Фрагмент β-амилоидного пептида, связанный с пептидом-носителем, фармацевтическая композиция или комбинация, его содержащая, и его применение

ФРАГМЕНТ -АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА, СВЯЗАННЫЙ С ПЕПТИДОМНОСИТЕЛЕМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ИЛИ КОМБИНАЦИЯ, ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к улучшенным агентам для лечения заболеваний, ассоциированных с отложениями амилоида А в головном мозге пациента, и способам лечения. Такие способы включают введение агентов, индуцирующих эффективный иммунный ответ против отложений амилоида. Способы полезны для профилактики и лечения болезни Альцгеймера. Предпочтительные агенты включают N-концевые фрагменты А, связанные с пептидом-носителем,причем фрагмент А состоит из: (i) A 1-7 с аминокислотной последовательностью DAEFRHD или(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЯНССЕН АЛЬЦГЕЙМЕР ИММУНОТЕРАПИ (IE) Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к иммунологии и медицине. Сведения о предшествующем уровне техники Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческому слабоумию (см., в основном, Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe,J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995. В целом, болезнь Альцгеймера развивается в две стадии: поздняя стадия наступает в возрасте 65 и более лет, а ранняя стадия характерна для возрастного периода, предшествующего старости, т.е. для 35-60 лет. В обоих случаях патологические процессы одинаковы, однако нарушения более распространены и имеют большую тяжесть на ранней стадии развития заболевания. Заболевание характеризуется по крайней мере двумя типами повреждений мозга, старческими бляшками и нейрофибриллярными сплетениями. Старческие бляшки - это области дезорганизованного нейропиля до 150 мкм в диаметре с внеклеточными отложениями амилоида в центре, что можно увидеть при микроскопическом анализе срезов ткани мозга. Нейрофибриллярные сплетения представляют собой внутриклеточные отложения ассоциированного с микротрубочками tau-белка, состоящие из двух филаментов, скрученных в пары друг с другом. Основным компонентом бляшек является пептид, называемый А- или -амилоидным пептидом. А-пептид представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого амилоидным белком-предшественником (АРР). Различные мутации в пределах АРР белка коррелируют с наличием болезни Альцгеймера (см., например, Goale et al., Nature 349, 704 (1991) (валин 717 заменен на изолейцин); Chartier Harlan et al., Nature 353, 844 (1991) (валин 717 заменен на глицин);(1992) (двойная замена лизина 595 - метинина 596 на аспарагин 595 - лейцин 596). Такие мутации, по-видимому,вызывают болезнь Альцгеймера путем усиления или изменения процессинга АРР в А, в частности процессинга АРР, приводящего к увеличению количества длинной формы А (т.е. A1-42 и A1-43). Мутации в других генах, таких как гены пресенилина PS1 и PS2, по-видимому, косвенно влияют на процессинг АРР с образованием повышенных количеств длинной формы А (см. Hardy, TINS 20, 154 (1997. Указанные наблюдения свидетельствуют о том, что А и в особенности его длинная форма являются ключевым элементом в возникновении болезни Альцгеймера.McMichael (ЕР 526511) предлагает вводить гомеопатические дозы (менее чем или эквивалентные 10-2 мг/день) А пациентам с предсуществующей БА. У обычного человека с 5 л циркулирующей плазмы крови даже верхний предел указанной дозы будет соответствовать концентрации А в плазме не более чем 2 пкг/мл. Обычная концентрация А в плазме крови человека обычно составляет 50-200 пкг/мл (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992. Поскольку доза, предложенная в ЕР 326511, будет незначительно изменять уровень эндогенного циркулирующего А и поскольку в данном источнике информации не рекомендуется использование адъюванта в качестве иммуностимулятора, представляется сомнительным,чтобы какой-либо терапевтический эффект был достигнут. В противоположность указанному настоящее изобретение направлено inter alia на лечение болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путем введения фрагментов А или антител к различным эпитопам А больным данным заболеванием, что приводит к формированию эффективного иммунного ответа у больного. Таким образом, изобретение решает давно стоящую терапевтическую потребность предотвращения и облегчения нейропатологии и, в некоторых случаях, когнитивной недостаточности, ассоциированной с болезнью Альцгеймера. Сущность изобретения Изобретение обеспечивает фрагмент А, связанный с пептидом-носителем, предназначенный для применения при стимулировании иммунного ответа против А и таким образом предотвращения или лечения болезни, ассоциированной с отложениями амилоида А в головном мозге пациента, причем фрагмент А состоит из:(ii) мультимера по (i). К таким заболеваниям относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя может наблюдаться вместе с другими признаками амилоидогенного заболевания, а может развиваться сама по себе. В другом контексте изобретение относится к способам предотвращения или лечения заболевания,ассоциированного с отложением амилоида А в мозге больного. Например, способы могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера, синдрома Дауна или когнитивной недостаточности. Такие способы включают введение фрагментов А или его аналогов, что вызывает иммуногенный ответ на определенные эпитопы в пределах А. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы полипептида, содержащего N-концевой сегмент по крайней мере остатков 1-5 А, первый остаток А является N-концевым остатком полипептида, в то время как полипептид свободен от С-концевого сегмента А. Другие способы включают введение больному эффективной дозы полипептида, включающего N-концевой сегмент А, сегмент начинается остатками 1-3 А и заканчивается остатками 7-11 А. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы агента, который индуцирует иммуногенный ответ на N-концевой сегмент А, сегмент начинается остатками 1-3 А и заканчивается остатками 7-11 А. При этом иммуногенный ответ не индуцируется против эпитопа, находящегося в пределах остатков 12-43 А 43. В некоторых из описанных выше способах N-концевой сегмент А связывают на С-концевом участке с гетерологичным пептидом. В других из описанных выше способах N-концевой сегмент А связывают на N-концевом участке с гетерологичным полипептидом. Иногда N-концевой сегмент А связывают на N- и С-концевых участках с первым и вторым гетерологичными полипептидами. Также Nконцевой сегмент А связывают на N-концевом участке с гетерологичным полипептидом, а на Сконцевом участке - по крайней мере с одной дополнительной копией N-концевого сегмента. В определенных случаях гетерологичный полипептид включает по крайней мере одну дополнительную копию Nконцевого сегмента. Может быть так, что полипептид включает от N-концевого участка к С-концевому участку N-концевой сегмент А, многочисленные дополнительные копии N-концевого сегмента и гетерологичный аминокислотный сегмент. В некоторых способах N-концевой сегмент содержит А 1-7. Иногда N-концевой сегмент содержит А 3-7. В определенных способах фрагмент свободен по крайней мере от 5 С-концевых аминокислотных остатков А 43. В некоторых случаях фрагмент содержит до 10 непрерывных аминокислот А 43. Фрагменты обычно вводят пациенту в дозе, составляющей более 10 мкг. В некоторых способах фрагмент вводят вместе с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на пептид А. Адъювант и фрагмент могут вводиться последовательно или в составе одной композиции. Адъювант может быть, например, гидроксидом алюминия, фосфатом алюминия, MPL, QS-21 (Stimulon) или неполным адъювантом Фрейнда. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей фрагменты А или другие агенты, вызывающие иммуногенный ответ к тем эпитопам А, которые описаны выше, и адъювант. Краткое описание фигур Фиг. 1. Показан титр антител после инъекции трансгенным мышам А 1-42. Фиг. 2. Отложения амилоида в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной амилоидными бляшками, осуществлялась в реакции со специфическим к А моноклональным антителом 3D6 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны в соответствии с группой обработки. Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса. Фиг. 3. Невритическая дистрофия в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной дистрофическим невритом, осуществлялась в реакции со специфическим к АРР моноклональным антителом человека 8 Е 5 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны для обработанной AN 1792 группы и группы, обработанной PBS (контроль). Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса. Фиг. 4. Астроцитоз в ретросплениальной коре. Оценка в процентах области коры, в которой выявляются астроциты, положительные по глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), осуществлялась с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга (реакция иммунного окрашивания). Оценка для индивидуальных мышей показана в соответствии с группой обработки и средние оценки по группе отмечены горизонтальными линиями. Фиг. 5. Геометрическое выражение титра антител к А 1-42 после иммунизации 8 дозами AN 1792,содержащими 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 или 300 мкг белка соответственно. Фиг. 6. Кинетика антительного ответа после иммунизации AN 1792. Титры выражены в геометрических значениях для 6 животных в каждой группе. Фиг. 7. Количественный анализ изображений кортикальных амилоидных отложений у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 8. Количественный анализ изображений невритических бляшек у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 9. Процентный количественный анализ изображений областей ретросплениальной коры, заполненных астроцитами, у мышей, обработанных AN 1792 и PBS. Фиг. 10. Исследование пролиферации лимфоцитов на клетках селезенки после обработки AN 1792(верхняя панель) и PBS (нижняя панель). Фиг. 11. Общие уровни А-профилей у мышей, иммунизированных производными А или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Фиг. 12. Амилоидные отложения в коре определяли количественным анализом изображений срезов мозга мышей, иммунизированных А-пептидными конъюгатами A 1-5, A 1-12 и А 13-28; полнораз-2 021614 мерные агрегаты AN 1792 (A 1-42) и AN 1528 (A 1-40) и обработанная контрольная группа. Фиг. 13. Геометрическое значение титров А-специфических антител в группах мышей, иммунизированных производными А или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Фиг. 14. Геометрическое значение титров А-специфических антител в группах морских свинок,иммунизированных AN 1792 или его пальмитоилированным производным вместе с различными адъювантами. Фиг. 15(А-Е). Уровни А в коре 12-месячных мышей PDAPP, обработанных AN 1792 или AN 1528 с различными адъювантами. Фиг. 16. Средние титры антител у мышей, обработанных поликлональным антителом к А. Фиг. 17. Средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 10D5 к А. Фиг. 18. Средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 2F12 к А. Фиг. 19. Эпитопная карта. Рестрицированный N-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус,отобранная на 175 день, была тестирована методом ELISA против серии состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся полипептидов (SEQ ID NO: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности AN 1792. Животное под номером F10920M обнаруживает репрезентативный N-концевой рестрицированный ответ на пептид DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), который соответствует аминокислотам 110 пептида AN 1792 и используется в качестве иммунизирующего антигена. Фиг. 20. Эпитопная карта. Нерестрицированный N-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус,отобранная на 175 день, была тестирована методом ELISA против состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся пептидов (SEQ ID NO: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности AN 1792. Животное под номером F10975F обнаруживает репрезентативный нерестрицированный Nконцевой ответ. Показана реактивность против двух N-концевых пептидов и одного С-концевого пептида DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), который соответствует аминокислотам 1-10 пептида AN 1792. Показана реактивность по отношению к двум N-концевым пептидам и одному С-концевому пептидуDAEFRHDSGY, который соответствует аминокислотам 1-10 пептида AN 1792. Определения Понятие "по существу, идентичный" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном линеаризованном сравнении, например при использовании программ GAP или BESTFIT на основе "пробелов" мол. массы, обнаруживают по крайней мере 65%-ную идентичность, предпочтительно 80-90%-ную идентичность, более предпочтительно по крайней мере 95%-ную идентичность или более(например, 99%-ную идентичность или более высокую). Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность служит в качестве референспоследовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и референс-последовательности помещают в компьютер, при необходимости задают последующие координаты и обозначают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Программа сравнения последовательностей затем вычисляет процент идентичности последовательностей, тестируемых по отношению к референспоследовательности, что основано на заданных параметрах программы. Для сравнения должно быть обеспечено оптимальное выравнивание последовательностей, например, при использовании локального алгоритма гомологии Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482(1981, алгоритма гомологии при выравнивании Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970, метода поиска сходства Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2444 (1988, компьютеризованных улучшений указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем визуальной оценки (см., в целом, Ausubel et al., см. выше). Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST,который описан Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990. Программное обеспечение для DLASTанализа публично доступно из Национального центра биотехнологической информации(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Обычно программные значения параметров по умолчанию могут быть использованы для осуществления сравнения последовательностей, хотя заказанные параметры также могут быть применены. Для аминокислотных последовательностей BLAST-программа использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу DLOSUM 62 (см.Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989. Для целей классификации аминокислотных замещений как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируются следующим образом. Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): gly, pro; группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами в пределах одной и той же группы. Неконсервативные замены подразумевают замену аминокислоты одной группы на замену аминокислоты другой группы. Заявленные в соответствии с настоящим изобретением терапевтические агенты обычно свободны от нежелательных контаминантов. Это означает, что агент обычно имеет по крайней мере примерно 50%-ную чистоту (вес./вес.), будучи, по существу, свободным от примесных белков и контаминантов. Иногда агенты имеют по крайней мере примерно 80%-ную чистоту (вес./вес.), более предпочтительно по крайней мере 90%-ную или примерно 95%-ную (вес./вес.) чистоту. Однако при использовании соответствующих методов очистки белков могут быть получены гомогенные пептиды, имеющие по крайней мере 99% чистоты (вес./вес.). Специфическое связывание между двумя молекулами называется аффинностью. Аффинность может составлять по крайней мере 106, 107, 108, 109 М-1 или 1010 М-1. Предпочтительна аффинность более 108 М-1. Понятие "антитело" или "иммуноглобулин" используется для обозначения интактных антител и их связывающих фрагментов. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфическое связывание с антигеном. К фрагментам относятся отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fabc- и Fv-фрагменты. Фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК или путем энзиматического или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Понятие "антитело" также включает одну или более цепей иммуноглобулинов,которые химически конъюгированы с другими белками или экспрессированы как белки слияния. Понятие антитело также означает биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелых/легких цепей и два различных связывающих сайта. