Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение

Номер патента: 22201

Опубликовано: 30.11.2015

Авторы: Макдонах Шарлотт, Фельдхаус Майкл, Хухалов Александра

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Агент, способный связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащий линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (HSA), включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, и содержащий первый связывающий элемент, связанный с аминоконцом HSA линкера, и второй связывающий элемент, связанный с карбоксиконцом HAS линкера, причем каждый связывающий элемент специфически связывает ErbB2 или ErbB3, где:

i) когда первый связывающий элемент специфически связывает ErbB3, второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2; и

ii) когда первый связывающий элемент специфически связывает ErbB2, второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3.

2. Агент по п.1, где линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

3. Агент по п.1 или 2, дополнительно содержащий полипептидные коннекторы на амино- и/или карбоксиконце HAS линкера, которые ковалентно связывают первый и/или второй элемент с HSA линкером, причем каждый из полипептидных коннекторов содержит от 2 до 20 аминокислотных остатков.

4. Агент по любому из пп.1-3, в котором первый связывающий элемент специфически связывает ErbB2 и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3.

5. Агент по любому из пп.1-3, в котором первый связывающий элемент специфически связывает ErbB3 и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2.

6. Агент по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что первый или второй связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела Fv.

7. Агент по п.6, отличающийся тем, что молекула одноцепочечного антитела Fv является молекулой человеческого или гуманизированного антитела.

8. Агент по п.5, в котором первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD от 1 до 50 нм.

9. Агент по п.5, в котором второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD от 0,01 до 10 нм.

10. Агент по п.8, где KD составляет около 16 нм.

11. Агент по п.9, где KD составляет около 0,3 нм.

12. Агент по п.6, где первый связывающий элемент специфически связывает ErbB2 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32, и где второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31.

13. Агент по п.6, где первый связывающий элемент специфически связывает ErbB3 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31, и где второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32.

14. Агент по п.13, в котором первый связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 и второй связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.

15. Агент по любому из пп.1-14, период полужизни которого in vivo составляет от 6 ч до 7 дней.

16. Агент по п.15, период полужизни которого in vivo составляет более 8 ч.

17. Агент по любому из пп.1-16, в котором HSA линкер содержит аминокислотные остатки 25-44 и аминокислотные остатки 494-513 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

18. Агент по любому из пп.1-16, в котором HSA линкер содержит аминокислотные остатки 25-70 и аминокислотные остатки 450-513 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

19. Агент по любому из пп.1-16, в котором HSA линкер содержит аминокислотные остатки 15-100 и аминокислотные остатки 400-520 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

20. Агент по любому из пп.1-16, в котором HSA линкер содержит аминокислотные остатки 10-200 и аминокислотные остатки 300-575 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

21. Агент по любому из пп.1-16, в котором HSA линкер содержит аминокислотные остатки 5-250 и аминокислотные остатки 275-580 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

22. Агент по п.1, где HSA линкер содержит сериновый остаток в положении 34 последовательности SEQ ID NO: 1 и глутаминовый остаток в положении 503 последовательности SEQ ID NO: 1.

23. Агент по любому из пп.1-3, где первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD от около 1 до около 50 нм и где второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD от около 0,01 до около 10 нМ.

24. Агент по любому из пп.1-23, где первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD равной около 16 нМ и где второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD равной около 0,3 нМ.

25. Агент по любому из пп.1-24, который является стабильным, сохраняя сравнимую способность связывать как ErbB2, так и ErbB3 до и после инкубации в сыворотке человека при 37°C в течение 120 ч.

26. Набор, включающий агент по любому из пп.1-25 в упаковке с инструкцией по приему агента пациентом.

27. Применение агента по любому из пп.1-25 для лечения млекопитающего, имеющего пролиферативное заболевание, которое ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ErbB2 и ErbB3.

28. Применение по п.27, при котором пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.

29. Применение по любому из пп.27, 28, при котором млекопитающее представляет собой человека.

30. Способ получения агента по любому из пп.1-25, включающий:

(i) обеспечение экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей агент, в бактериальной, дрожжевой или клетке млекопитающего или в ткани, органе или организме млекопитающего, не являющегося человеком; и

(ii) выделение агента.

31. Способ по п.30, где агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит последовательность линкера SEQ ID NO: 1.

32. Способ по п.30, где агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит первый связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32.

33. Фармацевтическая композиция для лечения пролиферативного заболевания, ассоциированного с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ErbB2 и ErbB3, содержащая агент по любому из пп.1-25, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или растворителем.

34. Фармацевтическая композиция по п.33, представляющая собой раствор, содержащий 25 мг/мл агента.

35. Применение фармацевтической композиции по п.33 для лечения человека, имеющего пролиферативное заболевание, которое ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ErbB2 и ErbB3.

36. Применение по п.35, где пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль.

37. Применение по любому из пп.35, 36, где пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.

