Композиции антител к vegfr-3

Изобретение предлагает моноклональные антитела к VEGFR-3, фармацевтические композиции,содержащие указанные антитела, и применение указанных антител для лечения заболеваний. 023331 Изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с рецептором фактора роста эндотелия сосудов-3 (VEGFR-3), в частности приведенным в данном описании аминокислотным и нуклеотидным последовательностям антител к VEGFR-3, фармацевтическим композициям и применению указанных антител в способах лечения заболеваний, опосредованных VEGFR-3. Специфические для эндотелиальных клеток факторы роста и рецепторы, как полагают, в первую очередь ответственны за стимуляцию роста эндотелиальных клеток, дифференциацию, а также некоторые клеточные функции. Одним из широко изученных семейств факторов роста является семейство Факторов Роста Эндотелия Сосудов (VEGFs).VEGFR-3 - это единственный тирозин-киназный рецептор (ТКР), экспрессия которого в нормальных зрелых тканях ограничивается эндотелием лимфатических сосудов. Образовавшиеся VEGF-C иVEGF-D специфически связываются с VEGFR-3. Протеолитическое расщепление N- и С-концевых участков этих белков приводит к высвобождению зрелых VEGF-CNC и VEGF-DNC, которые приобретают увеличенное сродство к VEGFR-3. Эти лиганды активируют сигнальный путь VEGFR-3 и инициируют лимфангиогенез (т.е. образование новых лимфатических сосудов из уже существующих лимфатических сосудов). Характер экспрессии лигандов для VEGFR-3 предполагает их участие не только в развитии и поддержании нормальной сосудистой системы, но и в опухолевом ангиогенезе и лимфангиогенезе. Кроме того, экспрессия VEGFR-3 была обнаружена в кровеносных сосудах внутри опухоли. Таким образом,моноклональные антитела (МАТ), которые ингибируют связывание VEGF-C и/или VEGF-D с VEGFR-3 могут быть эффективны в подавлении опухолевого ангиогенеза. Кроме того, было показано, что блокирование деятельности VEGFR-3 ингибирует связанный сVEGF-C лимфангиогенез в опухоли. Для многих видов рака первым местом образования метастазов являются лимфатические узлы и, следовательно, блокирование VEGFR-3 может быть эффективно для подавления метастазирования опухоли. В работе Persaud et al, J. Cell Science 777:2745-56 (2004), описаны определенные свойства моноклональных антител человека к VEGFR-3, но не раскрыты последовательности ни этих антител, ни эпитопов, которые такие антитела могут связывать. Таким образом, сохраняется необходимость в высоко аффинных антителах к VEGFR-3, которые связывают неизвестные эпитопы VEGFR-3 и которые способны блокировать связывание лиганда и активацию рецептора. Также сохраняется потребность в антителах кVEGFR-3, которые демонстрируют высокую противоопухолевую активность против различных типов опухолей, без значительных негативных побочных эффектов. Изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают VEGFR-3 человека, для которых:a) эффективность связывания указанных антител с VEGFR-3 человека уменьшается по меньшей мере на 90% при наличии точечной замены Pro-219 в VEGFR-3 человека на Leu; иb) эффективность связывания указанных антител с VEGFR-3 человека уменьшается по меньшей мере на 50% при наличии точечной замены Val-175 в VEGFR-3 человека на Ala. Предпочтительно измерять уровень связывания между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и человеческим или мутантным VEGFR-3 путем экспрессии растворимого внеклеточного домена человеческого или мутантного VEGFR-3 слитого со щелочной фосфатазой, а затем определять количество связавшегося с антителом белка с помощью хемилюминесцентного анализа. Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем. В дополнение, изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем и, возможно, по меньшей мере одним другим терапевтическим ингредиентом. Изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства. Кроме того, изобретение предлагает антитела или антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению для использования в лечении или профилактике рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах. Изобретение также предлагает способ лечения одного из следующих заболеваний: рака яичников,эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы,рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах у млекопитающих. Лечение включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела или антигенсвязывающей части антитела согласно настоящему изобретению. Изобретение также относится к применению антитела или его антигенсвязывающей части для производства лекарственного средства для лечения какой-либо из перечисленных ниже опухолей: рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, почечно-клеточного рака, рака под-1 023331 желудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах. Изобретение также предлагает антитело или антигенсвязывающий участок антитела согласно настоящему изобретению в сочетании с одним из противоопухолевых агентов (цисплатин, 5-фторурацил,лейковорин, оксалиплатин и доцетаксел) для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от рака, выбранного из группы, состоящей из рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного сочетания антитела или антигенсвязывающей части антитела согласно настоящему изобретению и другого противоопухолевого агента, выбранного из цисплатина, 5-фторурацила, лейковорина,оксалиплатина и доцетаксела. Антитела согласно настоящему изобретению связывают второй иммуноглобулиноподобный (ИГподобный) домен VEGFR-3 млекопитающих. Второй ИГ-подобный домен VEGFR-3 человека отвечает остаткам 138-226 полноразмерного рецептора. См. Pajusola et. al., Cancer Res. 52:5738-5743 (1992). Термин "второй ИГ-подобный домен VEGFR-3 человеческого/мышиного/млекопитающего" (и его разновидности) предназначен для обозначения естественных форм домена (например, выделенного из клетки, которая экспрессирует домен при нормальных условиях), а также рекомбинантных вариантов,например, кодируемых природных или искусственных точечных мутантов или делетированных вариантов. Антитела согласно настоящему изобретению связывают эпитоп во втором ИГ-подобном доменеVEGFR-3 человека, в котором Р 219 является главным компонентом эпитопа, V175 - вспомогательный компонент эпитопа, a L221 -побочный компонент эпитопа. (нумерация этих остатков основана на полноразмерном VEGFR-3 человека, как описано у Pajusola et. al., выше, и базе данных EMBL, номер доступаX 68203.) Этот вывод основан на следующем наблюдении: введение мутаций V175A, или P219L, илиL221V (т.е. замены на остатки из ортологичного мышиного VEGFR-3) в VEGFR-3 человека полностью препятствует или значительно ослабляет связывание антитела согласно настоящему изобретению с мутантным VEGFR-3 человека. Более того, антитела согласно настоящему изобретению, которые связывают эпитоп VEGFR-3 человека (в котором Р 219 - главный компонент эпитопа, V175 - вспомогательный компонент эпитопа, aL221 - побочный компонент эпитопа) способны блокировать связывание лиганда VEGF-C с VEGFR-3 и,таким образом, нейтрализовать активацию рецептора. Соответственно, настоящее изобретение предлагает новый нейтрализующий эпитоп VEGFR-3 человека, что позволяет получать новые нейтрализующие антитела к VEGFR-3 человека, которые способны блокировать связывание VEGF-C человека с рецептором. Таким образом, изобретение предлагает эпитоп VEGFR-3 человека, в котором Р 219 является главным компонентом эпитопа, V175 является вспомогательным компонентом эпитопа, a L221 является побочным компонентом эпитопа. Изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающий участок, которые связывается с эпитопом VEGFR-3 человека, содержащим аминокислотные остатки Р 219 и V175. Предпочтительно изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающий участок, которые связываются с эпитопом VEGFR-3 человека, содержащим аминокислоты Р 219, V175 и L221. Такие эпитопы связываются антителами согласно настоящему изобретению (например, антителом 1) и, следовательно, изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые реагируют с тем же эпитопом VEGFR-3 человека, как антитело, имеющее легкую цепь, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID15, и тяжелую цепь, представленную аминокислотной последовательностьюSEQ ID16. Антитела, взаимодействующие с тем же эпитопом человеческого VEGFR-3, как некоторые антитела согласно настоящему изобретению (например, антитело 1) будут конкурировать за связывание с VEGFR-3 человека и, соответственно, изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые конкурируют за связывание VEGFR-3 человека с антителом, имеющим легкую цепь, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID15, и тяжелую цепь, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID16. Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению также связывается с мутантным мышиным VEGFR-3, имеющим последовательность, представленную SEQ ID20 (которая включает мутацию L219P) и мутантным VEGFR-3 мыши, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID21 (которая включает мутацию A175V), а связывание мутантного VEGFR-3 мыши, имеющего последовательность, показанную в SEQ ID20, превышает более чем в 50 раз связывание с мышиным VEGFR-3 дикого типа (SEQ ID19), и связывание мутантного VEGFR-3 мыши, имеющего последовательность,показанную в SEQ ID21, превышает более чем в 10 раз связывание мышиного VEGFR-3 дикого типа. Предпочтительно измерять уровень связывания между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и мутантным VEGFR-3 мыши или мышиного VEGFR-3 дикого типа путем экспрессии растворимого внеклеточного домена мышиного VEGFR-3 или VEGFR-3 дикого типа, слитого со щелочной фосфатазой, а затем определять количество связавшегося с антителом белка с помощью хемилюминес-2 023331 центного анализа. Предпочтительно, антитела согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части имеют высокое сродство к VEGFR-3 человека. Например, антитела или их антигенсвязывающие части,которые имеют Kd между 110-9 и 5.6100-11 M для VEGFR-3 человека, при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса на биосенсоре BIACORE 2000 при 20 С. Наиболее предпочтительно, чтобы антитела согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части имели Kd между 110-10 и 5.610-11 M для VEGFR-3 человека, при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса на биосенсоре BIACORE 2000 при 20 С. Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела к VEGFR-3 или их антигенсвязывающие части, которые подавляют связывание VEGF-CNС человека с VEGFR-3 человека с IC50 между 2 и 1.3 нМ. Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела к VEGFR-3 или их антигенсвязывающие части, которые подавляют стимулированный VEGF-CNС митогенный ответ с IC50 между 10 и 5 нМ. Более предпочтительно, антитела или их антигенсвязывающий участок подавляет стимулированныйVEGF-CNС митогенный ответ с IC50 между 8 и 5 нМ, наиболее предпочтительно между 6 и 5 нМ при анализе, описанном в примере 5. Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают VEGFR-3 человека и которые включают вариабельный участок легкой цепи(LCVR) и вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), где LCVR включает участки, определяющие комплементарность (CDR) LCDR1, LCDR2, и LCDR3, a HCVR включает CDR HCDR1, HCDR2 иHCDR3, где LCDR1 представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID1, LCDR2 представлен полипептидом с последовательностью SEQ ID2, LCDR3 представлен полипептидом с последовательностью SEQ ID3, HCDR1 представлен полипептидом с последовательностью SEQ ID6,HCDR2 представлен полипептидом с последовательностью SEQ ID7 и HCDR3 представлен полипептидом с последовательностью SEQ ID8. Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают VEGFR-3 человека, которые включают полипептид LCVR с последовательностью SEQ ID5 и полипептид HCVR с последовательностью SEQ ID10. Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают VEGFR-3 человека, и которые содержат легкую цепь, состоящую из полипептида с последовательность SEQ ID15, и тяжелую цепь, состоящую из полипептида с последовательностью SEQ ID16. Еще более предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают VEGFR-3 человека, которые включают две легких цепи, состоящих из полипептида SEQ ID15, и две тяжелых цепи, состоящих из полипептида с последовательностью SEQID16. Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части,которые конкурируют с антителами согласно настоящему изобретению за связывание VEGFR-3 человека. Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части,которые являются антителами человека. Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части,которые являются сконструированными человеческими антителами. Определения Термин "антитело", используемый в данном описании, предназначен для обозначения моноклональных антител, которые могут быть полностью человеческими антителами или сконструированными человеческими антителами, а также фрагментами расщепления, отдельными частями или их вариантами,в том числе антителами-миметиками, частями антител, которые имитируют структуру и/или функции антитела или специфическими фрагментами или их частями, в том числе одноцепочечными антителами и их фрагментами, которые сохраняют способность связываться со вторым ИГ-подобным доменомVEGFR-3 человека. Например, фрагменты антител, способные специфически связываться со вторым ИГподобным доменом VEGFR-3 человека, включенные в настоящее изобретение, включают фрагменты Fab(например, после гидролиза папаином), фрагмент Facb (например, после расщепления плазмином),F(ab')2-фрагменты (например, после расщепления пепсином) и стабилизированные дисульфидными связями вариабельные фрагменты (dsFv) или вариабельные фрагменты одной цепи (ScFv), созданные с помощью способов молекулярной биологии. Фрагменты антител также включены в этот термин, например,антитела с удаленным доменом, диатела и тритела, которые сохраняют способность связываться со вторым ИГ-подобным доменом VEGFR-3 человека. Антитела представляют собой молекулу иммуноглобулина, включающую четыре пептидных цепи,две тяжелых цепи (Н) и две легких цепи (L), связанных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (сокращен в данном описании как HCVR) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из 3 доменов: CH1, CH2-3 023331 и СН 3. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (сокращен в данном описании как LCVR) и константный участок легкой цепи. Легкая цепь антител любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко определенных типов, называющихся каппаи лямбда , на основе аминокислотной последовательности их константных доменов. Используемое в данном описании выражение LCVR, относится как к вариабельной части легкой цепи типа каппа (V), так и к вариабельной части легкой цепи типа лямбда (V). Константный участок легкой цепи состоит из одного домена,CL. Участки HCVR и LCVR включают гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), рассеянные внутри более консервативных участков, называемых каркасными участками (FR). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных отN-конца к С-концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. В соответствии с целями настоящего изобретения CDR LCVR сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, a CDR HCVR сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей, антитела могут быть отнесены к различным классам. Есть пять основных классов интактных антител: IgA,IgD, IgE, IgG, и IgM. Некоторые из них могут быть разделены на подклассы (изотипы), например IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgA, и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются альфа , дельта , эпсилон , гамма , и мюсоответственно. Структуры субъединиц и трехмерные структуры различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Настоящее изобретение относится к антителам, которые относятся к любому из вышеупомянутых классов или подклассов (изотипов). Используемый в данном описании термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, например, отдельные антитела, составляющие популяцию, являются, по существу, идентичными, за исключением возможных природных мутаций или присутствия незначительных посттрансляционных модификаций. Моноклональные антитела являются очень специфичными, и направлены против одного антигенного сайта (также называемого детерминантой или эпитопом), который, как указано в данном описании, содержится во втором ИГ-подобном домене VEGFR-3 млекопитающих. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител,которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант, каждое моноклональное антитело направлено против одной антигенной детерминанты. Термин "моноклональное" указывает на характер антитела, в смысле получения из практически гомогенной популяции антител, и не должно толковаться как требующие получения антитела каким-либо конкретным способом. Используемый в данном описании термин "антитело человека" относится к антителам, последовательность которых в вариабельных и константных областях соответствует последовательности иммуноглобулина в клетках зародышевой линии человека (как описано в Kabat et al., (1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Термин "антитело человека", используемый в данном описании, не обозначает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из клеток зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, соединены с каркасными участками антител человека. Изменения в аминокислотной последовательности антитела 1, описанные в данном описании,включены в объем настоящего изобретения, в частности, в связи с повышением аффинности связывания и/или других биологических свойств антител. В этом контексте термин "сконструированное антитело человека", используемый в данном описании, относится к дополнительным антителам, которые имеют аналогичные функциональные свойства с антителом 1 (например, способность к связыванию эпитопа человеческого VEGFR-3, содержащего Р 219 и V175) и которые имеют почти или полностью человеческие каркасные участки, которые окружают человеческие CDR, которые получены из антитела 1. Почти каркасными участками антител человека в контексте настоящего изобретения являются те, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательности каркасных участков антитела 1. Предпочтительно,чтобы такие почти каркасные участки антител человека имели по меньшей мере около 85, около 90, около 95 или около 99% идентичности с последовательностью каркасных участков антитела 1. Последовательности каркасных участков