Пептид, способный связываться с интерлейкин-1-beta-конвертирующим ферментом (ice), и фармацевтические композиции на его основе

1 Область изобретения Настоящее изобретение касается пептидов,способных связываться с ICE и (или) с ферментами семейства ICE, при том, что этот пептид содержит аминокислотную последовательность по SEQ ID NO:1, приведенную в списке последовательностей, в которой Хаа выбран из аспарагиновой кислоты и аланина, необязательно содержащей одну или несколько аминокислот на ее N-конце и (или) С-конце. Оно также касается применения указанного пептида при лечении заболеваний, требующих ингибирования ICE и для приготовления фармацевтических композиций, активных при заболеваниях, требующих ингибирования ICE и(или) подавления ферментов семейства ICE, а также фармацевтических композиций на их основе. Предпосылки изобретенияICE (интерлейкин-1-конвертирующий фермент) является гетеродимерной цистеин-протеазой,которая недавно была очищена и клонирована [1]. Интерлейкин-1 (IL-1) синтезируется в виде неактивного предшественника с молекулярной массой 33 или 31 кД (pIL-1); характеризующаяся полной активностью зрелая форма IL-1 с молекулярной массой 17,5 кД начинается с остатка Аlа 117 и образуется в результате процессинга между остатками Аsр 116 и Аlа 117 [2, 3]. Таким образом, белок-предшественник IL-1 расщепляется с участием ICE с образованием зрелой и биологически активной формы. Активность ICE была установлена в моноцитах и клетках ТНР 1, в которых расщеплениеpIL-1 осуществляется как по Аsр 116-Аlа 117, так и по Asp27-Gly28 с образованием продуктов с молекулярными массами 17,5 и 28 кД, соответственно [3, 4]. Расщепление по каждому из этих сайтов является зависимым от остатка аспарагиновой кислоты, находящегося в положении Р 1[4, 6, 7]. Становится понятным, что цистеиновые протеазы, родственные белку гибели клеток ced3 нематоды Caenorhabditis elegans, представляют эффекторный компонент в комплексе механизмов апоптоза. ICE был первым охарактеризованным гомологом CED-3, и известно, что избыточная экспрессия ICE или CED-3 в фибробластах Rat-1 индуцирует апоптоз [8]. Дальнейшие исследования также подтверждают, что протеазы семейства ICE могут играть важную роль в механизмах апоптоза. Предположительно ICE является специфичным ферментом процессинга pIL-1, потому что он не расщепляет IL-1 или ряд других белков, включающих большое число связей Asp-X. Интерлейкины IL-1, и IL-1 являются полейотропными цитокинами, которые при наличии весьма низкого уровня сходства последовательностей проявляют ряд сходных эффектов в различных тканях и действуют при многих па 001866 2 тологических состояниях человека, в частности,при формировании иммунного ответа организма и при воспалительных процессах [9]. Оба белка характеризуются молекулярной массой около 17,5 кД и исходно синтезируются в виде молекул-предшественников большего размера с молекулярной маcсой около 31 кД. Интерлейцины-1 являются потенциальными воспалительными и пирогенными цитокинами, которые обычно проявляют благоприятное действие, но также могут иметь и резко отрицательное влияние на здоровье организма. Они могут, например, участвовать в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, и, в частности, они вовлечены в качестве медиаторов в усиление повреждения тканей, например, при ревматоидном артрите. Многие из биологических действий интерлейкинов-1 сходны с таковыми, которые могут быть выявлены при сепсисе. Недавние исследования показали, что внутривенное введение IL-1 в дозах 1-10 нг/кг приводит к лихорадке, бессоннице, анорексии, генерализованной миалгии,артралгии (суставным болям) и сильным головным болям. Поскольку интерлейкины-1 обладают плейотропными биологическими активностями,многие из которых негативно влияют на организм, мощное влияние IL-1 должно находиться под жестким физиологическим контролем. Синтез IL-1 ингибируется противопоспалительными цитокинами, простагландинами и глюкокортикоидами, и