Способы и композиции для лечения или предупреждения артрита или повреждения сустава

СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ АРТРИТА ИЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ СУСТАВА В изобретении описаны способы и композиции, предназначенные для лечения или предупреждения артрита и повреждения сустава, в которых используется полипептид, состоящий из С-концевого домена фибриногена ANGPTL3, обладающего хондрогенной активностью.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ СКРИППС РИСЧ ИНСТИТЬЮТ (US); НОВАРТИС АГ Перекрестные ссылки на родственные заявки Настоящая заявка согласно 35 U.S.С.1.119(е) претендует на приоритет предварительной заявки на патент США 61/225293, зарегистрированной 14 июля 2009 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпосылки создания изобретения Остеоартрит (ОА) представляет собой наиболее широко распространенное скелетно-мышечное нарушение. В настоящее время им поражено примерно 40 млн американцев, и прогнозируется, что это количество возрастет до 60 млн в течение следующих 20 лет в результате старения популяции и увеличения вероятной продолжительности жизни, что ставит его на четвертое место среди основных заболеваний, приводящих к нетрудоспособности. ОА отличается медленным дегенеративным разрушением сустава, затрагивающим как суставной хрящ (который содержит клетки и матрикс, вырабатывающие смазывающую среду и обеспечивающие амортизацию для сустава), так и субхондральную кость, расположенную под суставным хрящом. Современная терапия ОА включает облегчение боли с помощью оральных НСПВС или селективных ингибиторов циклооксигеназы 2 (СОХ-2), введение посредством внутрисуставной (IA) инъекции таких средств, как кортикостероиды и гиалуронан, и хирургическое вмешательство. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) присутствуют в суставном хряще у взрослых, и после выделения у них можно программировать in vitro их дифференцировку в хондроциты и другие линии мезенхимальных клеток. В частности, они регулируются факторами роста (TGF, BMP), условиями в сыворотке и контактом по типу клетка-клетка. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предложены способы облегчения или предупреждения артрита или повреждения сустава у млекопитающего. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения способ заключается в том, что вводят в сустав млекопитающего композицию, которая содержит в эффективном количестве полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или 25, тем самым облегчая или предупреждая артрит или повреждение сустава у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает артритом или имеет повреждение сустава. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум не страдает артритом или повреждением сустава, но имеет риск их возникновения. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит последовательность,представленную в SEQ ID NO: 1 или 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 95% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 80% любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. В некоторых вариантах осуществления изобретения артрит выбран из группы, включающей остеоартрит, травматический артрит и аутоиммунный артрит. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит также гиалуроновую кислоту. Настоящее изобретение относится также к способу индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты, которые формируют хрящевой матрикс. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что приводят в контакт мезенхимальные стволовые клетки с взятым в достаточным количестве полипептидом, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или 25, для индукции дифференцировки стволовых клеток в хондроциты. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ осуществляют in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ осуществляют in vivo и стволовые клетки присутствуют в организме млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит последовательность,представленную в SEQ ID NO: 1 или 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 95% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентич-1 023073 на по меньшей мере на 80% любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, предназначенным для внутрисуставного введения или системного введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция включает в фармацевтически эффективном количестве полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит также гиалуроновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит последовательность,представленную в SEQ ID NO: 1 или 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 95% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 80% любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность содержит любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-24. Дополнительные особенности, преимущества и варианты осуществления изобретения изложены или могут стать очевидными после ознакомления с прилагаемым подробным описанием и формулой изобретения. При этом, как должно быть очевидно, что как приведенное выше краткое изложение сущности изобретения, так и подробное описание изобретения представлены в качестве примера и подразумевается, что они предназначены для дополнительного пояснения и не накладывают ограничения на заявляемый объем изобретения. Определения Понятия "пептидомиметик" и "миметик" относятся к синтетическому химическому соединению,которое имеет практически такие же структурные и функциональные характеристики, что и встречающийся в естественных условиях или не встречающийся в естественных условиях полипептид (например,ANGPTL3 (ангиопоэтинподобный белок 3. Пептидные аналоги, как правило, применяют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств, которые обладают свойствами,аналогичными свойствам пептида, служащего в качестве эталона. Эти типы непептидных соединений обозначают как "пептидные миметики" или "пептидомиметики" (Fauchere J., Adv. Drug Res. 15, 1986, с. 29; Veber и Freidinger, TINS, 1985, с. 392; и Evans и др., J. Med. Chem. 30, 1987, с. 1229, указанные публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Пептидные миметики, которые структурно аналогичны применяемым в терапии пептидам, можно использовать для достижения эквивалентного или усиленного терапевтического или профилактического действия. Как правило, пептидомиметики структурно аналогичны полипептиду-образцу (т.е. полипептиду, который обладает биологической или фармакологической активностью), т.е. представляющему интерес полипептиду, но у них одна или несколько пептидных связей необязательно заменены связью, выбранной из группы, которая включает, например, CH2NH-, -CH2S-, -СН 2-СН 2-, -СН=СН- (цис- и транс-), -СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-. Миметик может либо полностью состоять из синтетических, не встречающихся в естественных условиях аналогов аминокислот, либо может представлять собой химерную молекулу, состоящую частично из аминокислот,которые входят в состав встречающихся в естественных условиях пептидов, и частично из не встречающихся в естественных условиях аналогов аминокислот. Миметик может включать также любое количество консервативных замен встречающихся в естественных условиях аминокислот, если такие замены также не приводят к значительному изменению структуры и/или активности миметика. Например, композиция миметика подпадает под объем изобретения, если она обладает по меньшей мере одним из видов активности представляющего интерес полипептида. Понятия "полипептид", "пептид" и "белок" в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Указанные понятия применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный, полученный химическим путем миметик соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также к встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам и не встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам. Понятие "аминокислота" относится к встречающимся в естественных условиях и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично встречающимся в естественных условиях аминокислотам. Встречающиеся в естественных условия аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые впоследствии модифицируются, например гидроксипролин, гаммакарбоксиглутамат и О-фосфосерин. Понятие "аминокислотные аналоги" относится к соединениям, кото-2 023073 рые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота, т.