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, в том числе слиянием гибридом или связыванием Fab'-фрагментов (см., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148,1547-1553 (1992.APP695, APP751 и АРР 770 обозначают, соответственно, полипептиды длиной 695, 751 и 770 аминокислот, кодируемые геном АРР человека (см. Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525(1988); и Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988. Аминокислоты амилоидного белка-предшественника человека (АРР) обозначены номерами в соответствии с последовательностью изоформы АРР 770. Сокращения А 39, А 40, А 41, А 42 и А 43 относятся к пептиду А, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43. Понятие "антиген" означает субстанцию, которая специфически связывается антителом. Понятие "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к участку антигена, на который отвечают Т- или В-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть сформированы как непрерывной последовательностью аминокислот, так и прерывающимися в линейной последовательности аминокислотами за счет четвертичного скручивания белка. Эпитопы, сформированные непрерывной последовательностью аминокислот, обычно сохраняют свою структуру при обработке денатурирующими растворителями, в то время как структура эпитопов, образованных в результате четвертичного скручивания белка, утрачивается при такой обработке. Эпитоп обычно включает по крайней мере 3 и более, по крайней мере 5 или 8-10 аминокислот, имеющих уникальную пространственную конформацию. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,vol. 66, Glenn E. Vorris, Ed. (1996. Антитела, которые распознают тот же самый эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью. Т-клетки распознают эпитопы, сформированные последовательными аминокислотами. Такой эпитоп содержит 9 аминокислот для CD8-клеток и около 1315 аминокислот для CD4-клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированыin vitro, основанными на измерении антиген-зависимой пролиферации по включению 3 Н-тимидина в праймированные Т-клетки в ответ на эпитоп (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994, по антигензависимому киллингу (исследование цитотоксических Т-лимфоцитов, Tigges et al., J. Immunol. 156, 39013910) или по секреции цитокинов. Понятие "иммунологический" или "иммунный" ответ означает развитие гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного на амилоидный пептид, в организме реципиента. Такой ответ может быть активным, индуцированным введением иммуногена, или пассивным, индуцированным введением антител или праймированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ обеспечивается презентацией полипептидных эпитопов вместе с молекулами МНС класса I или класса II для активации антиген-специфических CD4+ хелперных Т-клеток и/или CD8+ цитотоксических Т-клеток. Иммунный ответ может также включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток, базофилов, дендритных клеток,-4 021614 астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов или других клеток иммунной системы. Наличие опосредованного клетками иммунного ответа может быть определено в исследованиях пролиферации CD4+ Тклеток или цитотоксических Т-лимфоцитов (см. Burke, выше; Tigges, выше). Относительный вклад гуморального и клеточного ответов в протективный или терапевтический эффект иммуногена может быть установлен раздельным выделением антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и определением протективного или терапевтического эффекта у второго индивидуума."Иммуногенный агент" или "иммуноген" способен индуцировать иммунологический ответ при введении его млекопитающему, при необходимости вместе с адъювантом. Понятие "раздетый полинуклеотид" означает полинуклеотид, не находящийся в комплексе с коллоидным материалом. Иногда "раздетые полинуклеотиды" клонируют в плазмидном векторе. Понятие "адъювант" относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но когда вводится само по себе, не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ различным образом, в том числе за счет забора лимфоцитов, стимуляции В- или Т-клеток и стимуляции макрофагов. Понятие "пациент" относится к человеку и другому млекопитающему, которое получает профилактическое или терапевтическое лечение. Дезагрегированный или мономерный А представляет собой растворимый, мономерный пептид А. Одним из способов получения мономерного А является растворение лиофилизированного пептида в очищенном DMSO с обработкой ультразвуком. Полученный раствор центрифугируют для удаления каких-либо нерастворившихся образований. Агрегированный А представляет собой смесь олигомеров, в которой мономерные единицы удерживаются вместе посредством нековалентных связей. Конкуренцию между антителами определяют в исследовании, когда тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референс-антититела с общим антигеном, например А. Известны многочисленные модификации анализа конкурентного связывания, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноэссей (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноэссей(EIA), сэндвичный конкурентный анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253 (1983; твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см. Rirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986; твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвичевый анализ с меткой (см. Harlow andLane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988; твердофазный прямой RIA с меткой при использовании в качестве метки 125I (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15 (1988; твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (Cheung et al., Virology 176: 546-552 (1990; и прямойRIA с меткой (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990. Обычно такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеток, несущих такой антиген, немеченного тестируемого иммуноглобулина и меченного референс-иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой фазой или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицируемые в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно близким к эпитопу, с которым связывается референс-антитело. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном по крайней мере на 50 или 75%. Композиции и способы, включающие один или более из описанных выше элементов, могут включать и другие элементы, специфически не оговоренные. Например, композиция, которая содержит Апептид, относится к композиции, содержащей выделенный А-пептид и А-пептид как составляющую часть более длинной полипептидной последовательности. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияI. Общие положения Некоторые амилоидогенные заболевания и состояния характеризуются отложениями А-пептида,агрегированного в нерастворимую массу, в мозге больного. К таким заболеваниям относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя является симптомом болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, но может развиваться и сама по себе. Например, средней тяжести когнитивная недостаточность или связанная с возрастом потеря памяти наблюдается у больных, у которых еще не развилась в полной мере, а может быть никогда и не разовьется болезнь Альцгеймера. Средней тяжести когнитивная недостаточность может быть определена в соответствии с программой MinimentalState Exam и действующими рекомендациями. Указанные заболевания характеризуются наличием агрегатов А, имеющих -складчатую структуру и окрашивающихся красителем Конго Красный. Основной подход к предотвращению или лечению болезни Альцгеймера или других амилоидогенных болезней заключается в обеспечении развития иммунного ответа на компонент амилоидного отложения в организме больного, как описано в заявке WO 99/27944 (ссылочный материал). Настоящее изобретение подтверждает эффективность такого подхода. Однако оно принципиальным образом улучшает существующие реагенты и способы. В первую очередь, авторы настоящего изобретения локализовали предпочти-5 021614 тельные эпитопы А-пептида, против которых следует направить иммуногенный ответ. Идентификация предпочтительных эпитопов А-пептида привела к разработке агентов и способов, имеющих повышенную эффективность, редуцированные побочные эффекты и/или более легкое производство, приготовление и введение.II. Терапевтические агенты Иммуногенный ответ может быть активным, когда иммуноген вводится для индуцирования антител, взаимодействующих с А в организме больного, или пассивным, когда в организм больного вводятся готовые антитела, связывающие А. 1. Агенты, индуцирующие активный иммунный ответ Терапевтические агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к различным эпитопам А-пептидов. Предпочтительные агенты включают пептид А как таковой и его фрагменты. Также могут быть использованы варианты таких сегментов, аналоги и миметики природного Апептида, которые индуцируют образование антител и/или перекрестно реагируют с антителами к предпочтительным эпитопам А-пептида. А, также известный как -амилоидный пептид А 4 (см. US 4666829; Glenner and Wong, Biochem.Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984 представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. А образуется путем процессинга более крупного белка АРР с помощью двух ферментов, называемых - и -секретазами (см.Hardy, TINS 20, 154 (1997. Известные мутации АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, обнаруживаются в непосредственной близости от сайта - или -секретазы или в пределах А. Например,положение 717 является проксимальным по отношению к сайту расщепления -секретазой АРР с образованием А, а положение 670/671 является проксимальным по отношению к сайту расщепления секретазой. Полагают, что мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет нарушения реакций расщепления, за счет которых образуется А, так что увеличивается количество форм А, состоящих из 42/43 аминокислот. А обладает тем необычным свойством, что способен фиксировать и активировать как классический, так и альтернативный пути активации комплемента. В частности, он связывает C1q и обязательно С 3bi. Указанный комплекс обеспечивает связывание с макрофагами, что приводит к активации -клеток. Более того, С 3bi далее расщепляется и связывает CR2 на -клетках зависимым от Т-клеток образом с обеспечением активации указанных клеток в 10000 раз. Данный механизм способствует тому, что А генерирует избыточный иммунный ответ по отношению к другим антигенам. Известны различные формы природного А. К формам А человека относятся А 39, А 40, А 41,А 42 и А 43. Последовательности указанных пептидов и их взаимосвязь с предшественником АРР проиллюстрированы на фиг. 1 (Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997. Например, А 42 имеет следующую последовательность: А 41, А 40 и А 39 отличаются от А 42 отсутствием Ala, Ala-Ile, Ala-Ile-Val соответственно на С-концевом участке. А 43 отличается от А 42 наличием треонинового остатка на С-концевом участке. Иммуногенные фрагменты А имеют преимущество по сравнению с интактной молекулой А в заявленных способах по следующим причинам. Во-первых, поскольку только некоторые эпитопы в пределах А индуцируют необходимый для лечения болезни Альцгеймера иммуногенный ответ, эквивалентная доза массы фрагмента, содержащего такие эпитопы, обеспечивает большую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем доза интактного А. Во-вторых, определенные иммуногенные фрагменты А генерируют иммуногенный ответ против отложений амилоида без инициации значительного иммунного ответа против белка АРР, из которого образуется А. В-третьих, фрагменты А проще изготовить, чем интактный А, из-за более короткого размера. В-четвертых, фрагменты А не агрегируют таким образом, как интактный А, облегчая приготовление фармацевтических композиций и их применение. Некоторые иммуногенные фрагменты А имеют последовательность, состоящую по крайней мере из 2, 3, 5, 6, 10 и 26 последовательно расположенных аминокислот природного пептида. Некоторые иммуногенные фрагменты имеют более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непоследовательно расположенных остатков А. Фрагменты N-концевой половины пептида А предпочтительны. Предпочтительные иммуногенные фрагменты включают А 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение А 1-5, например, указывает на фрагмент, включающий остатки 1-5 А и утративший другие остатки А. Фрагменты, начинающиеся с остатков 1-3 А и заканчивающиеся остатками 7-11 А, особенно предпочтительны. Фрагмент А 1-12 также может быть использован, но менее предпочтителен. В некоторых способах фрагмент является N-6 021614 концевым фрагментом, другим, нежели фрагмент А 1-10. К другим менее предпочтительным фрагментам относятся фрагменты А 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 и 35-42. Указанные фрагменты требуют скрининга на активность в отношении предотвращения образования или разрушения отложений амилоида, как описано в примерах, до использования. Фрагменты, утратившие по крайней мере одну и иногда по крайней мере 5-10 С-концевых аминокислот по сравнению с природными формами А, используются в некоторых способах. Например, фрагмент, утративший 5 аминокислот С-концевого участка А 43, включает первые 38 аминокислот Nконцевого участка А. Другие компоненты амилоидных бляшек, например, синуклеин и его эпитопные фрагменты также могут быть использованы для индукции иммуногенного ответа. Если не указано иное, ссылка на А означает природную аминокислотную последовательность белка человека, описанную выше, а также на ее аналоги, включая аллельные, видовые и индуцированные варианты. Аналоги обычно отличаются от природно существующих пептидов по одному, двум или нескольким положениям, часто за счет консервативных замещений. Аналоги обычно обнаруживают по крайней мере 80 или 90%-ное сходство последовательностей в сравнении с последовательностями природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Nили С-концевых аминокислот по одному, двум или нескольким положениям. Например, природный остаток аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 А может быть заменен изоаспарагиновой кислотой. Примерами неприродных аминокислот являются D-аминокислоты, L-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, -N,N,Nтриметил-лизин, -N-ацетил-лизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и изоаспарагиновая кислота. Фрагменты и аналоги могут быть скринированы на профилактическую или терапевтическую эффективность при использовании моделей на трансгенных животных в сравнении с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо, как описано ниже. А, его фрагменты и аналоги могут быть синтезированы твердофазным методом или получены путем рекомбинантной экспрессии. Они также могут быть выделены из природных источников. Автоматические синтезаторы пептидов коммерчески доступны от различных поставщиков, таких как Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбинантная экспрессия может быть получена в бактериях, напримерE.coli, дрожжах, клетках насекомых или клетках млекопитающих (Методики рекомбинантной экспрессии описаны Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989. Некоторые формы А-пептида также доступны коммерчески (например, American Peptides Company,Inc., Sunnyvale, CA и California Peptide Research, Inc. Napa, CA). Терапевтические агенты также включают более длинные полипептиды, содержащие, например, активный фрагмент А-пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные агенты включают белки слияния, содержащие сегмент А, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которые индуцируют Т-хелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, таким образом, В-клеточный ответ против сегмента А. Такие полипептиды могут быть скринированы для анализа профилактической или терапевтической эффективности на моделях на животных по сравнению с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо,как описано ниже. Пептид А, аналог, активный фрагмент или другой полипептид может вводиться в ассоциированной или мультимерной форме или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры мономерных иммуногенных агентов. Кроме того, иммуногенный пептид, например фрагмент А, может быть представлен с помощью вируса или бактерии как части фармацевтической композиции. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный пептид, вводится в геном или эписому вируса или бактерии. Иногда нуклеиновая кислота вводится таким образом, что иммуногенный пептид экспрессируется как секретируемый белок или как белок слияния с внешним поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерии, так что пептид может быть представлен на поверхности вируса или бактерии. Вирусы или бактерии, используемые в таких способах, должны быть непатогенными или аттенуированными. Подходящие вирусы включают аденовирусы, HSV, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфавирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдовирусы, вирус вакцины и оспы домашней птицы. К подходящим бактериям относятся Salmonella и Shigella. Особенно полезным является слияние иммуногенного пептида с HbsAg HBV. К терапевтическим агентам также относятся пептиды и другие соединения, которые необязательно имеют существенную аминокислотную последовательность, сходную с таковой А, но обязательно являются миметиками А и вызывают аналогичный иммунный ответ. Например, любые пептиды и белки, формирующие -складчатую структуру, могут быть оценены на пригодность. Также могут быть использованы антиидиотипические антитела против моноклональных антител к А и другим амилоидогенным пептидам. Такие анти-Id антитела имитируют антиген и генерируют против него иммунный ответ (см. Essential Immunology Roit ed., Blackwell Scientific Publicftions, Palo Alto, 6th ed., p. 181). Агенты, отличные от А-пептидов, способны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более одного предпочтительных сегментов А, перечисленных выше (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7). Предпочтительно такие агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к одному из указанных сегментов и не направленный к другим сегментам А. Рандомизированные библиотеки пептидов или других соединений также могут быть подвергнуты скринингу на полезность. Комбинаторные библиотеки могут быть получены для различных типов соединений, которые могут быть синтезированы методикой "шаг за шагом". К таким соединениям относятся полипептиды, миметики бета-поворота, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные Nзамещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки указанных соединений могут быть сконструированы способом кодируемых синтетических библиотек (ESL), описаннымAffimax, WO 95/12608, Affimax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/080501, Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (каждая работа включена в настоящее описание в качестве ссылки). Пептидные библиотеки также могут быть получены с помощью методов фагового дисплея (см., например, Devlin, WO 91/18980). Комбинаторные библиотеки и другие соединения могут быть первоначально скринированы на пригодность путем определения их способности связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), для которых известна их специфичность по отношению к А или другим амилоидогенным пептидам. Например, первоначальный скрининг может быть осуществлен при использовании поликлональной сыворотки или моноклональных антител к А или его фрагментам. Затем соединения могут быть тестированы на связывание со специфическим эпитопом А например, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7. Соединения могут быть тестированы теми же самыми методами, которые описаны для картирования антительной эпитопной специфичности. Соединения, идентифицированные такими методами, затем анализируют на их способность индуцировать образование антител или реакционноспособных лейкоцитов, активных в отношении А или его фрагментов. Например, многочисленные разведения сыворотки могут быть тестированы в планшетах для микротитрования, предварительно "покрытых" А или его фрагментами, с помощью стандартного метода ELISA для выявления реакционноспособных антител к А или его фрагментам. Соединения могут быть тестированы на профилактическую и терапевтическую эффективность на трансгенных животных с амилоидогенным заболеванием, как описано в примерах. К таким животным относятся,например, мыши с мутацией 717 АРР (см. Games et al., см. выше) и мыши, несущие шведскую мутацию 670/671 АРР (см. McConlogue et al., US 5612486 и Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997. Аналогичная методика скрининга может быть использована для поиска других потенциальных агентов, взаимодействующих с аналогами А и более длинными пептидами, включающими фрагменты А, описанные выше. 2. Белковые носители Некоторые агенты для индукции иммунного ответа содержат необходимый эпитоп, генерирующий ответ против отложений амилоида, но сами по себе настолько малы, что не могут быть иммуногенными. В этом случае потенциальный пептидный иммуноген связывают с подходящим носителем, который обеспечивает иммунный ответ. Подходящие носители включают сывороточные альбумины, гемоцианин моллюска фиссуреллы, молекулы Ig, тиреоглобулин, овальбумин, токсоид столбняка или токсоид других патогенных бактерий, например бактерий дифтерии, Е. coli, холерного вибриона, Н. pylori или аттенуированные производные токсоида. К другим носителям относятся Т-клеточные эпитопы, которые связываются с многочисленными аллелями МНС, например, по крайней мере 75% всех аллелей МНС человека. Такие носители часто называют универсальными Т-клеточными эпитопами. Примерами универсальных Т-клеточных эпитопов являются следующие: Гемагглютинин вируса гриппа: HA307-319 HKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 43);PADRE (общие остатки выделены): AKXVAAVTLKAAA (SEQ ID NO: 44); Штамм малярии CS: Т 3 эпитоп EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 45); Поверхностный антиген вируса гепатита В: HBsAg19-28 FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 46); Белок теплового шока 65: hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 47); БЦЖ QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO: 48); Токсоид столбняка: ТТ 830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 49); Токсоид столбняка: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 50);HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 51). Другие носители для стимуляции или усиления иммунного ответа включают цитокинины, такие какIL-1, пептиды IL-1 и IL-1, IL-2,INF, IL-10, GM-CSF, и хемокины, такие как MIP1 ии RANTES. Иммуногенные агенты также могут быть связаны с пептидами, которые увеличивают транспорт между тканями (см. O'Mahony, WO 97/17613 и WO/17614). Иммуногенные агенты могут быть связаны с носителями путем химического перекрестного соединения. Методики связывания носителя с иммуногеном включают формирование дисульфидных связей при использовании N-сукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил 4-(N-8 021614 малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (если у пептида нет сульфгидрильной группы,обеспечивают добавление цистеинового остатка). Указанные реагенты создают дисульфидную связь между ними самими и цистеиновыми остатками одного белка и амидную связь между -амином лизина или другой свободной аминогруппой других аминокислот. Многочисленные агенты, формирующие дисульфид/амидные связи, описаны в Immun. Rev. 62, 185(1982). Другие бифункциональные сшивающие агенты формируют тиоэфирные связи, а не дисульфидные. Многие из таких агентов, формирующих тиоэфирные связи, коммерчески доступны и включают реакционноспособные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2-иодуксусной кислоты, 4-(N-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их объединения с сукцинимидом или 1-пуроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислотой,натриевой солью. Иммуногенные пептиды также могут быть экспрессированы как белки слияния с носителями (т.е. гетерологичными пептидами). Иммуногенный пептид может быть связан на амино-концевом участке,карбокси-концевом участке или обоих участках с носителем. Иногда в белке слияния могут быть множественные повторы иммуногенного пептида. С другой стороны, иммуногенный пептид может быть связан с многочисленными копиями гетерологичного пептида, например, как на С-концевом участке пептида. Некоторые пептидные носители служат для индукции хелперного Т-клеточного ответа на пептидноситель. Индуцированные хелперные Т-клетки, в свою очередь, индуцируют В-клеточный ответ против иммуногенного пептида, связанного с пептидом-носителем. Некоторые из заявленных агентов включают белок слияния, в котором N-концевой фрагмент А связан на своем концевом участке с пептидом-носителем. В случае таких агентов N-концевой остаток фрагмента А представляет собой N-концевой остаток белка слияния. Соответственно, такие белки слияния эффективны в отношении индукции антител, которые связываются с эпитопом, для которого необходимо, чтобы N-концевой остаток А находился в свободной форме. Некоторые заявленные агенты включают многочисленные повторы N-концевого сегмента А, связанного на С-концевом участке с одной или более копиями белка-носителя. N-концевой фрагмент А, включенный в такие белки слияния,иногда начинается с А 1-3 и заканчиваются А 7-11. А 1-7, А 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 предпочтительны в качестве N-концевого фрагмента А. Некоторые белки слияния включают различные N-концевые сегменты А в тандеме. Например, белок слияния может включать А 1-7 за А 1-3 и далее гетерологичный пептид. В некоторых белках слияния N-концевой сегмент А сливают на N-концевом участке с гетерологичным пептидным носителем. Тот же самый набор N-концевых сегментов А может быть использован для слияния по С-концу. Некоторые белки слияния включают гетерологичный пептид, связанный с Nконцевым участком N-концевого сегмента А, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительных N-концевых сегментов А в тандеме. Некоторые примеры белков слияния, подходящих для использования в изобретении, приведены ниже. Некоторые из указанных белков слияния включают сегменты А, связанные с эпитопами токсоида столбняка, такими как описанные в US 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Определенные белки слияния содержат сегменты А, связанные с пептидными носителями, описанными в US 5736142. Некоторые гетерологичные пептиды представляют собой универсальные клеточные эпитопы. В некоторых способах агент для введения представляет собой один белок слияния, состоящий из А-сегмента, связанного с гетерологичным сегментом в линейной конфигурации. В других способах агент представляет собой мультимерные белки слияния, выраженные формулой 2 х, где х представляет собой целое число 1-5. Предпочтительно х является 1, 2 или 3, значение 2 наиболее предпочтительно. Когда х=2, такой мультимер содержит 4 белка слияния, связанных в предпочтительной конфигурации, обозначенной как МАР 4 (см. US 5229490). Эпитопы А подчеркнуты. Конфигурация МАР 4 показана ниже. Разветвленные структуры получают путем инициирования пептидного синтеза по N-концевому амину и амину боковой цепи лизина. В зависимости от числа участков разветвления лизин включается в последовательность и обеспечивает разветвление; полученная в результате этого структура будет включать многочисленные концевые участки. В данном примере получают 4 идентичных N-концевых участка на разветвленном содержащем лизин ядре. Такая множественность во много раз усиливает отвечаемость распознающих В-клеток. Другие примеры белков слияния включают иммуногенные эпитопы (А выделены жирным шрифтом) Аналогичные или сходные белки-носители и способы связывания могут быть использованы для генерации иммуногенов с целью их применения для получения антител к А для пассивной иммунизации. Например, фрагмент А, связанный с носителем, может быть введен лабораторному животному для получения моноклональных антител к А.IV. Пациенты, подлежащие лечению Пациенты, подлежащие лечению, могут не обнаруживать симптомов заболевания, но иметь к нему предрасположенность, а могут обнаруживать явные симптомы заболевания. В случае болезни Альцгеймера к пациенту с предрасположенностью к ней или страдающему от нее может быть отнесен любой человек, если он живет достаточно долго. Таким образом, заявленные способы могут применяться профилактически по отношению ко всем людям без какой-либо оцени риска возникновения заболевания у конкретного человека. Заявленные способы особенно эффективны в тех случаях, когда пациенты имеют генетическую предрасположенность к болезни Альцгеймера. Это могут быть родственники людей с такой болезнью или индивидуумы, чья предрасположенность к болезни Альцгеймера установлена с помощью анализа генетических или биохимических маркеров. Генетическими маркерами предрасположенно- 10021614 сти к болезни Альцгеймера являются мутации в гене АРР, в особенности мутации в положениях 717 и 670 и 671, известных как мутации Hardy и Swedish соответственно (см. Hardy, TINS, выше). Другими маркерами риска являются мутации генов пресенилина PS1 и PS2, белок АроЕ 4, случаи заболевания болезнью Альцгеймера в семье, гиперхолестеролемия или атеросклероз. Индивидуумы, страдающие болезнью Альцгеймера, могут быть выявлены по характерному слабоумию, а также по наличию факторов риска, описанных выше. Кроме того, многочисленные диагностические тесты могут быть использованы для идентификации людей с болезнью Альцгеймера. Они включают, например, определение уровнейCSF тау и А 42. Увеличенные уровни тау и А 42 свидетельствуют о наличии болезни Альцгеймера. Индивидуумы, страдающие от болезни Альцгеймера, также могут быть выявлены в соответствии с критерием ADRDA, как описано в примерах. У пациентов с отсутствием симптомов лечение может начинаться в любом возрасте (например, 10,20, 30). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до того, как возраст пациента достигнет 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно включает введение множественных доз препарата в течение определенного периода времени. Лечение можно контролировать наблюдением за уровнем антител или активированным Т-клеточным или В-клеточным ответом на терапевтический агент (например, А-пептид) с течением времени. Если ответ спадает, назначают бустерную дозу. В случае потенциальных больных с синдромом Дауна лечение может начинаться в пренатальный период путем введения терапевтического агента в организм матери или сразу же после рождения.V. Режим лечения В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, чувствительному к болезни Альцгеймера или имеющему предрасположенность к данной болезни, в количестве, достаточном для элиминирования или редукции риска возникновения заболевания,снижения его тяжести, задержки возникновения заболевания, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникающих в процессе развития заболевания. В случае терапевтического применения композиции или лекарственные средства вводят пациенту, у которого возможно развитие заболевания, или с уже развившимся заболеванием в количестве, достаточном для лечения, или, по крайней мере, частичного элиминирования симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), в том числе его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникших в процессе развития заболевания. В некоторых способах введение агента, редуцирующего или элиминирующего миокогнитивную недостаточность у пациентов, у которых еще не наблюдаются развившиеся признаки болезни Альцгеймера. Количество препарата, адекватное для обеспечения терапевтического или профилактического лечения, определяется как терапевтическая или профилактическая эффективная доза. В случае профилактических и терапевтических схем агенты обычно вводят в нескольких дозах, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируется и повторные дозы могут быть назначены, если иммунный ответ начинает затихать. Эффективные дозы и композиции заявленного изобретения для лечения описанных выше состояний в большой степени зависят от многих различных факторов, в том числе способов введения, сайтамишени, физиологического состояния пациента, видовой принадлежности пациента (медицинское или ветеринарное применение), других принимаемых препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, однако заявленные способы лечения применимы и к другим млекопитающим. Дозы, используемые для лечения, следует титровать, чтобы оптимизировать их безопасность и эффективность. Количество иммуногена зависит от того, используется ли адъювант или нет, более высокие дозы не требуют введения адъюванта. Количество иммуногена для введения пациенту иногда варьирует от 1-500 мкг, однако обычно составляет 5-500 мкг на инъекцию при введении человеку. Иногда используется более высокая доза (1-2 мг) в расчете на инъекцию. Количество иммуногена также зависит от соотношения числа иммуногенных эпитопов и массы иммуногена в целом. Обычно 10-3-10-5 микромолей иммуногенного эпитопа используют в расчете на микрограмм иммуногена. Число инъекций варьирует существенным образом от одной в день до одной в год и одной в декаду. Доза иммуногена, вводимая пациенту в день, составляет более чем 1 мкг и обычно более чем 10 мкг, если она вводится совместно с адъювантом, и более 10 мкг, если адъювант не используется. Обычная схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями в определенные временные интервалы, например шестинедельные. Другая схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями 1, 2 и 12 месяцев спустя. Другая схема включает инъекции каждые два месяца в течение дальнейшей жизни. Альтернативно, бустерные инъекции могут быть нерегулярными в соответствии с контролем иммунного ответа. Для пассивной иммунизации антителом дозы варьируют от около 0,0001 до 100 мг/кг и, более часто, от 0,01 до 5 мг/кг веса тела. Например, доза может составлять 1 мг/кг веса тела или 10 мг/кг веса тела или в пределах 1-10 мг/кг. Примерная схема лечения включает введение препарата один раз каждые две недели или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными связывающими специфичностями вводят подкожно, причем доза вводимого антитела указана выше. Антитело обычно вводят множественными дозами. Интервалы между отдельными дозами могут составить неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, что зависит от уровней антитела к А в крови пациента. В некоторых способах доза подбирается таким образом, чтобы уровень антитела в плазме крови достиг 1-1000 мкг/мл и иногда 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело может быть введено в форме композиции с поддерживаемым высвобождением; в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения в большой степени зависят от периода полужизни антитела в организме пациента. В целом, антитела человека обладают наибольшим периодом полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела другой видовой принадлежности (нечеловеческие антитела). Доза и частота введения варьируют в большой степени от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических случаях используются относительно низкие дозы, которые вводят относительно нечасто в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение всю оставшуюся жизнь. В терапевтических случаях используются относительно высокие дозы, вводимые в относительно короткие интервалы времени до тех пор, пока не закончится или не остановится прогрессивное развитие заболевания, или предпочтительно до тех пор, пока у пациента частично или полностью не исчезнут симптомы заболевания. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, варьируют от около 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30-300 мкг ДНК в расчете на одного пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100, или более, вирионов на дозу. Агенты, индуцирующие иммунный ответ, могут вводиться парентерально, местно, внутривенно,орально, подкожно, внутриартериально, интраперитонеально, интраназально, внутримышечно или внутричерепным образом для профилактического и/или терапевтического лечения. Наиболее обычный способ введения иммуногенного агента - это подкожный, хотя и другие способы также эффективны. Другой наиболее распространенный способ введения - это внутримышечная инъекция, которую обычно осуществляют в плечо или ногу. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в определенную ткань, где аккумулированы отложения амилоида, например, внутричерепным образом. Внутримышечная инъекция или внутривенное вливание предпочтительны для введения антител. В некоторых способах определенные терапевтические антитела инъецируют непосредственно под черепную коробку. Иногда антитела вводят в форме композиции с поддерживаемым высвобождением или с помощью устройства,например Medipad. Заявленные агенты иногда могут быть введены в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере, частично эффективны в лечении амилоидогенной болезни. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых отложения амилоида обнаруживаются в мозге, заявленные агенты также могут вводиться совместно с другими агентами, которые увеличивают поступление терапевтически значимых соединений через гематоэнцефалический барьер. Заявленные иммуногенные агенты, такие как пептиды, иногда вводят в сочетании с адъювантом. Для генерации иммунного ответа в сочетании с пептидом, например пептидом А, могут вводиться различные адъюванты. Предпочтительные адъюванты усиливают иммунный ответ на иммуноген и не вызывают его конформационных изменений, которые влияют на качественный характер ответа. К таким адъювантам относятся гидроксид алюминия и фосфат алюминия 3 De-0-ацилированный монофосфорил липид A (MPL) (см. GB 2220211). Стимулон QS-21 представляет собой тритерпеновый гликозид или сапонин, выделенный из коры дерева Quillaja Saponaria Molina, растущего в Южной Америке (см. Kensilet al., в Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. PowellNewman, Plenum Press, NY,1995); US 5057540 (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA. К другим адъювантам относятся эмульсии типа масло в воде (например, сквален или арахисовое масло), часто в комбинации с иммунными стимуляторами, такими как монофосфорил липид А (см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997. Другим адъювантом является CpG (WO 98/40100). Альтернативно, А может быть связан с адъювантом. Однако такое связывание не должно существенным образом изменять конформацию А так,чтобы не влиять на природу возникающего иммунного ответа. Адъюванты могут использоваться в качестве компонентов терапевтической композиции вместе с активным агентом или могут вводиться отдельно, до, одновременно или после введения терапевтического агента. Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (алюминиевые квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Такие адъюванты могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как MPL или 3-DMP,QS-21, полимерные или мономерные аминокислоты, например полиглутаминовая кислота или полилизин. Другой класс адъювантов включает водно-масляные эмульсии, которые могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамил-пептиды (например, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr - VDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-Dизоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2' дипальмитоилsn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), N-ацетил-глюкозаминил-N-ацетилмурамил-LAl-D-изоглу-L-Ala-дипальмитокси пропиламид (DTP-DPP)терамид или другие компоненты клеточной стенки бактерий. К указанным эмульсиям относятся: а) MF 59 (WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% твина 80 и 0,5% спана 80 (часто содержащего различные количества МТР-РЕ) и представляющий собой субмикронные частицы, сформированные с помощью специального устройства (Model 110Y, Microfluidics, Newton MA); б) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% блок-полимера плюроника L 121 и thr-MDP,сформированного в виде субмикронной эмульсии или в виде эмульсии с более крупными частицами (полученными с помощью устройства Vortex), и в) Ribi система на основе адъюванта (RAS), (Ribi Immunochem., Hamilton, МТ), содержащая 2% сквалена, 0,2% твина 80 и один или более компонентов бактериальной стенки, выбранных из группы,включающей монофосфориллипид А (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и скелетон клеточной стенки бактерий (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox). Другой класс предпочтительных адъювантов включает сапониновые адъюванты, такие как стимулон (QS-21, Aquila, Framingham, MA) или частицы,полученные на его основе, например, ISCOMS (иммуностимулирующие комплексы) и ISCOMATRIX. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA). К адъювантам относятся и цитокины, такие как интерлейкины (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF). Адъювант может быть введен вместе с иммуногеном в составе одной композиции или же до, одновременно или после введения иммуногена. Иммуноген и адъювант могут быть упакованы вместе и храниться в одной ампуле или же быть упакованы в отдельные ампулы и смешиваться перед использованием. Обычно иммуноген и адъювант упаковывают вместе с аннотацией, раскрывающей необходимое терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы отдельно, упаковка обычно содержит инструкции по их смешиванию до использования. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности иммуногенной композиции, содержащей адъювант, способа введения, схемы дозирования и эффективности адъюванта в отношении видовой принадлежности иммунизируемого пациента. В случае человека фармацевтически приемлемым адъювантом является такой адъювант, который был протестирован и утвержден к применению на людях соответствующими инстанциями. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку. Предпочтительны алюминиевые квасцы, MPL и QS21. Одновременно могут быть использованы два или более различных адъюванта. Предпочтительные комбинации включают алюминиевые квасцы и MPL, квасцы и QS-21, MPL и QS-21, a также квасцы, QS21 и MPL. Также может быть использован неполный адъювант Фрейнда (Chang et al., Advanced Drag Delivery Reviews 32, 173-186 (1998, иногда в комбинации с какими-либо из квасцов, QS-21 и MPL, а также комбинации всех указанных веществ. Заявленные агенты часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент и другие фармацевтически приемлемые компоненты (см. Remington's PharmaceuticalScience (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensylvania, 1980. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического назначения. Композиции также могут включать, в зависимости от нужного состава, фармацевтически приемлемые нетоксичные носители или разбавители, которые широко используются для доставки композиций при введении человеку и животным. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность композиции. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатный-буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические неиммуногенные стабилизаторы и т.д. Фармацевтические композиции также могут включать более крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (например, латексную сефарозу (ТМ, агароза, целлюлоза и т.д., полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (например, капли масел или липосомы). Кроме того, указанные носители могут функционировать в качестве иммуностимулирующих агентов (т.е. адъювантов). Для парентерального применения заявленные агенты могут вводиться дозами в виде инъекций раствора или суспензии активного вещества в физиологически приемлемом разбавителе вместе с фармацевтически приемлемым носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как водные масла,физиологический раствор, глицерол или этанол. Кроме того, в состав композиций могут входить дополнительные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, сурфактанты, вещества, поддерживающие рН, и т.д. Другими компонентами композиций могут быть масла животного или растительного происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, а также синтетические и минеральные масла. В целом, предпочтительны гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль в качестве жидких носителей, в особенности для растворов, предназначенных для инъекций. Антитела могут вводиться в форме препаратов с поддерживаемым высвобождением активного ингредиента (инъекции типа "депо" или имплантаты). Примером антительной композиции может быть композиция, содержащая 5 мг/мл антител в водном буфере, включающем 50 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl (рН компо- 13021614 зиции доводят до 6,0 с помощью HCl). Обычно композиции готовят как пригодные для инъекций, как в виде жидких растворов или суспензий, так и в виде твердых форм, предназначенных для растворения или суспендирования в заранее приготовленных средствах доставки. Препарат может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактидные, полигликолидные или сополимерные, для усиления адъювантного эффекта, как описано выше (см. Langer, Science 249, 1527 (1990) и Hanes, Advanced DrugDelivery Reviews 28, 27-119 (1997. Заявленные агенты могут вводиться в форме депо-инъекций или имплантатов, которые имеют такой состав, чтобы обеспечить как поддерживаемое, так и пульсовое высвобождение активного ингредиента. Другие способы введения препаратов включают оральный путь, интраназальный, легочный, а также применение суппозиториев и чрезкожных пластырей. Для суппозиториев носителями и связывающими агентами могут быть, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть сформированы из смесей, содержащих активный ингредиент в количестве 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Оральные составы включают наполнители, например фармацевтической степени чистоты маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, целлюлозу и карбонат натрия. Указанные композиции могут быть в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с поддерживаемым высвобождением и содержать 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Местное применение обеспечивается путем чрезкожной или внутрикожной доставки. Такое применение может сопровождаться совместным использованием холерного токсина или его производных или субъединиц, лишенных токсичности, а также других бактериальных токсинов (см. Glenn et al., Nature 391, 851 (1998. Совместное введение может быть достигнуто использованием компонентов в виде смеси или в форме связанных молекул, полученных путем химического перекрестного сшивания или экспрессии белков слияния. Альтернативно, чрезкожная доставка может обеспечиваться при использовании кожных аппликаторов или трансферосом (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998.VI. Методы диагностики Изобретение относится к способам детекции иммунного ответа против пептида А у пациента,страдающего от болезни Альцгеймера или восприимчивого к такой болезни. Способы особенно полезны для мониторинга курсом лечения, назначенным больному. Указанные способы могут быть использованы для наблюдения за терапевтическим лечением пациентов с симптомами заболевания, а также профилактическим лечением бессимптомных пациентов. Такие способы применяются для контроля как активной иммунизации (например, за титром антител, образующихся в ответ на введение иммуногена), так и пассивной иммунизации (например, измерение уровня введенных антител). 1. Активная иммунизация Некоторые способы подразумевают определение базового значения иммунного ответа у пациента до введения дозы терапевтического агента и сравнение его со значением, полученным после лечения. Существенное увеличение (большее чем обычный предел экспериментальной ошибки в повторяющихся измерениях одного и того же образца, выражаемый как одно стандартное отклонение от среднего при таких измерениях) значения иммунного ответа свидетельствует о том, что лечение было позитивным(т.е. введение агента обеспечило иммунный ответ или усилило его). Если показатель иммунного ответа существенно не изменился или не увеличился, это свидетельствует о негативном лечении. В целом, у пациентов, которые подвергаются первоначальному курсу лечения иммуногенным агентом, ожидается усиление иммунного ответа, которое затем выходит на плато. Введение агента обычно продолжается до тех пор, пока иммунный ответ не перестает усиливаться. Поддержание уровня плато говорит о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза, или частота введения препарата. В других способах для контрольной популяции определяют контрольное (т.