Штамм escherichia coli bl21(de3)-pie-gamma и способ получения препарата нативного рекомбинантного интерферона гамма человека

ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА(56) RU-C1-2056460 ИНГАРОН. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. 2008, 16, Москва,РЛС-2008, 2007, стр.355-356Escherichia coli BL21(DE3)-pIE-gamma - продуцент интерферона гамма человека и способ получения высокоочищенного препарата непроцессированного безметионинового нативного рекомбинантного интерферона гамма человека. Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Интерферон гамма является полифункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы (Т-клетками и NK-клетками), обладает иммуностимулирующей (активирует Т-клетки), противоопухолевой (антипролиферативной) - за счет увеличения количества молекул МНС I и индукции антиангиогенного эффекта посредством секреции зависимых от интерферона-гамма IP-10 и MIG - и антивирусной активностями - активирует макрофаги за счет увеличения количества молекул МНС II. Природный иммунный интерферон человека (интерферон гамма) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 16.9 кДа, является растворимым цитокином, с pl 9.7, синтезируется в виде предшественника из 166 аминокислотных остатков с сигнальным пептидом (20 аминокислотных остатков),содержит два сайта гликозилирования (48 и 120 аминокислотный остаток). Гликозилирование интерферона гамма играет важную роль при его секреции из клетки, при использовании же рекомбинантного белка интерферона гамма в терапевтических целях во время инъекции он попадает сразу в кровяное русло, минуя этап секреции. Более того, известно, что активность гликозилированной и негликозилированной форм интерферона гамма сравнима (Sareneva T. et al., 1994). Это позволяет использовать для фармацевтических целей негликозилированный рекомбинантный белок интерферон гамма, полученный в бактериальных клетках E.coli. Создание микроорганизмов-продуцентов человеческого интерферона гамма позволило получать биологически активный рекомбинантный белок в количестве, необходимом как для проведения широких структурно-функциональных исследований, так и для использования в медицинской практике. Созданы лекарственные препараты на основе рекомбинантного интерферона гамма для лечения иммунных, онкологических и тяжелых вирусных заболеваний (Actimmune - для лечения хронического гранулематоза, Imukin для лечения псориаза, лепры, ревматоидного артрита, экземы и других заболеваний, Ингарон - для лечения хронического вирусного гепатита С, хронического вирусного гепатита В, ВИЧ/СПИД инфекции, туберкулеза легких в комплексной терапии, генитальной герпесвирусной инфекции и опоясывающего лишая (herpes zoster) в монотерапии, урогенитального хламидиоза в комплексной терапии, онкологических заболеваний в комплексной терапии в качестве иммуномодулятора, в том числе в комбинации с химиотерапией, для профилактики инфекционных осложнений у больных с хронической гранулематозной болезнью и др.). Однако следует стремиться уменьшить количество и выраженность побочных эффектов от терапии человеческим интерфероном гамма в составе вышеперечисленных препаратов. Этого можно добиться благодаря созданию препарата, в составе которого интерферон гамма будет нативным, стерильным, нетоксичным,апирогенным и будет содержать минимальное количество эндотоксинов. В конце 20 века исследования иммунного интерферона человека проводились на очень незначительных его количествах, что затрудняло изучение характеристик белка и использование в терапевтических целях. Интерферон гамма сначала получали, главным образом, митогенной индукцией лимфоцитов(патент РФ 2092561). В 1981 г появилось сообщение о гораздо более тщательной, но все еще частичной очистке иммунного интерферона человека (Y.K. Yip, R.H. Pang, С. Urban, and J. Vilcek. Partial purification and characterization of human gamma (immune) interferon. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 March; 78(3): 1601-1605). Данное соединение было получено из культур лимфоцитов, стимулированных сочетанием фитогемагглютина и форбола, и было очищено последовательными хроматографическими разделениями. В результате этой процедуры получили продукт с Mr 58 кДа. Позже иммунный интерферон человека стали получать в очень малых количествах трансляцией мРНК в ооцитах, которые приобретали характеристики активности иммунного интерферона человека. Некоторое время спустя появилась технология рекомбинантной ДНК, при которой конструируют генетическую конструкцию, основные элементы которой необходимы для ее репликации и возможности ее идентификации, в которой клонируют ген, экспрессия которого необходима, благодаря наличию в генетической конструкции участков, специфически расщепляемых рестиктазами, такой конструкцией трансформируют клетки реципиентного живого организма. Технология рекомбинантной ДНК позволила получить необходимый белок в больших количествах. Одна из первых попыток синтеза интерферона гамма человека (патент РФ 2092561) была осуществлена следующим образом. 