антител клеток зародышевой линии человека описаны в WO 2007/044411. Например, каркасный участок легкой цепи клеток зародышевой линии может быть выбран из группы,состоящей из А 11, А 17, А 18, А 19, А 20, А 27, А 30, LI, Lli, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, и O8 и каркасный участок тяжелой цепи клеток зародышевой линии может быть выбран из группы, состоящей изVH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, ДМС-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH I-18, VH Я-69,VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, и VH5-5I. Генетически модифицированные человеческие антитела, полученные из антитела 1, могут включать делецию, и/или вставку, и/или замену аминокислотных остатков в последовательности антитела 1. Тем не менее, конечная конструкция должна сохранять желаемые функциональные характеристики антитела 1 (например, способность связывать эпитоп VEGFR-3 человека, содержащий Р 219 и V175). Сконструированные антитела человека, имеющие сходные функциональные характеристики с антителом 1, могут быть созданы с помощью нескольких различных подходов, каждый подход начинаетсяSEQ ID10 соответственно) в качестве шаблона или родительского антитела для изготовления дополнительных антител. В первом подходе, CDR антитела 1 соединяют с различными каркасными участками антител человека, которые в значительной степени идентичны последовательности каркасных участков антитела 1. Совпадение последовательности новых каркасных участков должно составлять не менее 80,не менее 85, не менее 90, не менее 95 или не менее 99% с соответствующими каркасными участками антитела 1. Это соединение может привести к снижению аффинности связывания антител по сравнению с антителом 1. Если это произошло, то в каркасные участки можно ввести мутации, приводящие к восстановлению последовательности каркасных участков антитела 1 в отдельных позициях. Позиции для введения мутаций выбирают на основе определенных критериев, опубликованных в работе Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991). Идентификация остатков, которые необходимо заменить, может быть осуществлена следующим образом: если аминокислота попадает под одну из следующих категорий, аминокислотный остаток каркасного участка человеческого антитела эмбрионального типа, который используется (акцепторный каркасный участок) заменяется аминокислотным остатком из каркасного участка антитела 1 (донорный каркасный участок):(a) аминокислота в каркасном участке акцепторного каркасного участка необычна для каркасного участка антитела человека в этой позиции, в то время как соответствующая аминокислота в антителе 1 является типичной для каркасного участка антитела человека в этой позиции;(c) любой атом радикалов аминокислот, составляющих каркасный участок, находится на расстоянии около 5-6 ангстрем (от центра до центра) от любого атома аминокислотных остатков, составляющихCDR, в трехмерной модели иммуноглобулина. Если и аминокислотный остаток акцепторного каркасного участка, и соответствующий аминокислотный остаток каркасного участка антитела 1 являются необычными для каркасного участка человеческих антител эмбрионального типа, такие аминокислотные остатки могут быть заменены на аминокислотные остатки типичные для каркасного участка человеческих антител в этой позиции. Эти возвратные мутации позволяют восстановить у антитела активность антитела 1. Во втором подходе сконструированные антитела человека, полученные из антитела 1, которые сохраняют функциональные характеристики антитела 1, (например, способность к связыванию эпитопаVEGFR-3 человека, содержащего Р 219 и V175), могут быть получены путем внесения мутаций в CDR антитела 1 (случайных или направленных, чтобы избежать вырожденности аминокислотного кода) при сохранении каркасных участков антитела 1. Предпочтительно, мутации (делеции, вставки и/или замены) в аминокислотных последовательностях CDR сконструированных антител человека, полученных из антитела 1, ограничить максимум тремя мутациями, более предпочтительно двумя мутациями или наиболее предпочтительно одной мутацией в последовательности CDR сконструированных антител человека по сравнению с последовательностями CDR антитела 1. Если присутствует более чем одна мутация, мутации могут быть распределены между последовательностями CDR различными способами. Например,все мутации могут находиться в последовательности одного CDR (например, LCDR1), мутации могут находиться в последовательностях разных CDR или две мутации могут находиться в последовательности одного CDR, а третья мутация - в другой последовательности CDR. Это приводит к созданию комбинаторной библиотеки сконструированных антител человека, в которой последовательности CDR мутированы в одной или нескольких позициях, как описано выше, но сохранены каркасные участки антитела 1. Библиотека может быть исследована с целью обнаружения дополнительных вариантов антител, которые имеют аналогичные или улучшенные функциональные характеристики по сравнению с антителом 1. Еще одним подходом для создания сконструированных антител человека, полученных из антитела 1 (которые сохраняют функциональные характеристики антитела 1, например способность связывать эпитоп VEGFR-3 человека, содержащий Р 219 и V175) является сочетание двух подходов, описанных выше, т.е. внесение изменений как в каркасные участки, так и в CDR. Иными словами, после соединенияCDR антитела 1 с различными каркасными участками, отдельные аминокислотные остатки каркасных участков антител можно подвергнуть обратному мутированию, в дополнение к внесению изменений вCDR. Основной принцип этой методики описан в работе Wu et al. (1999), J. Mol. Biol. 294: 151-162. Аминокислотные замены также могут изменить посттрансляционные модификации сконструированных антител человека, например изменить количество или положение сайтов гликозилирования. Варианты антител с заменами могут быть получены путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков гипервариабельных участков антитела 1. Один из таких способов создания вариантов антител с заменами - это способ "созревания аффинности" с использованием фагового дисплея. Несколько фрагментов гипервариабельного участка (например, 6-7 фрагментов) мутируют для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом фрагменте. Варианты антител, полученных таким образом, экспонируются в моновалетной форме на нитевидных частицах фага, слитые с продуктом гена III фага М 13, упакованного в каждой частице. Экспонированные фагом варианты антител затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в данном описании.-5 023331 Описанные в данном документе способы могут быть использованы для скрининга сконструированных антител человека, полученных из антитела 1, для выявления антител, имеющих в искусственных и естественных условиях функции, описанные в данном документе. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть изолированными антителами. Изолированное антитело практически не содержит других клеточных материалов и/или химических веществ. Используемый в данном описании термин "эпитоп" относится к конкретному молекулярному участку на поверхности антигена, способному вызывать иммунный ответ и связывать специфические антитела, образованные в результате такого ответа. Эпитоп может быть линейным (т.е. состоять из смежных аминокислотных остатков, каждый из которых находится в одном коротком отрезке последовательности), или конформационным (т.е. состоящим из аминокислотных остатков, которые находятся в разных частях линейной последовательности антигена, но которые располагаются рядом и формируют сайт связывания антитела в результате образования антигеном его нормальной вторичной и третичной структуры). Как правило, эпитоп состоит из небольшого числа (например, от 2 до 5) ключевых аминокислотных остатков, и изменение этих остатков (например, замены на другой аминокислотный остаток) приводит к значительному снижению или даже полному нарушению связывания между антигеном и эпитопом. Антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, которые "конкурируют" с молекулами,описанными в данном документе, являются такие, которые связывают VEGFR-3 человека в участке (участках), который идентичен или перекрывается с тем, который связывают молекулы согласно настоящему изобретению. Конкурентные сконструированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть определены, например, с помощью конкурентного анализа антител. Например, образец очищенного или частично очищенного VEGFR-3 человека иммобилизуют на твердой подложке. Затем добавляют антитело согласно настоящему изобретению и тестируемые моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, причем либо тестируемые антитела, либо антитела согласно настоящему изобретению помечены. Если меченые антитела и немеченые антитела связывают разные и неперекрывающиеся участки на VEGFR-3, меченые антитела будут связываться на том же уровне, вне зависимости от присутствия других антител. Однако если участки взаимодействия являются одинаковыми или перекрываются, немеченые антитела будут конкурировать за связывание, и количество меченых антител, связанных с антигеном, будет снижено. Если немеченые антитела взяты в избытке, меченые антитела не будут связываться. Применительно к настоящему изобретению, конкурирующими сконструированными антителами человека или антигенсвязывающими фрагментами являются те, которые уменьшают связывание антител согласно настоящему изобретению примерно на 50, около 60, около 70,около 80, около 85, около 90, около 95 или около 99%. Подробная информация о процедурах проведения такого конкурентного анализа антител широко известна специалисту в данной области и может быть найдена, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Такие анализы могут быть выполнены количественно с помощью очищенных антител. Стандартной кривую получают путем титрования одного антитела против самого себя, т.