Новый антиген, ассоциированный с новообразованными сосудами опухолевых метастазов

НОВЫЙ АНТИГЕН, АССОЦИИРОВАННЫЙ С НОВООБРАЗОВАННЫМИ СОСУДАМИ ОПУХОЛЕВЫХ МЕТАСТАЗОВA (ED-A) фибронектина, для лечения опухолевых метастазов. Изобретение относится к обнаружению и лечению метастазов, т.е. к обнаружению и лечению вторичных опухолей, возникающих в области, которая отдалена от участка расположения первичной опухоли. Данное изобретение включает применение связывающего элемента, который связывается с изоформой ED-A фибронектина, в частности связывающего элемента, который связывается с ED-A фибронектина. Подавляющее большинство смертельных исходов при злокачественных опухолях связано с распространением метастазов при этом заболевании (Hanahan and Weinberg, 2000), и стремительный процесс образования новых сосудов является характерным признаком образования агрессивных опухолевых метастазов. Опухоли классифицируют либо как доброкачественные, либо как злокачественные. Злокачественные опухоли способны распространяться из области их первоначального возникновения (первичная опухоль) в другие части организма, тогда как доброкачественные опухоли не способны к подобному распространению. Злокачественные опухоли могут распространяться из области их первоначальной локализации путем инвазии и метастазирования. Опухоли, образованные в результате метастазирования, известны, например, как метастазы, вторичные опухоли, метастатические повреждения или очаги метастазирования. Ангиогенез означает рост новых кровеносных сосудов из существующих кровеносных сосудов. Опухоли могут индуцировать ангиогенез путем секреции различных факторов роста (например, фактор роста сосудистого эндотелия). Опухолевый ангиогенез позволяет опухолям расти до размеров более нескольких миллиметров в диаметре, а также создает предпосылки к образованию опухолевых метастазов. Новые кровеносные сосуды, образованные в результате ангиогенеза, образуют новую сосудистую систему опухоли или опухолевых метастазов. Фибронектин (FN) является гликопротеином и широко экспрессируется во многих нормальных тканях и жидкостях организма. Он является компонентом внеклеточного матрикса (ЕСМ) и играет важную роль во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, миграцию клеток, гемостаз,тромбоз, заживление ран, дифференцировку тканей и онкогенную трансформацию. Различные изоформы фибронектина вырабатываются в результате альтернативного сплайсинга трех областей (ED-A, ED-В, IIICS) пре-мРНК первичного транскрипта фибронектина процесса, который модулируется цитокинами и внеклеточным рН (Balza, 1988; Carnemolla, 1989; Borsi, 1990; Borsi, 1995). Фибронектин содержит два глобулярных экстрадомена III-типа, ED-A и ED-B, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу (ffrench-Constant, 1995, Hynes, 1990, Kaspar et al. 2006). Домены EDA фибронектина мыши и человека на 96,7% идентичны (между двумя аминокислотными последовательностями, состоящими из 90 аминокислот, отличие состоит только в 3 аминокислотах, см. фиг. 5). Экспрессия ED-A фибронектина была обнаружена в опухолевых клетках и в солидных опухолях на уровне мРНК (см., например, Jacobs et al. 2002, Matsumoto et al. 1999, Oyama et al. 1989, Tavian et al. 1994), на уровне изолированного белка (Borsi et al. 1987) и на иммуногистохимическом уровне (Borsi etal. 1998, Heikmheimo et al. 1991, Koukoulis et al. 1993, Koukoulis et al. 1995, Lohi et al. 1995, Scarpino et al. 1999). Кроме того, как было опубликовано Borsi et al. 1998, Exp Cell Res, 240, 244-251, ED-A присутствует в новообразованной кровеносной сети первичных опухолей. Однако никаких указаний на то, что ED-А ассоциирован с новообразованными сосудами опухолевых метастазов, прежде опубликовано не было. В настоящем документе авторами изобретения показано, что ED-A фибронектина селективно экспрессируется на новообразованных сосудах опухолевых метастазов. Поскольку опухолевые кровеносные сосуды легкодоступны для вводимых внутривенно терапевтических средств (Neri and Bicknell, 2005, Rybak et al. 2006, Thorpe, 2004, Trachsel and Neri, 2006), связывающие молекулы, такие как молекулы антител, которые связываются с A-FN и/или ED-A фибронектина, представляют собой новые средства, которые могут быть использованы для получения лекарственного средства для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухолей. Терапия новообразованных сосудов опухоли (нацеливание на сосуды опухоли) является многообещающим подходом для лечения опухолевых метастазов. Под нацеливанием на сосуды опухоли подразумевается разрушение сосудов внутри самой опухоли, с уменьшением притока крови, чтобы ограничить приток кислорода и питательных веществ в опухоль, вызывая гибель опухолевых клеток. В настоящем изобретении описаны анти-ED-А-антитела, которые селективно распознают вновь образованные кровеносные сосуды опухолевых метастазов. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с изоформой экстрадомена A (ED-A) фибронектина (AFN), для получения лекарственного средства для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухолей. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с ED-A фибронектина, для получения лекарственного средства для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухолей. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению связывающего элемента,например молекулы антитела, который связывается с изоформой ED-A фибронектина, для доставки к новообразованной сосудистой сети опухолевых метастазов молекулы, конъюгированной со связываю-1 018985 щим элементом. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с ED-A фибронектина, для доставки к новообразованной сосудистой сети опухолевых метастазов молекулы, конъюгированной со связывающим элементом. В следующем аспекте связывающий элемент может быть использован для производства лекарственного средства для доставки такой молекулы. Еще в одном аспекте изобретение относится к применению связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с изоформой ED-A фибронектина, для производства диагностического продукта для применения в диагностике опухолевых метастазов. Еще в одном следующем аспекте изобретение относится к применению связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с ED-A фибронектина, для производства диагностического продукта для применения в диагностике опухолевых метастазов. Настоящее изобретение в одном аспекте относится к способу обнаружения или диагностирования опухолевых метастазов у человека или животного, включающему стадии:(a) введения человеку или животному связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с изоформой ED-A фибронектина, и(b) определения наличия или отсутствия связывающего элемента на участке, отдаленном от области, в настоящее время или прежде занятой первичной опухолью в организме человека или животного; где локализация связывающего элемента на участке, отдаленном от области, в настоящее время или прежде занятой первичной опухолью в организме человека или животного, является указанием на наличие опухолевых метастазов. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения или диагностирования опухолевых метастазов у человека или животного, включающему стадии:(a) введения человеку или животному связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с ED-A фибронектина, и(b) определения наличия или отсутствия связывающего элемента на участке, отдаленном от области, в настоящее время или прежде занятой первичной опухолью в организме человека или животного; где локализация связывающего элемента на участке, отдаленном от области, в настоящее время или прежде занятой первичной опухолью в организме человека или животного, является указанием на наличие опухолевых метастазов. В одном аспекте настоящее изобретение относится также к способу лечения опухолевых метастазов у индивидуума, включающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например молекулу антитела, который связывается с изоформой ED-A фибронектина. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения опухолевых метастазов у индивидуума, включающему введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например молекулу антитела, который связывается с ED-A фибронектина. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу доставки молекулы в область вновь образованных сосудов опухолевых метастазов у человека или животного, предусматривающему введение указанному человеку или животному связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с изоформой ED-A фибронектина, где связывающий элемент конъюгирован с молекулой. В следующем аспекте изобретение относится к способу доставки молекулы в область вновь образованных сосудов опухолевых метастазов у человека или животного, предусматривающему введение указанному человеку или животному связывающего элемента, например молекулы антитела, который связывается с ED-A фибронектина, где связывающий элемент конъюгирован с молекулой. Связывающим элементом согласно изобретению может быть антитело, которое связывается с изоформой ED-A фибронектина и/или с ED-A фибронектина, включающее одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) антитела H1, B2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9 или их вариантов. Предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению представлял собой антитело, которое связывается с изоформой ED-А фибронектина и/или с ED-A фибронектина, включающее одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) антитела В 2, С 5, D5, С 8, F8, В 7 илиG9 или их вариантов. Наиболее предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению представлял собой антитело, которое связывается с изоформой ED-А фибронектина и/или с ED-A фибронектина, включающее одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) антитела F8 или их вариантов. Связывающий элемент согласно изобретению может включать набор областей Н- и/или L-CDR антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9, или набор областей Н- и/или L-CDR антитела H1,В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9 с десятью или менее, например одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью, аминокислотными заменами внутри раскрытого в настоящем изобретении набора областей Н- и/или L-CDR. Предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению содержал набор областей Н- и/или L-CDR антитела В 2, С 5, D5, С 8, F8, В 7 или G9 с десятью или менее, например одной,двумя, тремя, четырьмя или пятью, аминокислотными заменами внутри раскрытого в настоящем изобретении набора областей Н- и/или L-CDR. Предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изо-2 018985 бретению содержал набор областей Н- и/или L-CDR антитела F8 с десятью или менее, например одной,двумя, тремя, четырьмя или пятью, аминокислотными заменами внутри раскрытого в настоящем изобретении набора областей Н- и/или L-CDR. Потенциально могут быть произведены замены любого остатка внутри набора областей CDR, и они могут быть произведены внутри областей CDR1, CDR2 и/или CDR3. Например, как в настоящем изобретении описано, связывающий элемент согласно изобретению может включать одну или более областей CDR, например CDR3, и, необязательно, также и CDR1, иCDR2, образуя набор областей CDR. Связывающий элемент согласно изобретению может включать молекулу антитела, например молекулу человеческого антитела. Связывающий элемент обычно содержит VH- и/или VL-домен антитела.VH-домены связывающих элементов также включены в данное описание как часть настоящего изобретения. Внутри каждого из VH- и VL-доменов содержатся определяющие комплементарность области,("CDR") и каркасные области ("FR"). VH-домен содержит набор HCDR, а VL-домен содержит наборLCDR. Молекула антитела может включать VH-домен антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 VHобласти и каркасную область. Альтернативно или помимо этого, она может включать VL-домен антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области и каркасную область. В настоящем изобретении описаны VH- и VL-домены и CDR-области антител H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9. Все описанные в настоящем изобретении VH- и VL-последовательности, последовательности CDR, наборы CDR и наборы HCDR и наборы LCDR представляют собой аспекты и воплощения связывающего элемента для применения в настоящем изобретении. Как описано в настоящем документе, "набор CDR" включаетCDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, набор CDR относится к HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а набор LCDR относится к LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если не указано иное, "набор CDR" включает области HCDR иLCDR. Связывающий элемент согласно изобретению может содержать VH-домен антитела, включающий определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и каркасную область, где HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, и где необязательно HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4 и/или HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5. Предпочтительно,чтобы HCDR1 представлял собой SEQ ID NO: 23, 33, 43, 53, 73, 83 или 103. Более предпочтительно, чтобы HCDR1 представлял собой SEQ ID NO: 83. Обычно VH-домен спарен с VL-доменом, образуя антигенсвязывающий участок антитела, хотя, как будет обсуждаться ниже, VH- или VL-домен может быть использован отдельно для связывания антитела. Таким образом, связывающий элемент согласно изобретению может дополнительно включать VL-домен антитела, включающий определяющие комплементарность области LCDP1, LCDR2 и LCDP3 и каркасную область, где LCDP1 представляет собой SEQ ID NO: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116 и где необязательно LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 7 и/или LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 8. Предпочтительно, когда LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 26, 36, 46, 56, 76, 86 или 106. Наиболее предпочтительно, когда LCDP1 представляет собой SEQ ID NO: 86. В одном из аспектов связывающий элемент согласно изобретению представляет собой изолированную молекулу антитела против ED-A-домена фибронектина, включающую VH-домен и VL-домен, гдеVH-домен содержит каркасную область и набор определяющих комплементарность областей HCDR1,HCDR2 и HCDR3, и где VL-домен содержит определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 и каркасную область, и гдеHCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113,HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116;LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Одна или более из областей CDR или набор областей CDR антитела могут быть привиты на каркасную область (например, каркасную область человека) с