Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина для лечения глиобластомы (gbm) и других видов рака

КОМПОЗИЦИЯ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И ОТНОСЯЩАЯСЯ К НИМ ПРОТИВОРАКОВАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ (GBM) И ДРУГИХ ВИДОВ РАКА Изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии,в частности иммунотерапии рака. Изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против глиомы.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE) 023378 Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против глиомы. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Уровень техники Глиомы являются опухолями головного мозга, возникающими из глиальных клеток нервной системы. Глиальные клетки, называемые обычно нейроглия или просто глия, являются не-нейрональными клетками, которые обеспечивают поддержку и питание, поддерживают гомеостаз, формируют миелин и участвуют в передаче сигналов в нервной системе. Две наиболее важные подгруппы глиом - это астроцитомы и олигодендроглиомы, называемые в соответствии с видами нормальных глиальных клеток, из которых они образуются (астроциты или олигодендроциты соответственно). Относящаяся к подгруппе астроцитом, мультиформная глиобластома (называемая далее глиобластомой) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга взрослых людей и на ее счет приходится приблизительно 40% всех злокачественных опухолей головного мозга и приблизительно 50% глиом. Она агрессивно поражает центральную нервную систему и имеет наивысший уровень злокачественности (степень IV) среди всех глиом. Хотя наблюдается постоянный прогресс в их лечении благодаря усовершенствованию нейровизуализации, микрохирургии, различным возможностям лечения, таким как Темозоломид или облучение, глиобластомы остаются неизлечимыми. Процент летальных исходов при этой опухоли головного мозга очень высок: средняя ожидаемая продолжительность жизни после постановки первого диагноза составляет 9-12 месяцев. 5-летний срок выживаемости в течение периода наблюдения с 1986 по 1990 гг. составил 8,0%. На данный момент 5-летний срок выживаемости вследствие агрессивной терапии, включая макроскопическое удаление опухоли, все еще ниже 10%. Соответственно существует высокая потребность медицины в альтернативном и эффективном методе лечения. Опухолевые клетки глиобластомы являются наиболее недифференцированными среди опухолей головного мозга, так что опухолевые клетки имеют высокий потенциал для миграции и пролиферации и являются высокоинвазивными, приводя к очень неутешительному прогнозу. Глиобластомы приводят к смерти из-за быстрого, агрессивного и инфильтрирующего роста в головном мозге. Паттерны инфильтрирующего роста являются причиной нерезектабельности этих опухолей. Глиобластомы также относительно резистентны к облучению и химиотерапии, и поэтому высок процент рецидивов после лечения. Кроме того, иммунный ответ на неопластические клетки довольно неэффективен для полного устранения всех неопластических клеток после резекции и лучевой терапии. Глиобластома подразделяется на первичную глиобластому (de novo) и вторичную глиобластому в зависимости от различий в генном механизме во время злокачественной трансформации недифференцированных астроцитов или глиальных клеток-предшественников. Вторичная глиобластома возникает в более молодом возрасте, до 45 лет. В течение 4-5 лет, в среднем, вторичная глиобластома развивается из астроцитомы низкой степени, проходя стадию недифференцированной астроцитомы. Первичная глиобластома,напротив, возникает в более пожилом возрасте, в среднем это 55 лет. В целом, первичная глиобластома возникает как молниеносная глиобластома, характеризуясь прогрессированием опухоли в течение 3 месяцев, начиная с состояния без клинических или патологических отклонений. Глиобластома мигрирует вдоль миелинизированных нервов и широко распространяется по центральной нервной системе. В большинстве случаев хирургическое вмешательство приводит лишь к ограниченно устойчивому терапевтическому эффекту. Злокачественные клетки глиомы ускользают от обнаружения иммунной системой хозяина за счет выработки иммуноподавляющих веществ, которые наносят вред пролиферации Т-клеток и выработке иммуностимулирующего цитокина ИЛ-2. Внутричерепные неоплазмы могут возникнуть из любых структур или видов клеток, присутствующих в ЦНС, включая головной мозг, мягкие мозговые оболочки, мозговой придаток, череп и даже остаточную эмбриональную ткань. Общая ежегодная частота заболеваемости первичными опухолями головного мозга в Соединенных Штатах составляет 14 случаев на 100000. Наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга - менингиомы, составляющие 27% всех первичных опухолей головного мозга, и глиобластомы, составляющие 23% всех первичных опухолей головного мозга (причем на счет глиобластомы приходятся 40% всех случаев злокачественных опухолей головного мозга взрослого населения). Многие из этих опухолей агрессивны и имеют высокую степень злокачественности. Первичные опухоли головного мозга являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей и второй по частоте причиной смерти от рака после лейкемии у детей. Поиск методов эффективного лечения пациентов от глиобластом продолжается и сейчас. Была изучена иммунотерапия или лечение посредством стимуляции иммунной системы, в целях борьбы с данными-1 023378 неопластическими клетками. Первые обнадеживающие результаты были получены "Northwest Therapeutics" с использованием препарата "DCVax Brain" для лечения глиобластомы в рамках иммунотерапевтических исследований с человеческими пациентами, в которых могли быть индуцированы антигенспецифические ответы ЦТЛ, приводившие к увеличению средних сроков выживаемости в сравнении с теми, что были получены с применением стандартных методов лечения, сопровождаемых минимальной токсичностью (Heimberger et al., 2006). Колоректальная карцинома. По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах. Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять множество лет. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это, частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак. Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой т.н. курсы лечения "FOLFOX" (вливание 5-FU/лейковорин плюс оксалиплатин) и "FOLFIRI" (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-FU). Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин,увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании. Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени,таких как Авастин (Avastin) (бевацизумаб) и Эрбитукс (Erbitux) (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований по лечению различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у 80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия EGFR. На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (mAbs) (цетуксимаб + иринотекан илиFOLFOX4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с FOLFOX4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы трех-четырех-годичные периоды наблюдения. Моноклональные антитела (mAbs), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно,имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудовVEGF (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток. Рак предстательной железы и другие опухоли. Число смертей от рака предстательной железы в 2007 г. составил 27050, что делает его наиболее частой причиной смерти от рака у мужчин. Несмотря на то, что процент смертности среди белого и афроамериканского населения снижается с начала 1990-х годов, до сих пор число афроамериканских мужчин более чем в два раза превышает число белых мужчин. Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым видом рака у мужчин. По неизвестным причинам частота заболеваемости значительно выше среди афроамериканцев, чем среди белых мужчин. Частота заболеваемости раком предстательной железы постоянно менялась на протяжении последних 20 лет: быстрый рост с 1988 по 1992 гг., резкое снижение с 1992 по 1995 гг. и умеренный рост с 1995 г. Данные тенденции отражают большей частью-2 023378 увеличение числа обследований на рак предстательной железы с помощью анализа крови на простатспецифический антиген (PSA). Умеренный рост частоты заболеваемости за последнее десятилетие связан,скорее всего, с распространенным скринингом PSA среди мужчин моложе 65 лет. Частота заболеваемости раком предстательной железы стабилизируется у мужчин 65 лет и старше. Число случаев достигло своего пика для белых мужчин в 1992 г. (237,6 случаев на 100000 человек) и для афроамериканцев - в 1993 г.(342,8 случаев на 100000 человек). Лечение рака предстательной железы может включать внимательное наблюдение, операцию, лучевую терапию, высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (HIFU), химиотерапию, криохирургию,гормональное лечение или какую-либо комбинацию. Какая из возможностей является наилучшей зависит от стадии заболевания, оценки по шкале Глисона и уровня PSA. Другие важные факторы - это возраст мужчины, общее состояние его здоровья и его отношение к возможным способам лечения и побочным эффектам от них. Так как все способы лечения могут иметь побочные эффекты, такие как эректильная дисфункция и недержание мочи, то в центре внимания при дискуссиях о способе лечения часто стоит возможность нахождения баланса между целью лечения и рисками, связанными с изменением стиля жизни. Если рак распространился за пределы простаты, то возможности для лечения значительно изменяются, так что большинство врачей, лечащих рак предстательной железы, используют множество номограмм для предсказания вероятности распространения. Лечение с использованием внимательного наблюдения,высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (HIFU), лучевой терапии, криохирургии и операции предлагаются обычно мужчинам, рак которых остается в пределах предстательной железы. Гормональная терапия и химиотерапия часто предусматриваются для лечения заболевания, которое распространилось за пределы простаты. Однако возможны исключения: лучевая терапия может использоваться для некоторых опухолей на поздних стадиях, а гормональная терапия - для опухолей на ранней стадии. Криотерапия,гормональная терапия и химиотерапия могут быть также предложены, если первоначальное лечение было неудачным, и рак прогрессирует. У значительного числа пациентов с раком предстательной железы, которые подвергаются простатэктомии из-за клинического подозрения на рост внутри органа, окончательное гистологическое обследование операционного материала показывает локально экстенсивное распространение опухоли за пределы органа. Для этих пациентов существует высокий риск быстрого локального рецидива, обнаруживаемого обычно как повышение уровня PSA с точки зрения биохимического рецидивирования заболевания. Терапевтические возможности в данной ситуации включают наружную лучевую терапию и гормональную абляцию; однако значимость данных терапевтических подходов, в особенности в отношении продления жизни пациента в долгосрочной перспективе, не подтверждена. Кроме того, необходимо учитывать возможность связанных с лечением осложнений, таких как появление стриктуры уретры (лучевая терапия),потеря полового влечения и импотенция, риск снижения содержания солей кальция в костях в связи с остеопорозом и существенно возросший риск патологической хрупкости костей (гормональная абляция). Более 90% всех случаев заболевания раком предстательной железы обнаруживаются на локальной и региональной стадиях; 5-летняя относительная выживаемость для пациентов, опухоли которых были диагностированы на этих стадиях, достигает 100%. В течение последних 25 лет 5-летняя выживаемость для всех стадий в целом увеличилась с 69 до примерно 90%. В соответствии с последними данными относительная 10-летняя выживаемость составляет 93%, а 15-летняя - 77%. Разительное увеличение выживаемости, в особенности 5-летней, отчасти связано с ранней постановкой диагноза и улучшениями в лечении. Несмотря на это, сроки выживаемости значительно сокращаются после распространения на другие ткани и органы. Рак легких. В 2007 г. ожидаются приблизительно 210000 новых случаев в США, что составляет около 15% всех диагнозов рака. Частота заболеваемости значительно снижается среди мужчин, с 102 случаев на 100000 человек в 1984 г. до 