е. среднее и стандартное отклонение) значение иммунного ответа. Обычно индивидуумы в контрольной популяции не получают предварительного лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента после введения терапевтического агента сравнивают затем с контрольным значением. Существенное увеличение значений иммунного ответа по сравнению с контролем (например, на величину, большую чем одно стандартное отклонение от среднего значения) свидетельствует о положительном лечении. Отсутствие существенного увеличения или снижения сигналов указывает на негативное лечение. Введение агента обычно продолжают в течение периода времени, пока иммунный ответ увеличивается по сравнению с контрольным значением. Как и в ранее описанных способах, поддержание значений иммунного ответа на уровне плато по сравнению с контрольным свидетельствует о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза или частота введения препарата. В других способах определяют контрольное значение иммунного ответа (т.е. среднее и стандартное отклонение) для контрольной популяции индивидуумов, которые ранее подвергались лечению и чей иммунный ответ вышел на плато в результате лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента сравнивают с контрольным значением. Если значение иммунного ответа у пациента существенно не отличается (т.е. не выше одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение может быть остановлено. Если значение иммунного ответа у пациента существенно ниже контрольного значения,продолжается введение терапевтического агента. Если значение иммунного ответа у пациента постоянно находится ниже контрольного уровня, даже при изменении схемы лечения, может быть показано, например, использование адъюванта. В других способах у пациента, который не получает лечения в данное время, но прошел курс предварительного лечения, постоянно контролируют иммунный ответ для того, чтобы определить, не требуется ли повторение лечения. Измеренное значение иммунного ответа пациента можно сравнить со значением иммунного ответа, выявленного у пациента после предварительного курса лечения. Существенное снижение значения иммунного ответа по сравнению с предварительно измеренным (на величину, большую чем обычная ошибка повторных измерений одного и того же образца) свидетельствует о том, что лечение следует возобновить. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением (среднее + стандартное отклонение), измеренным для популяции пациентов после предварительного курса лечения. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением, измеренным для популяции пациентов, подвергнутых профилактическому лечению, у которых отсутствуют симптомы заболевания, или со значением для популяции пациентов, подвергнутых терапевтическому лечению, у которых снижены симптомы заболевания. Во всех случаях существенное снижение величины иммунного ответа по сравнению с контрольным (т.е. более чем на величину одного стандартного отклонения) свидетельствует о том, что лечение пациента следует возобновить. Образец ткани для анализа обычно представляет собой кровь, плазму, сыворотку крови, слизь или спинномозговую жидкость, полученные от пациента. Образцы анализируют на показатели иммунного ответа к любой форме пептида А, обычно А 42. Иммунный ответ может быть определен по наличию,например, антител или Т-клеток, которые специфически связываются с пептидом А. Методы ELISA для определения антител, специфических к А, описаны в примерах. Способы выявления реакционноспособных Т-клеток описаны выше (см. раздел "Определения"). В некоторых способах иммунный ответ определяют по разрушению бляшек, как описано в разделе III выше. В таких случаях образец ткани пациента тестируют, обеспечивая его контактирование с отложениями амилоида (например, полученными от мышей PDAPP) и фагоцитарными клетками, несущими рецепторы Fc. Последующее разрушение амилоидных отложений подвергается контролированию. Наличие и продолжительность такого иммунного ответа свидетельствует о том, что существующий уровень антител эффективен для очищения от отложений А тестируемого образца ткани, полученного от больного. ПримерыI. Профилактическая эффективность А по отношению к болезни Альцгеймера Указанные примеры описывают введение пептида А 42 трансгенным мышам, сверхэкспрессирующим АРР с мутацией в положении 717/APP717VF), за счет чего предрасположены к развитию нейропатологии, характерной для болезни Альцгеймера. Получение и свойства таких мышей (PDAPP мыши) описаны (Games et al., Nature, см. выше). Указанные животные в гетерозиготной форме обнаруживают тенденцию к отложению А, начиная с 6 месяцев жизни. К 15 месяцам жизни у них обнаруживаются уровни отложения А, эквивалентные таковым, которые свойственны болезни Альцгеймера. МышейPDAPP инъецируют агрегированным А 42 или фосфатным буферным раствором (PBS). Агрегированный А 42 выбирают потому, что он способен индуцировать образование антител к множественным эпитопам А. А. Методы 1. Источник мышей 30 Гетерогенных самок мышей PDAPP были произвольно разделены на следующие группы: 10 животных инъецировали агрегированным А 42 (одна мышь умерла при перевозке), 5 животных инъецировали PBS/адъювантом или PBS и 10 животных служили контролем. 5 Животных инъецировали пептидами, происходящими из последовательности сывороточного амилоидного белка (SAP). 2. Приготовление иммуногенов Получение агрегированного А 42: 2 млг А 42 (US Peptides Inc, lot K-42-12) растворяют в 0,9 мл воды и доводят до 1 мл добавлением 0,1 мл 10 PBS. Смесь обрабатывают на установке Vortex и инкубируют в течение ночи при 37 С для агрегации пептида. Любую часть неиспользованного А хранят в виде сухого лиофилизированного порошка при -20 С до следующей инъекции. 3. Осуществление инъекций Для каждой инъекции 100 мкг агрегированного А 42 в PBS в расчете на мышь эмульгируют в соотношении 1:1 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в конечном объеме 400 мкл эмульсии для первой иммунизации, за которой следует бустерное введение того же самого количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) через 2 недели. Две дополнительные дозы препарата в IFA вводят с месячны- 15021614 ми интервалами. Последующие иммунизации осуществляют с месячными интервалами в 500 мкл PBS. Инъекции осуществляют интраперитонеально (i.p.). Инъекции PBS проводят по той же самой схеме и мышей инъецируют смесью PBS/адъювант в соотношении 1:1 (400 мкл) в расчете на мышь или 500 мкл PBS. Инъекции SAP также проводят по аналогичной схеме при дозе 100 мкг на инъекцию. 4. Титрование крови мышей, препарирование тканей и иммуногистохимия Указанные способы описаны ниже в разделе "Материалы и методы". В. Результаты Мышей PDAPP инъецируют агрегированным А 42, пептидами SAP или PBS. Группу мышейPDAPP оставляют без инъекций в качестве положительного контроля. Титры антител у мышей, инъецированных А 42, оценивают каждый месяц, начиная с 4-й бустерной инъекции, до тех пор пока животным не исполнится год. Мышей умерщвляют через 13 месяцев. Во все анализируемые точки времени восемь из девяти мышей, инъецированных агрегированным А 42, обнаруживают высокий титр антител,который остается высоким на протяжении серии инъекций (титры превышают величину 1/10000). У девятой мыши обнаруживается низкий, но измеряемый титр, составляющий примерно 1/1000 (фиг. 1, табл. 1). У мышей, инъецированных SAP, титр составляет 1/100-1/30000 по отношению к данному иммуногену и только у одной мыши титр равен 1/100000. Кровь мышей, инъецированных PBS, титруют против агрегированного А 42 на 6-й, 10-й и 12-й месяцы. При разведении сыворотки контрольных животных 1/100, титруемой против агрегированного А 42, только в одну точку времени фоновое значение титра было превышено более чем в 4 раза, а во все временные точки значение титра было меньше фонового более чем в 4 раза (табл. 1). SAPспецифический ответ не определялся в указанные точки времени во всех титрах, меньших 300. Таблица 1 У 7 из 9 мышей, получавших агрегированный А 1-42, не выявлялись отложения амилоида в головном мозге. В противоположность этому в головном мозге мышей, иммунизированных SAP и PBS, обнаруживались значительные отложения амилоида в гиппокампе, так же как во фронтальной и в поясной извилинах. Характер отложений аналогичен таковым у контрольных необработанных животных с характерным включением уязвимых подучастков, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. У одной мыши среди животных, инъецированных А 1-42, наблюдалось существенное снижение отложений амилоида, ограниченное гиппокампом. Изолированная бляшка была идентифицирована у другой мыши, инъецированной А 1-42. Количественный анализ отложений амилоида в гиппокампе подтверждает существенное их снижение у обработанных А 42 (AN 1792) животных (фиг. 2). Средние значения отложений амилоида в группе животных, получавших PBS (2,22%), и группе контрольных необработанных животных (2,65%) были значительно выше, чем у животных, иммунизированных AN 1792 (0,00%, р=0,0005). В противополож- 16021614 ность указанному среднее значение для группы, иммунизированной SAP-пептидами (SAPP), составляло 5,74%. В мозговой ткани необработанных контрольных животных многочисленные отложения амилоида визуализируют с помощью А-специальных моноклональных антител (мАТ) 3D6 в гиппокампе, а также в ретросплениальной коре. Сходный характер амилоидных отложений также наблюдается у мышей, иммунизированных SAPP или PBS (фиг. 2). Кроме того, в последних трех группах выявилось характерное включение уязвимых подучастков в головном мозге, которое всегда наблюдается при болезни Альцгеймера, такое как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. Если в головном мозге не обнаруживалось отложений А, то в них отсутствовали и невритические бляшки, которые обычно визуализируются у мышей PDAPP с помощью антитела человека 8 Е 5 к АРР. У животных всех оставшихся групп (мыши, инъецированные SAP, PBS и необработанные мыши) в головном мозге выявлялись многочисленные невритические бляшки, характерные для необработанных животных. Незначительное число невритических бляшек обнаруживалось у одной мыши, инъецированнойAN 1792, и у второй такой мыши выявлялся определенный кластер дистрофического неврита. Анализ гиппокампа (фиг. 3) показал, что действительная элиминация дистрофического неврита у обработаннойAN 1792 мыши (среднее значение 0,00%) была сравнима с таковой животных-реципиентов PBS (среднее значение 0,25%, р=0,0005). Астроцитоз, характерный для ассоциированного с бляшками воспаления, также отсутствовал в головном мозге животных, входящих в группу, инъецированную А 1-42. В головном мозге мышей других групп содержались многочисленные и кластеризованные GFAP-позитивные астроциты, типичные для ассоциированного с бляшками глиоза. Набор срезов с реакцией на GFAP был противоокрашен Тиофлавином С для локализации отложений А. GFAP-позитивные астроциты были ассоциированы с бляшками А у животных, получавших SAP, PBS и контрольных мышей. Подобная ассоциация не обнаруживалась у не имеющих бляшек обработанных А 1-42 мышей, в то время как минимальный, ассоциированный с бляшками глиоз, идентифицировали у одной мыши, инъецированной AN 1792. Анализ ретросплениальной коры, приведенный на фиг. 4, показывает, что редукция числа астроцитов была значительной со средним значением 1,56% для группы, обработанной AN 1792, по сравнению со средним значением, превышающим 6%, для группы, иммунизированной пептидами SAP, PBS или необработанных животных (р=0,0017). Данные, полученные при исследовании мышей, инъецированных А 1-42 и PBS, показывают, что ассоциированная с бляшками иммунореактивность МНС II отсутствует у животных, которым инъецировали А 1-42, что соответствует утрате связанного с А воспалительного ответа. Срезы головного мозга мышей также подвергали реакции с мАТ, специфичными к моноклональным антителам к МАС-1, белку клеточной поверхности. МАС-1 (CD11b) представляет собой белок семейства интегринов и существует в гетеродимерной форме с CD18. Комплекс CD11b/CD18 присутствует на моноцитах, нейтрофилах и природных киллерных клетках (Mak and Simard). Резидентный МАС-1 реактивный тип клеток в головном мозге скорее всего является клетками микроглии, что основано на сходной фенотипической морфологии МАС-1 иммунореактивных срезов. Мечение МАС-1, ассоциированное с бляшками, было ниже в головном мозге животных, обработанных AN 1792, по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS, что соответствовало утрате индуцированного А воспалительного ответа. С. Выводы Отсутствие А-бляшек и реактивных нейрональных и глиотических изменений в головном мозге мышей, инъецированных А 1-42, свидетельствует о том, что существенно малые отложения амилоида образуются в головном мозге или не образуются вовсе, а патологические последствия этого, такие как глиоз и невритическая патология, отсутствуют. У PDAPP мышей, обработанных А 1-42, обнаруживается практически точно такая же утрата патологических признаков, что и у контрольных животных. Таким образом, инъекции А 1-42 высокоэффективны в предотвращении отложений амилоида или очищении от А ткани головного мозга, а также в элиминировании последующих нейрональных и воспалительных дегенеративных изменений. Соответственно, введение пептида А может иметь как превентивное значение, так и терапевтическое значение в борьбе с болезнью Альцгеймера.II. Изучение дозозависимого ответа Самок мышей Swiss Webster возраста 5 недель (6 мышей в группе) иммунизировали 300, 100, 33,11, 3, 7, 1, 2, 0,4 или 0,13 мкг А в CFA/IFA интраперитонеально. Три дозы вводили с двухнедельными интервалами, затем через месяц вводили четвертую дозу. Первую дозу эмульгируют в CFA, а оставшиеся дозы - в IFA. Кровь забирают на 4-7 дни после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. У животных из трех групп, которых иммунизировали дозами антигена, составляющими 11, 33 или 300 мкг, дополнительно забирали кровь примерно в месячные интервалы в течение четырех месяцев после четвертой иммунизации для контроля за снижением антительного ответа в зависимости от дозы иммуногена. Указанные животные получали последнюю пятую иммунизацию через семь месяцев после начала исследований. Их умерщвляли одну неделю спустя для измерения антительного ответа на AN 1792 и для осуществления токсикологических анализов. Снижающийся дозозависимый ответ наблюдали в интервале от 300 до 3,7 мкг и никакого ответа не наблюдали при двух более низких дозах. Средние титры антител составляли около 1:1000 после введения трех доз и около 11-300 мкг антигена (см. фиг. 5). Титры антител существенным образом возросли при введении наиболее низкой дозы; у всех животных после третьей иммунизации (геометрический средний титр антител (GMT) увеличился в 5-25 раз). Низкий антительный ответ выявляется даже при дозах 0,4 мкг. При дозах 1,2 мкг титры были сравнимы и имели значения GMT около 1000. При четырех наиболее высоких дозах значение GMT составляло около 25000, за исключением дозы 33 мкг, при которой обнаруживалось минимальное значение GMT, составляющее 3000. После четвертой иммунизации увеличение титра было более умеренным для большинства групп. Выявлялся явный дозовый ответ в группах, которым вводили низкие дозы антигена (от 0,14 до 11 мкг), причем при дозе 0,13 мкг антитела не выявлялись, а при дозе 11 мкг значение GMT составляло 36000. Опять же титры при наиболее высоких дозах от 11 до 300 мкг были сравнимы между собой и попадали в группу одной величины. Таким образом, после двух иммунизации титр антител зависел от вводимой дозы антигена в пределах ее значений от 0,4 до 300 мкг. К третьей иммунизации титры антител при наиболее высоких четырех дозах были сравнимы между собой и оставались на плато после дополнительной иммунизации. Через месяц после четвертой иммунизации титры были в 2-3 раза выше в группе животных, получавших 300 мкг антигена, чем измеренные в крови, забранной через 5 дней после иммунизации (фиг. 6). Указанное наблюдение позволяет предположить, что пик анамнестического антительного ответа приходится на более позднее время, чем 5 дней после иммунизации. Более умеренное (50%) увеличение титра наблюдается в это время в группе, получавшей 33 мкг антигена. В группе, получавшей 300 мкг антигена,через два месяца после введения последней дозы значения GMT резко снижаются примерно на 70%. Через месяц снижение происходит менее круто до 45% (доза 33 и 11 мкг). Таким образом, скорость снижения титров циркулирующих антител после прекращения иммунизации является бифазовой с резким падением в первый месяц после пикового ответа, за которым следует более умеренное падение титра. Титры антител и кинетика антительного ответа у мышей Swiss Webster сходна с таковой у молодых гетерозиготных трансгенных мышей PDAPP, иммунизированных параллельно. Дозы, эффективные для индукции иммунного ответа у человека, обычно сходны с дозами, эффективными у мышей.III. Скрининг терапевтической эффективности в случае установившейся болезни Альцгеймера Данное исследование проводят для тестирования иммуногенных агентов на активность в отношении элиминации или реверсии нейропатологических проявлений болезни Альцгеймера (БА) у старых животных. Иммунизации пептидом А из 42 аминокислот (AN 1792) начинают в то время, когда амилоидные бляшки уже обнаруживаются в головном мозге мышей PDAPP. Во время периода исследования у необработанных мышей PDAPP развиваются многочисленные нейродегенеративные изменения, которые свойственны БА (Games et al., см. выше и Johnson-Wood et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997.