е. те же антитела используются как меченые и как конкурентные. Затем определяют для немеченых конкурирующих моноклональных антител или антигенсвязывающих фрагментов емкость ингибирования связывания меченой молекулы к антигену. Результаты наносят на график и концентрации, необходимые для достижения желаемой степени подавления связывания, сравниваются.VEGFR-3 человека существует в двух формах, которые образуются на основе транскриптов мРНК различной длины. Более длинный транскрипт кодирует белок, содержащий 65 дополнительных аминокислотных остатков на С-конце, по сравнению с белком, закодированном в коротком транскрипте, более длинный белок является основной формой, встречающейся в тканях. Два варианта белка идентичны в своих N-концевых внеклеточных доменах. Термин "VEGFR-3 человека", если не указано иное, относится к обоим вариантам VEGFR-3 дикого типа (т.е. SEQ ID17 и SEQ ID18), которые получены из альтернативных транскриптов мРНК. Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательностей LCVR антитела 1 приведены в SEQ ID 4 и 5 соответственно. Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности HCVR антитела 1 приведены в SEQ ID 9 и 10 соответственно. Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности легкой цепи антитела 1 приведены в SEQ ID11 и 12 соответственно. Аминокислотные остатки 1-19 в SEQ ID12 представляют собой секреторную последовательность, которая удобна для экспрессии и выделения легкой цепи из различных клеточных линий млекопитающих, но которая не присутствуют в зрелых антителах. Аминокислотная последовательность легкой цепи зрелого антитела 1 приведена в SEQ ID15. Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности тяжелой цепи антитела 1 приведены в SEQ ID13 и 14 соответственно. Как и в случае последовательности легкой цепи, аминокислотные остатки 1-19 в SEQ ID14 представляют собой секреторную последовательность, которая удобна для экспрессии и выделения тяжелой цепи из различных клеточных линий млекопитающих, но которая не присутствует в зрелых антителах. Аминокислотная последовательность тяже-6 023331 лой цепи зрелого антитела 1 приведена в SEQ ID16. Специфичность антител может быть определена на основе аффинности и/или авидности. Аффинность, выраженная в виде константы равновесия для реакции диссоциации комплекса антигена с антителом (Kd), измеряет прочность связывания между антигенной детерминантой и связывающим антитело участком. Авидность является мерой силы связывания антитела со своим антигеном. Авидность связана как с аффинностью эпитопа к антигенсвязывающей части антитела, так и с валентностью антител, которая определяется количеством антигенсвязывающих сайтов для конкретного эпитопа. Чем меньше значение Kd, тем сильнее сила связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим участком антитела. Настоящее изобретение также предлагает полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1 - SEQ ID13), или полинуклеотиды, которые содержат любой из участков VH или их части, или любой из CDR VH, включая любые их варианты,антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1). Настоящее изобретение также предлагает полинуклеотид, который кодирует легкую цепь антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1 - SEQ ID11), или полину клеотиды, которые содержат любой из участков VL или их части, или любой из CDR VH, включая любые их варианты, антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1). Изобретение также включает экспрессионные векторы, содержащие любой из полинуклеотидов,описанных в данном документе. Примерами векторов являются плазмиды, фагмиды, космиды, нуклеиновые кислоты вирусов и фагов или другие молекулы нуклеиновых кислот, которые способны к репликации в прокариотических или эукариотических хозяевах, таких как клетки, например клетки млекопитающих. Типичные экспрессионные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициаторные последовательности, и промоторы, используемые для регуляции экспрессии молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Векторы также могут содержать генетическую экспрессионную кассету, содержащую независимую последовательность терминатора, последовательности,обеспечивающие репликацию вектора в эукариотах и прокариотах, т.е. бифункциональные векторы, а также селективные маркеры для прокариотических и эукариотических систем. Векторы обычно содержат маркер, чтобы обеспечить фенотипический признак для селекции трансформированных хозяев, такой как устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин или неомицин. Подходящие промоторы включают конститутивные промоторы и индуцируемые промоторы. Типичными представителями регуляторных последовательностей/промоторов являются lac система, trp система, tac система, trc система, операторные и промоторные участки фага лямбда, регуляторный участок гена белка оболочки fd, гликолитические промоторы дрожжей, например промотор 3 фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например Pho5, промоторы дрожжевого альфа-фактора спаривания, промоторы, полученные из цитомегаловируса человека, промоторы металлотионинов, промотор вируса рака молочной железы мышей, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина и промоторы, полученные из вируса полиомы, аденовирусов, ретровирусов и SV, например ранние и поздние промоторы SV40. Изобретение также включает хозяев, отличных от людей, таких как клетки, содержащие полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Под "хозяином" понимается отличный от человека многоклеточный организм или "клетка-хозяин", которая является клеткой или популяцией клеток, в которые введены полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может быть эукариотической клеткой или клеточной линией, например клеткой или линией клеток растения, животного, позвоночного, млекопитающего, грызуна, мыши, примата,или клеткой или клеточной линией человека. Подходящие эукариотические клетки включают дрожжи и другие грибы, клетки насекомых, клетки растений, клетки человека и клетки животных, включая клетки млекопитающих, такие как линии гибридом, COS клетки, клетки NS0 и клетки СНО. Под "популяцией клеток-хозяев" понимают группу культивируемых клеток, в которые может быть введен и экспрессирован полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Имеются в виду любые клеткихозяева, которые могут поддерживать экспрессию полинуклеотида или вектора согласно настоящему изобретению. Хозяином для согласно настоящему изобретению также может быть прокариотический организм. Подходящие прокариотические хозяева включают, например, Е. coli, такие как Е. coli SG-936, Е. coli НВ 101, Е. coli W3110, Е. coli X1776, Е. coli Х 2282, Е. coli DHI, и Е. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, такие как Bacillus subtilis и Streptomyces. Изобретение также включает способы получения антител согласно настоящему изобретению, которые влекут за собой культивирование клеток-хозяев, экспрессирующих один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, и выделение антител из среды для культивирования. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения человека. Антитела могут быть введены различными путями. Наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, содержащие антитела согласно настоящему изобре-7 023331 тению, для парентерального введения. Такие фармацевтические композиции могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области (см., например, Remington: The Science andPractice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) и включают описанные в данном документе антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Используемый в данном описании термин "подавлять" или "нейтрализовать" в отношении биологической активности антитела согласно настоящему изобретению означает возможность существенно противостоять, нарушать, предотвращать, ограничивать, замедлять, разрушать, уничтожать, останавливать,сокращать или отменять биологическую активность VEGFR-3 человека, в том числе, но не ограничиваясь, биологическую активность VEGFR-3 человека, измеренную в примере 4 или 5 настоящей статьи. Используемый в данном описании термин "лечить" и "лечение" относится к терапевтическому лечению, целью которого является предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательные физиологические изменения, связанные с заболеванием или расстройством. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают облегчение симптомов, уменьшение степени выраженности заболевания или расстройства, стабилизации заболевания или расстройства (т.