Антитела к с-мет

Предоставлены моноклональные антитела, их антиген-связывающие фрагменты и комбинации вышеуказанного, которые связываются с c-Met и ингибируют его активность и которые являются эффективными при лечении раковых опухолей и других заболеваний, расстройств или состояний,патогенез которых опосредован c-Met.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают c-Met, и их применению для лечения состояний и расстройств, патогенез которых опосредован этим рецептором.c-Met, представитель суперсемейства тирозинкиназ, является рецептором фактора роста гепатоцитов (HGF). Связывание HGF с c-Met приводит к димеризации или мультимеризации рецептора, фосфорилированию большого количества остатков тирозина в его внутриклеточном участке, каталитической активации и запуску нижеследующего сигнального каскада. c-Met также активируется через лиганднезависимые механизмы, включая сверхэкспрессию, амплификацию и мутацию рецептора. Активация cMet усиливает пролиферацию, миграцию, морфогенез, выживание (включая защиту от апоптоза) клеток и синтез протеаз, что представляет собой характеристики, ассоциированные с инвазивным фенотипом клеток и неблагоприятным исходом болезни и устойчивостью к лекарствам у больных раком. Сигнальный путь c-Met представляет собой один из сигнальных путей, регуляция которого наиболее часто нарушается при раке у человека, что происходит практически при всех видах солидных опухолей. Международная публикация РСТ WO 09/007427 описывает антитела мыши и гуманизированные антитела с привитыми CDR, направленные против c-Met. Мышиное антитело 224G11, описанное в указанном документе, не связывают домен Sema c-Met. Дополнительные функциональные свойства гуманизированных IgG1-производных этих мышиных антител, обозначенных как h224G11 Mab, приведены в рефератах 835 (данные in vitro) и 2792 (данные in vivo) и на сопровождающих их постерах, представленных на съезде Американской ассоциации научных исследований в области раковых заболеваний(Денвер, штат Колорадо, США) в апреле 2009 г. В этих рефератах и постерах сообщается, что бивалентные h224G11 Mab лишены собственных агонистических свойств, ведут себя как полные антагонисты cMet и эффективно снижают димеризацию c-Met. Сообщается, что мышиные 224G11 подавляют c-Met и блокируют фосфорилирование c-Met in vivo. В случае других рецепторов димеризация является обязательным условием для интернализации и деградации рецептора. В этих рефератах и постерах не представлены какие-либо данные, относящиеся к интернализации c-Met. Более того, не идентифицирован эпитоп c-Met, с которым связывает указанное гуманизированное антитело. Международная публикация РСТ WO 05/016382 также описывает антитела к c-Met, но не идентифицирует эпитоп(ы), с которым(и) связываются указанные антитела. Пример картирования эпитопов представлен, однако описанные результаты всего лишь показывают, что шесть антител к c-Met связываются с общим эпитопом, а седьмое антитело к c-Met связывается с обособленным эпитопом. Конкретные эпитопы, с которыми связываются эти антитела к c-Met, не представлены. Существует потребность в антагонистических антителах к с-Met человека, связывание которых с цепью c-Met человека облегчает интернализацию рецептора с поверхности клетки в присутствии и/или в отсутствие HGF. Также существует потребность в антагонистических антителах к c-Met человека, связывание которых с -цепью c-Met человека облегчает интернализацию рецептора с поверхности клетки в клетках, содержащих разновидности c-Met с мутациями, связанными с приобретением функции. Также существует потребность в антагонистических антителах к c-Met человека, индуцирующих деградацию cMet и сокращение количества фосфорилированных с-Met. Подобная антагонистическая активность могла бы снизить количество доступных сайтов связывания для HGF на поверхности опухолевых клеток и остановить активацию каскада, вызванную сверхэкспрессией, амплификацией или мутацией c-Met. В то же время такие антагонистические антитела должны ингибировать связывание HGF с c-Met и HGFиндуцированную активацию c-Met и слабо индуцировать или не индуцировать агонистическую активность сами по себе. Препараты антител согласно настоящему изобретению удовлетворяют этим потребностям. Они связываются с эпитопами в составе -цепи домена Sema c-Met человека, ингибируют связывание HGF с cMet и активацию рецептора, при этом слабо индуцируя или не индуцируя агонистическую активность. Антитела согласно настоящему изобретению также индуцируют интернализацию рецептора в присутствии или в отсутствие HGF, а также в клетках, содержащих разновидности c-Met с мутациями, связанными с приобретением функции. Они индуцируют деградацию c-Met и сокращение количества фосфорилированных c-Met человека и ингибируют HGF-зависимую и HGF-независимую пролиферацию опухолевых клеток, которые экспрессируют этот рецептор. Ввиду этих свойств препараты указанных антител могут находить терапевтическое применение при лечении злокачественных опухолей, опосредованныхc-Met через разнообразные механизмы. Кроме того, препараты антител согласно настоящему изобретению обладают рядом других привлекательных свойств. Они демонстрируют высокую аффинность (KD) к c-Met, блокируют HGFопосредованное фосфорилирование c-Met и активацию нижестоящего сигнального каскада, пролиферацию и миграцию клеток; и лишь в слабой степени индуцируют фосфорилирование c-Met при слабой индукции или отсутствии индукции HGF-подобной биологической активности, например индукции пролиферации, подвижности, инвазии опухолевых клеток, тубулогенеза, ангиогенеза или антиапоптозных эффектов. Они ингибируют и лиганд (HGF)-зависимую, и лиганд-независимую активацию пути c-Met. Кроме того, препараты антител согласно настоящему изобретению предпочтительно связывают внеклеточный домен (ECD) c-Met по сравнению с ECD близкородственных рецепторов RON и PlexinA2 и не вызывают "отщепления" (shedding) ECD c-Met. Соответственно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или антигенсвязывающему фрагменту указанного антитела, которое:b) индуцирует интернализацию c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует независимую от фактора роста гепатоцитов интернализацию c-Met человека с поверхности клетки. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислотSEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела содержит легкую цепь и тяжелую цепь,причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует интернализацию c-Met человека в клетках, содержащих разновидность c-Met с мутациями, связанными с приобретением функции. Мутация с приобретением функции может предствалять собой мутацию киназного домена c-Met M1149T или мутацию субмембранного домена R988C. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует интернализацию по меньшей мере 40% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 45% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антигенсвязывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 50% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 55% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 60% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 65% c-Met человека в клетке. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 70% c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающих фрагментов указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение количества фосфорилированного c-Met в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает, по существу, тот же эпитоп -цепи c-Met человека, что и антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ IDNO: 28, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 40, или которое связывает, по существу, тот же эпитоп -цепи c-Met человека, что и антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 29, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, за исключением тех, что содержат легкую цепь, содержащую последовательность амино-2 020398 кислот, соответствующую SEQ ID NO: 26, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 38, отличающееся тем, что указанный эпитоп содержит один или более остатков аминокислот из 144HVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO: 82) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из 123DTYYDD128 (SEQ ID NO: 81) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из 192FINF195 (SEQ ID NO: 83) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из 220KETKDGFM227 (SEQ ID NO: 84) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанное антитело связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей изd) 216VRRLKETKDGFM227 (SEQ ID NO: 80) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где антитело связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,состоящей изd) 220KETKDGFM227 (SEQ ID NO: 84) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается с аминокислотной последовательностью в пределах зпитопа, характеризующегося последовательностямиNO: 77),121VVDTYYDDQL130 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO: 78), 179ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEQ ID NO: 79) и 216VRRLKETKDGFM227 (SEQ ID NO: 80) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается с аминокислотной последовательностью в пределах эпитопа, характеризующегося последовательностями 123DTYYDD128 (SEQ ID NO: 81), 144HVFPHNHTADIQS156 (SEQ IDNO: 82), 192FINF195 (SEQ ID NO: 83) и 220KETKDGFM227 (SEQ ID NO: 84) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанное антитело связывается с участком в пределах аминокислотной последовательности 95CFPCQDCSSKA105 (SEQ ID NO: 86) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, за исключением тех, что включают легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 29, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 41, где эпитоп содержит один или более аминокислотных остатков из 95CFPCQDCSSKA105 (SEQ ID NO: 86) включительно. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывают c-Met человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи(LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), где указанные три LCDR и указанные три HCDR выбраны из группы, состоящей изa) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSX1LX2S (SEQ ID NO: 87), где X1 представляет собой Y или R, а X2 представляет собой А или R;LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEQ ID NO: 90), где Х 7 представляет собой N, I или R, a X8 представляет собой K или P; иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFX9Y (SEQ ID NO:91), где Х 9 представляет собой Y или F; иb) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVX3SIYLH (SEQ ID NO: 88), где Х 3 представляет собой S или R;LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот X4X5YX6GYPLT (SEQ ID NO: 89), где Х 4 представляет собой I или Q, Х 5 представляет собой Q или V, а X6 представляет собой S или R;HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEQ IDHCDR3, содержащего последовательность аминокислот X13NX14LDY (SEQ ID NO: 93), где X13 представляет собой Т или А, а X14 представляет собой W или I; где указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе -цепи указанного c-Met человека и индуцирует интернализацию c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает с-Met человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи(LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), причем указанное антитело содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепиLCDR1 содержит последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2 содержит последовательность аминокислот GTSX1LX2S (SEQ ID NO: 87), где X1 представляет собой Y или R, а Х 2 представляет собой А или R;LCDR3 содержит последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1 содержит последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2 содержит последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEQ ID NO: 90),где Х 7 представляет собой N, I или R, а Х 8 представляет собой K или P; иHCDR3 содержит последовательность аминокислот GYGAFX9Y (SEQ ID NO: 91), где Х 9 представляет собой Y или F. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает c-Met человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи(LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), где LCDR1 содержит последовательность аминокислот SVSSSVX3SIYLH (SEQ ID NO: 88), где Х 3 представляет собой S или R;LCDR2 содержит последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3 содержит последовательность аминокислот X4X5YX6GYPLT (SEQ ID NO: 89), где Х 4 представляет собой I или Q, Х 5 представляет собой Q или V, а Х 6 представляет собой S или R;HCDR1 содержит последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2 содержит последовательность аминокислот RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEQ ID NO: 92), где Х 10 представляет собой N или Y, X11 представляет собой G или R, а Х 12 представляет собой G или S; иHCDR3 содержит последовательность аминокислот X13NX14LDY (SEQ ID NO: 93), где X13 представляет собой Т или А, а X14 представляет собой W или I. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывают c-Met человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи(LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), и где указанные три LCDR и указанные три HCDR выбраны из группы, состоящей изa) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSYLAS (SEQ ID NO: 50);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 60); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFYY (SEQ ID NO: 61);b) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSYLAS (SEQ ID NO: 50);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYIEKFKG (SEQ ID NO: 62); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFFY (SEQ ID NO: 63);c) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSRLRS (SEQ ID NO: 52);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYREPFKG (SEQ ID NO: 64); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFYY (SEQ ID NO: 61);d) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот IQYSGYPLT (SEQ ID NO: 55);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 66); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот TNWLDY (SEQ ID NO: 67);e) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 56);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 68); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот ANWLDY (SEQ ID NO: 69); иf) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVRSIYLH (SEQ ID NO: 57);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QVYRGYPLT (SEQ ID NO: 58);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPYRGSTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 70); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот ANILDY (SEQ ID NO: 71); и причем указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе -цепи указанного c-Met человека и индуцирует интернализацию c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), где указанные три LCDR и указанные три HCDR выбраны из группы, состоящей изa) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSYLAS (SEQ ID NO: 50);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 60); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFYY (SEQ ID NO: 61);b) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSYLAS (SEQ ID NO: 50);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYIEKFKG (SEQ ID NO: 62); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFFY (SEQ ID NO: 63);c) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSISSTNLH (SEQ ID NO: 49);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот GTSRLRS (SEQ ID NO: 52);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QQWSSYPYS (SEQ ID NO: 51);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTSRYIH (SEQ ID NO: 59);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот WIYPVTGDTYYREPFKG (SEQ ID NO: 64); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот GYGAFYY (SEQ ID NO: 61). Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), причем указанные три LCDR и указанные три HCDR выбраны из группы, состоящей изa) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот IQYSGYPLT (SEQ ID NO: 55);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 66); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот TNWLDY (SEQ ID NO: 67);b) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 56);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 68); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот ANWLDY (SEQ ID NO: 69); иc) LCDR1, содержащего последовательность аминокислот SVSSSVRSIYLH (SEQ ID NO: 57);LCDR2, содержащего последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3, содержащего последовательность аминокислот QVYRGYPLT (SEQ ID NO: 58);HCDR1, содержащего последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2, содержащего последовательность аминокислот RVNPYRGSTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 70); иHCDR3, содержащего последовательность аминокислот ANILDY (SEQ ID NO: 71). Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое включает три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), гдеLCDR1 содержит последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2 содержит последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3 содержит последовательность аминокислот IQYSGYPLT (SEQ ID NO: 55);HCDR1 содержит последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2 содержит последовательность аминокислот RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 66) иHCDR3 содержит последовательность аминокислот TNWLDY (SEQ ID NO: 67). Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое включает три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR), гдеLCDR1 содержит последовательность аминокислот SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 53);LCDR2 содержит последовательность аминокислот STSNLAS (SEQ ID NO: 54);LCDR3 содержит последовательность аминокислот QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 56);HCDR1 содержит последовательность аминокислот GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 65);HCDR2 содержит последовательность аминокислот RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 68) иHCDR3 содержит последовательность аминокислот ANWLDY (SEQ ID NO: 69). Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где указанная LCVR и указанная HCVR, соответственно, содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей изb) SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO: 97,причем указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе -цепи указанного c-Met человека и индуцирует интернализацию c-Met человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где указанная LCVR содержит последовательность SEQ ID NO: 94, а указаннаяHCVR содержит последовательность SEQ ID NO: 96. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где указанная LCVR содержит последовательность SEQ ID NO: 95, а указаннаяHCVR содержит последовательность SEQ ID NO: 97. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная LCVR и указанная HCVR содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей изf) LCVR представляет собой SEQ ID NO: 6, a HCVR представляет собой SEQ ID NO: 18. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная LCVR и указанная HCVR, соответственно, содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из:c) LCVR представляет собой SEQ ID NO: 3, a HCVR представляет собой SEQ ID NO: 15. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная LCVR и указанная HCVR, соответственно, содержат последовательностиc) LCVR представляет собой SEQ ID NO: 6, a HCVR представляет собой SEQ ID NO: 18. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная LCVR содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, а указаннаяHCVR содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная LCVR содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5, а указаннаяHCVR содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 17. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь и указанная тяжелая цепь содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей изa) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 25, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 37;b) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 26, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 38;c) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 27, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 39;d) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 28, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 40;i) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 29, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 41; иf) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 30, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 42. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь и указанная тяжелая цепь содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей изa) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 25, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 37;b) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 26, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 38; иc) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 27, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 39. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь и указанная тяжелая цепь содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей изa) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 28, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 40;b) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 29, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 41; иc) легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 30, а тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 42. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ IDNO: 28, а каждая тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ IDNO: 29, а каждая тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое конкурирует с любым из вышеуказанных моноклональных антител к c-Met или антиген-связывающим фрагментом указанного антитела за связывание с c-Met. Такое конкурирующее моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела может связываться с тем же эпитопом c-Met,что и любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела конкурирует с антителом, которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28,а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела конкурирует с антителом, которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно сверхэкспрессируют указанный c-Met человека. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно сверхэкспрессируют указанный c-Met человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно сверхэкспрессируют указанный c-Met человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный c-Met человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный c-Met человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный c-Met человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества c-Met человека и количества фосфорилированного c-Met человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые чувствительны кфактору роста гепатоцитов. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое предпочтительно связывает внеклеточный домен c-Met человека по сравнению с внеклеточным доменом RON человека или внеклеточным доменом PlexinA2 человека. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена c-Met человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена c-Met человека,содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена c-Met человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие c-Met человека, от апоптоза,индуцированного стауроспорином. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие c-Met человека, от индуцированного стауроспорином апоптоза, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ IDNO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие c-Met человека, от апоптоза, индуцированного стауроспорином, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое ингибирует зависимую и независимую от фактора роста гепатоцитов пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих c-Met человека. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое ингибирует связывание фактора роста гепатоцитов с c-Met человека. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует HGF-подобную биологическую агонистическую активность. HGFподобная биологическая агонистическая активность включает пролиферацию опухолевых клеток, подвижность опухолевых клеток, инвазию опухолевых клеток, тубулогенез, ангиогенез и антиапоптозное действие. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует HGF-подобную биологическую агонистическую активность, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Фармацевтическая композиция, которая содрежит любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и фармацевтически приемлемый носитель,разбавитель или вспомогательное вещество. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим агентом. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим средством содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим средством содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ IDNO: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 41. Фармацевтическая композиция, которая содержит любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и фармацевтически приемлемый носитель,разбавитель или вспомогательное вещество. Применение любого из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела для изготовления медикамента для лечения рака у человека. Способ лечения рака, включающий введение пациенту-человеку, нуждающемуся в нем, эффективного количества любого из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела. Определения. Полноразмерное антитело в том виде, как оно существует в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, включающую 2 тяжелые (Н) и 2 легкие (L) цепи, связанные друг с другом дисульфидными связями. N-концевая часть каждой цепи содержит вариабельную область размером приблизительно 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена с помощью гипервариабельных участков (CDR), содержащихся в них. С-концевая часть каждой цепи ограничивает константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию.CDR перемежаются с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке:FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDR легкой цепи обозначаются как "LCDR1, LCDR2 иLCDR3", а 3 CDR тяжелой цепи обозначаются как "HCDR1, HCDR2 и HCDR3". CDR содержат большинство остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. Нумерация и определение положения аминокислотных остатков в CDR в пределах областей LCVR и HCVR соответствуют общеизвестной конвенции нумерации Кабата. Легкие цепи подразделяются на - или - и характеризуются определенной константной областью,как известно специалистам. Тяжелые цепи подразделяются на -, -, -, - или - и определяют изотопическую детерминанту антитела IgG, IgM, IgA, IgD или IgE соответственно. Антитела IgG, кроме того,делятся на подклассы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется определенной константной областью с последовательностью, общеизвестной специалистам. В настоящем документе термин "моноклональное антитело" (Mab) применяется по отношению к препаратам антител по настоящему изобретению, относящимся к антителам, происходящим из единственной копии или клона, включая, например, клон эукариотической клетки, прокариотической клетки или фага, а не к способу, с помощью которого оно получено. Mab по настоящему изобретению предпочтительно существуют в гомогенной или практически гомогенной популяции. Полные Mab содержат 2 тяжелые цепи и 2 легкие цепи. "Антиген-связывающие фрагменты" подобных моноклональных антител включают, например, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2, одноцепочечные фрагменты Fv и одноплечие антитела, включающие легкую цепь и тяжелую цепь. Моноклональные антитела и их антиген-связывающие фрагменты по настоящему изобретению можно получить, например, с помощью рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например CDRтрансплантации, или комбинации этих технологий, или иных технологий, известных специалистам."Препарат антител" относится к Mab и Fab, описанным в настоящем документе. Дополнительные препараты антител, демонстрирующие сходные функциональные свойства по настоящему изобретению,можно получить с помощью общепринятых способов. Например, мышей можно иммунизировать c-Met человека или его фрагментами, полученные антитела можно выделить и очистить, и с помощью способов, описанных в примерах 2-19 ниже, можно определить, обладают ли они связывающими и функциональными свойствами, сходными или совпадающими со свойствами препаратов антител, описанных в настоящем документе. Антиген-связывающие фрагменты также можно получить с помощью общепринятых способов. Способы получения и очистки антител и антиген-связывающих фрагментов общеизвестны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2. Фраза "сконструированные антитела" относится к моноклональным антителам и антигенсвязывающим фрагментам, кроме препаратов антител, описанных в настоящем документе, которые обладают связывающими и функциональными свойствами в соответствии с изобретением, сходными со свойствами, описанными в настоящем документе, и имеют каркасные области, в значительной степени или полностью соответствующие человеческим, окружающие CDR, происходящие из нечеловеческого антитела. "Каркасная область" или "каркасная последовательность" относится к любой из каркасных областей 1-4. Сконструированные антитела и антиген-связывающие фрагменты, охватываемые настоящим изобретением, включают молекулы, в которых любая или любые из каркасных областей 1-4 являются в значительной степени или полностью человеческими, т.е. в которых присутствует любая из возможных комбинаций индивидуальных в значительной степени или полностью человеческих каркасных областей 1-4. Например, это понятие включает молекулы, в которых каркасная область 1 и каркасная область 2,каркасная область 1 и каркасная область 3, каркасная область 1, 2 и 3 и т.д. являются в значительной степени или полностью человеческими. В значительной степени человеческие каркасные области представляют собой каркасные области, по меньшей мере приблизительно 80% последовательности которых идентично последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека. Предпочтительно в значительной степени человеческие каркасные области характеризуются последовательностью по меньшей мере на приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или приблизительно 99% идентичной последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека. Полностью человеческие каркасные области представляют собой каркасные области, идентичные последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека. Последовательности каркасной области антител эмбрионального типа человека можно получить от ImMunoGeneTics (IMGT) через веб-сайт http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin FactsBook под авторством MariePaule Lefranc и Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Например, каркасные области легкой цепи антител эмбрионального типа могут быть выбраны из группы, состоящей из A11, A17, A18,A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2 и O8, а каркасные области тяжелой цепи антител эмбрионального типа могут быть выбраны из группы, состоящей из: VH2-5, VH2-26, VH2-70,VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15,VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 и VH5-5I. Сконструированные антитела, в дополнение к описанным в настоящем документе, демонстрирующие сходные функциональные свойства в соответствии с настоящим изобретением, можно получить несколькими различными способами. При одном подходе CDR исходного препарата антител трансплантируют в человеческую каркасную область, последовательность которой характеризуется высокой степенью идентичности с каркасной областью исходного препарата антител. Идентичность последовательности новой каркасной области в общем случае будет составлять по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% совпадения с последовательностью соответствующей каркасной области в исходном препарате антител. В случае, если каркасные области содержат менее 100 аминокислотных остатков, можно заменить один, два или три аминокислотных остатка. Эта трансплантация может приводить к снижению сродства связывания по сравнению с исходным антителом. В этом случае каркасную область можно мутировать к первоначальному виду исходной каркасной области в некоторых положениях на основании специфических критериев, описанных в Queen et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Дополнительные ссылки, описывающие способы, используемые для гуманизации мышиных антител, включают патенты США 4816397, 5225539 и 5693761; компьютерные программы ABMOD и ENCAD, согласно описанию в Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; и способ согласно Winter и соавторам (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 и Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536). Идентификацию остатков для мутации к первоначальному виду можно выполнить следующим образом. Если аминокислота попадает в следующую категорию, то аминокислоту каркасной области используемой последовательности антител эмбрионального типа человека ("акцепторной каркасной области") заменяют аминокислотой каркасной области исходного препарата антител ("донорной каркасной области").