1) Стимулировали митогенами выработку клетками селезенки человека или периферическими лимфоцитами крови иммунного интерферона. 2) Из такой клеточной культуры экстрагировали в присутствии ингибитора рибонуклеазы осадок клеток для выделения всей цитоплазматической РНК. 3) На олиго-аТ колонке выделяли полностью информационную РНК (мРНК) в полиаденилированной форме. Эту РНК фракционировали по размерам, используя градиент плотности сахарозы и гель-электрофорез в системе кислота-мочевина. 4) РНК от 12S до 18S превращали в соответствующую однонитевую комплементарную ДНК (кДНК), из которой получали двунитевую ДНК. После поли-dC сшивания ее включали в вектор, несущий один или более генетических маркеров. 5) Полученные таким образом векторы использовали для трансформации бактериальных клеток. 6) Из клонов-трансформантов выделяли соответствующую плазмидную ДНК и секвенировали. 7) ДНК с определенной последовательностью оснований встраивали in vitro в соответствующий вектор для экспрессии, которым трансформировали клетки хозяина. При использовании колоночной хроматографии получают разброс мРНК (12S-18S), поэтому целесо-1 023379 образнее использовать метод, позволяющий выделить конкретную мРНК, кодирующую интерферон гамма. Более того, в данном случае использовали два разных вектора, что усложняет метод и увеличивает время работы над получением препарата белка. Очевидно, что такой метод необходимо совершенствовать. Более того, в данном случае организмом для экспрессии гена, кодирующего интерферон гамма человека, были дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Экспрессию чужого гена в дрожжах может инициировать 6'-боковая последовательность ДНК (промотор) из дрожжевого гена, помещенная на 5'-конце недрожжевого гена. Кроме промотора, экспрессия недрожжевого гена в дрожжах требует второй дрожжевой последовательности, расположенной в плазмиде на 3'-конце недрожжевого гена с тем, чтобы обеспечить соответствующее окончание транскрипции и полиаденилирование. Данную систему необходимо упростить для экономии времени и реактивов. В методике, используемой нами, вышеуказанные проблемы решены. В работе используется один вектор, обеспечивающий синтез необходимого белка в клетках E.coli, для работы с которыми не нужно модифицировать структуру гена, кодирующего интерферон гамма. Противовирусную активность проверяли более чувствительным и менее трудоемким методом. Есть данные об еще одном способе получения интерферона гамма человека (патент РФ 2214832). 1. Синтез интерферона гамма индуцировали в лимфоцитах периферической крови человека стафилококковым энтеротоксином Б, после чего клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ). 2. Выделяли мРНК, используя последовательно лизирующий буфер, содержащий додецил сульфат натрия и РНКазо/белковый расщепитель, 5 М NaCl и олиго(dT)-целлюлозу, с которой вымывали мРНК на колонке. 3. Синтез кДНК проводили с мРНК, используя M-MuLV обратную транскриптазу, набор и протокол фирмыPharmacia Biotech. 4. Необходимый фрагмент ДНК лигировали с плазмидой pUC 18. 5. Клетки E.coli штамма JM 83 трансформировали лигазной смесью с высевом на L-агар, содержащий X-gal и ИПТГ. 6. Необходимый фрагмент ДНК лигировали с синтетическим гетеродуплексом, содержащим рибосомсвязывающий сайт, и данный фрагмент помещали в плазмиду pThy 315 (Шмелев В.А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол. - 1995. - 1. - с.9-14), из которой был удален фрагмент, кодирующий тимозин. 7. Полученной плазмидой трансформировали клетки Е.coli штамма НВ 2151 с высевом на L-агар, содержащий ампициллин. 8. Выделяли плазмидную ДНК. 9. Трансформировали полученной плазмидой подходящий штамм Е.coli (SG 20050 или BL 21) и культивировали клетки трансформированного штамма в обычной среде. 10. Лизировали клетки и отмывали агрегированный белок. 11. Проводили хроматографическую очистку на катионообменнике с одновременной ренатурацией (колонке с целлюлозой КМ-52). Полученный таким образом рекомбинантный человеческий интерферон гамма состоял из 144 а.