е. имеют атом углерода в -положении, который связан с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метионинметилсульфоний. Такие аналоги несут модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота. Кодируемые в естественных условиях аминокислоты включают 20 обычных аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин), а также пирролизин и селеноцистеин. Понятие "консервативно модифицированные варианты" относится как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. Касательно конкретных нуклеотидных последовательностей понятие "консервативно модифицированные варианты" относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае,когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода любой конкретный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны GCA,GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин кодируется кодоном, кодон можно заменять на любые соответствующие известные кодоны без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются "молчащими вариациями", которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариантов. В контексте настоящего описания подразумевается, что каждая нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, включает также все возможные молчащие вариации нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, для каждой описанной последовательности подразумевается каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Касательно аминокислотных последовательностей специалисту в данной области должно быть очевидно, что индивидуальные замены, делеции или добавления в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, в результате которых изменяют, добавляют или изымают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, приводят к получению консервативно модифицированного варианта, в котором изменение приводит к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, обеспечивающих получение функционально сходных аминокислот, хорошо известен в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели, предлагаемые в изобретении. Каждая из приведенных ниже 8 групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т) и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984. Понятие "процент идентичности последовательностей" означает величину, определяемую путем сравнения двух оптимальным образом выровненных последовательностей в окне сравнения, где фрагмент полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может иметь вставки или делеции (т.е. бреши) по отношению к последовательности, с которой производится сравнение (референспоследовательности) (например, последовательности полипептида, предлагаемого в изобретении), которая не имеет вставок или делеций, для оптимального сравнительного анализа первичной структуры двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичное нуклеотидное основание или идентичный аминокислотный остаток, в результате чего получают количество совпадающих положений, деления количества совпавших положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Понятия "идентичный" или процент "идентичности" в отношении двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются "практически идентичными", если две последовательности имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичность на уровне 60, необяза-3 023073 тельно идентичность на уровне 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% в определенной области или, если она не указана конкретно, в полной последовательности) при сопоставлении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в окне сравнения или в предназначенной для этого области, что устанавливают с использованием одного из перечисленных ниже алгоритмов или путем сравнения вручную и визуального анализа. Изобретение относится к полипептидам, которые соответственно являются практически идентичными полипептидам, приведенным в настоящем описании в качестве примеров (например,имеющим последовательности, представленные в любой из SEQ ID NO: 1-28), а также к их применению,включая (но, не ограничиваясь только ими) применение для лечения или предупреждения артрита или повреждения сустава. Необязательно идентичность имеет место в области длиной примерно 50 нуклеотидов или более предпочтительно в области длиной от 100 до 500 или 1000 нуклеотидов или более, или по всей длине референс-последовательности. При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность представляет собой референс-последовательность, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения данные о тестируемой последовательности и референс-последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности и параметры алгоритмической программы сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы,задаваемые по умолчанию, или альтернативные параметры. После этого алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает на основе параметров программы процент идентичности для тестируемых последовательностей и референс-последовательности. В контексте настоящего описания понятие "окно сравнения" относится к сегменту, содержащему любое количество следующих непрерывно друг за другом положений, выбранных из группы, содержащей от 20 до 600, предпочтительно от примерно 50 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 150 положений, в которых можно сравнивать последовательность с референспоследовательностью, имеющей такое же количество непрерывных положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, которые можно применять для сравнения, хорошо известны в данной области. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей можно осуществлять, например, с использованием алгоритма локальной гомологии, который описан у Smith и Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 1970, с. 482, алгоритма сравнительного анализа гомологии, который описан у Needleman и Wunsch., J. Mol. Biol. 48,1970, с. 443, метода поиска сходства, который описан у Pearson и Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85,1988, c. 2444, с использованием компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA иTFASTA, входящих в пакет программ фирмы Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 ScienceDrive, Мэдисон, Висконсин, США) или путем сравнения вручную и визуального анализа (см., например,Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology (1995, приложение). Двумя примерами алгоритмов, которые можно применять для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, могут служить алгоритмы BLAST и BLAST 2.0,описанные у Altschul и др., Nuc. Acid Res. 25, 1977, сс. 3389-3402 и у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215,1990, сс. 403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов с помощьюBLAST может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (NationalCenter for Biotechnology Information). В этом алгоритме сначала производится идентификация пар последовательностей с высокими баллами (HSP) путем идентификации коротких "слов" длины W в запрашиваемой последовательности, которые или совпадают, или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) Т при сравнении со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговой оценкой (баллом) близкого "слова" (Altschul и др., 1990). Эти исходные совпадения близких "слов" используются в качестве "затравки" для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих эти "слова" более длинных HSP. Затем выборки "слова" удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может происходить увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров М (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда 0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда 0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение совпадающих "слов" в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения,если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков, или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина "слова" (W), равная 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4,при этом производится сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программеBLASTP используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина "слова" (W), равная 3,ожидание (Е), равное 10, и матрица баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89, 1989, с. 10915) для сравнительного анализа (В) 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N= -4, при этом производится сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST производит также статистический анализ сходства двух последовательностей(см., например, Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5787). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получать алгоритм BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N, которая характеризует вероятность, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с референспоследовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидной референс-последовательностью меньше приблизительно 0,2,более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001. Понятие "гиалуроновая кислота" в контексте настоящего описания включает производные гиалуроновой кислоты, такие как эфиры гиалуроновой кислоты, соли гиалуроновой кислоты, а также включает понятие гиалуронан. Под указанное понятие подпадают также как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные формы гиалуронанов и сшитые гиалуронаны или гиланы. Примерами указанных гиалуронанов являются Synvisc (фирма Genzyme Corp., Кэмбридж, шт. Массачусетс), ORTHOVISC (фирмаAnika Therapeutics, Уоберн, шт. Массачусетс) и HYALGAN (фирма Sanofi-Synthelabo Inc., Малверн,шт. Пенсильвания). Краткое описание чертежей На чертежах показано: На фиг. 1 - результаты количественной оценки индуцируемого MSC производства коллагена типа II в процессе хондрогенеза in vitro. hMSCs (10000 / 384-луночный планшет) высевали в течение 24 ч в среду для роста hMSC (фирма Millipore). Клетки обрабатывали вышеуказанными белками в течение еще 72 ч. Среду заменяли бессывороточной средой DMEM и осуществляли культивирование в течение еще 14 дней без каких-либо дополнительных стимулов. По окончании процесса инкубации клетки фиксировали формалином, отмывали, окрашивали антителом к коллагену типа II и подвергали их контрастному окрашиванию с помощью DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол). Количество окрашенного коллагена типа II оценивали с помощью высокоэффективной системы визуализации (система для микропланшетов, позволяющая получать очень подробное изображение и анализировать его (Opera - High Content Imaging System, фирма Perkin Elmer. Для каждой дозы объединяли данные, полученные в 3 экспериментах, проведенных с дублированием (n=6). На фиг. 2 - характеризация индуцируемого ANGTPL3 хондрогенеза. (А) hMSC выращивали в виде пеллет-культуры (клетки в высокой концентрации образующие плотный агрегат) (110 клеток/пеллет) в течение 21 дня в бессывороточной среде DMEM, lITS и ANGTPL3 (как указано). Среду заменяли каждые 3 дня. Экспрессию мРНК аггрекана оценивали количественно с помощью специфических человеческих Taqman-зондов согласно инструкциям производителя (объединенные данные, полученные в 3 экспериментах, проведенных с дублированием (n=6. (Б) Бычий хрящ выделяли, с помощью перфоратора получали симметричные кружки и помещали в культуру для органов. Срезы обрабатывали в течение 48 ч 20 нг/мл TNFa и 10 нг/мл OSM (медиаторы воспаления) для индукции расщепления (деградации) хрящевого матрикса в присутствии ANGPTL3 или без него с целью определения процента ингибирования высвобождения гликозаминогликана (объединенные данные, полученные для 4 доноров, n=12). (В) Высевали первичные здоровые хондроциты и синовиоциты (2500/384-луночный планшет в среде для роста) и культивировали в течение 24 ч при 37 С. Продемонстрировано умеренное увеличение хондроцитспецифического клеточного роста в ответ на обработку ANGTPL3 в течение 24-часового периода (для каждой дозы представлены объединенные данные, полученные в 2 экспериментах, проведенных с дублированием (n=4. На фиг. 3 - mANGTPTL3. (А) Первичная структура белка и подтвержденных сайты гликозилирования. (Б) Атомная структура (при разрешении 1,8 ангстрема) С-концевого FLD (фибриногенподобный домен) (225-455) mANGTPL3. На фиг. 4 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей ANGPTL3. (А) Сравнительный анализ первичной структуры последовательностей нативных человеческих, мышиных, бычьих и собачьих белков ANGPTL3; (Б) Сравнительный анализ первичной структуры последовательностей нативных человеческих, мышиных, бычьих, собачьих и конских белков ANGPTL3. На фиг. 5 - результаты анализа эффективности in vivo mANGPTL3 на модели остеоартрита, созданной путем хирургического вмешательства. Осуществляли хирургическое рассечение передней крестообразной связки (ACL), медиальной мениско-тибиальной связки (MMTL) и медиальной коллатеральной связки (MCL) правого колена мышей линии C57BL/6 (n=12 / группу) для индукции нестабильности коленного сустав и получения в результате фенотипа ОА. Через 1 неделю после хирургического вмешательства мышей подвергали указанной внутрисуставной инъекции, которую осуществляли один раз в 3-4 недели. (А). Образцы периферической крови получали в день 28 после хирургического вмешательства. Количественно оценивали присутствие в кровотоке фрагментов коллагена типа II (СТХ-II) с помощью(Б) Количественные оценки тибиального плато осуществляли с использованием шкалы 0-4, где 0 соответствует норме, а 5 - серьезному ОА (полное нарушение плотности хряща). По два среза, полученных от каждой мыши, оценивали вслепую 2 исследователя. Доза mANGPTL3 составляла 200 нг/колено, 3 недельные инъекции. (В) Связанную с ОА боль определяли количественно с помощью теста на "работоспособность" лап или на основе оценки промежутка времени (в процентах), в течение которого мышь могла стоять на подвергнутой хирургическому вмешательству лапе по сравнению с другой лапой, с помощью устройства для осуществления мониторинга. Выходные данные представляли собой болевой ответ в день 36 после хирургического вмешательства (3 дозы ANGPTL3 еженедельно в указанной концентрации). Подробное описание изобретенияI. Введение Настоящее изобретение основано, в частности, на открытии того факта, что ангиопоэтинподобный белок 3 (ANGPTL3) стимулирует дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение белков ANGPTL3 для предупреждения или облегчения артрита или повреждения сустава, которое осуществляют путем введения белка ANGPTL3 в сустав, позвонок, позвоночный диск или системно.II. Ангиопоэтинподобный белок 3 Ангиопоэтинподобный белок 3 является представителем семейства ангиопоэтинподобных секретируемых факторов. Он экспрессируется главным образом в печени и имеет характерную структуру ангиопоэтинов, состоящую из сигнального пептида, N-концевого coiled-coib-домена (CCD) и С-концевого фибриноген (FBN)-подобного домена. Известно, что FBN-подобный домен ангиопоэтинподобного белка 3 связывается с V/3-интегринами, и это связывание индуцирует адгезию и миграцию эндотелиальных клеток. Согласно настоящему изобретению можно применять различные белки ANGPTL3. Как указано в настоящем описании, нативный ANGPTL3, как правило, расщепляется in vivo с образованием аминоконцевого и карбоксиконцевого фрагментов. В настоящем изобретении предлагается применение различных белков ANGPTL3, которые обладают хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается применение полноразмерных нативных (или их вариантов) аминокислотных последовательностей белка ANGPTL3. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются белки ANGPTL3, которые содержат часть (не полноразмерную нативную последовательность) последовательности ANGPTL3 или ее вариант, которая/который сохраняет хондрогенную активность, т.е. без аминоконцевого фрагмента нативного белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения белкиANGPTL3, предлагаемые в изобретении, не имеют CCD-домена и/или не обладают выраженной CCDактивностью. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения белки ANGPTL3,предлагаемые в изобретении, содержат, по меньшей мере, фрагмент (например, состоящий по меньшей мере из 50, 100, 150, 200, 250 смежных аминокислот) нативной последовательности мышиного (например, SEQ ID NO: 12), человечьего (например, SEQ ID NO: 8), бычьего (например, SEQ ID NO: 16), собачьего (например, SEQ ID NO: 20) или конского (например, SEQ ID NO: 24) белка ANGPTL3 или практически идентичных последовательностей, но у них отсутствуют по меньшей мере 200 смежных аминоконцевых аминокислот нативного белка ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления изобретения белки ANGPTL3, предлагаемые в изобретении,содержат фибриногенподобный домен. В некоторых вариантах осуществления изобретения белкиANGPTL3, предлагаемые в изобретении, содержат смежные аминокислоты, которые соответствуют аминокислотам 207-455, 207-400, 207-350, 225-455, 225-400, 225-350, 241-455, 241-400, 241-350 нативной последовательности мышиного (например, SEQ ID NO: 12), человеческого (например, SEQ ID NO: 8),бычьего (например, SEQ ID NO: 16), собачьего (например, SEQ ID NO: 20) или конского (например, SEQID NO: 24) белка ANGPTL3, или они практически идентичны указанным последовательностям, но у них отсутствует фланкирующая аминокислотная последовательность нативного белка ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в белках ANGPTL3, предлагаемых в изобретении (включая(но, не ограничиваясь только ими) любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-28),отсутствует по меньшей мере часть С-концевой последовательности, например отсутствует 10, 20, 30, 40,50 аминокислот С-конца. Хотя описанные выше белки ANGPTL3, предлагаемые в изобретении, могут не иметь нативных последовательностей белка ANGPTL3, которые фланкируют указанные выше области, белки ANGPTL3,предлагаемые в изобретении, могут включать фланкирующие последовательности, которые не являются нативными для белка ANGPTL3. Например, обладающую хондрогенной активностью часть белкаANGPTL3 можно сливать с одной или несколькими гетерологичными аминокислотами с получением слитого белка. Последовательности партнеров по слиянию могут содержать (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные метки, не-L- (например, D-)-аминокислоты или другие аминокислотные миметики,предназначенные для удлинения времени полужизни in vivo и/или для обеспечения устойчивости к про-6 023073 теазам, обеспечивающие направленный перенос последовательности или другие последовательности. К белкам ANGPTL3, предлагаемым в изобретении, относятся варианты и укороченные версии нативных белков ANGPTL3, а также варианты и укороченные версии активных фрагментов, представленных в настоящем описании. Активные фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из различных путей, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно осуществлять сравнительные анализы первичной структуры активных белков для идентификации положений, которые являются инвариантными или которые включают консервативные аминокислотные замены. В SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4 представлены консенсусные последовательности, которые содержат инвариантные аминокислоты между определенными областями (положения 241-455, 225455 и 207-455 и нативная полноразмерная последовательность соответственно) нативных человеческих,мышиных, бычьих и собачьих белков ANGPTL3. В SEQ ID NO: 25, 26, 27 или 28 представлены консенсусные последовательности, которые содержат инвариантные аминокислоты между определенными областями (положения 241-455, 225-455 и 207-455 и нативная полноразмерная последовательность соответственно) нативных человеческих, мышиных, бычьих, собачьих и конских белков ANGPTL3. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения хондрогенные белки ANGPTL3, предлагаемые в изобретении, содержат SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 25, 26, 27 или 28. В некоторых вариантах осуществления изобретения хондрогенные белки ANGPTL3, предлагаемые в изобретении, содержат аминокислотную последовательность, практически идентичную любой из последовательностей, представленных в SEQ IDNO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 (при оценке по всей длине последовательностей). Белки ANGPTL3, предлагаемые в изобретении, обладают хондрогенной активностью. Как указано в настоящем описании, понятия "хондрогенез или хондрогенная активность" относятся к развитию хондроцитов из MSC. Индикаторами хондрогенной активности являются (но, не ограничиваясь только им) производство хрящевого матрикса. Производство хрящевого матрикса можно количественно оценивать с использованием различных маркеров, таких, например, как образование Sox9, коллагена типа II или гликозаминогликана (GAG). В некоторых вариантах осуществления изобретения количественно оценивают производство GAG в качестве маркера производства хрящевого матрикса. В некоторых вариантах осуществления изобретения 3-кратное повышение производства GAG, сопровождающееся экспрессией специфических для хряща белков, дает положительный ответ касательно производства хрящевого матрикса. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды ANGPTL3, предлагаемые в изобретении, могут содержать по меньшей мере одну не кодируемую в естественных условиях аминокислоту. Методы создания и интродукции не встречающихся в естественных условиях аминокислот в белок являются известными (см., например, US7083970 и 7524647). Общие принципы получения систем ортогональной трансляции, которые можно применять для получения белков, содержащих одну или несколько требуемых "ненатуральных" аминокислот, известны в данной области, поскольку они представляют собой общие методы получения систем ортогональной трансляции (см., например, публикации международных заявок, таких как WO 2002/086075, которая озаглавлена "METHODS AND COMPOSITIONFOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS" ("Способы и композиции получения ортогональных пар тРНК-аминоацил-тРНК-синтетаза"); WO 2002/085923,которая озаглавлена "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" ("Включение invivo "ненатуральных" аминокислот"); WO 2004/094593, которая озаглавлена "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE" ("Расширение генетического кода эукариот"; WO 2005/019415, зарегистрированная 7 июля 2004 г.; WO 2005/007870, зарегистрированная 7 июля 2004 г.; WO 2005/007624, зарегистрированная 7 июля 2004 г.; WO 2006/110182, зарегистрированная 27 октября 2005 г., которая озаглавлена "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" ("Компоненты ортогональной трансляции для включения in vivo "ненатуральных" аминокислот") и WO 2007/103490, зарегистрированная 7 марта 2007 г., которая озаглавлена"SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS" ("Системы для экспрессии компонентов ортогональной трансляции в эукариотических клетках-хозяевах". Каждая из указанных заявок полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Обсуждение систем ортогональной трансляции, которые обеспечивают включение "ненатуральных" аминокислот, и методов их получения и применения см., также у Wang и Schultz, "Expanding the Genetic Code", изд-во Angewandte Chemie Int ,44, 2005, cc. 34-66; Xie и Schultz, "An Expanding Genetic Code", Methods 36, 2005, cc. 227-238; Xie и Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire",Curr Opinion in Chemical Biology 9, 2005, cc. 548-554 и Wang и др., "Expanding the Genetic Code", AnnuRev Biophys Biomol Struct 35, 2006, cc. 225-249; Deiters и др., "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli", BioorganicMedicinal Chemistry Letters 15, 2005, cc. 1521-1524; Chin и др., "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli", J Am Chem Soc 124, 2002, cc. 9026-9027; и публикацию международной заявки WO 2006/034332, зарегистрированную 20 сентября 2005 г., содержание каждой из них полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительные детали описаны в US7045337; 7083970; 7238510; 7129333; 7262040; 7183082; 7199222 и 7217809. Понятие "не кодируемая в естественных условиях аминокислота" относится к аминокислоте, которая не представляет собой одну из обычных аминокислот или пиролизин или селеноцистеин. Другие понятия, которые можно использовать в качестве синонимов с понятием "не кодируемая в естественных условиях аминокислота", включают такие понятие как "не натуральная аминокислота", "ненатуральная аминокислота", "не встречающаяся в естественных условиях аминокислота" и различные написанные раздельно или вместе их версии. Понятие "не кодируемая в естественных условиях аминокислота" включает также (но, не ограничиваясь только ими) аминокислоты, которые получены в результате модификации (например, посттрансляционных модификаций) кодируемой в естественных условиях аминокислоты(включая (но не ограничиваясь только ими) 20 обычных аминокислот или пирролизин и селеноцистеин),но которые в естественных условиях сами не включаются в растущую полипептидную цепь с помощью трансляцонного комплекса. Примерами таких не встречающихся в естественных условиях аминокислот являются (но не ограничиваясь только ими) N-ацетилглюкозаминил-L-серин, N- ацетилглюкозаминил-Lтреонин и О-фосфотирозин. Не кодируемая в естественных условиях аминокислота, как правило, имеет любую структуру с любым заместителем в боковой цепи, отличным от применяемого в 20 встречающихся в естественных условиях аминокислотах. Поскольку не кодируемые в естественных условиях аминокислоты, предлагаемые в изобретении, как правило, отличаются от встречающихся в естественных условиях аминокислот только структурой боковой цепи, то не кодируемые в естественных условиях аминокислоты образуют амидные связи с другими аминокислотами, включая (но не ограничиваясь только ими) кодируемые и не кодируемые в естественных условиях аминокислоты, таким же образом, как они образуются в естественных условиях в полипептидах. Однако не кодируемые в естественных условиях аминокислоты имеют группы боковых цепей, которые отличают их от встречающихся в естественных условиях аминокислот. Например, R необязательно содержит алкильную, арильную, ацильную, кетогруппу, азидогруппу, гидроксильную группу, гидразин, цианогруппу, галоген, гидразид, алкенильную, алкинильную группу, простой эфир, тиольную, селеногруппу, сульфонильную группу, борат, боронат, фосфогруппу, фосфоногруппу, фосфиногруппу, гетероциклил, энон, имин, альдегид, сложный эфир, тиокислоту, гидроксиламин, аминогруппу или т.п., или любую их комбинацию. Другими представляющими интерес не встречающимися в естественных условиях аминокислотами, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но не ограничиваясь только ими) аминокислоты, содержащие фотоактивируемый перекрестно-сшивающий агент, меченные с помощью спиновой метки аминокислоты, флуоресцентные аминокислоты, связывающиеся в металлом аминокислоты, металлсодержащие аминокислоты, радиоактивные аминокислоты, аминокислоты с новыми функциональными группами, аминокислоты, взаимодействующие с помощью ковалентной или нековалентной связи с другими молекулами, активируемые светом (фотолабильные) и/или изомеризуемые под действием света аминокислоты, аминокислоты,содержащие биотин или аналог биотина, гликозилированные аминокислоты, такие как серии, несущий в качестве заместителя сахар, модифицированные другими углеводами аминокислоты, содержащие кетогруппу аминокислоты, аминокислоты, содержащие полиэтиленгликоль или простой полиэфир, аминокислоты, несущие в качестве заместителя тяжелый атом, химически расщепляемые и/или расщепляемые светом аминокислоты, аминокислоты с удлиненными по сравнению со встречающимися в естественных условиях аминокислотами боковыми цепями, которые включают (но не ограничиваясь только ими) простые полиэфиры или углеводороды с длинной цепью, содержащие в том числе (но не ограничиваясь только ими) более примерно 5 или более примерно 10 атомов углерода, аминокислоты, содержащие сшитые углеродом сахара, редокс-активные аминокислоты, содержащие аминотиокислоту аминокислоты и аминокислоты, содержащие один или несколько обладающих токсичностью фрагментов. Примерами не кодируемых в естественных условиях аминокислот, которые можно применять согласно настоящему изобретению и которые могут вступать во взаимодействия с водорастворимыми полимерами, являются (но не ограничиваясь только ими) аминокислоты с карбонильной, аминооксигруппой, гидразиновой, гидразидовой, семикарбазидной, азидной и алкиновой реактивными группами. В некоторых вариантах осуществления изобретения не кодируемые в естественных условиях аминокислоты содержат сахаридный остаток. Примерами таких аминокислот являются N-ацетил-L-глюкозаминил-Lсерин,N-ацетил-L-галактозаминил-L-серин,N-ацетил-L-глюкозаминил-L-трионин,N-ацетил-Lглюкозаминил-L-аспарагин и О-маннозаминил-L-серин. Примерами таких аминокислот являются также аминокислоты, в которых встречающаяся в естественных условиях N- или О-связь между аминокислотой и сахаридом заменена на ковалентную связь, которая обычно не встречается в естественных условиях,включая (но не ограничиваясь только ими) алкен, оксим, простой тиоэфир, амид и т.