получением молекулы антитела для применения в данном изобретении. Каркасные области могут содержать последовательности генных сегментов человеческой зародышевой линии. Таким образом, каркасную область можно сделать приближенной к зародышевой линии, когда один или более остатков внутри каркасной области изменяют таким образом, чтобы они соответствовали остаткам в эквивалентном положении в наиболее схожей каркасной области человеческой зародышевой линии. Связывающий элемент согласно изобретению может быть изолированной молекулой антитела, имеющего VH-домен, содержащий набор HCDR-областей в каркасной области человеческой зародышевой линии, например, DP47. Обычно связывающий элемент имеет также VLдомен, содержащий набор LCDR-областей, например, в каркасной области человеческой зародышевой линии. Каркасной областью человеческой зародышевой линии VL-домена может быть DPK22.VH-домен согласно изобретению может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,-3 018985 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 или 111. Предпочтительно, чтобы VH-домен согласно изобретению имел аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, 31, 41, 51, 71, 81 или 101. Наиболее предпочтительно, чтобы VH-домен согласно изобретению имел аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81. VL-домен согласно изобретению может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 или 112. Предпочтительно, чтобы VL-домен согласно изобретению имел аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, 32, 42, 52, 72, 82 или 102. Наиболее предпочтительно, чтобы VL-домен согласно изобретению имел аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82. Связывающий элемент согласно изобретению может быть одноцепочечным Fv (scFv), содержащимVH-домен и VL-домен, соединенные пептидным линкером. Специалисты могут выбрать соответствующую длину и последовательность линкера, например линкер длиной по меньшей мере от 5 или 10 аминокислот до 15, 20 или 25 аминокислот. scFv может состоять из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO: 9 или содержать эту последовательность. Связывающий элемент согласно изобретению может представлять собой димерное антитело(WO 94/13804; Holliger, 1993 а), которое является молекулой, содержащей первый полипептид с VHдоменом и VL-доменом, соединенными пептидным линкером, и второй полипептид с VH-доменом и VLдоменом, соединенными пептидным линкером, где VH-домен и VL-домен первого полипептида спарен соответственно с VL-доменом и VH-доменом второго полипептида. Первый и второй полипептиды могут быть одинаковыми (когда спаривание приводит к образованию бивалентной молекулы) или разными(когда спаривание приводит к образованию биспецифической молекулы). Специалисты могут выбрать соответствующую длину и последовательность линкера, например, линкер длиной в 5 или менее аминокислот. Линкер может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Связывающий элемент согласно изобретению может содержать антигенсвязывающий участок внутри молекулы, не являющейся антителом, обычно представленный одним или более CDR, например набором CDR в каркасном белке, не являющемся антителом. Связывающие элементы, включая антительные и неантительные молекулы, более подробно описаны далее. Связывающий элемент согласно изобретению может быть конъюгирован с молекулой, которая обладает биоцидной или цитотоксической активностью. Альтернативно, связывающий элемент согласно изобретению может быть конъюгирован с радиоизотопом. В качестве дополнительной альтернативы,связывающий элемент согласно изобретению может быть помечен детектируемой меткой. Эти и другие аспекты настоящего изобретения более подробно описаны ниже. Краткое описание чертежей Фиг. 1 А: приведено схематическое представление перфузии на основе методов протеомики, используемых для сравнительных анализов доступных белков в печени, полученной из организма здоровых мышей, и в печеночных метастазах F9, полученных из организма мышей. В: показаны обширные метастатические очаги, развившиеся в печени в результате метастазирования опухоли F9. С: показано селективное и эффективное окрашивание кровеносных сосудов печеночных метастазов F9 (Метастаз), а также сильное окрашивание кровеносных сосудов и включение метки некоторыми синусоидными капиллярами нормальной печени (Печень). Окрашивание соответствует более темным линиям, и оно получено после того, как мышей-опухоленосителей перфузировали 15 мл 1,8 мМ раствора сульфосукцинимидил-6-[биотин-амидо]гексаноата (1 мг/мл) в PBS, рН 7,4, обогащенного 10% декстраном-40 в качестве вещества, увеличивающего объем плазмы крови при терминальной анестезии, с последующим гистохимическим окрашиванием конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой. Фиг. 2 А: на основе структуры фибронектиновых доменов показана локализация пептидов фибронектина, идентифицированных методами протеомики при анализе нормальной печени мышей (Норма) и печеночных метастазов F9 у мышей (Опухоль). В: пептиды, идентифицированные методами протеомики при анализе нормальной печени мышей и печеночных метастазов F9 у мышей, подвергали экспериментам с использованием LC-MS/MS. Сначала пептиды разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, а затем элюировали, с получением 192 фракций. Аликвоту из каждой фракции наносили в виде отдельного пятна на планшет MALDI для автоматической идентификации мишеней, и для каждой фракции получали MALDI TOF MS-спектр. Показаны масс-спектры двух разных конкретных фракций ВЭЖХ (верхний ряд и средний ряд соответственно) для трех параллельных проб мышиных печеночных метастазов F9 (см. панель, обозначенную как "печеночные метастазы") и трех параллельных проб печени нормальных мышей (см. панель, обозначенную как "нормальная печень"). Высоты ионных пиков нормализованы по внутреннему стандарту (см. раздел "Материалы и методы"), и это, таким образом, позволяет провести полуколичественное сравнение соответствующих пептидов в различных пробах. В верхнем ряду пик, на который указывает стрелка (обозначен "FU" в первой представленной пробе), соответствует пептиду FLTTTPNSLLVSWQAPR (SEQ ID NO: 15), который происходит из константной области фибронектина (фибронектиновый домен 16 типа III). Ионный пик этого пептида выше в пробах печеночных метастазов F9 у мышей (Печеночные метастазы), но он присутствует также и в образцах нормальной пчени (Нормальная печень), указывая на то, что молекула фибронектина, в принципе, присутствует у мышей как в печеночных метастазах F9, так и в нормальной печени мышей, но в образцах печеночных метастазов F9 мышей она представлена в большем количестве. В среднем ряду пик, указанный правой стрелкой (обозначенный "EDA"), соответствует пептиду IAWESPQGQVSR (SEQ ID NO: 16), который происходит из фибронектинового экстрадомена А, образованного в результате альтернативного сплайсинга. Этот ED-A-пептид является единственным детектируемым пептидом в образцах печеночных метастазов F9 у мышей (Печеночные метастазы) и отсутствует в образцах нормальной печени (Нормальная печень). Ссылочный пептид, указанный левой стрелкой (обозначен "ref"), был использован для идентификации фракции ВЭЖХ, в которую был элюирован пептид ED-А. Это означает, что наличие пика ссылочного пептида в спектрах, приведенных для образцов нормальной печени мышей (Нормальная печень), является доказательством