78,5 в 2003 г. Среди женщин частота заболеваемости стабилизировалась после долгого периода роста. В целях лечения рак легких классифицируется клинически на мелкоклеточный (13%) или не мелкоклеточный (87%). Рак легких является наиболее частой причиной смертности от рака как среди мужчин, так и среди женщин. Около 160390 смертей, составляющих приблизительно 29% всех летальных исходов от рака,ожидаются в 2007 г. Начиная с 1987 г., от рака легких ежегодно умирало больше женщин, чем от рака молочной железы. Число смертей среди мужчин значительно снижалось в период с 1991 по 2003 гг., примерно на 1,9% ежегодно. Смертность от рака легких среди женщин сохраняется на неизменном уровне после продолжительного роста на протяжении нескольких десятилетий. Данные тенденции по смертности от рака легких отражают снижение числа курящих на протяжении последних 30 лет. Вид лечения определяется типом (мелкоклеточный или немелкоклеточный) и стадией ракового заболевания и включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, а также нацеленные биологические терапии, такие как бевацизумаб (Avastin) и эрлотиниб (Tarceva). Для локализованного рака в качестве терапии обычно выбирается операция. Последние исследования указывают на то, что выживаемость с немелкоклеточным раком легких ранней стадии улучшается, если за операцией следует химиотерапия. Так как на момент своего обнаружения заболевание обычно распространилось, часто исполь-3 023378 зуются лучевая терапия и химиотерапия, иногда в сочетании с операцией. Химиотерапия в отдельности или в сочетании с лучевой терапией является стандартным лечением, выбираемым для мелкоклеточного рака легких, при данной схеме лечения большой процент пациентов испытывает ремиссию, которая в некоторых случаях бывает продолжительной. Одногодичная относительная выживаемость для рака легких слегка возросла с 37% в 1975-1979 гг. до 42% в 2002 г., во многом благодаря усовершенствованиям в хирургической технике и комбинированным способам лечения. Однако 5-летний срок выживаемости для всех стадий в целом составил лишь 16%. Процент выживаемости для всех случаев, обнаруживаемых, когда заболевание все еще локализовано, составляет 49%, однако только 16% всех случаев рака легких диагностируются на этой ранней стадии. Таблица 1 Предполагаемое количество случаев заболевания раком и смертей в зависимости от пола для США в 2007 г. (данные American Cancer Society - Американское общество по борьбе с раком Cancer FactsFigures 2007 Atlanta American Cancer Society, 2007)n. d. = Данные отсутствуют. Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы,рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина, который улучшал бы самочувствие пациентов без применения химиотерапевтических средств или других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты. Детальное описание изобретения. Все термины, используемые здесь, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Термин"пептид" используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды предпочтительно имеют длину в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину,и длиннее - 11 или 13, 14, 15, 16, 17 или 18 аминокислот в длину. Термин "олигопептид" используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину. Термин "полипептид" обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов "пептид" или "олигопептид", термин "полипептид" введен для обозначения молекул,содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.-4 023378 Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является "иммуногенным" (и, таким образом, "иммуногеном" в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, "иммуноген" будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать ответ Т-клетки. Для Т-клеточного "эпитопа" необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I или II класса, образующий трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид),который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и, особенно типично, длину в 9 аминокислот. Тклеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, типично имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае пептидов, которые связываются с молекулами МНС II класса, один и тот же пептид и соответствующий Т-клеточный эпитоп могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по общей длине из-за примыкающих последовательностей с различными длинами, расположенными перед аминным концом центральной последовательности и после ее карбоксильного конца соответственно. Рецепторы МНС II класса имеют более открытую структуру, пептиды, связанные с рецепторами МНС II класса, соответствующим образом, не полностью углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса. Как ни удивительно, это не применимо к пептиду в соответствии с SEQ ID1, так как небольшие изменения в длине пептида ведут к экстремальному снижению активности (см. ниже). У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA:HLA-A, HLA-B и HLA-C. HLA-A01, HLA-A02 и HLA-A11 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов. Человеческий геном имеет 3 различных локуса для генов МНС II класса: HLA-DR, HLA-DQ и HLADP. Рецепторы МНС II класса являются гетеродимерами, состоящими из альфа- и бета-цепи, которые обе фиксируются на клеточной мембране с помощью трансмембранного региона. HLA-DRB104 и HLADRB107 - это два примера различных бета-аллелей МНС II класса, о которых известно, что они кодируются в данных локусах. Аллели II класса сильно полиморфичны, к примеру, было описано несколько сотен различных аллелей HLA-DRB1. Для HLA-A02 и наиболее частых серологических видов HLA-DR частоты экспрессии в различных популяциях представлены в табл. 2. Таблица 2 Частоты экспрессии F HLAA02 и наиболее частых серологических видов HLA-DR Частоты выведены из частот гаплотипа Gf среди американцев, приводимых Mori et al. (Mori et al.,1997), с использованием формулы Харди-Вейнберга F=1-(1-Gf)2. Комбинации А 02 с определенными аллелями HLA-DR могут быть обогащенными или менее частыми, чем ожидается от их одиночных частот в связи с неравномерным распределением связей. Более подробная информация представлена в работеChanock et al. (Chanock et al., 2004). Поэтому для терапевтических и диагностических целей крайне желателен пептид, который связывается с подходящей аффинностью с несколькими различными рецепторами HLA II класса. Пептид, связывающийся с несколькими различными молекулами HLA II класса, называется беспорядочно связывающимся пептидом.-5 023378 Используемая здесь ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Термин "кодирующая область" относится к тому участку гена, который естественно или обычно кодирует для экспрессионного продукта того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему in vivo для нативного продукта экспрессии гена. Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК. Термин "нуклеотидная последовательность" относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов. Нуклеотидная последовательность, кодирующая для конкретного пептида, олигопептида или полипептида, может быть встречающейся в природе или может быть получена синтетически. В целом, фрагменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для обеспечения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице,включающей регуляторные элементы, образованные из микробиального или вирусного оперона. Термин "продукт экспрессии" означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и кодирующих эквивалентов любой последовательности нуклеиновой кислоты, образующихся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующих для той/тех же самой(ых) нуклеиновой(ых) кислот(ы). Термин "фрагмент", если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК,включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого обязательно сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии целой кодирующей области. Термин "фрагмент ДНК" относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, изолированной по крайней мере один раз в существенно чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и получение фрагмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие фрагменты обеспечиваются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними не-транслированными последовательностями или интронами,которые типично присутствуют в эукариотических генах. Последовательности не-транслированной ДНК могут быть представлены по ходу транскрипции из открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей. Термин "праймер" означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК и обеспечивает свободный конец 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь. Термин "промотор" означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции. Термин "открытая рамка считывания (ОРС)" означает серии триплетов, кодирующих для аминокислот без каких-либо терминирующих кодонов, и является последовательностью (потенциально), способной транслироваться в белок. Понятие "изолированный" означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру,естественное окружение, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является изолированным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть изолированы, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения. Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением могут также быть в "очищенной" форме. Термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, изолированные из библиотеки кДНК, обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала по крайней мере до одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков и более предпочтительно четырех или пяти порядков величины определенно рассматривается. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительным образом 99,999 или по крайней мере 99,99 или 99,9 и еще более желательно 99 вес.% или более. Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоя-6 023378 щим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в "обогащенной форме". Используемый здесь термин "обогащенный" означает, что концентрация материала по крайней мере в приблизительно 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 вес.%, предпочтительно по крайней мере около 0,1 вес.%. Рассматриваются также препараты с около 0,5, 1, 5, 10 и 20 вес.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение,могут предпочтительно быть в обогащенной или изолированной форме. Термин "активный фрагмент" означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или опционально с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно, "активный фрагмент" может также быть использован для инициации ответа Тклетки in vitro. Используемые здесь термины "участок", "сегмент" и "фрагмент", если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например,если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки,сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен последовательности SEQ ID1 по 20, которая соответствует встречающимся в природе или "материнским" белкам последовательностей сSEQ ID1 по 20. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз. В соответствии с настоящим изобретением термин "процентная доля идентичности" или "идентичный с процентной долей", если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности ("Сравниваемая последовательность") описанной или заявленной последовательностью ("Контрольная последовательность"). Процентная доля идентичности определяется, затем, по следующей формуле: процентная доля идентичности = 100 [I-(C/R)],где "С" является числом различий между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между контрольной последовательностью и сравниваемой последовательностью, где:(i) каждое основание или аминокислота в контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего противопоставленного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, и(iii) каждое противопоставленное основание или аминокислота в контрольной последовательности,которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, представляют собой различие; и"R" - это число оснований или аминокислот в контрольной последовательности по длине противопоставления сравниваемой последовательности с любой брешью, образующейся в контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту. Если существует противопоставление между сравниваемой последовательностью и контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчетам выше, имеет значение приблизительного равенства или "более чем" установленной минимальной процентной доли идентичности,тогда сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых подсчитанная здесь выше процентная доля идентичности меньше, чем установленная процентная доля идентичности. Исходные пептиды, раскрываемые здесь, могут быть модифицированы путем замещения одного или нескольких остатков в различных, по возможности отобранных, местах по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками так же, как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств, встречающихся в природе гомологичных белков, определенные замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения "консервативных замещений". Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из последующих пяти-7 023378 групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Asp, Asn, Glu, Gln); группа 3 - полярные, положительно заряженные остатки (His, Arg, Lys); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); группа 5 - крупные, ароматические остатки (Phe, Tyr, Trp). Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие "радикальные" замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов. Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Lаминокислот. Таким образом, D-аминокислоты могут быть замещены L-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные R-группы (т.е. R-группы, отличающиеся от обнаруженных в распространенных 20 аминокислотах природных белков) могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением. Если были произведены замещения на более чем одной позиции для получения пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более 4 позиций внутри пептида должны замещаться одновременно. Термин "Т-клеточный ответ" означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом in vitro или in vivo. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС класса I,эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней с введенным импульсным способом пептидом, с введенным импульсным способом предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид, секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, TNF-альфа или ИЛ 2, индуцированная пептидом, секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС класса II, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно IFN-гамма, TNF-альфа, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком. Иммунотерапевтические подходы в лечении. Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положительные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIPS) (Schubertnewly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA). Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, DRIPS, и более крупных пептидов. Тем не менее, пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС класса I. Данный не традиционный способ презентации класса I описывается в литературе как кросс-презентация. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Что касается класса I, то описываются альтернативные способы процессинга антигена, которые позволяют пептидам из эндогенных источников презентироваться молекулами МНС класса II (например, аутофагоцитоз). Комплексы из пептида и молекулы МНС класса I распознаются CD8-положительными цитотокси-8 023378 ческими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются CD4-положительными хелперными Т-клетками с соответствующим ТКР.CD4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация CD4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Gnjatic, S.D. Atanackovic, E. Jger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont,G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NYESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7); CD4+ Т-клетки могут приводить к локальному повышению уровня IFN-гамма. На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток ЦТЛ (т.е. CD8-положительных Т-лимфоцитов), CD4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (IFN) (Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686). К тому же было показано, что CD4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами HLA класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (Ab) (Kennedy, R.C., М.Н. Shearer,A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumorimmunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами HLA класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса(www.cancerimmunity.org,www.syfpeithi.de). Так как конститутивная экспрессия молекул HLA класса II обычно ограничена клетками иммунной системы, то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, изобретателям недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas С., Gitsioudis G.,Schoor O., Altenberend F., Mller M., Krmer B., Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J., Wernet D., Stenzl A.,Rammensee H.G., Klingel K., Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности АПК, например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом, у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas С., Gitsioudis G., Schoor O.,Altenberend F., Mller M., Krmer B., Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J., Wernet D., Stenzl A., Rammenseecarcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якорь") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "соединительный элемент" определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Rammensee H.G., Bachmann J., Stevanovic S. MHCligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997). В зависящей от МНС иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР). Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами,могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, например, в качестве продуктов мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ ("раковый тестикул"), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника. Были идентифицированы различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, PSA (простатспецифический антиген) и PSMA (простатспецифический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как bcr/abl в-9 023378 лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы,встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, в работе(6Ptl):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р 53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL, иHER-2/neu, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышению уровня экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al.Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака. Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности, т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как "киллерные клетки", известные также как CD8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. МолекулыHLA презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам HLA и презентируются на клеточной поверхности (Rammensee 1993). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не или в намного меньшей степени на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (TUMAPs). Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. В дополнение также мишени белков по ходу транскрипции, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом,косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. В основном любой пептид, способный связываться с молекулой МНС может выполнять функцию Тклеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН 1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как CD8+ ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и CD4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса. Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 гг. Буном (Boon) и коллегами в основном для показания меланомы. Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами. Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды.- 10023378 Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ,действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по крайней мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Banchereau 2001), а также увеличение выживаемости (личные беседы с J.Banchereau), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания. Исследование кандидатов демонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почечно-клеточной карциномы, проходили курс лечения с вакциной, составленной из 13 различных пептидовIMA901, ASCO meeting 2007; Poster3017). Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Тхелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (HLA класса I) или II (HLA класса II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов. В настоящем изобретении изобретатели изолировали и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами HLA класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, т.е. первичных проб пациентов,страдающих преимущественно от глиобластомы, но и также из первичных образцов тканей колоректального рака, почечно-клеточной карциномы, рака легкого, рака поджелудочной железы, злокачественной меланомы и рака желудка. Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (HLA) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности CD4 положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа ТН 1. Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (HLA) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации обоих,которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака. В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена обеспечением фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака, характеризующегося присутствием раковых клеток, презентирующих пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 илиSEQ ID NO: 3, включающая в терапевтически эффективном количестве два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 2 и SEQ ID NO 3, и/или два полинуклеотида, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO 2 и SEQ ID NO 3, и фармацевтически приемлемый носитель, где указанный пептид связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) человека класса I, и где указанный пептид способен стимулироватьCD8 Т-клетки. Еще в одном аспекте настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно включает по крайней мере один дополнительный опухолеассоциированный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4-20, или по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 1 иSEQ ID NO: 4-20. Пептиды могут иметь общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 17 аминокислотами. Пептиды могут также иметь непептидные связи. Согласно одному воплощению изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно включать по меньшей мере один приемлемый адъювант, выбранный из группы, состоящей из солей алюминия, Amplivax, dSLIM, GM-CSF, имиквимода, ImuFact, IS Patch, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac,монофосфорил липида А, Монтанида IMS 1312, Монтанида ISA 206, Монтанида ISA 50V, МонтанидаISA-51, ONTAK, векторной системы PepTel, микрочастиц PLG, резиквимода, виросом и других вирусоподобных частиц, стимулона QS21, Ribi's Detox, Quil, Freund's, холерного токсина, иммунологических адъювантов, цитокинов и колониестимулирующих факторов. При этом колониестимулирующий фактор может- 11023378 представлять собой гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ). Согласно еще одному воплощению изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку, которая может быть представлена дендритной клеткой. Кроме того, указанная по меньшей мере одна антигенпрезентирующая клетка может представлять собой клетку с введенным импульсным методом, или нагруженную пептидом, или может включать конструкцию экспрессии, кодирующую пептид. Согласно другому воплощению изобретения фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, внутрикожного, внутриопухолевого, перорального, дермального, назального, буккального, ректального, вагинального или топического введения, или для введения с помощью ингаляции. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения рака, характеризующегося присутствием раковых клеток, презентирующих пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, у пациента. При этом упомянутое лекарственное средство может представлять собой противораковую вакцину, а раковые клетки могут представлять собой клетки колоректального рака, рака простаты или глиобластомы. Как будет описано далее, пептиды, за исключением МЕТ-005, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые клетками, несущими МНС I или II класса. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), все вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу. Предпочтительным образом варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению. Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 3 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы. Таблица 3 Пептиды настоящего изобретения и функция материнского белка Хондроитин сульфат протеогликан 4 (CSPG4).CSPG4 (хондроитин сульфат протеогликан) представляет интегральный мембранный хондроитин сульфат протеогликан. Он известен как ранний маркер прогрессии меланомы, присутствующий на клеточной поверхности и вовлеченный в стимуляцию пролиферации, миграции и инвазии опухолевой клетки.CSPG4 сильно экспрессирован в 90% случаях человеческой меланомы. Хотя CSPG4 не является строго опухолеспецифическим, опухолереактивные ответы CD4+ Т-клеток у пациентов с меланомой и здоровых- 12023378 индивидов распознают CSPG4693-709 на HLA-DR11-экспрессирующих клетках меланомы при отсутствии аутоиммунности (Erfurt et al., 2007). Экспрессия CSPG4 улучшает интегрин-опосредованное распространение клеток, фосфориляцию(Yang et al., 2004). Кроме того, накоплены доказательства на основе данных in vitro о том, что CSPG4 играет важную роль в ангиогенезе опухоли. Таким образом, CSPG4-положительные опухоли, как было обнаружено, имеют значительно повышенную степень неоваскуляризации и объем сосудистой массы, и, как было продемонстрировано, CSPG4 отделяет ангиостатин, который в нормальных условиях ингибирует пролиферацию и ангиогенез эндотелиальных клеток. Незрелые сосуды также содержат CSPG4 положительные перициты, позволяя предположить, что эта клеточная популяция играет роль в модулировании пролиферации эндотелиальных клеток, блокируя ингибирующее действие ангиостатина во время развития сосудов (Chekenya et al., 2002b). Кроме активированных перицитов экспрессия CSPG4 была также описана для некоторых нормальных тканей, таких как эндотелиальные клетки, хондроциты, гладкомышечные клетки, определенные виды базальных кератиноцитов внутри эпидермиса, в равной степени как и внутри волосяного фолликула(Campoli et al., 2004). Во время ангиогенеза и в ответ на патологии CNS высокоподвижные клетки CSPG4 подвергаются быстрым морфологическим изменениям и мобилизуются в места, где происходит рост и восстановление сосудов. CSPG4 гиперэкспрессированы и в опухолевых клетках, и в перицитах кровяных сосудов злокачественных опухолей головного мозга (Chekenya and Pilkington, 2002). Вживлением клеток из CSPG4 положительной клеточной линии человеческой глиомы в головной мозг иммунодефицитных "голых" крыс было продемонстрировано, что данные опухоли имеют более высокую капиллярную плотность по сравнению с контрольными пробами; это предполагает, что экспрессией CSPG4 регулируются как функции, так и структура полученной от хозяина сосудистой сети опухоли (Brekke et al., 2006). В эксперименте с ксенотрансплантатом по вживлению сфероидов мультиформной глиобластомы (GBM), полученных биопсией, в "голых" крыс было установлено, что CSPG4 в основном ассоциируется с кровеносными сосудами как перицитов, так и компонентов основания мембраны сосудистой сети опухоли, и экспрессия ассоциирована с участками высокой клеточной пролиферации (Chekenya et al., 2002 а). Кроме того, экспрессия CSPG4 сравнима с прогрессией опухоли в модели с имплантированной глиомой (Wiranowska et al., 2006). Прогрессия злокачественного характера сохраняется при перекрестных помехах между опухолью и ее стромой, где активированная строма питает пролиферативные и инвазивные клетки новообразования, обеспечивая образование новых сосудов, внеклеточных матричных компонентов и стимулирующих факторов роста. В данном контексте CSPG4 играет ведущую роль в активации опухолевой стромы посредством изменений в клеточной адгезии, миграции, пролиферации и морфогенезе сосудов (Chekenya and Immervoll,2007).CSPG4 дифференциально экспрессирован в человеческих глиомах с более высокой экспрессией в глиомах высокой степени злокачественности по сравнению с глиомами низкой степени злокачественности(Chekenya et al., 1999). Высокая экспрессия CSPG4 соотносится с мультилекарственной резистентностью,опосредованной возросшей активацией сигнальных процессов с участием 31 интегрин/PI3K и их мишеней по ходу транскрипции, способствуя выживанию клеток (Chekenya et al., 2008). Белок, связывающий жирную кислоту 7, головной мозг (IMA-FABP7-001). Белки, связывающие жирную кислоту (FABPs), являются цитозольными белками 14-15 кДа, которые,как предполагается, задействованы в поглощении, транспортировке и нацеливании жирной кислоты (ЖК). Как считается, они увеличивают растворимость ЖК в цитоплазме во время транспортировки ЖК между мембранными компартментами и доставляют ЖК к их ядерным мишеням (Glatz et al., 2002). FABP могут модулировать концентрацию ЖК и, таким образом, оказывать влияние на различные клеточные функции,такие как ферментативная активность, экспрессия генов, клеточный рост и дифференциация (Glatz andStorch, 2001). Нервная ткань содержит четыре из девяти известных видов FABP с различным пространственновременным распространением (Veerkamp and Zimmerman, 2001). FABP7 высоко экспрессирован в клетках радиальной глии во время развития центральной нервной системы и постепенно снижается у взрослых(Feng and Heintz, 1995; Shimizu et al., 1997). Это необходимо для нейрон-индуцированной глиальной дифференциации и последующей миграции нейронов вдоль глиальных процессов, но не имеет влияния на клеточную пролиферацию и адгезию (Feng et al., 1994; Kurtz et al., 1994). В швановских клетках экспрессия FABP7 является нисходящим каскадом Ras-независимых сигналов EGFR, и он регулирует взаимодействия между швановскими клетками и аксонами в нормальных периферийных нервах и опухолях периферийных нервов (Miller et al., 2003).FABP7 мРНК экспрессирован в тканях нейроэпителиального происхождения в равной степени, как и в злокачественных глиомах (степени III и IV по ВОЗ). Ген был картирован на хромосомной полосе 6q2223 - регионе, который также содержит протоонкоген с-тус и часто подвергается потере гетерозиготности при злокачественной глиоме. Анализ клеточных линий злокачественной глиомы показал, что FABP7 часто ко-экспрессирован с глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP); предполагается, что клетка, в ко- 13023378 торой возникает злокачественная глиома, может быть астроцитной клеткой-предшественником, которая обладает потенциалом для экспрессии обоих белков в нормальных условиях или в результате образования опухоли (Godbout et al., 1998). Белок FABP7 проявляет от умеренной до сильной ядерной и цитоплазмической экспрессии в мультиформной глиобластоме (GBM). Трансфицированные FABP7 клетки глиомы проявляют в 5 раз большую миграционную активность, чем контрольные клетки. Таким образом, более короткая общая выживаемость, ассоциированная с гиперэкспрессией FABP7, в особенности в глиобластоме,может быть обусловлена повышенной миграцией и инвазией опухолевых клеток в окружающую мозговую паренхиму (Liang et al., 2005). Дальнейший анализ распределения FABP7 в астроцитомах указывает на повышенные уровни FABP7 в регионах инфильтрации опухолей, предполагая что FABP7 играет важную роль в направлении инфильтрации злокачественных клеток в смежные мозговые ткани (Mita et al., 2007).FABP7 демонстрирует вариабельные уровни экспрессии и субклеточную локализацию в глиальных тканях и всех степенях астроцитомы. Тем не менее, в особенности ядерная локализация FABP7, по-видимому,ассоциирована с инфильтративным фенотипом клеток глиомы и каскадами реакций EGFR, так как его ядерная транслокация была обнаружена после активации EGFR и ассоциируется с плохим прогнозом в случае EGFR-положительной мультиформной глиобластомы (GBM). Более того, ядерная иммунореактивность FABP7 не может наблюдаться в астроцитоме I степени (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007). Нейролигин 4, Х-связь (IMA-NLGN4X-001). Нейролигин 4, экспрессируемый сцепленным с Х-хромосомой геном, является членом семейства белков клеточной адгезии, который, по-видимому, выполняет определенную роль при созревании и работе нейронных синапсов. Члены семейства нейролигинов обладают сходной структурной организацией: содержат N-концевой сигнальный пептид, эстеразо-подобный домен с двумя местами альтернативного сплайсинга, короткий линкерный регион с низким сходством последовательностей перед трансмембранным доменом и короткую цитозольную часть с высоко консервативной С-концевой последовательностью. Относительно самые высокие уровни содержания нейролигина 4 мРНК были обнаружены в сердце. Более низкая экспрессия была установлена в печени, скелетных мышцах и поджелудочной железе, тогда как в головном мозге, плаценте, легких и почке нейролигин 4 мРНК было трудно обнаружить (Bolliger et al.,2001). Мутации Х-сцепленного гена NLGN4 являются потенциальной причиной спектра нарушений аутистического характера, и о мутациях сообщалось у нескольких пациентов с аутизмом, синдромом Аспергера и умственной отсталостью (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008). Были описаны немногие случаи ассоциации NLGN4X с раком: при желудочно-кишечных стромальных опухолях гиперэкспрессия NLGN4X была установлена в детском и юношеском возрасте в отличие от случаев со взрослыми (Prakash et al., 2005). Тенасцин С (гексабрахион) (IMA-TNC-001). Внеклеточный матрикс, окружающий опухолевые клетки, отличается от внеклеточного матрикса нормальных тканей. Тенасцин-С (TNC) - белок внеклеточного матрикса, который представлен в высоко повышенном количестве в процессах, тесно ассоциированных с повышенной миграционной активностью,такой как эмбриональное развитие (Bartsch et al., 1992), заживление ран (Mackie et al., 1988) и неопластические процессы (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Кроме того, TNC гиперэкспрессируется в сосудах опухоли, которые имеют высокий пролиферативный индекс, указывающий на то, что TNC задействован в неопластическом ангиогенезе (Kim et al., 2000). В нормальном человеческом головном мозге экспрессия TNC была установлена только в редких случаях, тогда как в злокачественных глиомах он экспрессирован в высокой степени (Bourdon et al., 1983). Экспрессия TNC может быть вызвана гипоксией (Lai et al., 2001), TGF-beta1, обеспечивая механизм для инвазии глиом высокой степени злокачественности в здоровую паренхиму (Hau et al., 2006), или гастрином, который существенно модулирует миграцию человеческих GBM-клеток (Kucharczak et al., 2001). TNC снижает количество тропомиозина-1 и, таким образом, дестабилизирует стрессовые волокна актина. Это вызывает снижение количества ингибитора сигнального Wnt-каскада, "Dickkopf". Так как снижение экспрессии тропомиозина-1 и возрастаниеWnt-сигналинга тесно связаны с трансформацией и онкогенезом, то TNC специфически модулирует данные сигнальные пути, усиливая пролиферацию клеток глиомы (Ruiz et al., 2004). Периваскулярное окрашивание TNC вокруг кровеносных сосудов, снабжающих опухоль, наблюдалось в тканях мультиформной глиобластомы (GBM), и менее часто в глиомах II и III степени по ВОЗ, указывая на то, что интенсивность окрашивания TNC соотносится со степенью опухоли, причем наиболее сильное окрашивание указывает на плохой прогноз (Herold-Mende et al., 2002). TNC также вносит свой вклад в генерацию ниши стволовых клеток внутри субвентрикулярной зоны (SVZ), принимая участие в управлении сигналами фактора роста для ускорения развития нервных стволовых клеток. Доминирующим эффектом TNC на клетках SVZ-зоны является регуляция процессов, связанных с прогрессией (Garcion etal., 2004). TNC является сильнейшим инициатором направленной миграции нервных стволовых клеток человека (NSC). Вырабатываемый опухолью ЕСМ, таким образом, обеспечивает терпимое окружение для тропизма NSC к рассеянным опухолевым клеткам (Ziu et al., 2006). Нейрональная молекула клеточной адгезии (IMA-NRCAM-001).NRCAM (адгезивная молекула нервных клеток) - это нейронная адгезивная молекула трансмембран- 14023378 ных клеток со