Отложение А в амилоидных бляшках ассоциируется с дегенеративным нейрональным ответом, в основе которого лежит появление аберрантных аксональных и дендритных элементов, называемое дистрофическим невритом. Отложения амилоида, которые окружены дистрофическими невритными структурами, называются бляшками. У мышей с БА и мышей PDAPP дистрофический неврит имеет различную глобулярную структуру, является иммунореактивным по отношению к панели антител, распознающих АРР и элементы цитоскелета, и проявляется комплексом субклеточных дегенеративных изменений на ультраструктурном уровне. Указанные признаки обеспечивают связанные с заболеванием избирательные и воспроизводимые измерения формирования невритических бляшек в головном мозге мышей PDAPP. Дистрофический нейрональный компонент невритических бляшек у мышей PDAPP легко визуализируется при использовании специфических антител к АРР человека (моноклональное антитело 8 Е 5) и измеряется с помощью компьютерного анализа. Таким образом,помимо определения эффекторов AN 1792 на формирование амилоидных бляшек авторы изобретения контролировали влияние такого лечения на развитие невритической дистрофии. Астроциты и клетки микроглии не являются нейрональными клетками, которые ответственны за нейрональное повреждение, и отражают степень такого повреждения. GFAP-позитивные астроциты и МНС II-позитивные клетки микроглии обычно выявляются при БА, и их активация возрастает по мере увеличения тяжести заболевания. Таким образом, авторы изобретения контролировали развитие реакционноспособных астроцитов и клеток микроглии у мышей, обработанных AN 1792. А. Материалы и методы Сорок восемь гетерозиготных самок мышей PDAPP возраста от 11 до 11,5 месяцев, полученных отCharls River, случайным образом разделили на две группы: 24 мыши были иммунизированы 100 мкг AN 1792 и 24 мыши были иммунизированы PBS. В каждом случае антиген смешивали с адъювантом Фрейнда. Затем группы животных опять разделили по достижении ими возраста, составляющего примерно 15 месяцев. В этом возрасте около половины животных каждой группы умерщвляют (n=10 и 9 соответственно), остальных животных продолжали иммунизировать до достижения ими примерно 18 месяцев (n=9 и 12 соответственно). Всего 8 животных (5, получавших AN 1792, и 3, получавших PBS) погибли во вре- 18021614 мя эксперимента. Помимо иммунизированных животных в эксперимент были включены необработанные мыши возраста одного года (n=10) и 18 месяцев (n=10) для сравнения в ELISA измеренных уровней А и АРР в головном мозге. Животные возраста одного года были также включены в иммуногистохимический анализ. Методология эксперимента изложена в примере 1, если специально не оговаривается иное. Для получения антигена для шести иммунизаций до достижения мышами 15-месячного возраста используют пептиды US lot 12 и California Peptides lot MEO339. Пептиды California lot MEO339 и lot MEO439 используют для трех дополнительных иммунизаций, которые осуществляют между 15 и 18 месяцами жизни. Для иммунизации 100 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в CFA или IFA или PBS до конечного объема 400 мкл. Первую иммунизацию осуществляют в CFA и последние 4 дозы в PBS без добавления адъюванта. В целом, осуществляют 9 иммунизации в течение 7 месяцев по двухнедельной схеме для первых трех доз с последующим 4-недельным интервалом для остальных инъекций. Четырехмесячную группу обработки умерщвляют в возрасте 15 месяцев, она получает только первые 6 иммунизаций. В. Результаты 1. Эффекты обработки AN 1792 на отложения амилоида Результаты влияния обработки AN 1792 на кортикальные отложения амилоида показаны на фиг. 7. Среднее значение кортикальных отложений амилоида составляет 28% в группе необработанных животных 12-месячного возраста (мыши PDAPP), соответствующее количеству бляшек у мышей в начале исследования. В 18 месяцев амилоидные отложения усиливались более чем в 17 раз, достигая значения 4,87% у мышей, получавших PBS, в то время как у мышей, получавших AN 1792, они существенным образом уменьшались до величины 0,01%, значительно меньшей, чем у необработанных животных 12 месячного возраста и у животных 15- и 18-месячного возраста, получавших PBS. Отложения амилоида существенно редуцировались у реципиентов, получавших AN 1792, возраста 15 месяцев (96% редукции,р=0,003) и 18 месяцев (99% редукции, р=0,0002). Обычно кортикальные отложения амилоида у мышей PDAPP начинаются во фронтальной и ретросплениальной извилинах (RSC) и прогрессируют в вентрально-латеральном направлении и охватывают темпоральную и энторинальную извилины (ЕС). Немного амилоида обнаруживается в ЕС 12-месячных мышей (или не обнаруживается совсем). Примерно в этом возрасте впервые начинают введение AN 1792. Через 4 месяца после введения AN 1792 отложения амилоида существенно уменьшаются в RSC, и прогрессирующее вовлечение ЕС в этот процесс действительно элиминируется при лечении с помощьюAN 1792. Позднее наблюдение показывает, что введение AN 1792 полностью останавливает развитие отложений амилоида, которые в норме охватывают темпоральную и вентральную извилины, а также предотвращает возможную реверсию отложений амилоида в RSC. Действительные эффекты введения AN 1792 на развитие кортикальных отложений амилоида у мышей PDAPP далее были показаны на 18-месячных мышах, которых обрабатывали в течение 7 месяцев. Практически полное отсутствие кортикального амилоида обнаруживается у мышей, инъецированных AN 1792, вместе с полным отсутствием диффузных бляшек и редукцией компактных отложений. 2. Лечение AN 1792 ассоциируется с клеточными и морфологическими изменениями Обнаружено, что популяция А-позитивных клеток находится в участках мозга, которые обычно содержат отложения амилоида. Существенно, что в головном мозге реципиентов AN 1792 обнаруживается совсем немного внеклеточных кортикальных амилоидных бляшек или они вообще не обнаруживаются. Большая часть А-иммунореактивности связана с клетками с дольчатой и агрегированной сомой. Фенотипически указанные клетки соответствуют активированным моноцитам или клеткам микроглии. Они обладают иммунореактивностью при связывании с антителами, распознающими лиганды, которые экспрессируются активированными моноцитами и клетками микроглии (МНС II и CD 11b), и иногда ассоциированы со стенкой или просветом кровеносных сосудов. Сравнение близлежащих срезов, меченных антителами, специфичными к А и МНС-II, показывает, что оба класса антител выявляют сходные структуры в этих клетках. Детальный анализ головного мозга AN 1792-обработанных животных обнаруживает, что МНС II-позитивные клетки ограничены определенной областью отложений амилоида, которые еще остаются у данных животных после лечения. Если проводится фиксация, то клетки не обладают иммунореактивностью с антителами, распознающими лиганды Т-клеток (CD3, CD3e), В-клеток(CD45RA, CD45RB) или общий лейкоцитарный антиген (CD45), но сохраняют реактивность по отношению к антителу, выявляющему лейкосиалин (CD43), которое перекрестно реагирует с моноцитами. Такого типа клетки не обнаруживаются ни у одного из животных, получавших PBS. У мышей PDAPP неизменно развиваются амилоидные отложения во внешнем молекулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Отложения формируют четкую полосу с отверстиями, классический подучасток которой содержит амилоидные бляшки при БА. Характерное появление таких бляшек у мышей, получавших PBS, соответствует тому, что свойственно необработанным мышам PDAPP. Отложения амилоида состоят как из диффузных, так и из компактных бляшек, формирующих непрерывную по- 19021614 лосу. В противоположность указанному во многих случаях в головном мозге мышей, получавших AN 1792, указанный характер отложений существенным образом изменен. Амилоидные отложения гиппокампа уже не содержат диффузного амилоида, и полосы отложений разрушены и носят прерывистый характер. Вместо указанных выше структур выявляются многочисленные нетипичные пятнистые структуры, которые реагируют с антителами к А; некоторые из таких структур содержат клетки с амилоидом. МНС II-позитивные клетки часто выявляются в непосредственной близости от внеклеточного амилоида в головном мозге обработанных AN 1792 животных. Характер взаимосвязи А-позитивных клеток с амилоидом очень схож между собой у некоторых животных, получавших AN 1792. Распределение указанных моноцитарных клеток ограничено близостью отложений амилоида, и они практически полностью отсутствуют в других участках мозга без А-бляшек. Конфокальная микроскопия МНС II- и А-меченых срезов показывает, что бляшки сформированы многочисленными моноцитарными клетками. Количественный анализ МНС II- и MAC I-меченых срезов головного мозга выявил тенденцию к увеличению иммунореактивности в RSC и гиппокампе у обработанных AN 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими PBS, что усиливает значимость измерений реактивности MAC-I в гиппокампе. Указанные результаты являются показателем активного опосредованного клетками разрушения амилоида в участках мозга с амилоидными бляшками. 3. Эффекты AN 1792 на уровни А: определения методом ELISA(а) Кортикальные уровни У необработанных мышей PDAPP средний уровень общего А в коре в возрасте 12 месяцев составляет 1,600 нг/г, который увеличивается до 8,700 нг/г к 15 месяцам (табл. 2). В 18 месяцев уровень А достигает 22,000 нг/г, т.е. увеличивается в 10 раз во время течения эксперимента. У животных, получавших PBS, в возрасте 15 месяцев уровень общего А составляет 8,600 нг/г, который увеличивается до 19,000 нг/г в возрасте 18 месяцев. В противоположность указанному у обработанных AN 1792 животных уровень общего А уменьшен на 81% в возрасте 15 месяцев (1,600 нг/г) по сравнению с животными, получавшими PBS. Существенно меньший уровень (р=0,0001) общего А (5,200 нг/г) обнаруживается у 18 месячных животных при сравнении групп, получавших AN 1792 и PBS (табл. 2), отражая 72%-ное снижение уровня А, который в противном случае был бы обнаружен. Сходные результаты были получены при сравнении уровней А 42 в коре, показывая, что у животных, получавших AN 1792, содержание А 42 существенно ниже, но в этом случае различие между группами обработки AN 1792 и PBS было значительным как в 15-месячном (р=0,04), так и 18-месячном (р=0,0001) возрасте (табл. 2). Таблица 2. Средние уровни А (нг/г) в коре(б) Уровни А в гиппокампе У необработанных мышей PDAPP медианные уровни общего А в гиппокампе в 12-месячном возрасте составляет 15,000 нг/г, которые возрастают до 51,000 нг/г в возрасте 15 месяцев и далее до 81,000 нг/г в возрасте 18 месяцев (табл. 3). Сходным образом у PBS иммунизированных мышей значения общего А составляли 40,000 нг/г и 65,000 нг/г в 15 и 18 месяцев соответственно. У иммунизированных AN 1792 животных уровни общего А были ниже, составляя 25,000 нг/г и 51,000 нг/г в соответствующие точки времени, равные 15 и 18 месяцам. Значение уровня в группе, получавшей AN 1792, в возрасте 18 месяцев было существенно ниже, чем в группе, получавшей PBS (р=0,0105; табл. 3). Измерение А 42 давало сходные результаты, показывая, что уровни в обработанной AN 1792 группе были существенно ниже, чем в группе, получавшей PBS (39,000 нг/г против 57,000 нг/г соответственно; р=0,002) по достижении 18-месячного возраста (табл. 3).(с) Церебеллярные уровни У 12-месячных необработанных мышей PDAPP медианный церебеллярный уровень общего А составляет 15 нг/г (табл. 4). В возрасте 15 месяцев указанное значение возрастает до 28 нг/г и к 18 месяцам достигает 35 нг/г. У обработанных PBS животных средние уровни общего А составляли 21 нг/г в возрасте 15 месяцев и 43 нг/г в возрасте 18 месяцев. У животных, получавших AN 1792, общий уровень А составляет 22 нг/г в возрасте 15 месяцев и существенно уменьшается (р=0,002) в возрасте 18 месяцев (25 нг/г), что соответствует значениям уровней в группе, получавшей PBS (табл. 4). Таблица 4. Средние уровни А (нг/г) в мозжечке р=0,0018 4. Эффекты лечения с помощью AN 1792 на уровни АРР АРР- и полноразмерная молекула АРР содержат всю или часть А последовательности и, таким образом, потенциально способны генерировать направленный к AN 1792 иммунный ответ. До настоящего времени было показано, что незначительное увеличение уровней АРР представляет собой нейропатологическое увеличение у мышей PDAPP. В коре уровни APP-/FL (полная длина) или АРР- практически не изменяются под действием лечения с ожиданием того, что уровень АРР- снизится до 19% через 18 месяцев в группе животных, обработанных AN 1792, по сравнению с животными, получившими PBS. Уровни АРР через 18 месяцев у обработанных AN 1792 существенно не отличаются от 12-месячного и 15-месячного уровней АРР у необработанных животных и 15-месячного уровня у животных, получавших PBS. Во всех случаях уровни АРР оставались в тех пределах, которые в норме обнаруживаются у мышей PDAPP. 5. Эффекты лечения AN 1792 на нейродегенеративную и глиотическую патологию Отложения невритических бляшек существенно редуцируются во фронтальной коре обработанныхAN 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими PBS, к 15 (84%; р=0,03) и 18 (55%; p=0,01) месяцам жизни (фиг. 8). Средние значения отложений невритических бляшек возрастают с 0,32 до 0,49% в группе, получавшей PBS, между 15 и 18 месяцами жизни. Это контрастирует со значительным снижением развития невритических бляшек у животных, получавших AN 1792, где среднее значение отложений невритических бляшек составляет 0,05 и 0,22% в 15 и 18 месяцев соответственно. При иммунизациях AN 1792 высокотолерантные и реакционноспособные астроциты также существенно уменьшаются в числе у животных, обработанных PBS и AN 1792, по сравнению с животными,обработанными PBS, к 15 (56%; р=0,011) и 18 (39%; р=0,028) месяцам жизни (фиг. 9). Средние значения числа астроцитов в процентах к группе животных, получавших PBS, возрастают между 15 и 18 месяцами жизни от 4,26 до 5,21%. Обработка AN 1792 супрессирует развитие астроцитов в обе временные точки на 1,89 и 3,2% соответственно. Это позволяет предположить, что нейропиль не повреждается в процессе разрушения бляшек. 