того, что масс-спектры фракций, в которых пептид ED-A мог бы детектироваться, если бы он присутствовал в образцах нормальной печени мышей, представлены. Стрелка внизу указывает в масс-спектре на положение, в котором должен проявляться ионный пик пептида ED-A(указано стрелкой), демонстрируя отсутствие этого пептида в образцах нормальной печени. Фиг. 3 А: иммуногистохимическое окрашивание (более темные линии) печеночных метастазов F9 и прилежащей ткани нормальной мышиной печени flag-меченным родительским анти-ED-А-антителом(анти-ED-A) позволило выявить четкий рисунок (паттерн) окрашивания сосудов в метастазах, в то время как никакого специфического окрашивания в прилежащей ткани нормальной печени обнаружено не было. В отрицательном контроле (Контроль) flag-меченное родительское анти-ED-А-антитело не выявлялось. Рисунок окрашивания, наблюдаемый при использовании flag-меченного родительского анти-ED-Аантитела, подобен рисунку окрашивания, наблюдаемому в случае flag-меченного анти-ED-B scFv(L19) антитела (анти-EDB), которое распознает экстра-В-домен фибронектина, который является хорошо установленным маркером структур вновь образованных сосудов. В: Показаны органы (селезенка, сердце,легкое и часть печени, содержащая два метастаза) мышей Sv190, которым инъецировали опухолевые клетки F9DR, а еще через три недели дополнительно вводили в хвостовую вену (200 мкл/мышь, т.е. 60 мкг антитела/мышь) Alexa 750-меченное родительское анти-ED-А-антитело (в конечной концентрации 0,3 мг/мл). Мышиные органы извлекали через шесть часов после инъекции Alexa 750-меченного родительского анти-ED-А-антитела. Окрашивание Alexa 750-меченного родительского анти-ED-Aантитела визуализировали с помощью самодельного инфракрасного флуоресцентного устройства для визуализации изображения (Birchler et al. 1999), снабженного вольфрамовой галогеновой лампой, фильтрами поглощения и испускания, специфичными для Alexa 750, и монохроматической CCD-камерой. Фиг. 4: показана экспрессия ED-A в человеческих метастазах. Для иммуногистохимической оценки экспрессии ED-A в человеческих метастазах использовали flag-меченное родительское анти-ED-Aантитело. В то время как не наблюдалось никакого положительного окрашивания в отрицательных контрольных пробах (Контроль), в которых отсутствовал пик, соответсвующий flag-меченному родительскому анти-ED-А-антителу, и лишь очень слабое фоновое окрашивание flag-меченным родительским анти-ED-А-антителом наблюдалось на срезах нормальной ткани легкого человека (Нормальная ткань легких), легочные метастазы (Человеческие легочные метастазы RCC [почечноклеточная карцинома]) строго положительно окрашивались flag-меченным родительским анти-ED-А-антителом (анти-EDA), как показано более темными линиями и тенями. Рисунок (паттерн) окрашивания flag-меченным родительским анти-ED-А-антителом носил в основном сосудистый характер и напоминал рисунок окрашивания,наблюдаемый в случае flag-меченного анти-ED-B scFv(L19) антитела (анти-EDB), которое распознает экстра-В-домен фибронектина, являющийся хорошо установленным маркером структур вновь образованных сосудов. Аналогичные результаты были получены при иммуногистохимическом анализе человеческих печеночных метастазов колоректальной карциномы (Человеческие печеночные метастазы CRC) с использованием flag-меченного родительского анти-ED-А-антитела. Flag-меченное родительское антиED-А-антитело позволило выявить строго сосудистый и стромальный характер окрашивания человеческих печеночных метастазов колоректальной карциномы. Фиг. 5: показано выравнивание человеческого ED-A (верхняя последовательность) и мышиного EDA (нижняя последовательность). Звездочками указаны аминокислотные положения, в которых аминокислоты человеческого и мышиного ED-A идентичны. Фиг. 6 А: приведена нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (VH) анти-ED-А-антитела H1(SEQ ID NO: 12). Нуклеотидная последовательность CDR1 тяжелой цепи анти-ED-А-антитела H1 подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR2 тяжелой цепи анти-ED-А-антитела H1 выделена курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR3 тяжелой цепи анти-ED-А-антитела H1 выделена жирным шрифтом и подчеркнута. В: Приведена нуклеотидная последовательность линкерной последовательности (SEQ ID NO: 14) анти-ED-А-антитела H1. С: Приведена нуклеотидная последовательность легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 13) анти-ED-А-антитела H1. Нуклеотидная последовательностьCDR3 легкой цепи анти-ED-А-антитела H1 выделена жирным шрифтом и подчеркнута. Фиг. 7 А: приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи (VH) анти-ED-А-антитела анти-ED-А-антитела H1 выделена курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 5) анти-ED-А-антитела H1 выделена жирным шрифтом и подчеркнута. В: Приведена аминокислотная последовательность линкерной последовательности (SEQ ID NO: 11) антиED-А-антитела Н 1. С: Приведена аминокислотная последовательность легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 2) анти-ED-А-антитела H1. Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 6) антиED-А-антитела H1 подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 7) анти-ED-А-антитела H1 выделена курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 8) анти-ED-А-антитела H1 выделена жирным шрифтом и подчеркнута. Фиг. 8: показано биораспределение димерного антитела F8 у мышей-носителей опухоли F9. Четырех мышей-носителей опухоли внутривенно инъецировали I125-меченным димерным антителом F8. Через 24 ч мышей умерщвляли и извлекали опухоль, печень, легкое, селезенку, сердце, почку, кишечник, хвост и кровь. Затем определяли радиоактивный счет в изъятых опухоли, печени, легком, селезенке, сердце,почке, кишечнике, хвосте и крови. На фиг. 8 показан процент (%) инъецированной дозы (ID) I125 меченного димерного антитела, детектируемый на 1 г опухоли, печени, легкого, селезенки, сердца, почки, кишечника, хвоста и крови. Опухоли F9 (опухоли) содержали приблизительно в четыре раза большеID, чем любая из остальных подвергнутых анализу мышиных тканей. Терминология Фибронектин. Фибронектин является антигеном, подвергаемым альтернативному сплайсингу, и, как описано в настоящем изобретении, известен целый ряд альтернативных изоформ фибронектина. Экстрадомен A(EDA, или ED-A) известен также как ED, экстраповтор А типа III (EIIIA), или EDI. Последовательность человеческого ED-A была опубликована Kornblihtt et al. (1984), Nucleic AcidsRes. 12, 5853-5868 и Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. Последовательность человеческого ED-A можно найти также в базе данных SwissProt как аминокислоты 1631-1720 (фибронектиновый домен 12 типа III; экстрадомен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под регистрационным номером Р 02751. Последовательность мышиного ED-A можно найти в базе данных SwissProt как аминокислоты 1721-1810 (фибронектиновый домен 13 типа III; экстрадомен Z) аминокислотной последовательности, депонированной под регистрационным номером Р 11276. Изоформа ED-A фибронектина (A-FN) содержит экстрадомен-А (ED-A). Последовательность человеческого A-FN может быть дедуктивно выведена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина человека, которую можно найти в базе данных SwissProt под регистрационным номером Р 02751. Последовательность мышиного A-FN может быть дедуктивно выведена из соответствующей последовательности предшественника мышиного фибронектина, которую можно найти в базе данных SwissProt под регистрационным номером Р 11276. A-FN может быть изоформой ED-A человеческого фибронектина. ED-A может быть экстрадоменом-А человеческого фибронектина.ED-A является последовательностью, содержащей 90 аминокислот, которая встроена в фибронектин (FN) путем альтернативного сплайсинга и локализована между 11 и 12 доменами FN (Borsi et al. 