п. Примерами таких аминокислот являются также аминокислоты, включающие сахариды, которые не являются характерными длявстречающихся в естественных условиях белков, такие как 2-дезоксиглюкоза, 2-дезоксигалактоза и т.п. Другим типом модификации, которую необязательно можно интродуцировать в белки ANGPTL3,предлагаемые в изобретении (например, в полипептидную цепь или на ее N-, или на С-конец), например,для удлинения времени полужизни in vivo, является ПЭГилирование или включение длинноцепочечных полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ). Интродукция ПЭГ или длинноцепочечных полимеров ПЭГ повы-8 023073 шает эффективную молекулярную массу полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, ее применяют, например, с целью предупреждения быстрой фильтрации с образованием мочи. В некоторых вариантах осуществления изобретения остаток лизина в последовательности ANGPTL3 конъюгируют с ПЭГ непосредственно или с помощью линкера. Указанный линкер может представлять собой, например,остаток Glu или ацильный остаток, содержащий тиольную функциональную группу, предназначенную для связи с соответственным образом модифицированной цепью ПЭГ. Альтернативный метод интродукции цепи ПЭГ предусматривает сначала интродукцию остатка Cys на С-конец или на доступные растворителю остатки, такие как замена на остатки Arg или Lys. Затем указанный остаток Cys сайтспецифическим образом присоединяют к цепи ПЭГ, которая содержит, например, малеимидную функцию. Методы включения ПЭГ или длинноцепочечных полимеров ПЭГ хорошо известны в данной области (они описаны, например, у Veronese F. М. и др., Drug Disc. Today 10, 2005, cc. 1451-1458; Greenwald R. В. и др., Adv.Drug Deliv. Rev. 55, 2003, cc. 217-250; Roberts M. J. и др., Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 2002, cc. 459-476, содержание публикаций включено в настоящее описание в качестве ссылки). Другие методы конъюгации полимеров известны в данной области, и их можно также применять согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения интродуцируют поли(2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин (ПМФХ в качестве полимера, конъюгированного с белками ANGPTL3, предлагаемыми в изобретении (см., например, WO 2008/098930; Lewis и др., Bioconjug Chem., 19, 2008, cc. 2144-2155). В некоторых вариантах осуществления изобретения согласно настоящему изобретению можно применять содержащий фосфорилхолиновый полимер конъюгат с белками ANGPTL3. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что можно применять конъюгаты с другими биосовместимыми полимерами. С учетом результатов более современных исследований для полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять альтернативный подход для включения ПЭГ или полимеров ПЭГ посредством включения "ненатуральных" аминокислот (которые описаны выше). Этот подход основан на применении пары развернутая тРНК/тРНК-синтетаза и ее кодировании в экспрессионной плазмиде с использованием супрессорного амбер-кодона (Deiters А. и др., Bio-org. Med. Chem. Lett. 14, 2004,cc. 5743-5745). Например, пара-азидофенилаланин можно включать в полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, и затем подвергать взаимодействию с полимером ПЭГ, имеющим ацетиленовый остаток, в присутствии восстановителя и ионов меди для облегчения органической реакции, известной как "реакция циклоприсоединения [3+2] по Хьюзгену". Некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения являются специфические мутации белков ANGPTL3, такие как изменение гликозилирования полипептида. Указанные мутации можно выбирать таким образом, чтобы интродуцировать или элиминировать один или несколько сайтов гликозилирования, включая (но не ограничиваясь только ими) О-сцепленные или N-сцепленные сайты гликозилирования. В конкретных вариантах осуществления изобретения белки ANGPTL3, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют сайты и схемы гликозилирования, не измененные относительно встречающихся в естественных условиях белков ANGPTL3. В конкретных вариантах осуществления изобретения вариант белков ANGPTL3 включает вариант гликозилирования, в котором количество и/или тип сайтов гликозилирования изменены относительно встречающихся в естественных условиях белков ANGPTL3. В конкретных вариантах осуществления изобретения вариант полипептида содержит большее или меньше количество N-сцепленных сайтов гликозилирования относительно нативного полипептида. Nсцепленный сайт гликозилирования отличается наличием последовательности: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr,в которой аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности приводит к получению потенциально нового сайта, пригодного для добавления N-сцепленной углеводной цепи. В другом варианте замены, элиминирующие указанную последовательность, должны приводить к удалению существующей N-сцепленной углеводной цепи. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к перестановке N-сцепленных углеводных цепей, при которой один или несколько N-сцепленных сайтов гликозилирования (как правило, встречающихся в естественных условиях) элиминируют, а один или несколько новых N-сцепленных сайтов создают. Примерами вариантов белков ANGPTL3 являются затрагивающие цистеин (цистеиновые) варианты, в которых один или несколько остатков цистеина удалены в результате делеции или заменены другой аминокислотой (например, серином) относительно аминокислотной последовательности встречающихся в естественных условиях белков ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно применять цистеиновые варианты, в которых белки ANGPTL3 могут подвергать рефолдингу с образованием биологически активной конформации, как это имеет место после выделения нерастворимых телец включения. В конкретных вариантах осуществления изобретения цистеиновые варианты содержат меньшее количество остатков цистеина, чем нативный полипептид. В конкретных вариантах осуществления изобретения цистеиновые варианты имеют четкое количество остатков цистеина для минимизации взаимодействий, связанных с неспаренными остатками цистеина. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональные варианты или модифицированные формы белков ANGPTL3 включают слитые белки, содержащие белок ANGPTL3, предлагаемый в изобретении, и один или несколько доменов слияния. Хорошо известные примеры доменов слияния включают (но не ограничиваясь только ими) полигистидин, Glu-Glu, глутатион-S-трансферазу (GST),тиоредоксин, белок А, белок G, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), связывающий маннозу белок (МВР) или человеческий сывороточный альбумин. Домен слияния можно выбирать таким образом, чтобы он придавал требуемое свойство. Например, некоторые домены слияния наиболее часто применяют для выделения слитых белков с помощью аффинной хроматографии. Для осуществления аффинной очистки используют матрицы, применяемые в аффинной хроматографии, такие как конъюгированные с глутатионом, амилазой и никелем или кобальтом смолы. Целый ряд таких матриц является доступным в форме "набора", такого как систем для очистки с использованием GST фирмы Pharmacia и система QLAexpress (фирма Qiagen), при использовании которой используют (HIS6) в качестве применяемых для слияния партнеров. В другом варианте домен слияния можно выбирать таким образом, чтобы облегчать определение белков ANGPTL3. Примерами таких применяемых для определения доменов являются различные флуоресцентные белки (например, GFP), а также "эпитопные метки", которые, как правило, представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых существует специфическое антитело. Хорошо известными эпитопными метками, для которых легко доступны специфические моноклональные антитела, являются такие метки, как FLAG, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и с-myc. В некоторых случаях домены слияния имеют сайт расщепления протеазой, такой как фактор Ха или