6. Антительный ответ Как описано выше, 11-месячные гетерозиготные PDAPP мыши (N=24) получали серии из 5 иммунизаций по 100 мкг AN 1792 в адъюванте Фрейнда, вводимых интраперитонеально в недели 0, 2, 4, 8 и 12. Шестую иммунизацию осуществляют одним PBS (без адъюванта Фрейнда) на 16-ю неделю. В качестве негативного контроля используют группы из 24 трансгенных мышей, совпадающих по возрасту с теми, которым вводят PBS, эмульгированный в тех же самых адъювантах и по той же самой схеме, что и опытным животным. Животных обескровливали через 3-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй дозы. Антительный ответ на AN 1792 измеряют методом ELISA. Средние геометрические значения титров (GMT) для животных, которые были иммунизированы AN 1792, составляют около 1900,- 21021614 7600, 45000 после второй, третьей и последней (шестой) доз соответственно. Никаких А-специфических антител не выявляется у контрольных животных после шестой иммунизации. Примерно половину животных обрабатывают в течение дополнительных трех месяцев, проводя иммунизации примерно на 20, 24 и 27 неделе. Каждую из указанных доз вводят в PBS без добавления адъюванта Фрейнда. Средние значения титров антител остаются без изменений за указанный период времени. В действительности титры антител остаются стабильными от четвертого до восьмого забора крови, соответствующих периоду, охватывающему время от пятой до девятой инъекции. Для определения того, ассоциированы ли А-специфические антитела, образующиеся в ответ на иммунизацию (которые определяются анализом сыворотки AN 1792-обработанных мышей), с отложениями амилоида в головном мозге, срезы головного мозга мышей, обработанных AN 1792 и PBS, подвергают воздействию антител, специфичных к IgG мыши. В противоположность контролю (PBS) Абляшки в головном мозге животных, получавших AN 1792, оказались покрытыми эндогенными IgG. Такое различие между двумя группами можно было наблюдать в группах как 15-, так и 18-месячных животных. Особенно неожиданным было отсутствие метки в группе животных, получавших PBS, несмотря на наличие значительных отложений амилоида у данных животных. Указанные результаты свидетельствуют о том, что иммунизация синтетическим белком А генерирует образование антител, которые распознают и связывают in vivo А в амилоидных бляшках. 7. Клеточно-опосредованный иммунный ответ Селезенки удаляют у девяти 18-месячных мышей PDAPP, иммунизированных AN 1792, и двенадцати таких же мышей, иммунизированных PBS, через 7 дней после девятой иммунизации. Спленоциты выделяют и культивируют в течение 72 ч в присутствии А 40, А 42 или А 40-1 (белок обратного порядка). В качестве позитивного контроля используют митоген Con А. Оптимальные ответы получают при концентрации белка 1,7 мкМ. Клетки, полученные ото всех 9 животных, обработанных AN 1792,пролиферируют в ответ на белки А 1-40 или А 1-42 с эквивалентным уровнем включения метки в оба белка (фиг. 10, верхняя панель). На белок А 40-1 ответ не обнаруживается. Клетки от контрольных животных не отвечают ни на какой-либо из белков А (фиг. 10, нижняя панель). С. Выводы Результаты данного исследования показывают, что иммунизация AN 1792 мышей PDAPP воздействует на существующие отложения амилоида и предотвращает их прогрессивное образование, а также замедляет последующие нейропатологические изменения, возникающие с возрастом в головном мозге мышей PDAPP. Иммунизация AN 1792, по существу, задерживает развитие амилоидных отложений в структурах, которые в норме чувствительны к амилоидозу. Таким образом, введение пептида А имеет терапевтическую эффективность в лечении болезни Альцгеймера.IV. Скрининг фрагментов А 100 Мышей PDAPP возраста 9-11 месяцев иммунизировали 9 различными фрагментами АРР и А для того, чтобы определить, какие эпитопы вызывают эффективный ответ. Животным интраперитонеально инъецировали 9 различных иммуногенов и один контрольный, как описано выше. Иммуногены включали четыре А-пептидных конъюгата человека 1-12, 13-28, 32-42, 1-5 (все соединены с антителами овцы к Ig мыши посредством цистеиновой связи); полипептид АРР из аминокислот 592-695, агрегированный А 1-40 человека, агрегированный А 25-35 человека и агрегированный А 42 грызунов. Агрегированные А 42 и PBS были использованы как положительный и отрицательный контроли соответственно. В группу обработки входило 10 мышей. Титры антител контролировали, как описано выше, и мышей умерщвляли в конце 4-го месяца инъекций. После умерщвления животных осуществляли гистохимический и токсикологический анализ, а также оценивали уровни А. А. Материалы и методы 1. Получение иммуногенов Получение связанных А-пептидов: четыре пептидных конъюгата А человека (аминокислотные остатки 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42: каждый пептид конъюгирован с антителами овцы к IgG мыши) были получены путем добавления искусственного остатка цистеина к пептиду А при использовании перекрестно-сшивающего агента сульфо-EMCS. Производные А-пептида были синтезированы со следующими конечными аминокислотными последовательностями. В каждом случае локализация встроенного остатка цистеина обозначена подчеркиванием. Производное пептида А 13-28 также имеет два остатка глицина,добавляемых предварительно к карбокси-концевому цистеину, как указано Для осуществления реакции связывания диализуют 10 мг Ig овцы к Ig мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories) в течение ночи против 10 мМ натрий-боратного буфера, рН 8,5. Затем диализован- 22021614 ное антитело концентрируют до объема 2 мл при использовании пробирки Amicon Centriprep. Затем 10 мг сульфо-EMCS N(-малеимидокупроилокси)сукцинимида (Molecular Sciences Co.) растворяют в 1 мл деионизованной воды. Сорокакратный молярный избыток сульфо-EMCS добавляют по каплям при перемешивании к Ig овцы против Ig мыши и далее раствор дополнительно перемешивают 10 мин. Активированные антитела овцы к IgG мыши очищают и заменяют буфер, пропуская их через 10-мл колонку для гель-фильтрации (Pierce Presto Column, Pierce Chemicals), уравновешенную 0,1 M NaPO4, 5 мМ ЭДТА, рН 6,5. Фракции, содержащие антитела, идентифицируют при поглощении 280 нм, далее их объединяют и разводят до примерной концентрации 1 мг/мл, принимая 1,4 мг на OD за коэффициент экстинкции. Сорокакратный молярный избыток пептида А растворяют в 20 мл 10 мМ NaPO4, рН 8,0, за исключением пептида А 33-42, 10 мг которого сначала растворяют в 0,5 мл DMSO и затем разводят в 20 мл буфера с 10 мМ NaPO4. Каждый из растворов пептида добавляют к 10 мл активированных Ig овцы против Ig мыши и инкубируют на качалке при комнатной температуре 4 ч. Полученные конъюгаты концентрируют до конечного объема менее 10 мл с помощью пробирки Amicon Centriprep и затем диализуют против PBS и буфера для замены буфера и далее удаляют свободный пептид. Конъюгаты пропускают через фильтры с размером пор 0,22 мкм для стерилизации и далее разделяют на фракции по 1 мг и хранят при замораживании до -20 С. Концентрации конъюгатов определяют при использовании анализа с BCA (PierceChemicals) и IgG лошади для получения стандартной кривой. Конъюгацию контролируют по увеличению мол. массы конъюгированных пептидов, связанных с активированными антителами овцы к IgG мыши. Конъюгат А 1-5 и антител овцы к IgG мыши представляет собой объединение двух конъюгатов, которые получены в виде отдельных препаратов. 2. Получение агрегированных А пептидов Пептиды 1-40 (AN 1528; California Peptides Inc., Lot MEO541), 1-42 (AN 1792; California PeptidesInc., Lots MEO339 и МЕО 439), 25-35 человека и 1-42 (California Peptides Inc., Lot MEO218) грызунов заново солюбилизировали для получения каждого набора инъекций из лиофилизированного порошка, который хранили высушенным при -20 С. Для указанных целей 2 мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизованной воды и смесь обрабатывают на устройстве Vortex для получения относительно однородного раствора или суспензии. На этой стадии из всех пептидов растворяется только AN 1528. 100-мкл Аликвоты 10PBS (1PBS: 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфат натрия, рН 7,5) затем добавляют к AN 1528 для преципитации. Суспензию опять перемешивают на вортексе и инкубируют в течение ночи при 37 С для использования на следующий день. Получение белка рВ 6: плазмиду экспрессии, кодирующую рВ 6, белок слияния, содержащий 100 аминокислотную N-концевую лидерную последовательность полимеразы бактериофага MS-2 и аминокислоты 592-695 АРР (АРР), конструируют, как описано Oltersdorf et al. (J. Biol. Chem. 265, 4492-4497(1990. Плазмиду трансфицируют в E.coli, и белок экспрессируется после индукции промотора. Бактерии лизируют в 8 М мочевине и рВ 6 частично очищают препаративным SDS PAGE. Фракции, содержащие рВ 6, идентифицируют путем Вестерн-блоттинга при использовании поликлональных антител кролика к рВ 6, объединяют, концентрируют с помощью пробирки Fmicon Centriprep и диализуют противPBS. Чистоту препарата оценивают путем окрашивания кумасси синим гелей, полученных при электрофорезе; она составляет около 5-10%. В. Результаты и обсуждение 1. План исследования Сто гетерозиготных трансгенных мышей PDAPP (самцов и самок) в возрасте от 9 до 11 месяцев получают от Charles River Laboratory и Taconic Laboratory. Мышей разбивают на 10 групп для иммунизации различными участками А или АРР в сочетании с адъювантом Фрейнда. Животных группируют по максимально возможному совпадению пола, возраста, родителей и источника происхождения. Иммуногены включают четыре пептида А на основе последовательностей белков человека 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42,которые конъюгированы с антителами овцы к IgG мыши; четыре агрегированных А (пептиды человека 1-40 (AN 1528), 1-42 (AN 1792) и 25-35 и пептид грызунов 1-42), а также полипептид слияния, обозначенный рВ 6, содержащий аминокислотные остатки 592-695 АРР. Десятую группу животных иммунизируют PBS с адъювантом в качестве контроля. Для каждой иммунизации 100 мкг каждого А пептида в 200 мкл PBS или 200 мкг АРР производного рВ 6 в том же самом объеме PBS или только PBS эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в полном адъюванте Фрейнда (CFA) до конечного объема 400 мкл для первой иммунизации, за которой следует бустерная инъекция того же самого количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) для последующих четырех доз и PBS для финальной дозы. Иммунизации осуществляют интраперитонеально по двухнедельной схеме для первых трех доз и далее - по схеме с интервалом в один месяц. Кровь у животных забирают через 4-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй дозы для измерения титров антител. Животных умерщвляют примерно через одну неделю после введения последней дозы. 2. Уровни А и АРР в головном мозге Через четыре месяца после иммунизации различными пептидами А или АРР производным удаляют головной мозг у перфузированных физиологическим раствором животных. Одно полушарие подготавливают для иммуногистохимического анализа, а второе используют для количественного определения уровней А и АРР. Для измерения концентрации различных форм бета-амилоидного пептида и белка-предшественника амилоида полушарие рассекают и гомогенаты гиппокампа, коры и участков мозжечка помещают в 5 М гуанидин. Далее их разводят и уровень амилоида или АРР количественно определяют путем сравнения с последовательными разведениями стандартов А-пептида или АРР известной концентрации методом ELISA. Средняя концентрация общего А в контрольной группе животных, иммунизированных PBS, в 5,8 раз выше в гиппокампе, чем в коре (среднее значение 24,318 нг/г ткани гиппокампа по сравнению со значением 4,221 нг/г в коре). Средний уровень общего А в мозжечке контрольных животных (23,4 нг/г ткани) был примерно в 1000 раз меньшим, чем в гиппокампе. Указанные уровни были сходны с таковыми, о которых было предварительно сообщено в отношении гетерозиготных трансгенных мышей PDAPP данного возраста (Johnson - Woods et al., 1997, см. выше). В коре головного мозга животных экспериментальных групп средние уровни общего А и А 1-42 существенно отличались от соответствующих значений в контрольной группе (р 0,05). Указанные животные получали AN 1792, А 1-42 грызунов или А 1-5 пептидные конъюгаты, как показано на фиг. 11. Средние уровни общего А у них были редуцированы на 75, 79 и 61% соответственно. Не было выявлено значимых корреляций между титрами А-специфических антител и уровнями А в коре головного мозга ни в одной из групп животных. В гиппокампе среднее уменьшение общего А, ассоциированное с лечением AN 1792 (46%,р=0,0543), было не таким значительным, как наблюдаемое в коре головного мозга (75%, р=0,0021). Однако величина уменьшения была намного больше в случае гиппокампа, чем в случае коры головного мозга; общее снижение составляло 11,186 нг/г ткани в гиппокампе против 3,171 нг/г ткани коры. В случае животных, получавших А 1-42 грызунов или А 1-5, среднее значение общих уровней А было редуцировано на 36 и 26% соответственно. Однако, принимая во внимание небольшие размеры групп и высокую вариабельность уровней амилоидного пептида от животного к животному в пределах обеих групп, указанное снижение нельзя считать значительным. Когда уровни А 1-42 измеряли в гиппокампе,ни одно из индуцированных лечением снижений уровней не было значительным. Таким образом, обусловленные меньшими отложениями А в коре изменения в данном участке мозга являются более чувствительным индикатором эффектов лечения. Изменения уровней А, измеренные методом ELISA в коре,были сходными, но не идентичными по сравнению с результатами иммуногистохимического анализа(см. ниже). Общий А измеряли также в мозжечке, участке мозга, который в норме минимальным образом подвержен патологии БА. Ни одно из средних значений концентраций А в какой-либо группе животных, иммунизированных различными пептидами А или АРР производным, не отличались от таковых у животных контрольной группы при измерении в мозжечке. Этот результат позволяет предположить, что непатологические уровни А не подвергаются воздействию лечения. Концентрацию АРР также определяли методом ELISA в коре головного мозга и мозжечке обработанных и контрольных мышей. Использовали два различных анализа АРР. Первый, называемый АРР/FL, определяет как АРР- (, секретируемая форма АРР, которая отщепляется от А-последовательности) и полноразмерные формы (FL) АРР, в то время как второй анализ определяет только АРР. В противоположность связанному с лечением уменьшению А у животных обработанных групп уровни АРР оставались неизменными у всех обработанных животных по сравнению с контрольными. Эти результаты свидетельствуют о том, что иммунизации А пептидами не истощают АРР; скорее лечение является специфичным по отношению к А. В целом, общие уровни А и А 1-42 были значительно редуцированы в коре головного мозга при лечении конъюгатами AN 1792, А 1-42 грызунов или А 1-5. В гиппокампе общий уровень А был значительно редуцирован только при введении AN 1792. Не было других существенных изменений в уровнях А или АРР в гиппокампе, коре или мозжечке при осуществлении лечения. 3. Гистохимический анализ Головной мозг животных шести групп подготавливают для иммуногистохимического анализа, три группы животных иммунизируют конъюгатами А пептидов А 1-5, А 1-12 и А 13-28; две группы иммунизируют агрегатами полноразмерного А AN 1792 и AN 1528, а одна группа служит контролем, ее иммунизируют PBS. Результаты анализа отложений амилоида в срезах головного мозга указанных животных приведены на фиг. 12. Наблюдается существенное снижение отложений амилоида в участках коры животных трех обработанных групп по сравнению с контрольными животными. Наибольшее уменьшение отложений амилоида наблюдается в группе животных, получавших AN 1792, где среднее значение такого уменьшения составляет 97% (р=0,001). Существенное снижение также наблюдается у животных, обработанных AN 1528 (95%, р=0,005) и пептидным конъюгатом А 1-5 (67%, р=0,02). Результаты, полученные при количественном определении общего А или А 1-42 методом ELISA и гистохимическим анализом отложений амилоида, некоторым образом различаются. Обработка AN 1528 оказывает существенное воздействие на уровень отложений амилоида в коре при измерении количественным гистохимическим анализом, однако не на концентрацию общего А в том же самом участке мозга при исследовании ELISA. Различие между двумя указанными результатами, скорее всего, обусловлены особенностями исследований. Гистохимический анализ срезов определяет только нерастворимые агрегаты А в бляшках. В противоположность этому ELISA определяет все формы А, как растворимые, так и нерастворимые, мономерные и агрегированные. Поскольку патология заболевания, повидимому, ассоциируется с нерастворимыми формами А в составе бляшек, гистохимический анализ может быть более чувствителен для выявления эффектов лечения. Однако, поскольку ELISA является более быстрым и легким методом, он очень полезен для скрининга. Более того, он может показать, что связанная с лечением редукция А больше в отношении связанного с бляшками, чем общего А. Для определения того, реагируют ли индуцированные иммунизацией А-специфические антитела с отложениями амилоида в головном мозге, набор срезов мозга обработанных и контрольных животных подвергают воздействию антител, специфичных к IgG мыши. В противоположность группе, иммунизированной PBS, А-содержащие бляшки "покрыты" эндогенными IgG у животных, иммунизированных пептидными конъюгатами А 1-5, А 1-12 и А 13-28, а также полноразмерными агрегатами А, AN 1792 и AN 1528. Данным методом не анализировали головной мозг животных, иммунизированных другими А-пептидами или АРР пептидом рВ 6. 