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). ED-A в основном отсутствует в плазматической форме FN, но в изобилии представлена в процессе эмбриогенеза, моделирования тканей, при фиброзе, трансплантации сердца и росте солидных опухолей. Альтернативный сплайсинг. Альтернативный сплайсинг относится к появлению различных характеров сплайсинга первичного РНК-трансрипта ДНК для продуцирования различных мРНК. После исключения интронов путем селекции определяется то, какие экзоны будут подвергнуты сплайсингу друг с другом, образуя мРНК. Альтернативный сплайсинг приводит к образованию различных изоформ, содержащих разные экзоны и/или разное число экзонов. Например, одна изоформа может содержать дополнительную аминокислотную последовательность, соответствующую одному или более экзонам, которая может содержать один или более доменов. Связывающий элемент. Этим термином обозначается один элемент из пары молекул, которые связываются друг с другом. Компоненты связанной пары могут быть получены природным путем или же могут быть полностью или частично синтезированы. Один компонент из этой пары молекул имеет на своей поверхности область,или полость, которая связывается и, следовательно, комплементарна особой пространственной и полярной организации другого компонента из этой пары молекул. Примерами таких связанных пар являются антиген-антитело, биотин-авидин, гормон-рецептор гормона, рецептор-лиганд, фермент-субстрат. Настоящее изобретение относится к реакциям типа антиген-антитело. Связывающий элемент обычно содержит молекулу, имеющую антигенсвязывающий участок. Например, связывающий элемент может быть молекулой антитела или не являющимся антителом белком,который имеет антигенсвязывающий участок. Антигенсвязывающий участок может быть получен в результате аранжировки определяющих комплементарность областей (CDR) на каркасных структурах не являющегося антителом белка, такого как фибронектин или цитохром В и пр. (HaanMaggos, 2004; Koide, 1998; Nygren, 1997), или путем рандо-6 018985 мизации или мутации аминокислотных остатков петли внутри белкового каркаса для придания специфичности связывания с требуемой мишенью. Каркасные структуры для инженерии новых связывающих участков в белках подробно описаны Nygren et al. (1997). Каркасные структуры белков для имитации антител описаны в публикации WO 0034784, которая во всей полноте включена в настоящее описание в виде ссылки и в которой авторы этого изобретения описывают белки (имитаторы антител), которые включают фибронектиновый домен типа III, имеющий по меньшей мере одну рандомизированную петлю. Подходящую каркасную структуру, в которую можно встроить одну или более областей CDR, например набор HCDP, можно обеспечить любым доменным элементом суперсемейства иммуноглобулиновых генов. Каркасной структурой может служить человеческий или не-человеческий белок. Преимуществом каркасной структуры неиммуноглобулинового белка является то, что она может обеспечить антигенсвязывающий участок в каркасной структуре молекулы, которая меньше и/или которую произвести легче, чем по меньшей мере некоторые молекулы антител. Малый размер связывающего элемента может привнести полезные физиологические свойства, такие как способность проникать в клетки, глубоко проникать в ткани или достигать мишеней внутри других структур, или связываться внутри находящихся в белковой структуре полостей антигена-мишени. Применение антигенсвязывающих участков в каркасных структурах белков, не являющихся антителом, рассмотрено в обзоре Wess, 2004. Типичными являются белки, имеющие стабильный остов и одну или более вариабельных петель, в которых аминокислотная последовательность петли или петель претерпела специфические или случайные мутации для создания антигенсвязывающего участка, который связывается с антигеном-мишенью. Такие белки включают IgG-связывающие домены белка А из S. aureus, трансферрина, тетранектина, фибронектина (например, 10-го домена фибронектина типа III) и липокалинов. Другие подходы включают "Микротельца"(Selecore GmbH), которые основаны на циклотидах - малых белках, имеющих внутримолекулярные дисульфидные связи. Помимо последовательностей антител и/или антигенсвязывающего участка, связывающий элемент согласно изобретению может включать другие аминокислоты, например, образующие пептид или полипептид, такой как складчатый домен, или придающие молекуле другие функциональные характеристики,помимо способности связываться с антигеном. Связывающие элементы согласно изобретению могут быть снабжены детектируемой меткой или могут быть конъюгированы с токсином или нацеливающим фрагментом или ферментом (например, через пептидиловую связь или линкер). Например, связывающий элемент может включать каталитический участок (например, в ферментативном домене), а также антигенсвязывающий участок, где антигенсвязывающий участок связывается с антигеном и, таким образом,нацеливает, или направляет, каталитический центр на этот антиген. Каталитический центр может ингибировать биологическую функцию антигена, например, путем расщепления. Несмотря на то что, как было указано, участки CDR могут быть перенесены на не-антительные каркасные структуры, тем не менее структуры, несущие CDR или набор CDR согласно изобретению, обычно представляют собой последовательность тяжелой или легкой цепи или ее существенной части, в которой локализованы области CDR или набор CDR-областей, на участке, соответствующем CDR или наборуCDR природных вариабельных VH- и VL-доменов антитела, кодируемого иммуноглобулиновыми генами, претерпевшими реаранжировку. Структуры и места локализации иммуноглобулиновых вариабельных доменов могут быть определены согласно Kabat, 1987, с обновлениями этой ссылки, которые в настоящее время доступны в Интернете (по адресу immuno.bme.nwu.edu или по ключевому слову "Kabat" в любой поисковой системе). Под областью CDR или CDR подразумеваются гипервариабельные области тяжелой или легкой цепей иммуноглобулина, как определено у Kabat et al. (1987), (Kabat, 1991a, а также более поздние издания). Обычно антитело содержит 3 области CDR тяжелой цепи и 3 области CDR легкой цепи. Термин область CDR или области CDR используется в настоящем изобретении для указания, в зависимости от конкретного случая, на одну, несколько или даже на все из этих областей, которые содержат основную часть аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела с антигеном или с эпитопом, которые оно распознает. Среди шести коротких последовательностей CDR третья областьCDR тяжелой цепи (HCDR3) имеет больший уровень вариабельности (большую степень разнообразия, в основном за счет механизмов арранжировки генов, которые тому способствуют). Она может иметь в длину всего 2 аминокислоты, при этом наибольшая из известных длин этой области составляет 26. Функционально HCDR3 отчасти играет роль в определении специфичности антитела (Segal, 1974; Amit,1986; Chothia, 1987; Chothia, 1989; Caton, 1990; Sharon, 1990a; Sharon, 1990b; Kabat et al. 1991b). Молекула антитела. Это относится к иммуноглобулину, полученному природным путем или продуцируемому частично или полностью синтетическим путем. Этот термин охватывает также любой полипептид или белок, содержащий антигенсвязывающий участок антитела. В настоящем изобретении следует иметь в виду, что настоящее изобретение не относится к антителам в природной форме, т.