-фрагмент с последовательностью тяжелой цепи соответственно SEQ ID NO: 12 или 13 и последовательностью легкой цепиSEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 9, 10 или 11 и с последовательностью вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2 или 14. В других вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела с последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO: 12 или 13 и с последовательностью легкой цепи SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 15 и последовательности тяжелой цепи SEQ IDNO: 13. В некоторых вариантах осуществления CD154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 15 и последовательности тяжелой цепи SEQ IDNO: 12. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к фрагменту антитела, содержащему последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 56 и содержащему последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 54. В других вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 58. В одном варианте осуществления данное изобретение относится к Fab-, или F(ab')2-, или F(ab')3 фрагменту, который специфически связывается с CD154. Данный Fab'-, или F(ab')2-, или F(ab')3-фрагмент может быть гуманизирован и может содержать последовательность тяжелой цепи, которая содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 13, и может включать последовательность легкой цепи, которая содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154-антителу,которое не содержит Fc-домена. Такое антитело или фрагмент без Fc-области могут быть моновалентными, дивалентными или дополнительно мультивалентными. Также данное изобретение относится к антителам или фрагментам антител, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связываются Fab'-, или F(ab')2-, или F(ab')3-фрагменты,описанные выше. Данные антитела или фрагменты антител можно идентифицировать в тесте перекрестного связывания, описанном в данном документе (пример 9). Данные антитела или фрагменты антител могут быть выделенными, рекомбинантными или синтетическими и их можно присоединить ко второй молекуле с образованием конъюгата антитела. Антитела с пониженной эффекторной функцией. Взаимодействие антител и комплексов антиген-антитело с клетками иммунной системы приводит к"запуску" различных ответных реакций, которые относятся в данном документе к эффекторным функциям. IgG-антитела активируют эффекторные пути иммунной системы посредством связывания с членами семейства клеточных поверхностных рецепторов Fc и с C1q системы комплемента. Лигирование эффекторных белков кластерными антителами "запускает" различные ответные реакции, включающие высвобождение воспалительных цитокинов, регуляцию продукции антигенов, эндоцитоз и гибель клеток. В некоторых клинических применениях данные ответные реакции являются критическими для проявления эффективности моноклонального антитела. В других они провоцируют развитие нежелательных побочных эффектов, таких как воспаление и элиминация антиген-несущих клеток. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно относится к CD154-связывающим белкам, включая антитела, с измененными, например пониженными, эффекторными функциями. Важно, что пониженная эффекторная функция не обязательно приводит к уменьшению способности анти-CD154-антитела ингибировать одно или несколько заболеваний посредством блокирования взаимодействия CD154:CD40 (см. заявку WO 05/03175,которая в полном объеме включена в данный документ для сведения). Анти-CD154-антитела с пониженной эффекторной функцией (например, опосредованными Fc- 24019636 областью эффекторными функциями; см. ниже) являются особенно желательными для применения у субъектов, у которых существует потенциальная вероятность проявления нежелательной тромбоэмболической активности. Дополнительно пониженная эффекторная функция анти-CD154-антител может приводить к снижению или устранению других потенциальных нежелательных эффектов, возникающих при терапии анти-CD154-антителами, таких как делеция активированных Т-клеток и других популяций клеток, индуцированных на экспрессию CD154, или Fc-зависимая активация моноцитов/макрофагов. Эффекторную функцию анти-CD154-антитела по настоящему изобретению можно определить с использованием многих известных тестов. Эффекторная функция анти-CD154-антитела может быть снижена относительно второго анти-CD154-антитела. В одних вариантах осуществления второе антиCD154-антитело может представлять любое антитело, которое специфически связывается с CD154. В некоторых вариантах осуществления второе анти-CD154-антитело может представлять антитело 5 с 8(продуцированное гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, описанной в патенте США 5474771) или гуманизированное антитело 5 с 8. В других вариантах осуществления второе CD154-специфическое антитело может быть любым из антител по изобретению, таким как 342,381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 или 402 (фиг. 12). В еще одних вариантах осуществления в том случае,когда интересующее анти-CD154-антитело подверглось модификации в целях снижения эффекторной функции, то второе антитело может представлять немодифицированный или исходный вариант антитела. Эффекторную функцию анти-CD154-антитела по настоящему изобретению также можно оценить,например, по определению уровня агрегации или активации тромбоцитов, вызванной обработкой антиCD154-антителом, по сравнению с контрольным антителом. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитела по настоящему изобретению не опосредуют или не усиливают агрегацию или активацию тромбоцитов в стандартном тесте агрегации или активации тромбоцитов. В других вариантах осуществления анти-CD154-антитела опосредуют более низкий уровень агрегации или активации тромбоцитов по сравнению со вторым анти-CD154-антителом (например, 5 с 8 или гуманизированным 5 с 8). Приводимые в качестве примера эффекторные функции включают связывание с Fc-рецептором, фагоцитоз, апоптоз, провоспалительные ответные реакции, отрицательную регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Другие эффекторные функции включают антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), посредством которой антитела связываются с Fc-рецепторами на цитотоксических Т-клетках, природных клетках-киллерах(NK) или макрофагах, приводя к гибели клеток, и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), при которой гибель клеток индуцируется посредством активации каскада комплемента (см. обзор Daeron,Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997; Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol., 2:77-94, 1995 и Ravetch andKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492, 1991. Как правило, для проявления таких эффекторных функций требуется, чтобы Fc-область сочеталась со связывающей областью (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием стандартных методов, которые известны в данной области (см., например, заявку WO 05/018572, WO 05/003175 и патент США 6242195). Эффекторные функции можно "отменить" при использовании фрагментов без Fc-домена, таких какFab, F(ab')2 или одноцепочечный Fv. Альтернативой является использование подтипа IgG4 антитела, который связывается с FcRI, но который слабо связывается с C1q и FcRII и FcRIII. Подтип IgG2 также обладает пониженным связыванием с Fc-рецепторами, но сохраняет способность к значительному связыванию с аллотипом Н 131 FcRIIa и C1q. Таким образом, необходимы дополнительные изменения в последовательности Fc для элиминации связывания со всеми Fc-рецепторами и с C1q. Несколько эффекторных функций, включая ADCC, опосредуются Fc-рецепторами (FcR), которые связываются с Fc-областью антитела. Аффинность антитела для конкретного FcR и, следовательно, эффекторную активность, опосредованную антителом, можно модулировать изменением аминокислотной последовательности и/или посттрасляционными модификациями Fc-области и/или константной области антитела.FcR определяются их специфичностью для изотипов иммуноглобулинов; Fc-рецепторы для IgGантител относятся к FcR, для IgE к FcR, для IgA к FcR и т.д. Было установлено три подкласса FcR:FcRIIB (CD32); FcRIIIA (CD16a) и FcRIIIB (CD16b). Поскольку каждый подкласс FcR кодируется двумя или тремя генами и альтернативный сплайсинг РНК приводит к многочисленным транскриптам,то существует широкое разнообразие изоформ FcR. Например, FcRII (CD32) включает изоформы 11 а,11b1, 11b2, 11b3 и 11c. Сайт связывания в человеческих и мышиных антителах для FcR ранее был картирован к так называемой "нижней шарнирной области", состоящей из остатков 233-239 (EU нумерация по системе Kabat et принимающих участие в связывании. Другими ранее упоминавшимися областями, которые, возможно,принимают участие в связывании с FcR, являются: G316-K338 (человеческий IgG) для человеческогоFcRI (только при сравнении последовательностей; мутанты по замене не оценивались) (Woof et al.,Molec. Immunol., 23:319-330, 1986); K274-R301 (человеческий IgG1) для человеческого FcRIII (основываясь на пептидах) (Sarmay et al., Molec. Immunol, 21:43-51, 1984 и Y407-R416 (человеческий IgG) для человеческого FcRIII (основываясь на пептидах) (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans., 12:739-743, 1984) иShields et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604, 2001; Lazar G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:40054010, 2006). Данные и другие участки или области аминокислотных остатков, принимающие участие в связывании с FcR, могут быть очевидными специалистам в данной области по данным исследования кристаллической структуры комплексов Ig-FcR (см., например, Sondermann et al., 2000, Nature,406(6793):267-73 и Sondermann et al., 2002, Biochem. Soc. Trans., 30(4):481-6). Следовательно, антиCD154-антитела по настоящему изобретению включают модификации одного или более указанных выше остатков. Другие известные подходы снижения эффекторной функции mAb включают мутирование аминокислот на поверхности mAb, которые принимают участие в эффекторных взаимодействиях связывания(Lund J. et al., 1991, J. Immunol., 147(8):2657-62; Shields R.L. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-604 и использование комбинаций последовательностей сегментов различных подтипов (например, комбинацииIgG2 и IgG4) с получением более существенного снижения связывания с Fc-рецепторами по сравнению с одним подтипом (Armour et al., Eur. J. Immunol., 1999, 26:2613-1624; Mol. Immunol., 40, 2003, 585-593). В данной области известно большое количество вариантов Fc-области с измененной и/или пониженной аффинностью для Fc-рецепторов некоторых или всех подтипов (и таким образом для эффекторных функций); см., например, заявки на патент США 2007/0224188; 2007/0148171; 2007/0048300; 2007/0041966; 2007/0009523; 2007/0036799; 2006/0275283; 2006/0235208; 2006/0193856; 2006/0160996; 2006/0134105; 2006/0024298; 2005/0244403; 2005/0233382; 2005/02157 68; 2005/0118174; 2005/0054832; 2004/0228856; 2004/132101; 2003/158389; также см. патенты США 7183387; 6737056; 6538124; 6528624; 6194551; 5624821; 5648260. При CDC комплекс антитело-антиген связывается с комплементом, приводя к активации каскада комплемента и генерации атаки мембраны комплексом. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их антигеном; таким образом, активация каскада комплемента частично регулируется аффинностью связывания иммуноглобулина с белком C1q. Для активации каскада комплемента необходимо, чтобы C1q связался по меньшей мере с двумя молекулами IgG1, IgG2 илиIgG3, но только с одной молекулой с IgM, присоединенной к антигенной мишени (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology, 2:77-94, 1995, p. 80). Для оценки активации комплемента можно провести тест CDC,например, описанный Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163, 1996. Было высказано предположение, что различные остатки молекулы IgG принимают участие в связывании с C1q, включая остатки Glu318, Lys320 и Lys322 в СН 2-домене, аминокислотный остаток 331, расположенный в максимальной близости к той же бета-цепи, остатки Lys235 и Gly237, расположенные в нижней шарнирной области, и остатки 231-238, расположенные в N-концевой области в СН 2-доменеDunkan and Winter, Nature, 332:738-40, 1988; Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184, 2000; патенты США 5648260 и 5624821). В качестве примера в IgG1 две мутации в СООН концевой области СН 2 домена человеческого IgG1 - K322 А и Р 329 А - не активируют путь CDC и было показано, что они приводят к более чем 100-кратному снижению связывания C1q (патент США 6242195). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения можно модифицировать, заместить или удалить один или более данных остатков или один или более аминокислотных остатков можно вставить в целях снижения активности CDC антител против CD154, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть желательным снизить или элиминировать эффекторную функцию(и) данных антител для снижения или элиминации вероятности активирования иммунных ответных реакций. Антитела с пониженной эффекторной функцией также могут снизить риск развития тромбоэмболических осложнений у субъектов, получающих антитела. В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-CD154 антителу, которое проявляет пониженное связывание с одним или более Fc-рецепторами, но которое сохраняет его способность связываться с комплементом (например, в аналогичной или в некоторых случаях меньшей степени по сравнению с нативным, немутантным или исходным анти-CD154-антителом). Следовательно, анти-CD154-антитело по настоящему изобретению может связываться и активировать комплемент, одновременно проявляя пониженное связывание с FcR, например, таким как FcRIIa (например, FcRIIa, экспрессированным на тромбоцитах). Такое антитело с пониженным связыванием или не связывающееся с FcRIIa (например, таким как FcRIIa, экспрессированным на тромбоцитах), но которое может связываться с C1q и активировать каскад комплемента, по меньшей мере, до некоторой сте- 26019636 пени будет снижать риск развития тромбоэмболических осложнений, одновременно с сохранением желаемых эффекторных функций. В альтернативных вариантах осуществления анти-CD154-антитело по настоящему изобретению показывает пониженное связывание с одним или более FcR, но сохраняет способность связываться с одним или более другим FcR; см., например, заявки на патент США 2007/0009523, 2006/0194290, 2005/0233382, 2004/0228856 и 2004/0191244, в которых описываются различные аминокислотные модификации, приводящие к получению антител с пониженным связыванием сFcRI, FcRII и/или FcRIII, а также аминокислотные замены, которые обеспечивают повышенное связывание с одним FcR, но пониженное связывание с другим FcR. Следовательно, эффекторные функции, в обеспечении которых принимает участие константная область анти-CD154-антитела, можно модулировать изменением свойств константой области и Fc, в частности. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело с пониженной эффекторной функцией сравнивают со вторым антителом с эффекторной функцией и которое может быть немутантным,нативным или исходным антителом (например, антителом 342 или антителом 5 с 8, которое описано в патенте США 5474771), содержащим константную область или Fc-область, которая опосредует эффекторную функцию. В конкретных вариантах осуществления модуляция эффекторной функции включает ситуации, при которых активность отменяется или полностью отсутствует. Нативная последовательность Fc-области или константной области содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области или константной области цепи, обнаруживаемой в естественных условиях. Предпочтительно контрольная молекула, используемая для оценки относительной эффекторной функции, содержит тот же тип/подтип Fc-области, что и тестируемое или мутантное антитело. Вариантная или измененная Fc-область или константная область содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой нативной последовательности области тяжелой цепи в результате по меньшей мере одной аминокислотной модификации (например, такой как посттрансляционная модификация, аминокислотная замена, вставка или делеция). Следовательно, мутантная константная область может содержать одну или более аминокислотных замен,делеций или вставок, которые приводят к измененным посттрансляционным модификациям, включающим, например, измененный профиль гликозилирования. Исходное антитело или Fc-область представляет, например, вариант, обладающий нормальной эффекторной функцией, используемый для конструирования константной области (т.е. Fc-области) с измененной, например, пониженной эффекторной функцией. Антитела с измененной (например, пониженной или элиминированной) эффекторной функцией(ми) можно получить конструированием или продукцией антител с вариантной константной областью, Fcобластью или областью тяжелой цепи. Можно использовать технологию рекомбинантной ДНК и/или культивирование клеток и условия экспрессии для получения антител с изменой функцией и/или активностью. Например, технологию рекомбинантной ДНК можно использовать для конструирования одной или более аминокислотных замен, делеций или вставок в областях (например, таких как Fc-область или константная область), которые оказывают влияние на функции антител, включая эффекторные функции. Альтернативно, можно обеспечить изменения в посттрансляционных модификациях, таких как профили гликозилирования (см. ниже), посредством манипуляций с клетками-хозяевами и культивированием клеток и условиями экспрессии, с помощью которых получают антитело. Изменения аминокислот, такие как аминокислотные замены, могут привести к изменению эффекторной функции анти-CD154-антител по настоящему изобретению без изменения аффинности связывания антигена. Описанные выше аминокислотные замены (в частности, Glu318, Lys320, Lys322, Lys235,Gly237, K332 и Р 329), например, можно использовать для получения антител с пониженной эффектоной функцией. В других вариантах осуществления аминокислотные замены можно провести для одного или более следующих аминокислотных остатков: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 константной области тяжелой цепи (см. патенты США 5624821 и 5648260). Такие замены могут изменить эффекторную функцию с одновременным сохранением при этом активности связывания антигена. Изменение по одной или более аминокислотам 234, 235, 236 и 237 может снизить аффинность связывания Fc-области с FcRIрецептором по сравнению с немодифицированным или немутантным антителом. Аминокислотные остатки 234, 236 и/или 237 можно подвергнуть замещению, например, на аланин, и аминокислотный остаток 235 можно заместить, например, на глутамин. В другом варианте осуществления анти-CD154 антитело может содержать замену Leu в положении 234 на Ala, замену Leu в положении 235 на Glu и замену Gly в положении 237 на Ala. Дополнительно или альтернативно, можно изменить аминокислотные остатки в Fc-области в положениях 318, 320 и 322. Данные аминокислотные остатки, которые являются высококонсервативными в мышином и человеческом IgG, опосредуют связывание комплемента. Было показано, что изменение данных аминокислотных остатков снижает связывание с C1q, но не изменяет связывание с антигеном,связывание с протеином А или способность Fc-области связываться с мышиными макрофагами. В другом варианте осуществления анти-CD154-антитело по настоящему изобретению представляет иммуноглобулин IgG4, содержащий замены, которые снижают или элиминируют эффекторную функцию. Fc-область IgG4 анти-CD154-антитела по изобретению может содержать одну или более из следующих замен: замену пролина на глутамат в остатке 233, аланина или валина на фенилаланин в остатке 234 и аланина или глутамата на лейцин в остатке 235 (EU нумерация по Kabat E.A. et al., 1991, выше). Кроме того, удаление сайта N-связанного гликозилирования в Fc-области IgG4 заменой Ala на Asn в остатке 297 (EU нумерация) может дополнительно снизить эффекторную функцию и элиминировать любую остаточную эффекторную активность, которая может иметь место. Другим примерным мутантомIgG4 с пониженной эффекторной функцией является вариант подтипа IgG4, содержащий мутации S228P и L235E (РЕ мутация) в константной области тяжелой цепи. Данная мутация приводит к обеспечению пониженной эффекторной функции; см. патенты США 5624821 и 5648260. Другой примерной мутацией в IgG4, которая приводит к снижению эффекторной функции, является S228P/T229A, описанная в данном документе. Другие приводимые в качестве примера изменения аминокислотных последовательностей в константной области включают, но не ограничиваются этим, мутацию Ala-Ala, описанную Bluestone et al.