Текст

Смотреть все

АГЕНТ, СПОСОБНЫЙ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ОПУХОЛЕВОЙ КЛЕТКОЙ, СОДЕРЖАЩИЙ ЛИНКЕР НА ОСНОВЕ HSA, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к агенту, способному связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащему линкер на основе человеческого сывороточного альбумина. Также раскрываются наборы для диагностического и терапевтического применения агента, способы его получения и фармацевтические композиции и применение для лечения пролиферативных заболеваний. Область, к которой относится изобретение Изобретение включает агент, способный связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащий линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (HSA). В одном варианте изобретения HSA линкер включает две аминокислотные замены. Помимо этого, изобретение включает способы получения и применения конъюгатовHSA линкеров. Предпосылки создания изобретения Сывороточные альбумины принадлежат к семейству белков, которое включает альфа-фетопротеин и специфический компонент к человеческой группе, также известный как витамин-D-связывающий белок. Сывороточные альбумины представляют собой основные растворимые белки системы кровообращения (сердечно-сосудистой системы) и участвуют во многих жизненно важных физиологических процессах. Сывороточный альбумин обычно составляет около 50% массы сухого вещества всех компонентов крови. Альбумины и родственные им белки крови также играют важную роль в транспорте, распределении и метаболизме многих эндогенных и экзогенных лигандов в человеческом организме, включая множество разнообразных химических молекул, таких как жирные кислоты, аминокислоты, стероиды,кальций, металлы, такие как медь и цинк, и различные фармацевтические агенты. Полагают, что молекулы семейства альбуминов содействуют переносу многих из этих лигандов через поверхности раздела между органом, таким как печень, кишечник, почки и мозг, и сердечно-сосудистой системой. Таким образом, альбумины задействованы в широком диапазоне функций сердечно-сосудистой системы и метаболических функций. Человеческий сывороточный альбумин (HSA) представляет собой белок массой около 66500 кДа и содержит 585 аминокислот, включающих по меньшей мере 17 дисульфидных мостиков. Так же как многие члены семейства альбуминов, человеческий сывороточный альбумин играет важную роль в физиологии человека и локализуется практически во всех человеческих тканях и выделениях организма. Как указано выше, HSA способен связывать и переносить широкий спектр лигандов по всей сердечнососудистой системе, включая длинноцепочечные жирные кислоты, которые в противном случае были бы нерастворимы в циркулирующей плазме. Сущность изобретения Изобретение относится к агенту, способному связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащему линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (HSA), включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1 и содержащую первый связывающий элемент, связанный с аминоконцом HSA линкера, и второй связывающий элемент, связанный с карбоксиконцом HAS линкера, причем каждый из первого и второго связывающих элементов специфически связывает ErbB2 или ErbB3 и когда i) первый связывающий элемент специфически связывает ErbB3,второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2; и ii) первый связывающий элемент специфически связывает ErbB2, второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3. В другом варианте осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления агент дополнительно содержит полипептидные коннекторы на амино- и/или карбоксиконце HAS линкера, которые ковалентно связывают первый и/или второй элемент с HSA линкером, причем каждый из полипептидных коннекторов содержит от 2 до 20 аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент специфически связываетErbB2 и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3. В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент специфически связываетErbB3 и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2. В другом варианте осуществления первый или второй связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела Fv. В другом варианте осуществления молекула одноцепочечного антитела Fv является молекулой человеческого или гуманизированного антитела. В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD от 1 до 50 нм. В другом варианте осуществления в агенте второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD от 0,01 до 10 нм. В другом варианте осуществления KD составляет около 16 нм. В другом варианте осуществления KD составляет около 0,3 нм. В другом варианте осуществления первый связывающий элемент специфически связывает ErbB2 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32, и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB3 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31. В другом варианте осуществления первый связывающий элемент специфически связывает ErbB3 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент специфически связывает ErbB2 и представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32. В другом варианте осуществления первый связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 и второй связывающий элемент имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 27. В другом варианте осуществления период полужизни in vivo составляет от 6 ч до 7 дней. В другом варианте осуществления период полужизни in vivo составляет более 8 ч. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит аминокислотные остатки 25-44 и аминокислотные остатки 494-513 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит аминокислотные остатки 25-70 и аминокислотные остатки 450-513 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит аминокислотные остатки 15-100 и аминокислотные остатки 400-520 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит аминокислотные остатки 10-200 и аминокислотные остатки 300-575 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит аминокислотные остатки 5-250 и аминокислотные остатки 275-580 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления HSA линкер содержит сериновый остаток в положении 34 последовательности SEQ ID NO: 1 и глутаминовый остаток в положении 503 последовательностиSEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD от около 1 до около 50 нм и второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD от около 0,01 до около 10 нМ. В другом варианте осуществления первый связывающий элемент связывает ErbB3 с KD равной около 16 нМ и второй связывающий элемент связывает ErbB2 с KD равной около 0,3 нМ. В другом варианте осуществления агент является стабильным, сохраняя сравнимую способность связывать как ErbB2, так и ErbB3 до и после инкубации в сыворотке человека при 37C в течение 120 ч. Изобретение также относится к набору, включающему агент в упаковке с инструкцией по приему агента пациентом. Изобретение также относится к применению агента для лечения млекопитающего, имеющего пролиферативное заболевание. В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ErbB2 и ErbB3. В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой меланому,светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга. В другом варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. Изобретение также относится к способу получения агента, включающему стадии:(i) обеспечение экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей агент, в бактериальной, дрожжевой или клетке млекопитающего, или в ткани, органе или организме млекопитающего, не являющегося человеком; и(ii) выделение агента. В другом варианте осуществления агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит последовательность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит первый связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29 или 32. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения пролиферативного заболевания, содержащей агент, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или растворителем. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции в растворе, содержащем 25 мг/мл агента. Изобретение также относится к применению фармацевтической композиции для лечения человека,имеющего пролиферативное заболевание. В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ErbB2 и ErbB3. В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой меланому,светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга. Определения Термин "антитело", употребляемый в данном описании взаимозаменяемо, включает полные антитела или иммуноглобулины и любой их антигенсвязывающий фрагмент или их одиночные цепи. Антитела по данному описанию могут представлять собой выделенные антитела млекопитающего (например, человека или мыши), гуманизированные, химерные, рекомбинантные, синтетические или природные антитела. У большинства млекопитающих, включая человека, антитела имеют по меньшей мере две тяжелые(Н) и две легкие (L) цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном описании VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3, и шарнирной области между CH1 и CH2. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном описании VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL, VH и VL области могут далее подразделяться на гипервариабельные области (участки), называемые областями определения комплементарности (CDR), расположенные вперемежку с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR областей, расположенных от амино- к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классического пути системы комплемента. Антитела по настоящему изобретению включают все формы антител и другие белки скаффолда со свойствами, подобными свойствам антител. Например,антитело может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело, химерное антитело или другой белок скаффолда со свойствами, подобными свойствам антител, например фиборонектиновые или анкириновые повторы. Антитело может также представлять собой Fab, F(ab')2, scFv, SMIP, диатело, наноантитело, аптамеры или доменное антитело. Антитело может иметь любой из нижеприведенных изотипов IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgM, IgA (например, IgA1, IgA2 и IgA sec), IgD или IgE. Антитела, которые можно использовать в качестве связывающих элементов по данному описанию, в комбинации с HSA линкером по данному изобретению, включают, но без ограничения, натализумаб, инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб, алемтузумаб, бевацизумаб, даклизумаб, эфализумаб, голимумаб, сертолизумаб, трастузумаб, абатацепт, этанерцепт, пертузумаб, цетуксимаб и панитумумаб. Термин "фрагмент антител" по данному описанию относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ErbB2). Антигенсвязывающую функцию антитела можно осуществлять, используя фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают, но без ограничения, (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH,CL и CH1 доменов; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) фрагмент Fv, состоящий из VL и VH доменов одной "клешни" (arm, "плеча") антитела; (v) dAb,включающее VH, VL домены; (vi) фрагмент dAb (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989, который состоит из VH домена; (vii) dAb, которое состоит из VH или VL домена; (viii) выделенную гипервариабельную область (CDR); и (ix) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые, необязательно, могут быть связаны синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно связывать, с помощью методов рекомбинантной ДНК, синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой пары VL и VH областей объединяются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см.,например, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883(1988. Эти фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и эти фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, что и интактные антитела. Фрагменты антител можно получать методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Под "аутоиммунным заболеванием" понимают заболевание, при котором вырабатывается ответ иммунной системы на собственные эпитопы или антигены. Примеры аутоиммунных заболеваний включают, но без ограничения, гнездную алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром ЧергаСтрауса, рубцовый пемфигоид, CREST синдром, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дис-3 022201 коидную красную волчанку, смешанную эссенциальную криоглобулинемию, фибромиалгиюфибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA нефропатию, инсулинзависимый диабет, ювенильный артрит, красный плоский лишай (лихен планус), болезнь Меньера, смешанную соединительнотканевую болезнь, рассеянный склероз, обыкновенную пузырчатку, злокачественную анемию, узелковый (нодозный) полиартериит, полихондрит,плюригландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку (SLE), артериит Такаясу, артериит темпоральный/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит (например, хориоретинит Birdshot и саркоидозный увеит), васкулит, витилиго, гранулематоз Вегенера и тяжелую псевдопаралитическую миастению. Под выражением "связывающий элемент" подразумевается любая молекула, которая специфически связывается с целевым эпитопом, антигеном, лигандом или рецептором. Связывающие элементы включают, но без ограничения, антитела (например, моноклональные, поликлональные, рекомбинантные, гуманизированные и химерные антитела), фрагменты антител (например, Fab фрагменты, (Fab')2, scFv антитела, SMIP, диатела, мини-антитела, scFv-Fc, аффитела, наноантитела и доменные антитела), рецепторы, лиганды, аптамеры и другие молекулы, имеющие известного партнера по связыванию. Под термином "биологически активный" понимают, что молекула, включая биологические молекулы, такие как нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды и белки, проявляет физическую или химическую активность по отношению к самой себе или к другой молекуле. Например, "биологически активная" молекула может обладать, например, ферментативной активностью, белок-связывающей активностью (например, взаимодействие антител) или цитотоксической активностью и является "биологически активной". Термин "химерное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которого происходят от (животного) первого вида, а константные области - от второго вида. Химерные антитела можно создавать, например, методами генетической инженерии, используя сегменты генов иммуноглобулинов, относящихся к различным видам (например, мыши и человека). Под "коннектором" или "полипептидным коннектором" понимают аминокислотную последовательность длиной 2-20 остатков, которая связана ковалентной связью с одним из амино- или карбоксиконцов HSA линкера по изобретению или с обоими этими концами или связана ковалентной связью с одним или более остатков HSA линкера (например, с остатком между амино- или карбоксиконцевыми остатками). В предпочтительном варианте изобретения полипептидный коннектор, связанный с аминоконцом HSA линкера, имеет аминокислотную последовательность "AAS" или "AAQ", а коннектор, связанный с карбоксиконцом, имеет аминокислотную последовательность "AAAL" (SEQ ID NO: 5). Выражения "эффективное количество", или "количество, эффективное для", или "терапевтически эффективное количество" означают количество агента по изобретению (например, HSA линкера, связанного с одним или более связывающих элементов или с диагностическим или терапевтическим агентами с коннекторной последовательностью или без нее), достаточное для того, чтобы получить нужный результат, например киллинг раковых клеток, снижение пролиферации опухолевых клеток, уменьшение воспаления в больной ткани или в больном органе или мечение специфической популяции клеток в ткани, органе или организме (например, человека). Предполагается, что выражение "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела или их фрагменты, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области образованы с использованием последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов зародышевой линии, как описано, например, Kabat et al. (Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication, No 91-3242 (1991 Помимо этого, если антитело содержит константную область, константная область также образована с использованием последовательностей генов человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями генов человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайтнаправленным мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). He предполагается, однако, что выражение "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела, в которых CDR последовательности из зародышевой линии млекопитающего другого вида, такого как мышь, привиты к человеческим каркасным последовательностям (т.е. гуманизированное антитело или фрагмент антитела). Термин "гуманизированное антитело" относится к любому антителу или фрагменту антитела, которое(ый) включает вариабельную каркасную область, в основном образованную из человеческого иммуноглобулина или антитела, а гипервариабельные области (например, по меньшей мере одна областьCDR) в основном образованы из иммуноглобулина или антитела нечеловеческого происхождения. Выражение по данному описанию "ингибитор передачи воспалительного сигнала" или "ISI" означает агент, который ослабляет связывание между провоспалительным цитокином (например, TNF-альфа,TNF-бета или IL-1) и его рецептором (например, TNF рецептором 1 или 2 или IL-1 рецептором соответственно); ослабляет связывание активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекула-4 022201 ми клеточной поверхности (например, CD20, CD25, CTLA-4, CD80/CD86 или CD28) или снижает последующую активацию, или активность, внутриклеточных сигнальных молекул, которые активируются после связывания провоспалительных цитокинов со своими рецепторами, или связывание активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности (например, агент, который снижает активацию, или активность, сигнальных молекул на р 38 MAPK сигнальном пути). Предпочтительно ослабление связывания между провоспалительным цитокином и его рецептором, ослабление связывания активирующей молекулы с провоспалительной сигнальной молекулой клеточной поверхности или уменьшение внутриклеточной передачи сигнала, которое происходит после связывания провоспалительных цитокинов со своими рецепторами или активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности, выражаются величиной по меньшей мере примерно 10%, предпочтительно 20, 30, 40 или 50%, более предпочтительно 60, 70, 80, 90% или более(вплоть до 100%). ISI может снижать количество провоспалительного цитокина (например, TNF-альфа,TNF-бета или IL-1), легкодоступного для связывания рецептора. Например, ISI может представлять собой растворимый белок рецептора провоспалительного цитокина (например, растворимый слитый белокTNF рецептора, такой как этанерцепт (ENBREL) или ленерцепт), или растворимую провоспалительную сигнальную молекулу клеточной поверхности (например, растворимый CTLA-4 (абатацепт, или антитело, специфическое к провоспалительному цитокину или к провоспалительной сигнальной молекуле клеточной поверхности (например, антитело к TNF, такое как адалимумаб, цертолизумаб, инфликсимаб или голимумаб; антитело к CD20, такое как ритуксимаб; или TRU-015 (TRUBION. Помимо этого, TSI может нарушать способность эндогенного дикого типа провоспалительного цитокина или провоспалительной сигнальной молекулы клеточной поверхности связываться со своим рецептором (например, TNF рецептором 1 или 2, IL-1 рецептором или CD11a (например, эфализумаб (RAPTIVA, Genentech. Примерами доминантно-негативных TNF-альфа вариантов являются XENP345 (пегилированная версияTNF варианта A145R/I97T) и XproTM1595 и другие варианты, раскрываемые в опубликованных патентных заявках США 20030166559 и 20050265962, вводимых в данное описание в качестве ссылки. Примером доминантно-негативного IL-1 варианта является анакинра (KINERET), представляющая собой растворимую форму IL-1, которая связывается с IL-1 рецептором, не вызывая активации внутриклеточных сигнальных