е. подразумевается, что они не находятся в своем природном окружении, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, или же они могут быть получены путем генетической рекомбинации или путем химического синтеза, и что поэтому они, как будет описано далее, могут содержать неприродные аминокислоты. Фрагменты антитела, которые содержат антигенсвязывающий участок антитела, включают, не ограничиваясь перечисленным, такие молекулы антитела как Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb,Fd; и димерные антитела. Можно взять моноклональные и другие антитела и использовать технологию рекомбинантных ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые связываются с антигеном-мишенью. Такие технологии могут включать введение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина,или область CDR антитела, в константные области или в константные области плюс каркасные области,другого иммуноглобулина. См., например, ЕР-А-184187, GB 2188638A или ЕР-А-239400 и обширный список литературы, связанной с этими ссылками. Гибридома или другая клетка, продуцирующая антитело, может быть подвергнута генетической мутации или другим изменениям, которые могут изменить, а могут и не изменять специфичность связывания продуцируемых антител. Поскольку антитела могут быть модифицированы целым рядом различных путей, термин "молекула антитела" должен быть истолкован как охватывающий любой связывающий элемент или вещество,имеющее антигенсвязывающий участок антитела с требуемой специфичностью и/или связыванием с антигеном. Таким образом, этот термин распространяется на фрагменты антитела и его производные,включая любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий участок антитела, будь он природным или же полностью или частично синтезированным. Следовательно, в это понятие включены также химерные молекулы, содержащие антигенсвязывающий участок антитела или его эквивалент, слитый с другим полипептидом (например, полученным из организма другого вида или принадлежащим другому классу или подклассу антител). Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023, а также в обширном списке литературы, связанной с этими ссылками. Новые технологии, известные в области инженерии антител, позволяют изолировать человеческие и гуманизированные антитела. Например, человеческие гибридомы могут быть получены, как описаноKontermannDubel (2001). Фаговый дисплей, другая установившаяся технология для получения связывающих элементов, подробно описана во многих публикациях, таких как WO 92/01047 (дополнительно обсуждается ниже) и патентах США US 5969108, US 5565332, US 5733743, US 5858657, US 5871907,US 5872215, US 5885793, US 5962255, US 6140471, US 6172197, US 6225447, US 6291650, US 6492160,US 6521404, а также KontermannDubel (2001). Трансгенные мыши, у которых гены мышиного антитела инактивированы и функционально заменены генами человеческого антитела, а остальные компоненты иммунной системы остались при этом интактными, могут быть использованы для выделения человеческих антител (Mendez, 1997). Синтетические молекулы антител могут быть созданы путем экспрессии из генов, полученных на основе олигонуклеотидов, синтезированных и скомпонованных внутри соответствующих экспрессирующих векторов, например, как описано Knappik et al. (2000) или Krebs et al. (2001). Показано, что фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (i) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1;(ii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одноцепочечного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward, 1989; McCafferty, 1990; Holt, 2003), который состоит из VH- или VL-домена; (v) изолированные области CDR; (vi) F(ab')2-фрагменты, бивалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента; (vii) одноцепочечные Fv-молекулы (scFv), в которыхVH-домен и VL-домен связаны пептидным линкером, который позволяет двум доменам ассоциировать друг с другом, с образованием антигенсвязывающего участка (Bird, 1988; Huston, 1988); (viii) биспецифические одноцепочечные Fv-димеры (PCT/US92/09965) и (ix) "димерные антитела", мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, полученные путем слияния генов (WO 94/13804; Holliger, 1993a). Молекулы Fv, scFv или димерных антител могут быть стабилизированы путем встраивания дисульфидных мостиков, связывающих VH- и VL-домены (Peiter, 1996). Могут быть получены также минитела,содержащие scFv, соединенный с СН 3-доменом (Hu, 1996). Другими примерами связывающих фрагментов являются Fab', который отличается от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце CH1-домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной части антитела, иFab'-SH, который представляет собой Fab'-фрагмент, в котором цистеиновый остаток (остатки) константного домена несет свободную тиоловую группу. Фрагменты антитела согласно изобретению могут быть получены, начиная с любой из описанных в настоящем изобретении молекул антитела, например молекул антитела, содержащих VH-и/или VLдомены или области CDR любого из описанных в настоящем изобретении антител, такими методами как переваривание ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных мостиков путем химического восстановления. Иным способом фрагменты антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием технологии генетической рекомбинации, также хорошо известной специалистам в данной области, или еще путем пептидного синтеза, например, с использованием автоматических пептидных синтезаторов, таких как поставляемые компанией Applied Biosystems, и т.д., или путем синтеза и экспрессии нуклеиновой кислоты. Функциональные фрагменты антитела согласно изобретению включают любой функциональный фрагмент, время полужизни которого увеличено в результате химической модификации, в частности,-8 018985 путем ПЭГилирования или путем встраивания в липосому.dAb (домен антитела) представляет собой малый мономерный антигенсвязывающий фрагмент антитела, а именно вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела (Holt, 2003). VH-dAbфрагменты природным путем возникают у камелидов (например, верблюд, лама) и могут быть получены у камелида путем иммунизации антигеном-мишенью, выделения антиген-специфических В-клеток и прямого клонированием dAb-генов из индивидуальных В-клеток. dAb-домены можно получить также в клеточной культуре. Их малый размер, хорошая растворимость и теплостабильность делает их физиологически чрезвычайно эффективными и подходящими для селекции и созревания аффинности. Связывающим элементом согласно изобретению может быть dAb, содержащий VH- или VL-домен, по существу, такой, как в настоящем изобретении описано, или VH- или VL-домен, содержащий набор CDR, по существу, такой, как в настоящем изобретении описано. В настоящем изобретении фраза "по существу, такой, как описано", относится к характеристике(ам) соответствующих областей CDR VH- или