(a) Аминокислота акцепторной каркасной области человека является нетипичной для каркасных областей человека в этом положении, в то время как соответствующая аминокислота донорного иммуноглобулина типична для каркасных областей человека в этом положении;(b) положение аминокислоты непосредственно примыкает к одному из CDR; либо(c) любой атом боковой цепи аминокислоты каркасной области находится в пределах 5-6(центрцентр) от любого атома аминокислоты CDR в трехмерной модели иммуноглобулина. Если и аминокислота акцепторной каркасной области человека, и соответствующая аминокислота в донорной области являются в общем случае нетипичными для каркасных областей человека в этом положении, такую аминокислоту можно заменить аминокислотой, типичной для каркасных областей человека в этом положении. Критерии для мутации к первоначальному виду позволяют восстановить активность исходного препарата антител. Еще один подход к получению сконструированных антител, демонстрирующих функциональные свойства, сходные с препаратами антител, описанных в настоящем документе, включает случайные мутации аминокислот в пределах трансплантированных CDR без изменения каркасной области и скрининг полученных молекул на сродство связывания и другие функциональные свойства, совпадающие или превосходящие свойства исходного препарата антител. В положении каждой аминокислоты в пределах каждого CDR можно ввести одиночные мутации с последующей оценкой действия таких мутаций на сродство связывания и другие функциональные свойства. Одиночные мутации, приводящие к улучшению свойств, можно комбинировать для оценки их действия в комбинации друг с другом. Кроме того, возможна комбинация обоих вышеописанных подходов. После трансплантации CDR можно мутировать специфические каркасные области к первоначальному виду в дополнение к внесению аминокислотных замен в CDR. Эта методология описана в Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162. Применяя идеи настоящего изобретения, специалист в данной области техники может использовать общепринятые методики, например сайт-направленный мутагенез, для замены аминокислот в пределахCDR и каркасных последовательностей, описанных в настоящем документе, и таким образом получать дополнительные аминокислотные последовательности вариабельных областей, являющиеся производными настоящих последовательностей. Все природные аминокислоты можно вводить в конкретный сайт замены. Способы, описанные в настоящем изобретении, можно использовать для скрининга этих дополнительных аминокислотных последовательностей вариабельной области для идентификации последовательностей, обладающих перечисленными функциями in vivo. Таким образом, можно идентифицировать дополнительные последовательности, пригодные для изготовления сконструированных антител и их антиген-связывающих частей в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно аминокислотные замены в пределах каркасных областей ограничивают одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или более из 4 каркасных областей легких цепей и/или тяжелых цепей, описанных в настоящем изобретении. Предпочтительно аминокислотные замены в пределах CDR ограничивают одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или более из 3 CDR легких цепей и/или тяжелых цепей. Также возможны комбинации различных изменений в пределах этих каркасных областей и CDR, описанных выше. То, что функциональные свойства препаратов антител, полученных путем аминокислотных замен,обсуждавшихся выше, соответствуют свойствам, демонстрируемым конкретными молекулами, описанными в настоящем документе, можно подтвердить с помощью способов, описанных ниже в примерах 219. Термин "эпитоп" относится к специфическому расположению аминокислот, находящихся на пептиде или белке, с которым связывается антитело или фрагмент антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, например аминокислот или боковых цепей углеводов, и имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические зарядовые характеристики. Эпитопы могут быть линейными, т.е. предусматривающими связывание с одиночной аминокислотной последовательностью, или конформационными, т.е. предусматривающими связывание с двумя или более аминокислотными последовательностями в различных областях антигена, которые не обязательно могут быть смежными. Эпитопы, описанные в настоящем документе, могут состоять из, главным образом состоять из или включать в себя последовательности аминокислот, описанные в примере 3. Моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые "конкурируют" с молекулами, описанными в настоящем документе, представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают c-Met человека на сайте(ах), который(е) совпадает(ют) или перекрывается(ются) с сайтом(ами), с которым(и) связываются настоящие молекулы. Конкурирующие моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты можно идентифицировать, например, с помощью конкурентного иммуноанализа. Например, можно иммобилизовать образец очищенного или частично очищенного c-Met человека на твердой подложке. Затем добавляют препарат антител или антиген-связывающих фрагментов антител по настоящему изобретению и моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое предположительно способно конкурировать с препаратом антител согласно настоящему изобретению. Одну из двух молекул метят. Если меченое и немеченое соединение связываются с различными и отделенными друг от друга сайтами на c-Met, меченое соединение будет связываться на одном и том же уровне вне зависимости от наличия предположительно конкурирующего соединения. Однако если сайты взаимодействия совпадают или перекрываются, немеченое соединение будет вступать в конкуренцию, и количество меченого соединения,связанного с антигеном, будет снижаться. Если немеченое соединение присутствует в избытке, меченое соединение будет связываться в очень малом количестве или не будет связываться вообще. Для целей настоящего изобретения конкурирующие моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые снижают связывание настоящих препаратов антител к c-Met на примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%. Подробности процедур проведения подобных конкурентных анализов общеизвестны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Такие анализы можно выполнять количественно при применении очищенных антител. Стандартную кривую строят путем титрования одного из антител против самого себя, т.е. одно и то же антитело используют и в качестве меченого, и в качестве конкурирующего. Титруют способность немеченого конкурирующего моноклонального антитела или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела ингибировать связывание меченой молекулы на планшете. Результаты выводят на график и сравнивают концентрации,необходимые для достижения требуемой степени ингибирования связывания. С помощью способов, описанных в примерах 2-19 в настоящем документе, можно определить, обладает ли моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое конкурирует с препаратом антител по настоящему изобретению, при таком конкурентном анализе функциональными характеристиками,совпадающими или сходными с характеристиками настоящих препаратов антител. Моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связываются практически с тем(и) же эпитопом(ами) c-Met, что и моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают c-Met человека на сайте(ах), который(е) перекрывается(ются) с сайтом(ами), с которым(и) связываются настоящие молекулы. Способы, которые облегчают идентификацию моноклональных антител или их антиген-связывающих фрагментов, связывающихся практически с тем же эпитопом c-Met, что и моноклональные антитела к c-Met или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, широко известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в международной публикации РСТ WO 00/64946. С помощью способов, описанных в примерах 2-19 в настоящем документе, можно определить, обладает ли моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается практически с тем(и) же эпитопом(ами) с-Met, что и препараты, описанные в настоящем изобретении, функциональными характеристиками, совпадающими или сходными с характеристиками настоящих препаратов антител."c-Met" или "c-Met человека" относится к любому c-Met человека, а также его функционально активным мутантным формам. Структура c-Met может быть схематически изображена следующим образом:SEMA: домен Sema,PSI: домен плексина, семафоринов и интегринов,IPT: 4 домена иммуноглобулинов, плексинов и фактора транскрипции,ТМ: трансмембранный участок,JM: субмембранный участок,KD: киназный домен. В ECD c-Met человека (SEQ ID NO: 75) аминокислоты 1-24 включают сигнальную последовательность. Зрелый белок начинается с аминокислоты 25 (Е). Домен Sema состоит примерно из 500 аминокислотных остатков на N-конце c-Met и содержит -цепь (аминокислотные остатки 25-307) и часть -цепи(аминокислотные остатки 308-519). Термин "ингибировать" означает способность в значительной степени оказывать антагонистическое действие, препятствовать, предотвращать, сдерживать, замедлять, разобщать, устранять, останавливать,снижать или обращать вспять биологическое действие c-Met. Термин "лечение" (или "лечить", или "воздействие") означает замедление, прерывание, купирование, контроль, остановку, снижение или обращение вспять развития или тяжести симптома, расстройства, состояния или заболевания, но не обязательно включает полное устранение всех симптомов, состояний или расстройств, относящихся к заболеванию. Можно лечить острые случаи и хронические состояния. При остром случае антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят при появлении симптома, расстройства, состояния или заболевания и прерывают при окончании острого случая. В противоположность этому хронический симптом, расстройство, состояние или заболевание лечат в течение более длительного промежутка времени. Термин "эффективное количество" относится к количеству или дозе препарата антител по настоящему изобретению, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает требуемое лечение или профилактику. Терапевтически эффективное количество настоящих препаратов антител может составлять количество в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг на однократную дозу. Терапевтически эффективное количество для любого отдельного пациента можно определить в медицинском учреждении путем мониторинга действия препаратов антител на биомаркер, например поверхностный c-Met в опухолевых и неопухолевых тканях, регрессию опухоли и т.