(см. WO 94/28027 и WO 98/47531; также см. Xu et al., 2000, Cell Immunol., 200:16-26). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитела с мутациями в константной области, включая мутацию Ala-Ala, можно использовать для снижения или отмены эффекторной функции. По данным вариантам осуществления константная область анти-CD154-антитела содержит мутацию на аланин в положении 234 или мутацию на аланин в положении 235. Дополнительно константная область может содержать двойную мутацию: мутацию на аланин в положении 234 и вторую мутацию на аланин в положении 235. В одном варианте осуществления анти-CD154-антитело содержит каркасную область IgG4, где мутация Ala-Ala будет относиться к мутации(ям) фенилаланина на аланин в положении 234 и/или мутации лейцина на аланин в положении 235. В еще одном варианте осуществления анти-CD154-антитело содержит каркасную область IgG1, где мутация Ala-Ala будет относиться к мутации(ям) лейцина на аланин в положении 234 и/или мутации лейцина на аланин в положении 235. Анти-CD154-антитело может, альтернативно или дополнительно, содержать другие мутации, включая точковую мутацию K322 А в СН 2 домене (Hezareh et al., 2001, J. Virol., 75:12161-8). Другие примерные аминокислотные замены приведены в заявке WO 94/29351 (этот источник в полном объеме включен в данный документ для сведения), в которой описаны антитела с мутациями вN-концевой области СН 2-домена, которые приводят к изменению способности антител связываться сFcRI со снижением тем самым способности антител связываться с C1q, что, в свою очередь, подавляет способность антител фиксировать комплемент; также см. Cole et al. (J. Immunol., 1997, 159:3613-3621), в этом источнике описаны мутации в верхних областях СН 2 в IgG2, которые приводят к снижению связывания с FcR. Способы получения любого из описанных выше вариантов антител, содержащих аминокислотные замены, хорошо известны в данной области. Данные методы включают, не ограничиваясь этим, получение посредством сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦРмутагенеза и кассетного мутагенеза полученной молекулы ДНК, кодирующей антитело или, по меньшей мере, константную область антитела. Сайт-направленный мутагенез является хорошо известным в данной области (см., например, Carteret al., Nucleic Acids Res., 13:4431-4443, 1985 и Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, 1987). ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотных последовательностей исходного полипептида; см. Higuchi в PCR Protocols, р. 177-183 (Academic Press, 1990) и Vallette et al.,Nuc. Acids Res., 17:723-733, 1989. Другим способом получения вариантов последовательностей является кассетный мутагенез, основанный на методе, описанном Wells et al., Gene, 34:315-323, 1985. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к анти-CD154-антителу с пониженной эффекторной функцией, в котором Fc-область антитела или ее участки заменены на Fc-область(или ее участки) с естественной пониженной индуцирующей активностью. Например, константная область человеческого IgG4 проявляет пониженную способность к активации комплемента или ее отсутствие. Кроме того, различные молекулы IgG различаются по их аффинности связывания в отношении FcR,что частично может быть результатом различной длины или гибкости шарнирных областей IgG (которая снижается в следующем порядке IgG3IgG1IgG4IgG2). Например, IgG4 показывает пониженное связывание с FcRIIa или его отсутствие. Примеры химерных молекул и химерных константных областей см., например, у Gillies et al. (Cancer Res., 1999, 59:2159-2166) и Miller et al., (Mol. Immunol., 1997, 34:441452). Также изобретение относится к анти-CD154-антителам с пониженной эффекторной функцией, в которых Fc-область полностью отсутствует. Такие антитела также можно отнести к производным антител и антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению. Такие производные и фрагменты можно слить с белковыми последовательностями, отличными от антител, или небелковыми структурами, особенно структурами, предназначенными для способствования доставке и/или биодоступности при введе- 28019636 нии животному, например человеку (см. ниже). Как уже обсуждалось выше, изменения в шарнирной области также оказывают влияние на эффекторные функции. Например, делеция шарнирной области может привести к снижению аффинности дляFc-рецепторов и может снизить активацию комплемента (Klein et al., 1981, PNAS USA, 78:524-528). Следовательно, настоящее изобретение относится к антителам с изменениями в шарнирной