тромбин, в котором можно частично расщеплять слитые белки соответствующей протеазой и тем самым высвобождать из них рекомбинантные белки. Высвободившиеся белки затем можно отделять от слитого домена с помощью последующего хроматографического разделения. В конкретных вариантах осуществления изобретения белок ANGPTL3 сливают с доменом, который стабилизирует белокANGPTL3 in vivo (домен-"стабилизатор"). Понятие "стабилизирующая" относится к субстанции, которая удлиняет время полужизни в сыворотке, вне зависимости от того, происходит ли снижение расщепления,снижение клиренса почкой или другое фармакокинетическое действие. Слияния с Fc-фрагментом иммуноглобулина, как известно, придает требуемые фармакокинетические свойства широкому спектру белков. Аналогично этому, слияние с человеческим сывороточным альбумином может придавать требуемые свойства. Другие типы доменов слияния, которые можно применять, включают домены мультимеризации (например, димеризации, тетрамеризации) и функциональные домены (которые придают при необходимости дополнительную биологическую функцию).III. Симптомы связанных с ангиопоэтинподобными белками 3 заболеваний Подразумевается, что полипептиды, композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения или предупреждения артритов любого типа или поражений суставов. Кроме того, подразумевается, что полипептиды, композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения или предупреждения различных нарушений хрящей. В некоторых вариантах осуществления изобретения белки, предлагаемые в изобретении, вводят с целью предупреждения артрита или поражения суставов, например, при наличии в генетическом или семейном анамнезе артрита или повреждения суставов или перед или в процессе операции на суставах. Примерами состояний или нарушений, подлежащих лечению с использованием полипептидов, композиций и способов,предлагаемых в изобретении, являются (но не ограничиваясь только ими) системная красная волчанка,ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, остеоартрит, дегенеративное заболевание (межпозвонкового) диска, спондилоартропатии, системный склероз (склеродерма), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз,аутоиммунная гемолитическая анемия (иммунная панцитопения, пароксизмальная ночная гемоглобинурия), аутоиммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, опосредуемая иммунной системой тромбоцитопения), тиреоидит (болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, опосредуемая иммунной системой болезнь почек (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие болезни центральной и периферической нервных систем, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полинейропатия или синдром Гийена-Барре, и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, заболевания гепатобилиарной системы, такие как инфекционный гепатит(гепатит А, В, С, D, Е и другие вызываемые не гепатотропным вирусом гепатиты), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, гранулематозный гепатит, и склерозирующий холангит, воспалительное заболевание кишечника (неспецифический язвенный колит: болезнь Крона), глютен-чувствительная энтеропатия и болезнь Виппла, аутоиммунные и опосредуемые иммунной системой кожные болезни, такие как буллезные болезни кожи, мультиформная эритема и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая гиперчувствительность и крапивница, иммунологические заболевания легкого, такие как эозинофильная пневмония, идиопатический легочный фиброз и гиперчувствительная пневмония, связанные с трансплантацией болезни, такие как отторжение трансплантата и реакция "трансплантат против хозяина". В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, композиции и способы,предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, композиции и способы, предла- 10023073 гаемые в настоящем изобретении, применяют в способе стимуляции пролиферации хондроцитов и образования хряща в хрящевых тканях, которые повреждены в результате травмы или хондропатии. Наиболее важным является лечение тканей, имеющих суставные поверхности, таких как спинной мозг, плечо,локоть, запястье, суставы пальцев, бедро, колено, голеностоп и суставы стопы. Примерами болезней, на которые может оказывать благоприятное воздействие лечение, включают остеоартрит, ревматоидный артрит, другие аутоиммунные заболевания или рассекающий остеохондрит. Кроме того, пороки развития хряща часто проявляются у людей в форме карликовости, это позволяет предположить, что полипептиды, композиции и способы могут оказывать благоприятное воздействие на таких пациентов. Подразумевается, что полипептиды, композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения млекопитающих. В контексте настоящего описания понятие "млекопитающее" включает любое млекопитающее, относящее к этому классу, в том числе человека, домашних и сельскохозяйственных животных, а также находящихся в зоопарке, применяемых для спорта или комнатных животных, таких как крупный рогатый скот (например, коровы), лошади, собаки, овцы, свиньи,кролики, козы, кошки и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, предлагаемые в изобретении,могут быть гетерологичными относительно подлежащего лечению млекопитающего. Например, бычий белок ANGPTL3 или его фрагменты, белок или пептид, выведенный из бычьего белка ANGPTL3 (например, модифицированный бычий белок ANGPTL3, консервативный вариант бычьего белка ANGPTL3,пептидомиметик, выведенный из бычьего белка ANGPTL3), применяют для лечения больного человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичный белок ANGPTL3 можно применять для размножения популяций хондроцитов в культуре с целью трансплантации. В некоторых вариантах осуществления изобретения размноженные культуры можно затем смешивать с полипептидами и композициями, гомологичными млекопитающему, подлежащему лечению, и помещать в область сустава или непосредственно в пораженный хрящ. В альтернативном варианте полипептиды, предлагаемые в изобретении, полученные из тех же самых видов, т.е. человеческого белка ANGPTL3 или его фрагментов, белка или пептида, выведенного из человеческого белка ANGPTL3 (например, модифицированного человеческого белка ANGPTL3, консервативного варианта человеческого белка ANGPTL3, пептидомиметика,выведенного из человеческого белка ANGPTL3), применяют для лечения больного человека. При использовании белка, выведенного из тех же видов млекопитающих, что и млекопитающие, которые подлежат лечению, можно избегать нецелевых (случайных) иммунных ответов. Полипептиды и композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять путем непосредственной инъекции в синовиальную жидкость сустава, системного введения (орально или внутривенно) или непосредственно в пораженный хрящ либо индивидуально, либо в комплексе с приемлемым носителем для пролонгированного высвобождения белка. Полипептиды, композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также для размножения популяций хондроцитов в культуре с целью трансплантации аутогенных или аллогенных хондроцитов. Трансплантацию необязательно можно сочетать с сопутствующим введением полипептидов и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении. При осуществлении этих процедур, например, хондроциты можно собирать путем артроскопии из неповрежденной небольшой воспринимающей нагрузку области поврежденного сустава и их можно культивировать в присутствии полипептидов и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, с целью увеличения количества клеток перед трансплантацией. Затем размноженные культуры можно смешивать с полипептидами и композициями, предлагаемыми в настоящем изобретении, и помещать в область сустава или непосредственно в область повреждения. Полипептиды и композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с периостеальными или перихондриальными трансплантатами, содержащими клетки, которые могут образовывать хрящ и/или помогать удерживать трансплантированные хондроциты или их клетки-предшественники в требуемой области. Полипептиды и композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для репарации повреждения хряща в сочетании с лаважем сустава, стимуляцией костного мозга абразивной артропластикой, сверлением субхондральной кости или микропереломом субхондральной кости. Кроме того, после выращивания хряща в результате введения полипептидов и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, может требоваться дополнительное хирургическое вмешательство для придания соответствующего контура вновь образовавшейся хрящевой поверхности.IV. Фармацевтические композиции Доза соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, предназначенная для лечения вышеуказанных заболеваний или нарушений, варьируется в зависимости от пути введения, возраста и веса тела индивидуума и состояния подлежащего лечению индивидуума, и в конечном счете ее выбор осуществляет лечащий врач или ветеринар. Указанное количество соединения, определяемое лечащим врачом или ветеринаром, обозначают в контексте настоящего описания как "эффективное количество". Предназначенные для введения препаративные формы содержат эксципиент, такой как (но не ограничиваясь только ими) водные и неводные растворы, изотонические стерильные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, кото- 11023073 рые придают препаративной форме изотоничность, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. В контексте настоящего изобретения доза, вводимая пациенту, должна быть достаточной для того,чтобы в течение определенного периода времени вызывать у пациента положительную реакцию. Доза должна зависеть от эффективности конкретного применяемого белка и состояния пациента, а также от веса тела или площади подлежащей обработки поверхности. Размер дозы должен также зависеть от наличия, природы и степени любых побочных воздействий, которыми сопровождается введение конкретного белка или вектора конкретному пациенту. Введение можно осуществлять с использованием одной дозы или разделенных доз.V. Методы введения Можно использовать любой метод введения белков, предлагаемых в изобретении, в пораженный сустав. При воплощении на практике настоящего изобретения композиции можно вводить, например внутрисуставно (т.