д. Анализ данных, полученных с помощью этих способов, позволяет модифицировать режим лечения во время терапии так,что вводят оптимальные количества препаратов антител самих по себе или в комбинации с еще одним терапевтическим агентом, а также так, что можно определить длительность лечения. Таким образом,схему дозирования/лечения можно модифицировать в течение курса терапии так, что вводят минимальные количества препаратов антител самих по себе или в комбинации, которые показывают удовлетворительную эффективность уменьшения опухоли, и так, что введение подобных препаратов продолжают только до тех пор, пока это необходимо для успешного лечения пациента. Препараты антител по настоящему изобретению можно применять в качестве медикаментов для лечения человека, вводимых различными путями. Такие композиции наиболее предпочтительны для парентерального введения. Подобные фармацевтические композиции могут быть получены способами,широко известными в данной области техники. См., например, Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co., и включают один или более из препаратов антител, описанных в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Термин "опухоль" относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей. Термины "рак", "злокачественный" и "опухоль" взаимно не исключают друг друга. Термины "рак" и "злокачественный" относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, обычно характеризующееся нарушенным ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы и лейкозы, но не ограничиваются ими.c-Met и рак. Сигнальные пути c-Met с нарушенной регуляцией могут быть индуцированы за счет транскрипционной активации, амплификации гена c-Met, специфических генетических изменений или лигандзависимых аутокринных или паракринных механизмов. Наиболее частый случай конститутивной активации c-Met в опухолях человека представляет собой повышенную экспрессию белка вследствие транскрипционной активации в отсутствие амплификации гена. Кроме того, амплификация гена MET с последующей сверхэкспрессией белка и конститутивной активацией киназы описана для ряда первичных опухолей человека, включая карциномы желудочно-кишечного тракта и пищевода, немелкоклеточную карциному легкого (NSCL) и медуллобластомы. Опухоли мезенхимального происхождения, например остеосаркомы и рабдомиосаркомы, часто используют аутокринные механизмы для производства HGF. Повышенный уровень HGF и сверхэкспрессия c-Met часто ассоциируются с плохим исходом болезни, что включает более агрессивный ход болезни, повышенное метастазирование опухоли и сокращенную продолжительность жизни пациента. Кроме того, высокие уровни белков HGF и/или c-Met в опухолях придают устойчивость к химиотерапии и лучевой терапии. В дополнение к аномальной экспрессии HGF и cMet, каскад c-Met может быть активирован за счет генетических изменений, например мутаций c-Met,амплификации гена и реаранжировки генов. Миссенс-мутации c-MET найдены у всех лиц с выраженным наследственным папиллярным почечноклеточным раком (PRCC) и в небольшой подгруппе (13%) спорадических образцов PRCC. Некоторые из этих мутаций несут онкогенный потенциал ввиду повышенной киназной активности. Трисомия по 7 хромосоме, на которой расположены и HGF, и c-MET гены, часто имеет место при PRCC и приводит к неслучайной дупликации мутантного аллеля c-MET. Кроме того,соматические мутации c-MET идентифицированы в других злокачественных опухолях человека, включая рак желудочно-кишечного тракта, головы и шеи, печени, яичника, немелкоклеточный рак легкого и рак щитовидной железы, а также в метастазах некоторых из этих злокачественных опухолей. В противоположность PRCC, при котором мутации обычно ограничиваются киназным доменом, эти мутации часто локализуются в других участках рецептора, например в субмембранном домене. Кроме мутаций, ген cMET часто амплифицируется при раке молочной железы, печени, мозга, ободочной и прямой кишки,желудочно-кишечного тракта, легкого и желудка, что коррелирует с развитием заболевания у некоторых пациентов. Показания к применению. Нарушения сигнального каскада HGF/c-Met описаны для широкого спектра злокачественных новообразований, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, ободочной и прямой кишки, эндометрия, пищевода, желудочно-кишечного тракта, головы и шеи, почек, печени, легкого, носоглотки, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы и щитовидной железы, а также холангиокарциномы, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, синовиальной саркомы, саркомы Капоши, лейомиосаркомы и злокачественной фиброзной гистиоцитомы/фибросаркомы. Кроме того, аномальная экспрессия HGF и/или c-Met описана для гематологических злокачественных новообразований, например острого миелобластного лейкоза, T-клеточного лейкоза взрослых, хронического миелолейкоза, лимфом и множественной миеломы, а также других опухолей, например меланомы, мезотелиомы, опухоли Вильмса, глиобластомы и астроцитом (обобщено в Liu et al. (2008) Expert Opin. Investig. Drugs 17(7):997-1011). Антитела к c-Met по настоящему изобретению могут ингибировать и HGF-зависимые, и HGFнезависимые опухоли. Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения. В примерах, приведенных ниже, контрольные антитела гуманизированные IgG2 и IgG4 и мышиныеIgG (также иногда называемые mIgG1) - представляют собой изотипические контрольные антитела, неродственные настоящим антителам к с-Met. Антитела С 8, D11 и optD11 представляют собой мышиные антитела. Во всех случаях HGF человека получали из RD Systems (294). Пример 1. Антитела к c-Met. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей, полных легких и тяжелых цепей и соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности для настоящих сконструированных антител перечислены ниже в разделе, озаглавленном "Аминокислотные и нуклеотидные последовательности". Аминокислотные последовательности CDR легких и тяжелых цепей показаны в табл. 1 и 2 соответственно. Консенсусные последовательности для вариабельных областей легких и тяжелых цепей антителD11- и С 8- представляют собой консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела D11- (SEQ ID NO: 94) где X1 представляет собой Y или R, а Х 2 представляет собой А или R. Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела С 8- (SEQ ID NO: 95) где X3 представляет собой S или R, Х 4 представляет собой I или Q, X5 представляет собой Q или V, а X6 представляет собой S или R. Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела D11- (SEQ ID NO: 96) где Х 7 представляет собой N, I или R, X8 представляет собой K или P, а Х 9 представляет собой Y или F. Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела С 8- (SEQ ID NO: 97) где X10 представляет собой Y или N, X11 представляет собой G или R, X12 представляет собой S или G,X13 представляет собой А или Т, a X14 представляет собой I или W. Временную экспрессию антител осуществляли в клетках HEK293 EBNA (Edge BioSystems,90500130) согласно стандартной процедуре трансфекции. Трансфицированные клетки культивировали в стандартной бессывороточной среде, содержащей генетицин (G418) и тобрамицин в течение 48 и 120 ч при 37C после трансфекции. Антитела очищали на 60-мл колонке rProtein A Sepharose (Amersham Biosciences, 17-1279-04), следуя инструкциям изготовителя, затем концентрировали и очищали гельхроматографией (XK50/60 Superdex200, Pharmacia) с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), pH 7,4 в качестве подвижной фазы. Затем антитела фильтровали с помощью ПВДФ мембран Millev-GV, 0,22 мкм, 33 мм (Millipore,SLGV033RS) и хранили при температуре от 4 до 8C. Мышиные IgG1 антитела к c-Met 5D5 (патент США 5,686,292), обсуждающиеся ниже во многих примерах, выделяли и очищали из гибридомы НВ-11895, полученной из Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, США, как описано выше. Пример 2. Кинетика связывания антител к c-Met с различными внеклеточными доменами c-Met. Последовательности внеклеточных доменов (ECD) c-Met человека, яванского макака и крысы экспрессировали в виде гибридного белка Fc с flag- и His-маркером (Flis-маркер) на С-конце Fc (последовательности SEQ ID NO: 72-74). Эти гибридные с-Met ECD Fc белки по отдельности временно экспрессировали в клетках HEK293 EBNA и очищали согласно описанию в примере 1. Для измерения кинетики связывания антител к c-Met с ECD с-Met человека, яванского макака и крысы использовали измерительный прибор Biacore 2000. Измерения выполняли при 25C. Образцы растворяли в HBS-EP буфере (150 мМ хлорида натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,005% (вес./об.) поверхностноактивного вещества Р-20 и 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) при pH 7,4; BR-1001-88). F(ab')2 фрагмент козьих антител к IgG человека, отдельно взятый фрагментF(ab')2 (Jackson Immunoresearch Inc., 109-006-097) иммобилизовали на проточных ячейках 1-4 сенсорного чипа СМ 5 с уровнем 4000 единиц ответа (RU) с помощью амин-связывающего реагента для захвата антител к c-Met. Связывание оценивали с помощью множественных циклов. Каждый цикл выполняли при скорости потока 50 мкл/мин, цикл состоял из следующих этапов: ввод примерно 10 мкл антител к с-Met при 10 мкг/мл с ожидаемым захватом 40-100 RU, ввод 250 мкл ECD cMet-Flis-Fc человека, яванского макака или крысы (начиная со 100 нМ, используя двукратные последовательные разведения для каждого цикла), затем диссоциация в течение 20 мин и регенерация с помо- 16020398 щью 30 мкл 10 мМ гидрохлорида глицина, pH 1,5. Скорость ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивали с помощью модели "1:1 (Langmuir) binding" в программе BIAevaluation версии 4.1. При связывании антитела D11-S17Y с ECD c-Met-Flis-Fc крысы для адекватной аппроксимации данных использовали модель гетерогенного лиганда; таким образом, получили два значения сродства связывания. Результаты представлены ниже в табл. 3-5. Таблица 3 Аффинность и кинетика связывания антител к c-Met с ECD c-Met-Flis-Fc человека Таблица 4 Аффинность и кинетика связывания антител к c-Met с ECD c-Met-Flis-Fc яванского макака Таблица 5 Аффинность и кинетика связывания антител к c-Met с ECD c-Met-Flis-Fc крысы Эти данные демонстрируют, что антитела С 8-Н 241, С 8-6 и С 8-со 16 связывают ECD c-Met и человека, и яванского макака (но не крысы) с близкой аффинностью. Дополнительные данные (не приведены) указывают, что эти антитела не связывают ECD c-Met мыши вплоть до 100 нМ антител при 1 мкг/млECD, нанесенного на планшеты для твердофазного ИФА. Однако антитела D11-8B8, D11-C27G3 и D11S17Y связывают ECD c-Met человека, яванского макака и крысы. Пример 3. Картирование эпитопов. Эпитопы настоящих антител к c-Met картировали с помощью комбинации масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена (HDXMS) (Yamada et al. (2002) Rapid Commun. Mass Spectrom. 16(4):293299) и мечения диэтилполикарбонатом (DEPC) (Mendoza et al. (2008) Analy. Chem. 80 (8): 2895-2904). Реакцию водородно-дейтериевого обмена в домене Sema c-Met человека проводили в присутствии и в отсутствие антител к c-Met. Области домена Sema, которые накапливали меньше дейтерия в присутствии антитела, чем в его отсутствие, идентифицировали как эпитоп(ы) для этого антитела. DEPC может реагировать с аминогруппами поверхностно локализованных остатков лизина или гистидина в домене Sema,образуя этилкарбамат лизина или гистидина. Если эти аминокислоты локализованы в области эпитопа,они будут защищены при связывании с антителом и не будут реагировать с DEPC. Это помогало при дальнейшей локализации и/или подтверждении локализации областей эпитопа, определенной с помощьюHEK293 EBNA и очищали согласно описанию в примерах 1 и 2. Очищенный белок хранили при 4C вPBS при pH 7,4. Этот домен связывается с антителами к c-Met по настоящему изобретению с аффинностью, близкой к аффинности полноразмерного ECD c-Met человека, что указывает на то, что эпитопы для этих антител локализованы в этой области c-Met человека. Дегликозилирование и десиалирование домена Sema c-Met. Для де-N-гликозилирования 100 мкл 1,2 мг/мл раствора домена Sema c-Met обрабатывали 1 мкл раствора PNGазы F (Prozyme, GKE-5006B) при 37C в течение ночи. ЖХ/МС-анализ демонстрировал,что большая часть белка после обработки являлась дегликозилированной. Отдельно для десиалирования домена Sema 100 мкл 1,2 мг/мл раствора домена Sema c-Met обрабатывали 2 мкл 10 Ед/мл раствора нейраминидазы (Roche, Cat.10 269 611 001) при 37C в течение 1 ч. Образование комплексов домен Sema c-Met/антитело. 