о., был лишен трех N-концевых аминокислотных остатков Cys-Tyr-Cys зрелого белка, в отличие от природного,и имел иную молекулярную массу (16,9 кДа) и pl (10,36). Использование описанной нами методики позволяет получить нативный непроцессированный рекомбинантный интерферон гамма человека без метионина на N-конце. Наиболее близкий аналог изобретения описан в патенте РФ 2097428. Это группа изобретений: рекомбинантная плазмида pTTgKm2, обеспечивающая синтез интерферона гамма человека в E.coli,штамм-продуцент и способ получения рекомбинантного человеческого интерферона гамма. ПлазмидаpTTgKm2 сконструирована на основе плазмиды pUC 19, содержащей ген устойчивости к канамицину,триптофановый промотор, вслед за ним ген человеческого интерферона гамма и терминаторы транскрипции rrnBT1T2. Эта плазмида введена в штамм С 600 Е.coli, который и является штаммомпродуцентом интерферона гамма человека. Используемый здесь способ получения интерферона гамма включает культивирование клеток штамма-продуцента в среде с пониженным содержанием триптофана,лизис клеток, отмывку агрегированного белка, растворение интерферона гамма в 7 М растворе мочевины с цетавлоном, ренатурацию за счет десятикратного разведения водой, фракционирование и осаждение интерферона гамма сульфатом аммония и хроматографию на анионообменнике или дополнительно обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией. Недостатком плазмиды pTTgKm2 является то, что экспрессия гена человеческого интерферона гамма с триптофанового промотора запускается в средах с дефицитом триптофана. В обычных питательных средах работа триптофанового промотора ослаблена (репрессирована). При этом в компонентах обычных питательных сред (таких как дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина: триптон, пептон) количество триптофана не ограничивается, поэтому поиск или приготовление сред с пониженным содержанием триптофана усложняет технологию и увеличивает себестоимость этапа культивирования. Кроме того, использование в качестве штамма-продуцента рекомбинантного человеческого интерферона гамма штамма С 600 Е.coli не вполне соответствует требованиям, предъявляемым к штаммампродуцентам, в частности по продуктивности и стабильности синтезируемых рекомбинантных белков. Более продуктивный штамм Е.coli, BL 21, имеющий Ion- и ompT-мутации по генам протеаз, позволяет получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах. Способ получения интерферона гамма, указанный в патенте РФ 2097428, включает ренатурацию за счет десятикратного разведения водой интерферона гамма, растворенного в 7 М растворе мочевины, а затем фракционирование и осаждение интерферона гамма сульфатом аммония. Это не технологично, так как операции с большими объемами растворов требуют большего расхода реагентов (того же сульфата аммония) и использования крупномасштабного оборудования. Далее в формуле изобретения указана хроматография на анионообменнике, а интерферон гамма имеет положительный заряд при рН от 0 до 10 и не может сорбироваться на положительно заряженные анионообменники. Касаемо других этапов работы, а именно процесса выделения телец включения и дальнейшей экстракции белка из них, другими авторами (патент США 4681930) было предложено провести химический лизис клеток штамма-продуцента E.coli и одновременную солюбилизацию интерферона гамма из телец включения раствором 7 М гуанидинхлорида; удалить нерастворившиеся компоненты центрифугированием; 10-кратно разбавить целевую фракцию буфером рН 9,5 и отделить образующийся осадок белка центрифугированием; фракционировать белок на силикагеле (NuGel-952 AC) и, наконец, провести аффинную хроматографию на сорбенте с моноклональными антителами. Полученный продукт находился в растворе 20 мМ натрийфосфатного буфера, содержащего 1 М NaCl и 1 М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представлял собой белок с Mr 18 кДа, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составил 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составила 107 ед./мг белка. По результату видно, что выход белка необходимо увеличивать. Поэтому была предложена модификация данного метода (патент 2132386). Клетки разрушали в буферном растворе, затем центрифугированием клеточного экстракта отделяли большую массу балластных клеточных белков Е.coli от нерастворимого целевого продукта, находящегося в тельцах включения, при этом соли цинка