путей. Ингибиторами передачи воспалительного сигнала, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются также низкомолекулярные соединения, которые ингибируют или нарушают (уменьшают активность) сигнальные пути, следующие за провоспалительными цитокинами или провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности (например, DE 096). Примеры ISI такого типа включают ингибиторы р 38 MAP киназы, например производные 5-амино-2 карбонилтиофена (описанные в международной патентной заявке WO 04/089929, вводимой в данное описание в качестве ссылки), ARRY-797, BIRB 796 BS, (1-5-трет-бутил-2-п-толил-2 Н-пиразол-3-ил)-3-[42-(морфолин-4-илэтокси)нафталин-1-ил]мочевина), CHR-3620, CNI-1493, FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical, Osaka, Japan), ISIS 101757 (Isis Pharmaceuticals), ML3404, NPC31145, PD169316, PHZ1112,RJW67657,(4-(4-(4-фторфенил)-1-(3-фторфенил)-5-(4-пиридинил)-1 Н-имидазол-2-ил)-3-бутин-1-ол,SCIO-469, SB202190, SB203580, (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)-1Hимидазол),SB239063,транс-1-(4-гидроксициклогексил)-4-(4-фторфенилметоксипиримидин-4 ил)имидазол, SB242235, SD-282, SKF-86002, TAK 715, VX702 и VX745. Помимо этого, ISI может препятствовать переходу (процессированию) провоспалительного цитокина (например, TNF-альфа иTNF-бета) из его мембраносвязанной формы в растворимую форму. Ингибиторы ТАСЕ являются ISI этого класса. Примеры ингибиторов ТАСЕ включают ВВ-1101, ВВ-3103, BMS-561392, бутинилоксифенилTAPI-1, TAPI-2 и TMI 005. Другие примеры ISI включают короткие пептиды, выделенные из белков теплового шока E.coli, созданных для специфической по отношению к заболеванию иммуномодулирующей активности (например, пептид dnaJP1). Под "агонистом интегрина" подразумевается любой агент, который снижает или ингибирует биологическую активность молекулы интегрина (например, снижает или ингибирует по меньшей мере на 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более по сравнению с биологической активностью в отсутствие антагониста интегрина), такой как 4 субъединица молекулы интегрина. Агент может действовать непосредственно (прямо) или опосредованно (косвенно) на субъединицу 4 интегрина (NCBI, Регистрационный No. P13612; Takada et al., EMBO J. 8: 1361-1368 (1989, ингибируя активность или экспрессию субъединицы 4 интегрина, или может действовать на мишень, с которой связывается интактный интегрин, содержащий 4 субъединицу. Например, антитело или блокирующий пептид, которое(ый) связывается с молекулой клеточной адгезии сосудов 1 (VCAM-1), тем самым предупреждая связывание 41 интегрина с VCAM-1, рассматривается как агонист интегрина для целей настоящего изобретения. Неограничивающие примеры агонистов интегрина, пригодных для применения в настоящем изобретении,могут включать белки, блокирующие пептиды, такие как натализумаб (TYSABRI), и низкомолекулярные ингибиторы. Примеры антагонистов 4 интегрина включают, но без ограничения, натализумаб(Schering-Plough). Другие неограничивающие примеры антагонистов 4 интегрина включают низкомолекулярные соединения, описанные в патентах США 5821231; 5869448; 5936065; 6265572; 6288267; 6365619; 6423728; 6426348; 6458844; 6479666; 6482849; 6596752; 6667331; 6668527; 6685617; 6903128 и 7015216(каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки); в опубликованных патентных заявках США 2002/0049236; 2003/0004196; 2003/0018016; 2003/0078249; 2003/0083267; 2003/0100585; 2004/0039040; 2004/0053907; 2004/0087574; 2004/0102496; 2004/0132809; 2004/0229858; 2006/0014966; 2006/0030553; 2006/0166866; 2006/0166961; 2006/0241132; 2007/0054909 и 2007/0232601 (каждая из них вводится в данное описание в качестве ссылки); в европейских патентахЕР 0842943; ЕР 0842944; ЕР 0842945; ЕР 0903353; и ЕР 0918059; и в опубликованных международных заявках PCTWO 95/15973; WO 96/06108; WO 96/40781; WO 98/04247; WO 98/04913; WO 98/42656; WO 98/53814;WO 02/28830; каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки. Другие примеры антагонистов 4 интегрина включают производные фенилаланина, описанные в патентах США 6197794; 6229011; 6329372; 6388084; 6348463; 6362204; 6380387; 6445550; 6806365; 6835738; 6855706; 6872719; 6878718; 6911451; 6916933; 7105520; 7153963; 7160874; 7193108; 7250516 и 7291645 (каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки). Производные других аминокислот, являющиеся антагонистами 4 интегрина, включают антагонисты, описанные, например, в опубликованных патентных заявках США 2004/0229859 и 2006/0211630(вводимых в данное описание в качестве ссылки) и в опубликованных международных патентных заявках РСТWO 01/36376; WO 01/47868 и WO 01/70670; все они вводятся в данное описание в качестве ссылок. Другие примеры антагонистов 4 интегрина включают пептиды и пептидные и полупептидные соединения, описанные, например, в опубликованных международных патентных заявках РСТWO 94/15958; WO 95/15973; WO 96/00581; WO 96/06108; WO 96/22966 (трипептид Leu-Asp-Val;Biogen, Inc.); WO 97/02289; WO 97/03094 и WO 97/49731. Другим примером антагониста 4 интегрина является пегилированная молекула, описанная в опубликованной патентной заявке США 2007/066533(вводимой ссылкой в данное описание). Примеры антител, которые представляют собой антагонисты 4 интегрина, включают антитела, описанные, например, в опубликованных международных патентных заявках РСТWO 93/13798; WO 93/15764; WO 94/16094 и WO 95/19790. Другие примеры антагонистов 4 интегрина представлены в данном описании. Под термином "интерферон" понимают интерферон млекопитающего (например, человеческий интерферон-альфа, -бета, -гамма или -тау), полипептид или его биологически активный фрагмент, например IFN- (например, IFN1 а (см. патентную заявку США 20070274950, вводимую в данное описание в качестве ссылки во всей полноте), IFN1b, IFN2a (см. международную заявку РСТWO 07/044083, вводимую в данное описание в качестве ссылки во всей полноте), IFN2b),IFN- (описанный в патенте США 7238344, вводимом в данное описание в качестве ссылки во всей полноте; IFN1a (AVONEX и REBIF), описанный в патенте США 6962978, вводимом в данное описание в качестве ссылки во всей полноте, и IFN1b (BETASERON, описанный в патентах США 4588585; 4959314; 4737462 и 4450103; вводимых в данное описание в качестве ссылки во всей полноте, IFN- и IFN- (описанные в патенте США 5738845 и в опубликованных патентных заявках США 20040247565 и 20070243163; вводимых в данное описание в качестве ссылки во всей полноте). Под "конъюгатом HSA линкера" понимают линкерный белок человеческого сывороточного альбумина (HSA) по изобретению в комбинации с одним или более связывающих элементов, полипептидных коннекторов, диагностических агентов или терапевтических агентов. Термин "моноклональное антитело" по данному описанию относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию,являются идентичными, за исключением возможных природных (естественных) мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими,так как являются специфическими к единственному антигенному сайту. Помимо этого, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, включают различные антитела, специфические к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело является специфическим к единственной детерминанте на антигене. Моноклональные антитела можно получать, используя любой метод, принятый в данной области техники, например, такой как метод гибридом, описанный Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), трансгенное животное (например, Lonberg et al., Nature,368(6474): 856-859 (1994, методы рекомбинантной ДНК (например, патент США 4816567) или ис-6 022201 пользование фаговых библиотек антител, библиотек дрожжевых антител или синтетических библиотек скаффолда антител с применением методов, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). Под выражением "фармацевтически приемлемый носитель" понимают носитель, который является физиологически приемлемым для проходящего лечение млекопитающего, в то же время сохраняет терапевтические свойства соединения, с которым он вводится. Примером фармацевтически приемлемого носителя является физиологический солевой раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в руководстве-справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, (18thedition), ed. A. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA, вводимом в данное описание в качестве ссылки. Под термином "пролиферативное заболевание" или "рак" понимают любое состояние, характеризующееся патологическим или неконтролируемым ростом клеток. Примеры пролиферативных заболеваний включают, например, солидные опухоли, такие как саркомы (например, светлоклеточная саркома),карциномы (например, почечно-клеточная карцинома) и лимфомы; опухоли молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого, мезофаринкса (ротоглотки), гипофаринкса, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря, желчного протока, тонкого кишечника, мочевыводящей системы (включая опухоли почки, мочевого пузыря и эпителия мочевых путей), женских половых органов (включая опухоли шейки матки, матки, яичника, хориому и трофобласт при беременности), мужских половых органов (включая опухоли предстательной железы, семенного пузырька и яичек), эндокринных желез (включая опухоли щитовидной железы, надпочечника и гипофиза), кожи (включая ангиому, меланому, саркому костной и мягкой ткани и саркому Калоши), мозга и мягких оболочек мозга (включая астроцитому, нейроастроцитому, спонгиобластому, ретинобластому, неврому, нейробластому и невриному),нервов, глаз, кроветворной системы (включая хлорлейкоз, плазмоцитому и кожную Т-клеточную лимфому/лейкоз) и иммунной системы (включая лимфому, например, ходжкинскую лимфому и неходжкинскую лимфому). Примером пролиферативного заболевания с несолидной опухолью является лейкоз (например, острый лимфобластный лейкоз). Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, полученному, экспрессированному, созданному или выделенному рекомбинантными методами, такому как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трансгенного или трансхромосомного по генам иммуноглобулина (например,генам человеческого иммуноглобулина), или полученной из него гибридомы; (б) антитела, выделенные при использовании клетки-хозяина, трансформированной таким образом, чтобы экспрессировать антитело, например, при использовании трансфектомы; (в) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител (например, содержащие человеческие последовательности антител) с применением фагового дисплея, визуализации библиотек дрожжевых антител и антител с синтетическим каркасом (скаффолдом); и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов (например, генов человеческого иммуноглобулина) с другими ДНК-последовательностями. Под выражением "специфически связывается" понимают предпочтительную ассоциацию связывающего элемента (например, антитела, фрагмента антитела, рецептора, лиганда или низкомолекулярного участка агента по изобретению) с молекулой-мишенью (например, секретированной молекулоймишенью, такой как цитокин, хемокин, гормон, рецептор или лиганд) или с клеткой или тканью, несущей молекулу-мишень (например, антиген клеточной поверхности, такой как рецептор или лиганд), а не с нецелевыми клетками ("клетками-немишенями") или тканями, не несущими молекулу-мишень. Общепризнано, что между связывающим элементом и нецелевой молекулой (молекулой, не являющейся мишенью) (присутствующей индивидуально или в комбинации с клеткой или тканью) может до некоторой степени происходить неспецифическое взаимодействие. Тем не менее, специфическое связывание можно отличить как опосредуемое специфическим распознаванием молекулы-мишени. Специфическое связывание приводит к более прочной ассоциации между связывающим элементом (например, антителом) и,например, клетками, несущими молекулу-мишень (например, антиген), чем между связывающим элементом, и, например, клетками, не содержащими молекулы-мишени. Специфическое связывание обычно вызывает более чем двукратное, предпочтительно более чем пятикратное, более предпочтительно более чем десятикратное и наиболее предпочтительно более чем стократное увеличение количества связывающего элемента, связывающейся (в единицу времени), например, с клеткой или тканью, несущей молекулу-мишень или маркер, по сравнению с клеткой или тканью, не несущей эту молекулу-мишень или маркер. Связывающие элементы связываются с молекулой-мишенью или маркером с константой диссоциации, например, менее чем 10-6 М, более предпочтительно менее чем 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 М и наиболее предпочтительно менее чем 10-13, 10-14 или 10-15 М. Для специфического связывания с белком в таких условиях требуется связывающий элемент, который выбирают в соответствии с его специфичностью к конкретному белку. Для отбора связывающих элементов (например, антител), способных специфически связываться с конкретной молекулой-мишенью, имеются различные форматы. Например, для выбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных к белку, обычно используютсяPublication, New York (1988) описание форматов иммуноанализа и условий, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности. Термин "практическая идентичность" или "практически идентичный", используемый при сравнении полинуклеотидной или полипептидной последовательности с эталонной последовательностью, означает,что при оптимальном выравнивании двух последовательностей полинуклеотидная или полипептидная последовательность является такой же, как эталонная последовательность, или имеет определенное процентное содержание тех же нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующих положениях эталонной последовательности. Например, аминокислотная последовательность,"практически идентичная" эталонной последовательности, имеет процент идентичности с эталонной последовательностью (например, HSA аминокислотной последовательностью, представленной вSEQ ID NO: 1, или ее фрагментом) по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно 65, 70, 75, 80, 85,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высокий процент идентичности (вплоть до 100%) при сравнении и выравнивании по максимальному соответствию по всей длине эталонной последовательности, определяемый с применением алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию, или при выравнивании вручную и визуальном изучении (см. например,NCBI web-сайт). Под "доступным" ("находящимся на поверхности", "экспонированным на поверхности") аминокислотным остатком понимают аминокислотный остаток, находящийся на внешней поверхности складчатой и конформационно корректной третичной структуры HSA полипептида. Такие остатки можно заменять,например, на другие, химически активные, аминокислоты (например, цистеин), чтобы содействовать сайт-специфической конъюгации диагностических или терапевтических агентов. Кроме того, доступные аминокислотные остатки можно заменять таким образом, чтобы способствовать гликозилированию (например, добавляя сериновый, треониновый или аспарагиновый остатки или мотивы гликозилирования) или предотвратить гликозилирование (например удаляя сериновый, треониновый или аспарагиновый остатки или мотивы гликозилирования). Доступные (на поверхности) аминокислотные остатки включают, но без ограничения, треонин в положении 496, серин в положении 58, треонин в положении 76, треонин в положении 79, треонин в положении 83, треонин в положении 125, треонин в положении 236, серин в положении 270, серин в положении 273, серин в положении 304, серин в положении 435, треонин в положении 478, треонин в положении 506 и треонин в положении 508 (нумерация аминокислот дается в соответствии,например,с последовательностьюSEQ ID NO: 1). Другие доступные (экспонированные на поверхности) остатки специалист в данной области техники может идентифицировать, используя HSA кристаллическую структуру (Sugio et al., Crystalstructure of human serum albumin at 2.5resolution", Protein Eng. 12: 439-446 (1999. Термины "молекула-мишень" ("целевая молекула") или "клетка-мишень" означают молекулу (например, белок, эпитоп, антиген, рецептор или лиганд) или клетку, с которой может специфически связываться связывающий элемент (например, антитело) или HSA-конъюгат, который содержит одну или более связывающих элементов (например, HSA линкер, связанный с одним или более антител или фрагментов антител). Молекула-мишень может находиться на внешней стороне клетки-мишени (например,белок клеточной поверхности или секретируемый белок) или внутри клетки-мишени. Предполагается, что термин "лечение" означает уменьшение (ослабление, снижение) (примерно, по меньшей мере на 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или даже 100%) прогрессирования или тяжести заболевания или расстройства у человека (например, аутоиммунного или пролиферативного заболевания) или прогрессирования, тяжести или частоты одного или более симптомов заболевания или расстройства у больного человека. Краткое описание чертежей На фиг. 1 схематически показан типичный конъюгат HSA линкера. Коннектор между аминоконцевым связывающим элементом и HSA линкером имеет последовательность: аланин, аланин и серин. Коннектор между HSA линкером и карбоксиконцевым связывающим элементом имеет последовательность: аланин, аланин, аланин, лейцин (SEQ ID NO: 5). На фиг. 2 изображена диаграмма, показывающая, что В 2 В 3 варианты ингибируютHRG-индуцированный pErbB3 в ZR75-1 раковых клетках молочной железы. На фиг. 3A-D даны графики (кривые), показывающие ингибирование фосфорилированного pErbB3(гомолога вирусного онкогена эритробластомы) в раковых клетках ВТ 474 молочной железы после 24 ч предварительной обработки В 2 В 3 вариантами A5-HSA-B1D2 (фиг. 3 А), H3-HSA-B1D2 (фиг. 3 В),H3-HSA-F5B6H2 (фиг. 3 С) и F4-HSA-F5B6H2 (фиг. 3D). На фиг. 4A-D представлены графики, показывающие ингибирование фосфорилированного AKT в ВТ 474 раковых клетках молочной железы после 24-часовой предварительной обработки В 2 В 3 вариантами A5-HSA-B1D2 (фиг. 4 А), Н 3-HSA-B1D2 (фиг. 4 В), H3-HSA-F5B6H2 (фиг. 4 С) и F4-HSA-F5B6H2(фиг. 4D). На фиг. 5A-D даны графики, показывающие ингибирование фосфорилированного ERK в ВТ 474 раковых клетках молочной железы после 24-часовой предварительной обработки В 2 В 3 вариантами(фиг. 5D). На фиг. 6 представлен график, показывающий, что обработка ВТ 474 раковых клеток В 2 В 3-1 вариантами вызывает блок клеточного цикла в G1 фазе и снижение числа клеток в S фазе. На фиг. 7 представлена гистограмма проточной цитометрии, показывающая, что преинкубация клеток ВТ-474-М 3 с 1 мкМ В 2 В 3-1 в значительной степени блокирует связывание HRG. На фиг. 8A-D представлены графики, показывающие, что В 2 В 3-1 ингибирует фосфорилированиеErbB3 и AKT в В-Т 474-М 3 и ZR75-30 клеточных линиях. Раковые клетки молочной железы линий ВТ-474-М 3 (фиг. 8 А и 8 С) и ZR75-30 (фиг. 8 В и 8D) предварительно обрабатывали титрованием дозы В 2 В 3-1 в течение 24 ч, а затем стимулировали в течение 10 мин с помощью 5 нМ HRG 13 EGF домена. Статус фосфорилирования ErbB3 и AKT изучают затем методом ELISA. На фиг. 9 представлен снимок вестерн-блоттинга, который показывает действие обработки с помощью В 2 В 3-1 на сигнальные белки в ВТ 474 раковых клетках молочной железы. На фиг. 10 представлен снимок вестерн-блоттинга, который показывает иммунопреципитацию обработанных В 2 В 3-1 раковых клеток молочной железы ВТ 474. На фиг. 11 А-С представлены диаграммы и график, показывающие, что обработка ВТ-474 линии клеток с помощью В 2 В 3-1 вызывает блок клеточного цикла в G1 фазе и снижение популяции клеток в S фазе (фиг. 11 А) и ингибирует образование колоний как ВТ-474, так и SKBr3 клеток по сравнению с необработанными клетками (фиг. 11 В). Помимо этого, В 2 В 3-1 ингибирует пролиферацию ВТ-474-М 3 клеток в импедансном анализе клетки (фиг. 11 В). На фиг. 12 представлена диаграмма, показывающая, что В 2 В 3-1 не стимулирует фосфорилированиеErbB3 (фиг. 13 А) и ErbB2 (фиг. 13 В). На фиг. 14 представлен график, показывающий, что авидность связывания В 2 В 3-1 с MALME-3 клетками приводит к заметному повышению кажущейся аффинности связывания по сравнению с ErbB2 только связывающий вариант, SKO-3, и ErbB3 - только связывающий вариант, SKO-2. На фиг. 15 А-С представлены графики, показывающие стабильность В 2 В 3-1 в сыворотке мышей,обезьян циномолгус (Cynomolgus) и человека. 