Получение 6-аминокапроновой кислоты из α-кетопимелиновой кислоты
Номер патента: 19163
Опубликовано: 30.01.2014
Авторы: Шюрманн Мартин, Трефцер Аксель Кристоф, Де Вильдеман Стефаан Мари Андре, Раемакерс-Франкен Петронелла Катарина
Формула / Реферат
1. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, в котором:
(i) α-кетопимелиновую кислоту превращают в 5-формилпентаноат и
(ii) 5-формилпентаноат превращают в 6-аминокапроновую кислоту, где по меньшей мере одна реакция катализируется биокатализатором, где биокатализатор для стадии (i) включает фермент, способный катализировать декарбоксилирование α-кетопимелиновой кислоты или аминокислоты, и биокатализатор для стадии (ii) включает фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование.
2. Способ по п.1, в котором фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование, выбирают из группы аминотрансфераз (Е.С. 2.6.1) и дегидрогеназ аминокислот (Е.С.1.4.1).
3. Способ по п.2, в котором аминотрансферазу или дегидрогеназу аминокислот выбирают из группы β-аминоизобутират:α-кетоглутарат-аминотрансфераз, β-аланин-аминотрансфераз, аспартат-аминотрансфераз, 4-аминобутират-аминотрансфераз, (ЕС 2.6.1.19), L-лизин-6-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 5-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48), 2-аминогексонат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67), лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71) и лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18).
4. Способ по п.2 или 3, в котором фермент выбирают из группы ферментов, способных катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование из организма, выбранного из группы Vibrio; Pseudomonas; Bacillus; Mercurialis; Asplenium; Ceratonia; млекопитающих; Neurospora; Escherichia; Thermus; Saccharomyces; Brevibacterium; Corynebacterium; Proteus; Agrobacterium; Geobacillus; Acinetobacter; Ralstonia; Salmonella; Rhodobacter и Staphylococcus, в частности из организма, выбранного из группы Bacillus subtilis, Bacillus weihenstephanensis, Rhodobacter sphaeroides, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Nitrosomonas europaea, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas syringae, Rhodopseudomonas palustris, Vibrio fluvialis и Pseudomonas aeruginosa.
5. Способ по любому из пп.2-4, в котором используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, или гомолог любой из этих последовательностей.
6. Способ по п.1, в котором ферментом, способным катализировать декарбоксилирование, является декарбоксилаза (ЕС 4.1.1).
7. Способ по п.6, где декарбоксилазу выбирают из группы глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), декарбоксилаз α-кетокислот с разветвленной цепью, α-кетоизовалератдекарбоксилаз, α-кетоглутаратдекарбоксилаз, пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1) и оксалоацетаткарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3).
8. Способ по п.6 или 7, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, является ферментом из организма или его части, выбранных из группы Cucurbitaceae; Saccharomyces; Candida; Hansenula; Kluyveromyces; Rhizopus; Neurospora; Zymomonas; Escherichia; Mycobacterium; Clostridium; Lactobacillus; Streptococcus; Pseudomonas и Lactococcus.
9. Способ по любому из пп.6-8, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 46, или гомолог любой из этих последовательностей.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором α-кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 5-формилпентаноат в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование α-кетокислоты, и 5-формилпентаноат биокаталитически превращают в 6-аминокапроновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование 5-формилпентаноата.
11. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, в котором α-кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в α-аминопимелиновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование α-кетопимелиновой кислоты с образованием посредством этого α-аминопимелиновой кислоты, и α-аминопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 6-аминокапроновую кислоту в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование аминокислоты.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором α-кетопимелиновая кислота получена из природного источника.
13. Способ получения капролактама, предусматривающий циклизацию 6-аминокапроновой кислоты, полученной способом по любому из предыдущих пунктов, с образованием посредством этого капролактама.
14. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью.
15. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, или ее гомолог.
16. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14 или 15, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 46, или гомолог любой из этих последовательностей.
17. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью аминотрансферазы α-кетопимелиновой кислоты или активность дегидрогеназы α-кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-аминопимелиновой кислоты.
18. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.17, в которой этот биокатализатор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, или ее гомолог.
19. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-18, содержащая одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в получении альфа-кетопимелиновой кислоты из альфа-кетоглутаровой кислоты.
20. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-19, где эта клетка-хозяин выбрана из группы Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Hansenula, Bacillus, Corynebacterium и Escherichia.
21. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-20, содержащая ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, представленных любой последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, и их функциональных аналогов.
22. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, и их функциональных аналогов.
Текст
Это изобретение относится к способу получения 6-аминокапроновой кислоты (далее называемой здесь "6-АСА") с использованием биокатализатора. Кроме того, это изобретение относится к способу получения -капролактама (далее называемого здесь "капролактамом") циклизацией такой 6-АСА. Кроме того, это изобретение относится к клетке-хозяину, микроорганизму или полинуклеотиду, которые могут быть использованы в получении 6-АСА или капролактама.(DE), Трефцер Аксель Кристоф (NL),Де Вильдеман Стефаан Мари Андре(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Это изобретение относится к способу получения 6-аминокапроновой кислоты (далее называемой"6-АСА"). Это изобретение относится также к способу получения -капролактама (далее называемого"капролактамом") из 6-АСА. Кроме того, это изобретение относится к клетке-хозяину, которая может быть использована в получении 6-АСА или капролактама. Сведения о предшествующем уровне техники Капролактам является лактамом, который может быть использован для получения полиамида, например найлона-6 или найлона-6,12 (сополимера капролактама и лауролактама). Различные способы получения капролактама из химикалиев органического синтеза известны в данной области и включают в себя получение капролактама из циклогексанона, толуола, фенола, циклогексанола, бензола или циклогексана. Эти промежуточные соединения получают обычно из минерального масла. Ввиду растущей потребности получения материалов с использованием более длительно поддерживаемой технологии было бы желательным обеспечение способа, в котором капролактам получают из промежуточного соединения,которое может быть получено из биологически возобновляемого источника или по меньшей мере из одного промежуточного соединения, которое превращается в капролактам при помощи биохимического способа. Кроме того, было бы желательным обеспечение способа, который требует меньше энергии, чем общепринятые химические процессы, использующие органические химикалии из нефтехимического источника. Известно получение капролактама из 6-АСА, например, как описано в US-A 6194572. Как описано вWO 2005/068643, 6-АСА может быть получена биохимически превращением 6-аминогекс-2-еновой кислоты (6-АНЕА) в присутствии фермента, имеющего ,-еноатредуктазную активность. Эта 6-АНЕА может быть получена из лизина, например, биохимически или чистым химическим синтезом. Хотя получение 6-АСА через восстановление 6-АНЕА осуществимо способами, описанными в WO 2005/068643,авторы изобретения обнаружили, что - при условиях реакции восстановления - 6-АНЕА может самопроизвольно и, по существу, необратимо циклизоваться с образованием нежелательного побочного продукта, в особенности -гомопролина. Эта циклизация может быть узким местом в получении 6-АСА и может приводить к значительной потере выхода. Целью этого изобретения является обеспечение нового способа получения 6-АСА или капролактама, который может быть, inter alia, использован для получения полиамида или промежуточного соединения для получения 6-АСА или капролактама, который может служить в качестве альтернативы известным способам. Следующей целью является обеспечение нового способа, который мог бы преодолеть один или несколько упомянутых выше недостатков. Одна или несколько дополнительных задач, которые могут быть решены в соответствии с этим изобретением, будут вытекать из приведенного ниже описания. В настоящее время была обнаружена возможность получения 6-АСА из конкретного исходного соединения, а именно была обнаружена возможность получения 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА),причем эту 6-аминокапроновую кислоту получают из 2-оксогептандиовой кислоты, также известной как-кетопимелиновая кислота (AKP). В частности, обеспечен способ, в котором AKP сначала превращается в 5-формилпентаноат (5-формилвалериановую кислоту, 5-FVA), который превращается в 6-АСА. Кроме того, обеспечен способ, в котором AKP сначала превращается в альфа-аминопимелиновую кислоту (ААР). После этого ААР превращается в 6-АСА. Авторы этого изобретения ясно понимают, что, в принципе, можно получать 6-АСА из AKP полностью химическим (т.е. без применения биокатализатора) образом. Примеры подходящих химических способов проведения отдельных реакционных стадий приводятся здесь ниже. Однако авторы изобретения понимают также, что можно получать 6-АСА биохимически из AKP. Сущность изобретения Таким образом, данное изобретение относится, в частности, к способу получения 6-АСА, в котором 6-АСА получают из АКР с использованием по меньшей мере одного биокатализатора. Кроме того, это изобретение относится к способу, в котором 6-АСА получают из 5 формилпентаноата (5-формилвалериановой кислоты, 5-FVA) с использованием биокатализатора. Как указано выше, 5-FVA может быть получен из AKP. В одном варианте осуществления 6-АСА, полученную в способе этого изобретения, используют для получения капролактама. Такой способ предусматривает циклизацию 6-аминокапроновой кислоты, необязательно в присутствии биокатализатора. При ссылке здесь на карбоновые кислоты или карбоксилаты, например 6-АСА, 2 аминогептандиовую кислоту (-аминопимелиновую кислоту, сокращаемую здесь далее как "ААР"), другую аминокислоту, 5-FVA или AKP, имеется в виду, что эти термины включают в себя протонированную группу карбоновой кислоты (т.е. нейтральную группу), их соответствующий карбоксилат (их конъюгированные основания), а также их соли. При ссылке здесь на аминокислоты, например 6-АСА, имеется в виду, что этот термин включает в себя аминокислоты в их цвиттерионной форме (в которой аминогруппа находится в протонированной, а карбоксилатная группа находится в депротонированной форме), аминокислоту, в которой аминогруппа является протонированной, а карбоксильная группа находится в ее нейтральной форме, и аминокислоту, в которой аминогруппа находится в ее нейтральной форме, а карбоксилатная группа находится в депротонированной форме, а также их соли. Согласно этому изобретению в отношении нежелательной циклизации промежуточного продукта при образовании 6-АСА и необязательно капролактама не были замечены никакие проблемы, приводящие к потере выхода. Представляется, что способ этого изобретения позволит получать сравнимый или даже лучший выход, чем способ, описанный в WO 2005/68643. Представляется, что способ этого изобретения может быть, в частности, предпочтительным при использовании живого организма - в частности, в способе, в котором рассматривается выращивание и поддержание этого организма. Кроме того, представляется, что в одном варианте осуществления этого изобретения может быть улучшен выход образованного 6-АСА (в г/лч) в способе этого изобретения. Термин "или" определен в данном контексте как "и/или", если нет другого указания. Неопределенный артикль "а" или "an" в данном контексте обозначает "по меньшей мере один", если нет другого указания. При ссылке на имя существительное (например, соединение, добавка и т.