и меди использовали для предотвращения протеолитической деструкции целевого белка. Применение для солюбилизации интерферона гамма из телец включения менее сильного, чем гуанидинхлорид, денатурирующего агента мочевины обеспечивает более эффективную ренатурацию белка (M. Matsubara, D. Nohara, T.Sakai//Chem. Pharm.Bull., 1992, v. 40,2, p. 550-552). Использование для хроматографической очистки сорбента СООН-Биохром К-1 значительно упростило и удешевило способ, по сравнению с использованием иммунного сорбента. Однако способ, используемый в наших экспериментах, еще более совершенный. За счет того что клетки лизировали не только в буфере (отличающемся от вышеуказанного), но и ультразвуком, обеспечили более эффективное разрушение клеток и отсутствие пагубного влияния веществ, составляющих буфер, на необходимый белок. Более того, в нашей работе тельца включения отмывали 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего удаляли липополисахариды, поэтому получили чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов. Для солюбилизации интерферона гамма из телец включения мы также использовали мочевину, но для получения очищенного белка использовали S-Sepharose, которая обладает стабильностью при большом разбросе значений рН (4-13) и большей связывающей способностью. Исследователями было предложено модифицировать аминокислотную последовательность белка интерферона гамма, а именно "защитить" С-концевую область молекулы, поскольку она чрезвычайно насыщена сайтами для различных протеаз (патент РФ 2105813). Однако неизвестно, положительный ли эффект у пациента будет наблюдаться, если молекула будет долгоживущей. Более того, если вводить препарат в кровоток, нет необходимости защищать интерферон гамма от воздействия клеточных протеаз,поскольку в клетки молекула не попадет, лишь будет взаимодействовать с соответствующим рецептором. Также, в отличие от формы препарата для перорального введения, для инъекционной формы не столь важно быть устойчивой к протеазам ЖКТ. В связи с вышеперечисленными причинами, предложенный нами препарат не содержит N-концевой метионин и какие-либо модификации на С-конце. Подробное описание изобретения Предложен штамм Escherichia coli BL21(DE3)-pIE-gamma - продуцент интерферона гамма человека,коллекционный номер ВКПМ В-11012. Штамм характеризуется устойчивостью к антибиотику - ампициллину. Полученный высокоочищенный препарат нативного интерферона гамма человека обладает высокой удельной биологической активностью (2000000 ед. на 50 мкг) и стабильностью. По данным электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия не менее 95% основного вещества препарата находится в форме мономера, а в димерной форме - не более 5%. Полученный препарат реагирует только с антителами к интерферону гамма (фирма Peprotech, каталожный номер 500-М 90), устойчив в диапазоне рН от 4,5 до 10. Удельная противовирусная активность составляет не менее 2106 МЕ/мг. Концентрированный раствор интерферона гамма разводят до терапевтической концентрации (от 10 до 100 мкг/мл) водным буферным раствором, содержащим стабилизирующие добавки. Жидкий полуфабрикат лиофилизируют и хранят при температуре не выше +10 С в течение 1.5 лет. Полученный препарат нетоксичен, апирогенен при испытаниях на животных, обладает контролируемой противирусной активностью при испытаниях на культуре клеток карциномы легкого человека(А 549), зараженных вирусом ЕМС (от 50000 МЕ/мл раствора до 1 млн МЕ/мл раствора), не вызывает побочных реакций у испытуемых животных; препарат быстро, в течение нескольких секунд, растворяется в воде и физиологическом растворе для инъекций, раствор остается прозрачным при комнатной температуре не менее чем 48 ч. Данный препарат получен благодаря проведению ряда экспериментов. Пример 1. Получение гена, кодирующего интерферон гамма человеческий (кДНК). 