области. В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно модифицировать с целью ингибирования комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Модулированную активность CDC можно обеспечить введением одной или более аминокислотных замен, вставок или делеций вFc-области антитела (см., например, патенты США 6194551 и 6242195). Альтернативно или дополнительно, можно ввести остаток(и) цистеина в Fc-область с созданием тем самым дисульфидной связи между цепями в данной области. Полученное, таким образом, гомодимерное антитело может обладать повышенной или пониженной способностью к интернализации и/или повышенной или пониженной комплементзависимой гибели клеток; см., например, Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195, 1992 и Shopes В., J. Immunol., 148:2918-2922, 1992, WO 99/51642, DuncanWiner, Nature, 322:738-40, 1988; патент США 5648260; патент США 5624821 и WO 94/29351. Кроме того, следует понимать, что эффекторная функция может варьировать в зависимости от аффинности связывания антитела. Например, антитела с высокой аффинностью могут быть более эффективными в активации системы комплемента по сравнению с антителами с относительно низкой аффинностью (Marzocchi-Machado et al., 1999, Immunol. Invest., 28:89-101). Следовательно, антитело можно изменить таким образом, что аффинность связывания с его антигеном была снижена (например, изменением вариабельных областей антитела с использованием таких способов, как замена, добавление или делеция одного или более аминокислотных остатков). Антитело с пониженной аффинностью связывания может проявлять пониженные эффекторные функции, включая, например, пониженную ADCC и/илиCDC. Анти-CD154-антитела по настоящему изобретению с пониженной эффекторной функцией включают антитела с пониженной аффинностью связывания с одним или более Fc-рецепторами (FcR) по сравнению с исходным или немутантным анти-CD154-антителом. Следовательно, анти-CD154-антитела с пониженной аффинностью связывания с FcR включают анти-CD154-антитела, которые имеют 1,5-, 2-,2,5-, 3-, 4- или 5-кратное или более снижение аффинности связывания с одним или более Fc-рецепторами по равнению с исходным или немутантным анти-CD154-антителом (например, антителом 342 или 5 с 8). В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело с пониженной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью примерно в 10 раз ниже по сравнению с исходным или немутантным антителом. В других вариантах осуществления анти-CD154-антитело с пониженной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью примерно в 15 раз ниже или с аффинностью примерно в 20 раз ниже по сравнению с исходным или немутантным антителом. FcR-рецептор может представлять один или более из FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16) и их изоформы, и FcR, FcR, FcR и/или FcR. В конкретных вариантах осуществления анти-CD154-антитело с пониженной аффинностью имеет 1,5-, 2-,2,5-, 3-, 4- или 5-кратное или более снижение аффинности связывания с FcRIIa. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по настоящему изобретению проявляет пониженное связывание с белком комплемента по сравнению со вторым антиCD154-антителом. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело проявляет связывание,которое ниже примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более,примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более, примерно в 8 раз или более, примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более или примерно в 15 раз или более по сравнению со вторым анти-CD154-антителом. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам, которые проявляют пониженную эффекторную функцию при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по данному изобретению не вызывает тромбоза у субъекта, которому вводят антитело. Тромбоз включает, например, тромбоэмболические осложнения. Такие осложнения включают, например, вазопатию (например, сосудистые изменения, такие как утолщение внутренней оболочки сосудов и изменения в сосудистой стенке). В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по данному изобретению вызывает меньшие тромбоэмболические осложнения по сравнению со вторым CD154-специфическим антителом (например, антителом 342, антителом 5 с 8 или гуманизированным антителом 5 с 8). Анти-CD154-антитело с пониженной эффекторной функцией может показывать 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50% снижение частоты проявления тромбоэмболических осложнений при введении субъекту и по сравнению с немутантным или исходным анти-CD154-антителом. В некоторых вариантах осуществления анти-CD154-антитело по данному изобретению не вызывает агрегацию или активацию тромбоцитов в условиях in vitro и/или в меньшей степени повышает агрегацию или активацию тромбоцитов по сравнению со вторым CD154-специфическим антителом (например, антителом 5 с 8 или гуманизированным антителом 5 с 8; см. пример 1). Следовательно, в некоторых вариантах осуществления присутствие CD154-связывающего белка, например анти-CD154-антитела, по на- 29