100 нМ В 2 В 3-1 инкубируют в сыворотке мышей(фиг. 15 А), обезьян циномолгус (фиг. 15 В) или человека (фиг. 15 С) при 37C в течение 120 ч. Образцы отбирают через 0, 24, 48, 72, 96 и 120 ч и количественно определяют способность В 2 В 3-1 связывать какErbB2, так и ErbB3 методом ELISA (RLU - относительные световые единицы). На фиг. 16 представлен график, показывающий эффект дозы В 2 В 3-1 на модели ксенотрансплантата ВТ-474-М 3 рака молочной железы. Влияние дозы В 2 В 3-1 на реакцию опухоли оценивают в ВТ-474-М 3 линии опухолевых клеток молочной железы при указанных дозах. HSA дают в дозе 52,5 мг/кг, эквимолярной дозе 90 мг/кг B2B3-1. На фиг. 17 А-Е представлены графики, показывающие, что эффективность В 2 В 3-1 на различных моделях ксенотрансплантата зависит от ErbB2. Показаны модели ксенотрансплантатов: Calu-3 (аденокарцинома легкого человека; фиг. 17 А), SKOV-3 (аденокарцинома яичника человека; фиг.17 В), NCI-N87MDA-МВ-361 (аденокарцинома молочной железы человека; фиг. 17 Е). Мышам вводили 30 мг/кг В 2 В 3-1 каждые 3 дня или HAS контроль в дозе, эквимолярной В 2 В 3-1. На фиг. 18 А, В представлены графики, показывающие, что сверхэкспрессия ErbB2 превращает модель ксенотрансплантата ADRr рака молочной железы из не отвечающей на В 2 В 3-1 в респондра (отвечающую на лечение). ErbB2 сверхэкспрессирует в дикого типа ADRr ксенотрансплантатах (фиг. 18 А) иADRr-Е 2 ксенотрансплантатах (фиг. 18 В) при использовании ретровирусной системы экспрессии. На фиг. 19 А, В представлены графики, показывающие, что активность B2B3-1 позитивно коррелирует с уровнями экспрессии ErbB2 in vitro (фиг. 19 А) и in vivo (фиг. 19 В). На фиг. 20 А, В показано, что обработка с помощью B2B3-1 модифицирует клеточный цикл опухолевых клеток. На фиг. 20 А представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В 2 В 3-1 опухолевых клеток молочной железы ВТ 474-М 3 в течение 6 ч приводит к транслокации ингибитора клеточного цикла p27kip1 в ядро. Для идентификации ядра используется окрашивание раствором Хехста (Hoechst). На фиг. 20 В показан вестерн-блоттинг ВТ-474-М 3 клеток, обработанных В 2 В 3-1 в течение 72 ч, что привело к снижению уровня регулятора клеточного цикла циклина D1. В данном эксперименте в качестве белка для контроля нанесения образца используют цитоскелетный белок винкулин. На фиг. 21 А, В показаны снимки, полученные с помощью электронного микроскопа (электронные микроснимки), показывающие, что обработка ксенотрансплантатов опухолей молочной железы ВТ 474 с помощью В 2 В 3-1 приводит к транслокации р 27kip1 в ядро. Ксенотрансплантаты опухолей молочной железы ВТ 474 обрабатывают с помощью В 2 В 3-1 (фиг. 21 А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой HSA На фиг. 22 А, В представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В 2 В 3-1 приводит к уменьшению содержания маркера пролиферации Ki67 в ВТ 474-М 3 ксенотрансплантате рака молочной железы. Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ 474-М 3 обрабатывают с помощью В 2 В 3-1 (фиг. 22 А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой HSA (фиг. 22 В) каждые 3 дня, всего 4 дозы. На фиг. 23 А, В представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В 2 В 3-1 приводит к снижению плотности сосудов в опухолевых ксенотрансплантатах ВТ 474-М 3 рака молочной железы (определяется снижением интенсивности окрашивания CD31). Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ 474-М 3 обрабатывают с помощью В 2 В 3-1 (фиг. 23 А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой HSA (фиг. 23 В) каждые 3 дня, всего 4 дозы. На фиг. 24 А, В представлены диаграммы, показывающие, что B2B3-1 ингибирует фосфорилирование ErbB3 in vivo. Лизаты отдельных ксенотрансплантатов ВТ-474-М 3 опухолей, обработанные В 2 В 3-1pErbB3 по среднему сигналу бета-тубулина показывает, что опухоли, обработанные В 2 В 3-1, содержат значительно меньше pErbB3, чем опухоли, обработанные HSA (фиг. 24 В). На фиг. 25 А и В представлены кривые (графики), показывающие in vivo активность В 2 В 3-1 ВТ-474-М 3 ксенотрансплантатах с пониженной PTEN активностью. Культивированные ВТ-474-М 3 опухолевые клетки трансфицируют контрольным вектором (фиг. 25 А) или ретровирусным вектором, кодирующим shPTEN (фиг. 25 В), который нокаутирует ген PTEN (активность). Раковые клетки молочной железы ВТ-474-М 3, созданные (генная инженерия) таким образом, чтобы нокаутировать PTEN активность, инъецируют в правый бок мышей, тогда как клетки, трансфицированные контрольным вектором,инъецируют тем же мышам в левый бок. Мышам вводят 30 мг/кг В 2 В 3-1 каждые 3 дня или 10 мг/кг герцептина каждую неделю, a HSA инъецируют в качестве контроля в дозе, эквимолярной дозе В 2 В 3-1. В 2 В 3-1 и герцептин инициируют уменьшение размера опухолей, образованных контрольными раковыми клетками ВТ-474-М 3 молочной железы (фиг. 25 А), тогда как только В 2 В 3-1 (а не герцептин) вызывает уменьшение размера опухолей, образованных раковыми клетками молочной железы ВТ-474-М 3 в отсутствие экспрессии PTEN (фиг. 25 В). На фиг. 26 А, В показано, что В 2 В 3-1 ингибирует фосфорилирование AKT в ксенотрансплантатах ВТ-474-М 3 с пониженной PTEN активностью. Опухоли лизируют после завершения обработки (q3dx11) и тестируют на уровни экспрессии PTEN, pErbB3 и pAKT вестерн-блоттингом (фиг. 26 А). Данные плотности (денситометрию) по интенсивности полос для pAKT, нормализованные по тотальному AKT и тотальному белку, показывают, что В 2 В 3-1 способен ингибировать фосфорилирование этого белка, тогда как герцептин не способен этого делать (фиг. 26 В). На фиг. 27A-D представлены кривые (графики), показывающие фармакокинетические свойства разовых доз: болюсные дозы 5 (фиг. 27 А), 15 (фиг. 27 В), 30 (фиг. 27 С) и 45 (фиг. 27D) мг/кг В 2 В 3-1, вводимые nu/nu мышам. Сывороточные концентрации В 2 В 3-1 сравнимы, как показывают измерения с помощью HSA анализа или ErbB2/ErbB3 анализа, это показывает, что антигенсвязывающая активность В 2 В 3-1 в системе кровообращения сохраняется. На фиг. 28 представлен график, показывающий зависимость доза-экспозиция для болюсных доз В 2 В 3-1, 5, 15, 30 и 45 мг/кг, вводимых "голым" мышам". Повышение дозы вызывает линейное увеличение общей экспозиции с В 2 В 3-1. На фиг. 29 представлен график, показывающий сывороточные концентрации B2B3-1 у обезьян циномолгус, которым каждые три дня вводят 4 дозы по 4 мг/кг (n=2), 20 мг/кг (n=2) и 200 мг/кг (вплоть до 336 ч, n=4, для временных точек 384, 552 и 672 ч, n=2). На фиг. 30 показана экспрессионная плазмида pMP10k4H3-mHSA-B1D2 для экспрессии В 2 В 3-1. На фиг. 31 показана плазмида резистентности к неомицину pSV2-neo. На фиг. 32 показана плазмида резистентности к гигромицину pTK-Hyg. Подробное описание изобретения Данное изобретение включает человеческий сывороточный альбуминовый (HSA) линкер, который при использовании его для получения агента по изобретению (например, связывающего, диагностического или терапевтического агента) имеет, например, повышенный in vivo период полужизни между 6 ч и 7 днями и который не вызывает заметного гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа при введении его in vivo млекопитающему (например, человеку). В одном аспекте изобретение включает мутантный HSA линкер, который имеет две определенные аминокислотные замены (а именно,замены "C34S" и "N503Q", как представлено в SEQ ID NO: 1). В другом аспекте изобретение включаетHSA линкер, связанный с одним или более связывающих элементов (например, антителом, фрагментами антител, рецепторами/лигандами или низкомолекулярными соединениями) для применения в диагностике или терапии млекопитающего (например, человека) in vivo или для применения in vitro в клетках, тканях и органах млекопитающих. В другом аспекте HSA линкер может связываться с одним или более иммуномодулирующих агентов, иммуномодуляторов, цитотоксических или цитостатических агентов, детектируемых меток или радиоактивных агентов для целей диагностики или терапии млекопитающего(или для применения в клетках, тканях и органах млекопитающих). Агент по изобретению, который включает HSA линкер, может, необязательно, смешиваться с одним или более фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов и может быть приготовлен таким образом, чтобы его можно было вводить внутривенно, внутримышечно, перорально, в виде ингаляций, парентерально, интраперитонеально, интраартериально, трансдермально, сублингвально, назально, с помощью суппозиториев, трансбуккально (защечно), в виде липосом, в жировую ткань, в виде глазного препарата, в виде внутриглазного препарата, подкожно, интратекально (подоболочечно), наружно или местно. Агент по изобретению, который включает HSA линкер, может смешиваться или вводиться совместно с одним или более биологически активных агентов (например, биологических или химических агентов, таких как химиотерапевтические и противоопухолевые агенты). В другом аспекте изобретение включает набор, с инструкциями, для конъюгации связывающих элементов (например, антител, фрагментов антител, рецепторов или лигандов), иммуномодуляторов, цитотоксических или цитостатических агентов, детектируемых меток или радиоактивных агентов с HSA линкером по изобретению для получения агентов по изобретению, которые можно использовать для диагностических или терапевтических целей. Мутантный человеческий сывороточный альбуминовый (HSA) линкер. Мутантный HSA линкер по изобретению содержит две аминокислотные мутации, в положениях 34 и 503, по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа HSA, представленной вSEQ ID NO: 3. Цистеиновый остаток в положении 34 (т.е. С 34) может заменяться (мутация в) на любой аминокислотный остаток, отличный от цистеина (например, серин, треонин или аланин). Аналогично,аспарагиновый остаток в положении 503 (т.е. N503) может заменяться на любой аминокислотный остаток, отличный от аспарагина (например, глутамин, серин, гистидин или аланин). В одном варианте изобретения HSA линкер по изобретению имеет аминокислотную последовательность и соответствующую нуклеотидную последовательность, представленные в SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно. Этот мутантныйHSA линкер по изобретению содержит две аминокислотные замены (т.е. замена цистеина на серин в положении аминокислотного остатка 34 ("C34S") и замена аспарагина на глутамин в положении 503 аминокислотного остатка ("N503Q". HSA линкер при связывании с одним или более связывающих элементов (например, с антителами, фрагментами антител (например, одноцепочечными антителами) или другими нацеливающими или биологически активными агентами (например, рецепторами и лигандами сообщает этим конъюгатам и дополнительным также соединенным с ним диагностическим или терапевтическим агентам (например, иммуномодуляторам, цитотоксическим или цитостатическим агентам, детектируемым меткам или радиоактивным агентам) некоторые полезные фармакологические свойства по сравнению с фармакологическими свойствами этих агентов в отсутствие HSA линкера по изобретению. Эти полезные свойства могут включать пониженную иммуногенность (например, пониженную нейтрализацию антителами хозяина конъюгатов линкер-антитело), более легкую детекцию конъюгатов HSA линкера (например, масс-спектроскопией) и повышенный фармакологический период полужизни (например, период полужизни более 6, 8, 12, 24, 36 ч, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней) после введения млекопитающему (например, человеку). Конкретно, замена цистеина на серин в положении аминокислотного остатка 34 приводит к уменьшению окисления и пониженной гетерогенности белка HSA линкера. В HSA дикого типа аспарагин в положении аминокислотного остатка 503 чувствителен к дезаминированию, что, повидимому, уменьшает фармакологический период полужизни. Замена аспарагина на глутамин в аминокислотном положении 503 может повысить фармакологический период полужизни HSA линкера по изобретению и, соответственно, агентов-конъюгатов, которые включают HSA линкер, при введении млекопитающему (например, человеку) или в его клетки, ткани или органы. В других вариантах изобретения мутантный HSA линкер по изобретению включает домен I HSASEQ ID NO: 1), комбинацию доменов I и III HSA или комбинацию домена I или III HSA с доменом IIHSA (SEQ ID NO: 54; остатки 189-385 SEQ ID NO: 1). Например, HSA линкер по изобретению может включать домены I и II, I и III или II и III. Помимо этого, цистеиновый остаток в положении 34 (т.е. С 34) домена I (SEQ ID NO: 53) может быть заменен на любой аминокислотный остаток, отличный от цистеина(например, серин, треонин или аланин). Аналогично, аспарагиновый остаток в положении 503 (т.е. N503) домена III может заменяться на любой аминокислотный остаток, отличный от аспарагина (например,глутамин, серин, гистидин или аланин). Эти HSA линкеры можно вводить в конъюгат HSA линкера по изобретению, который включает один или более элементов из полипептидных коннекторов, связывающих элементов, терапевтических или диагностических агентов, каждый из этих элементов подробнее описан ниже. Полипептидные коннекторы. Чтобы упростить конъюгацию связывающих элементов по данному описанию с HSA линкером по изобретению, короткие (например, длиной 2-20 аминокислот) полипептидные коннекторы, которые могут быть связаны (например, ковалентной связью (например, пептидной связью), ионной связью или за счет гидрофобного взаимодействия, или за счет высокоаффинного белок-белкового связывающего взаимодействия (например, биотин и авидин с амино- или с карбоксиконцом HSA линкера. Эти коннекторы обеспечивают гибкие концы, с которыми могут связываться любые связывающие элементы по данному описанию. Полипептидный коннектор может иметь в длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20 или более аминокислот. В одном варианте изобретения коннектор представляет собой последовательность, например, остатков глицина, аланина, серина, глицина, глутамина, лейцина или валина. Хотя в данном описании конкретно не перечисляется, коннектор по изобретению может представлять собой только остатки глицина, аланина, серина, глутамина, лейцина или валина или он может представлять собой любую комбинацию этих остатков длиной примерно до 20 аминокислот. В предпочтительном варианте изобретения коннектор, связанный с аминоконцом HSA линкера, имеет аминокислотную последовательность "AAS" или "AAQ", а коннектор, связанный с карбоксиконцом, имеет аминокислотную последовательность "AAAL" (SEQ ID NO: 5). Коннектор может быть связан ковалентной связью с амино- или карбоксиконцевым остатком HSA линкера, с аминокислотным остатком внутри HSA линкера или может включаться между одним или более связывающими элементами при их наличии. Получение HSA линкера.HSA линкер по изобретению, который, необязательно, включает пептидные коннекторы, описанные выше, один или более связывающих элементов, описанных ниже, полипептидные детектируемые метки и другие полипептидные терапевтические агенты, можно получать методами рекомбинантной ДНК. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую HSA линкер (и один или более необязательных элементов), можно экспрессировать (например, в плазмиде, вирусном векторе или трансгенно) в бактериальной клетке (например, E.coli), клетке насекомого, дрожжевой клетке или клетке млекопитающего (например, в СНО клетке) либо в ткани, органе или организме млекопитающего (например, трансгенного грызуна, копытного (например, козы) или нечеловеческого примата). После экспрессии HSA линкера в клетке, ткани или органе хозяина опытный специалист может выделить и очистить HSA линкер стандартными методами очистки белков (например, FPLC или аффинной хроматографией). Система экспрессии рекомбинантного белка для получения HSA линкера в комбинации с двумя связывающими элементами показана на фиг. 1.HSA линкер по изобретению, который может включать один или более необязательных элементов,описанных выше, можно получать синтетическими методами. Например, HSA линкер можно получать методами, общепринятыми в пептидном синтезе, такими как твердофазный синтез. Твердофазный синтез включает постадийное добавление аминокислотных остатков к растущей пептидной цепи, которая связана с нерастворимой подложкой или матрицей, такой как полистирол. С-концевой остаток пептида сначала прикрепляют ("заякоривают") к продажной подложке, причем его аминогруппы защищеныN-защитным агентом, таким как трет-бутилоксикарбонильная группа (t-Boc), или флуоренилметоксикарбонильной (Fmoc) группой. Аминозащитную группу удаляют с помощью подходящих агентов для снятия защитных групп, таких как ТФА (TFA) в случае t-Boc или пиперидин для Fmoc, и добавляют следующий аминокислотный остаток (в N-защищенной форме) с конденсирующим агентом, таким как дициклокарбодиимид (DCC). После образования пептидной связи реагенты смывают с подложки. После добавления конечного остатка агент отщепляют от подложки с помощью соответствующего реагента,такого как трифторуксусная кислота (ТФА) или фтористо-водородная кислота (HF). При желании, HSA линкер, который может включать один или более необязательных элементов, описанных выше, можно получать в виде одного, двух, трех или более сегментов, которые затем можно лигировать с образованием целой конструкции HSA линкера. Связывающие элементы HAS линкера.HSA линкер по изобретению можно также получать как конструкцию, которая включает один или более связывающих элементов, таких как антитела, фрагменты антител (по определению в данном описанию, например, одноцепочечный Fv фрагмент (scFv) или рецепторы/лиганды (т.е. белковые или гликопротеиновые лиганды или рецепторы, которые способствуют связыванию конструкции HSA линкера с клеткой-мишенью, тканью-мишенью или органом-мишенью. Связывающие элементы могут быть связаны с HSA линкером (например, ковалентной связью (например, пептидной связью), ионной связью или за счет гидрофобного взаимодействия, или за счет высокоаффинного белок-белкового связывающего взаимодействия (например, биотин и авидин. Как обсуждается выше, HSA линкер по изобретению, который включает один или более полипептидных коннекторов или связывающих элементов, можно получать методами рекомбинантной ДНК или синтетическими методами. С HSA линкером по изобретению может быть связан один или более связывающих элементов. В одном варианте изобретения с HSA линкером связаны два или более связывающих элемента (т.