1.1. Получили моноцитарные клетки периферической крови (МКПК) человека методом центрифугирования гепаринезированной крови в градиенте плотности Ficoll-Paque (Boyum, 1964): ресуспендированные клетки (10 мл) осторожно наслоили на 4 мл раствора Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Швеция) и отцентрифугировали при комнатной температуре в течение 30 мин при 400g на настольной центрифуге. Образовавшееся после центрифугирования кольцо клеток (моноциты и лимфоциты) осторожно отобрали пипеткой и ресуспендировали в 20-кратном объеме PBS. МКПК трижды очистили центрифугированием в растворе PBS при комнатной температуре в течение 10 мин при 400g на настольной центрифуге. После третьей отмывки клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Лимфоциты культивировали в среде RPMI 1640,содержащей 10% FBS. 1.2. Простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, в лимфоцитах раствором РМА (phorbol myristic acetate, Sigma, США), при этом использовали аллостимуляцию гомологичных МКПК, полученных от разных индивидумов. Для этого по 107 МКПК, полученных от 3 независимых индивидумов, смешали в одном фальконе, отмыли 1 раз PBS и ресуспендировали в 1 мл средыRPMI 1640, содержащей 1% FBS, добавили РМА до концентрации 25 нг/мл (стоковый раствор 1 мг/мл вDMSO) и инкубировали 6-8 ч в CO2-инкубаторе при +37 С. После инкубации клетки собрали центрифугированием, отмывали в PBS и использовали для выделения РНК. 1.3. Выделили РНК с помощью метода, основанного на использовании гуанидина изотиоционата, с последующей очисткой ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Для этого простимулированные МКПК ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора(NaCl), к ним добавили 1 мл раствора, содержащего 5.5 М гуанидина изотиоционат, 50 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, 0.5% саркозил и 7 мкл -меркаптоэтанола. Смесь перемешали и добавили 1 мл раствора, содержащего 5.7 М хлорид цезия, 25 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА. Полученную суспензию наслоили на 1.5 мл раствора, содержащего 5.7 М хлорид цезия, 25 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, помещенного в центрифужную пробирку ротора SW65 (Becman, США). Центрифугирование провели при 100000g в течение 18 ч при +20 С. После центрифугирования слили надосадочную жидкость, а осадок,содержащий РНК, кодирующую интерферон-гамма, 3 раза промыли 70% этанолом и просушили в течение ночи при -20 С. РНК хранили в сухом виде или под 70% этанолом при -70 С. 1.4. Для получения последовательности кДНК, кодирующей интерферон гамма, провели реакцию ОТ-ПЦР. РНК, полученную из 107-108 простимулированных клеток МКПК, растворили в 20 мкл воды. На реакцию обратной транскрипции (ОТ) взяли по 5 мкл тотальной РНК и 0.5 мкг oligo(dT)18 праймера. Реакцию провели в соответствии с инструкцией к набору RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). Полученную в результате ОТ первую (+)-нить ДНК использовали как матрицу в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации гена, кодирующего интерферон гамма. Для этого брали по 5 мкл результата ОТ-ПЦР и по 0.2 пМ каждого праймера (IFNsp: 5'-CTCGCTAGCCACCATGGCCTTGACCTTTGCT-3' и IFNr 5'-GTAAGCTTATCATTCCTTACTTCTTAAACT-3'). Реакцию провели в стандартных условиях для Taq-полимеразы (Fermentas, Литва) по программе: 95 С - 10 с, 58 С - 10 с, 72 С - 40 с в течение 35 циклов, 72 С - 2 мин для достройки концевых последовательностей. Результат ПЦР проанализировали электрофорезом в 1% агарозном геле. Пример 2. Создание плазмидной ДНК (pIE-gamma), содержащей ген, кодирующий интерферон гамма человека. 2.1. По методике, описанной в примере 1, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в средеRPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК. 2.2. Проклонировали кДНК гена, кодирующего интерферон гамма человека, в плазмидном вектореpGemTEasy (Promega, США), используя реактивы данного набора. Вектор pGemTEasy содержит следующие компоненты: промотор для полимеразы фага Т 7, что обеспечивает контроль уровня экспрессии гена, lac-оператор для обеспечения контролируемой экспрессии гена, кодирующего необходимый белок, сайт связывания с рибосомальным комплексом (RBS), старт кодон для трансляции клонированного фрагмента, фрагмент ДНК, кодирующий полигистидин, находящийся в рамке трансляции, что обеспечивает экспрессию необходимой нуклеотидной последовательности в виде белка, слитого с полигистидином, для удобства его дальнейшей очистки с использованием хроматографии, нуклеотидную последовательность, кодирующую V5 эпитоп в линкере, что обеспечивает синтез V5 эпитопа, сшитого с необходимым белком; моноклональные антитела к этому эпитопу позволяют анализировать экспрессию любого встроенного гена с помощью иммуноблоттинга, сайт дляTEV-протеазы, позволяющий получить белок в виде отдельной аминокислотной последовательности, без полигистидина и V5 эпитопа, фрагмент rop, обеспечивающий оптимальную копийность плазмиды,pBR322ori для осуществления инициации репликации, lacI - лактозный репрессор для обеспечения работы lac-оперона, сайт устойчивости к ампициллину для селекции