10 мкл раствора дегликозилированного домена Sema c-Met (1,2 мг/мл) смешивали с аликвотой раствора антител, содержавшей 29 мкг белка (2,07 мкл С 8-Н 241, 2,01 мкл D11-8B8 или 3,87 мкл неродственных контрольных Mab) и затем разбавляли 1X раствором PBS до конечного объема 40 мкл. Отдельно 5 мкл раствора десиалированного домена Sema c-Met (1,2 мг/мл) смешивали с аликвотой раствора антител, содержавшей 14 мкг белка (1,04 мкл С 8-Н 241, 1,01 мкл D11-8B8 или 1,94 мкл неродственных контрольных Mab) и затем разбавляли 1X раствором PBS до конечного объема 15 мкл. Каждый из смешанных растворов каждого антитела затем подвергали HDXMS-анализу.HDXMS-анализ. 4 мкл смеси дегликозилированного или десиалированного домена Sema c-Met/антитело смешивали с 16 мкл 100% D2O (Acros, Code 166310500; 80% D во время обмена) и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 с. Реакцию обмена гасили 50 мкл 0,5% (об./об.) раствора муравьиной кислоты в воде при 0C. Сразу после гашения раствор обрабатывали 2 мкл 5 мг/мл (об./об.) раствора пепсина (Sigma, Cat.P6887) при 0C в течение 3,5 или 4 мин. Сразу после этого гидролизованный раствор вручную вводили в колонку для обращенно-фазной ВЭЖХ (Polymer Laboratories, Part 1912-1802; 2,150 мм, размер пор 1000 , размер частиц 8 мкм). Поток буфера для ВЭЖХ от ВЭЖХ-насоса (Waters, 2795 HPLC) проходил через металлическую трубку (приблизительно 1 мл) в ручной инжектор. Элюат колонки затем подавали на масс-спектрометр Micromass LCT Premier или SYNAPT. Металлическую трубку, петлю инжектора и колонку погружали в водную баню со льдом. Колонку уравновешивали 99% А (0,05% (об./об.) водного раствора ТФУК (трифторуксусной кислоты и 1% В (0,04% (об./об.) ТФУК в ацетонитриле) при скорости потока 0,2 мл/мин. Изократическое градиентное элюирование осуществляли в течение 1 мин, от 1 до 10% В в течение 1 мин, до 40% В в течение 12 мин, до 90% В в течение 4 мин при 3 мин задержки, а затем быстро восстанавливали исходные условия. Масс-спектрометрию осуществляли на масс-спектрометре Micromass LCT Premier при положительном распылении в режиме W при следующих настройках: напряжение на капилляре 1,5 кВ, напряжение на конусе 100 В, апертура 1 25 В, диапазон массовых чисел от 200 до 2000, температура высушивания 150C, поток сушащего газа 500 л/ч. Масс-спектр каждого пептического пептида c-Met получали после D/H-обмена с или без антител к c-Met. Среднюю массу каждого пептида рассчитывали согласно распределению изотопов в наиболее интенсивном ионном пике.DEPC-мечение комплексов c-Met/антитело. 8,3 мкл 1,2 мг/мл раствора домена Sema c-Met человека смешивали с раствором антител (24 мкг белка: 1,71 мкл С 8-Н 241, 1,67 мкл D11-8B8 или 3,2 мкл неродственных контрольных Mab) и с 1X раствором PBS до конечного объема 76 мкл. Каждую смесь cMet/антитело обрабатывали 4 мкл 10 мг/мл (об./об.) раствора DEPC в изопропаноле при комнатной температуре в течение 5 мин и затем гасили 10 мкл 20 мг/мл раствора гистидина в 0,1 М Трис-HCl буфере,pH 8, и 10 мкл 0,2 мг/мл раствора лизина в 0,1 М Трис-HCl буфере, pH 8. Каждый раствор смешивали с 5 мкл 0,2 мг/мл (вес./об.) раствора трипсина свиньи (Promega, Cat.V528A), и половину смеси смешивали с 0,5 мкл 50 мг/мл (вес./об.) раствора дитиотрейтола. Каждый раствор образца инкубировали при 37C в течение 5 ч и затем обрабатывали 0,5 мкл раствора PNGазы F в течение следующего часа. Каждый гидролизованный раствор подкисляли 2 мкл 10% (об./об.) раствора уксусной кислоты. К невосстановленному гидролизату без добавленного дитиотрейтола добавляли 2 мкл 100 мг/мл раствора ТСЕР (трис(2 карбоксиэтил)фосфин-гидрохлорида) (Sigma, Cat.C4702-2G). Каждый из растворов подвергали ЖХ/МС-анализу, используя Waters Acquity UPLC и масс-спектрометр Waters SYNAPT. При ВЭЖХ использовали колонку Waters Acquity UPLC ВЕН С 8 (2,150 мм, 1,7 мкм, Waters, part 186002877) при 60C, пептиды элюировали градиентом ацетонитрила в системе подвижной фазы ВЭЖХ вода/ацетонитрил/ТФУК. Для гидролизатов использовали время прогона 45 мин. Колонку уравновешивали 99% А (0,05% (об./об.) водного раствора ТФУК) и 1% В (0,04% (об./об.) ТФУК в ацетонитриле) при скорости потока 0,2 мл/мин. Градиентное элюирование осуществляли в изократическом состоянии в течение 2 мин, от 1 до 25% В в течение 25 мин, до 45% В в течение 10 мин, до 90% В в течение 1 мин с задерж- 18020398 кой 1,5 мин (в тот же самый промежуток времени, скорость потока 0,3 мл/мин) и затем быстро восстанавливали до 1% В. Результаты. По-видимому, Mab C8-H241 связывают конформационный эпитоп, включающий четыре области домена Sema c-Met, расположенных на -цепи внеклеточного домена c-Met человека (аминокислотные остатки 25-307 последовательности SEQ ID NO: 75): 121VVDTYYDDQL130 (SEQ ID NO: 77),131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO: 78),179ALGAKVLSSVKDRFINFF196 (SEQ ID NO: 79) и 216VRRLKETKDGFM227 (SEQ ID NO: 80). Более конкретно, Mab C8-H241 связывает c-Met за счет взаимодействия с одним или более аминокислотных остатков в пределах 123DTYYDD128 (SEQ ID NO: 81) включительно,144HVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO: 82) включительно,192FINF195 (SEQ ID NO: 83) включительно и 220KETKDGFM227 (SEQ ID NO: 84) включительно. Связывание Mab C8-H241 с областью 144HVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO: 82) делает его способным связывать внеклеточный домен с-Met и человека (SEQ ID NO: 75) и яванского макака (аминокислоты 25-932 последовательности SEQ ID NO: 73) с сопоставимой аффинностью, но не c-Met крысы или мыши вплоть до 100 нМ антител при анализе связывания.Mab D11-8B8 связывается с -цепью домена Sema c-Met, видимо, локализованной в одной области,т.е. аминокислотными остатками в пределах линейного эпитопа в рамках аминокислотной последовательности 84YKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL107 (SEQ ID NO: 85) включительно, более конкретно в области 95CFPCQDCSSKA105 (SEQ ID NO: 86) включительно. Эпитоп для Mab D11-8B8 дополнительно подтвержден экспериментами по выделению эпитопа (Dhungana et al. (2009) Methods Mol. Biol. 524:87101). Домен Sema c-Met гидролизовали трипсином свиньи (Promega) и затем смешивали гидролизат с биотинилированным Mab D11-8B8, используя комплект EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Prod. 1754210), для связывания пептидов c-Met. Биотинилированные D11-8B8 с или без связанных пептидовc-Met захватывали стрептавидин-агарозной смолой высокой емкости (Thermo Scientific, Prod.20359). Связанные пептиды высвобождали 0,15% раствором (об./об.) муравьиной кислоты в H2O и затем идентифицировали ЖХ/МС. Пример 4. Предпочтительное связывание антител с c-Met no сравнению с ECD RON и Plexin A2.RON и Plexin A2 представляют собой белки человека, наиболее родственные по последовательности c-Met. Данный эксперимент сравнивал специфичность связывания антител к c-Met с ECD c-Met, RON и Plexin A2. Лунки 96-луночных планшетов с высокой степенью фиксации для ИФА/РИА (Costar, 2592) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл раствора гибрида "внеклеточный домен (ECD) c-Met человека - Fc - Flis" (SEQID NO: 72), RON-ECD-Fc (RD Systems, 1947-MS) или PlexinA2-ECD-Fc (Abnova, Тайбэй, Тайвань Н 00005362-Р 01) в буфере для иммобилизации (BioFX Labs,COAT-1000-01) в течение ночи при 4C. Лунки аспирировали, несвязавшиеся сайты связывания блокировали добавлением 200 мкл блокирующего буфера (Трис-солевой буферный раствор, pH 8,0, с 0,05% (об./об.) полисорбата 20 (Tween-20) (TBS-T)(BioFX Labs,WSHW-1000-01) и 1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Jackson Immuno, 001-000-162 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали отмывочным буфером (TBS-T), добавляли 100 мкл/лунку последовательных разведений 1:6 антител к c-Met в блокирующем буфере (начиная с 100 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали и инкубировали в присутствии 100 мкл/лунку раствора козьих F(ab)2 к IgG человека, конъюгированных с ПХ (Jackson ImmunoResearch Labs 109-036-097) в блокирующем буфере в течение 90 мин. После промывки планшетов добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата (BioFx, TMBW-1000-01) и инкубировали планшеты в течение 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл/лунку раствора стоп-реагента (BioFx,LSTP-1000-01) для остановки реакции. Развившийся колориметрический сигнал считывали при длине волны 450 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax 190 (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния, США). Связывание антител к c-Met с ECD c-Met, RON и PlexinA2 было пропорционально образованию цветового сигнала. Как показано в табл. 6, антитела к c-Met по настоящему изобретению - и С 8, и D11 - предпочтительно связываются с ECD с-Met человека по сравнению с ECD RON или ECD PlexinA2. Таблица 6 Предпочтительное связывание антител к c-Met с ECD c-Met человека по сравнению с ECD RON и Plexin A2 Пример 5. Антитела к c-Met блокируют связывание HGF/c-Met. Для определения ингибирования связывания HGF с c-Met настоящими антителами к c-Met использовали анализ связывания in vitro. Лунки 96-луночных планшетов с высокой степенью фиксации для ИФА/РИА (Costar, 2592) покрывали 100 мкл раствора ECD c-Met человека-Fc-Flis (SEQ ID NO: 72) (2 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) в течение ночи при комнатной температуре; четырежды промывали отмывочным буфером (Трис-солевой буферный раствор, pH 8,0, с 0,05% (об./об.) полисорбата 20 (TWEEN-20)(TBS-Т) (BioFX Labs,WSHW-1000-01) на устройстве отмывки планшетов; блокировали добавлением 300 мкл блокирующего буфера (TBS-T с добавлением 1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина(БСА) (Jackson Immuno, 001-000-162; и инкубировали в течение 60 мин при 37C. Затем блокирующий буфер удаляли из лунок и в каждую лунку добавляли 50 мкл антител в блокирующем буфере с конечными концентрациями согласно указаниям в табл. 7 соответственно. Добавляли блокирующий буфер в контрольные лунки, содержащие только HGF. Планшеты с антителами к c-Met инкубировали в течение 90 мин при 37C. В каждую лунку, кроме контрольных лунок, содержащих только антитела, добавляли 50 мкл фактора роста гепатоцитов человека (HGF) (RD Systems, 294) в блокирующем буфере с конечной концентрацией 10 нг/мл. Планшеты, содержащие смесь антитела к с-Met/HGF, инкубировали на планшетном шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем лунки четырежды промывали TBS-T на устройстве отмывки планшетов. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора биотинилированных антител к HGF (RD Systems,BAF294) в блокирующем буфере с конечной концентрацией 100 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Лунки вновь четырежды промывали TBS-T на устройстве отмывки планшетов. В каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидазы хрена (ПХ) (RD Systems, DY998), разведенной 1:200 в блокирующем буфере. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Лунки четырежды промывали TBS-T на устройстве отмывки планшетов. Затем добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата (BioFx,TMBW-1000-01) и инкубировали планшеты в течение 10 мин при комнатной температуре. Для остановки реакции добавляли 100 мкл/лунку раствора стоп-реагента (BioFx,LSTP-1000-01). Образцы считывали при длине волны 450-570 нм на устройстве для считывания микропланшетов (Spectra, MAX 190), не вычитая фоновый сигнал. Как показано в табл. 7, и антитела С 8, и D11 по настоящему изобретению блокируют связывание Таблица 7 Ингибирование связывания HGF человека с c-Met человека антителами С 8- и D11 Сокращения: СРЕД. - среднее значение; Станд. ош. - стандартная ошибка Пример 6. Антитела к c-Met индуцируют ослабленное фосфорилирование с-Met no сравнению с фактором роста гепатоцитов и агонистом Mab 5D5. При стимуляции HGF клеточная линия карциномы легких А 549 демонстрирует повышенное фосфорилирование c-Met по остатку тирозина 1349. Для измерения агонистической активности различных антител к c-Met в отсутствие HGF, а также Mab 5D5 и самого HGF использовали твердофазный ИФА фосфорилированного c-Met (p-Met). Клетки А 549 (АТСС, CCL-185) культивировали на среде Хэма F12K+2 мМ глутамина (Invitrogen, 21127-022)+10% FBS (Invitrogen, 10082). Клетки высевали на 96-луночные планшеты из расчета 6104 клеток/лунку на богатую сывороточную среду и инкубировали в течение ночи при 37C и 5% (об./об.)CO2. Среду удаляли из лунок и клетки оставляли голодать в 100 мкл среды Хэма F12K+2 мМ глутамина+ 0,5% FBS в течение 6 ч при 37C и 5% (об./об.) CO2. Антитела или HGF разбавляли голодной культуральной средой, добавляли в конечных концентрациях, указанных в табл. 8, и инкубировали в течение 15 мин при 37C. Среду отбирали, клетки лизировали в 50 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис (Invitrogen, 15567-027), 150 мМ NaCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Invitrogen, 15575038), 50 мМ NaF (Sigma, S1504), 1% (об./об.) октилфеноксиполиэтоксиэтанола (TRITON-X 100; Sigma,Т 8787), 2 мМ ортованадата натрия (EMD Chemicals, Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США, 567540),ингибитор протеаз (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США; Р 8340) и смесь ингибиторов фосфатаз II(Sigma Р 5726 на лунку и инкубировали на льду в течение 15-20 мин. Клеточные лизаты использовали при твердофазном ИФА, описанном ниже, для определения фосфорилирования c-Met по остатку Y1349. Антитела для захвата c-Met разбавляли буфером для иммобилизации Bup H (Thermo FisherScientific, Уолтем, штат Массачусетс, США, 28382) до 2 мкг/мл, добавляли на планшеты для твердофазного ИФА (Greiner Bio-One, Монро, штат Северная Каролина, США, 655081) и инкубировали в течение ночи при 4C. Лунки аспирировали, трижды промывали TBS-T (BioFX, Оуингс-Миллз, штат Мэриленд,США, WSH-1000-01) и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (TBS-T плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали TBS-T. Затем добавляли 25 мкл клеточных лизатов и 75 мкл блокирующего буфера и инкубировали планшеты в течение ночи при 4C. Затем планшеты трижды промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора поликлональных антител к c-Met pY1349 (Cell Signaling Technology, Данверс, штат Массачусетс, США,3133) в блокирующем буфере и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл козьих поликлональных антител к IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой и разведенных 1/10000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories,Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США, 111-035-144) в блокирующем буфере и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (BioFX, TMBW-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стоп-реагента (BioFX, LSTP-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния, США), значения образцов определяли с помощью программы SOFTmax Pro 4,8 (Molecular Devices). Результаты представлены в табл. 8. Таблица 8 Действие антител к c-Met, HGF и агониста Mab 5D5 на фосфорилирование c-Met в клетках А 549 Данные демонстрируют, что HGF и агонист c-Met Mab 5D5 сильно стимулируют фосфорилирование c-Met, в то время как настоящие c-Met Mab C8-H241 и С 8-6 слабо стимулируют фосфорилированиеc-Met. Аналогичные результаты получили при использовании клеточных линий НСТ 116, Н 460 и MDAMB-231.Mab D11-8B8 дают аналогичные результаты. Пример 7. Антитела к c-Met ингибируют HGF-индуцированное фосфорилирование c-Met. Связывание HGF с c-Met приводит к фосфорилированию тирозина в молекулах c-Met и активации сигнального пути c-Met. В данном примере для оценки ингибирования HGF-индуцированного фосфори- 23020398 лирования c-Met по остаткам тирозина 1230, 1234 и 1235 использовали клеточную линию рака толстой кишки человека НСТ 116. Клетки НСТ 116 (АТСС, Манассас, штат Виргиния, США, CCL-247) ресуспендировали в среде Мак-Коя 5 А (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США, 16600-082) с добавлением пенициллина/стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, 10082-147) из расчета 150000 клеток/мл. 0,2 мл ресуспендированных клеток НТС 116 вносили в 96-луночные титрационные микропланшеты (Corning, Лоуэлл, штат Массачусетс, США, 3596) из расчета 300000 клеток/лунку и инкубировали клетки в течение 48 ч при 37C и 5% (об./об.) CO2. Затем удаляли культуральную среду и оставляли клетки голодать в 100 мкл среды Мак-Коя 5 А с добавлением пенициллина/стрептомицина и 0,1 (вес./об.) БСА в течение 24 ч при 37C и 5% (об./об.) СО 2. Добавляли 25 мкл раствора азида натрия (конечная концентрация 0,01% (вес./об. (Sigma, S2002) с немедленным последующим добавлением 25 мкл 8 Х разведений антител к c-Met в среде Мак-Коя 5 А с добавлением пенициллина/стрептомицина и 0,1 (вес./об.) БСА и инкубировали клетки в течение 30 мин при 37C и 5%(об./об.) CO2. В каждую лунку добавляли 50 мкл HGF в конечной концентрации 200 нг/мл и инкубировали клетки в течение следующих 15 мин при 37C и 5% (об./об.) CO2. Затем удаляли среду и добавляли 50 мкл буфера для лизирования клеток (10 мМ Трис (Invitrogen, 15567-027), 150 мМ NaCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Invitrogen, 15575-038), 50 мМ NaF (Sigma, S1504), 1% (об./об.) октилфеноксиполиэтоксиэтанола (TRITON-X 100; Sigma, T8787), 2 мМ ортованадата натрия (EMDChemicals, Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США, 567540) и полный ингибитор протеаз, не содержащий ЭДТА (Roche, Базель, Швейцария, 11836170001). Клетки инкубировали в лизирующем буфере при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Клеточные лизаты анализировали на фосфорилирование тирозина в составе c-Met с помощью твердофазного ИФА следующим образом. Антитела для захвата c-Met разбавляли буфером для иммобилизации (BioFX, Глендора, штат Калифорния, США, СОАТ-1000-01) до концентрации 2 мкг/мл. 110 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА (Greiner Bio-One, Монро, штат Северная Каролина, США,655081) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4C. Лунки аспирировали, дважды промывалиTBS-T и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (TBS-T плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч. Планшеты дважды промывали TBS-T. Затем добавляли 25 мкл клеточных лизатов и 75 мкл блокирующего буфера или 100 мкл разведения клеточных лизатов MKN45 (разбавленных блокирующим буфером, в качестве стандарта) и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора поликлональных антител к c-Met pYpYpY1230/1234/1235 (Invitrogen, 44-888G) в блокирующем буфере и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали TBS-T. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл козьих поликлональных антител к IgG кролика,конъюгированных с пероксидазой и разведенных 1/12000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, ВестГроув, штат Пенсильвания, США, 111-035-144) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты шестикратно промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (BioFX, TMBW-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стоп-реагента (BioFX, LSTP-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм с коррекцией при 570 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax 190 (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния, США). Стандартную кривую устанавливали, используя 4 параметрический анализ, значения образцов определяли с помощью программы SOFTmax Pro 3.1.2 (Molecular Devices). Процент ингибирования фосфорилирования тирозина в составе с-Met устанавливали как среднее значение при обработке HGF без добавления антител к c-Met (0% ингибирования), а 100% ингибирования устанавливали как среднее значение при обработке азидом натрия (без обработки HGF или антителами к c-Met). В табл. 9 показаны средние значения по трем повторам обработки на эксперимент для трех экспериментов со стандартными ошибками. Данные демонстрируют, что пять из шести антител к c-Met по настоящему изобретению значительно ингибируют HGF-индуцированное фосфорилирование тирозина в составе c-Met по сравнению с изотипическими контролями IgG2 и IgG4 человека.% ингибирования HGF-стимулированного p-Met по данным твердофазного ИФА Пример 8. Индукция интернализации c-Met антителами к c-Met. В экспериментах, описанных в этом примере, для демонстрации того, что настоящие антитела к cMet связываются с молекулами c-Met на поверхности клеток и индуцируют интернализацию c-Met, использовали сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS). Использованные клетки MKN45 отличаются высоким уровнем конститутивной экспрессии общего с-Met и демонстрируют HGFнезависимое фосфорилирование c-Met в результате амплификации гена МЕТ. По-видимому, интернализация c-Met индуцирует деградацию c-Met (см. примеры 10 и 19), что приводит к ингибированию сигнального пути c-Met. В лунки 6-луночных планшетов для тканевых культур (Costar, 3598) засевали по 1,5105 клеток опухоли желудочно-кишечного тракта человека MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health ScienceResearch Resource Bank, JCRB0254) в 2 мл культуральной среды (RPMI-1640 (Invitrogen, 11835); 10%(об./об.) FBS (Invitrogen, 10082); 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, 25030); 100 Ед/500 мл пенициллина G и 100 мкг/500 мл стрептомицина (Invitrogen, 15140. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37C,95% относительной влажности и 5% (об./об.) CO2. Затем в лунки добавляли антитела в конечной концентрации 5 мкг/мл. После обработки в течение ночи из лунок удаляли культуральную среду, заменяя ее 1 мл раствора для диссоциации клеток, не содержащего ферментов (Chemicon, S-014-B). После инкубирования в течение 5 мин при комнатной температуре клетки собирали в центрифужные пробирки, однократно промывали культуральной средой, после чего еще раз промывали буфером для фиксации (DPBS с добавлением 1% (вес./об.) БСА и 0,01% (вес./об.) азида натрия). Перед окрашиванием клеток антитела кc-Met, распознающие иной эпитоп, чем настоящие антитела к c-Met, метили с помощью комплекта для мечения моноклональных антител Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit (Molecular Probes,Юджин, штат Орегон, США, А-20181) согласно инструкциям поставщика. К клеткам добавляли 100 мкл буфера для фиксации, содержащего 2 мкг/мл антител, меченных Alexa Fluor 488, после чего инкубировали в течение 60 мин на льду. Затем клетки однократно промывали буфером для фиксации и ресуспендировали в DPBS, содержащем 2 мкг/мл пропидиум-иодида (для окрашивания мертвых клеток). Количество молекул c-Met, оставшихся на поверхности клеток, анализировали с помощью FACS и в каждом образце обнаруживали 10000 событий. Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток отражала количество молекул c-Met,которые остались на поверхности клеток после обработки антителами к c-Met. Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 10. Данные демонстрируют, что средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток, обработанных настоящими антителами к c-Met, ниже, чем в клетках, обработанных соответствующими изотипическими контрольными антителами mIgG, что указывает на индукцию интернализации c-Met настоящими антителами к c-Met. Более того, средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток, обработанных настоящими антителами к c-Met, ниже, чем в клетках, обработанных контрольными агонистическими антителами к c-Met 5D5. % интернализации можно рассчитать следующим образом:% интернализации=[1-(средняя флуоресценция тестируемого антитела, разделенная на среднюю флуоресценцию изотипического контрольного антитела)]100. Данные по интернализации означают, что настоящие антитела индуцируют димеризацию c-Met человека. Данные в примерах 9 и 19 демонстрируют, что антитела С 8- и D11- также индуцируют деградацию и снижают фосфорилирование c-Met. Дополнительные результаты по интернализации получили с помощью конфокальной микроскопии,используя мышиные антитела С 8 с флуоресцентной меткой и клетки MKN45 и Caki-1. При использовании антител С 8-Н 241, С 8-6, С 8-со-16 и мышиных антител D11 получили аналогичные результаты на клетках яванского макака NIH3T3, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей c-Met яванского макака. Антитела С 8-Н 241, С 8-6, С 8-со-16 и optD11 также индуцируют интернализацию c-Met в клеткахNIH3T3, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей мутацию киназного домена c-Met человека М 1149 Т. Антитела С 8-Н 241, С 8-6, С 8-со-16 и мышиные антитела D11 также индуцируют интернализацию c-Met в клетках немелкоклеточного рака легких Н 1437, содержащих мутацию субмембранного домена c-Met R988C. Обе мутации вызывают конститутивную активацию c-Met. Пример 9. Ингибирование лиганд-независимой пролиферации опухолевых клеток in vitro антителами. В этом исследовании производили оценку ингибирования роста опухолевых клеток in vitro антителами к c-Met в HGF-независимых клетках MKN45 в отсутствие лиганда HGF.c-Met и изотипические контрольные антитела разбавляли культуральной средой (RPMI-1640 (Invitrogen, 11835); 10% (об./об.) FBS, 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, 25030); 100 Ед/500 мл пенициллина G и 100 мкг/500 мл стрептомицина (Invitrogen, 15140 до 2 конечных концентраций, указанных в табл. 11, и в каждую лунку 96-луночных планшетов для тканевых культур (PerkinElmer 1450-517) добавляли 50 мкл 2 растворов антител. Клетки MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health Science ResearchResource Bank, JCRB0254) поддерживали на вышеуказанной среде и ресуспендировали в той же среде до концентрации 1105 клеток/мл. 50 мкл этой суспензии MKN45 добавляли в каждую лунку до количества 5103 клеток/лунку. Затем планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37C, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) CO2. В течение последних 6 ч культивирования выполняли импульсное мечение клеток 3 Н-тимидином (МР Biomedicals, Солон, штат Огайо, США 24066) из расчета 1 мкКи/лунку при 37C, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) CO2. Затем среду удаляли и однократно промывали клетки DPBS. После этого в каждую лунку добавляли 200 мкл Optiphase Supermix (PerkinElmer, 1200439). Планшеты герметично закрывали и инкубировали по меньшей мере в течение 1 ч при комнатной температуре. 3 Н-тимидин, ассимилированный клетками, подсчитывали в течение 1 мин с помощью сцинтилляционного счетчика. Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 11. Таблица 11 Ингибирование ассимиляции 3 Н-тимидина клетками MKN45 различными антителами С 8- и D11 Сокращения: Сред. = среднее; соб./мин = событий/минуту; Станд. ош. = стандартная ошибка Эти данные демонстрируют, что различные антитела С 8- и D11- по настоящему изобретению ингибируют HGF-независимую пролиферацию клеток MKN45, что доказывается снижением ассимиляции 3 Нтимидина. Аналогичные результаты получили на опухолевых клетках SNU5 и NUGC-4, каждые из которых демонстрируют конститутивную сверхэкспрессию и фосфорилирование c-Met. Пример 10. Снижение количества фосфорилированного и общего c-Met и дефект отщепления внеклеточного домена c-Metn в ответ на антитела к c-Met. В данном примере исследовали, приводит ли обработка клеток MKN45 антителами к c-Met по настоящему изобретению к снижению фосфорилированного c-Met (p-Met) и общего c-Met. Кроме того,данное исследование использовали для определения того, индуцирует ли обработка антителами к c-Met отщепление ECD c-Met в среду, кондиционированную MKN-45.c-Met и изотипические контрольные антитела разбавляли культуральной средой (RPMI-1640 (Invitrogen, 11835); 10% (об./об.) FBS (Invitrogen, 10082), 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, 25030); 100 Ед/500 мл пенициллина G и 100 мкг/500 мл стрептомицина (Invitrogen, 15140 до 2 Х конечных концентраций,указанных в табл. 12, и в каждую лунку 96-луночных планшетов для тканевых культур (Costar, 3596) добавляли 50 мкл 2 Х растворов антител. Клетки MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health ScienceResearch Resource Bank, JCRB0254) поддерживали на вышеуказанной среде и ресуспендировали в той же среде до концентрации 1105 клеток/мл. 50 мкл этой суспензии MKN45 добавляли в каждую лунку до количества 5103 клеток/лунку. Затем планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37C, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) СО 2 и получали клеточные лизаты согласно описанию в примере 7. Кроме того, собирали кондиционированную среду после каждой обработки для количественной оценкиECD c-Met. Уровни p-Met и общего c-Met в клеточных лизатах определяли с помощью твердофазного ИФА и нормализовали по концентрации белка в лизате (определенной по ВСА, Pierce 23225). Фосфорилированный p-Met. Фосфорилирование c-Met по остаткам тирозина 1230, 1234 и 1235 определяли согласно описанию в примере 7. Общий c-Met и отщепление ECD c-Met. Для твердофазного ИФА общего c-Met и ECD c-Met антитела для захвата c-Met разбавляли буфером для иммобилизации (BioFX, Глендора, штат Калифорния, США, СОАТ-1000-01) до концентрации 2 мкг/мл. 110 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА(Greiner Bio-One, Монро, штат Северная Каролина, США, 655081) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4C. Лунки аспирировали, дважды промывали TBS-Т и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (TBS-T плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты дважды промывали TBS-T. Затем добавляли лизаты клеток MKN45, кондиционированную среду MKN45 или внеклеточный домен (ECD) c-Met (SEQ ID NO:75) (в качестве стандарта) и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали TBS-T. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора биотинилированных вторых антител (Mab 5D5) в блокирующем буфере, которые связывают эпитоп c-Met, отличающийся от эпитопа антител для захвата, и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали TBS-T. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой и разведенного 1/12000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США,016-030-084) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты шестикратно промывали TBS-T. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'тетраметилбензидина (BioFX, TMBW-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стопреагента (BioFX, LSTP-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм с коррекцией при 570 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax 190 (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния, США). Стандартную кривую устанавливали, используя 4-параметрический анализ, значения образцов определяли с помощью программы SOFTmax Pro 3.1.2 (Molecular Devices). Как показано в табл. 12, данные твердофазного ИФА p-Met и общего c-Met выявили, что обработкаD11-8B8 максимально снижает p-Met приблизительно на 75%, а общий c-Met - на 63%. Как отмечено в примере 8, эти данные демонстрируют, что антитела С 8- и D11- индуцируют деградацию c-Met и снижают фосфорилирование c-Met. Данные в табл. 12 также показывают, что обработка антителами к c-Met C8-H241 и D11-8B8 не индуцирует отщепления и сбрасывания ECD c-Met. Таблица 12 Действие антител С 8- и D11- на фосфорилированный c-Met, общий c-Met и отщепление внеклеточного домена c-Met в лизатах клеток MKN45 и кондиционированной среде Процент ингибирования фосфорилированного c-Met в MKN45 Процент ингибирования общего c-Met в MKN45 Пример 11. Агонистическая активность антител в опухолевых клетках Caki-1 в отсутствие HGF. Клетки почечно-клеточного рака Caki-1 пролиферируют в ответ на HGF. В данном примере выполняли проверку активации с-Met в клетках Caki-1 антителами к c-Met для оценки агонистической активности антител к c-Met по настоящему изобретению. В лунки 96-луночных планшетов для тканевых культур засевали по 5000 клеток светлоклеточного рака почек человека Caki-1 (АТСС, НТВ-46) в культуральной среде Мак-Коя 5 А (Invitrogen, 16600) с добавлением 10% (об./об.) FBS, 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, 25030), 100 Ед/500 мл пенициллина G и 100 мкг/500 мл стрептомицина (Invitrogen, 15140). После культивирования в течение 24 ч клетки оставляли голодать в среде с низким содержанием сыворотки (0,5% (об./об.) FBS) в течение следующих 24 ч. Затем клетки культивировали в присутствии антител к c-Met и контрольных антител в среде с низким содержанием сыворотки в конечных концентрациях, указанных в табл. 13, в течение 24 ч при 37C, 95% относительной влажности, 5% (об./об.) СО 2. В течение последних 6 ч культивирования выполняли импульсное мечение клеток 3 Н-тимидином (МР Biomedicals, Солон, штат Огайо, США 24066) из расчета 1 мкКи/лунку при 37C, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) CO2. Затем среду удаляли и однократно промывали клетки DPBS. После этого в каждую лунку добавляли 200 мкл Optiphase Supermix(PerkinElmer, 1200-439). Затем планшеты герметично закрывали и инкубировали по меньшей мере в течение 1 ч при комнатной температуре. 3 Н-тимидин, ассимилированный клетками, подсчитывали в течение 1 мин с помощью сцинтилляционного счетчика. Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 13. Таблица 13 Действие антител С 8- и D11- на ассимиляцию 3 Н-тимидина в клетках Caki-1 в отсутствие HGF Сокращения: Сред. = среднее; соб/мин = событий/минуту; Станд. ош. = стандартная ошибка Эти данные демонстрируют, что антитела к c-Met C8-H241, С 8-6, С 8-со-16 и D11-8B8 не вызывают существенного увеличения поглощения тимидин-[метил-3 Н] клетками Caki-1 по сравнению с изотипическими контрольными IgG. D11-C27G3 и D11-S17Y вызывают слабую, переменную, но статистически значимую стимуляцию поглощения тимидин-[метил-3 Н] клетками Caki-1 по сравнению с изотипически- 29