е. когда заболевание или расстройство не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или расстройства, улучшение или временное улучшение заболевания или нарушения и ремиссию (частичную или полную) заболевания или расстройства, детектируемую или не детектируемую. "Лечение" может также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемым выживанием при отсутствии лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет заболевание или расстройство, а также лиц, склонных к возникновению заболевания или расстройства. Композиции согласно настоящему изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" антитела согласно настоящему изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективные количества антитела могут варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия болезни, возраст, пол и вес человека, и способности антитела или части антитела вызвать желаемую реакцию в человеке. Терапевтически эффективное количество является также таким, в котором любые токсичные или вредные эффекты участков антител или антител перевешиваются благоприятными терапевтически эффектами. Терапия может быть "первой линии", т.е. первичной терапией для пациентов, которые ранее не получали противоракового лечения, как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения, или"второй линии", для лечения пациентов, которые уже прошли курс противоракового лечения, как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения, или "третьей линии", "четвертой линии" и др.,как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения. Терапия также может быть назначена пациентам, которые уже прошли, возможно, частично успешные курсы лечения, но которые плохо переносили данное лечение. Терапия также может быть адъювантной, т.е. предотвращающей повторное появления рака у пациентов, у которых в данное время не обнаруживается заболевания или после хирургического удаления опухоли. Рак, который можно лечить с использованием изобретения, включает первичные и вторичные опухоли или метастазирующие опухоли, метастазы которых распространяются по лимфатической системе (в том числе метастазы из легких, молочной железы или простаты). Рак, который можно лечить, включает опухоли, которые не являются васкуляризированными или еще не существенно васкуляризированы, а также васкуляризированные опухоли. Рак может быть представлен не-солидными опухолями (такими как лейкозы и лимфомы) или солидными опухолями. Типы рака, которые следует лечить антителами согласно настоящему изобретению, включают рак яичников, эритролейкемию человека, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак легких и рак толстой кишки. Кроме того, учитывая роль VEGF-C/VEGFR-3 пути в продвижении лимфангиогенеза и учитывая, что для большинства видов рака, первым местом метастазирования являются лимфатические узлы, блокируя VEGF-C/VEGFR-3 сигнальный путь можно ожидать подавление метастазирования в лимфатических узлах, например рака груди, поджелудочной железы,желудка и колоректального рака (Roberts et al., Cancer Res., 66(5), 2650-2657 (2006. Антитела могут быть введены самостоятельно (монотерапия) или в комбинации с одним или несколькими терапевтически эффективными средствами или способами лечения (комбинированная терапия). Другие терапевтически эффективные средства могут быть конъюгированы с антителом, включены в тот же состав, что и антитело, или введены как отдельная композиция. Другие терапевтически эффективные средства или лечение могут быть введены до, во время и/или после введения антител. Другие терапевтически эффективные средства могут быть введены для усиления терапевтического эффекта антитела или уменьшения негативных побочных эффектов антитела. Способы лечения, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения любого подходящего млекопитающего, включая приматов, таких как обезьяны и человек, лошадей, коров, кошек, собак, кроликов и грызунов, таких как крысы и мыши. В одном из вариантов реализации млекопитающие, подлежащее лечению - это человек. Как показано в следующих примерах, в которых антитело 1 связывается с эпитопом VEGFR-3 чело-8 023331 века, содержащим Р 219 в качестве главного компонента эпитопа, V175 как вспомогательный компонент эпитопа, и L221 как побочный компонент эпитопа. Далее видно, что антитело 2 (соответствующее крысиное моноклональное антитело к VEGFR-3 мыши ) связывает эпитоп в VEGFR-3 мыши, который включает остатки L219 и V221. Кроме того, примеры также показывают, что антитело 1 имеет высокое сродство к VEGFR-3 человека (56 пМ), способно блокировать связывание лиганда VEGF-C с VEGFR-3, способно блокировать стимулирование VEGF-C митогенного ответа и является эффективным в естественных условиях на модели ксенотрансплантатов рака яичников и эритролейкемии. Наконец, можно также заметить, что антитело 2 является эффективным в ксенотрансплантатной модели рака головы и шеи, рака молочной железы, рак легкого, почечно-клеточного рака, рака поджелудочной железы и рака толстой кишки. Пример 1. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть сделаны и очищены с использованием различных подходящих способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Например,подходящую клетку-хозяина, такую как НЕК 293 EBNA или СНО, временно или стабильно трансфицировали экспрессионной системой для секретируемых антител с использованием оптимального предопределенного соотношения векторов, кодирующих легкую цепь и тяжелую цепь, или одним вектором, кодирующим легкую цепь (например, SEQ ID12 для антитела 1) и тяжелую цепь (например, SEQ ID14 для антитела 1). Среду, в которую секретировались антитела, очищали, используя любой из широко известных способов. Например, среду наносили на колонку с белком А или G Sepharose FF, предварительно уравновешенную приемлемым буфером, таким как фосфатный буферный раствор (рН 7,4). Колонку промывали, чтобы удалить неспецифически связавшиеся компоненты. Антитело элюировали, например,градиентом рН (например, от 0,1 М натрий-фосфатного буфера с рН 6,8 до 0,1 М натрий-цитратного буфера с рН 2,5). Фракции, содержащие антитела детектировали, например, с помощью SDS-PAGE, а затем объединяли. Дальнейшая очистка является необязательной, в зависимости от предполагаемого использования. Антитела можно сконцентрировать и/или стерилизовать с помощью обычных способов. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить обычными способами, в том числе гельфильтрационной, гидрофобной, ионообменнной или гидроксиапатитной хроматографией. Чистота антител после такой хроматографии составляет более 99%. Продукт может быть немедленно заморожен при температуре -70 С или может быть лиофилизирован. Последовательности CDR и вариабельных участков Пример 2. В следующем примере описаны эксперименты, в которых определили эпитоп рецептора VEGFR-3,с которым связываются антитела 1 и 2. Получение VEGF-CNС и мышиного и человеческого sR3-AP. Рекомбинантный зрелый VEGFCNС человека получили, как описано в Pytowski et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(1).14-21. Полноразмерные (т.е. ИГ домены 1-7) растворимые внеклеточные участки VEGFR-3 человека и мыши (sR3) соединили с кДНК, кодирующей щелочную фосфатазу (АР) человека, для получения химерного белка sR3AP (Persaud et al. (2004) J. Cell Science 777:2745-56; Pytowski et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(J):14-21). Получение химерного sR3-AP человек/мышь и сайт-специфических мутантов sR3-AP. Химерные конструкции человек/мышь и мышь/человек 3 N-концевых ИГ-подобных доменов sR3-AP получили с использованием реакции ПЦР с перекрывающимися фрагментами (Но et al. (1989), Gene 77:51-59) и клонировали в вектор, экспрессирующий АР (Persaud et al., supra; Pytowski et al., supra). Сайт-специфический мутагенез конструкций sR3-AP проводили с использованием набора QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя. Наличие желаемых мутаций проверяли секвенированием обеих цепей ДНК в мутированных участках с использованием ABI Prism 3100Genetic analyzer (Applied Biosystems) и набора для секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenc-9 023331ing Kit (Applied Biosystems). Экспрессия растворимых белков VEGFR-3. кДНК, кодирующей внеклеточные участки мутированного sR3-AP и sR3-AP дикого типа, трансфицировали клетки FreeStyle 293 (Invitrogen, R79007), выращиваемые в суспензионной культуре в среде FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen, 12338026) известного химического состава, не содержащей белка. В некоторых случаях отобранные sR3-AP очищали с использованием аффинной хроматографии с антителами к АР, как описано выше (Zhu et al, (1998)Cancer Res. 55:3209-14), или аффинной хроматографии с иммобилизованными моноклональными антителом 1 и антителом 2, описанными в данном документе. Нормализация белков sR3 в кондиционированной среде (КС). КС исследовали на активность АР с использованием набора Great EscAPe SEAP Chemiluminescence kit 2.0 (Clontech, Mountain View, CA) с применением люменометра Tropix TR7171 (Applied Biosystems, Foster City, CA). КС разводили пропорционально активности АР в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA), и проводили повторное измерение для подтверждения нормализации по измерению активности АР и Вестерн-блоту. Исследование связывания sR3-AP. Сто (100) мкл нормализованной КС перенесли в 96-луночный титрационный