клонов, содержащих данный вектор. Результат ПЦР осадили этанолом в присутствии 2 М ацетата аммония, центрифугировали при 10000g в течение 5 мин, осадок промыли 70% этанолом, просушили и растворили в 10 мкл воды. На реакцию лигирования взяли 3 мкл раствора кДНК, 1 мкл раствора готового вектора pGemTEasy,5 мкл буфера для лигирования 2 и 1 мкл Т 4-лигазы. Реакцию провели при +20 С в течение 2 ч. После этого смесь прогрели при +95 С в течение 10 мин и очистили от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ провели против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин. Пример 3. Создание штамма E.coli для амплификации плазмидной ДНК, содержащей ген, кодирующий интерферон гамма человеческий. 3.1. По методике, описанной в примере 2, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в средеRPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК и получили плазмидную ДНК pIE-gamma: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор pGemTEasy. 3.2. Трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R (F-mcrA, (mrr-hsdRMS-mcrBC),80d/acZM 15, lacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, (ara,leu)769, galU, galK-, rpsL, nupG) плазмидной ДНК pIE-gamma методом электропорации с использованием генератора высоковольтных импульсов ГВИ-1 (СПбГТУ, Санкт-Петербург). Для этого к 12 мкл компетентных клеток добавили 1 мкл диализованной лигазной смеси, поместили между электродами парационной ячейки и обработали импульсом тока напряженностью 1 кВ на 1 мм и длительностью 4 мс. 3.3. После трансформации клетки поместили в 1 мл SOC-среды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37 С. 3.4. Провели скрининг клеток E.coli на наличие плазмид на селективной среде, содержащей LBагар, 100 мкг/мл ампициллина, 5 мМ IPTG, 20 мкг/мл X-gal. 10 колоний E.coli, развивающих белую окраску на хромогенном субстрате X-gal, проверили на наличие гена, кодирующего интерферон гамма, методом ПЦР. Условия реакции были те же, что и в реакции ОТ-ПЦР (см. пример 1). 3.5. Провели анализ скрининга электрофорезом в 1% агарозном геле. Колонии клеток E.coli, содержащие плазмиды со вставкой гена, кодирующего интерферон гамма, были использованы в качестве ночной затравки для последующего выделения плазмидной ДНК. 3.6. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК (pIE-gamma) проверили с помощью рестрикционного анализа и секвенирования. Пример 4. Создание штамма E.coli - продуцента интерферона гамма человеческого. 4.1. По методике, описанной в примере 3, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в средеRPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК pIE-gamma: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор pGemTEasy и получили большое количество плазмидной ДНК pIE-gamma, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R плазмидной ДНК pIE-gamma; инкубировали в SOC-среде, провели скрининг клеток E.coli на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК. 4.2. Подготовили клетки Е.coli штамма BL21(DE3) с генотипом F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcmrne131 (DE3) следующим образом. Инкубировали клетки при +37 С в течение ночи в 5 мл L-бульона,содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Развели культуру свежим Lбульоном в 50-100 раз и вырастили на качалке при +37 С до оптической плотности 0,2-0,3 при длине волны 590 нм. При достижении оптической плотности более 0,3 культуру развели свежим L-бульоном до оптической плотности 0,1 и растили 30 мин. Перенесли 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осадили клетки при +4 С на 5000g в течение 10 мин. Супернатант слили, клетки ресуспендировали в 50 мл 0,1 М CaCl2, охлажденного на льду. Инкубировали клетки 20 мин на льду. Осадили клетки в течение 10 мин при 5000 об/мин, +4 С. Супернатант слили, клетки ресуспендировали в 3 мл 0,1 МCaCl2, охлажденного на льду. 4.3. Для экспресии гена, кодирующего интерферон гамма человеческий, трансформировали клеткиE.coli штамма BL21[DE3], имеющего Ion- и ompT-мутации по генам протеаз и позволяющго получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах, созданной плазмидой методом электропорации. Перенесли 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавили 5-10 мкг плазмидной ДНКpIE-gamma. Инкубировали на льду 1 ч. Перенесли пробирку на +42 С и выдержали 5 мин. Переносили клетки в колбу со 100 мл подогретого до +37 С L-бульона без антибиотика и инкубировали при +37 С в течение 1-1,5 ч. Затем клетки использовали непосредственно для засева в ферментер. Полученная плазмида pIE-gamma после трансформации в компетентные клетки штамма Е.coliBL21(DE3) обеспечивает высокий уровень биосинтеза рекомбинантного человеческого интерферона гамма, определяемый электрофорезом в 15% ПААГ-ДСН. Пример 5. Получение интерферона гамма человеческого в клетках E.coli индукцией синтеза белка 0.2% лактозой по методу Штудиера. 