е. в сустав), орально, внутривенно. Препаративные формы соединений могут находиться в рассчитанных на одну дозу или на несколько доз запечатанных контейнерах, таких как ампулы и пузырьки. Растворы и суспензии можно приготавливать из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного ранее типа. Белки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно также эффективно применять в сочетании с одним или несколькими дополнительными действующими веществами (например,гиалуроновой кислотой или ее солью) в зависимости от требуемой терапии или действия. Примеры Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения, не ограничивая заявляемый объем изобретения. Пример 1. Широкомасштабный скрининг индукторов хондрогенеза Для идентификации и исследования новой неинвазивной стратегии репарации сустава в случае ОА при создании изобретения был разработан "беспристрастный" широкомасштабный скрининг белков, обладающих способностью избирательно контролировать дифференцировку человеческих мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в хондроциты. Система анализа обладает способностью моделировать резидентные MSC в хряще и идентифицировать медиаторы, которые стимулируют естественный потенциал репарации и повышают регенерацию всего хряща. При создании изобретения была выбрана библиотека уникального секретируемого белка для тестирования с использованием широкомасштабных клеточных скринингов человеческих и мышиных MSC. Этот подход представляет собой стратегию, которая дает возможность быстро идентифицировать неохарактеризованные и нативные белковые лиганды, которые оказывают воздействие на хондрогенез. Для изучения указанных секретируемых белков применяли два подхода: получение кондиционированных сред (СМ) с использованием являющейся продуцентом клеточной линии млекопитающих(НЕК 293 Т) и получение очищенных белков из FreeStyle HEK-F-клеток. В сочетании эти комплементарные подходы позволяют идентифицировать новые мишени при различных вариантах применения. Скрининг белков при MSC-анализе позволил идентифицировать наиболее перспективного ("лидерного") кандидата, представляющего собой ангиопоэтинподобный белок 3, который сокращенно обозначен как ANGPTL3. ANGPTL3 был идентифицирован в двух параллельных, но ортогональных начальных скринингах как СМ, так и очищенных белков. Согласно концепции СМ-скрининга С 3 Н 10t1/2-клетки инкубировали в течение 7 дней после переноса СМ. При оценке с помощью окрашивания альцианом голубым для выявления производства хрящевого матрикса было установлено, что хондрогенез имел место в лунках, содержащих ANGPTL3-75. Независимо от этого ANGPTL3-75 идентифицировали путем скрининга 531 очищенного белка в отношении дифференцировки человеческих MSC в хондроциты. После анализа на стадии начального скрининга ANGPTL3 далее характеризовали с использованием шести вторичных анализов. Эти анализы включали: (1) анализ с использованием монослойной культуры мышиных мезенхимальных клеток C3H10t 1/2, пр этом выявлена: индукция коллагена типа II и экспрессия белка Sox9 (маркеры хондрогенеза), но отсутствие индукции остеокальцина (маркеры остеогенеза);(2) анализ ингибирования индуцированного TNF/онкостатином М (OSM) высвобождения оксида азота(NO) в бычьих хондроцитах; (3) анализ ингибирования индуцированного TNF/OSM высвобождения гликозаминогликана (GAG) в культуре органов бычьего хряща; (4) анализ индукции экспрессии гена хрящевого матрикса (аггрекан) в системе пеллет-культуры человеческих MSC; (5) анализ отсутствия токсичности в отношении первичных человеческих хондроцитов, человеческих синовиальных фибробластов и человеческих MSC; (6) анализ стимуляции человеческих хондроцитов. Мышиный белок ANGPTL3 функционирует в мышиных, человеческих и бычьих типах клеток, и поэтому его выбирали для дополнительной характеризации, поскольку он эффективно (0,5-5 нМ) индуцировал хондрогенную дифференцировку, хотя для человеческого гомолога обнаружена эффективность в отношении хондрогенеза, сходная с эффективностью других известных ранее индукторов хондрогенеза в основанном на количественной визуализации анализе коллагена типа II (фиг. 1). Дифференцировка и мышиных, и человеческих MSC в монослойной культуре и пеллет-культуре (соответственно) происходила в течение 18-21 дня при обработке 0,5-5 нМ ANGPTL3 и приводила к экспрессии трех специфиче- 12023073 ских для хряща белков: коллагена типа II, Sox9 и аггрекана. При этом оценку осуществляли как путем иммуногистохимического окрашивания, так и количественного определения мРНК с помощью Taqmanзондов (фиг. 2 А). Дополнительные данные, полученные после культивирования мышиных MSC в течение 18 дней, позволяли предположить, что ANGPTL3 ингибирует спонтанную тенденцию к ответу в виде репарации фиброзной ткани благодаря пониженной экспрессии щелочной фосфатазы. Для оценки потенциальной способности предупреждать повреждение ткани осуществляли стимулирование культур бычьих хрящевых органов TNF и онкостатином М (OSM). Высвобождение в результате такой стимуляции гликозаминогликана, индикатора расщепления матрикса, в значительной степени ингибировалось обработкой ANGPTL3 (фиг. 2 Б). Кроме того, обработка первичных человеческих хондроцитов, но не человеческих синовиоцитов приводила к 2-кратному повышению клеточного роста в течение 24 ч (фиг. 2 В), что позволяет предположить наличие специфичности действия в отношении хряща. Белок не обладал также заметными токсическими действиями in vitro (100 мкМ) в отношении жизнеспособности первичных человеческих хондроцитов, синовиальных фибробластов и MSC (данные не представлены). При непосредственном сравнении двух отобранных при создании изобретения кандидатов в клинических исследованиях установлено, что обработка FGF18 в дозе 100 нг/мл или ВМР 7 в дозе 100 нг/мл могла индуцировать хондрогенные узлы, но повышала производство общего матрикса в меньшей степени, чем обработка ANGPTL3. У FGF18 отсутствовала способность повышать окрашивание альцианом голубым Sox9 или коллагена типа II, что свидетельствует об отсутствии специфичности в отношении истинного хрящевого матрикса. ВМР 7 в дозе 100 нг/мл повышал окрашивание альцианом голубым Sox9 или коллагена типа II, но в с меньшей достоверностью при использовании одинаковых концентраций. Пример 2. Экспрессия рекомбинантного полноразмерного ANGPTL3 и мутантного белка и функциональный анализ Предсказанная молекулярная масса мышиного белка ANGPTL3 составляет 51 кДа. Он принадлежит к семейству, состоящему из 7 идентифицированных ангиопоэтинподобных (ANGPTL) белков, которые имеют структурное сходство с ангиопоэтинами, но у которых отсутствует способность связываться сTie2-рецептором и которые имеют другие функции. Они содержат N-концевой "coiled-coil"-домен (CCD) и С-концевой фибриногенподобный домен (FLD). Белки ANGPTL строго регулируются их микроокружением и взаимодействуют с внеклеточным матриксом (ЕСМ), хотя пока детально не изучены ни их точные сайты взаимодействия, ни партнеры. ANGPTL3 секретируется печенью и попадает в системный кровоток. Его контроль осуществляется через печеночные Х-рецепторы (LXR), при этом известно, что индуцируемая LXR гипертриглицеридемия является результатом высвобождения ANGPTL3. Взаимодействия между CCD и ЕСМ через предполагаемый гепаринсвязывающий мотив могут приводить к ингибированию расщепления последовательности пропротеина, распознаваемой конвертазой (R221-R224), аналогично тому, что описано для ANGPTL4. Расщепление приводит к значительному повышению способности CCD ингибировать активность липопротеинлипазы (LPL), тем самым приводя к усилению триглицеридемии (TG). Это представляет собой основную биологическую функцию ANGPTL3, идентифицированную до создания настоящего изобретения. Наличие С-концевого FLD является достаточным для индукции адгезии эндотелиальных клеток и опосредует ангиогенез после непосредственной имплантации в роговицу крыс in vivo. Установлено также, что рекомбинантный ANGPTL3 может связываться с очищенным У 3-интегрином и приводит к