е. элементы, имеющие одинаковую структуру и одинаковую аффинность связывания), один или более (например,в тандеме) из них на амино- и карбоксиконцах, тем самым HSA линкер предусматривает повышенную авидность связывающих элементов к их целевому антигену. Или же два или более различных связывающих элемента (например, антитело, такое как scFv с аффинностями связывания с двумя или более различными молекулами мишенями или scFv с аффинностями связывания с двумя или более различными эпитопами на одной и той же молекуле-мишени) могут связываться с HSA линкером (например, биспецифическим конъюгатом HSA линкера), содействуя тому, что конъюгат HSA линкера может связываться с несколькими целевыми антигенами или эпитопами. В другом варианте изобретения различные виды связывающих элементов также могут связываться с HSA линкером, придавая конъюгату линкера, на- 12022201 пример, две или более различные специфичности связывания или агонистические/антагонистические биологические свойства. Комбинации пар связывающих элементов, применимые для получения биспецифических конъюгатов HSA линкера, раскрываются, например, в опубликованных международных патентных заявках WO 2006/091209 и WO 2005/117973, вводимых в данное описание в качестве ссылок. В других вариантах изобретения с HSA линкером могут связываться более двух связывающих элементов(например, одинаковых или различных связывающих элементов), образуя агент по изобретению. Изобретение включает агент, имеющий, по меньшей мере, первый и второй связывающие элементы, каждый из которых может быть связан либо с амино-, либо с карбоксиконцом HSA линкерного белка, либо с полипептидными коннекторами, по определению в данном описании, находящимися на любом конце или на обоих концах. На фиг. 1 представлен типичный мутантный HSA линкер по изобретению, у которого два связывающих элемента ("плечо 1" и "плечо 2) связаны с мутантными HSA линкером аминоконцевым полипептидным коннектором AAS и карбоксиконцевым полипептидным коннекторомAAAL (SEQ ID NO: 5). Связывающие элементы (например, антитело или scFv) могут быть связаны с другими локусами (например, внутренними аминокислотными остатками HSA линкера), например, ковалентной или ионной связью, например, с применением взаимодействий биотин-авидин. Биотинилирование амино- (например, лизиновых остатков) или сульфгидрильных (например, цистеиновых остатков) боковых цепей аминокислот известно в уровне техники и может быть использовано для присоединения связывающих элементов к HSA линкеру. Связывающие элементы, которые можно включать в конъюгат HSA линкера по изобретению,включают антитела, фрагменты антител, рецепторы и лиганды. Связывающие элементы, связанные сHSA линкером по изобретению, могут быть рекомбинантными (например, человеческими, мышиными,химерными или гуманизированными), синтетическими или природными. Изобретение включает полные антитела, доменные антитела, диатела, биспецифические антитела, фрагменты антител, Fab фрагменты,F(ab')2 молекулы, одноцепочечные Fv (scFv) молекулы, тандемные scFv молекулы, слитые белки антител и аптамеры. Антитела. Антитела по изобретению включают IgG, IgA, IgM, IgD и IgE изотипы. Антитела и фрагменты антител по изобретению, используемые в данном описании, содержат одну или более гипервариабельных областей (CDR) или связывающие пептиды, которые связываются с целевыми белками, гликопротеинами или эпитопами, находящимися на внешней стороне или внутри клетки-мишени. Многие антитела или их фрагменты по данному описанию могут претерпевать некритические (неответственные, неважные) замены, добавления или делеции как в вариабельной, так и в константной областях без утраты специфичности связывания или эффекторных функций или недопустимое снижение аффинности связывания (например, ниже примерно 10-7 М). Обычно антитело или его фрагмент, в которые вводятся такие изменения, показывают практическую идентичность последовательности с последовательностью эталонного антитела или его фрагмента, из которой они получены. Иногда можно выбирать мутантное антитело или его фрагмент с той же специфичностью и повышенной аффинностью по сравнению с эталонным антителом или его фрагментом, из которого они получены. Метод фагового дисплея предоставляет мощный инструмент для селекции таких антител. См., например, e.g., Dower et al.,международная патентная заявка WO 91/17271, McCafferty et al., международная патентная заявкаWO 92/01047 и Huse, международная патентная заявка WO 92/06204, вводимые в данное описание в качестве ссылки.HSA линкер по изобретению может быть также связан с одним или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с целевым антигеном. Фрагменты антитела включают отдельные вариабельные области тяжелых цепей, вариабельные области легких цепей, Fab,Fab', F(ab')2, Fabc и scFv. Фрагменты можно получать ферментативными или химическими методами расщепления интактных иммуноглобулинов. Например, фрагмент F(ab')2 можно получать из молекулыIgG протеолитическим расщеплением пепсином при рН 3,0-3,5 стандартными методами, такими как методы, описанные в практикуме Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPubs., N.Y. (1988). Фрагменты Fab можно получать частичным восстановлением фрагментов F(ab')2 или из целого антитела расщеплением папаином в присутствии восстановителя. Фрагменты можно также получать методами рекомбинантной ДНК. Сегменты нуклеиновых кислот, кодирующих выбранные фрагменты, получают расщеплением полноразмерных кодирующих последовательностей рестриктазами или синтезом de novo. Часто фрагменты экспрессируются в виде слитых белков с оболочечным белком фага. Этот способ экспрессии имеет преимущество благодаря уточнению (сужению) антител по аффинности. Гуманизированные антитела. Помимо этого, изобретение включает гуманизированные антитела в комбинации с HSA линкером по изобретению, причем одна или более областей CDR антитела образованы из последовательности антитела нечеловеческого происхождения и одна или более, но предпочтительно все, CDR специфически связываются с антигеном (например, белком, гликопротеином или с другим подходящим эпитопом). Гуманизированное антитело содержит константные каркасные области практически человеческого антитела (называемого акцепторным антителом), а также в некоторых случаях преобладающую часть вариабельной области человеческого антитела. Включается одна или более областей CDR (целиком или частично, а также отдельные аминокислоты, соседние с одной или более областями CDR) антитела нечеловеческого происхождения, такого как мышиное антитело. Константная(ые) область(и) антитела может(гут) присутствовать или может(гут) отсутствовать. Наиболее вероятно, что замена одной или более областей CDR мышиного антитела на человеческую последовательность каркасного участка вариабельного домена приведет к сохранению корректной пространственной ориентации, если человеческий каркасный участок вариабельной области примет ту же самую конформацию или конформацию, аналогичную конформации мышиного каркасного участка вариабельной области, из которого взяты CDR. Этого достигают, получая человеческие вариабельные домены из человеческих антител, каркасные последовательности которых показывают высокую степень идентичности последовательности и структурной идентичности с последовательностями каркасных участков мышиных вариабельных доменов, из которых образованы CDR. Каркасные участки вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей могут быть образованы из одной и той же или из различных последовательностей человеческих антител. Человеческие последовательности антител могут представлять собой последовательности природных человеческих антител, консенсусные последовательности нескольких человеческих антител или могут являться последовательностями вариабельных доменов человеческой зародышевой линии. См., например, Kettleborough et al., Protein Engineering, 4, 773 (1991), Kolbinger et al.,Protein Engineering, 6, 971(1993). Подходящие последовательности человеческих антител идентифицируют с помощью выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных областей мышиного антитела с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводят отдельно для тяжелой и легкой цепей, но принцип одинаков для каждой цепи. Методы получения химерных и гуманизированных антител и фрагментов антител описаны, например, в патентах США 4816567, 5530101. 5622701, 5800815, 5874540, 5914110, 5928904, 6210670,6677436 и 7067313 и в патентных заявках США 2002/0031508, 2004/0265311 и 2005/0226876. Помимо этого, получение антитела или его фрагментов описано в патентах США 6331415, 6818216 и 7067313. Рецепторы и лиганды. Изобретение включает белковые или гликопротеиновые рецепторы или лиганды, связанные с HSA линкером по изобретению. HSA линкеры, связанные с рецептором или лигандом, можно использовать,например, для специфического нацеливания на секретированный белок, клетку (например, раковую клетку), ткань или орган. Помимо этого, специфическое связывание конъюгата HSA линкер-рецептор или конъюгат с когнатными ("своими") целевыми рецепторами или лигандами может вызвать агонистическую или антагонистическую биологическую активность на пути внутриклеточной или межклеточной передачи сигнала. Как и в случае других связывающих элементов по данному описанию, рецепторы и лиганды или их фрагменты могут соединяться с амино- и/или карбоксиконцом HSA линкера по изобретению или с аминокислотным остатком внутри HSA линкера. Типичные рецепторы и лиганды, которые могут связываться с HSA линкером по изобретению,включают, но без ограничения, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), IGF2R, инсулиноподобный фактор роста (IGF), рецептор фактора мезенхимально-эпителиального перехода (c-met, также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR, фактор роста гепатоцитов (HGF), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), эпидермальный фактор роста (EGF), герегулин, рецептор фактора роста фибробластов (FGFR), рецептор фактора роста тромбоцитов (PDGFR), фактор роста тромбоцитов (PDGF), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), рецептор фактора некроза опухолей (TNFR), фактор некроза опухолей альфа (TNF-), TNF-, рецептор фолата (FOLR), фолат, рецептор трансферрина (TfR), мезотелин, Fc рецептор, c-kit рецептор, c-kit, 4-интегрин, Р-селектин, рецептор-1 сфингозин-1-фосфата (S1PR), рецептор гиалуроната, лейкоцитарный функциональный антиген типа 1 (LFA-1), CD4, CD11, CD18, CD20, CD25,CD27, CD52, CD70, CD80, CD85, CD95 (Fas рецептор), CD106 (молекулу клеточной адгезии сосудов 1(VCAM1), CD166 (активированную молекулу лейкоцитарной клеточной адгезии (ALCAM, CD178 (Fas лиганд), CD253 (TNF-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL, ICOS лиганд, CCR2, CXCR3,CCR5, CXCL12 (фактор стромальных клеток 1 (SDF-1, интерлейкин 1 (IL-1), CTLA-4, рецепторы альфа и бета, MART-1, gp100, MAGE-1, эфриновый (Eph) рецептор, молекулу клеточной адгезии слизистой оболочки-адрессин-1 (MAdCAM-1), карциноэмбриональный антиген (СЕА), LewisY, MUC-1, молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), раковый антиген 125 (СА 125), простат-специфический мембранный антиген (PSMA), TAG-72 антиген и их биологически активные фрагменты. Рецепторы и лиганды можно экспрессировать, выделять или связывать с HSA линкером по изобретению любыми методами, описанными выше, относящимися к антителам или фрагментам антител.HSA линкер по изобретению или конъюгированный с ним любой связывающий элемент (например,антитело, фрагмент антитела, рецептор или лиганд) могут быть связаны с хелатирующим (комплексообразующим) агентом или с детектируемой меткой с образованием диагностического агента по изобретению. Также рассматриваются конъюгаты HSA линкера, которые включают детектируемую метку по данному описанию, а также один или более терапевтических агентов или связывающих элементов по данному описанию.HSA линкер и хелатираующие (комплексообразующие) компоненты могут связываться с образованием конъюгата реакцией свободной аминогруппы остатка треонина HSA линкера с соответствующей функциональной группой хелатирующего вещества, такой как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа. Например, конъюгат может образовываться при введении комплексообразователя этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, EDTA), широко применяемой в координационной химии,функционализованной карбоксильной группой в этиленовой цепи. Синтез производных EDTA такого типа представлен в Arya et al. (Bioconjugate Chemistry, 2, 321 (1991, где описано блокирование каждой из четырех образующих координационные связи карбоксильных групп трет-бутильной группой, тогда как карбоксильный заместитель в этиленовой цепи свободен и может реагировать с аминогруппой пептидного участка агента по изобретению, при этом образуется конъюгат.HSA линкер или конъюгат HSA линкера могут включать металл-хелатирующий компонент, который является пептидным, т.е совместимым с твердофазным пептидным синтезом. В этом случае хелатирующий реагент может связываться с HSA линкером по изобретению таким же, описанным выше, способом, что и этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), или более обычно хелатирующий агент и HSA линкер или конъюгат HSA линкера по изобретению синтезируют in toto, начиная с С-концевого остаткаHSA линкера или конъюгата HSA линкера и кончая N-концевым остатком хелатирующего агента. Помимо этого, HSA линкер или конъюгат HSA линкера может включать связывающую группу, которая служит для связывания HSA линкера по изобретению с хелатирующим агентом, но в то же время не оказывает вредного воздействия на биологические свойства HSA линкера, нацеливающую функцию участка(ов) связывающего(их) элемента (элементов) конъюгата HSA линкера или металлсвязывающую функцию хелатирующего агента. Подходящие связывающие группы включают аминокислотные цепи и алкильные цепи, функционализованные реакционноспособными группами для связывания HSA линкера или конъюгата HSA линкера с хелатирующим агентом. Аминокислотная цепь является предпочтительной связывающей группой, если хелатирующий агент имеет пептидную природу, так что HSA линкер или конъюгат HSA линкера можно синтезировать полностью (in toto) твердофазными методами. Связывающая группа с алкильной цепью может быть включена в HSA линкер или конъюгат HSA линкера реакцией аминогруппы остатка треонина пептидного участка HSA линкера по изобретению с первой функциональной группой в алкильной цепи, такой как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа. Затем хелатирующий агент связывают с алкильной цепью, завершая образование HSA линкера или конъюгата HSA линкера, реакцией второй функциональной группы в алкильной цепи с соответствующей группой в хелатирующем агенте. Вторую функциональную группу в алкильной цепи выбирают из заместителей, которые реагируют с функциональной группой в хелатирующем агенте, но не реагируют с остатком треонина мутантного HSA линкерного белка. Например, если хелатирующий агент включает функциональную группу, такую как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа,второй функциональной группой в алкильной связывающей группе может быть аминогруппа. Понятно,что при образовании HSA линкера или конъюгата HSA линкера может потребоваться защита и депротекция (снятие защитной группы) присутствующих функциональных групп, чтобы избежать образования нежелательных продуктов. Защиту и депротекцию проводят, используя обычные в органическом синтезе защитные группы, реагенты и протоколы. В частности, можно применять описанные выше методы введения (защиты) и снятия (депротекции) защитных групп, используемые в твердофазном синтезе. Альтернативной алкильной цепи химической связывающей группой является полиэтиленгликоль(ПЭГ), функционализованный так же, как описано выше для включения алкильной цепи в HSA линкер или конъюгат HSA линкера. Понятно, что в качестве альтернативы связывающие группы могут сначала связываться с хелатирующим агентом, а затем с HSA линкером или конъюгатом HSA линкера по изобретению. В соответствии с одним аспектом изобретения конъюгаты HSA линкер-хелатирующий агент по изобретению включают применимый для диагностики металл, способный образовывать комплекс. Подходящие металлы включают, например, радионуклиды, такие как технеций и рений, в различных формах(например, 99mTcO3+, 99mTcO2+, ReO3+ и ReO2+). Включение металла в HSA линкер или конъюгат HSA линкера можно осуществлять различными методами, хорошо известными в координационной химии. Если металлом является технеций-99m, для получения комплекса технеция можно применять следующую общую методику. Сначала получают раствор конъюгата HSA линкер-хелатирующий агент, растворяя HSA линкер или конъюгат HSA линкера в водном спирте, таком как этанол. Затем раствор дегазируют с целью удаления кислорода с помощью подходящего реагента, например гидроксида натрия, депротекционируют тиольные группы и нейтрализуют органической кислотой (такой как уксусная кислота(рН 6,0-6,5). На стадии введения метки (мечения) стехиометрический избыток пертехнетата натрия, полученного с применением молибден-технециевого генератора, добавляют к раствору конъюгата с таким количеством восстановителя, такого как хлорид олова, которого достаточно для восстановления технеция, и нагревают. Меченый HSA линкер или конъюгат HSA линкера можно отделить от примесей 99mTcO4- и коллоидного 99mTcO2, хроматографируя, например, с применением картриджа С-18 Sep Pak. В альтернативном методе мечение HSA линкера по изобретению можно осуществлять по обменной реакции хелатирования ("трансхелатирования", "перехелатирования", обменного комплексообразования). Источником технеция является раствор комплекса технеция с лабильными лигандами, способствующими обмену лиганда на выбранный хелатирующий агент. Лиганды, подходящие для обменной реакции хелатирования (трансхелатирования), включают тартрат, цитрат и гептаглюконат. В этом примере предпочтительным восстановителем является дитионат натрия. Понятно, что HSA линкер или конъюгатHSA линкера можно метить описанными выше методами или можно метить сам хелатирующий агент, а затем связывают с HSA линкерным белком по изобретению с образованием конъюгата HSA линкерхелатирующий агент; этот метод называется методом "с предварительно меченым" лигандом. Другой метод введения метки в HSA линкер по изобретению или любой агент, конъюгированный с ним, включает иммобилизацию конъюгата HSA линкер-хелатирующий агент на твердофазной подложке за счет связи, которая расщепляется при образовании координационного комплекса с металлом (при хелатировании металла). Предпочтительно, чтобы комплексообразующий атом серы связывался с подложкой, которая функционализируется S-защитной группой, такой как малеимидная. При введении в качестве метки металла, используемого для диагностики, агент по изобретению, который включает конъюгат HSA линкер-хелатирующий агент, можно применять для обнаружения ткани,у которой повышен риск развития ракового заболевания (например, рака легкого, рака молочной железы,рака толстой кишки или рака предстательной железы), возрастных заболеваний (например, сердечнососудистого заболевания, цереброваскулярных заболеваний или болезни Альцгеймера), заболеваний,вызванных употреблением табака (например, эмфиземы, аневризмы аорты, рака пищевода или плоскоклеточного рака головы и шеи), обычными в диагностике методами. Агент по изобретению, который включает HSA линкер, меченный радионуклидом, таким как технеций-99m, можно вводить млекопитающему, например человеку, внутривенной инъекцией в фармацевтически приемлемом растворе, таком как изотонический солевой раствор, или другими методами по данному описанию. Количество меченого агента по изобретению, требующееся для введения, зависит от профиля распределения выбранного HSA линкера или конъюгата HSA линкера в том смысле, что агент по изобретению, который включает быстровыводимый из организма HSA линкер или конъюгат HSA линкера, можно вводить в более высоких дозах, нежели агент, который включает медленнее выводимый из организма HSA линкер или конъюгатHSA линкера. Разовые (стандартные) дозы, приемлемые для визуализации тканей, составляют примерно 5-40 мКи при массе пациента 70 кг. 3 а in vivo распределением и локализацией агента по изобретению,который включает HSA линкер или конъюгат HSA линкера, можно следить стандартными методами по данному описанию в определенное время после введения, обычно через время 30-180 мин, примерно до 5 дней после введения, в зависимости от скорости аккумуляции в сайте-мишени с учетом скорости клиренса в нецелевой ткани. Для применения в диагностике или терапии HSA линкер по изобретению либо любую молекулу или элемент, конъюгированный с ним, можно также модифицировать или метить. Детектируемые метки,такие как радиоактивные, флуоресцентные или содержащие тяжелые металлы молекулы, могут быть связаны с любыми агентами по изобретению. Предпочтительным является введение в агент одной, двух или нескольких меток. Например, двойное мечение радиоактивным йодом одного или более остатков наряду с дополнительным связыванием, например Y90, с помощью хелатирующей группы, с аминсодержащим сайтом или с реакционноспособным группами, позволяет провести комбинированное мечение. Такое мечение может применяться для специализированных диагностических целей, таких как идентификация широко распределенных в организме небольших масс опухолевых клеток.HSA линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент по изобретению можно также модифицировать, например, галогенированием тирозиновых остатков пептидного компонента. Галогены включают фтор, хлор, бром, йод и астатин. Такие