множественными иммуноглобулин-подобными типа С 2 и фибронектиновыми доменами типа III. Она задействована в управлении, разрастании и фасцикуляции нейронов (Grumet et al., 1991;Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001) при формировании гомофильных, в равной степени как и гетерофильных взаимодействий с IgCAMs (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). Связывающаяся с анкирином NRCAM (Davis and Bennett, 1994) представлена в повышенном количестве в образующих трубки эндотелиальных клетках, позволяя предположить ее возможную роль в образовании трубок и ангиогенезе (Aitkenhead et al., 2002).NRCAM является геном-мишенью -катенина и комплекса плакоглобин-LEF/TCF, который содействует онкогенезу (Conacci-Sorrell et al., 2002). Эктодомен NRCAM может быть сброшен с клеточной поверхности металлопротеазо-подобными активностями. Этот сброшенный домен способен активировать разнообразные сигнальные пути, он повышает клеточную подвижность и ведет к онкогенезу у мышейNRCAM присутствует в повышенном количестве в анапластичных астроцитомах и опухолевых тканях мультиформной глиобластомы (GBM) по сравнению с нормальным головным мозгом, и повышенные уровни соотносятся с инвазивным поведением (Sehgal et al., 1998). Антисмысловая РНК, в отличие отNRCAM, снижает онкогенную способность GBM-клеток человека (Sehgal et al., 1999). Инсулиноподобный фактор роста, 2 мРНК-связывающий белок 3 (IMA-IGF2BP3-001).IGF2BP3 является членом белкового семейства инсулиноподобных факторов роста II, связывающих мРНК, вовлеченным в локализацию, оборот и трансляционный контроль мРНК. Этот белок содержит несколько KH-доменов (K-гомологических), которые важны в связывании РНК, и о которых известно, что они вовлечены в синтез и метаболизм РНК. Экспрессия проявляется, главным образом, во время эмбрионального развития и была описана для некоторых опухолей. Таким образом, IGF2BP3 рассматривается как онкофетальный белок (Liao et al., 2005). Высокий уровень транскрипции IGF2BP3 в многочисленных раковых тканях по сравнению с контрольными тканями указывает на то, что белок IGF2BP3 может играть функциональную роль в пролиферации трансформированных клеток. В пользу данной гипотезы говорит и то, что единственной незлокачественной тканью человека, экспрессирующей транскрипт IGF2BP3, является человеческая плацента, ткань, характеризующаяся клеточным ростом и пролиферацией (MuellerPillasch et al., 1997). В научной литературе нет специальной информации об экспрессии IGF2BP3 в глиобластоме, но описывалось, что IGF2BP3 гиперэкспрессирован в нескольких других злокачественных заболеваниях. Например, IGF2BP3 экспрессирован в образце светлоклеточной почечно-клеточной карциномы(RCC), и его экспрессия ассоциирована с распространенной стадией и степенью первичных опухолей. Кроме того, положительная экспрессия IGF2BP3 ассоциирована с повышенным в 5-10 раз риском отдаленных метастазов и с повышенным на 42%-50% риском летального исхода от RCC (Hoffmann et al., 2008;Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). Экспрессия IGF2BP3 обнаруживалась также в злокачественной меланоме в сравнении с доброкачественными невусами, где не было явной экспрессии, даже если присутствовали диспластические черты (Pryor et al., 2008). У пациентов, страдающих плоскоклеточной карциномой пищевода, Т-клетки, специфические для HLA-А 2402-рестриктированного пептидного эпитопа изIGF2BP3, могли наблюдаться в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL), лимфоцитах региональных лимфатических узлов и лимфоцитах периферической крови в 40% всех случаев (Mizukami et al., 2008).IGF2BP3 также высоко экспрессирован в карциномах поджелудочной железы. В 2 исследованиях 90% проб тканей опухолей поджелудочной железы проявляли экспрессию IGF2BP3 после иммуноокрашивания, в то время как не-неопластические ткани поджелудочной железы были негативными дляIGF2BP3. Кроме того, экспрессия прогрессивно возрастала вместе со стадией опухоли (Yantiss et al., 2005;Yantiss et al., 2008).Экспрессия IGF2BP3 была также обнаружена в существенно повышенном состоянии в уротелиальных опухолях высокой степени, в то время как он обычно не экспрессирован в доброкачественном уротелии или уротелиальных опухолях низкой степени. Более того, пациенты с IGF2 ВР 3 положительными опухолями имеют намного более низкий процент выживаемости без прогрессирования и выживаемости без болезни, чем те, что имеют IGF2 ВР 3-негативные опухоли (Li et al., 2008; Sitnikova et al.,2008; Zheng et al., 2008).BCAN - Бревикан (IMA-BCA-002). Бревикан (BCAN) является специфическим для головного мозга членом лектинового семейства хондроитинсульфатпротеогликанов. Сообщалось о двух изоформах BCAN: изоформе с полной длиной цепи,секретируемой во внеклеточный матрикс, и более короткой изоформе с последовательностью, которая предсказывает наличие гликофосфатидилинозитольного (GPI) "якоря". Секретируемая изоформа высоко экспрессирована от рождения в течение первых 8 лет жизни, а к 20 годам ее активность снижается до низких уровней, которые сохраняются в нормальном взрослом корковом веществе. Изоформа GPI экспрессирована на постоянно низких уровнях во время развития (Gary et al., 2000). BCAN принадлежит к семейству протеогликанов, описываемых обычно как барьерные молекулы, которые препятствуют клеточной и нейритной подвижности во взрослой нервной системе (Viapiano and Matthews, 2006). In vivo, BCAN экспрессирован вокруг границ рострального миграционного потока (Jaworski and Fager, 2000) и является основным компонентом с повышенным количеством глиального рубца после травмы нервной системы (Ja- 15023378BCAN имеет разительно высокое повышение количества в глиомах, где может быть установлено приблизительно 7-кратное повышение экспрессии по сравнению с нормальными уровнями (Gary et al.,2000; Gary et al., 1998). Экспрессия детектируется на границах инвазии экспериментально индуцированных опухолей (Glass et al., 2005) и повышена в опухолях с инфильтрирующими профилями (Phillips et al.,2006). В клинических случаях повышение количества BCAN соотносится с низкой выживаемостью пациентов с глиомами высокой степени злокачественности (Liang et al., 2005). В дополнение к увеличению уровня BCAN в глиоме, протеолитический процессинг белка полной длины может также вносить свой вклад в инвазию (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). Расщепление BCAN металлопротеазами семействаADAMTS является необходимым этапом в опосредовании его про-инвазивного эффекта в глиоме. При генерации сайт-специфической мутантной формы, которая устойчива к расщеплению ADMATS, было показано, что эта "не расщепляемая" форма BCAN не способна усиливать инвазивность глиомных клетокBCAN способствует активации EGFR, увеличивает экспрессию молекул клеточной адгезии и способствует секреции фибронектина (Hu et al., 2008).BCAN мРНК не был обнаружен в пробах коркового вещества взрослых людей у индивидов, которые умерли без нейрологических осложнений. Как яркое отличие, BCAN мРНК был обнаружен в каждой из 27 хирургических проб человеческой глиомы, таким образом, вызывая предположение, что BCAN может быть единственным селективным маркером в глиоме (Jaworski et al., 1996). Повышенное количество BCAN в глиоме не только ведет к общему повышению экспрессии, но и также к специфической для глиомы экспрессии дифференциально гликозилированных изоформ. Таким образом, В/bg является продуктом BCAN мРНК полной длины, который возникает из неполного или сокращенного гликозилирования центрального белка. В/bg экпрессирован на очень низком уровне во время второй половины пренатального и в первые дни постнатального развития, исчезает к одному году и отсутствует в нормальном взрослом головном мозге, но обнаруживается в пробах глиомы высокой степени злокачественности. В одном исследовании могло быть показано, что В/bg присутствовал в каждой пробе глиомы высокой степени злокачественности, степени 3 и 4, являясь причиной половины полной гиперэкспрессии, превышающей контрольные уровни, для не расщепленного BCAN. Пробы, которые были негативными для В/bg, принадлежали пациентам с диагнозом опухоли низкой степени злокачественности(Viapiano et al., 2005). Данная специфическая для глиомы высокой степени злокачественности экспрессия могла, таким образом, представлять реактивацию ранних программ развития, механизма, который задействован в прогрессии глиомы (Seyfried, 2001). IMA-BCA-002 содержит потенциальный сайт гликозилирования внутри своей последовательности. Было показано, что он является сильно иммуногенным в сравнении с другими пептидами, образованными из BCAN (IMA-BCA-001), не имеющими сайта гликозилирования. Кроме того, BCAN описывали как селективно гиперэкспрессированный в одном виде образованных из глиобластомы опухолевых клеток, которые проявляют наиболее высокую плюрипотентность и онкогенность (Gunther et al., 2008).Met-протоонкоген (рецептор фактора роста гепатоцитов) (IMA-MET-005). Протоонкоген MET, c-Met, кодирует рецептор трансмембранной тирозинкиназы, который способен модулировать клеточную пролиферацию, дифференциацию, подвижность, адгезию и инвазию. Он активируется фактором роста гепатоцитов (HGF) (Giordano et al., 1989; Trusolino and Comoglio, 2002). Сигнальные реакции c-Met задействованы в регенерации органов, как было продемонстрировано, для печени и почек, эмбриогенеза, кроветворения, развития мышц и при регуляции миграции и адгезии нормально активированных В-клеток и моноцитов (Naldini et al., 1991; Mizuno et al., 1993; Bladt et al., 1995;Schmidt et al., 1995; Zarnegar and Michalopoulos, 1995; van der Voort et al., 1997; Beilmann et al., 2000). В исследованиях различных видов опухолей было продемонстрировано несколько механизмов для активации c-Met, включая аутокринную петлю HGF/c-Met, активацию точечных мутаций, белок слиянияal., 1994; Schmidt et al., 1997; Olivero et al., 1999; Park et al., 1999; Di Renzo et al., 2000). Конститутивная активация c-Met посредством фосфорилирования также описывалась в качестве важного механизма онкогенеза при светлоклеточной RCC (почечно-клеточная карцинома) у человека (Nakaigawa et al., 2006). Далее, многочисленные исследования показали, что гиперэкспрессия c-Met задействована в злокачественной трансформации и инвазивности злокачественных клеток. c-Met опосредует мультифункциональные и потенциально онкогенные активности фактора роста гепатоцитов HGF (Bottaro et al., 1991; Rubin etal., 1993; Zarnegar and Michalopoulos, 1995). При связывании с рецептором HGF вызывает автофосфорилирование c-Met и активирует сигнальные процессы по ходу транскрипции, включая ras, фосфатидилиноситол 3'-киназу, фосфолипазу С и активированные митогеном белковые каскады реакций, связанные с киназой (Naldini et al., 1991; Ponzetto et al., 1993; Montesano et al., 1998; Furge et al., 2000; Dong et al., 2001;Furge et al., 2001). Ген c-Met экспрессирован преимущественно в эпителиальных клетках и гиперэкспрессирован в нескольких злокачественных тканях и клеточных линиях (Di Renzo et al., 1995; Ferracini et al.,1995; Tuck et al., 1996; Koochekpour et al., 1997; Fischer et al., 1998; Ramirez et al., 2000; Li et al., 2001;- 16023378 Гиперэкспрессия c-Met, зачастую вызванная опухолевой гипоксией, ведет к конститутивной активации рецептора и соотносится с плохим прогнозом. "Выключение" эндогенного гена с-МЕТ приводит к сбоям в выполнении полной программы инвазивного роста in vitro, отсутствию роста опухоли и снижению образования экспериментальных метастазов in vivo (Corso et al., 2008). Гиперэкспрессия с-МЕТ описывалась для GBM (Tso et al., 2006). c-Met соотносится с гистологической степенью опухоли, позволяя предположить, что образование аутокринной петли HGF/c-MET появляется вместе с прогрессией астроцитных опухолей головного мозга. Поэтому считается, что HGF демонстрирует активность, индуцирующую миграцию/инвазию для клеток GBM, несущих рецептор c-Met (Moriyama et al., 1999). Промотор c-Met содержит индуцируемые при гипоксии фактор-1-связывающие сайты,таким образом, было показано, что гипоксия активирует промотор c-Met и приводит к высоким уровням его экспрессии. Приблизительно половина всех человеческих глиобластом (GBM), как считается, отвечает на гипоксию индукцией c-Met, который может усиливать стимулирующий эффект HGF на миграцию опухолевых клеток (Eckerich