усилению передачи сигналов FAK, MAPK и AKT в эндотелиальных клетках. Указанные данные позволяют предположить, что взаимодействие FLD с интегринами опосредует ангиогенез. Экспрессия ANGPTL3 не описана и не обнаружена в исследованиях, проведенных при создании изобретения, при использовании вестерн-блоттинга в человеческих хондроцитах, hMSC или человеческих синовиальных фибробластах, и экспрессия не выявлена в коленных суставах мышей. Кроме того,отсутствуют данные об активности какого-либо его фрагмента в клетках суставов, связанной с указанной новой хондрогенной функцией, которая обнаружена при проведенном при создании изобретения скрининге. При создании изобретения было установлено, что полноразмерный ANGPTL3 является новым медиатором хондрогенеза и защиты хряща. При создании изобретения изучали, какие из доменовANGPTL3 имеют решающее значение для указанной новой хондрогенной функции. Укороченные серииANGPTL3 и полноразмерный белок экспрессировали и очищали с использованием созданной линииHEK-S-клеток, в которой имело место ограниченное и гомогенное гликозилирование, что можно было подробно изучать с помощью биофизических методов. Подходы на основе масс-спектрометрии подтвердили "оккупацию" всех четырех предсказанных сайтов N-сцепленного гликозилирования (N115, N232,N296 и N357, фиг. 3 А). На основе эндогенно процессированных в НЕК-клетках фрагментов был определен сайт протеолитического расщепления между CCD- и FLD-доменом в положении R224. С помощью гель-фильтрации на основе данных об элюции полноразмерного ANGPTL3 определено, что его молекулярная масса составляет 400 кДа, свидетельствующая о том, что он представляет собой тример с гетерогенным гликозилированием. По данным гель-фильтрации и на основе статического рассеяния света установлено, что FLD (241-455), который является мономером, кристаллизовался. Атомную структуруFLD определяли при разрешении 1,8 ангстрема. Установлено, что структура FLD характеризуется наличием коровой бета-складчатой конформации со спиральными сегментами, которые образуют три петли в направлении С-конца, что типично для других гомологов FLD (фиг. 3 Б). Температурные коэффициенты С-концевой области домена выше, чем остальной части структуры, что позволяет предположить высокую степень гибкости в этой области. Сравнение со структурой ANGPTL2/Tie2 (PDB-код: 2GY7) позволяет предположить, что С-концевая область FLD может принимать участие в белок-белковых взаимодействиях. Пять созданных укороченных продуктов оценивали с использованием нескольких анализов хондрогенной активности. Полученные результаты позволяют предположить, что активность не сохраняется,когда присутствует только CCD, но активность сохраняется у FLD. Кроме того, фосфорилированиеSMAD1 повышалось при стимуляции в течение 3 дней только полноразмерным белком или мутантами G или Н, что позволяет предположить активацию каскада передачи сигналов, связанных с проявлением хондрогенной активности. Хотя системное действие белка при его внутрисуставной инъекции уже ограничено дренированием синовиальной жидкости, иногда требуется минимизация системного воздействия. Если имеет место системное действие, то расщепление ANGPTL3 может приводить к высвобождению CCD-домена. Повышенное ингибирование активности LPL с помощью CCD может приводить к изменению уровней TG у пациентов. Результаты, полученные при создании настоящего изобретения, свидетельствуют о возможных клинических преимуществах ANGPTL3. Например, в результате выявления области локализации хондрогенной активности ANGPTL3 можно минимизировать или исключать нежелательные системные действия на метаболизм липидов или ангиогенные свойства. Хондрогенная активность локализована прежде всего на С-конце, то есть специфическое применение этого домена должно снижать регуляциюTG по сравнению с полноразмерной молекулой или N-концом. Поскольку в сыворотке, как правило,присутствует полноразмерный ANGPTL3, можно не ожидать иммуногенности. Дополнительным преимуществом применения С-конца является то, что он расщепляется и представляет собой мономер (29 кДа), а не тримеризованный полноразмерный белок, что, возможно, должно снижать системное время полужизни любого небольшого процента продукта, который может присутствовать в кровотоке, и ограничивать любое потенциальное воздействие, связанное с ангиогенезом. Пример 3. Анализ in vivo ANGPTL3 При создании изобретения осуществляли несколько исследований in vivo полноразмерногоANGPTL3 для определения возможных нежелательных явлений и сохранения внутри сустава. После внутрисуставной (IA) инъекции в левые коленные суставы 8-недельных мышей линии C57BL/10 3,6 мкг полноразмерного ANGPTL3 оценивали иммуногистохимически экспрессию с 24-экспозиций и без экспозиции. Через 24 ч уровни ANGPTL3, более низкие чем выявляемые, сохранялись в синовиальной жидкости, поскольку, как правило, круговорот белков и воды в результате транс-потока синовиальной жидкости в синовиальные лимфатические узлы происходил в течение примерно 2 ч. Результаты продемонстрировали отсутствие эндогенной экспрессии ANGPTL3 в необработанных суставах, но присутствие значительных выявляемых уровней белка в перицеллюлярном матриксе суставного хряща и в мениске даже через 24 ч. Кроме того, in vivo не обнаружено широко распространенной цитококсичности в отношении хондроцитов или повреждения хряща. После серий, состоящих из 3 IA-инъекций в коленные суставы крыс (один раз в неделю в течение 3 недель), не обнаружено клинической токсичности (ни опухания сустава, ни изменения походки) или проявления острой воспалительной реакции в суставе крыс. Гистологически не обнаружено повышение синовита или неконтролируемой пролиферации в суставах у пяти подвергнутых инъекции крыс. Также как и в случае мышей ANGPTL3 можно было выявлять в хрящевом матриксе и окружающих хондроцитах. Указанные результаты свидетельствуют о том, что ANGPTL3 сам не вызывает никаких нежелательных воздействий на хрящ и что ANGPTL3 действительно проникает и сохраняется в хряще и мениске in vivo. ОА не является индивидуальным заболеванием, а может рассматриваться как следствие различных этиологических факторов. У человека он часто вызывается аномальным биохимическим стрессом или генетическими или приобретенными аномалиями суставного хряща или кости. Таким образом выбор наиболее пригодной (наилучшей) модели ОА, созданной на мелких животных, является сложным, и несколько моделей требуется применять для определения защитных свойств любой терапии. При создании изобретения осуществляли полное исследование эффективности с использованием модели хронического ОА (описанное у van der Kraan с соавторами исследование, которое основано на индукции коллагеназыVII) и модели острого ОА, созданной с помощью хирургического вмешательства (хирургическая модель) путем рассечения трех основных связок (ACL, MCL и MMTL) в суставе на основе метода, который описан у Glasson с соавторами. При применении обеих моделей происходила индукция патологических изменений, как правило, ассоциированных с ОА, таких как: снижение окрашивания протеогликана, эрозия хряща и кости, образование остеофитов и метапластические изменения в синовиальной оболочке и связках, которые можно выявлять через 4-8 недель после инициации ОА. На фиг. 5 представлены данные о регенеративной способности ANGPTL3, полученные с помощью хирургической модели ОА. При использовании хирургической модели для проведения исследования потенциальных биомаркеров ОА по- 14023073 лучали образцы периферической крови с целью оценки фрагментов коллагена типа II, высвободившихся в результате повреждения хряща (фиг. 5 А). Гистологический анализ и последующая балльная оценка медиального тибиального плато подтвердили регенерацию хрящевого матрикса после введения 200 нгANGTPL3/колено один раз в неделю в течение 3 недель (фиг. 5 Б). С использованием подгруппы мышей, на которых создавали в течение 8 недель хирургическую модель ОА, оценивали способность трех доз ANGPTL3 облегчать индуцируемую ОА боль с использованием теста на "работоспособность" лап. Этот метод предусматривает оценку распределения веса между подвергнутыми хирургическому вмешательству и не подвергнутыми хирургическому вмешательству лапами. В день 36 после хирургического вмешательства и через 3 недели после еженедельных обработокPRO1, при применении дозы 100 нг/колено обнаружено значительное улучшение по сравнению с обработанными наполнителем подвергнутыми хирургическому вмешательству коленями (фиг. 5 В). При обобщении указанных данных получено четкое доказательство эффективности ANGTPL3 in vivo при использовании двух моделей ОА (как коррекция патологии, так и снижение боли) и подтвержден успех его разработки в качестве нового терапевтического средства при ОА. Хотя изобретение описано выше с помощью примеров и вариантов его осуществления, приведенными только с целью его иллюстрации, специалисту в данной области в свете изложенного должно быть очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения или модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, полностью и для все целей включены в него в качестве ссылок.