галогенированные агенты можно метить детектируемой меткой, если атом галогена является радиоизотопом, например, таким как 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I или 211At. Галогенированные агенты по изобретению содержат атом галогена, связанный по меньшей мере с одной аминокислотой и предпочтительно с D-Tyr остатками в каждой молекуле. Другие подходящие детектируемые модификации включают связывание других компонентов (например, флуорохрома, такого как флуоресцеин) с лизиновым остатком агента по изобретению или аналога, в частности агента или аналога, имеющего линкер, включающий лизиновые остатки. Радиоизотопы для введения радиоактивной метки в HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент включают любой радиоизотоп, который может быть связан ковалентной связью с остатком пептидного компонента агента по изобретению или его аналога. Радиоизотопы можно также выбирать из радиоизотопов, испускающие при расщеплении бета- или гаммачастицы, любые агенты по изобретению можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали хелатирующие группы, которые, например, могут быть связаны ковалентной связью с лизиновым(и) остатком(амин) HSA линкера или конъюгированного с ним пептидного агента. Хелатирующие группы можно затем модифицировать таким образом, чтобы они содержали несколько радиоизотопов, таких как изотопы галлия, индия, технеция, иттербия, рения или таллия (например, 125I, 67Ga, 111In, 99mTc, 169Yb,186HSA линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно модифицировать присоединением радиоизотопа. Предпочтительными радиоизотопами являются такие радиоизотопы с периодом полураспада, соответствующим биологическому периоду полужизни используемого HSA конъюгата или превышающим этот биологический период полужизни. Более предпочтительно, чтобы радиоизотопом являлся радиоизотоп атома галогена (например, радиоизотоп атома фтора,хлора, брома, йода или астатина), еще более предпочтительно 75Br, 77Br, 76Br, 122I,123I, 124I,125I,129I, 131I или 211At. Агент по изобретению, который включает HSA линкер либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно связывать с радиоактивными металлами и применять при радиографической визуализации или в радиотерапии. Предпочтительные радиоизотопы включают также 99mTc, 51Cr, 67Ga,68Bi. Выбор металла определяется необходимым терапевтическим или диагностическим применением.HSA линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно связывать с металлическим компонентом, получая агент по изобретению, который можно применять в качестве диагностического или терапевтического агента. Детектируемая метка может представлять собой ион тяжелого или редкоземельного металла, такой как Gd3+, Fe3+, Mn3+ или Cr2+. Агент по изобретению,который включает HSA линкер, содержащий связанные с ним ионы парамагнитных (парамагнетиков) или суперпарамагнитных металлов, применимы в качестве диагностических агентов в МРТ. Парамагнетики, которые могут связываться с агентами по изобретению, включают, но без ограничения, хром(III),марганец(II), железо(II), железо(III), кобальт(II), никель(II), медь(II), празеодим(III), неодим(III), самарий(III), гадолиний(III), тербий(III), диспрозий(III), гольмий(III), эрбий(III) и иттербий(III). Хелатирующие группы могут применяться для непрямого связывания детектируемых меток или других молекул с HSA линкером по изобретению или с конъюгированным с ним агентом. Хелатирующие группы могут связывать агенты по изобретению с радиометками, такими как бифункциональный устойчивый хелатирующий агент (комплексообразователь), или с одной или более реакционноспособных концевых или внутренних аминокислотных групп. HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может связываться с помощью изотиоцианатAla или соответствующего неаминокислотного линкера, который предупреждает расщепление (деградацию) по Эдману. Примеры хелатирующих агентов, известных в уровне техники, включают, например, иминокарбоксильные и полиаминополикарбоксильные реакционноспособные группы, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA).HAS линкер по изобретению в процессе рекомбинантной экспрессии можно связывать с пептидной детектируемой меткой или диагностическим агентом. Пептиды и белки, которые можно применять в качестве детектируемой метки с HSA линкером, включают, но без ограничения, флуоресцентные белки,биолюминесцентные белки и эпитопные тэги (метки), все они подробнее обсуждаются ниже. Одну или более этих детектируемых меток можно также включать в HSA линкер по изобретению, который также включает терапевтический, цитотоксический или цитостатический агент. Флуоресцентные белки, или флуорохромы, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP,SEQ ID NO: 47), улучшенный GFP (eGFP), желтый флуоресцентный белок (SEQ ID NO: 48, YFP), циановый (голубой) флуоресцентный белок (SEQ ID NO: 49, CFP) и флуоресцентный белок красныйHSA линкером по изобретению. Флуоресцентные белки можно рекомбинантно экспрессировать в клетке(например, клетке крови, такой как лимфоцит) после трансфекции или трансдукции клетки экспрессирующим вектором, который кодирует нуклеотидную последовательность флуоресцентного белка. После экспозиции флуоресцентного белка при стимулирующей частоте световой волны (свете определенной длины волны) флуоресцентный белок испускает свет низкой, средней или высокой интенсивности, который можно наблюдать под микроскопом или с помощью оптического визуализирующего устройства. Типичные флуоресцентные белки, пригодные для применения в качестве диагностической последовательности в агентах по изобретению, описаны, например, в патентах США 7417131 и 7413874, каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки. Биолюминесцентные белки также можно использовать в качестве детектируемой метки, введенной в HSA линкер по изобретению. Биолюминесцентные белки, такие как люцифераза (например, люцифераза светляков (SEQ ID NO: 51), люцифераза коралла Renilla reniformis (SEQ ID NO: 52) и люцифераза грибов Omphalotus olearius) и экворин (aequorin, белок медуз), испускают свет при химической реакции с субстратом (например, люциферином и коэлентеразином). В одном варианте изобретения вектор, кодирующий ген люциферазы, позволяет in vivo, in vitro или ex vivo детектировать клетки (например, клетки крови, такие как лимфоциты), трансдуцированные или трансфицированные методами по изобретению. Типичные биолюминесцентные белки, применимые в качестве диагностической последовательности по изобретению и методы их применения описаны, например, в патентах США 5292658, 5670356,6171809 и 7183092, каждый из которых вводится в данное описание в качестве ссылки. Эпитопные метки (тэги) представляют собой короткие аминокислотные последовательности, имеющие протяженность, например, 5-20 аминокислотных остатков, которые можно включать в HSA линкер по изобретению в качестве детектируемой метки, чтобы содействовать обнаружению HSA линкера, экспрессированного в клетке, секретированного клеткой или связанного с клеткой-мишенью. Агент по изобретению, который включает эпитопную метку в качестве диагностической последовательности, можно обнаружить посредством его взаимодействия с антителом, фрагментом антитела или другой связывающей молекулой, специфической к эпитопной метке. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эпитопную метку, получают либо клонированием соответствующих участков природных генов, либо синтезом полинуклеотида, который кодирует эпитопную метку. Антитело, фрагмент антитела или другая связывающая молекула, которые связывают эпитопную метку, могут непосредственно включать эпитопную метку (например, флуорохром, радиометку, тяжелый металл или фермент, такой как пероксидаза хрена) или сами служат в качестве мишени для вторичного антитела, фрагмента антитела или другой связывающей молекулы, которая включает такую метку. Типичные эпитопные метки, которые можно использовать в качестве диагностической последовательности, включают c-myc (SEQ ID NO: 33), гемагглютининовую (НА, SEQ ID NO: 34) и гистидиновую метку (His-6, SEQ ID NO: 35). Кроме того,флуоресцентные (например, GFP) и биолюминесцентные белки могут также служить в качестве эпитопных меток, так как антитела, фрагменты антител и другие связывающие молекулы для обнаружения этих белков являются доступными (выпускаются промышленно).In vivo, in vitro или ex vivo обнаружение, визуализацию HSA линкера по изобретению или слежение за HSA линкером по изобретению, который включает диагностическую последовательность (например,флуоресцентный белок, биолюминесцентный белок или эпитопную метку), или обнаружение, визуализацию любой клетки или слежение за любой клеткой, экспрессирующей HSA линкер или связанной с HSA линкером, можно осуществлять с помощью микроскопа, проточного цитометра, люминометра или другого прибора для оптической визуализации, такого как IVIS Imaging System (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA). Терапевтические или цитотоксические агенты, связанные с HSA линкером по изобретению.HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может связываться с любым известным цитотоксическим или терапевтическим элементом с образованием агента по изобретению, который можно вводить для лечении, ингибирования, ослабления или облегчения заболевания. Примеры включают, но без ограничения, противоопухолевые агенты, такие как активицин, акларубицин, акодазола гидрохлорид; акронин; адозелезин; адриамицин; алдеслейкин; алтретамин; амбомицин; аметантрона ацетат; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; бисантрена гидрохлорид; биснафида димезилат; бизелезин; блеомицина сульфат; бреквинар натрия; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калустерон; камптотецин; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицина гидрохлорид; карзелезин; цедефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; комбретестатин А-4; криснатола мезилат; циклдофосфамид; цитарабин; дакарбазин;(MeCCNU),N-(2-хлорэтил)-N'-(диэтил)этилфосфонат-Nнитрозомочевина (фотемустин), стрептозотоцин, диакарбазин (DTIC), митозоломид, темозоломид, тиотепа, митомицин С, AZQ, адозелезин, цисплатин, карбоплатин, ормаплатин, оксалиплатин, Cl-973, DWA 2114R, JM216, JM335, бис-(платина), томудекс, азацитидин, цитарабин, гемцитабин, 6-меркаптопурин, 6 тиогуанин, гипоксантин, тенипозид, 9 аминокамптотецин, топотекан, СРТ-11, доксорубицин; дауномицин; эпирубицин; дарубицин; митоксантрон; лозоксантрон; дактиномицин (актиномицин D); амсакрин; пиразолоакридин; полностью трансретинол; 14-гидроксиретроретинол; полностью транс-ретиноевая кислота; N-(4-гидроксифенил)ретинамид; 13-цис-ретиноевая кислота; 3-метил TTNEB; 9-цис-ретиноевая кислота; флударабин (2-F-ara-AMP) или 2-хлордезоксиаденозин (2-Cda). Другие терапевтические соединения включают, но без ограничения, 20-pi-1,25 дигидроксивитаминD3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфульвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкин; антагонисты ALL-TK; альтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновую кислоту; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; антидорсализующий морфогенетический белок-1; антиандроген, карцинома простаты; антиэстроген; антиэстроген; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколина глицинат; модуляторы генов апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; ara-CDP-DL-PTBA; аргининдеаминазу; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азастерон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимустат; антагонисты BCR/ABL; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные бета-лактамов; бета-алетин; бетакламицин В; бетулиновую кислоту; ингибитор bFGF; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен А; бизелезин; брефлат; блеомицин А 2; блеомицин В 2; бропиримин; будотитан; бутионин сульфоксимина; кальципотриол; кальфостин С; производные камптотецина (например, 10-гидрокси-камптотецин); канарипокс IL-2; капецитабин; карбоксамид-аминотриазол; карбоксамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; ингибитор из хрящевой ткани; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин В; цетрореликс; хлорины; хлорхиноксалина сульфонамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллимустин А; коллимустин В; комбрестатин А 4; аналог комбрестатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина А; курацин А; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабина октосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин В; 2'-дезоксиформицин (DCF); деслорелин; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемин В; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5 азацидин; дигидротаксол, 9-; диоксамицин; дифенилспиромустин; дискодермолид; докозанол; доласетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; экомустин; эдельфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпотилоны (A, R=Н; В, R=Me); эпитилоны; эпирестид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; этопозид; этопозида 4'-фосфат (этопофос); экземестан; фадрозол; фазарабин; фенретидин; филгастим; финастерид; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтородаунорубицина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиния тексафирин; галлия нитрат; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; герегулин; гексаметилен бисацетамид; гомогаррингтонин (ННТ); гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; имидазоакридоны; имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; йоддоксорубицин; ипомеанол 4-; иринотекан; ироплакт; ирсогландин; изобенгазол; изогомогаликондрин В; итасетрон; жасплакинолид; кахалалид F; ламелларина-N триацетат; ланреотид; леинамицин; ленограстин; лентинана сульфат; лептолстатин; летрозол; лейкоз-ингибирующий фактор; лейкоцитарный альфа-интерферон; лейпролид + эстроген + прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; линейный полиаминный аналог; липофильный дисахарид-пептид; липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; ловастатин; локсорибин; луртотекан; лютеция тексафирин; лизофиллин; литические пептиды; майтанзин; манностатин А; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матриксных металлопротеиназ; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефозин; миримостин; mismatched двухцепочечную РНК (с мисматчами); митрацин; митогуазон; митолакол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксин фактор роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостин; моноклональное антитело, человеческий хорионный гонадотропин; монофосфориллипид А+sk клеточной стенки миобактерий; мопидамол; ингибитор гена множественной лекарственной устойчивости; терапию множественным опухолевым супрессором-1; противораковый агент мустин; микапероксид В; экстракт микобактериальных клеточных стенок; мириапорон; N-ацетилдиналин;N-замещенные бензамидины; нафарелин; нагрестип; налоксон + пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нейтральную эндопептидазу; нилутамид; низамицин; модуляторы оксида азота; нитроксидный антиоксидант; нитруллин; 06-бензилгуанин; октреотид, окиценон, олигонуклеотиды, онапристон, ондансетрон, орацин, пероральный индуктор цитокинов,ормаплатин, осатерон. оксалиплатин, оксауномицин, аналоги паклитаксела, производные паклитаксела,палауамин, пальмитоилризоксим, памидроновую кислоту, панакситриол, паномифен, парабацин, пазеллиптин, пегаспаргазу, пелдезин, пентозана полисульфат, натриевую соль, пентостатин, пентрозол, перфлуброн, перфосфамид, периллиловый спирт, феназиномицин, фенилацетат, ингибиторы фосфатаз, пицибанил, пилокарпина гидрохлорид, пирарубицин, плацетин А, плацетин В, ингибитор активатора плазминогена, комлексы платины, соединения платины, комплекс платина-триамин, подофиллотоксин, порфимер натрия, порфиромицин, пропил бис-акридон, простагландин J2, ингибиторы протеасомы, иммуномодулятор на основе белка А, ингибиторы протеинкиназы С, микроалгал, ингибиторы протеинтирозинфосфатазы, ингибиторы пурин-нуклеозидфосфорилазы, пурпурины, пиразолоакридин, конъюгат пиродоксилированного гемоглобина с полиоксиэтиленом, антагонисты raf, ралтитрексед, рамосетрон, ингибиторы ras фарнезилпротеинтрансферазы, ингибиторы ras, ингибитор ras-GAP, деметилированный ретеллиптин, рения Re 186 этидронат, ризоксин, рибозимы, RII ретинамид, роглетимид, рохитукин, ромуртид, роквинимекс, робугинон В 1, робуксил, сафингол, саинтопин, SarCNU, саркофитол А, сарграмостим,миметики Sdi I, семустин, (senescence derived) ингибитор старения 1, смысловые олигонуклеотиды, ингибиторы сигнальной трансдукции, модуляторы сигнальной трансдукции, одноцепочечный антигенсвязывающий белок, сизофиран, собузоксан, борокаптат натрия, фенилацетат натрия, солверол, соматомединсвязывающий белок, сонермин, спарфосовую кислоту, спикамицин D, спиромустин, спленопентин,спонгистатин 1, скваламин, ингибитор стволовых клеток, ингибиторы деления стволовых клеток, стипиамид, ингибиторы стромелизина, сульфонизин, антагонист суперактивного вазоактивного кишечного пептида, сурадисту, сурамин, сваинсонин, синтетические гликозаминогликаны, таллимустин, тамоксифена метйодид, тауромустин, тазаротен, текогалан натрия, тегафур, теллурапирилий, ингибиторы теломераз, темопорфин, темозоломид, тенипозид, тетрахлордекаоксид, тетразомин, талибластин, талидомид,тиокоралин, тромбопоэтин, миметик тромбопоэтина, тималфазин, агонист рецептора тимопоэтина, тимотринан, тиреоид-стимулирующий гормон, этилэтиопурпурин олова, тирапазамин, титаноцендихлорид,топотекан, топсентин, торемифен, фактор тотипотентных стволовых клеток, ингибиторы трансляции,третиноин, триацетилуридин, трицирибин, триметрексат, трипторелин, трописетрон; торустерид; ингибиторы тирозинкиназ; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; фактор, ингибирующий рост урогенитального синуса; антагонисты урокиназных рецепторов; вапреотид; вариолин В; векторную систему,эритроцит-генную терапию; веларезол; верамин; вердины; вертепорфин; винорельбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб и зинастатин стималамер.HSA линкерные агенты по изобретению могут включать также сайт-специфически конъюгированные молекулы и элементы. Сайт-специфическая конъюгация способствует контролируемому стехиометрическому связыванию со специфическими остатками в HSA линкере цитотоксических, иммуномодулирующих или цитостатических агентов, включая, например, тубулинсодержащие агенты, связующие малых бороздок ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты, антрациклины, антибиотики,антифолаты, антиметаболиты, сенсибилизаторы химиотерапии или лучевой терапии, дуокармицины,этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомераз и алкалоиды винка или любые другие молекулы или элементы по данному описанию. Методы конъюгации терапевтических агентов с белками и, в частности, с антителами, общеизвестны (например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", incancer therapy", Nature Biotech. 