д.) в единственном числе,имеется в виду, что включено и множественное число. При ссылке на соединение, которое имеет стереоизомеры, это соединение может быть любым из таких стереоизомеров или их комбинацией. Таким образом, при ссылке, например, на аминокислоту,которая имеет энантиомеры, эта аминокислота может быть L-энантиомером, D-энантиомером или их комбинацией. В случае существования природных стереоизомеров, это соединение является предпочтительно природным стереоизомером. При упоминании фермента со ссылкой на класс фермента (ЕС) между скобками, этот класс фермента является классом, в котором этот фермент классифицирован или может быть классифицирован, на основе номенклатуры ферментов, предложенной Комитетом по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB), причем номенклатура может быть найдена вhttp://www.chem.gmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Предполагается, что включены также другие подходящие ферменты, которые (еще) не были классифицированы в указанном классе, но могут быть классифицированы как таковые. Термин "гомолог" используется в данном контексте, в частности, для полинуклеотидов или полипептидов, имеющих идентичность по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99%. Имеется в виду, что термин гомолог включает в себя также последовательности нуклеиновых кислот(полинуклеотидные последовательности), которые отличаются от другой последовательности нуклеиновой кислоты вследствие вырожденности генетического кода и кодируют одну и ту же полипептидную последовательность. Идентичность или сходство последовательностей определено здесь как родство между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более последовательностями, определяемое сравнением этих последовательностей. Обычно, идентичности или сходства последовательностей сравнивают на протяжении полной длины этих последовательностей, однако, иногда они могут также сравниваться только для части последовательностей, сопоставленных друг с другом. В данной области,"идентичность" или "сходство" означает также степень родства последовательностей между полипептидными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, в зависимости от обстоятельств, определяемую по совпадению между такими последовательностями. Предпочтительные способы для определения идентичности или сходства созданы для получения наивысшего совпадения между тестируемыми последовательностями. В контексте этого изобретения предпочтительный способ компьютерной программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включает в себя BLASTP и BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410, доступный публично из NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Предпочтительными параметрами для сравнения полипептидных последовательностей с использованием BLASTP являются открытие бреши 10,0, удлинение бреши 0,5, матрица Blosum 62. Предпочтительными параметрами для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот с использованиемBLASTN являются открытие бреши 10,0, удлинение бреши 0,5, полная матрица ДНК (матрица идентичности ДНК). Согласно этому изобретению используется биокатализатор, т.е. по меньшей мере одна стадия реакции в этом способе катализируется биологическим материалом или молекулярной частицей, происходящей из биологического источника, например организма, или биомолекулы, происходящей из него. Этот биокатализатор может, в частности, содержать один или несколько ферментов. Биокатализатор может быть использован в любой форме. В одном варианте осуществления используют один или несколько ферментов, выделенных из природного окружения (выделенных из организма, в котором он был продуцирован), например, в виде раствора, эмульсии, дисперсии, (суспензии) лиофилизированных клеток, в виде лизата, или иммобилизованных на носителе. В одном варианте осуществления один или несколько ферментов образуют часть живого организма (например, живые целые клетки). Эти ферменты могут выполнять каталитическую функцию в этой клетке. Возможно также, что этот фермент может секретироваться в среду, в которой присутствуют эти клетки. Живые клетки могут быть растущими клетками, покоящимися клетками или клетками в фазе G0(например, спорами) или клетками в стационарной фазе. Можно также использовать ферментобразующую часть клетки с увеличенной проницаемостью (т.е. клетки, проницаемость которой увеличена субстратом для этого фермента или предшественником субстрата этого фермента или этих ферментов). Биокатализатором, используемым в способе этого изобретения, может быть, в принципе, любой организм, или биокатализатор может быть получен из любого организма. Этот организм может быть эукариотическим или прокариотическим. В частности, этот организм может быть выбран из животных (в том числе человека), растений, бактерий, архебактерий, дрожжей и грибов. В одном варианте осуществления биокатализатор происходит из животного, в частности из его части: например, поджелудочной железы, головного мозга, почки, сердца или другого органа. Это животное может быть, в частности, выбрано из группы, состоящей из млекопитающих, более конкретно, выбрано из группы Leporidae, Muridae и Bovidae. Подходящие растения включают в себя, в частности, растения, выбранные из группы, состоящей изMercurialis, например Mercurialis perennis; Hydnocarpus и Ceratonia. Подходящие бактерии могут быть выбраны, в частности, из группы Vibrio, Pseudomonas, Bacillus,Corynebacterium, Brevibacterium, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Thermus, Mycobacterium, Zymomonas, Proteus, Agrobacterium, Geobacillus, Acinetobacter, Ralstonia, Rhodobacter, Paracoccus, Novosphingobium, Nitrosomonas, Legionella, Neisseria, Rhodopseudomonas, Staphylococcus, Deinococcus и Salmonella. Подходящие архебактерии могут быть выбраны, в частности, из группы Archaeoglobus, Aeropyrum,Halobacterium, Methanosarcina, Methanococcus, Thermoplasma, Pyrobaculum, Methanocaldococcus,Methanobacterium, Methanosphaera, Methanopyrus и Methanobrevibacter. Подходящие грибы могут быть выбраны, в частности, из группы Rhizopus, Neurospora, Penicillium иAspergillus. Подходящие дрожжи могут быть выбраны, в частности, из группы Candida, Hansenula, Kluyveromyces и Saccharomyces. Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, что в способе этого изобретения может применяться природный биокатализатор (дикого типа) или мутант природного биокатализатора. Свойства природного биокатализатора могут быть улучшены биологическими способами, известными квалифицированному в данной области специалисту, такими как, например, молекулярная эволюция или рациональное конструирование. Мутанты биокатализаторов дикого типа могут быть, например, изготовлены модификацией кодирующей ДНК организма, способной действовать в качестве биокатализатора или способной продуцировать биокаталитическую частицу (такую как фермент), с использованием способов мутагенеза, известных квалифицированному в данной области специалисту (случайного мутагенеза, сайт-направленного мутагенеза, направленной эволюции, рекомбинации генов и т.д.). В частности,эта ДНК может быть модифицирована таким образом, что она кодирует фермент, который отличается по меньшей мере одной аминокислотой от фермента дикого типа, так что она кодирует фермент, который содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в сравнении с диким типом, или таким образом, что эти мутанты объединяют последовательности двух или более исходных ферментов, или осуществлением экспрессии модифицированной таким образом ДНК в подходящей клетке-(хозяине). Последнее может достигаться способами, известными квалифицированному в данной области специалисту, такими как оптимизация кодонов или оптимизация пар кодонов, например, на основе способа, описанного в WO 2008/000632. Мутантный биокатализатор может иметь улучшенные свойства, например, в отношении одного или нескольких из следующих аспектов: селективности в отношении субстрата, активности, стабильности,устойчивости к растворителю, профиля рН, температурного профиля, субстратного профиля, чувствительности к ингибированию, использования кофакторов и субстратной аффинности. Мутанты с улучшенными профилями могут быть идентифицированы применением, например, способов высокопроизводительного скрининга или отбора на основе таких способов, известных квалифицированному в данной области специалисту. При ссылке на биокатализатор, в частности фермент, из конкретного источника, рекомбинантные биокатализаторы, в частности ферменты, происходящие из первого организма, но фактически продуцируемые в (генетически модифицированном) втором организме, имеется конкретно в виду, что они вклю-3 019163 чают в себя биокатализаторы, в частности ферменты, из этого первого организма. В предпочтительном способе этого изобретения это получение предусматривает биокаталитическую (обычно ферментативную) реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование -кетокислоты или аминокислоты (т.е. соединения, содержащего по меньшей мере одну группу карбоновой кислоты и по меньшей мере одну аминогруппу). Таким образом, фермент,имеющий такую каталитическую активность, может называться декарбоксилазой -кетокислот, соответственно, декарбоксилазой аминокислот. Указанная кислота является предпочтительно дикислотой, причем указанный биокатализатор является селективным в отношении группы кислоты, ближайшей к кето- или аминогруппе. Обычно, подходящая декарбоксилаза имеет -кетопимелат-декарбоксилазную активность, способную катализировать превращение AKP в 5-FVA, или аминопимелатдекарбоксилазную активность, способную катализировать превращение ААР в 6-АСА. Фермент, способный декарбоксилировать -кетокислоту или аминокислоту, может быть выбран, в частности, из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3), предпочтительно из группы оксалоацетатдекарбоксилаз(ЕС 4.1.1.3), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), декарбоксилаз -кетокислот с разветвленной цепью (ЕС 4.1.1.72), -кетоизовалератдекарбоксилаз, -кетоглутаратдекарбокилаз (ЕС 4.1.1.71) и пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1). Одна или несколько подходящих декарбоксилаз могут быть выбраны из группы оксалатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.2), ацетоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), валиндекарбоксилаз/лейциндеарбоксилаз (ЕС 4.1.1.14), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), аспартат-1 декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), 3-гидроксиглутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.16), орнитиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.17),лизиндекарбоксилаз(ЕС 4.1.1.19),2 оксоглутаратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.71) и диаминобутиратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.86). Декарбоксилаза может быть, в частности, декарбоксилазой организма, выбранного из группы тыкв; огурцов; дрожжей; грибов, например Saccharomyces cerevisiae, Candida flareri, Hansennula sp., Kluyveromyces marxianus, Phizopus javanicus и Neurospora crassa; млекопитающих, в частности, головного мозга млекопитающих и бактерий, таких как Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas sp. иZymomonas mobilis. Пируватдекарбоксилаза может происходить из Saccharomyces cerevisiae или Zymomonas mobilis. В частности, может быть использован мутант I472A из Zymomonas mobilis. Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза, диаминопимелатдекарбоксилаза или аспартатдекарбоксилаза из Escherichia coli (E. coli). Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза из Neurospora crassa, Mycobacterium leprae, Clostridium perfringens, Lactobacillus brevis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus или Lactococcus. Примеры видов Lactococcus, из которых может происходить глутаматдекарбоксилаза, включают в себя, в частности, Lactococcus lactis, такой как штамм Lactococcus lactis В 1157, Lactococcus lactis IFPL730, более конкретно Lactococcus lactis var. maltigenes (ранее называемый Streptococcus lactis var. maltigenes). В частности, может быть использована оксалоацетатдекарбоксилаза из Pseudomonas. Может быть использована декарбоксилаза альфа-кетокислот с разветвленной цепью из Lactococcuslactis. Более конкретно, может быть использована альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза из Lactococcuslactis. В частности, может быть использована альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза из Mycobacterium tuberculosis. В предпочтительном способе этого изобретения, получение 6-АСА предусматривает ферментативную реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию переаминирования в присутствии донора аминогруппы, выбранного из группы аминотрансфераз (ЕС 2.6.1). Обычно, подходящая аминотрансфераза имеет активность аминотрансферазы 6-аминокапроновой кислоты, способную катализировать превращение 5-FVA в 6-АСА, или -аминопимелат-2 аминотрансферазную активность, способную катализировать превращение АКР в ААР. Эта аминотрансфераза может, в частности, быть выбрана из группы -аминоизобутират:кетоглутарат-аминотрансфераз, -аланин-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.19), L-лизин-6-аминотрансферазы(ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 5-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48), 2-аминогексаноат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67) и лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71). В одном варианте осуществления аминотрансфераза может быть выбрана из группы аланинаминотрансфераз (ЕС 2.6.1.2), лейцин-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.6), аланин-оксокислотааминотрансфераз (ЕС 2.6.1.12), -аланин-пируват-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.18), (S)-3-амино-2 метилпропионат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.22), L,L-диаминопимелат-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.83). Аминотрансфераза может быть, в частности, выбрана из аминотрансфераз из млекопитающего;Mercurialis, в частности Mercurialis perennis, более конкретно из побегов Mercurialis perennis; Asplenium,более конкретно Asplenium unilaterale или Asplenium septentrionale; Ceratonia, более конкретно Ceratoniasiliqua; Rhodobacter, более конкретно Rhodobacter sphaeroides, Staphylococcus, более конкретно Staphylococcus aureus; Vibrio, более конкретно Vibrio fluvialis; Pseudomonas, более конкретно Pseudomonas aeruginosa; Rhodopseusomonas; Bacillus, более конкретно Bacillus weihenstephanensis и Bacillus subtilis; Legionella; Nitrosomas; Neisseria; или дрожжей, в частности, Saccharomyces cerevisiae. В случае, когда этот фермент является ферментом млекопитающего, он может, в частности, происходить из почки млекопитающего, из печени млекопитающего, из сердца млекопитающего или из головного мозга млекопитающего. Например, подходящий фермент может быть выбран из группы аминоизобутират:-кетоглутарат-аминотрансферазы из почки млекопитающего, в частности, аминоизобутират:-кетоглутарат-аминотрансферазы из почки свиньи; -аланин-аминотрансферазы из печени