существование множественных уровней ингибирования IL-1 указывает на необходимость жесткого контроля этого медиатора. Существуют два типа рецепторов IL-1,обозначаемых IL-1RI и IL-1RII. IL-1RII является неинформационной молекулой, связывающейIL-1, которая активна как регулируемая мишень-ловушка для IL-1 [10, 11, 12]. Полипептид, являющийся антагонистом рецептора IL-1, к настоящему времени описан третьим известным на сегодня компонентом семейства рецептор-связывающих белков, является антагонист рецептора IL-1 (IL-1ra) [13, 14,15]. Все три компонента (IL-1, IL-1, IL-1ra) распознают и связываются с одним и тем же рецептором клеточной поверхности (IL-1R); связывание IL-1 и IL-1 на IL-1R является информационным (передает сигнал), в то время как связывание IL-1ra неинформационно. 3 К настоящему времени две молекулярные формы IL-1ra идентифицированы и клонированы: 1) секретируемый IL-1ra (sIL-1ra) включает классическую основную последовательность из 25 аминокислот, дающую зрелый белок из 152 аминокислот; 2) внутриклеточный IL-1ra (icIL1ra) утрачивает основную последовательность,что позволяет предсказать, что такой белок остается внутри клетки.sIL-1ra и icIL-1r генерируются одним и тем же геном. Транскрипты icIL-1ra образуются вследствие использования альтернативного сайта начала транскрипции и сплайсинга первого альтернативного экзона по внутреннему акцепторному сайту сплайсинга, расположенному в первом экзоне sIL-1ra. Таким образом, предсказанные белки характеризуются идентичной аминокислотной последовательностью, за исключением их NН 2-концов, в которых 21 аминокислота sIL-1ra замещена 4 аминокислотами вsIL-1ra и icIL-1ra, регулируется по-разному. Биологическое значение icIL-1ra пока не установлено. Принимая во внимание, что IL-1 участвует в патогенезе многих заболеваний, ясна необходимость наличия медикаментов, применимых для ограничения негативных проявлений IL-1. Новая молекулярная форма icIL-1 была недавно идентифицирована и клонирована [16,РСТ/ЕР 95/04023]. Эта молекула образуется путем вставки в кодирующую рамку нового 63 нуклеотидного экзона, расположенного между первым и вторым экзонами специфичной дляicIL-1ra формы. Экспрессия этого нового транскрипта была обнаружена в фибробластах, кератиноцитах, активированных моноцитах и полиморфоядерных клетках. Экспрессия в клеткахCOS указывает на то, что эта новая молекула в основном является внутриклеточной и характеризуется молекулярной массой приблизительно 25 кД по данным SDS-PA-GE (электрофорез в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом). Эта новая молекула была обозначенаicIL-1raII является внутриклеточным белком,так же как и ICE, заявитель также исследовал способность icIL-1raII подавлять активностьicIL-1raII ингибирует активность ICE. Описание изобретения Основным объектом настоящего изобретения является обеспечение новыми пептидами,способными связываться с ICE, блокируя таким образом образование активной формы IL-1 и(или), в более общем виде, способными связываться с ферментами семейства ICE, блокируя тем самым активность таких ферментов. Соответственно, настоящее изобретение относится к пептиду, способному связываться с ICE и (или) 4 с ферментами семейства ICE, при том, что этот пептид содержит аминокислотную последовательность по SEQ ID NO: 1, приведенную в списке последовательностей, в которой Хаа выбран из аспарагиновой кислоты и аланина, как особо показано в SEQ ID NO: 2 или 3, необязательно содержащий одну или несколько аминокислот на ее N-конце и (или) С-конце. Соответственно,пептид по настоящему изобретению может состоять из 19-40, а предпочтительнее из 19-25 аминокислот. В особенности, в соответствии с одним из аспектов изобретения, пептид содержит аминокислотную последовательность по SEQ ID NO: 4 или 5. Неограниченный список цистеиновых протеаз семейства ICE включает: CED-3 [17], Nedd2/ICH-1 [18, 19], Yama/CPP-32/апопаин [20, 21,22], Тх/IСН-2/IСЕ-подобный II [23, 24, 25], ICEподобный III [25], Mch-2 [26], ICE-Lap3/Mch3/CMH-1 [27, 28, 29], ICE-LAP-6 [30] иFLICE/MACH [31, 32]. Другой задачей настоящего изобретения является представление пептида в существенно очищенном виде так, чтобы он был пригодным для использования в составе фармацевтических композиций в качестве активного ингредиента при патологиях, при которых необходимо ингибирование ICE и (или) ингибирование ферментов из семейства ICE. Примерами патологий, при которых новый антагонист, согласно настоящему изобретению,может быть эффективно использован для решения профилактических, терапевтических или диагностических задач, являются смертельные вирусные и бактериальные инфекции, равно как аутоиммунные и воспалительные заболевания. Специфические примеры включают: ревматоидный артрит, септический шок, острый миеломоноцитарный лейкоз, иммунореакция отторжения при трансплантации, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), язвенный колит и рассеянный склероз. Другие задачи и преимущества настоящего изобретения будут видны из последующего описания. Воплощение изобретения представляет введение фармакологически активного количества пептида по настоящему изобретению донорам в случае риска развития заболевания, при которых требуется ингибирование ICE и (или) ингибирование фермента семейства ICE, или донорам, у которых такие заболевания уже имеют место. Может быть использован любой тип введения активного начала, однако наиболее предпочтительным считается парентеральное введение, поскольку оно позволяет достигать системного эффекта в короткое время. С этой точки зрения предпочтительным является введение в виде внутривенного шарика до, в ходе или после хирургической операции. Доза вводимого 5 пептида зависит от медицинских показаний,связанных с возрастом, весом тела и индивидуальной реакцией пациента. Дозы могут находиться в пределах от 0,05 до 30 мг на 1 кг веса тела, а предпочтительные дозы составляют 0,1-10 мг/кг веса тела. Фармацевтические композиции для парентерального применения могут быть приготовлены в инъекционной форме, включающей активное начало и удобный носитель. Носители для парентерального введения хорошо известны в данной области техники и включают, например,воду, солевой раствор, физиологический раствор и декстрозу. Носитель может включать меньшее количество наполнителя с целью поддержания стабильности и изотоничности раствора. Приготовление указанных растворов может быть проведено в соответствии со стандартными процедурами, а предпочтительное содержание пептида должно составлять 1-10 мг/мл. Настоящее изобретение описано в отношении специальных его воплощений, но содержание описания включает все модификации и замещения, которые могут быть произведены специалистом в данной области техники без выхода за пределы задач и целей, охватываемых формулой изобретения. Изобретение будет теперь охарактеризовано посредством следующих примеров, которые не должны рассматриваться как каким-либо образом ограничивающие настоящее изобретение. Примеры будут иметь ссылки на рисунки, описанные ниже. Описание чертежей Фиг. 1 показывает данные анализа методом Нозерн-блоттинга экспрессии мРНК ICE в трансфицированных клетках COS. Общий пул мРНК, экстрагированных клетками COS, трансфицированных пустым вектором или кДНК,кодирующей ICE человека, анализировали методом Нозерн-блоттинга с целью подтверждения экспрессии, специфичной для ICE мРНК. В частности: линия 1 - пустой вектор,линия 2 - ICE. Фиг. 2 показывает данные Вестернблоттинга, pIL-1 инкубировали с лизатом моноцитов, приготовленным согласно описанному в литературе методу [4]: спустя 60 мин инкубации при 37 С реакционную смесь разгоняли электрофорезом в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом, а присутствие предшественника или зрелого IL-1 маркировали с помощью Вестерн-блоттинга. В частности,линия 1 - pIL-1; линия 2: pIL-1 + лизат моноцитов. Фиг. 3 показывает аминокислотные последовательности изучаемых пептидов. Пептид A 6 определены на