микропланшет покрытый VEGF-CNС ИЛИ исследуемым антителом (200 нг/лунка). После 2 ч инкубации планшеты промывали 5 раз и связавшийся sR3-AP детектировали по хемилюминесценции. Специфичность связывания антитела 1 и контрольного крысиного моноклонального антитела кVEGFR- 3 мыши (обозначено "антитело 2") проверяли методом ELISA с использованием иммобилизованных внеклеточных участков мышиного и VEGFR-3 человека (ИГ домены 1-7). Антитело 1 и антитело 2 связывают сильно и дозозависимо VEGFR-3 человека и мыши соответственно. Человеческое антитело антитело 1 демонстрирует слабую, но воспроизводимую кросс-реактивность с мышиным VEGFR-3 в концентрации превышающей 10 нМ. Наоборот, антитело 2 не проявляет никакого детектируемого связывания с VEGFR-3 человека. Эпитопы антитела 1 и антитела 2 полностью содержаться во втором иммуноглобулин-подобном(ИГ) домене VEGFR-3. Связывающие лиганд участки всех трех представителей семейства рецепторовVEGF содержатся в трех N-концевых ИГ доменах внеклеточного участка. Видовую специфичность антитела 1 и антитела 2 использовали для того, чтобы определить, какой их трех ИГ доменов содержит эпитопы для этих антител. Последовательности ДНК, кодирующие ИГ человека и мыши домены с 1 по 3 соединили в различных комбинациях с получением следующих конструкций внеклеточного доменаVEGFR-3: 1) человеческий дикого типа; 2) мышиный дикого типа; 3) химерный 1 (ИГ 1 человека - ИГ 2 человека - ИГ 3 мыши); 4) химерный 2 (ИГ 1 человека - ИГ 2 мыши - ИГ 3 мыши); 5) химерный 3 (ИГ 1 мыши - ИГ 2 человека - ИГ 3 мыши) и 6) химерный 4 (ИГ 1 человека - ИГ 2 мыши - ИГ 3 человека). Конструкции экспрессировали в виде белков, слитых со щелочной фосфатазой (АР) Persaud et al., см. выше. Кодируемые белки выделяли из кондиционированной среды (КМ) временно трансфицированных клеток и нормализовали по содержанию белка и активности АР. sR3-AP мыши и человека связывали VEGFCNС с близкой аффинностью. Таким образом, способность различных химерных sR3-AP связывать человеческий VEGF-CNС использовали для определения того, что химерные рецепторы сохраняют правильную укладку полипептидной цепи. Способность антитела 1 и антитела 2 связывать химерные белки 1 и 4 показывает, что эпитопы антитела 1 и антитела 2 полностью содержатся во втором ИГ домене (ИГ 2) VEGFR-3 человека и мыши соответственно. Например, антитело 1 не связывает химерные конструкции 2 или 4, которые содержат последовательность домена ИГ 2 VEGFR3 мыши. Определение аминокислотных остатков VEGFR-3, которые образуют эпитопы для антитела 1 и антитела 2. определили двенадцать (12) позиций в аминокислотной последовательности второго ИГ домена Использовали сайт-специфический мутагенез для замены каждого видоспецифичного аминокислотного остатка в последовательности мышиного и человеческого белка на соответствующий ортолог противоположного вида; каждый мутированный белок затем экспрессировали в виде белка SR3-AP, содержащего первый, второй и третий ИГ домены. Картирование эпитопа проводили с использованием двух взаимодополняющих подходов. В первом подходе измеряли ослабление связывания антитела 1,специфичного для белка человека, и антитела 2, специфичного для белка мыши, с их соответствующими белками sR3-AP человека и мыши из-за точечных аминокислотных замен в человеческом или мышином ортологах. Во втором подходе измеряли усиление связывания антитела 1 и антитела 2 с sR3-AP противоположного вида, вызванное точечными аминокислотными заменами в человеческом или мышином ортологах. Остаток считали сильным кандидатом в компоненты эпитопа, если описанная выше мутация вызывала ослабление связывания в первом подходе и усиление связывания во втором. Связывание VEGF- 10023331 СNC всеми мутантными белками измеряли параллельно, чтобы избежать различий из-за сильных изменений в структуре белка. Измерение связывания проводили в трех повторностях и результат вычисляли как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Из 12 проверенных замен во втором ИГ доменеsR3-AP человека, только одна (V184L) приводила к полному нарушению связывания с VEGF-CNC И антителом 1. Предполагается, что эта замена нарушает структуру sR3-AP человека. Замена V175 А приводила к приблизительно 50% ослаблению связывания с VEGF-C и антителом 1. Замена P219L приводила к примерно 75% ослаблению связывания с VEGF-C и почти полному (95%) нарушению связывания с антителом 1. Замена L221 на V не влияла на связывание sR3-AP человека с VEGF-C, но уменьшала связывание с антителом 1 приблизительно на 55%. Остальные замены ни привели к значительному изменению связывания ни с VEGF-C, ни с антителом 1. При проверке усиления связывания антитела 1 с мышиным sR3-AP, в который были введены точечные мутации, заменяющие мышиные аминокислотные остатки на человеческие, обнаружили значительное усиление связывания для мутантного белка с заменами A175V ( в 12 раз) и L219P ( в 60 раз),по сравнению с белком дикого типа. Другие замены не привели к усилению связывания с антителом 1. Критерии для определения аминокислот, составляющих эпитоп антитела 1, были следующие: замены в sR3-AP человека на аминокислоты мышиного ортолога должны значительно ослаблять связывание с антителом 1, но в то же время оставлять неизменным или ослаблять (но не отменять полностью) связывание с VEGF-CNC. В дополнение, аминокислотные остатки, составляющие эпитоп антитела 1, должны значительно увеличивать связывание с антителом 1 при введении этих аминокислотных остатков из человеческого ортолога в мышиный sR3-AP. Для антитела 1 этим критериям удовлетворяют V175 и Р 219 человеческого sR3-AP. V184 был исключен, так как его замена в человеческом sR3-AP на мышиный ортолог нарушала связывание с VEGF-CNC и с антителом 1, в то же время соответствующая замена в мышином sR3-AP на аминокислоту из человеческого ортолога в этой же позиции не приводила к связыванию с антителом 1. Замена лейцина 221 в человеческом sR3-AP на соответствующий валин из мышиного белка уменьшала связывание с антителом 1 на 55%. Тем не менее, соответствующая замена в мышиномsR3-AP на аминокислоту из человеческого ортолога не приводила к связыванию с антителом 1. Таким образом, L221 может быть побочным компонентом эпитопа антитела 1, но не отвечает всем критериям,установленным выше. Для дальнейшего изучения роли остатка в положении 221 мутации P219L и L221V в SR3-AP человека объединили в одну конструкцию. Связывание двойного мутанта с антителом 1 практически не наблюдалось, по сравнению белком с одной мутацией P219L, который сохранял 5% связывание с человеческим SR3-AP. Подводя итог, эти результаты показывают, что главным компонентом эпитопа является Р 219, аV175 является вспомогательным компонентом эпитопа человеческого VEGFR-3 для антитела 1. Кроме того, вероятно L221 также является побочным компонентом эпитопа. Затем проверили, какие именно аминокислотные остатки второго ИГ домена VEGFR-3 мыши образуют эпитоп для антитела 2, используя аналогичный метод. Измерение связывания опять проводили в трех повторениях и результат вычисляли как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Из 12 проверенных точечных мутаций, в которых мышиные аминокислотные остатки были заменены на соответствующие человеческие, 4 замены (H177W, P194S, R199H и N214D) значительно уменьшали связывание мышиного sR3-AP с VEGF-C и с антителом 2. Интересно, что мутации в положениях 219 и 221 (L219P и V221L) уменьшали связывание с антителом 2, но не с VEGF-C. Соответствующие замены аминокислотных остатков последовательности человека на мышиные в VEGFR-3 человека в положениях 219 и 221 (P219L и L221V) повышали связывание антитела 2 с человеческим sR3-AP в 55 раз и в 10 раз соответственно по сравнению с человеческим белком дикого типа. Также было обнаружено,что связывание мышиных белков, с заменами в позициях 219 и 221 на аминокислотные остатки человеческого ортолога с VEGF-CNC незначительно возрастало или оставалось неизменным, в то время как связывание таких мутантов с антителом 2 полностью нарушалось (219) или уменьшалось приблизительно на 85% (221). Критерии для определения аминокислот, составляющих эпитоп антитела 2, были следующие: замены в мышином sR3-AP на аминокислоты человеческого ортолога должны значительно ослаблять связывание с антителом 2, но в то же время оставлять неизменным или ослаблять (но не отменять полностью) связывание с VEGF-CNN. В дополнение, аминокислотные остатки, составляющие эпитоп антитела 2,должны значительно увеличивать связывание с антителом 2 при введении этих аминокислотных остатков из мышиного ортолога в человеческий sR3-AP. Для антитела 2 этим критериям удовлетворяют Р 219 и L221 мышиного sR3-AP. Другой способ выражения данных - это подсчет процента максимального связывания антитела 2 с мышиным sR3-AP дикого типа, который воссоздан с помощью индивидуальных замен в последовательности человеческого sR3-AP на аминокислоты мышиного ортолога. Он показывает, что индивидуальные замены P219L и L221V в последовательности человеческого sR3-AP приводят, соответственно, к 5 и 1%- 11023331 связыванию от максимального связывания антитела 2 с мышиным sR3-AP дикого типа. Этот метод также показывает, что L219 и V221 являются компонентами эпитопа антитела 2. Видно, что антитело 1 и антитело 2 связывают очень похожие эпитопы в VEGFR-3 