21: (7) 778-784 (2003. См. также, например, международную опубликованную заявку РСТ WO89/12624.HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с литическим пептидом с образованием агента по изобретению. Такие литические пептиды индуцируют клеточную смерть и включают, но без ограничения, стрептолизин О; стохастический токсин; фаллолизин; альфа-токсин стафилококка; голотурин А; дегитонин; мелиттин; лизоцитин; кардиотоксин; и токсин cerebratulus A (Kem et al., J. Biol. Chem. 253(16): 5752-5757, 1978). Агент по изобретению может образовываться конъюгацией HSA линкера по изобретению либо любой конъюгированной с ним молекулы или элементы (например, конъюгатов антитела или фрагментов антитела) с синтетическим пептидом, который имеет некоторую общую гомологию или некоторые химические характеристики, общие с любыми природными "пептид-лизинами"; такие характеристики включают, но без ограничения, линейность, положительный заряд, амфипатичность и образование альфа-спиральных структур в гидрофобной среде (Leuschner et al., Biology of Reproduction, 73: 860-865, 2005). HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с агентом, который индуцирует комплемент-опосредованный лизис клеток, например, таким как субъединица иммуноглобулина Fc. HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с любым членом семейства ферментов фосфолипаз (включая фосфолипазу А, фосфолипазу В, фосфолипазу С или фосфолипазу D) или с его каталитически активной субъединицей.HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с радиоактивным агентом с образованием агента, который можно использовать для детекции или в терапии. Радиоактивные агенты, которые можно использовать, включают, но без ограничения, фибриноген 125I; флудезоксиглюкозу 18F; флуородопу 18F; инсулин 125I; инсулин 131I; лобенгуан 123HSA линкера. Соответствующие реакционноспособные группы можно использовать для конъюгации с сайт-специфическими бифункциональными хелатирующими агентами для мечения радиоизотопами,включая 123I,124I, 125I, 131I, 99mTc, 111In, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188Re, 177Lu, 90Y, 77As, 72As, 86Y, 89Zr, 211At, 212Bi,213Bi или 225 Ас. Терапевтические или цитотоксические агенты, включенные в HSA линкер или в конъюгат HSA линкера или связанные с ним, могут, помимо этого, включать, например, противораковые дополнительные потенцирующие агенты, включая, но без ограничения, трициклические антидепрессанты (например,имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и мапротилин); нетрициклические антидепрессанты (например, сертралин, тразодон и циталопрам); антагонисты Са 2+ (например, верапамил, нифедипин, нитрендипин и кароверин); ингибиторы кальмодулина (например, прениламин, трифторперазин и кломипрамин); амфотерицин В; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); лекарства против аритмии (например, квинидин); гипотензивные лекарства (например, резерпин); вещества, уменьшающие содержание тиолов (истощающие тиол) (например, бутионин и сульфоксимин); и агенты, снижающие множественную лекарственную устойчивость(резистентность), такие как кремафор EL. Агент по изобретению, который включает HSA линкер или любую конъюгированную с ним молекулу или элемент, можно также связывать или вводить совместно с цитокинами (например, с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, интерфероном-альфа или фактором некроза опухолейальфа). HSA линкер по изобретению или любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно также связывать с антиметаболическим агентом. Антиметаболические агенты включают, но без ограничения, следующие соединения и их производные: азатиоприн, кладрибин, цитарабин, дакарбазин, флударабина фосфат, генцитабина хлоргидрат, меркаптопурин, метотрексат, митобронитол, митотан, прогуанила хлоргидрат, пирометамин, ралтитрексед, триметрексата глюкуронат, уретан, винбластина сульфат,винкристана сульфат и т.д. Более предпочтительно HSA линкер или конъюгат по изобретению может также связываться с антиметаболитом типа фолиевой кислоты, агентами класса, который включает, например, метотрексат, прогуанила хлоргидрат, пириметамин, трометамин или триметрексата глукуронат,или производные этих соединений. HSA линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также быть связана с противоопухолевыми агентами семейства антрацик- 21022201 линов, включая, но без ограничения, акларубицина хлоргидрат, даунорубицина хлоргидрат, доксорубицина хлоргидрат, эпирубицина хлоргидрат, идарубицина хлоргидрат, пирарубицин или зорубицина хлоргидрат, камптотецин или его производные или родственные соединения, такие как 10,11 метилендиоксикамптотецин, или член семейства майтанзиноидов, которое включает ряд родственных по структуре соединений, например, ансамитоцин Р 3, майтанзин, 2'-N-деметилмайтанбутин и майтанбициклинол.HSA линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно также непосредственно связывать с цитотоксическим или терапевтическим агентом общеизвестными химическими методами или связывать опосредованно с цитотоксическим или терапевтическим агентом через непрямое связывание. Например, HSA линкер может связываться с хелатирующей группой, соединенной с цитотоксическим или терапевтическим агентом. Хелатирующие группы включают, но без ограничения, иминокарбоксильные или полиаминополикарбоксильные реакционноспособные группы, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA). Общие методы описаны, например, в Liu et al., Bioconjugate Chem. 12(4): 653, 2001,Cheng et al., международная патентная заявка WO 89/12631, Kieffer et al., международная патентная заявка WO 93/12112, Albert et al., патент США 5753627 и международная патентная заявка WO 91/01144(все они вводятся в данное описание в качестве ссылки). Агент по изобретению, который включает HSA линкер, одну или более связывающих элементов (в присутствии или в отсутствие промежуточных связывающих полипептидных коннекторов по данному описанию) и терапевтический или цитотоксический агент, может быть специфически нацелен с помощью связывающего элемента (например, антитела, фрагмента антитела или рецептора/лиганда) на клетку или ткань, что делает возможной селективная деструкция клетки- или ткани-мишени, на которую нацелен связывающий элемент. Например, агент по изобретению можно использовать, чтобы нацелить на раковую клетку и разрушить раковую клетку легкого, молочной железы, предстательной железы и толстой кишки, чтобы предупредить, стабилизировать, ингибировать прогрессирование или лечить раковые заболевания в этих органах, если агент включает связывающий элемент, который специфически связывается с раковыми клетками в этих органах. Также, например, агенты по изобретению можно использовать,чтобы нацелить на и разрушить клетки сосудистой системы, головного мозга, печени, почки, сердца,предстательной железы, прямой кишки, носоглотки, ротовой части глотки, гортани, бронхов и кожи, с целью предупредить, стабилизировать, ингибировать прогрессирование или лечить возрастные, вызванные курением или аутоиммунные заболевания или состояния, связанные с этими органами, путем нацеливания, в случае аутоиммунного заболевания, на аутореактивные Т-клетки (например, связыванием с рецептором фактора некроза опухолей 2 (TNFR2), присутствующим на аутореактивных Т-клетках или выступая в качестве агониста этого рецептора). При рекомбинантной экспрессии HSA линкер по изобретению может связываться с цитотоксическим полипептидом. Цитотоксические полипептиды при контакте их с клеткой-мишенью (например,раковой клеткой) оказывают на клетку цитотоксический или цитотоксический эффект. Например, цитотоксический полипептид, связанный с HSA линкером по изобретению, при связывании клетки-мишени может индуцировать события в клетке-мишени, которые ведут к клеточной гибели, например, за счет апоптоза, некроза или старения. Или же цитотоксический полипептид, связанный с HSA линкером по изобретению, может препятствовать нормальной клеточной биологической активности или ингибировать нормальную клеточную биологическую активность, такую как деление, метаболизм и рост, или патологическую клеточную биологическую активность, такую как метастаз. Например, HSA линкер по изобретению, связанный с каспазой 3, связывает клетку-мишень (например, раковую клетку) и подвергает эндоцитозу. После интернализации клеткой-мишенью участок каспазы в конъюгате HSA линкера может инициировать проапоптотический каспазный каскад, в конечном счете приводящий к апоптозу клетки-мишени. В предпочтительном варианте изобретения HSA линкер по изобретению включает цитотоксический полипептид, способный убивать раковую клетку (киллинг). В другом варианте изобретения цитотоксический полипептид ингибирует рост или метастаз раковой клетки. Цитотоксический полипептид, связанный с HSA линкером по изобретению, можно использовать также для киллинга или ингибирования роста клеток, ассоциированных с ростом, необходимых для роста или благотворно действующих на рост раковых клеток, таких как эндотелиальные клетки, которые образуют кровеносные сосуды, пронизывающие солидные опухоли. В одном варианте изобретения HSA линкер по изобретению может включать два или более цитотоксических полипептида с тем, чтобы модулировать (например, повысить) специфичность, интенсивность или продолжительность цитотоксического или цитостатического действия на клетку-мишень (например, раковую клетку). В другом варианте изобретения HSA линкер по изобретению связывается с активируемой формой цитотоксического полипептида (например, биологически инактивным проагентом, который способен активироваться при расщеплении ферментом или лекарством). В данном варианте изобретения экспозиция (например, in vivo) цитотоксического полипептидного проагента с ферментом или лекарством, способным расщеплять цитотоксический полипептид, делает цитотоксический полипептид биологически активным (например, цитотоксическим или цитостатическим). Примером биологически инактивного цитотоксического полипептида, который можно превратить в биологически активную форму для применения с HSA линкером по изобретению, является прокаспаза (например, прокаспаза 8 или 3). Например,домен прокаспазы 8 HSA линкера по изобретению можно отщеплять с помощью TRAIL FasL после интернализации клеткой-мишенью (например, раковой клеткой). После отщепления биологически активная каспаза 8 может промотировать апоптоз клетки-мишени. В одном варианте изобретения цитотоксический полипептид, связанный с HSA линкером по изобретению, может включать полноразмерный пептид, полипептид или белок или его биологически активный фрагмент (например, "домен смерти", death domain, DD), заведомо имеющий цитотоксические или цитостатические свойства. Пептиды, полипептиды или белки с цитотоксическими или цитостатическими свойствами, можно изменять (например, с помощью аминокислотных замен, мутаций, усечения (процессирования) или добавления), чтобы способствовать включению цитотоксической последовательности в агент по изобретению. Желательные изменения включают, например, изменения в аминокислотной последовательности, которые способствуют экспрессии белка, продолжительности жизни белка, секреции белка из клетки и токсичности его по отношению к клетке-мишени. Изобретение включает также нуклеотидную молекулу, кодирующую цитотоксический полипептид в виде слитого белка с HSA линкером по изобретению, необязательно включающим связывающие элементы и полипептидные коннекторы. Нуклеотидная молекула по изобретению может быть включена в вектор (например, экспрессирующий вектор) таким образом, что после экспрессии HSA линкера по изобретению в клетке, трансфицированной или трансдуцированной вектором, цитотоксический полипептид, HSA линкер и связывающие элементы, при их наличии, функционально связаны (например, слиты, образуют непрерывную цепь (непрерывно соединены) или связаны друг с другом). Примеры пептидов, полипептидов и белков, которые можно применять в качестве цитотоксических полипептидов по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, апоптоз-индуцирующие белки, такие как цитохром с (SEQ ID NO: 39); каспазы (например, каспаза 3 (SEQ ID NO: 36) и каспаза 8 (SEQ ID NO: 37; прокаспазы, гранзимы (например, гранзимы А и В (SEQ ID NO: 38; члены семейств фактора некроза опухолей (TNF) и рецепторов TNF, включая TNF-альфа (TNF; SEQ ID NO: 40, TNF-бета, Fas (SEQ ID NO: 41) и Fas лиганд; Fasассоциированный DD-подобный IL-1 превращающий фермент (FLICE); TRAIL/APO2L (SEQ ID NO: 45) и TWEAK/APO3L (см., например, опубликованную патентную заявку США 2005/0187177, вводимую в данное описание в качестве ссылки); проапоптотические члены семейства Вс 1-2, включая Вах(SEQ ID NO: 46), Bid, Bik, Bad (SEQ ID NO: 42), Bak и RICK (см., например, опубликованную патентную заявку США 2004/0224389, вводимую в данное описание в качестве ссылки); белки 1 и 2, индуцирующие апоптоз васкулярных клеток (VAP1 и VAP2; Masuda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 278: 197-204 (2000; пиеризин (SEQ ID NO:44; Watanabe et al., Biochemistry 96: 10608-10613 (1999; апоптозиндуцирующий белок (SEQ ID NO: 43; AIP; Murawaka et al., Nature, 8: 298-307 (2001; прополипептид прокомпонента IL-1 (см., например, патент США 6191269, вводимый в данное описание в качестве ссылки); апоптин и апоптин-ассоциированные белки, такие как ААР-1 (см., например, европейскую опубликованную патентную заявкуЕР 1083224, вводимую в данное описание в качестве ссылки); антиангиогенные факторы, такие как эндостатин и ангиостатин; и другие апоптоз-индуцирующие белки,включая такие белки, описанные в следующих международных опубликованных патентных заявках и опубликованных патентных заявках США, каждая из которых вводится в данное описание в качестве ссылки: US 2003/0054994, US 2003/0086919, US 2007/0031423, WO 2004/078112, WO 2007/012430 иWO 2006/0125001 (внеклеточный домен Delta 1 и jagged 1 белков). Конъюгаты дикого типа HSA линкера. Настоящее изобретение охватывает также природный дикого типа HSA линкер, аминокислотная и нуклеотидная последовательности которого представлены в SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно, участвующий в образовании связывающих, диагностических или терапевтических агентов по изобретению. Во всех вариантах изобретения, использующих HSA линкер с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, один или более полипептидных коннекторов, описанных выше, связаны ковалентной связью с амино- и/или карбоксиконцами HSA линкера или с аминокислотным остатком внутри HSA линкерной последовательности с целью содействовать конъюгации одного или более связывающих элементов. Процессирование (усечение). Помимо этого, изобретение включает конъюгат, который образуется при использовании усеченного(процессированного) HSA полипептида, который может быть связан с одним или более пептидных коннекторов или с одним или более связывающими элементами. Дикого типа HSA полипептид, не содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200 или более аминокислот полноразмерной дикого типа HSA аминокислотной последовательности (т.е. SEQ ID NO: 3), можно связывать с любым из связывающих элементов или с любым диагностическим или терапевтическим агентом по данному описанию. Процессирование (усечение) может происходить по одному или по обоим концам HSA линкера или может включать делецию внутренних остатков. Усечение более чем одного аминокислотного остатка необязательно должно быть линейным. Примеры дикого типа HSA линкеров по изобретению включают такие линкеры,имеющие в комбинации с одним (одной) или более полипептидных коннекторов или связывающих элементов один или более доменов, выбранных из домена I (SEQ ID NO: 56; остатки 1-197 последовательности SEQ ID NO: 3), домена II (SEQ ID NO: 54; остатки 189-385 последовательности SEQ ID NO: 3) или домена III (SEQ ID NO: 57; остатки 381-585 последовательности SEQ ID NO: 3) или их комбинации, например домены I и II, I и III и II и III. Сывороточный клиренс конъюгата по изобретению (например, биспецифического HSA-лекарства или радиоизотоп-содержащего агента) можно оптимизировать, тестируя конъюгаты, содержащие усеченный дикого типа HSA линкер, по описанию выше. Дополнительные модификации HSA линкера. Далее изобретение включает сайт-специфическую химическую модификацию аминокислотных остатков в полипептиде HSA линкера. Корректно скрученная третичная структура HSA визуализирует некоторые аминокислотные остатки на внешней поверхности белка. Химически реакционноспособные аминокислотные остатки (например, цистеин) можно вводить вместо находящихся (экспонированных) на поверхности остатков, чтобы содействовать сайт-специфической конъюгации диагностического или терапевтического агента. Изобретение включает также добавление или удаление аспарагинового, серинового или треонинового остатков из HSA линкерной полипептидной последовательности, чтобы изменить гликозилирование этих аминокислотных остатков. Сайты гликозилирования, добавляемые к HSA линкеру, предпочтительно экспонированы на поверхности, как обсуждается в данном описании. Гликозильные или другие углеводные элементы, введенные в HSA линкер, могут конъюгироваться непосредственно с диагностическими, терапевтическими или цитотоксическими агентами. Конъюгация цистеина (тиола). Изобретение включает замену экспонированных на поверхности аминокислотных остатков HSA линкера с цистеиновыми остатками на цистеиновые остатки, чтобы содействовать химической конъюгации диагностических, терапевтических или цитотоксических агентов. Цистеиновые остатки, экспонированные на поверхности HSA линкерного полипептида (который сложен в свою нативную третичную структуру), способствуют специфической конъюгации диагностического, терапевтического или цитотоксического агента с группой, реакционноспособной к тиольной группе, такой как малеимидная или галогенацетильная. Нуклеофильная реакционная способность тиольной функциональной группы цистеинового остатка по отношению к малеимидной группе примерно в 1000 раз выше, чем у любой другой аминокислотной функциональной группы аминокислоты в белке, такой как аминогруппа лизинового остатка или N-концевой аминогруппы. Тиол-специфическая функциональная группа в йодацетил- или малеимидсодержащих реагентах может реагировать с аминогруппами, но для этого требуются более высокие значения рН (9.0) и более продолжительное время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: APractical Approach, Academic Press, London). Количество свободных тиольных групп в белке можно оценивать в стандартном анализе с помощью реактива Эллмана. В некоторых случаях для получения свободной реакционноспособной тиольной группы требуется восстановление дисульфидных связей таким реагентом, как дитиотреитол (DTT) или селенол (Singh et al., Anal Biochem. 