5.1. По методике, описанной в примере 4, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в средеRPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК pIE-gamma: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор pGemTEasy и получили большое количество плазмидной ДНК pIE-gamma, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R плазмидной ДНК pIE-gamma; инкубировали в SOC-среде, провели скрининг клеток E.coli на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм E.coli - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.coli штамма BL 21 к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки E.coli штамма BL21[DE3] созданной плазмидой pIE-gamma; перенесли клетки в L-бульон с температурой раствора +37 С без антибиотика; инкубировали при +37 С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер. 5.2. Для автоиндукции экспрессии по методу Штудиера (Studier, 2005) использовалась среда PYP5052, состоящая из 1% пептона (Gibco, США), 0.5% дрожжевого экстракта (Gibco, США), 50 мМ Na2HPO4,50 мМ K2HPO4, 25 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0.5% глицерола, 0.05% глюкозы и 0.2% лактозы. В среду PYP-5052, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, инокулировали единичную колонию штамма-продуцента. После ферментировали при +37 С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин в течение 20 ч до отсутствия существенного изменения оптической плотности при длине волны 600 нм за 1 ч. Далее отобрали аликвоту клеток на анализ методом электрофореза,а оставшуюся биомассу осадили центрифугированием при 9000g и оставили храниться при -70 С для последующего выделения белка. Пример 6. Получение чистого фармацевтического препарата нативного рекомбинантного интерферона гамма человеческого без примесей бактериальных эндотоксинов. 6.1. По методике, описанной в примере 5, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон-гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК,получили плазмидную ДНК pIE-gamma: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор pGemTEasy и получили большое количество плазмидной ДНК pIE-gamma, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R плазмидной ДНК pIE-gamma; инкубировали в SOC-среде, провели скрининг клеток E.coli на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм E.coli - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.coli штамма BL21(DE3) к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки E.coli штамма BL21[DE3] созданной плазмидой pIE-gamma; перенесли клетки в L-бульон с температурой раствора +37 С без антибиотика; инкубировали при +37 С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер, синтезировали белок: индуцировали экспрессию гена, кодирующего интерферон гамма, 0.2% лактозой по методу Штудиера. 6.2. Выделили белок интерферон гамма в составе телец включения из клеток E.coli посредством лизиса клеток. Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обработали ультразвуком 7 раз по 30 с с интервалом в 30 с (частота ультразвука составляет 22 кГц). Лизат центрифугировали 10 мин при +4 С, 5000g. Надосадочную жидкость слили, к осадку добавили раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешали. Повторили центрифугирование. Супернатант слили, осадок ресуспендировали в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторили центрифугирование. Супернатант слили. 6.3. Отмыли тельца включения 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего удалили липополисахариды, поэтому впоследствии (см. пример 7, пп.7.2-7.6) получили чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов. 7. Получение очищенного непроцессированного интерферона гамма человеческого без метионина на N-конце. 