базе последовательности icIL1raII. Пептид Х (SEQ ID NO: 7) является случайно выбранным пептидом. Пептид S (SEQ IDNO: 5) идентичен пептиду С, за исключением присутствия двух остатков аланина, замещающих два остатка аспарагиновой кислоты. Пептид В (SEQ ID NO: 8) является известным ингибитором ICE [la]. Фиг. 4 показывает ингибирование активности ICE низкими концентрациями изучаемых пептидов. pIL-1 (5 нг) инкубировали с ICE в присутствии или в отсутствии пептидов (0,25 или 2,5 мккМ), а присутствие предшественника или зрелого IL-1 было подтверждено также,как это описано для фиг. 2. В частности,линия 1: pIL-1; линия 2: pIL-1 + пептид А; линия 3: pIL-1 + пептид В; линия 4: pIL-1 + пептид С; линия 5: pIL-1 + ICE; линия 6: pIL-1 + ICE + пептид-А [2,5 мкМ); линия 7: pIL-1 + ICE + пептид-А (0,25 мкМ); линия 8: pIL-1 + ICE + пептид-В (2,5 мкМ); линия 9: pIL-1 + ICE + пептид-В (0,25 мкМ); линия 10: pIL-1 + ICE + пептид-С (2,5 мкМ); линия 11: pIL-1 + ICE + пептид-С (0,25 мкМ). Фиг. 5 показывает ингибирование активности ICE высокими концентрациями изучаемых пептидов. pIL-1 (5 нг) инкубировали с ICE в присутствии или в отсутствии пептидов (40 или 400 мкМ), а присутствие предшественника или зрелого IL-1 было подтверждено также,как это описано для фиг. 2. В частности,линия 1: pIL-1 + пептид-А; линия 2: pIL-1 + пептид-В; линия 3: pIL-1 + пептид-С; линия 4: pIL-1 + пептид-Х; линия 5: pIL-1; линия 6: pIL-1 + ICE; линия 7: pIL-1 + ICE + пептид-А (400 мкМ); линия 8: pIL-1 + ICE + пептид-В (400 мкМ); линия 9: pIL-1 + ICE + пептид-С (400 мкМ); линия 10: pIL-1 + ICE + пептид-Х (400 мкМ); линия 11: pIL-1 + ICE + пептид-А (40 мкМ); линия 12: pIL-1 + ICE + пептид-В (40 мкМ); линия 13: pIL-1 + ICE + пептид-С (40 мкМ); и линия 14: pIL-1 + ICE + пептид-Х (40 мкМ). Фиг. 6 показывает ингибирование активности ICE пептидами С и S. pIL-1 (5 нг) инку 7 бировали с ICE в присутствии или в отсутствии пептидов (100, 300 или 1000 мкМ) , а присутствие предшественника или зрелого IL-1 было подтверждено также, как это описано для фиг. 2. В частности,линия 1: pIL-1; линия 2: pIL-1 + пептид-С; линия 3: pIL-1 + пептид-S; линия 4: pIL-1 + пептид-В; линия 5: pIL-1 + ICE; линия 6: pIL-1 + ICE + пептид-С (0,1 мМ); линия 7: pIL-1 + ICE + пептид-С (0,3 мМ); линия 8: pIL-1 + ICE + пептид-С (1 мМ); линия 9: pIL-1 + ICE + пептид-S (0,1 мМ); линия 10: pIL-1 + ICE + пептид-S (0,3 мМ); линия 11: pIL-1 + ICE + пептид-S (1 мМ); линия 12: pIL-1 + ICE + пептид-В (1 мМ). Примеры Материалы и методы Реагенты. Следующие стандартные реагенты были использованы для культивирования и сепарирования клеток:(Seramed, Berlin, Германия) и Hepes (Merk, Darmastadt Германия). Клетки. Моноядерные клетки были получены из периферической крови здоровых доноров с использованием центрифугирования в градиенте Фиколл. Очищенные моноциты сепарировали из моноядерных клеток с помощью центрифугирования в градиенте Перколл при 2000 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре[10]. Клетки COS-7 (взяты из колекции АТСС,Роквилл, Мэрилэнд, США) и моноциты культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% плодной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина,20 мМ HEPES. Рекомбинантный предшественник IL-1 человека был получен от Cistron Biotechnology, Pinebroom, NJ (США). Поликлональное антитело, активное в отношении и предшественника, и зрелого IL-1, было получено в этой же лаборатории. ПЦР. кДНК ICE была получена с помощью полимеразной цепной реакции с ревертированием с использованием опубликованных последовательностей (8 а). Полимеразная цепная реакция с ревертированием была проведена в соответствии с описанной процедурой [16] на протяжении 30 циклов при 95 С в течение 1,5 мин, при 55 С в течение 1,5 мин и при 72 С в течение 1,5 мин. Олигонуклеотиды были получены от DuotechICE 2: 5'TCTCTTCACCCTGCCCACAGAC-3' (SEQ ID NO: 10) Результаты Экспрессия рекомбинантного фермента ICE в клетках COS кДНК, кодирующая ICE человека, была