человека иVEGFR-3 мыши соответственно, остаток в положении 219 является ключевым остатком в каждом конкретном случае. Данные в следующих примерах показывают, что и антитело 1 и антитело 2 являются нейтрализующими антителами, которые способны блокировать активность своих антигенов, а также подавляют рост опухоли в естественных условиях в ксенотрансплантатной модели. Такие данные приводят дополнительные доказательства того, что новый эпитоп во втором ИГ домене VEGFR-3, определенный в данном описании, является нейтрализующим эпитопом. Антитела, связывающиеся с указанным эпитопом, таким образом, способны блокировать связывание лигандов, сигнальный путь VEGFR-3 и подавлять рост опухолей в естественных условиях. Пример 3. Измерение аффинности (Kd) антител к VEGFR-3. Кинетику связывания антитела 1 измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса с биосенсором BIACORE 2000 (BIACORE, Piscataway, NY) при 20 С. Растворимый внеклеточный доменVEGFR-3 человека (sR3-AP) иммобилизовали на сенсорном чипе и антитело 1 вводили через проточный канал в концентрации от 0.8 до 6.25 нМ. Сенсограмму анализировали в программе BIA Evaluation 3.2 для определения скорости связывания (ka) и скорости диссоциации (kd). Константу диссоциации (Kd) высчитывали на основе ka и kd, используя уравнение: Kd = ka/kd. Анализ кинетики BIAcore показал, что Kd комплекса антитело 1 с sR3-AP составляет 56 пМ. Таким образом, антитело 1 имеет очень высокую аффинность к VEGFR-3 человека, причем эта аффинность почти на 2 порядка больше, чем у sR3-AP кVEGF- CNС. Пример 4. Блокирование связывания VEGF-C с VEGFR-3 антителами к VEGFR-3. Для измерения способности антител к VEGFR-3 блокировать связывание с VEGF-C с VEGFR-3 человека использовали конкурентный анализ блокирования связывания VEGF-C. Антитела или растворимые фаговые частицы в концентрации от 0.001 до 5 мкг/мл смешивали с 50 нг sR3-AP, инкубировали при комнатной температуре 1 ч и переносили в 96-луночный титрационный микропланшет, покрытый VEGFCNC (200 нг/лунка). Через 2 ч микропланшет промывали 5 раз и добавляли п-нитрофенилфосфат(Sigma) для количественного определения связавшихся молекул sR3-AP по поглащению света с длиной волны 405 нм. Вычисляли IC50, т.е. концентрацию Fab или IgG, требуемую для 50% подавления связывания sR3-AP с VEGF-CNC. Fab и IgG формы антитела 1 сильно подавляли связывание sR3-AP с иммобилизованным VEGF-CNC, IC50 составила 2 и 1.3 нМ соответственно. Контрольное антитело к рецепторуIGF человека, полученное из той же фаговой библиотеки, было неактивным. Пример 5. Подавление стимулированного VEGF-СNC митогенного ответа антителом 1. Для того чтобы проверить способность антитела 1 подавлять передачу сигнала, опосредованнуюVEGFR-3, создали клеточную линию NIH-3T3, которая экспрессировала химерную форму VEGFR-3,которая представляет собой внеклеточный домен VEGFR-3 человека соединенный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами cFMS человека. Эндогенной экспрессии VEGFR-3 родительскими клетками детектировано не было, а локализацию химерного рецептора на плазматической мембране продемонстрировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Клетки VEGFR-3-FMS (5103 клеток/лунка) поместили в 96-луночный планшет для культивирования тканей (Wallac, Gaithersburg, MD) в 200 мл бессывороточной среды и инкубировали при 37 С в течение 72 ч. Антитело в концентрации до 20 нМ добавляли и инкубировали при 37 С в течение 1 ч, затем добавляли VEGF- СNC до конечной концентрации 20 нг/мл. После 18 ч инкубации добавляли в каждую лунку 0.25 мКи тимидина, содержащего тритий, ([3H]-TdR) (Amersham) и инкубировали еще 4 ч. Клетки помещали на лед, промывали один раз средой, содержащей сыворотку, инкубировали 10 мин при 4 С с 10% ТХУ, а затем растворяли в 25 мл 2% SDS. Включение радиоактивной метки определяли на сцинтилляционном счетчике (Wallac, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter). Включение [3H]-TdR NIH-3T3 клетками, экспрессирующимиVEGFR-3-cFMS, увеличивалось по меньшей мере в 3 раза при добавлении VEGF-CNС. Митогенный ответ специфически и дозозависимо блокировался антителом 1 с IC50 около 5 нМ. Пример 6. Моноклональные антитела к VEGFR-3 в модели подкожного ксенотрансплантата на основе линии клеток карциномы яичников человека OVCAR-8. В данном эксперименте моноклональные антитела к VEGFR3 антитело 1 и антитело 2 использовали по отдельности или в комбинации на ксенотрансплантате культуры клеток карциномы яичников человека OVCAR-8 (NCI-60, Developmental Therapeutics Program, NCI/NTH) иммунодефицитных мышей линииSCID. OVCAR-8 - одна из немногих х клеточных линий карциномы человека, которые экспрессируютVEGFR-3 человека. В этом эксперименте ожидали увидеть, что антитело 2 будет блокировать ангиогенез и лимфангиогенез в строме растущей опухоли, но не будет оказывать никакого эффекта на саму опухоль. А антитело 1, наоборот, будет действовать только на опухолевые клетки человека. Клетки OVCAR-8 вводили подкожно в левый бок 75 бестимусным самкам мышей в количестве 1107 клеток/мышь. Когда опухоль достигала объема 180 мм 3, 13 дней после введения клеток, мышей случайным образом делили на 5 групп лечения (n = 12): стерильным физиологическим раствором (кон- 12023331 троль), 0.5 мл/доза; крысиным IgG в количестве 40 мг/кг; антителом 1 в количестве 40 мг/кг; антителом 2 в количестве 40 мг/кг и антителом 1 в количестве 40 мг/кг + антителом 2 в количестве 40 мг/кг. Моноклональные антитела к VEGFR-3 и контроль вводили интраперитонеально по схеме понедельник-средапятница. Измерение опухоли проводили 2 раза в неделю. Т/С% высчитывали для каждой группы лечения как отношение относительного объем опухоли в каждой группе лечения к относительному объему опухоли в контрольной группе. Для сравнения роста опухоли среди разных групп лечения на 41 день использовали дисперсионный анализ повторных измерений (RM ANOVA). Антитело 2 значительно подавляло рост опухоли OVCAR-8, Т/С% составил 71% (Р = 0.0299). Антитело 1 продемонстрировало тенденцию к эффективности в этой модели (Т/С% составил 74%), но степень подавления опухоли не достигла статистической значимости (Р 0.05). Это могло произойти из-за большого разброса объема опухолей на 41 день в этой группе (335-1504 мм 3). Этот факт мог помешать достигнуть статистической значимости в этой группе. Сочетание антитела 1 и антитела 2 увеличило эффект подавления опухоли антителом 2 (Т/С% составил 47% и разница с каждым антителом по отдельности была статистически значима (Р 0.0358. Антитело 2 значительно подавляет рост опухоли OVCAR-8, в то время как антитело 1 производит впечатление эффективного в этой модели, но не достигает статистической значимости. Тем не менее, так как сочетание двух моноклональных антител значительно подавляет рост опухоли OVCAR-8 по сравнению с лечением только антителом 2, заключили, что антитело 1 показало терапевтическую эффективность в этом эксперименте. Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели карциномы яичников. Пример 7. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 1 в модели подкожного ксенотрансплантата на основе клеток эритролейкемии человека (HEL). В следующем эксперименте обнаружили значительную противоопухолевую активность антитела 1 в ксенотрансплантатной модели эритролейкемии человека (HEL). Мышей линии Nu/nu (самки, 7-8 недель) разместили по 5-6 в клетку и ввели подкожно 5106 HEL клеток/мышь. Когда опухоли достигли приблизительно 400 мм 3 в объеме, мышей рандомизировали по объему опухоли на 4 группы лечения (n=11/группу): 1) стерильный физиологический раствор, 10 мл/кг,2) антитело 1,60 мг/кг (ударная доза 150 мг/кг в 1 день),3) антитело 1,20 мг/кг (ударная доза 50 мг/кг в 1 день),4) антитело 1,6 мг/кг (ударная доза 15 мг/кг в 1 день). Антитело 1 растворяли в стерильном физиологическом растворе. Лекарства вводили интраперитонеально, дважды в неделю, в 10 мл раствора лекарства на килограмм массы тела. Первую дозу, ударную дозу, вводили в 1 день, затем поддерживающие дозы вводили два раза в неделю в течение всего срока исследования. Объем опухоли измеряли два раза в неделю. Массу тела измеряли по меньшей мере два раза в неделю на протяжении всего исследования. Т/С% рассчитывали для каждой группы в 18 день как отношение относительного объема опухоли в каждой группе лечения к относительному объему опухоли в контрольной группе (табл. 5). Рост опухоли и изменение массы тела в группах лечения сравнивали с использованием дисперсионного анализа повторных измерений. Лечение антителом 1 привело к дозозависимому подавлению роста опухоли HEL, причем при дозе антитела 1 60 мг/кг наблюдали значительное подавление роста опухоли (р=0.0031). Эффекта на массу тела лечение антителом 1 в данном исследовании не оказало (табл. 5). Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели HEL, и приводят к минимальным побочным эффектам в этой модели. Таблица 5 Пример 8. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2 в сочетании с цисплатином в модели ксенотрансплантата плоскоклеточного рака CAL27.