млекопитающего, в частности -аланин-аминотрансферазы из печени кролика; аспартатаминотрансфераз из сердца млекопитающего; в частности аспартат-аминотрансферазы из сердца свиньи; 4-аминобутират-аминотрансферазы из печени свиньи; 4-аминобутират-аминотрансферазы из головного мозга млекопитающего, в частности 4-аминобутират-аминотрансферазы из головного мозга человека,свиньи или крысы; -кетоадипат-глутамин-аминотрансферазы из Neurospora, в частности кетоадипат:глутамат-аминотрансферазы из Neurospora crossa; 4-аминобутират-аминотрансферазы из Е.aminovalericum. Подходящая 3-аминоадипат-аминотрансфераза может быть, например, обеспечена Pyrobaculum islandicum. В частности, донор аминогруппы может быть выбран из группы, состоящей из аммиака, ионов аммония, аминов и аминокислот. Подходящие амины является первичными аминами и вторичными аминами. Аминокислота может иметь D- или L-конфигурацию. Примерами доноров аминогруппы являются аланин, глутамат, изопропиламин, 2-аминобутан, 2-аминогептан, фенилметанамин, 1-фенил-1 аминоэтан, глутамин, тирозин, фенилаланин, аспартат, -аминоизобутан, -аланин, 4-аминобутират и аминоадипат. В следующем предпочтительном варианте осуществления, способ получения 6-АСА предусматривает биокаталитическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию восстановительного аминирования в присутствии источника аммиака, выбранного из группы, состоящей из оксидоредуктаз, действующих на CH-NH2-группу доноров (ЕС 1.4), в частности, из группы дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1). Обычно, подходящая дегидрогеназа аминокислот имеет активность дегидрогеназы 6-аминокапроновой кислоты, катализирующую превращение 5-FVA в 6-АСА, или имеет аминопимелат-2-дегидрогеназную активность, катализирующую превращение AKP в ААР. В частности,подходящая аминокислота-дегидрогеназа может быть выбрана из группы, состоящей из диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16), лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18), глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3; ЕС 1.4.1.4) и лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9). В одном варианте осуществления дегидрогеназ аминокислот может быть выбрана из дегидрогеназ аминокислот, классифицированных как глутаматдегидрогеназы, действующие с НАД или НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.3), глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.4), лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9), диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16) и лизин-6 дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18). Дегидрогеназа аминокислот может, в частности, происходить из организма, выбранного из группы,состоящей из Corynebacterium, в частности Corynebacterium glutamicum; Proteus, в частности Proteus vulgaris; Agrobacterium, в частности Agrobacterium tumefaciens; Geobacillus, в частности Geobacilluscerevisiae; Brevibacterium, в частности Brevibacterium flavum; и Bacillus, в частности Bacillus sphaericus,Bacillus cereus или Bacillus subtilis. Например, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из диаминопимелатдегидрогеназ из Bacillus, в частности Bacillus sphaericus; диаминопимелатдегидрогеназ из Brevibacterium sp.; диаминопимелатдегидрогеназ из Corynebacterium, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из Corynebacterium glutamicum; диаминопимелатдегидрогеназ из Proteus, в частности диаминопимелатдегидрогеназы из Proteus vulgaris; лизин-6-дегидрогеназ из Agrobacterium, в частности, Agrobacterium tumefaciens, лизин-6-дегидрогеназ из Geobacillus, в частности из Geobacillusstearothermophilus; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3), из Acinetobacter, в частности глутаматдегидрогеназ из Acinetobacter sp. ADP1; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3) из Ralstonia, в частности глутаматдегидрогеназ из Ralstonia solanacearum; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4), из Salmonella, в частности глутаматдегидрогеназ из Salmonella typhimurium; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Saccharomyces, в частности глутаматдегидрогеназ из Saccharomyces cerevisiae; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Brevibacterium, в частности глутаматдегидрогеназ из Brevibacterium flavum; и лейциндегидрогеназ из Bacillus, в частности лейциндегидрогеназ из Bacillus cereus или Bacillus subtilis. В одном конкретном варианте осуществления AKP биокаталитически превращают в 5-5 019163 формилпентаноат (5-FVA) в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, катализирующего такое превращение. Декарбоксилаза, используемая в соответствии этим изобретением, может быть, в частности, выбрана из группы декарбоксилаз -кетокислот из Lactococcus lactis, Lactococcus lactis var.maltigenes или Lactococcus lactis subsp. cremoris; декарбоксилаз -кетокислот с разветвленной цепью из штамма Lactococcus lactis B1157 или Lactococcus lactis IFPL730; пируватдекарбоксилаз из SaccharomycesKluyveromyces marxianus; -кетоглутаратдекарбоксилаз из Mycobacterium tuberculosis; глутаматдекарбоксилаз из Е. coli, Lactobacillus brevis, Mycobacterium leprae, Neurospora crassa или Clostridium perfringens; и аспартатдекарбоксилаз из Е. coli. В частности, было обнаружено, что декарбоксилаза из Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas species или Lactobacillus lactis пригодна для катализа превращения АКР в 5-FVA. Более конкретно, может быть использован биокатализатор, содержащий декарбоксилазу, имеющую аминокислотную последовательность, идентифицированную какSEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, или ее гомолог. Предполагается также, что такая декарбоксилаза может быть использована для получения 6 АСА из ААР. После этого 5-FVA превращают в 6-АСА. Это может выполняться химически: 6-АСА может быть получена с высоким выходом восстановительным аминированием 5-FVA аммиаком над катализатором гидрирования, например, Ni на носителе SiO2/Al2O3, как описано для 9-аминононановой кислоты (9 аминопеларгоновой кислоты) и 12-аминододекановой кислоты (12-аминолауриновой кислоты) в ЕР-А 628535 или DE 4322065. Альтернативно, 6-АСА может быть получена гидрированием над PtO2 6-оксимокапроновой кислоты, полученной реакцией 5-FVA и гидроксиламина (см., например, F.O. Ayorinde, E.Y. Nana, P.D. Nicely,A.S. Woods, E.O. Price, C.P. Nwaonicha J. Am. Oil Chem. Soc. 1997, 74, 531-538 для синтеза гомологичной 12-аминододекановой кислоты). В одном варианте осуществления превращение 5-FVA в 6-АСА выполняют биокаталитически в присутствии (i) донора аминогруппы и (ii) аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение. В частности, в таком варианте осуществления аминотрансфераза может быть выбрана из группы, состоящей из аминотрансфераз из Vibriofluvialis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus weihenstephanensis или Escherichia coli; аминоизобутират: -кетоглутарат-аминотрансферазы из почки свиньи; -аланин-аминотрансферазы из печени кролика; аминотрансферазы из побегов из Mercurialis perennis; 4-аминобутиратаминотрансферазы из печени свиньи или из головного мозга человека, крысы или свиньи; -аланинаминотрансферазы из печени кролика и -лизин:-кетоглутаратаминотрансферазы. В случае использования дегидрогеназы аминокислот, такая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана, в частности, из группы лизин-6-дегидрогеназ из Agrobacterium tumefaciens или Geobacillus stearothermophilus. Другая подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы диаминопимелатдегидрогеназ из Bacillus sphaericus, Brevibacterium sp., Corynebacterium glutamicum или Proteus vulgaris; из группы глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3), из(ЕС 1.4.1.4) из Saccharomyces cerevisiae или Brevibacterium flavum; или из группы лейциндегидрогеназ изBacillus cereus или Bacillus subtilis. В одном конкретном варианте осуществления превращение 5-FVA в 6-АСА катализируется биокатализатором, содержащим аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, или гомолог любой из этих последовательностей. В одном конкретном варианте осуществления, АКР химически превращают в 5-FVA. Эффективное химическое декарбоксилирование 2-кетокарбоновой кислоты в соответствующий альдегид может выполняться образованием промежуточного енамина с использованием вторичного амина, например, морфолина, при азеотропном удалении воды и одновременной потере СО 2, например, на основе способа,описанного в Tetrahedron Lett. 1982, 23(4), 459-462. После этого 5-FVA может быть биокаталитически превращен в 6-АСА переаминированием в присутствии аминотрансферазы или ферментативным восстановительным аминированием дегидрогеназой аминокислот или другим биокатализатором, способным катализировать такое превращение. Такие аминотрансфераза или дегидрогеназа аминокислот могут быть, в частности, выбраны из биокатализаторов, упомянутых выше при описании превращения 5-FVA в 6-АСА. Альтернативно, превращение 5-FVA в 6-АСА может выполняться химическим способом, как упоминалось выше. В одном конкретном варианте осуществления AKP биокаталитически превращают в ААР в присутствии (i) аминотрансферазы, аминодегидрогеназы или другого биокатализатора, способного катализиро-6 019163 вать такое превращение, и (ii) донора аминогруппы. Такая аминотрансфераза, используемая в соответствии с этим изобретением для превращения AKP в ААР, может быть выбрана, в частности, из аминотрансфераз из сердца свиньи; -кетоадипат:глутамат-аминотрансфераз из Neurospora crassa или дрожжей; аминотрансферазы из побегов из Mercurialis perennis; 4-аминобутират-аминотрансфераз из Е. coli;-аминоадипат-аминотрансфераз из Asplenium septentrionale или Asplenium unilaterale и аминотрансфераз из Ceratonia siliqua. В предпочтительном варианте осуществления аминотрансфераза для превращения AKP в ААР выбрана из группы аминотрансфераз из Vibrio, Pseudomonas, Bacillus, Legionella. Neisseria, Rhodobacter,Escherichia и Rhodopseudomonas. В частности, было обнаружено, что аминотрансферазы из организма, выбранного из группы Bacillus subtilis, Rhodobacter sphaeroides, Legionella pneumophila, Nitrosomonas europaea, Neisseria gonorrhoeae,Pseudomonas syringae, Rhodopseudomonas palustris, Vibrio fluvialis, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, пригодны для превращения АКР в ААР. В одном конкретном варианте осуществления, для превращения АКР в АРР используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 или гомолог любой из этих последовательностей. В следующем варианте осуществления способ получения ААР предусматривает биокаталитическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию восстановительного аминирования, в присутствии источника аммиака, выбранного из группы оксидоредуктаз, действующих на CHNH2-группу доноров (ЕС 1.4), в частности, из группы дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1). Обычно подходящая дегидрогеназа аминокислот имеет -аминопимелат-2-дегидрогеназную активность, катализирующую превращение АКР в АРР. В частности, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16), глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3; ЕС 1.4.1.4) и лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9). В одном варианте осуществления дегидрогеназа аминокислот выбрана из дегидрогеназ аминокислот, классифицируемых как глутаматдегидрогеназы, действующие с НАД или НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.3), глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.4), лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9) и диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16). Дегидрогеназа аминокислот может, в частности, происходить из организма, выбранного из группыBacillus subtilis. Например, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из диаминопимелатдегидрогеназ из Bacillus, в частности Bacillus sphericus; диаминопимелатдегидрогеназ из Brevibacterium sp.; диаминопимелатдегидрогеназ из Corynebacterium, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из Corynebacterium glutamicum; диаминопимелатдегидрогеназ из Proteus, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из Proteus vulgaris; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора(ЕС 1.4.1.3), из Acinetobacter, в частности глутаматдегидрогеназ из Acinetobacter sp. ADP1; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3) из Ralstonia, в частности глутаматдегидрогеназ из Ralstonia solanacearum; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4) из Salmonella, в частности глутаматдегидрогеназ из Salmonella typhimurium; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Saccharomyces, в частности глутаматдегидрогеназ из Saccharomyces cerevisiae; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Brevibacterium, в частности глутаматдегидрогеназ из Brevibacterium flavum; и лейциндегидрогеназ из Bacillus,в частности лейциндегидрогеназ из Bacillus cereus или Bacillus subtilis. Другая подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы лизин-6 дегидрогеназ из Agrobacterium tumefaciens или Geobacillus stearothermophilus; или из группы лейциндегидрогеназ из Bacillus cereus или Bacillus subtilis. ААР, полученная в способе этого изобретения, может быть далее использована для получения 6 АСА. Авторы изобретения понимали, что ААР, полученная из АКР, может быть превращена в 6-АСА реакцией декарбоксилирования. Она может выполняться химически, например нагреванием в растворителе с высокой температурой кипения в присутствии кетонного или альдегидного катализатора. Например, аминокислоты декарбоксилируются с хорошими выходами в циклогексаноле при 150-160 С с 1-2%(о/о) циклогексеноном, как описано М. Hashimoto, Y. Eda, Y. Osanai T. Iwai and S. Aoki in Chem. Lett. 1986, 893-896. Сходные способы описаны в Европейской заявке на патент 1586553, 2005, Daiso и S.D.Brandt D. Mansell S. Freeman L. A. Fleet, J. F. Alder J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 872-882. (14-15). Альтернативно, декарбоксилирование