304, 147-156 (2002. Сайты для замены на цистеин можно идентифицировать анализом поверхностной доступности HSA линкера (например, идентификация сериновых и треониновых остатков как подходящих для замены описана ниже в примере 1). Поверхностную доступность можно выражать как площадь поверхности (например, в квадратных ангстремах), которая может контактировать с молекулой растворителя, например воды. Пространство, занятое водой, аппроксимируют сферой с радиусом 1.4 ангстрем. Программы для расчета поверхностной доступности каждой аминокислоты белка являются легкодоступными или лицензируемыми. Например, кристаллографические программы ССР 4 Suite, использующие алгоритмы для расчета поверхностной доступности каждой аминокислоты белка с известными из РСА координатами("ССР 4 Suite Program for Protein Crystallography", Acta Cryst, D50, 760-763 (1994),www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html). Доступность растворителя можно оценивать также как свободное программное обеспечение DeepView Swiss PDB Viewer от Swiss Institute of Bioinformatics. Цистеиновые замены в поверхностных (экспонированных на поверхности) сайтах содействуют конъюгации реактивного цистеина с реакционноспособной тиольной группой с диагностическим или терапевтическим агентом. Гликозилирование. Помимо этого, изменение сывороточного клиренса можно осуществлять, вводя сайты гликозилирования в HSA линкер. В некоторых вариантах изобретения HSA линкер по изобретению является гликозилированным. Гликозилирование полипептидов обычно является либо N-связанным, либо О-связанным. Выражение "N-связанный" относится к связыванию углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности узнавания для ферментативного связывания углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Та- 24022201 ким образом, присутствие этих трипептидных последовательностей в полипептидах создает потенциальный сайт гликозилирования. Выражение "О-связанное гликозилирование" относится к связыванию одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы с аминокислотой, содержащей гидроксиламиногруппу, чаще всего с серином или треонином, хотя можно также использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление к HSA линкеру или делецию из него сайтов гликозилирования обычно проводят, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы создавалась одна или более вышеописанных трипептидных последовательностей (в случае N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно также проводить с помощью добавления в последовательность, делеции или замены в последовательности первоначального HSA линкера одного или более сериновых или треониновых остатков(для О-связанных сайтов гликозилирования). Полученные углеводные структуры в HSA можно также использовать для сайт-специфической конъюгации вышеописанных цитотоксических, иммуномодулирующих или цитостатических агентов. Комбинации HSA линкерных агентов с терапевтическими агентами. Помимо этого, изобретение предусматривает для применения HSA линкерные агенты по данному описанию с одним или более терапевтических, цитотоксических или диагностических агентов по данному описанию. Например, пациентке, страдающей раком молочной железы, можно вводить HSA линкер,содержащий ErbB2 и ErbB3 scFvs (например, В 2 В 3-1), совместно с доксорубицином, циклофосфамидом и паклитакселом, обычной терапевтической схемой лечения рака молочной железы. Другие биологические и химические агенты, применимые для лечения рака, приводятся в приложении С (Appendix С). Сочетание HSA линкерных агентов с лучевой терапией и хирургической операцией. Изобретение предусматривает введение HSA линкерного агента по изобретению до, во время или после лучевой терапии или хирургической операции. Например, пациент, страдающий пролиферативным расстройством (например, раком молочной железы), может получать HSA линкерный агент, самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими, диагностическими или цитотоксическими агентами по данному описанию одновременно с нацеленной лучевой терапий или с хирургическим вмешательством (например, лампэктомией или мастэктомией) в месте расположения раковой опухоли. Лучевая терапия для применения в комбинации с HSA линкерными агентами по изобретению включает брахитерапию и нацеленную интраоперативную лучевую терапию (TARGIT). Фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции по изобретению содержат терапевтически или диагностически эффективное количество конъюгата HSA линкера по изобретению, который включает один или более агент из группы: связывающий элемент (например, антитела или фрагменты антител), диагностический агент(например, радионуклидные или хелатирующие агенты) или терапевтический агент (например, цитотоксические или иммуномодулирующие агенты). Активные ингредиенты, конъюгат HSA линкера по изобретению (полученный с одним или более агентов, выбранных из связывающего элемента, диагностического агента или терапевтического агента) можно приготовить для применения в виде различных систем доставки лекарства. В состав соответствующей рецептуры можно включать один или более соответствующих эксципиентов или носителей. Подходящие рецептуры для применения в настоящем изобретении можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed(1985). Краткий обзор методов доставки лекарств представлен в Langer Science, 249, 1527-1533 (1990). Фармацевтические композиции предназначены для парентерального, интраназального, топического, перорального или локального введения, например, трандермальным способом для профилактического и/или терапевтического лечения. Обычно фармацевтические композиции вводят парентерально (например, с помощью внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции), или перорально, или с помощью местного нанесения (топически). Так, изобретение включает композиции для парентерального введения, которые включают HSA линкер по изобретению, конъюгированный или не конъюгированный с одним из агентов - связывающим, диагностическим и/или терапевтическим, растворенный или суспендированный в подходящем, предпочтительно в водном носителе, например в воде, забуференной воде,солевом растворе, PBS и т.п. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, корректирующие рН, и буферизующие агенты, агенты, корректирующие тоничность, смачивающие агенты, детергенты и т.п. Изобретение также включает композиции для пероральной доставки, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как связующие или наполнители, для приготовления таблетки капсулы и т.п. Помимо этого, данное изобретение включает композиции для локального введения, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как растворители или эмульгаторы, для приготовления крема, мази и т.п. Эти композиции можно стерилизовать обычными методами стерилизации или их можно подвергнуть стерильной фильтрации. Полученные водные растворы можно упаковывать как есть или в лиофилизированном виде, причем лиофилизированный препарат перед применением смешивают со стерильным водным носителем. рН препаратов обычно находится в интервале 3-11, более предпочтительно в интервале 5-9 или 6-8 и наиболее предпочтительно в интервале 7-8, например 7-7,5. Полученные композиции в твердом виде можно упаковывать в виде нескольких однократных доз, каждая из которых содержит фик- 25022201 сированное количество конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в герметичной упаковке,содержащей, например, таблетки или капсулы. Композицию в твердом виде можно упаковывать в контейнер для меняющегося (гибкого) количества препарата, такой как мягкие тубы для крема или мази,предназначенных для местного нанесения. Композиции, содержащие эффективное количество конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), можно вводить млекопитающему (например, человеку) для профилактического и/или терапевтического лечения. При профилактическом применении композиции по изобретению, содержащие конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), вводят пациенту, восприимчивому к развитию или иным образом подверженному повышенному риску развития заболевания или состояния (например, рака, аутоиммунного заболевания или сердечно-сосудистого заболевания). Такое количество определяют как"профилактически эффективную дозу". В этом случае точные количества опять же зависят от состояния здоровья пациента, но обычно находятся в интервале примерно 0,5-400 мг конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) на дозу (например, 10, 50, 100, 200, 300 или 400 мг/дозу) и примерно 0,1 мкг-300 мг одного или более иммуномодуляторов на дозу (например, 10, 30, 50 мкг/дозу, 0,1, 10, 50,100 или 200 мг/дозу). Дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту с целью профилактики один или более раз в час, день, неделю, месяц или год (например, 2, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11 или 12 раз/ч, день, неделю, месяц или год). Чаще вводят разовую дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент). Для применения в терапии дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) вводят млекопитающему (например, человеку), уже страдающему заболеванием или состоянием (например, раковым заболеванием, аутоиммунным заболеванием или сердечно-сосудистым заболеванием), в количестве, достаточном для исцеления (выздоровления) или по меньшей мере частичного прекращения или ослабления одного или более симптомов заболевания или состояния и их осложнений. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяют как "терапевтически эффективную дозу". Эффективное количество для такого применения может зависеть от тяжести заболевания или состояния и общего состояния пациента, но обычно находится в интервале примерно 0,5-400 мг конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) на дозу (например, 10, 50, 100, 200, 300 или 400 мг/дозу). Дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту с целью терапии один или более раз в час, день, неделю,месяц или год (например, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз в час, день, неделю, месяц или год). Чаще вводят разовую дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент). В некоторых вариантах изобретения пациент может получать дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в примерном интервале 0,5-400 мг/дозу один или более раз в неделю (например, 2,3, 4, 5, 6 или 7 раз в неделю), предпочтительно примерно 5-300 мг/дозу один или более раз в неделю, и еще более предпочтительно примерно 5-200 мг/дозу один или более раз в неделю. Пациент может также получать раз в две недели дозу конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов,выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в примерном интервале 50-800 мг или ежемесячную дозу HSA линкера по изобретению, или в виде его конъюгата с любым конъюгированным с ним связывающим, диагностическим и/или терапевтическим агентом в примерном интервале 50-1200 мг. В других вариантах изобретения конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в стандартном интервале доз примерно 0,5-400 мг/неделю, примерно 1,0-300 мг/неделю, примерно 5-200 мг/неделю, примерно 10-100 мг/неделю, примерно 20-80 мг/неделю, примерно 100-300 мг/неделю или примерно 100-200 мг/неделю. Конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в интервале примерно 0,5-100 мг/через день, предпочтительно примерно 5-75 мг/через день, более предпочтительно примерно 10-50 мг/через день и еще более предпочтительно примерно 20-40 мг/через день. Конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в интервале примерно 0,5-100 мг три раза/неделю, предпочтительно примерно 5-75 мг три раза/неделю, более предпочтительно примерно 10-50 мг три раза/неделю и еще более предпочтительно примерно 20-40 мг три раза/неделю. В неограничивающих вариантах способов по настоящему изобретению конъюгат HSA линкера(приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) вводят млекопитающему (например, человеку) непрерывно в течение 1, 2,3 или 4 ч; 1, 2, 3 или 4 раза в день; через день, через два, три, четыре дня или через пять дней; 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10 раз в неделю; каждые две недели; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 раз в месяц; каждые два месяца; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз каждые шесть месяцев; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз в год; или каждые два года. В соответствие с терапевтической схемой конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить с различной частотой. В других вариантах изобретения конъюгат HSA линкера(приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить с одной и той же частотой или с различной частотой. Количество одного или более диагностических или терапевтических агентов и HSA линкера или любого конъюгированного с ним агента, необходимое для достижения нужного терапевтического эффекта, зависит от ряда факторов, таких как специфический(е) выбранный(е) диагностический(е) или терапевтический(е) агент(ы), способ введения и клиническое состояние реципиента. Специалист в данной области техники сможет определить соответствующие дозы одного или более диагностических или терапевтических агентов и HSA линкера или любого конъюгированного с ним агента, чтобы достичь желаемых результатов. Однократное или многократное введение композиций, содержащих эффективное количество конъюгата HSA линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), можно осуществлять с уровнем и типом доз, выбранными лечащим врачом. Дозу и схему введения можно определять и корректировать с учетом тяжести заболевания или состояния млекопитающего (например, человека), которое можно контролировать в ходе всего лечения методами, обычно принятыми в клинической практике, или методами по данному описанию. Конъюгат HSA линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить млекопитающему, такому как человек, непосредственно или в комбинации с любыми фармацевтически приемлемыми носителями или солью, известными в уровне техники. Фармацевтически приемлемые соли могут включать нетоксические соли присоединения кислоты или комплексы металлов, которые обычно применяются в фармацевтической промышленности. Примеры солей присоединения кислоты включают органические кислоты,такие как уксусная, молочная, пальмовая, малеиновая, лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, пальмитиновая, субериновая, салициловая, винная, метансульфоновая, толуолсульфоновая или трифторуксусная и т.п. кислота; полимерные кислоты, такие как дубильная, карбоксиметилцеллюлоза и т.п.; и неорганические кислоты, такие как хлористо-водородная (соляная) кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и т.п. Комплексы металлов включают комплексы цинка,железа и т.п. Типичным фармацевтически приемлемым носителем является физиологический солевой раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A.Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Применение в диагностике и терапии. Конъюгаты HSA линкера по изобретению, представленные в данном описании, можно применять для диагностики и терапии человека, включая, например, диагностику или лечение пролиферативных заболеваний (например, раковых заболеваний, таких как меланома, светлоклеточная саркома или рак почки) и аутоиммунных заболеваний (например, рассеянного склероза, ревматоидного артрита и увеита). Предполагается, что нижеприведенное обсуждение пролиферативных и аутоиммунных заболеваний человека даст квалифицированному практику общее понятие о том, как применять конъюгаты HSA линкера по изобретению в диагностике и терапии, но не предполагается, что это обсуждение ограничит объем настоящего изобретения. Пролиферативные заболевания (рак). Конъюгат HSA линкера по изобретению можно применять для диагностики, лечения, предупреждения или прекращения пролиферативных заболеваний, таких, но без ограничения, как рак молочной железы, меланома, саркома, рак почки, рак легкого, рак желудка и рак яичника. Связывающие элементы,которые должны быть соединены с HSA линкером по изобретению для применения в диагностике или терапии пациента с подозрением на пролиферативное заболевание, можно выбрать с учетом их способности специфически связывать, оказывать агонистическое действие на, активировать, оказывать антагонистическое действие на или ингибировать молекулы-мишени (например, рецепторов клеточной поверхности, такие как рецепторы тирозинкиназ), ассоциированные с пролиферативным заболеванием. Связывающие элементы, которые нацелены, например, на рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR,например, IGF1R и IGF2R), рецептор фактора роста фибробластов (FGFR), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), рецептор фактора некроза опухолей (TNFR), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, например ErbB2 (HER2/neu, Fc рецептор, c-kit рецептор или рецептор фактора мезенхимально-эпителиального перехода (с-met, также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR, можно также соединять с HSA линкером по изобретению для диагностики или лечения пролиферативного заболевания. Специфическое связывание раковой клетки с конъюгатомHSA линкера может содействовать детекции (например, HSA линкер, соединенный с детектируемой меткой по данному описанию) или деструкции (например, HSA линкер, соединенный с цитотоксическим агентом) связанной раковой клетки. Специфическое применение конъюгатов HSA линкера по изобретению для лечения рака молочной железы и рака почки описано ниже. Рак молочной железы. Обычные формы рака молочной железы включают инвазивный протоковый рак, злокачественную опухоль в протоках молочных желез и инвазивный дольковый рак, злокачественную опухоль в дольках молочных желез. Известно, что некоторые типы раковых клеток молочной железы экспрессируют высокие уровни рецепторов эпидермального фактора роста, в особенности ErbB2 (т.е. HER2/neu). Аберрантную передачу сигналов или неконтролируемую активацию EGFR связывают с развитием и прогрессированием многих типов раковых заболеваний, включая рак молочной железы. Неконтролируемую клеточную пролиферацию, опосредуемую нарушением EGFR путей (дисфункциональные пути), можно обнаружить у широкого ряда солидных опухолей эпителиального происхождения, и результаты показывают связь экспрессии, сверхэкспрессии и дисрегуляции EGFR с запущенным заболеванием, метастатическим фенотипом, резистентностью к химиотерапии и общим неблагоприятным прогнозом.HSA линкер по изобретению, связанный с одним или более связывающих элементов, специфических к EGFR (например, антитело к ErbB2, трастузумаб), можно использовать с диагностическим (например, с детектируемой меткой) или с цитотоксическим, цитостатическим или терапевтическим агентом по данному описанию для диагностики или лечения рака молочной железы. Или же биспецифический конъюгат HSA линкера, который содержит связывающие элементы, специфические к ErbB2 иErbB3, такие как "В 2 В 3-1", описанные подробно далее, можно использовать для диагностики или лечения раковых заболеваний, таких как рак молочной железы, почки, яичника и легкого. Как описывается выше, конъюгат HSA линкера по изобретению, применяемый для лечения рака молочной железы, можно вводить до (например, неоадъювантная химиотерапия), во время или после(например, неоадъювантная химиотерапия) лучевой терапии или хирургического вмешательства. Конъюгат HSA линкера можно также вводить совместно с другими соединениями (например, противоопухолевыми агентами, такими как биологические или химические терапевтическими веществами), применимыми для лечения рака молочной железы. Например, известно, что противоопухолевые агенты, перечисленные в табл. 1, включающие митотические ингибиторы (например, таксаны), алкилирующие агенты(включающие, например, агенты на основе платины), селективные модуляторы рецепторов эстрогенаErbB3, особенно применимы для лечения рака молочной железы. Врач-клиницист может вводить конъюгат HSA линкера по изобретению в комбинации с любым соединением, включая соединения, перечисленные в приложении С, заведомо или предположительно благотворные (подходящие) для лечения рака молочной железы. Таблица 1 Типичные противоопухолевые агенты для лечения рака молочной железы в комбинации с конъюгатами HSA линкера по изобретению. Рак почки (почечный рак). Раковые заболевания почек, такие как почечно-клеточный рак, особенно устойчивы к традиционной лучевой и химиотерапии. Соответственно, применение биологических терапевтических средств, связанных с HSA линкером по изобретению, предоставляет привлекательную возможность пациентам,страдающих этими типами рака. Например, HSA линкер, соединенный со связывающими элементами,которые проявляют свойства, агонистические по отношению к рецепторам типа I интерферона или интерлейкина 2, можно использовать для лечения рака почки. Ввиду того что это солидная опухоль, связывающие элементы, которые нацелены на и ингибируют васкуляризацию опухоли (например, антитела против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF, также можно применять для достижения терапевтического эффекта. Аутоиммунные заболевания. Конъюгат HSA линкера по изобретению можно использовать для диагностики, лечения, предупреждения или стабилизации аутоиммунных заболеваний и расстройств, например, у человека, например,таких как рассеянный склероз (PC, MS), инсулинозависимый сахарный диабет (ИСЗД, IDDM), ревматоидный артрит (РА), увеит, синдром Съегрена, болезнь Грейвса и тяжелая псевдопаралитическая миастения. Аутоиммунные заболевания и расстройства вызываются аутореактивными элементами иммунной системы (например, Т-клетками. В-клетками и аутореактивными антителами). Соответственно, связывающие элементы, которые ингибируют, блокируют, действуют как антагонисты на аутореактивные иммунные клетки и антитела или истощают аутореактивные иммунные клетки и антитела (например, антилимфоцитарные или антитимоцитарные глобулины, моноклональные антитела базиликсимаб, даклизумаб или муромонаб-CD3), можно связывать с HSA линкером по изобретению для применения в терапии. Связывающие элементы, которые действуют как ингибиторы передачи сигналов воспаления (ISI), по данному описанию, можно связывать с HSA линкером по изобретению для лечения аутоиммунитета. Помимо этого, связывающие элементы, которые ингибируют функцию интегрина или противодействуют

МПК / Метки

МПК: C12P 21/04

Метки: основе, содержащий, способный, агент, применение, связываться, линкер, опухолевой, клеткой

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-22201-agent-sposobnyjj-svyazyvatsya-s-opuholevojj-kletkojj-soderzhashhijj-linker-na-osnove-hsa-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение</a>

Похожие патенты