амплифицирована с применением ПЦР. Последовательность была подтверждена, а кДНК была субклонирована в состав экспрессирующего вектора pSG5. Клетки COS были трансфицированы пустым вектором или вектором, включающим кДНК ICE и спустя 48 ч клетки анализировали по экспрессии мРНК, специфичной для ICE. Как показано на фиг. 3, клетки COS,трансфицированные кДНК ICE, экспрессируют высокий уровень мРНК ICE. Лизат моноцитов, приготовленный в соответствии с описанным ранее методом [II], также был способен конвертировать pIL-1 в зрелую форму (фиг. 2). Таким образом, рекомбинантный ICE или свежеизолированные моноциты человека были использованы в качестве источника каталитической активности ICE для дальнейших экспериментов . Ингибирование активности ICE Готовили источник активности ICE, а его способность расщеплять pIL-1 тестировали путем инкубации смеси при 37 С в течение 1 ч. Затем смесь разгоняли электрофорезом в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом,а присутствие pIL-1 или зрелой формы оценивали методом Вестерн-блоттинга. Четыре различающихся пептида были обозначены, синтезированы и их тестировали по способности ингибировать активность ICE. Эти пептиды указаны на фиг. 3: они были получены путем синтеза в твердой фазе на оборудованииApplied Biosystems (Foster City, CA). Чистоту этих пептидов проверяли методом жидкостной хроматографии под высоким давлением. В качестве позитивного контроля использовали тетрапептид В (Bachem, Bubendorf,Швейцария), упомянутый на фиг. 3, который является известным ингибитором ICE [1a]. Список литературы(ICE), имеющий, согласно Списку последовательностей, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой Хаа представляет собой Asp или Аlа. 2. Пептид по п.1, имеющий, согласно Списку последовательностей, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. 3. Пептид по п.1, имеющий, согласно Списку последовательностей, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. 11 4. Пептид по п.1, дополнительно содержащий одну или более аминокислот на Nконцевом и(или) С-концевом участке и состоящий из 20-40 аминокислот. 5. Пептид по п.4, имеющий согласно Списку последовательностей, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. 6. Пептид по п.4, имеющий согласно Списку последовательностей, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. 7. Применение пептида по любому из пп.1-6 при лечении заболеваний, требующих ингибирования ICE. 8. Применение пептида по любому из пп.1-6 в качестве активного начала для приготовления фармaцевтических препаратов, используемых при лечении заболеваний, требующих ингибированияICE. 9. Применение по п.8, отличающееся тем,что заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. 10. Применение по п.8, отличающееся тем,что заболевание является бактериальной или вирусной инфекцией со смертельным исходом. 11. Применение по п.8, отличающееся тем,что заболевание представляет собой воспалительное заболевание. 12. Фармацевтическая композиция, предназначенная для использования в профилактике,терапии или диагностике заболеваний, требующих ингибирования ICE, содержащая пептид,по любому из пп.1-6 вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. 13. Фармацевтическая композиция по п.12,отличающаяся тем, что заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. 14. Фармацевтическая композиция по п.12,отличающаяся тем, что заболевание является бактериальной или вирусной инфекцией со смертельным исходом. 15. Фармацевтическая композиция по п.12,отличающаяся тем, что заболевание представляет собой воспалительное заболевание. Список последовательностей ОСНОВНАЯ ИНФОРМАЦИЯ(iv) ПРИГОДНАЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА ФОРМА:"Хаа обозначает предпочтительно аминокислоту, выбираемую из аспарагиновой кислоты и аланина. Более предпочтительным является Asp"."Хаа обозначает аминокислоту, выбираемую предпочтительно из аспарагиновой кислоты и аланина. Более предпочтительным является Asp"