et al., 2007) и может привлекать стволовые клетки нервной системы к опухоли(Kendall et al., 2008). c-Met и EGFR часто ко-экспрессированы при злокачественной астроцитоме (Reznik etal., 2008). Как было продемонстрировано, активирующий сайт фосфориляции на рецепторе c-Met сильно чувствителен к уровням EGFRvIII, что предполагает перекрестную связь между EGFRvIII и рецептором cMet в глиобластоме (Huang et al., 2007 а; Huang et al., 2007b). MET предлагался в качестве маркера для стволовых раковых клеток в глиобластоме (Nam et al., 2008). Другое исследование показало, что МЕТ был селективно гиперэкспрессирован в другом подтипе образованных из GBM раковых стволовых клеток(Gunther et al., 2008). Промежуточные результаты второй фазы исследования с пациентами с рецидивирующей GBM с использованием AMG102, человеческого нейтрализующего антитела против HGF, позволяют предположить,что у некоторых пациентов заболевание может зависеть от сигнальных путей c-MET-HGF, так как из участвовавших 18 пациентов у 1 наблюдался частичный ответ, у 1 - меньший ответ и у 2 - стабильное протекание болезни (Reardon et al., 2008). Интересно, что существует некоторая очевидность для взаимодействия сигнальных реакций МЕТ с каскадом реакций Wnt/бета-катенина, зачастую представленного в повышенном количестве при раке толстой кишки. МЕТ может активироваться простагландином Е 2 (PGE2), и PGE2-активированный c-Met ассоциируется с -катенином, увеличивая его тирозиновое фосфорилирование, тем самым индуцируя инвазивность раковых клеток при раке толстой кишки (Pai et al., 2003). Недавно была описана совместная активация МЕТ и бета-катенина, приводящая к положительному контуру обратной связи между этими двумя ключевыми игроками при колоректальном онкогенезе (Rasola et al., 2007). Уровень экспрессии c-Met мРНК в первичных опухолях КРР (n = 36) является важным предсказывающим маркером для инвазии на ранних стадиях и региональных метастазов заболевания, таким образом, находясь в прямом соотношении со стадией рака толстой кишки (Takeuchi et al., 2003). Другой анализ экспрессии c-Met в 130 пробах КРР показал гиперэкспрессию (T/N2,0) c-Met в 69% случаев первичного КРР и значительно повышенные уровни c-Met при КРР с поражением кровеносных сосудов (Р = 0,04) и на поздней стадии (Р = 0,04), подтверждая роль c-Met в прогрессировании и распространении метастазов при КРР человека (Zeng et al., 2004). В другом исследовании в 69 и 48% из 60 аденокарцином толстой кишки было установлено повышение c-Met мРНК в более чем 2 и более чем 10 раз соответственно по сравнению со смежной нормальной слизистой оболочкой (Kammula et al., 2007). Таким образом, увеличение передачи сигналов c-Met является широко распространенным явлением на ранней стадии КРР, но и проявляющееся даже с еще большей экспрессией на поздних стадиях и при метастатической болезни.- 17023378 Таблица 4 Дополнительные иммуногенные пептиды, полезные для композиции по изобретениюGTP-азой подсемейства Rho, которая регулирует сигнальные пути, которые контролируют различные клеточные функции, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прохождение клеточного цикла. Как было установлено, CDC42 высоко гиперэкспрессирован при глиобластоме. В патенте WO 2004/067023 описываются пептиды, рестриктированные по МНС класса I, образованные из опухолеассоциированного антигена сурвивина, пептиды из которого способны связываться с молекулами I класса HLA с высокой аффинностью. Секретированный фосфопротеин 1 (SPP1), также известный как костный сиалопротеин I (BSP-1),ранняя активация Т-лимфоцитов (ЕТА-1) и под наиболее известным названием -остеопонтин (OPN), является человеческим генным продуктом, который также сохраняется и у других видов. Остеопонтин участвует в качестве важного фактора при ремоделировании костей. В особенности исследования предполагают, что он играет роль в фиксации остеокластов к минеральной матрице костей. Органическая часть кости составляет около 20% сухого веса и включает, другие чем остеопонтин составные, - коллаген типа I, остеокальцин, остеонектин, костный сиалопротеин и щелочную фосфатазу. На коллаген типа I приходится 90% белковой массы.OPN связывается с несколькими рецепторами интегрина, включая 41, 91 и 94, экспрессируемыми лейкоцитами. Для этих рецепторов была хорошо обоснована функция в клеточной адгезии, миграции и выживаемости этих клеток. Поэтому последние исследования были сфокусированы на роли OPN в опосредовании таковых ответов. Остеопонтин экспрессирован в диапазоне иммунных клеток, включая макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и Т- и В-клетки с разнообразной кинетикой. Об OPN сообщалось, что он выступает в качестве иммунного модулятора с разнообразием способов действия. Во-первых, он имеет хемотактические свойства, которые способствуют рекрутингу клеток к местам воспаления. Он также действует как белок адгезии, участвуя в присоединении клеток и заживлении ран. Помимо этого, OPN опосредует клеточную активацию и выработку цитокинов, а также способствует выживаемости клеток при регуляции апоптоза. Активированные Т-клетки поддерживаются ИЛ-12 для дифференциации до типа Th1 с выработкой цитокинов, включая ИЛ-12 и IFN. OPN ингибирует выработку Th2 цитокина ИЛ-10, который приводит к усиленному ответу Th1. OPN влияет на опосредованную клетками иммунность и имеет функции цитокинаTh1. Он усиливает выработку В-клеточного иммуноглобулина и пролиферацию. В последних исследованиях 2008 г. делается предположение, что OPN также вызывает дегрануляцию тучных клеток. [NagasakaA., Matsue H., Matsushima H., et al. (February 2008). "Osteopontin is produced by mast cells and affects IgEmediated degranulation and migration of mast cells". Eur. J. Immunol. 38 (2): 489-99] Исследователи заметили,что IgE-опосредованная анафилаксия была значительно снижена у OPN-нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого вида. Роль OPN в активации макрофагов рассматривалась также в исследовании рака,когда исследователи обнаружили, что OPN-вырабатывающие опухоли были способны индуцировать активацию макрофагов по сравнению с опухолями с недостатком OPN.OPN является важным антиапоптическим фактором при многих обстоятельствах. OPN блокирует вызванную активацией клеточную смерть макрофагов и Т-клеток в равной степени как и фибробластов и эндотелиальных клеток, не защищенных от опасных стимулов. OPN предупреждает не запрограммированную смерть клетки при воспалительном колите.- 18023378 Тот факт, что OPN взаимодействует со множеством рецепторов на поверхности клетки, которые повсеместно экспрессированы, делает его активным участником многих физиологических и патологических процессов, включая заживление ран, ремоделирование кости, онкогенез, воспаление, ишемию и иммунные реакции. Поэтому манипуляция плазменных уровней OPN может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса. Было показано, что OPN возбуждает выработку ИЛ-17; OPN гиперэкспрессирован в различных видах рака, включая рак легких, рак молочной железы, колоректальных рак, рак желудка, рак яичника, меланому и мезотелиому; OPN содействует гломерулонефриту и тубулоинтерстициальному нефриту; и OPN был обнаружен в атеросклеротических бляшках внутри артерий. Таким образом, манипуляция плазменных уровней OPN может быть полезна при лечении аутоиммунных заболеваний, раковых метастазов, остеопороза и некоторых форм стресса. Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторного типа, Zeta1 (PTPRZ1, РТР-).PTPRZ1 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок I типа с двумя цитоплазматическими тирозин-белковыми фосфатазными доменами, одним альфа-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. Экспрессия этого гена индуцирована в раковых клетках желудка (Wu et al., 2006),при раке молочной железы (Perez-Pinera et al., 2007), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (Harroch et al., 2002) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии (Wang et al., 2005). Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (Lu et al., 2005), и геномной амплификации ДНК в глиобластоме (Mulholland et al.,2006). Хитиназа-3-подобный белок 2 (CHI3L2).CHI3L2 был первоначально идентифицирован из хондроцитов, и он представлен в повышенном количестве, например, при остеоартрите (Steck et al., 2002). Хотя этот белок еще не достаточно хорошо охарактеризован, он, скорее всего, секретируется во внеклеточное пространство. Его часто описывали как антиген-мишень при ревматическом артрите. Экспериментальная индукция анти-ангиогенеза при трансфекции siPHK (VEGF-А) человеческой глиомной клеточной линии вызвала повышение количестваCHI3L2. Сурвивин (BIRC5). Экспрессия BIRC5 (сурвивин), члена семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP), содержится в повышенном количестве в фетальных тканях и различных видах рака человека. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптических клеток. В особенности, в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (Angileri et al.,2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, анти-апоптозе и ангиогенезе (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). В особенности для глиобластомы, но и также для других видов опухолей, экспрессия сурвивина была существенно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшей экспрессией сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al.,2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002). Коровый антиген вируса гепатита В. Для корового белка НВс вируса гепатита В (HBV) иммуногенные пептиды хорошо известны (Bertoletti et al., 1993; Livingston et al., 1997). Пептид из НВс, состоящий из десяти аминокислот, может быть включен в качестве положительного контроля в противораковые вакцины, основанные на настоящем изобретении, для контроля иммунокомпетентности и успешной иммунизации пациентов. В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID3 и аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID2, а также дополнительный пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID17. Дальнейшие предпочтительные воплощения изобретения включают по крайней мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID1 по SEQ ID12 и SEQ ID14 по SEQ ID20. Фармацевтическая композиция в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже."Вариантной аминокислотной последовательностью" данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС,- 19023378 такой как HLA-A или -DR, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из банка данных, определенные позиции связывающихся с HLA-A пептидов являются типичными "якорными" остатками, образующими центральную последовательность,подходящую к соединительному элементу HLA-связывающей бороздки. Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано. В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы "коровой последовательностью", имеющей конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). N- и/или Стерминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но типично они могут иметь молекулярный вес менее чем 100000, предпочтительно менее чем 50000, более предпочтительно менее чем 10000, более предпочтительно менее чем 5000, более предпочтительно менее чем 2500 и типично около 1000 и до 2000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 17, а именно 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот. Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID8, SEQ ID12 и SEQ ID14 по SEQ ID20 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на С-терминальном и/или N-терминальном конце,более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в любом соотношении к С-концу и N-конпу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии,что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA таким же путем, как и указанный пептид в соответствии с любой из SEQ ID8, SEQ ID12 и SEQ ID14 по SEQ ID20. В соответствии с этим, варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине. Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному HLA-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Кроме того,примыкающие аминокислоты могут также снижать скорость деградации пептидов in vivo, так что количество фактического пептида, находящегося в распоряжении ЦТЛ, выше по сравнению с пептидом без примыкающих аминокислот. Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Также как и в случае с эпитопами МНС II класса, предпочтительно, чтобы примыкающие остатки удлиненных пептидов-предшественников против и/или по ходу транскрипции N- и Сконца истинного эпитопа существенно не влияли на презентацию пептида ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для получения истинного эпитопа, опосредованного процессингом удлиненного пептида. Предпочтительными являются пептиды с коровой последовательностью, состоящие из SEQ ID1 по SEQ ID7 и SEQ ID9 по SEQ ID11 с удлиняющими сегментами из 1 до 10 аминокислот на Стерминальном и/или N-терминальном конце, более предпочтительно, если общее число данных примыкающих аминокислот составляет от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, где примыкающие аминокислоты могут быть распределены в лю- 20023378 бом соотношении к С-концу и N-конпу (например, все примыкающие аминокислоты могут быть добавлены к одному концу, или же аминокислоты могут быть добавлены в равном количестве к обоим концам или в любой другой пропорции), при условии, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулойSEQ ID9 по SEQ ID11. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 18, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 аминокислот. Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека МНС I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в литературе для различных аллелей МНС II классаhuman twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int. Immunol. 1998 (12): 1765-1776). Дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на N- и/или С-конце, не являющиеся обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как истинный эпитоп для молекул МНС,могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки (см. выше). В одном воплощении настоящего изобретения пептид настоящего изобретения является белком слияния, который включает, например, 80 N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р 33, в дальнейшем "Ii"), как взятая из банка данных NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497 (Strubin, M., Mach, В. and Long,E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide withan unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984. Предпочтительными являются фармацевтические композиции, где пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 17 или 9, 10, 11, 12,13, 14, 15 или 16 аминокислот. Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают,например, введение обратных пептидных или непептидных связей. Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой по крайней мере один пептид или вариант включает непептидные связи. В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями(-CO-NH-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими как описано в работе Meziere и соавт. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere и соавт. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Тхелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи NH-СО вместо пептидных связей CO-NH,намного более устойчивы к протеолизу. Непептидной связью, является, например, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -СН=СН-, -СОСН 2-,-СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-. Патент США 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-CH2-NH) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NaCNBH3. Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или третбутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным об- 21023378 разом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов. Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, D-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный L-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению. Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела "Current Protocols" в журнале "Protein Science", Eds. Coligan et al. (John WileySons NY 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков. Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с PEG-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия. В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu и соавт. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433-3436 и в прилагающихся ссылках. Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием,к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода. Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (FAB), а также массспектрометрический анализ MALDI и ESI-Q-TOF. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид),кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК,ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется,только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов. Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе Sambrook и соавт. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. В особенно предпочтительном воплощении изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID1 по SEQ ID12.- 22023378 Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (i. v.) инъекции, подкожной (s. с.) инъекции, внутрикожной (i. d.) инъекции, внутрибрюшной (i. p.) инъекции, внутримышечной (i. m.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - s.c., i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются i.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Brunsvig P.F., Aamdal S., Gjertsen M.K., Kvalheim G., Markowski-Grimsrudvaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена так, что выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раково- и/или пациентспецифической/ими. Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить образцы экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, отHLA-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения. Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против КРР, например,будут избегаться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфического для данного конкретного белка или сигнального пути данного белка. Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток in vitro в равной степени, как их эффективность и общее присутствие, пролиферацию, аффинности и размножение конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток,например, при анализе выработки IFN-гамма (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются, затем, в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше. Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, или 14 различных пептидов и наиболее предпочтительно 10, 11,12, 13 или 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 8- или 9- или 10- или 11-мерным пептидом или 12-, 13-, 14- или 15-мером. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в приложенных табл. 1 и 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I, в то время как 12-15-меры предпочтительны для пептидов МНС класса II. Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться invitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Т-клетки CD4 или ЦТЛ CD8. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного CD. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют Т-клетки CD4, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD8 положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют CD8- 23023378 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4-положительные Т-клетки. CD4- и CD8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т.п. Примеры составов рассматриваются, например, в работе Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott WilliamsWilkins, 2000 и включают, но не ограничиваются, раствором натрия хлорида, водой,буферной водой, 0,3% глицином, гиалуроновой кислотой, декстрозой и т.п. Недавно было обнаружено,что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутривенного питания пациентов (людей), могут также выступать в роли наполнителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Интралипид (Intralipid) и Липофундин (Lipofundin). "Intralipid" является зарегистрированной торговой маркой фирмыKabi Pharmacia, Швеция, для жировой эмульсии для внутривенного питания и описывается в патенте США U.S. Pat. No. 3169094. "Lipofundin" - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Braun Melsungen, Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10 или 20% соответственно). Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка - в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изотоничность является результатом добавления глицерола (25 г/л) как в Интралипид, так и в Липофундин. Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить адъюванты, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает далее по крайней мере один подходящий адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ(например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (ТН) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP870,893, CpG7909, СуаА, Mologen's dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимод, ImuFact IMP321, интерферон-альфа или -бета, IS Patch, ISS, ISCOMs, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфорил липид А, и другие нетоксические производные LPS, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V, МонтанидISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторная система PepTel, микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан,Pam3Cys, Aquila's QS21 стимулон (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который получают из сапонина,микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox. Quil или Superfos. Предпочтительными адъювантами являются такие как Имиквимод, Резимиквимод, неполный адъювант Фрейнда, интерферон-альфа или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например,MF59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Dupuis M., Murphy T.J., Higgins D., Ugozzoli M., van Nest G., Ott G., McDonald D.M.; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A.C.; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, TNF-), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (амер. патент 5849589, специфически включенный сюда в его целостности путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12) (Gabrilovich D.I., Cunningham H.T., Carbone D.P.; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendriticcells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418). Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах CpG также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, CpG-олигонуклеотиды при активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR), в основном TLR9. Вызванная CpG активация TLR9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации ТН 1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи CD4 Т-клеток. Отклонение в сторону ТН 1, вызванное стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют отклонению в сторону ТН 2. CpG-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы,липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного- 24023378 ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484). В патенте США 6406705 B1 описывается комбинированное применение CpG-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом CpG TLR9 является dSLIM (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании"Mologen" (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с TLR, такие как РНК, связывающаяся с TLR 7, TLR 8 и/или TLR 9. Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными CpG (например, CpR, Idera), Poly(I:C) (например, polyI:C12U), не-CpG бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как имидазохинолины, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, XL-999, СР-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, ипилимумаб, тремелимумаб и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются dSLIM, БЦЖ, OK432, имиквимод, резимиквимод, ГМКСФ, интерферон-альфа, PeviTer и JuvImmune или их комбинации. В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа. В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод и резиквимод. В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является комбинация из ГМ-КСФ и имиквимода. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное,внутримышечное, внутрибрюшинное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят,например, из работы A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, изд. "American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press". Композиция может применяться для предупреждения,профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно КРР. Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС скорее, чем интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Так, активация ЦТЛ возможна, только если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС. Поэтому в предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку. Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном воплощении является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro. Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т 2 - нагружающую пептидом дефектную клеточную линию человека,которая имеется в наличии в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговымCRL 1992; клеточные линии, в которых не хватает ТАР, могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами при тщательной проверке, использованными для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут определенно приписываться использованным пептидам. Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использова- 25023378 нием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается в работе Murphy и соавторов (1996) The Prostate 29, 371-380 и Tjua etal. (1997) The Prostate 32, 272-278. Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения в фармацевтическую композицию,содержащую по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку, введен импульсным методом или погружен пептид, к примеру, методом примера 4. В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка включает модель экспрессии, кодирующей пептид. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета. Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к MUC1 (см. Gong et al.(1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 и Szabolcs et al. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Tuting et al. (1997)Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182). В целом, фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения. По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту, которым она лечится. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивировании опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому, в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым веществом. Второе противораковое вещество может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым веществом, при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового вещества в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например,инъецирована, в то время как второе противораковое вещество вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое вещество могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения. Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности, активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным, при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящей спецификации. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение роста обработанной опухоли и/или ее рецидива. В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения фармацевическая композиция применяется в качестве противораковой вакцины. Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также формировать вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей,раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не-Ходжкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком молочной железы,раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком головного мозга, гастроинтести- 26023378 нальной стромальной опухолью (GIST) или глиобластомой, предпочтительно опухолями головного мозга и еще более предпочтительно глиобластомами. В наиболее предпочтительном воплощении метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является комплексной пептидной противоопухолевой вакциной для лечения глиобластомы. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных изSEQ ID1 по SEQ ID12, которые локализованы и были идентифицированы на первичных клетках глиобластомы. Этот комплекс включает пептиды HLA класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена HBV, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном конкретном воплощении вакцина состоит из 14 отдельных пептидов (в соответствии с SEQ ID1 по 12) с весом каждого пептида от около 1500 до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 до около 175 мкг и более предпочтительно от около 500 до около 600 мкг, наиболее предпочтительно около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и наиболее предпочтительно между около 300 до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин "около" подразумевает здесь+/- 10% заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например,иммунный статус отдельного пациента и/или количество TUMAP (опухолеассоциированный пептид), который презентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата. Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли. Используемое здесь понятие "фармацевтически приемлемая соль" относится к производным раскрытых пептидов, причем пептид модифицирован путем получения кислотных или щелочных солей агента. Например, кислотные соли получают из свободного основания (типично, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -NH2) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислотных солей включают как органические кислоты, например уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту,оксиянтарную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту,винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например хлористо-водородную кислоту, бромисто-водородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, приготовление щелочных солей кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, приготовляются при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобные. В одном особенно предпочтительном воплощении фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты(ацетаты), аммония или хлористоводородной кислоты (хлориды). В другом воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения может включать сахара, сахарные спирты, аминокислоты, такие как глицин, аргинин, глютаминовую кислоту и другие в качестве образователей структуры. Сахара могут быть моно-, ди- или трисахаридами. Эти сахара могут быть использованы в отдельности, в равной степени как и в комбинации с сахарными спиртами. Примеры сахаров включают глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу или сорбозу в качестве моносахаридов; сахарозу,лактозу, мальтозу или трегалозу в качестве дисахаридов и раффинозу в качестве трисахарида. Сахарный спирт может быть, например, маннитозой. Предпочтительными ингредиентами являются сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маннит и/или сорбит и более предпочтительно маннитол. Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать хорошо переносимые физиологические наполнители (см. "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 5-е изд., авторы:Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006, такие как антиоксиданты, подобные аскорбиновой кислоте или глютатиону; консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или бензальконий хлорид; стабилизаторы, структуроформирующие средства, такие как сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, миннитоза, маннит и/или сорбит, маннит и/или лактоза и растворители, такие как полиэтиленгликоли (PEG), например PEG 3000, 3350, 4000 или 6000; или циклодекстрины, например гидроксипропилциклодекстрин, сульфобутилэтилциклодекстрин или-циклодекстрин; или декстраны или полоксамеры, например полоксамер 407, полоксамер 188 или Твин 20, Твин 80. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции настоящего изобретения включают один или более хорошо переносимых наполнителей, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, структороформирующих средств и стабилизаторов. Приемлемым диапазоном значений рН является рН 2-12 для внутривенного и внутримышечного вве- 27023378 дения, но для подкожного введения диапазон снижается до 2,7-9,0, так как степень растворения in vivo понижена, приводя к увеличению потенциала для возникновения раздражения на месте инъекции. Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO: 2, 201-230 (2004). Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеиновую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как представленные в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим. В другом предпочтительном воплощении изобретения вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы ко-экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ. Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например липосомами. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "ген-пистолета". Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует CD4-положительные Т-клетки. Соответственно любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. "Обнаженная" ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся s.c. или i.d. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут быть нетрансфецированными, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани ("кросс-прайминг", например, Thomas A.M., Santarsiero L.M., Lutz E.R.,Armstrong T.D., Chen Y.C., Huang L.Q., Laheru D.A., Goggins M., Hruban R.H., Jaffee E.M. Mesothelinspecific CD8(+) T-cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306). Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Conry и соавторов (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al. (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong etCancer 65, 664-670 и Burchell et al. (1996) с. 309-313 В: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics,Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, которые все включены в описание путем ссылки. Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ex vivo пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается уZhou и соавторов (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место. Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. В- 28023378 дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения. Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака. Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител,масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей. Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками. Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адаптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина". Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный,внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было s.c. и наиболее предпочтительно i.d. Введение может производиться инфузионным насосом. Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь,могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие чертежи,Список последовательностей и Примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации CSP-001 и NLGN4X-001 специфических CD8+ лимфоцитов из периферической крови здорового донора. ПК, обогащенные на лунку 1106 CD8+ здорового донора, стимулировались еженедельно микросферами, связанными с антиCD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/CSP-001 (верхняя секция) или анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/NLGN4X-001 (нижняя секция). После трех стимуляций in vitro клетки были окрашены антителом CD8 FITC и тетрамерами с флуоресцентными меткамиA0201/CSP-001 РЕ и A0201/NLGN4X-001. Клетки высаживаются на CD8+ лимфоциты; цифрами обозначена процентная доля клеток в указанном квадранте среди CD8+ лимфоцитов. Фиг. 2 - афинность пептидов HLA I класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной аллелем HLA-A0201. Константы диссоциации (KD) пептидов IMA950 HLA класса I, контрольных пептидовIMA-MUC-001 (средняя сила связывания) и вирусного пептида-маркера HBV-001 (сильная сила связывания) были измерены основанным на методике ELISA анализом рефолдинга МНС. Анализ проводили три раза с похожими результатами. Фиг. 3 - относительное связывание образованных из IMA-BIR-002 и IMA-MET-005 15-меров с наиболее частыми аллелями HLA-DR. В технологии ProImmune REVEAL используются анализы сборки invitro HLA-DR для определения скорости ассоциации комплекса МНС - пептид, являющейся одним из основных определяющих фактов для констант связывания отдельных пептидов. Анализ проводили с помо- 29