7.1. По методике, описанной в примере 6, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в средеRPMI 1640, содержащей 10% FBS; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК pIE-gamma: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лиги-6 023379 ровали в вектор pGemTEasy и получили большое количество плазмидной ДНК pIE-gamma, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R плазмидной ДНК pIE-gamma; инкубировали в SOC-среде, провели скрининг клеток E.coli на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм E.coli - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.coli штаммаBL21(DE3) к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки E.coli штамма BL21[DE3] созданной плазмидой pIE-gamma; перенесли клетки в L-бульон с температурой раствора +37 С без антибиотика; инкубировали при +37 С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер, синтезировали белок: индуцировали экспрессию гена, кодирующего интерферон гамма, 0.2% лактозой по методу Штудиера, выделили тельца включения из клеток E.coli: лизировали клетки, удалили липополисахариды: отмыли тельца включения 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего получили очень чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов. 7.2. Осадок растворили в буфере, содержащем 0,1 М аммония ацетат рН 7,5 и 8 М мочевину, того же объема. Отцентрифугировали. Надосадочная жидкость представляла собой раствор интерферон гамма около 60-70%-ной электрофоретической чистоты. 7.3. После содержания в 8 М растворе мочевины белок обработали TEV протеазой для отщепленияN-концевого метионина, сайта для TEV-протеазы и полигистидиновой последовательности и пропустили через мембрану с отсекающими порами в 10 кДа, для отделения данных аминокислотных последовательностей от белка интерферона гамма. 7.4. Провели рефолдинг белка интерферона гамма человеческого. Поместили интерферон-гамма безN-концевого метионина в буфер для рефолдинга (0.1 М Tris рН 8.0, 0.2 мМ ЭДТА) с 0.5 М L-Аргинином. Растворенные тельца включения сагрегировали в зависимости от количества Аргинина. Агрегацию наблюдали при длине волны 500 нм. Буфер перемешали при 10 С, добавили три раза по 10 мл IB с интервалом в 2 ч. Раствор инкубировали 36-48 ч, не перемешивая, при 10 С. При большей температуре преобладала агрегация. 7.5. Обессолили ренатурированный белок раствором 20 мМ Tris-HCl рН 8.0, содержащим 100 мМ мочевину. Диализ провели при 10 С до достижения проводимости 3-3.7 мкСм. Раствор центрифугировали на 10000 rpm в течение 10 мин, был собран супернатант. 7.6. Провели хроматографическую очистку полученного раствора интерферона гамма человеческого, без N-концевого метионина. Около 1200 мл обессоленного супернатанта поместили на 20 мл SSepharose колонку, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl рН 8.0. Колонку отмыли 200 мл 50 мМ Tris рН 8.0,белок элюировали 160 мл линейного градиента 50 мМ Tris рН 8.0 1 М NaCl. Фракция очищенного на SSepharose интерферона гамма человеческого без N-концевого метионина была помещена на S-100 колонку (2.580 см), предварительно уравновешенную фосфатным буфером. Фракции анализировались с помощью SDS-PAGE. Колонку откалибровали с использованием 10 мг бычьего сывороточного альбумина,овальбумина и соевого трипсинового ингибитора. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)-pIE-gamma - продуцент интерферона гамма человека, ВКПМ В-11012. 2. Способ получения препарата рекомбинантного интерферона гамма человека, заключающийся в том, что осуществляют культивирование рекомбинантного штамма Е.coli - продуцента интерферона гамма в питательной среде, выделение агрегированного белка с последующей его ренатурацией и очисткой от примесей, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантного штамма используют штамм Е.coli по п.1, после культивирования осуществляют индукцию экспрессии гена, кодирующего интерферон гамма человека, выделение агрегированного белка осуществляют в результате лизиса бактериальных клеток с последовательным использованием буфера 20 мМ трис-HCl рН 7.5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид и ультразвука, трехкратного отмывания телец включения 0.2 М дезоксихолятом натрия с последующей обработкой TEV-протеазой и пропусканием через мембранный фильтр, ренатурацию осуществляют с использованием 8 М раствора мочевины в буфере, содержащем 0.1 М Tris рН 8.0, 0.2 мМ ЭДТА, 0.5 М L-аргинин, после чего ренатурированный белок обессоливают раствором 20 мМTris-HCl рН 8.0, содержащим 100 мМ мочевину, очистку полученного раствора белка осуществляют наS-Sepharose колонке и S-100 колонке (2.580 см) с использованием соответствующих буферов, высокоочищенный раствор полученного непроцессированного безметионинового нативного рекомбинантного интерферона гамма человека смешивают с физиологически приемлемым носителем. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2