- 13023331 Для того чтобы проверить активность антител к VEGFR-3 против рака головы и шеи, использовали ксенотрансплантатную модель CAL27. Суспензию клеток CAL27 в количестве 1107 клеток/мышь вводили подкожно в левый бок 60 самкам бестимусных мышей. Когда опухоль достигала объема 180 мм 3,через 8 дней после введения клеток, мышей случайным образом разделяли на 4 группы лечения (n = 12): 1) стерильным физиологическим раствором (контроль), 0.5 мл интраперитонеально, 3 дня в неделю; 2) антитело 2 в количестве 40 мг/кг, 3 дня в неделю 3.) цисплатин в количестве 7 мг/кг, 7 дней в неделю 4.) антитело 2 в количестве 40 мг/кг, 3 дня в неделю + цисплатин в количестве 7 мг/кг, 7 дней в неделю. Измерение опухоли проводили 2 раза в неделю; для сравнения роста опухоли в разных группах лечения на 61 день использовали RM ANOVA. Критерий хи-квадрат использовали для проверки статистической значимости количества случае регрессии опухоли в группах лечения. Лечение антителом 2 или цисплатином по отдельности значительно подавляло рост опухоли CAL27 по сравнению с контрольной группой (Р 0.0077). Т/С% составили 55 и 39% для антитела 2 и цисплатина соответственно. Совместное лечение антителом 2 и цисплатином привело к значительному подавлению роста опухоли по сравнению с монотерапией (Р 0.0322). Влияние комбинированной терапии было сильнее, чем при простом сложении эффективности, как это определено с помощью метода разделения препаратов (Fractional Product Method). Таким образом, антитела к VEGFR-3, а именно к эпитопу во втором ИГ домене VEGFR-3, демонстрирует противоопухолевую эффективность в естественных условиях в модели рака головы и шеи в виде монотерапии или в комбинации с цисплатином. Пример 9. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2 в сочетании с 5 фторурацилом/лейковорином в ксенотрансплантатной модели рака молочной железы MDA-MB-231. Для того чтобы проверить активность антител к VEGFR-3 против рака молочной железы, использовали ксенотрансплантатную модель MDA-MB-231. Бестимусным мышам линии NIH nu/nu (самки, 8 недель) вводили подкожно в жировую ткань, окружающую млечную железу, 6106 клеток MDA-MB-231 в 0.4 мл смеси вода/матригель (1:1). Когда опухоли достигали объема приблизительно 300 мм 3, мышей рандомизировали по размеру опухоли на следующие группы лечения: (n=12): 1) стерильный физиологический раствор 10 мкл/г, 3 раза в неделю 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю 3) 125 мг/кг 5FU (5 фторурацила) + 62 мг/кг LV (лейковорина), один раз в неделю 4) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю + 125 мг/кг и 62 мг/кг 5FU и LV соответственно, один раз в неделю. Все вещества готовили в день введения и вводили интраперитонеально. Цитотоксическое лечение начали на день раньше, чем лечение антителами. Сравнение объема опухолей у мышей контрольной группы и у мышей других групп лечения показало значительное подавление роста опухоли в группах, получавших лечение антителом 2 или антителом 2 + 5FU/LV (см. табл. 6). Хотя эффект от лечения антителом 2 + 5-FU/LV не превышает эффект от монотерапии, существует тенденция к увеличению противоопухолевого эффекта при сочетании препаратов. Соответственно, антитела к VEGFR-3, связывающие эпитоп во втором ИГ домене VEGFR-3, демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака молочной железы (по сравнению с физиологическим раствором, использованным в качестве контроля), как в случае монотерапии, так и в сочетании с 5FU/LV. Таблица 6 Пример 10. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2, отдельно или в сочетании с доцетакселом в ксенотрансплантатной модели рака легких NCI-H292. Для того чтобы определить активность антител к VEGFR-3 против рака легких, использовали ксенотрансплантатную модель с клетками линии NCI-H292. Мышам линии Nu/nu (самки, возраст 7-8 недель) вводили подкожно 2106 NCI-Н 292 клеток/мышь. Когда опухоли достигали объема около 300 мм 3,мышей рандомизировали по размеру опухоли на следующие группы лечения (n=15): 1) физиологческий раствор в дозе 10 мкл/г, 3 раза в неделю, интраперитонеально, начиная со второго дня; 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю, интраперитонеально, начиная со второго дня; 3) 12 мг/кг доцетаксела, 7 дней в неделю, начиная с первого дня; 4) 12 мг/кг доцетаксела, 7 дней в неделю, начиная с первого дня и 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю, начиная со второго дня. Объем опухоли и массу тела животных измеряли приблизительно 2 раза в неделю на протяжении всего исследования. В конце исследования мышей умерщвляли асфиксией в атмосфере СО 2. Т/С% вы- 14023331 считывали для каждой группы лечения как отношение относительного объема опухоли в экспериментальной группе к относительному объему опухоли в контрольной группе. Рост опухоли и массу тела сравнивали с контрольной группой с использованием RM ANOVA на 26 день. Лечение антителом 2 и доцетакселом значительно подавляло рост опухоли NCI-H292 с значениями Т/С% 74 и 49% соответственно. Комбинированное лечение антителом 2 и доцетакселом значительно увеличивало противоопухолевую активность препаратов по сравнению с каждой монотерапией с Т/С% 24%. Соответственно, антитела к VEGFR-3, связывающие эпитоп во втором ИГ домене VEGFR-3, проявляют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака легких, причем как при монотерапии (р=0.0001), так и в сочетании с Доцетакселом (р=0.0001). Пример 11. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2 в подкожной ксенотрансплантатной модели почечно-клеточной карциномы человека SK-RC-29. Для того чтобы определить активность антител к VEGFR-3 против почечно-клеточного рака (RCC),использовали ксенотрансплантатную модель RCC SK-RC-29. Самкам бестимусных мышей линии nu/nu(n = 12 на группу) вводили подкожно 2106 клеток SK-RC-29 RCC на мышь. Клетки вводили в смеси 1:1 с веществом базальной мембраны Matrigel (Vt = 0.4 мл). Когда опухоли достигали объема 200-250 мм 3,мышей разделяли на группы и начинали интраперитонеально вводить препараты для лечения - стерильный физиологический раствор контрольной группе (500 мкл/инъекция) и антитело 2 экспериментальной группе (60 мг/кг - первая доза и 40 мг/кг - последующие дозы). Измерение объема опухоли проводили дважды в неделю в течение 43 дней. Образцы опухолей (n = 4 на группу лечения) взяли на 48 день для гистологического анализа. Для определения достоверности противоопухолевого эффекта использовали статистический анализ RM ANOVA. Потери веса ни в одной группе лечения не наблюдалось, как показали измерения на 47 день. Наоборот, вес мышей, получавших лечение антителом 2, увеличился примерно на 5.5% за время исследования. Чтобы определить противоопухолевую эффективность и вычислить значения Т/С%, все группы лечения сравнивали с мышами контрольной группы в день 32. Значение Т/С% для антитела 2 составило 62% (р=0.012); это показывает подавление роста почечно-клеточной карциномы в подкожной ксенотрансплантатной модели с минимальными побочными эффектами. Пример 12. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2 в ксенотрансплантатной модели рака поджелудочной железы ВхРС-3. Для того чтобы определить активность антител к VEGFR-3 против рака поджелудочной железы,использовали ксенотрансплантатную модель рака поджелудочной железы ВхРС-3. Самкам бестимусных мышей линии nu/nu (n = 36) вводили подкожно 2106 клеток поджелудочной железы человека на одну мышь в смеси с матригелем в соотношении 1:1. Когда опухоли достигали объема 350 мм 3, животных разделяли на 3 группы лечения (n = 10): 1) физиологический раствор; 2) 10 мг/кг моноклонального антитела 2; 3) 40 мг/кг моноклонального антитела 2. Все препараты вводили интраперитонеально, 3 раза в неделю в количестве 0.1 мл/10 г массы тела. Измерения размера опухолей проводили 2 раза в неделю в течение 6 недель. При лечении антителом 2 рост опухоли ВхРС-3 дозозависимо подавлялся. В конце исследования, на 40 день, значения Т/С% составили 75% (р=0.042) и 56% (р=0.002) групп с дозами 10 мг/кг и 40 мг/кг соответственно. Пример 13. Моноклональное антитело к VEGFR-3 антитело 2 в сочетании с оксалиплатином в ксенотрансплантатной модели рака толстой кишки НТ-29. Для того чтобы испытать действие антител к VEGFR-3 на рак толстой кишки, использовали ксенотрансплантатную модель рака толстой кишки. Суспензию клеток НТ-29, 5106/мышь, вводили подкожно в левый бок 60 самкам бестимусных мышей. Когда опухоли достигали объема 180 мм 3, на восьмой день после введения клеток, мышей рандомизировали и делили на 4 группы лечения (n = 12): 1) стерильный физиологический раствор, 0.5 мл интраперитонеально, 3 раза в неделю; 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю; 3) 12 мг/кг оксалиплатина, 7 дней в неделю; 4) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю + 12 мг/кг оксалиплатина, 7 дней в неделю. Измерения объема опухоли проводили 2 раза в неделю. Для сравнения роста опухоли в разных группах лечения использовали статистический анализ RM ANOVA. Антитело 2 отдельно не подавляло рост опухоли НТ-29; антитело имело тенденцию к эффективности с Т/С% 80%. Совместное лечение антителом 2 и оксалиплатином значительно подавляло рост опухоли НТ-29 по сравнению с контрольной группой и группами с монотерапией любым из препаратов (Р 0.0280), значение Т/С% составило 47%. Соответственно, антитело к VEGFR-3, связывающее эпитоп во втором ИГ домене VEGFR-3, демонстрирует противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака толстой кишки при использовании вместе с оксалиплатином.