4. Измерение титров антител У мышей забирали кровь через 4-7 дней после последней иммунизации, начиная со второй иммунизации, в целом 5 раз. Титры антител измеряли как титры А 1-42-связывающих антител при использовании сэндвичевого ELISA на пластиковых многолуночных планшетах, покрытых А 1-42. Как показано на фиг. 13, пик титра антител наблюдается после четвертой дозы для тех четырех иммунизированных составов, которые обусловливают наиболее высокие титры AN 1792-специфических антител: AN 1792(пик GMT: 94,647), AN 1528 (пик GMT: 88,231), конъюгат А 1-12 (пик GMT: 47,216) и А 1-42 грызунов (пик GMT: 10,766). Титры в указанных группах снижаются немного после пятой и шестой доз. Для оставшихся пяти иммуногенов титры достигают пикового значения после 5-й и 6-й доз и составляют намного меньшую величину по сравнению с таковой для 4 групп с наибольшими титрами: конъюгат А 1-5(пик GMT: 2,356), рВ 6 (пик GMT: 1,183), конъюгат А 33-42 (пик GMT: 658), А 25-35 (пик GMT: 125). Титры антител также измеряли против гомологичных пептидов при использовании того же самого сэндвичевого ELISA с набором иммуногенов; такие группы иммунизировали А 1-5, А 13-28, А 25-35, А 33-42 или А 1-42 грызунов. Указанные титры были практически теми же самыми, что и измеренные против А 1-42, за исключением А 1-42 грызунов, когда титры антител против гомологичного иммуногена были примерно в 2 раза выше. Величина титра AN 1792-специфических антител у индивидуальных животных или средние значения у животных обработанных групп не коррелировали с эффективностью измерения, как редукция А в коре. 5. Лимфопролиферативный ответ Зависимую от А пролиферацию измеряли при использовании клеток селезенки, полученных через одну неделю после последней, шестой иммунизации. Свежесобранные клетки, 105 на лунку, культивируют в течение 5 дней в присутствии А 1-40 в концентрации 5 мкМ для стимуляции. Клетки животных семи из десяти групп также культивируют в присутствии обратного пептида А 40-1. В качестве положительного контроля дополнительные клетки культивировали с Т-клеточным митогеном, РНА, а в качестве отрицательного контроля клетки культивировали без пептида. Лимфоциты большинства животных пролиферируют в ответ на РНА. Не было существенных ответов на обратный пептид А 40-1. Клетки животных, иммунизированных более длинными агрегированными А-пептидами, AN 1792, А 1-42 грызунов и AN 1528, пролиферируют интенсивно при стимуляции А 1-40 с наибольшим cpm у реципиентов AN 1792. Клетки одного животного в каждой из групп,иммунизированных конъюгатом А 1-12, конъюгатом А 13-28 и А 25-35, пролиферируют в ответ на А 1-40. Животные оставшихся групп, получавших конъюгат А 1-5, А 33-42, конъюгат рВ 6 или PBS,не обнаруживали симулированного А ответа. Указанные результаты суммированы в табл. 5 ниже. Приведенные результаты показывают, что AN 1792 и AN 1528 стимулируют сильный Т-клеточный ответ, наиболее вероятно фенотипа CD4+. Отсутствие А-специфичного Т-клеточного ответа у животных, иммунизированных А 1-5, неудивительно, поскольку пептидные эпитопы, распознаваемые CD4+ Т-клетками, обычно имеют в длину около 15 аминокислот, в то время как более короткие пептиды иногда бывают менее эффективны. Таким образом, основные эпитопы хелперных Т-клеток в случае четырех конъюгированных пептидов скорее всего входят в состав партнера по конъюгации IgG, а не в участок А. Эта гипотеза поддерживается тем, что обнаруживается очень низкая пролиферативная отвечаемость у животных в каждой из указанных групп обработки. Поскольку конъюгат А 1-5 эффективен в отношении существенной редукции уровня А в головном мозге при явном отсутствии А-специфических Тклеток, ключевой эффекторный иммунный ответ, индуцированный при иммунизации данным пептидом,основан на образовании антител. Утрата Т-клеточного ответа и низкий антительный ответ на пептид слияния рВ 6, включающий аминокислоты 592-695 АРР, в том числе все остатки А, могут быть обусловлены низкой иммуногенностью этого конкретного препарата. Низкая иммуногенность агрегата А 25-35 скорее всего связана с тем,что пептид очень небольшой для того, чтобы содержать действенный Т-клеточный эпитоп, способствующий индукции антительного ответа. Если этот пептид конъюгировать с белком-носителем, он, возможно, станет более иммуногенным.V. Получение поликлональных антител для пассивной защиты 125 Нетрансгенных мышей иммунизировали 100 мкг А 1-42 и адъювантом CFA/IFA и умерщвляли через 4-5 месяцев. Затем забирают кровь и выделяют IgG. Антитела, специфичные к иммуногену, могут быть частично очищены аффинной хроматографией. От одной мыши в среднем получают 0,5-1 мг специфичных к иммуногену антител. В целом, получают 60-120 мг.VI. Пассивная иммунизация антителами А Мышей PDAPP 7-9-месячного возраста инъецируют 0,5 мг в PBS поликлональных или моноклональных антител, специфичных к А, как описано ниже. Все препараты антител очищают для обеспечения низкого уровня эндотоксина. Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации фрагментом или более длинной формой А мышей, получением гибридом и скринингом гибридом на синтез антител, специфически связывающихся с нужным фрагментом А и не связывающихся с другими неперекрывающимися фрагментами А. Таблица 6 Мышей инъецировали интраперитонеально, как необходимо, в течение 4-х месяцев для поддержания концентрации циркулирующих антител с титром более чем 1/1000, как определяется ELISA, специфичных к А 42 или другому иммуногену. Титры контролировали методом ELISA и мышей умерщвляли в конце 6-месячного периода инъекцией. После этого проводили гистохимический и токсикологический анализ и определяли уровень А. Дополнительные методики осуществления пассивной иммунизации описаны в примерах XI и XII ниже.VII. Сравнение различных адъювантов Данный эксперимент проводит сравнение CFA, алюминиевых квасцов, эмульсии типа "масло в воде" и MPL в отношении их способности стимулировать иммунный ответ. А. Материалы и методы 1. План исследования 100 Самок морских свинок Hartley шестинедельного возраста, полученных от Elm Hill, разделяют на 10 групп и иммунизируют AN 1792 или его пальмитолированным производным в сочетании с различными адъювантами. Животные семи групп получали инъекции AN1792 (33 мкг, если не оговорено иное) в сочетании с a) PBS, б) адъювантом Фрейнда, в) MPL, г) MPL/скваленом, д) низкими дозами алюминиевых квасцов или е) высокими дозами алюминиевых квасцов. Две группы животных получали инъекции пальмитолированного производного AN 1792 (33 мкг) в сочетании с a) PBS или б) скваленом. Последняя десятая группа животных получала PBS без антигена или дополнительного адъюванта. В случае групп,получавших адъювант Фрейнда, первую дозу эмульгировали в CFA, а оставшиеся четыре дозы - в IFA. Антиген вводили в дозе 33 мкг для всех групп, за исключением группы, получавшей высокую дозу алюминиевых квасцов, которая получала антиген в дозе 300 мкг (AN 1792). Инъекции осуществляли интраперитонеально в случае CFA/IFA и внутримышечно в квадраты подушечек лап попеременно с правой и с левой сторон животным всех других групп. Первые три дозы вводили по двухнедельной схеме, а затем вводили две дозы с месячным интервалом. Кровь забирали через 6-7 дней после каждой иммунизации,начиная со второй дозы, для измерения титров антител. 2. Получение иммуногенов Два мг А 42 (California Peptide, Lot MEO339) добавляют к 0,9 мл деионизованной воды и смесь перемешивают на вортексе с получением относительно однородной суспензии. 100-мкл Аликвоту 10PBS(1PBS, 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфат натрия, рН 7,5) добавляют к полученной смеси. Суспензию опять перемешивают на вортексе и инкубируют в течение ночи при 30 С для использования на следующий день. Неиспользованный А 1-42 хранят до использования в виде высушенного лиофилизированного порошка при -20 С. Пальмитоилированное производное AN 1792 получают путем конъюгации пальмитинового ангидрида, растворенного в диметилформамиде, с амино-концевым остатком AN 1792 до удаления образующегося пептида со смолы обработкой фтористо-водородной кислотой. Для получения состава доз в полном адъюванте Фрейнда (CFA) (группа 2) 33 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS эмульгируют в сотношении 1:1 (об./об.) в CFA в конечном объеме 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген сходным образом эмульгируют в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Для получения состава доз в MPL для групп 5 и 8 лиофилизированный порошок (Ribi Immunochem.Research, Inc., Hamilton, MT) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают на вортексе. Затем смесь нагревают до 65-70 С в течение 30 с с получением слегка непрозрачной однородной суспензии мицелл. Раствор каждый раз готовят заново для каждой серии инъекций. Для каждой инъекции в группе 5 33 мкг AN 1792 в 16,5 мкл PBS смешивают в боросиликатной пробирке сразу же перед использованием. Для получения состава доз со слабой эмульсией типа "масло в воде" AN 1792 в PBS добавляют к 5% сквалену, 0,5 Твину 80, 0,5 Спану 85 в PBS для получения конечной однократной дозы, равной 33 мкгAN 1792 в 250 мкл (группа 6). Смесь эмульгируют пропусканием через двухкамерное самодельное устройство 15-20 раз до тех пор, пока не появятся капли эмульсии, диаметр которых практически эквивалентен 1,0-мкм диаметру стандартных латексных бус при наблюдении под микроскопом. Полученная суспензия опалесцирует и является молочно-белой. Эмульсию каждый раз готовят заново перед каждой серией инъекций. Для группы 8 MPL в 0,2% триэтиламине добавляют в концентрации 50 мкг/дозу к сквалену и смеси детергента для эмульгирования, как описано выше. Для пальмитоилового производного(группа 7) 33 мкг на дозу пальмитоил-NH-A 1-42 добавляют к сквалену и перемешивают на вортексе. Твин 80 и Спан 85 добавляют к смеси и снова перемешивают на вортексе. Указанную смесь добавляют кPBS с достижением конечной концентрации 5% сквалена, 0,5% Твина 80, 0,5% Спана 85 и смесь эмульгируют, как указано выше. Для приготовления составов доз с алюминиевыми квасцами (группы 9 и 10), AN 1792 в PBS добавляют к Альгидрогелю (гель гидроксида алюминия, Accurate, Westbury, NY) до обеспечения концентрации 33 мкг (низкая доза, группа 9) или 300 мкг (высокая доза, группа 10) AN 1792 на 5 мг алюминиевых квасцов в конечном дозовом объеме 250 мкл. Суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре. 3. Измерение титров антител У морских свинок кровь забирают через 6-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй иммунизации, в целом, 4 раза. Титры антител против А 42 измеряют методом ELISA, как описано в разделе "Основные материалы и методы". 4. Приготовление тканей Примерно через 14 недель всех морских свинок умерщвляют путем введения CO2. Собирают спинномозговую жидкость, удаляют головной мозг из трех участков мозга (гиппокампа, коры и мозжечка),приготавливают срезы и используют их для измерения концентрации общего А-белка при использовании ELISA. В. Результаты 1. Антительный ответ Существует большой разброс в активности различных адъювантов при измерении антительного ответа на AN 1792 после иммунизации. Как показано на фиг. 14, в том случае, когда AN 1792 вводят в PBS,антительный ответ не выявляется после двух или трех иммунизаций и очень слабые ответы выявляются после четвертой и пятой доз, когда геометрические значения титров (GMT) составляют только около 45. Эмульсия типа "масло в воде" индуцирует средние значения титров после третьей дозы (GMT 225), которые сохраняются и после четвертой дозы (GMT 301) и снижаются с конечной дозой (GMT 54). Обнаруживается явный дозовый ответ на антиген AN 1792, связанный с квасцами, причем доза 300 мкг более иммуногенна во все точки времени, чем доза 33 мкг. Во время пикового антительного ответа после четвертой иммунизации различие между указанными двумя дозами составляет 43% со значениями GMT около 1940 (33 мкг) и 3400 (300 мкг). Антительный ответ на дозу 33 мкг AN 1792 и MPL был очень схож с ответом, который генерируется практически десятикратной дозой антигена (300 мкг), связанного с алюминиевыми квасцами. Добавление MPL к эмульсии типа "масло в воде" уменьшает эффективность составов по отношению к таковым с MPL, как к адъюванту самому по себе, на 75%. Пальмитолированное производное AN 1792 полностью неиммуногенно, когда его вводят в PBS, и генерируют умеренные титры при введении в эмульсии типа "масло в воде" с GMTs 340 и 105 для третьего и четвертого заборов крови. Наиболее высокие титры антител выявляются при использовании адъюванта Фрейнда с пикомGMT около 87000. Это значение почти в 30 раз выше, чем значения GMTs для следующих двух наиболее эффективных составов, MPL и высокой дозы AN 1792 с алюминиевыми квасцами. Наиболее многообещающими адъювантами, идентифицированными в указанном исследовании,оказались MPL и алюминиевые квасцы. Из этих двух адъювантов MPL, по-видимому, предпочтительнее,поскольку в 10 раз более низкая доза антигена необходима для генерации аналогичного антительного ответа, чем при использовании алюминиевых квасцов. Антительный ответ может быть увеличен путем увеличения дозы антигена и/или адъюванта и путем оптимизации схемы иммунизации. Эмульсия типа"масло в воде" является очень слабым адъювантом для AN 1792 и добавление эмульсии типа "масло в воде" к адъюванту PML уменьшает изначальную активность адъюванта самого по себе. 2. Уровни А в головном мозге Примерно через 14 дней морских свинок глубоко анестезируют, забирают спинномозговую жидкость (CSF), удаляют головной мозг у животных, которые были иммунизированы адъювантом Фрейнда(группа 2), MPL (группа 5), алюминиевыми квасцами вместе с 300 мкг AN 1792 (группа 10) и PBS (контрольная группа 3). Для измерения уровня пептида А одно полушарие измельчают и приготавливают гомогенаты гиппокампа, коры и мозжечка в 5 М гуанидине. Указанные гомогенаты разводят и количественно сравнивают с сериями разведений стандартного белка А известных концентраций методомELISA. Уровни белка А в гиппокампе, коре и мозжечке были очень схожи между собой для всех четырех групп, за исключением широкого разброса антительных ответов на А, вызванных введением соответствующих доз. Средние уровни А около 25 нг/г ткани измеряют в гиппокампе, 21 нг/г в коре и 12 нг/г ткани в мозжечке. Таким образом, наличие высокого уровня циркулирующих антител к А практически в течение трех месяцев у некоторых из указанных животных не изменяет общих уровней А в головном мозге этих животных. Уровни А в спиномозговой жидкости были также незначительно сходны между группами. Утрата сильного эффекта иммунизации AN 1792 на экзогенный А свидетельствует о том, что иммунный ответ сфокусирован на патологических формах А.VIII. Иммунный ответ на различные адъюванты у мышей Для этого исследования использовали шестинедельных самок мышей Swiss Webster (10-13 животных на группу). Иммунизации осуществляли в дни 0, 14, 28, 60, 90 и 20 подкожно в дозовом объеме 200 мкл. В качестве буфера использовали PBS для всех составов. У животных забирали кровь через 7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для анализа титров антител с помощью ELISA. Режим обработки каждой группы представлен в табл. 7. Примечание а Количество мышей в каждой группе на начало эксперимента.b Адъюванты указаны. PBS служил в качестве буфера для всех составов. Для группы 8 не использовалось ни адъюванта, ни антигена. Титры антител к А 42, определенные методом ELISA, в каждой группе приведены в табл. 8. Таблица 8 Из данных таблицы видно, что наиболее высокие титры были получены для групп 4, 5 и 18, которым вводили соответственно следующие адъюванты: 125 мкг MPL, 50 мкг MPL и QS-21 в сочетании сIX. Терапевтическая эффективность различных адъювантов Терапевтическую эффективность оценивали на трансгенных мышах PDAPP при использовании набора адъювантов, подходящих для применения на людях, для определения их способности усиливать иммунный ответ на А и индуцировать опосредованное иммунитетом разрушение отложений амилоида в головном мозге.