ААР в 6-АСА может выполняться биокаталитически в при-7 019163 сутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, катализирующего это декарбоксилирование. Эта декарбоксилаза может быть выбрана из декарбоксилаз, способных катализировать декарбоксилирование -аминокислоты. Фермент, способный декарбоксилировать альфа-аминокислоту, может быть выбран, например, из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1), предпочтительно из группы пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), декарбоксилаз альфа-кетокислот с разветвленной цепью (ЕС 4.1.1.72), которые включают в себя альфа-кетоизовалератдекарбоксилазы и альфакетоглутаратдекарбоксилазы (ЕС 4.1.1.71). Одна или несколько других подходящих декарбоксилаз могут быть, в частности, выбраны из группы оксалатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.2), оксалоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3), ацетоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), валиндекарбоксилаз/лейциндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.14), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), 3-гидроксиглутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.16), орнитиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.17), лизиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.18), аргининдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.19), 2 оксоглутаратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.71) и диаминобутиратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.86). Декарбоксилаза может быть, в частности, декарбоксилазой организма, выбранного из группы тыкв,например, Cucurbita moschata; огурцов; дрожжей; грибов, например, Saccharomyces cerevisiae, Candidaflareri, Hansennula sp., Kluyveromyces marxianus, Phizopus javanicus и Neurospora crassa; млекопитающих,в частности, головного мозга млекопитающих; и бактерий, таких как Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas sp. и Zymomonas mobilis. Пируватдекарбоксилаза может происходить из Saccharomyces cerevisiae или Zymomonas mobilis. В частности, может быть использован мутант I472A из Zymomonas mobilis. Может быть, в частности, использована оксалоацетатдекарбоксилаза из Pseudomonas. Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза или аспартатдекарбоксилаза из Escherichia coli (E. coli) или может быть использована глутаматдекарбоксилаза из Neurospora crassa, Mycobacterium leprae, Clostridium perfringens, Lactobacillus brevis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus или Lactococcus. Примеры видов Lactococcus, из которых может происходить глутаматдекарбоксилаза, включают в себя, в частности, Lactococcus lactis, такой как штамм(ранее называемый Streptococcus lactis var. maltigenes). Диаминопимелатдекарбоксилаза может, например, происходить из организма, способного синтезировать лизин из диаминопимелата. Такой организм может быть, в частности, обнаружен среди бактерий, архебактерий и растений. В частности, диаминопимелатдекарбоксилаза может происходить из грамотрицательной бактерии, например, Е. coli. Могут быть использованы декарбоксилазы -кетокислот с разветвленной цепью из Lactococcus lactis. Более конкретно, могут быть использованы декарбоксилазы -кетокислот с разветвленной цепью и альфакетоизовалератдеарбоксилазы из Lactococcus lactis. Может быть, в частности, использована альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза из Mycobacterium tuberculosis. Авторы этого изобретения обнаружили, что альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза (Kgd) из Mycobacterium tuberculosis может быть использована для превращения ААР в 6-АСА. В частности, авторы изобретения обнаружили, что такая декарбоксилаза, содержащая последовательность, показанную в SEQID NO:46, или ее функциональный аналог, могут быть способны катализировать образование 6-АСА из ААР. Глутаматдекарбоксилаза может быть, в частности, выбрана из декарбоксилаз Cucurbita moschata; огурца; дрожжей или головного мозга теленка; и диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20). Диаминопимелатдекарбоксилаза может быть, например, декарбоксилазой из организма, способного синтезировать лизин из диаминопимелата. Такой организм может быть, в частности, найден среди бактерий, архебактерий и растений. В частности, диаминопимелатдекарбоксилаза может быть декарбоксилазой из грамотрицательной бактерии, например Е. coli. В одном конкретном варианте осуществления AKP химически превращают в ААР. ААР может быть получена из 2-оксопимелиновой кислоты каталитической реакцией Лейкарта-Валлаха, как описано для сходных соединений. Эту реакцию выполняют с формиатом аммония в метаноле и [RhCpCl2]2 в качестве гомогенного катализатора (М. Kitamura, D.Lee, S. Hayashi, S. Tanaka, M. Yoshimura J. Org. Chem. 2002, 67, 8685-8687). Альтернативно, реакция Лейкарта-Валлаха может выполняться с водным формиатом аммония с использованием [Ir111Cp(bru)H2O]SO4 в качестве катализатора, как описано S. Ogo, K.Uehara and S. Fukuzumi в J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3020-3021. Превращение -кетокислот в (энантиомерно обогащенные) аминокислоты возможно также реакцией с (хиральными) бензиламинами и последующим гидрированием промежуточного имина над Pd/C или Pd(OH)2/C. См., например, R.G. Hiskey,R.C. Northrop J. Am. Chtm. Soc. 1961, 83, 4798. После этого ААР биокаталитически превращают в 6-АСА, в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного выполнять такое декарбоксилирование. Такая декарбоксилаза может быть, в частности, выбрана из биокатализаторов, которые упоминаются выше при описании биокатализаторов для превращения ААР в 6-АСА. Альтернативно, превращение ААР в 6-АСА может выполняться химическим способом, например,-8 019163 упоминаемым выше. В одном конкретном варианте осуществления AKP биокаталитически превращают в 5-FVA в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение,и после этого 5-FVA превращают в 6-АСА в присутствии аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение. Декарбоксилазы, подходящие для этих реакций, могут быть, в частности, выбраны из группы декарбоксилаз, упомянутых выше при описании бикаталитического превращения AKP в 6-АСА. Подходящие аминотрансфераза или дегидрогеназа аминокислот для превращения 5-FVA могут быть, в частности, выбраны из аминотрансфераз или дегидрогеназ, упомянутых выше при описании биокаталитического превращения 5-FVA в 6 АСА. В одном конкретном варианте осуществления AKP биокаталитически превращают в ААР в присутствии аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот и другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение, и после этого ААР превращают в 6-АСА в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение. Ферменты, подходящие для таких реакций, могут быть, в частности, выбраны из группы аминотрансфераз, дегидрогеназ аминокислот и декарбоксилаз, которые были описаны выше при описании биокаталитического превращения AKP в ААР и биокаталитического превращения ААР в 6-АСА соответственно.AKP, используемая для получения 6-АСА, может быть, в принципе, получена любым способом. Например, AKP может быть получена на основе способа, описанного Н. Jager et al., Chem. Ber. 1959, 92,2492-2499. AKP может быть получена алкилированием циклопентанона диэтилоксалатом с использованием этоксида натрия в качестве основания, нагреванием полученного продукта при температуре дефлегмации в сильной кислоте (2 М HCl) и извлечением этого продукта, например, кристаллизацией из толуола.AKP можно также получить из природного источника, например, из метаногенных Archaea, из Asplenium septentrionale или из Hydnocarpus anthelmintica. Подходящий способ экстракции может быть, например, основан на способе, описанном A.I. Virtanen and A.M. Berg в Acta Chemica Scandinavica 1954, 6. 1085-1086, где описана экстракция аминокислот и AKP из Asplenium с использованием 70% этанола. В одном конкретном варианте осуществления AKP получают в способе, предусматривающем превращение альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG) в альфа-кетоадипиновую кислоту (АКА) и превращение альфа-кетоадипиновой кислоты в альфа-кетопимелиновую кислоту. Эта реакция может катализироваться биокатализатором. AKG может быть, например, получена биокаталитически из углеродного источника,такого как углевод, способом, известным per se в данной области. Подходящий биокатализатор для получения AKP из AKG может быть выбран, в частности, из биокатализаторов, катализирующих С 1-удлинение альфа-кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту и/или С 1-удлинение альфа-кетоадипиновой кислоты в альфа-кетопимелиновую кислоту. В одном конкретном варианте осуществления получение AKP катализируют биокатализатором, содержащим:b) по меньшей мере один фермент, выбранный из группы ферментов AksD, ферментов AksE, гомологов ферментов AksD и гомологов ферментов AksE; иc) фермент AksF или его гомолог. Один или несколько ферментов AksA, AksD, AksE, AksF или их гомологов могут быть обнаружены в организме, выбранном из группы метаногенных архебактерий, предпочтительно выбранных из группыMethanococcus, Methanocaldococcus, Methanosarcina, Methanothermobacter, Methanosphaera, Methanopyrus и Methanobrevibacter. В одном конкретном варианте осуществления биокатализатор, катализирующий получение AKP из альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG), содержит систему ферментов, катализирующих превращение альфа-кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту, где указанная система ферментов образует часть альфа-аминоадипатного пути для биосинтеза лизина. Термин "система ферментов" используется здесь, в частности, для единственного фермента или группы ферментов, посредством которых может катализироваться конкретное превращение. Получение AKP из AKG может предусматривать одну или несколько биокаталитических реакций с известными или неизвестными промежуточными продуктами, например превращение AKG в АСА или превращение АКА в AKP. Такая система может присутствовать в клетке или может быть выделена из клетки. Эта система ферментов может, в частности, происходить из организма, выбранного из группы дрожжей, грибов, архебактерий и бактерий, в частности из группы Penicillium, Cephalosporium, Paelicomyces, Trichophytum, Aspergillus, Phanerochaete, Emericella, Ustilago, Schizosaccharomyces, Saccharomyces,Sulfolobus, Thermococcus, Methanococcus, Methanocaldococcus, Methanosphaera, Methanopyrus, Methanobrevibacter и Methanothermobacter. В одном конкретном варианте осуществления биокатализатор, катализирующий получение AKP из альфа-кетоглутаровой кислоты, содержит систему ферментов, катализирующих превращение альфа-9 019163 кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту, где по меньшей мере один из ферментов этой системы ферментов происходит из азотфиксирующих бактерий, выбранных из группы цианобактерий,ризобий, -протеобактерий и актинобактерий, в частности, из группы Anabaena, Microcystis, Synechocystis, Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Azorobacter, Klebsiella и Frankia. Примеры гомологов этих ферментов Aks и генов, кодирующих эти ферменты, приведены в табл. 1 А и 1B на следующих страницах. Таблица 1A Ссылки на ген и белок могут быть найдены через www.ncbi.nih.gov/ (доступный на 15 апреля 2008 г.) Таблица 1 В Ссылки на ген и белок могут быть найдены через www.ncbi.nih.gov/ (доступный на 15 апреля 2008 г.) Если желательно, 6-АСА, полученная в соответствии с этим изобретением, может быть циклизована с образованием капролактама, например, как описано в US-A 5194572. Условия реакции для любой биокаталитической стадии в контексте данного изобретения могут быть выбраны в зависимости от известных условий для этого биокатализатора, в частности фермента,описанной здесь информации и необязательно некоторого рутинного экспериментирования. В принципе, рН используемой реакционной среды может быть выбран в широких пределах, пока этот биокатализатор является активным при этих условиях рН. Могут быть использованы щелочные,нейтральные или кислые условия, в зависимости от этого биокатализатора и других факторов. В случае,когда этот способ включает в себя применение микроорганизма, например для экспрессии фермента,катализирующего способ этого изобретения, рН выбирают таким образом, что этот микроорганизм способен выполнять предполагаемую для него функцию или предполагаемые для него функции. В частности, рН может быть выбран в диапазоне четырех рН-единиц ниже нейтрального рН и двух рН-единиц выше нейтрального рН, т.е. между рН 3 и рН 9, в случае, по существу, водной системы при 25 С. Система считается водной, если вода является единственным растворителем или преобладающим растворителем (50 мас.%, в частности, 90 мас.% в расчете на все жидкости), в котором, например, может быть растворено минорное количество спирта или другого растворителя (50 мас.%, в частности, 10 мас.% в расчете на все жидкости) (например, в виде источника углерода) в такой концентрации, что микроорганизмы, которые могут присутствовать, остаются активными. В частности, в случае использования дрожжей и/или гриба, могут быть предпочтительными кислые условия, в частности рН может находиться в диапазоне рН 3 - рН 8, на основе, по существу, водной системы при 25 С. Если желательно, рН может корректироваться с использованием кислоты и/или основания или может быть забуферен подходящей комбинацией кислоты и основания. В принципе, условия инкубирования могут быть выбраны в широких пределах, пока биокатализатор обнаруживает достаточную активность и/или достаточный рост. Это включает в себя аэробные, микроаэробные условия, условия с ограниченным кислородом и анаэробные условия. Анаэробные условия определяются здесь как условия без какого-либо количества кислорода или условия, в которых кислород, по существу, не потребляется биокатализатором, в частности микроорганизмом, и обычно соответствуют потреблению кислорода менее 2,5 ммоль/лч или менее 1 ммоль/лч. Аэробные условия являются условиями, в которых в среде растворен уровень кислорода, достаточный для неограниченного роста, способный поддерживать скорость потребления кислорода, по меньшей мере, 10 ммоль/лч, более предпочтительно более 20 ммоль/лч, даже более предпочтительно более 50 ммоль/л.ч и наиболее предпочтительно более 100 ммоль/л.ч. Условия с ограниченным кислородом определяются здесь как условия, в которых потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Нижний предел для условий с ограниченным кислородом определяется верхним пределом для анаэробных условий, т.е. обычно по меньшей мере 1 ммоль/лч и, в частности, по меньшей мере 2,5 ммоль/лч или по меньшей мере 5 ммоль/лч. Верхний предел для условий с ограниченным кислородом определяется нижним пределом для аэробных условий, т.е. менее 100 ммоль/лч, менее 50 ммоль/лч, менее 20 ммоль/лч или менее 10 ммоль/лч. Являются ли условия аэробными, анаэробными или условиями с ограниченным кислородом, зависит от условий, при которых проводится этот способ, в частности количества и состава входящего потока газа, фактических свойств смешивания/переноса массы используемого оборудования, типа используемого микроорганизма и плотности микроорганизма. Используемая температура, в принципе, не является критической, пока биокатализатор, в частности фермент, обнаруживает существенную активность. Обычно эта температура может быть по меньшей мере 0 С, в частности по меньшей мере 15 С, более конкретно по меньшей мере 20 С. Желаемая максимальная температура зависит от биокатализатора. Обычно такая максимальная температура известна в данной области, например, указана в техническом описании продукта в случае коммерчески доступного биокатализатора, или она может быть определена рутинным образом на основе обычных общих знаний и описанной здесь информации. Эта температура равна обычно 90 С или менее, предпочтительно 70 С или менее, в частности 50 С или менее, более конкретно 40 С или менее. В частности, если биокаталитическую реакцию выполняют вне организма-хозяина, реакционная среда, содержащая органический растворитель, может использоваться в высокой концентрации (например, большей чем 50% или большей чем 90 масс.%), в случае использования фермента, который сохраняет достаточную активность в такой среде. В предпочтительном способе 6-АСА получают с использованием биопревращения целыми клетками субстрата для 6-АСА или промежуточного продукта для образования 6-АСА (AKP, ААР или 5-FVA),содержащего микроорганизм, в котором продуцируются один или несколько биокатализаторов (обычно один или несколько ферментов), катализирующих это биопревращение, таких как один или несколько биокатализаторов, выбранных из группы биокатализаторов, способных катализировать превращениеAKP в ААР, биокатализаторов, способных катализировать превращение ААР в 6-АСА, биокатализаторов, способных катализировать превращение AKP в 5-FVA, и биокатализаторов, способных катализировать превращение 5-FVA в 6-АСА. В предпочтительном варианте осуществления этот микроорганизм способен продуцировать декарбоксилазу, и/или продуцируется по меньшей мере один фермент, выбранный из дегидрогеназ аминокислот и аминотрансфераз, способный катализировать стадию реакции, описанную выше, и источник углерода для этого микроорганизма. В частности, этот источник углерода содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы одноатомных спиртов, многоатомных спиртов, карбоновых кислот, диоксида углерода, жирных кислот, глицеридов, в том числе смесей, содержащих любое из указанных соединений. Подходящие одноатомные спирты включают в себя метанол и этанол. Подходящие полиолы включают в себя глицерин и углеводы. Подходящие жирные кислоты или глицериды могут быть обеспечены, в частности, в форме съедобного масла, предпочтительно растительного происхождения. В частности, может быть использован углевод, так как обычно углеводы могут быть получены в больших количествах из биологически возобновляемого источника, такого как сельскохозяйственный продукт, предпочтительно отходы сельскохозяйственного продукта. Предпочтительно используют углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, сахарозы, крахмала,целлюлозы и гемицеллюлозы. Особенно предпочтительными являются глюкоза, олигосахариды, содержащие глюкозу, и полисахариды, содержащие глюкозу. Клетка, в частности рекомбинантая клетка, содержащая один или несколько биокатализаторов(обычно один или несколько ферментов) для катализа стадии реакции в способе этого изобретения, может быть сконструирована с использованием молекулярно-биологических способов, которые per se известны в данной области. Например, если один или несколько биокатализаторов должны продуцироваться в рекомбинантной клетке (которая может быть гетерологичной системой), такие способы могут быть использованы для обеспечения вектора (такого как рекомбинантный вектор), который содержит один или несколько генов, кодирующих один или несколько указанных биокатализаторов. Могут использоваться один или несколько векторов, каждый из которых содержит один или несколько таких генов. Такой вектор может содержать один или несколько регуляторных элементов, например один или несколько промоторов, которые могут быть функционально связаны с геном, кодирующим биокатализатор. В данном контексте, термин "функционально связанные" относится к связыванию полинуклеотидных элементов (или кодирующих последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот) в функциональной взаимосвязи. Последовательность нуклеиновой кислоты "функционально связана", когда она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой кодирующей последовательности. В данном контексте термин "промотор" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для регуляции транскрипции одного или нескольких генов, расположенных слева (выше) относительно направления транскрипции от сайта инициации транскрипции этого гена, и структурно идентифицируется по присутствию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других ДНК-последовательностей, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, сайты связывания факторов транскрипции, сайты связывания репрессорного и активаторного белков и любые другие последовательности нуклеотидов, известные квалифицированному в данной области специалисту, для прямого или опосредованного действия для регуляции величины транскрипции от этого промотора. "Конститутивным" промотором является промотор, который является активным при большинстве условий окружающей среды и развития. "Индуцируемым" промотором является промотор, который является активным при регуляции окружающей средой или развитием. Термин"гомологичный" при использовании его для указания родства между определенной (рекомбинантной) молекулой нуклеиновой кислоты или полипептида и определенным организмом-хозяином или определенной клеткой-хозяином обозначает, что в природе эта молекула нуклеиновой кислоты или полипептида продуцируется клеткой-хозяином или организмом того же самого вида, предпочтительно того же самого сорта или штамма. Промотор, который мог бы использоваться для получения экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент для применения в способе этого изобретения, в частности, аминотрансферазу, дегидрогеназу аминокислот или декарбоксилазу, такой как описано здесь выше, может быть природным для последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который должен быть экспрессирован, или может быть гетерологичным относительно последовательности нуклеиновой кислоты (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Предпочтительно этот промотор является гомологичным, т.е. эндогенным для этой клетки-хозяина. Если используют гетерологичный промотор (относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес фермент), этот гетерологичный промотор предпочтительно способен продуцировать более высокий уровень стационарного состояния транскрипта, содержащего эту кодирующую последовательность (или способен продуцировать больше молекул транскрипта, т.е. мРНК-молекул, на единицу времени), чем промотор, который является природным для этой кодирующей последовательности. Подходящие промоторы в этом контексте включают в себя как конститутивные, так и индуцируемые природные промоторы, а также сконструированные промоторы, которые хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту."Сильный конститутивный промотор" является промотором, который заставляет мРНК инициироваться при высокой частоте в сравнении с нативной клеткой-хозяином. Примеры таких сильных конститутивных промоторов в грамположительных микроорганизмах включают в себя SPO1-26, SPO1-15, veg,рус (промотор пируваткарбоксилазы) и amyE. Примеры индуцируемых промоторов в грамположительных микроорганизмах включают в себяIRPG-индуцируемый промотор PSPAC, индуцируемый ксилозой промотор PxylA. Примеры конститутивных и индуцируемых промоторов в грамотрицательных микроорганизмах включают в себя, но не ограничиваются ими, tac, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara(PBAD), SP6, -PR и -PL. Промоторы для клеток (мицелиальных) грибов известны в данной области и могут быть, например,промоторами gpdA глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, промоторами протеаз, такими как рерА, рерВ,рерС, промоторами glaA глюкоамилазы, промоторами amyA, amyB амилазы, промоторами catR или catA каталазы, промотором goxC глюкозооксидазы, промотором lacA бета-галактозидазы, промотором aglA альфа-глюкозидазы, промотором tefA фактора элонгации трансляции, промоторами ксиланаз, такими как среди других промоторов в web-сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/). Термин "гетерологичный" при применении в отношении нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или белка относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые не встречаются природно в виде части организма, клетки, генома или последовательности ДНК или РНК, в котором они присутствуют, или которые обнаруживаются в клетке или местоположении или местоположениях в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от тех, в которых он обнаруживается в природе. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными в отношении клетки, в которую их вводят, но были получены из другой клетки или были получены синтетически или рекомбинантно. Обычно, хотя и не обязательно, такие нуклеиновые кислоты кодируют белки, которые в норме не продуцируются клеткой, в которой эта ДНК транскрибируется или экспрессируется. Подобным образом, экзогенная РНК кодирует белки, не экспрессируемые в норме в клетке, в которой присутствует эта экзогенная РНК. Гетерологичные нуклеиновые кислоты и белки могут также называться чужеродными нуклеиновыми кислотами или белками. Любая нуклеиновая кислота или любой белок, которые квалифицированный в данной области специалист мог бы признать как гетерологичные или чужеродные для клетки, в которой они экспрессируются, включены в термин "гетерологичные" нуклеиновая кислота или белок. Способ по этому изобретению может проводиться в организме-хозяине, который может быть новым. Таким образом, это изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей один или несколько биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе этого изобретения, в частности, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении AKP, ААР или 5-FVA в 6-АСА. Это изобретение относится также к новому вектору, содержащему один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать,по меньшей мере одну стадию реакции в превращении AKP в 6-АСА, и к новой клетке-хозяину, содержащей один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе этого изобретения, в частности способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении AKP в 6-АСА (причем эти один или несколько генов могут образовывать часть одного или нескольких векторов). В одном конкретном варианте осуществления, клеткой-хозяином по данному изобретению является рекомбинантная клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биокатализатор, способный катализировать реакцию переаминирования или реакцию восстановительного аминирования с образованием альфа-аминопимелиновой кислоты из альфа-кетопимелиновой кислоты. Указанная последовательность может быть частью вектора или может быть инсертирована в хромосомную ДНК. В частности, клетка-хозяин или вектор по этому изобретению могут содержать по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, в частности, по меньшей мере две последовательности нуклеиновых кислот, выбранные из группы последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью декарбоксилазы -кетопимелиновой кислоты, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью аминотрансферазы кетопимелиновой кислоты, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих активность декарбоксилазы -аминопимелиновой кислоты. Из этих последовательностей, обычно одна или несколько, в частности две или более, последовательностей являются рекомбинантными последовательностями. В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин, обычно рекомбинантная клеткахозяин или вектор по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один биокатализатор, имеющий активность декарбоксилазы кетопимелиновой кислоты, и/или по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательностей, кодирующих биокатализатор с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью. В таком варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с активностью декарбоксилазы -кетопимелиновой кислоты, может, в частности, кодировать аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ IDNO:40, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:46, или гомолог любой из этих последовательностей, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент 5-формилпентоат-аминотрансферазу, может,в частности, кодировать аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, или их гомолог. Одна или несколько из указанных последовательностей нуклеиновых кислот могут образовывать часть одного или нескольких рекомбинантных векторов. В следующем предпочтительном варианте осуществления вектор или клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью аминотрансферазы кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы -аминопимелиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты,- 13019163NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, или их гомолог. Одна или несколько из указанных последовательностей нуклеиновых кислот могут образовывать часть одного или нескольких рекомбинантных векторов. В одном конкретном предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с -аминопимелат-2 дегидрогеназной активностью, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с аминопимелатдекарбоксилазной активностью. В одном конкретном предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 6-аминокапроновая кислота-6-дегидрогеназной активностью, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с -кетопимелиновая кислота-декарбоксилазной активностью. Один или несколько подходящих генов клетки-хозяина или векторов по данному изобретению могут быть, в частности, выбраны из генов, кодирующих фермент, упомянутый здесь выше. В одном конкретном варианте осуществления эта клетка-хозяин является рекомбинантной клеткой,содержащей по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, идентифицированных в любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQNO: 68, и их функциональных аналогов. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с 5-FVA-аминотрансферазной активностью, может быть, в частности, последовательностью, выбранной из группы последовательностей,представленных любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 64, 66, 68, и функциональных аналогов любой из этих последовательностей. В данном контексте термин "функциональные аналоги" включает в себя, по меньшей мере, другие последовательности, кодирующие фермент, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, и другие последовательности, кодирующие гомолог такого фермента. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с AKP-декарбоксилазной активностью, может быть, в частности, последовательностью, выбранной из группы последовательностей,представленных любой из SEQ ID NO: 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45, 47, и функциональных аналогов любой из этих последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный катализировать превращение ААР в AKP, соответствующую SEQ ID NO: 1, 3, 7, 11, 13, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, или ее функциональный аналог, который может быть последовательностью дикого типа или может не быть последовательностью дикого типа. В одном конкретном варианте осуществления клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биокатализатор, имеющий активность декарбоксилазы альфа-аминопимелиновой кислоты, который может быть гомологичным или гетерологичным относительно этой клетки-хозяина. В частности, такой биокатализатор может быть выбран из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1), более конкретно из группы глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), декарбоксилаз альфакетокислоты с разветвленной цепью,альфа-кетовалератдекарбоксилаз,альфакетоглутаратдекарбоксилаз, пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1) и оксалоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3). В одном конкретном варианте осуществления клетка-хозяин содержит один или несколько ферментов, катализирующих образование AKP из AKG (см. также выше). Может быть изготовлена система ферментов, образующая часть альфа-аминоадипатного пути для биосинтеза лизина. Термин "система ферментов" используется здесь, в частности, для единственного фермента или группы ферментов, посредством которых может катализироваться конкретное превращение. Указанное превращение может предусматривать одну или несколько химических реакций с известными или неизвестными промежуточными продуктами, например превращение AKG в AKA или превращение AKA в AKP. Такая система может присутствовать в клетке или может быть выделена из клетки. Известно, что аминотрансферазы часто имеют широкий диапазон субстратов. Если эта система присутствует, может быть желательным уменьшение активности одного или нескольких таких ферментов в клетке-хозяине, так что активность в превращении AKA в альфа-аминоадипат (ААА) уменьшается при сохранении каталитических функций в отношении биосинтеза других аминокислот или клеточных компонентов. Предпочтительной также является клетка-хозяин, лишенная любой другой ферментативной активности, приводящей к превращению В одной предпочтительной клетке-хозяине, подходящей для получения ААР, использующего процесс биопревращения целых клеток, кодируются один или несколько биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в получении альфа-кетопимелиновой кислоты из альфа-кетоглутаровой кислоты. Подходящими биокатализаторами являются, например, биокатализаторы,описанные выше при обсуждении получения AKP. Клетка-хозяин может быть, выбрана, например, из бактерий, дрожжей или грибов. В частности,клетка-хозяин может быть выбрана из родов, выбранных из группы Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Hansenula, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Gluconobacter,Methanococcus, Methanobacterium, Methanocaldococcus и Methanosarcina и Escherichia. Здесь были клонированы и экспрессированы обычно одна или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, как описано выше. В частности, штамм-хозяин и, следовательно, клетка-хозяин, подходящие для биохимического синтеза 6-АСА, могут быть выбраны из группы клеток-хозяев Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacterium glutamicum, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Saccharomyces cervisiae, Hansenula polymorpha, Candida albicans, Kluyveromyces lactis, Pichia stipitis, Pichia pastoris,Methanobacterium thermoautothrophicum H, Methanococcus maripaludis, Methanococcus voltae, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri и Methanosarcina mazei. В предпочтительном варианте осуществления эта клетка-хозяин способна продуцировать лизин (в качестве предшественника). Клетка-хозяин может быть, в принципе, природным организмом или может быть сконструированным генной инженерией организмом. Такой организм может быть сконструирован с использованием скрининга мутаций или стратегиями метаболического конструирования, известными в данной области. В одном конкретном варианте осуществления эта клетка-хозяин природно содержит (или способна продуцировать) один или несколько ферментов, подходящих для катализа стадии реакции в способе этого изобретения, таких как одна или несколько активностей, выбранных из группы декарбоксилаз, аминотрансфераз и дегидрогеназ аминокислот, способных катализировать стадию реакции в способе этого изобретения. Например, Е. coli может быть природно-способной продуцировать фермент, катализирующий переаминирование в способе этого изобретения. Можно обеспечить также рекомбинантную клетку-хозяина как рекомбинантным геном, кодирующим аминотрансферазу или дегидрогеназу аминокислот, способные катализировать стадию реакции в способе этого изобретения, так и рекомбинантным геном, кодирующим ген декарбоксилазы, способной катализировать стадию реакции в способе этого изобретения. Например, клетка-хозяин может быть выбрана из рода Corynebacterium, в частности Corynebacterium glutamicum, кишечных бактерий, в частности Saccharomyces, в частности S. cerevisiae. Особенно подходящими являются штаммы С. glutamicum или В. methanolicus, которые были разработаны для промышленного производства лизина. Далее, это изобретение относится к микроорганизму, который может быть микроорганизмом дикого типа, выделенным из его природного окружения, или рекомбинантным микроорганизмом, содержащим ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированную в любой изSEQ ID NO, выбранной из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ IDNO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, и их функциональных аналогов. Функциональные аналоги нуклеотидной последовательности, в данном контексте, являются, в частности, нуклеотидными последовательностями, кодирующими ту же самую аминокислотную последовательность, что и эта нуклеотидная последовательность, или гомологом этой нуклеотидной последовательности. В частности, предпочтительными функциональными аналогами является нуклеотидная последовательность, имеющая сходный, тот же самый или лучший уровень экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине, в сравнении с нуклеотидной последовательностью, называемой ее функциональным аналогом. Кроме того, это изобретение относится к полинуклеотиду или вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированную в SEQ ID NO, выбранной из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ IDNO: 47, и их функциональных аналогов не дикого типа. Такой полинуклеотид или вектор является особенно полезным для обеспечения клетки-хозяина, в частности клетки-хозяина Е. coli, или другой клеткихозяина, которая способна катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении AKP в 6-АСА с высоким выходом в сравнении с соответствующим геном дикого типа. Необязательно, этот полинуклеотид или вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько биокатализаторов, подходящих для катализа стадии реакции в способе по этому изобретению, в частности, такие один или несколько биокатализаторов,приведенные выше. Кроме того, это изобретение относится к способу получения альфа-аминопимелиновой кислоты(ААР), предусматривающему превращение AKP в ААР, причем это превращение катализируется биокатализатором. Для такого способа может, в частности, использоваться биокатализатор, имеющий аминотрансферазную активность или активность восстановительного аминирования, как описано выше. Как указано выше, ААР может быть, следовательно, использована для получения 6-АСА. Альтернативно, ААР может быть использована как таковая, например, в качестве химикалия для биохимического исследования или в качестве соединения рН-буфера, например, для применения в препаративном или аналитическом способе разделения, таком как жидкостная хроматография или капиллярный электрофорез. Кроме того, ААР, полученная способом этого изобретения, может дополнительно использоваться в получении другого соединения, например, ААР может быть превращена в капролактам. Как описано выше и иллюстрировано в примере ниже, ААР может быть химически превращена в капролактам, например, подверганием высокой температуре. Не связывая себя теорией, авторы изобретения предполагают, что также и в этой реакции 6-АСА может быть образована в виде короткоживущего промежуточного продукта. Далее это изобретение будет иллюстрировано следующими примерами. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Примеры Общие способы Молекулярные и генетические способы Стандартные генетические способы и способы молекулярной биологии обычно известны в данной области и были описаны ранее (Maniatis et al. 1982 "Molecular cloning: a laboratory manual". Cold SpringpBAD/Mys-His С получали из Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Плазмиду pBAD/Myc-His-DEST,сконструированную, как описано в WO 2005/068643, использовали для экспрессии белка. Е. coli ТОР 10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) использовали для всех процедур клонирования и для экспрессии геновмишеней. СредыLB-среду (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) использовали для выращивания Е. coli. Антибиотики (50 мкг/мл карбенициллин) добавляли для поддержания плазмид. Для индукции экспрессии генов под контролем промотора PBAD В произведенных из pBAD/Myc-His-DEST плазмидах,добавляли L-арабинозу до конечной концентрации 0,2% (м/о). Идентификация плазмид Плазмиды, несущие различные гены, идентифицировали генетическими, биохимическими и/или фенотипическими способами, обычно известными в данной области, такими как устойчивость трансформантов к антибиотикам, рестрикционный анализ очищенной плазмидной ДНК или анализ последовательности ДНК. Анализ ВЭЖХ-МС для определения 5-FVA 5-FVA детектировали селективным мониторингом реакции (SRM)-MC, измеряя переход m/z 12983. Концентрации для 5-FVA рассчитывали измерением максимальной площади пика 5-FVA, элюирующегося при приблизительно 6 мин. Калибровку выполняли с использованием процедуры наружного стандарта. Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на системе Agilent 1200 ЖХ, состоящей из насоса для нагнетания четырех компонентных смесей, автоматического пробоотборника и термостата для колонок,соединенных с Agilent 6410 QQQ triple quadrupole MS. Условия жидкостной хроматографии (ЖХ): Колонка: 504,6 мм Nucleosil С 18, 5 мкм (MacheryNagel) на колонку, соединенную с колонкой 2504,6 мм вн. диам. Prevail С 18, 5 мкм (Alltech) Температура колонок: комнатная температура Элюент: А: вода, содержащая 0,1% муравьиную кислоту В: ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиную кислоту Условия масс-спектрометрии (МС): Ионизация: электрораспыление отрицательных ионов условия источника: напряжение электрораспыления: 5 кВ температура: 350 С оптимизированные напряжение фрагментирующего устройства и энергия соударений Режим сканирования: режим селективной реакции: переход m/z 12983 Анализ ВЭЖХ-МС для определения ААР ААР детектировали селективным мониторингом ионов (SIM)-MC, измеряя протонированную молекулу для ААР с m/z 176. Концентрации для ААР рассчитывали измерением максимальной площади пика ААР, элюирующегося при времени удерживания 2,7 мин в этих пробах. Калибровку выполняли с использованием процедуры наружных стандартов. Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на системеAgilent 1100 ЖХ, состоящей из насоса для нагнетания четырех компонентных смесей, аппарата для дегазации, автоматического пробоотборника и термостата для колонок, соединенных с API 2000 triple quadrupole MS (Applied Biosystems). Условия ЖХ были следующими: Колонка: 504 Nucleosil С 18, 5 мкм (Macherey-Nagel) + 2504,6 Prevail С 18, 5 мкм (Alltech), обе при комнатной температуре (RT) Элюент: А = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в сверхчистой воде В = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в ацетонитриле (pa, Merck) Скорость потока: 1,2 мл/мин, перед вхождением в МС этот поток разделяли 1:3 Градиент: Градиент начинался при t=0 мин с 90% (о/о) А и изменялся в пределах 6 мин до 50% (о/о) А. При 6,1 мин этот градиент изменяли до первоначального состояния. Объем инжекции: 2 мкл Условия МС: Для ионизации использовали электрораспыление положительных ионов Детектирование: в режиме SIM на m/z 176, с интервалом времени 100 мс. Анализ ВЭЖХ-МС для определения 6-АСА Калибровка: Калибровку выполняли при помощи наружной калибровочной линии 6-АСА (m/z 132m/z 114, Rt 7,5 мин). Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на Agilent 1100, снабженном насосом для нагнетания четырех компонентных смесей, аппаратом для дегазации, автоматическим пробоотборником и термостатом для колонок и single-quadrupole MS (Agilent, Waldbronn, Germany). Условия ЖХ-МС были следующие: Колонка: 504 Nucleosil C18, 5 мкм (Macherey-Nagel) + 2504,6 Prevail C18, 5 мкм (Alltech), обе при комнатной температуре (RT) Элюент: А = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в сверхчистой воде В = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в ацетонитриле (pa, Merck) Скорость потока: 1,0 мл/мин, перед вхождением в МС этот поток разделяли 1:3 Градиент: Градиент начинался при t=0 мин с 100% (о/о) А, оставаясь таким же в течение 15 мин, и изменялся в пределах 15 мин до 80% (о/о) В. (t=30 мин). От 30 до 31 мин градиент выдерживали при постоянных 80% (о/о) В. Электрораспылительную ионизацию (ESI) проводили в положительном режиме сканирования со следующими условиями: m/z 50-500, устройство для фрагментации 50 В, размер ступени m/z 0,1, температура газа для сушки 350 С, газ для сушки 10 л N2/мин, давление распылителя 50 фунт/квадр.дюйм (506894, 757 Па) и напряжение капилляров 2,5 кВ. Клонирование генов-мишеней Конструирование экспрессионных конструкций Сайты attB добавляли ко всем генам слева от сайта связывания рибосом и инициирующего (стартового) кодона и справа от терминирующего кодона для облегчения клонирования с использованием технологии Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Синтез генов и конструирование плазмид Синтетические гены получали из DNA2,0 и оптимизировали в отношении кодонов для экспрессии в Е. coli в соответствии со стандартными процедурами DNA2,0. Гены аминотрансферазы из Vibrio fluvialisJS17 [SEQ ID No. 1] и Bacillus weihenstephanensis KBAB4 [SEQ ID No. 4], кодирующие аминокислотные последовательности -аминотрансферазы V. fluvialis JS17 [SEQ ID No. 2] и аминотрансферазы В. weihenstephanensis KBAB4 (ZP01186960) [SEQ ID No. 5], соответственно, оптимизировали в отношении кодонов и полученные последовательности [SEQ ID No. 3] и [SEQ ID No. 6] получали синтезом ДНК. Гены декарбоксилазы из Escherichia coli [SEQ ID No. 30], Saccharomyces cerevisiae [SEQ ID No. 33],Zymomonas mobilis [SEQ ID No. 36], Lactococcus lactis [SEQ ID No. 39], [SEQ ID No. 42] и Mycobacteriumtuberculosis [SEQ ID No. 45], кодирующие аминокислотные последовательности -аминотрансферазы V.Kgd Mycobacterium tuberculosis [SEQ ID No. 46], соответственно, оптимизировали в отношении кодонов и полученные последовательности [SEQ ID No. 32], [SEQ ID No. 35], [SEQ ID No. 38], [SEQ ID No. 41],[SEQ ID No. 44] и [SEQ ID No. 47] получали синтезом ДНК соответственно. Эти конструкции генов клонировали в экспрессирующие векторы pBAD/AMyc-His-DEST с использованием технологии Gateway (Invitrogen) с использованием введенных сайтов attB и pDONR201 (Invitrogen) в качестве вводимого (entry) вектора, как описано в протоколах изготовителя(www.invitrogen.com). Таким путем получали экспрессирующие векторы pBAD-VflAT и pBAD-BweAT соответственно. Соответствующие экспрессионные штаммы получали трансформацией химически компетентной Е. coli ТОР 10 (Invitrogen) соответствующими pBAD-экспрессирующими векторами. Клонирование при помощи ПЦР Различные гены, кодирующие биокатализатор, амплифицировали из геномной ДНК с использованием PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen) в соответствии с описаниями изготовителя с использованием праймеров перечисленных в следующей таблице. Таблица 2 ПЦР-реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле и продукты ПЦР правильного размера элюировали из этого геля с использованием набора для очистки QIAquick (Qiagen, Hilden, Germany). Очищенные продукты ПЦР клонировали в экспрессирующие векторы pBAD/Myc-His-DEST с использованием технологии Gateway (Invitrogen) с применением введенных сайтов attB и pDONR-zeo(Invitrogen) в качестве entry-вектора, как описано в протоколах изготовителя. Последовательность генов,клонируемых при помощи ПЦР, подтверждали секвенированием ДНК. Таким путем были получены экспрессирующие векторыpBAD-Pae-gi9946143AT,pBAD-Bsugi16078032 АТ,pBADBsugi16080075AT, pBAD-Bsugi16077991AT, pBAD-RspAT, pBAD-LpnAT, pBAD-NeuAT, pBADNgoAT, pBAD-Paegi9951299AT, pBAD-Paegi9951072AT, pBAD-Paegi9951630AT и pBADRpaAT. Соответствующие экспрессионные штаммы получали трансформацией химически компетентной Е. coli ТОР 10 (Invitrogen) соответствующими конструкциями pBAD. Выращивание Е. coli для экспрессии белка Выращивание в малом масштабе проводили в 96-луночных планшетах с глубокими лунками с 940 мкл среды, содержащей 0,02% (м/о) L-арабинозу. Инокуляцию выполняли перенесением клеток из замороженных исходных культур в 96-луночную матрицу (Kkhner, Birsfelden, Switzerland). Планшеты инкубировали на орбитальном шейкере (300 об/мин, амплитуда 5 см) при 25 С в течение 48 ч. Обычно достигалась OD620 нм 2-4. Приготовление лизатов клеток Приготовление лизисного буфера Лизисный буфер содержал следующие ингредиенты: Этот раствор готовили непосредственно перед применением. Приготовление бесклеточного экстракта при помощи лизиса Клетки из выращивания малого масштаба (см. предыдущий абзац) собирали центрифугированием и супернатант выбрасывали. Осадки клеток, образованные во время центрифугирования, замораживали при -20 С в течение по меньшей мере 16 ч и затем оттаивали на льду. 500 мкл свежеприготовленного лизисного буфера добавляли в каждую лунку и клетки ресуспендировали сильным перемешиванием этого планшета на вортексе в течение 2-5 мин. Для достижения лизиса планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Для удаления остатков клеток планшет центрифугировали при 4 С и 6000 g в течение 20 мин. Супернатант переносили в свежий планшет и хранили на льду до дальнейшего использования. Получение бесклеточного экстракта обработкой ультразвуком Клетки из выращивания в средних масштабах (см. предыдущий абзац) собирали центрифугированием и супернатант выбрасывали. 1 мл калий-фосфатного буфера рН 7 добавляли к 0,5 г сырого осадка клеток и клетки ресуспендировали сильным перемешиванием на вортексе. Для достижения лизиса эти клетки обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин. Для удаления остатков клеток эти лизаты центрифугировали при 4 С и 6000 g в течение 20 мин. Супернатант переносили в свежую пробирку и замораживали при -20 С до дальнейшего использования. Получение 5-формилпентановой кислоты химическим гидролизом метил-5-формилпентаноата Субстрат для аминотрансферазной реакции, т.е. 5-формилпентановую кислоту, получали химическим гидролизом метил-5-формилпентаноата следующим образом: 10% (м/о) раствор метил-5 формилпентаноата в воде доводили до рН 14,1 при помощи NaOH. После 24 ч инкубации при 20 С рН доводили до 7,1 при помощи HCl. Ферментативные реакции для превращения 5-формилпентановой кислоты в 6-АСА Если нет других указаний, готовили реакционную смесь, содержащую 10 мМ 5 формилпентановоую кислоту, 20 мМ рацемический -метилбензиламин и 200 мкМ пиридоксаль-5'фосфат, в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0. 100 мкл этой реакционной смеси наливали в каждую лунку планшетов с лунками. Для инициирования этой реакции, добавляли 20 мкл бесклеточных экстрактов, в каждую из лунок. Реакционные смеси инкубировали на шейкере при 37 С в течение 24 ч. Кроме того, химическую смесь в качестве контрольной пробы (слепого опыта) (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. coli TOP10 с pBAD/Myc-His С) инкубировали при тех же самых условиях. Пробы анализировали с использованием ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 4. Образование 6-АСА из 5-FVA в присутствии аминотрансферазn.d.: не детектируется способ отличается тем, что использовали 10 мкл бесклеточного экстракта вместо 20 мкл, концентрация пиридоксаль-5'-фосфата была 50 мкМ вместо 200 мкМ и объем реакционной смеси в этих лунках был 190 мкл вместо 100 мкл. Показано, что 6-АСА образуется из 5-FVA в присутствии аминотрансферазы. Ферментативные реакции для превращения AKP в 5-формилпентановую кислоту Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ AKP, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (для LysA) или 1 мМ тиаминдифосфат (для всех других ферментов) в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 4 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 1 мл бесклеточных экстрактов, полученных обработкой ультразвуком, в каждую из лунок. В случае коммерческой оксалоацетатдекарбоксилазы (Sigma-Aldrich product number 04878), использовали 50 Е. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37 С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. coli TOP10 с pBAD/Myc-His С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 5. Образование 5-FVA из AKP в присутствии декарбоксилазn.d.: не детектируется Показано, что 5-FVA образуется из AKP в присутствии декарбоксилазы. Ферментативные реакции для превращения AKP в 6-АСА в присутствии декарбоксилазы Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ AKP, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (для LysA) или 1 мМ тиаминдифосфат (для всех других ферментов) в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 4 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 1 мл бесклеточных экстрактов в каждую из лунок. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37 С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. coli TOP10 с pBAD/Myc-His С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 6. Образование 6-АСА из AKP в присутствии декарбоксилазcoli содержала природную 5-FVA-аминотрансферазную активность. Ферментативные реакции для превращения AKP в 6-АСА в присутствии рекомбинантной декарбоксилазы и рекомбинантной аминотрансферазы Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ AKP, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат, 1 мМ тиаминдифосфат и 50 мМ рацемический -метилбензиламин в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 1,6 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 0,2 мл содержащего декарбоксилазу бесклеточного экстракта, в каждый из реакционных сосудов. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37 С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. coli TOP10 с pBAD/Myc-His С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 7. Образование 6-АСА из AKP в присутствии рекомбинантной декарбоксилазы и рекомбинантной аминотрансферазыDC=декарбоксилаза В химическом контроле и в биологическом контроле 6-АСА была недетектируемой. Кроме того, эти результаты показывают, что в сравнении с примером, в котором использовали клетку-хозяин только с рекомбинантной декарбоксилазой (и без рекомбинантой аминотрансферазы),превращение в 6-АСА улучшалось. Конструирование плазмид для экспрессии аминотрансфераз и декарбоксилаз в S. cerevisiae Ген аминотрансферазы из Vibrio fluvialis JS17, кодирующий аминокислотную последовательность-аминотрансферазы V. fluvialis JS17 [SEQ ID No. 2], амплифицировали при помощи ПЦР из pBADVflAT [SEQ ID No. 3] с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [SEQ ID No. 76 и 77]. Ген аминотрансферазы из Pseudomonas aeruginosa [SEQ ID No. 7], кодирующий аминотрансферазуP. aeruginosa [SEQ ID No. 8], амплифицировали из pBAD-PaeAT при помощи ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [SEQ ID No. 78 и 79]. Полученные продукты ПЦР клонировали в вектор pAKP-41 с использованием рестрикционных ферментов SpeI и BamHI с получением векторов pAKP-79 и pAKP-80 соответственно, которые теперь содержат ген аминотрансферазы под контролем промотора gal10 S. cerevisiae и терминатора adh2 S. cerevisiae. Ген декарбоксилазы из Saccharamyces cerevisiae [SEQ ID No. 33], кодирующий пируватдекарбоксилазу Pdc Saccharamyces cerevisiae [SEQ ID No. 34], амплифицировали из pBAD-Pdc с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [SEQ ID No. 80 и 81]. Ген декарбоксилазы из Lactococcus lactis [SEQ ID No. 39], кодирующий декарбоксилазу KdcA кетокислот с разветвленной цепью Lactococcus lactis [SEQ ID No. 40], амплифицировали из pBAD-KdcA с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [SEQ ID No. 82 и 83]. Полученные продукты ПЦР клонировали в вектор pAKP-44 с использованием рестрикционных ферментов AscI и BamHI с получением векторов pAKP-81 и pAKP-82 соответственно, которые теперь содержат ген декарбоксилазы под контролем промотора gal2 S. cerevisiae и терминатора pma1 S. cerevisiae. Плазмиды pAKP-79 и pAKP-80 расщепляли рестрикционными ферментами SacI и XbaI и плазмидыpAKP-81 и pAKP-82 расщепляли рестрикционными ферментами SalI и XbaI. SacI/XbaI-фрагмент аминоферазы соединяли с SalI/XbaI-фрагментом декарбоксилазы в низкокопийный эписомный вектор pRS414S. cerevisiae, который расщепляли рестрикционными ферментами SalI и SacI. Получали следующие плазмиды: Трансформация и выращивание S. cerevisiae Штамм S. cerevisiae CEN.PK113-3C трансформировали 1 мкг плазмидной ДНК согласно способу,описанному Gietz и Woods (Gietz, R.D. and Woods, R.A. (2002). Transformation of yeast by the Liac/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96). Клетки высевали на чашки с агаром с 1 азотистым основанием дрожжей без аминокислот и 2% глюкозы. Полученные штаммы выращивали аэробно при 30 С в течение 48 ч в минимальной среде Verduyn,содержащей 0,05% глюкозу и 4% галактозу. Получение бесклеточного экстракта 1 мл калий-фосфатного буфера (рН 7) добавляли к 0,5 г осадка клеток. Эту смесь добавляли в пробирку Эппендорфа на 2 мл, которая содержала 0,5 г стеклянных гранул (бусин) с диаметром 0,4-0,5 мм. Пробы сильно встряхивали с использованием шейкера Эппендорфа (IKA VIBRAX-VXR) в течение 20 с. Полученный бесклеточный экстракт центрифугировали в течение 5 мин 14000 об./мин и 4 С. Этот супернатант использовали для анализов активности ферментов. Ферментативные реакции для превращения AKP в 6-ACA в присутствии декарбоксилазы и аминотрансферазы, коэкспрессируемых в S. cerevisiae Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ AKP, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат, 1 мМ тиаминдифосфат и 50 мМ рацемический -метилбензиламин в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 1,6 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 0,4 мл бесклеточного экстракта из S. cerevisiae, содержащего декарбоксилазу и аминотрансферазу, в каждый из реакционных сосудов. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37 С. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (S. cerevisiae). Пробы, взятые после 19 ч инкубирования, анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 8. Образование 6-ACA из AKP с использованием микроорганизма в качестве биокатализатора Ферментативные реакции для превращения -кетопимелиновой кислоты в -аминопимелиновую кислоту Готовили реакционную смесь, содержащую 10 мМ -кетопимелиновую кислоту, 20 мМ L-аланин и 50 мкМ пиридоксаль-5'фосфат в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0. 800 мкл реакционной смеси наливали в каждую лунку многолуночных планшетов. Для запуска реакции, добавляли 200 мкл лизатов клеток в каждую из этих лунок. Реакционные смеси инкубировали на шейкере при 37 С в течение 24 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. coli TOP10 с pBAD/Myc-His С). Пробы анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице. Таблица 9. Образование ААР из AKP в присутствии аминотрансфераз Показано, что образование ААР из AKP катализируется биокатализатором. Химическое превращение ААР в капролактам К суспензии 1,5 г D,L-2-аминопимелиновой кислоты в 21 мл циклогексанона добавляли 0,4 мл циклогексенона. Эту смесь нагревали на масляной бане в течение 20 ч при дефлегмации (приблизительно 160 С). После охлаждения до комнатной температуры эту реакционную смесь декантировали и прозрачный раствор упаривали при пониженном давлении. Оставшиеся 2 г коричневатого масла анализировали при помощи 1 Н-ЯМР и ВЭЖХ, и они содержали 0,8 мас.% капролактама и 6 мас.% циклических олигомеров капролактама.(ii) 5-формилпентаноат превращают в 6-аминокапроновую кислоту, где по меньшей мере одна реакция катализируется биокатализатором, где биокатализатор для стадии (i) включает фермент, способный катализировать декарбоксилирование -кетопимелиновой кислоты или аминокислоты, и биокатализатор для стадии (ii) включает фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование. 2. Способ по п.1, в котором фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование, выбирают из группы аминотрансфераз (Е.С. 2.6.1) и дегидрогеназ аминокислот(Е.С.1.4.1). 3. Способ по п.2, в котором аминотрансферазу или дегидрогеназу аминокислот выбирают из группы-аминоизобутират:-кетоглутарат-аминотрансфераз,-аланин-аминотрансфераз,аспартатаминотрансфераз, 4-аминобутират-аминотрансфераз, (ЕС 2.6.1.19), L-лизин-6-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 5-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48),2-аминогексонат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67), лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71) и лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18). 4. Способ по п.2 или 3, в котором фермент выбирают из группы ферментов, способных катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование из организма, выбранного из группыpneumophila, Nitrosomonas europaea, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas syringae, Rhodopseudomonas palustris, Vibrio fluvialis и Pseudomonas aeruginosa. 5. Способ по любому из пп.2-4, в котором используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, или гомолог любой из этих последовательностей. 6. Способ по п.1, в котором ферментом, способным катализировать декарбоксилирование, является декарбоксилаза (ЕС 4.1.1). 7. Способ по п.6, где декарбоксилазу выбирают из группы глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15),диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), декарбоксилаз кетокислот с разветвленной цепью, -кетоизовалератдекарбоксилаз, -кетоглутаратдекарбоксилаз, пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1) и оксалоацетаткарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3). 8. Способ по п.6 или 7, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, является ферментом из организма или его части, выбранных из группы Cucurbitaceae; Saccharomyces; Candida; Hansenula; Kluyveromyces; Rhizopus; Neurospora; Zymomonas; Escherichia; Mycobacterium; Clostridium; Lactobacillus; Streptococcus; Pseudomonas и Lactococcus. 9. Способ по любому из пп.6-8, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 46, или гомолог любой из этих последовательностей. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором -кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 5-формилпентаноат в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование -кетокислоты, и 5-формилпентаноат биокаталитически превращают в 6 аминокапроновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование 5-формилпентаноата. 11. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, в котором -кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в -аминопимелиновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование -кетопимелиновой кислоты с образованием посредством этого -аминопимелиновой кислоты, и -аминопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 6-аминокапроновую кислоту в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование аминокислоты. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором -кетопимелиновая кислота получена из природного источника. 13. Способ получения капролактама, предусматривающий циклизацию 6-аминокапроновой кисло- 23019163 ты, полученной способом по любому из предыдущих пунктов, с образованием посредством этого капролактама. 14. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы -кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью. 15. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты,кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, или ее гомолог. 16. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14 или 15, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы -кетопимелиновой кислоты, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ IDNO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 46, или гомолог любой из этих последовательностей. 17. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью аминотрансферазы -кетопимелиновой кислоты или активность дегидрогеназы -кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы -аминопимелиновой кислоты. 18. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.17, в которой этот биокатализатор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ IDNO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29,или ее гомолог. 19. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-18, содержащая одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в получении альфа-кетопимелиновой кислоты из альфакетоглутаровой кислоты. 20. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-19, где эта клетка-хозяин выбрана из группыAspergillus, Penicillium, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Hansenula, Bacillus, Corynebacterium и Escherichia. 21. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-20, содержащая ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, представленных любой последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 68, и их функциональных аналогов. 22. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, и их функциональных аналогов.
МПК / Метки
МПК: C07C 229/08, C12P 17/10, C12P 13/00
Метки: 6-аминокапроновой, кислоты, получение, alpha;-кетопимелиновой
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-19163-poluchenie-6-aminokapronovojj-kisloty-iz-alpha-ketopimelinovojj-kisloty.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Получение 6-аминокапроновой кислоты из α-кетопимелиновой кислоты</a>
Получение l-аскорбиновой кислоты в результате микробиологического процесса
Номер патента: 9287
Опубликовано: 28.12.2007
Авторы: Берри Алан, Синдзе Масако, Ли Конни, Майер Анн Франсуаз
МПК: C12N 15/11, C12N 1/21, C12N 15/53...
Метки: микробиологического, результате, процесса, кислоты, получение, l-аскорбиновой
Формула / Реферат:
1. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий L-сорбозондегидрогеназной активностью, выбранный из группы, состоящей из: (a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 27; (b) полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ NO: 1, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 26; (c) полинуклеотида, включающего нуклеотидную...
Получение механоактивированных аморфной и аморфно-кристаллической кальциевых солей глюконовой кислоты
Номер патента: 16596
Опубликовано: 30.06.2012
Авторы: Коныгин Григорий Николаевич, Ефремов Юрий Яковлевич, Гумаров Габдрауф Габдрашитович, Поздеев Виктор Владимирович, Шарафутдинова Диляра Рашидовна, Рыбин Дмитрий Станиславович, Петухов Владимир Юрьевич, Стрелков Николай Сергеевич, Елсуков Евгений Петрович
МПК: A61K 31/191, A61P 3/14, A61P 3/02...
Метки: получение, аморфно-кристаллической, аморфной, глюконовой, кальциевых, механоактивированных, солей, кислоты
Формула / Реферат:
1. Механоактивированная аморфная кальциевая соль глюконовой кислоты с однородным диффузным гало в ее порошковой рентгеновской дифрактограмме, характеризующаяся смещением центра тяжести полосы поглощения 3000-3600 см-1 в область больших волновых чисел на величину не более 200 см-1, наличием полос поглощения с частотами 3308±20, 2933±10, 1602±10, 1420±10 с плечом 1260±40, 1085±10, 1044±10, 877±10, 682±10, 577±10 см-1 и дополнительной полосы...
Производные амида гетероарил-гексановой кислоты, их получение и их применение в качестве селективных ингибиторов связывания mip-1-альфа с его рецептором ccr1
Номер патента: 2146
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Посс Кристофер Стенли, Браун Мэттью Фрэнк, Кэт Джон Чарлз
МПК: A61P 37/08, C07D 215/54, A61K 31/47...
Метки: амида, ингибиторов, mip-1-альфа, качестве, производные, применение, селективных, гетероарил-гексановой, кислоты, получение, рецептором, связывания
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы где R1 представляет собой (С2-С9)гетероарил, возможно замещенный одним или более чем одним заместителем, независимо выбранным из группы, в которую входят водород, галогено, (C1-С6)алкил, возможно замещенный одним или более чем одним атомом фтора, гидрокси, (C1-С6)алкокси, фенил, (С2-С9)гетероарил; R2 представляет собой фенил-(CH2)m-, нафтил-(CH2)m-, (С3-С10)циклоалкил-(CH2)m-, (C1-С6)алкил или (С2-С9)гетероарил-(CH2)m-,...
Новые пролекарства (n-2-пиридил-n-2-гидроксикарбонилэтил)амида 1 – метил-2-(4-амидинофениламинометил)бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты, их получение и их применение в качестве лекарственных средств
Номер патента: 8249
Опубликовано: 27.04.2007
Авторы: Кольбацки Флориан, Буш Ульрих, Хауэль Норберт
МПК: C07D 401/12, A61K 31/245, A61P 7/02...
Метки: n-2-пиридил-n-2-гидроксикарбонилэтил)амида, метил-2-(4-амидинофениламинометил)бензимидазол-5-илкарбоновой, качестве, средств, пролекарства, кислоты, новые, лекарственных, получение, применение
Формула / Реферат:
1. Соединения общей формулы в которой а) R' обозначает атом водорода, a R обозначает метоксикарбонильную группу или б) R' обозначает атом водорода либо С1-С6алкильную группу, a R обозначает гидроксигруппу, при этом алкильные группы, содержащие более 2 атомов углерода, включают также их изомеры с разветвленной цепью, такие, например, как изопропильная, трет-бутильная и изобутильная группа, их таутомеры и их соли. 2. Соединения общей формулы I по...
Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты;зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности
Номер патента: 7414
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Уемори Такаси, Мукаи Хироюки, Кобаяси Ейдзи, Асада Киезо, Като Икуносин, Еноки Тацудзи, Томоно Дзун, Сагава Хироаки, Ямамото Дзунко
МПК: C12N 15/09, C12Q 1/68
Метки: продукт, способ, способа, амплификации, кислоты;зонд, кислоты, определения, иммобилизованной, последовательности, кислотой, получения, нуклеотидной, олигонуклеотидный, химерный, праймер, детекции, нуклеиновой, кислоты-мишени, материал, амплифицированной
Формула / Реферат:
1. Зонд, гибридизующийся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, выбранного из следующей группы: (a) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической Escherichia coli, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131; (b) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий...
Предыдущий патент: Способ для измерения расходов газовой и жидкостной фаз, содержащихся в многофазном потоке, и устройство для его осуществления
Следующий патент: Воздухозаборник для газотурбинной установки
Случайный патент: Большеразмерный тюк изделий из изоляционного материала, в особенности изделий из минеральной ваты в виде плит или рулонов