VL-домена описанных в настоящем изобретении связывающих элементов, которые либо идентичны, либо очень схожи со строго определенными областями, последовательность которых в настоящем изобретении описана. Под фразой "очень схожи" в отношении строго определенной области (областей) одного или более вариабельных доменов в настоящем изобретении подразумевается, что от 1 приблизительно до 5, например от 1 до 4, включая 1-3, или 1, или 2, или 3, или 4 аминокислотных замены может быть произведено в области CDR и/или в VH- или VL-домене. Биспецифические или бифункциональные антитела образуют второе поколение моноклональных антител, в которых две различных вариабельные области скомбинированы в составе одной и той же молекулы (Holliger, 1999). Их применение продемонстрировано как в диагностической области, так и в терапии, от их способности выполнять новые эффекторные функции до нацеливания на несколько молекул на поверхности опухолевых клеток. Где бы ни использовались биспецифические антитела, они могут быть серийными биспецифическими антителами, которые можно производить различными путями (Holliger, 1993b), например, получать химическим путем или из гибридом, или же они могут быть любыми из описанных в настоящем изобретении биспецифических фрагментов антитела. Эти антитела могут быть получены химическими методами (Glennie, 1987; Repp, 1995) или соматическими методами (Staerz, 1986;Suresh, 1986), но подобными технологиям генной инженерии, которые позволяют производить гетеродимеризацию и, таким образом, облегчают процесс очистки искомого антитела (Merchand, 1998). Примеры биспецифических антител включают такие антитела согласно технологии BiTE, в которых могут быть использованы связывающие домены двух антител с различной специфичностью, напрямую связанные короткими гибкими пептидами. Это позволяет комбинировать два антитела на короткой одинарной полипептидной цепи. Димерного антитела и scFv могут быть сконструированы без Fc-области, только с использованием вариабельных доменов, что потенциально снижает эффекты анти-идиотипической реакции. Биспецифические антитела могут быть сконструированы в виде полноразмерного IgG, в виде биспецифического Fab'2, в виде Fab'-ПЭГ, в виде димерных антител или еще в виде биспецифического scFv. Кроме того, два специфических антитела могут быть связаны с помощью рутинных методов, известных в данной области, с образованием тетравалентных антител. Биспецифические димерные антитела в отличие от биспецифических полноразмерных антител также могут представлять особую ценность, поскольку их легко можно сконструировать и экспрессировать в E.coli. Димерные антитела (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с соответствующей специфичностью связывания легко можно подвергнуть селекции с использованием фагового дисплея из библиотек (WO 94/13804). Если одно плечо димерного антитела надо поддерживать в неизменном состоянии, например, со специфичностью против антигена-мишени, тогда можно создать библиотеку, в которой другое плечо варьирует, и отобрать антитело с соответствующей специфичностью. Биспецифические полноразмерные антитела могут быть получены с использованием методов альтернативной инженерии, как описано у Ridgeway, 1996. В данной области существуют различные способы получения антител против антигена-мишени. Антитела могут быть моноклональными антителами, в частности, человеческой, мышиной, химерной или гуманизированной природы, которые могут быть получены в соответствии со стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области. Обычно для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиной природы, можно воспользоваться технологией, которая описана, в частности, в руководстве"Antibodies" (Harlow and Lane, 1988), или технологией их получения из гибридом, описанной Kohler иMilstem, 1975. Моноклональные антитела могут быть получены, например, из клеток животных, иммунизированных A-FN или одним из его фрагментов, содержащих эпитоп, распознаваемый указанными моноклональными антителами, например, фрагментом, содержащим или состоящим из ED-A, или пептидным фрагментом ED-A. A-FN или один из его фрагментов может быть получен, в частности, в соответствии с обычно используемыми методами, путем генетической рекомбинации, начиная с последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности кДНК, кодирующей A-FN или его фрагмент,-9 018985 путем пептидного синтеза, начиная с аминокислотной последовательности, содержащейся в пептидной последовательности A-FN и/или его фрагмента. Моноклональные антитела могут быть очищены, например, на колонке для аффинной хроматографии, на которой ранее был иммобилизован A-FN или один из его фрагментов, содержащих эпитоп, распознаваемый указанными моноклональными антителами, например, фрагмент, содержащий ED-A или состоящий из него, или пептидный фрагмент ED-A. Моноклональные антитела могут быть очищены путем хроматографии на колонке с белком А и/или G, необязательно с последующей ионообменной хроматографией с целью удаления остаточных белковых примесей, а также примесей ДНК и ЛПС как таковых,необязательно с последующей эксклюзионной хроматографией на сефарозном геле с целью удаления потенциальных агрегатов за счет наличия димеров или других мультимеров. В совокупности эти технологии могут быть использованы одновременно или последовательно. Антигенсвязывающий участок. Это относится к части молекулы, которая связывается и комплементарна полному антигенумишени или его части. В молекуле антитела она называется антигенсвязывающим участком и включает часть антитела, которая связывается и комплементарна полному антигену-мишени или его части. Когда антиген большой, антитело может связываться только с особой частью антигена, которая называется эпитопом. Антигенсвязывающая часть антитела может быть обусловлена одним или более вариабельными доменами антитела. Антигенсвязывающая часть антитела может содержать вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела. Изолирование. Это относится к состоянию, в котором в соответствии с настоящим изобретением будут обычно находиться связывающие элементы согласно изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая такие связывающие элементы. Таким образом, связывающие элементы, VH- и/или VL-домены согласно изобретению могут быть представлены в изолированной и/или очищенной, например, от их природного окружения, по существу чистой или гомогенной, формах, или, в случае нуклеиновой кислоты, в форме,свободной или по существу свободной от нуклеиновой кислоты или генов иной природы, нежели последовательность, кодирующая полипептид с требуемой функцией. Изолированные элементы и изолированная нуклеиновая кислота будут свободны или по существу свободны от материала, с которым они ассоциированы в природе, такого как другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми они обнаруживаются в их природном окружении, или в среде, в которой их получают (например, клеточная культура), когда такое получение представляет собой технологию рекомбинантных ДНК, практикуемуюin vitro или in vivo. Элементы и нуклеиновая кислота могут быть получены в составе с разбавителями или адъювантами, и для практических же целей их будут смешивать с желатином или другими носителями при использовании для покрытия микротитровальных планшетов для применения в иммуноанализе или смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями при использовании в диагностике или терапии. Связывающие элементы могут быть гликозилированы либо природным путем,либо в системе гетерологических эукариотических клеток (например, СНО или NSO (ЕСАСС 85110503,или же они могут быть негликозилированы (например, если они получены путем экспрессии в прокариотической клетке). Гетерогенные препараты, содержащие молекулы антитела, также составляют часть настоящего изобретения. Например, такими препаратами могут быть смеси антител с полноразмерными тяжелыми цепями и тяжелые цепи, лишенные С-концевого лизина, с различными уровнями гликозилирования и/или с дериватизированными аминокислотами, например, циклизация N-концевой глутаминовой кислоты с образованием остатка пироглутаминовой кислоты. Один или более связывающих элементов в отношении антигена, например, A-FN- или ED-Aфибронектина, могут быть получены путем приведения библиотеки связывающих элементов согласно изобретению в контакт с антигеном или его фрагментом, например фрагментом, содержащим или состоящим из ED-A или пептидного фрагмента ED-A, и селекции одного или более связывающих элементов библиотеки, способных связываться с антигеном. Библиотека антител может быть подвергнута скринингу методом ICFS. При ICFS бактерии, содержащие ДНК, кодирующую несколько специфичностей связывания, выращивают в жидкой среде, и сразу по достижении стадии экспоненциального роста несколько биллионов бактерий наносят на ростовую основу, состоящую из предварительно обработанного соответствующим образом мембранного фильтра,который инкубируют до тех пор, пока бактериальные колонии не достигнут состояния полного конфлуэнта. Второй задерживающий субстрат состоит из другого мембранного фильтра, предварительно увлажненного и покрытого требуемым антигеном. Затем задерживающий мембранный фильтр помещают на планшет, содержащий соответствующую культуральную среду, и покрывают ростовым фильтром, наружная поверхность которого покрыта бактериальными колониями. Полученный таким образом сэндвич инкубируют приблизительно 16 ч. Таким образом можно обеспечить экспрессию генов, кодирующих фрагменты scFv антител широкого действия,при этом те фрагменты, которые специфически связываются с антигеном, который присутствует на задерживающем мембранном фильтре, удерживаются на этом фильтре. Затем задерживающую мембрану обрабатывают, чтобы выделить фрагменты scFv антител, используя для этого общепринятые методы колориметрии. Положение окрашенных пятен на задерживающем фильтре позволяет вернуться назад к соответствующим бактериальными колониям, которые присутствуют на ростовой мембране и которые являются продуцентами задержанных фрагментов антител. Такие колонии собирают, выращивают и несколько миллионов бактерий наносят на новую кулътуральную мембрану фильтра, повторно производя описанные выше процедуры. Затем аналогичные циклы выполняют до тех пор, пока положительные сигналы на задерживающей мембране положительным колониям единственного типа, каждая из которых представляет собой потенциальный источник фрагментов моноклонального антитела против антигена, который был использован при селекции. Метод ICFS описан, например, в заявке WO 0246455, которая включена в настоящее описание в виде ссылки. Библиотеку можно также разделить на частицы или молекулярные комплексы, например, на репликативные генетические блоки из частиц таких бактериофагов (например,Т 7), или другие визуализированные системы in vitro, где каждая частица или молекулярный комплекс содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный VH-домен обнаруживаемого на них антитела, а также, необязательно, VL-домен, если он присутствует. Метод фагового дисплея описан в заявкеWO 92/01047 и, например, в патентах США US 5969108, US 5565332, US 5733743, US 5858657,US 5871907, US 5872215, US 5885793, US 5962255, US 6140471, US 6172197, US 6225447, US 6291650,US 6492160 и US 6521404, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание в виде ссылки. После селекции связывающих элементов, способных связываться с данным антигеном и представленных на бактериофаге или других частицах или молекулярных комплексах библиотеки, нуклеиновую кислоту можно получить из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, на которых представлен указанный связывающий элемент. Такая нуклеиновая кислота может быть использована в последующем продуцировании связывающего элемента или вариабельного VH- или VL-домена антитела путем экспрессии с нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, взятой из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, на которых представлен указанный связывающий элемент. Вариабельный VH-домен антитела с аминокислотной последовательностью вариабельного VHдомена антитела указанного селективного связывающего элемента может быть получен как в изолированной форме, так и в виде связывающего элемента, содержащего такой VH-домен. Способность связываться с фибронектиновым A-FN или ED-A или с другими антигенами- или изоформами-мишенями можно проверить дополнительно, например, их способность конкурировать, например, с любым из анти-ED-А-антител H1, B2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9 в отношении связывания А-FN или фрагмента A-FN, например, ED-A фибронектина. Связывающий элемент согласно изобретению может специфически связываться с A-FN и/или ED-A фибронектина. Связывающий элемент согласно изобретению может связываться с А-FN и/или ED-A фибронектина с той же самой аффинностью, что и анти-ED-А-антитело H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1,В 7, Е 8 или G9, например, в формате scFv, или с еще более высокой аффинностью. Связывающий элемент согласно изобретению может специфически связываться с A-FN и/или ED-A фибронектина с KD,составляющей 310-8 М, или с еще более высокой аффинностью. Предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению связывался с A-FN и/или ED-A фибронектина с KD, составляющей 210-8 М, или с еще более высокой аффинностью. Более предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению связывался с A-FN и/или ED-A фибронектина с KD, составляющей 1,710-8 М, или с еще более высокой аффинностью. Еще более предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению связывался с A-FN и/или ED-A фибронектина с KD, составляющей 1,410-8 М, или с еще более высокой аффинностью. Наиболее предпочтительно, чтобы связывающий элемент согласно изобретению связывался с A-FN и/или ED-A фибронектина с KD, составляющей 310-9 М, или с еще более высокой аффинностью. Связывающий элемент согласно изобретению может связываться с тем же самым эпитопом на AFN и/или ED-A фибронектина, что и анти-ED-А-антитело H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9. Связывающий элемент согласно изобретению может не проявлять какого-либо существенного связывания с молекулами, отличными от A-FN и/или ED-A фибронектина. В частности, связывающий элемент может не связываться с другими изоформами фибронектина, например изоформой ED-B и/или изоформой IIICS фибронектина. Описанные в настоящем изобретении варианты молекул антитела могут быть продуцированы и использованы в рамках настоящего изобретения. Такие технологии требуют реализации замен внутри аминокислотных последовательностей CDR, VH- или VL-доменов антител и связывающих элементов, обычно доступных в данной области. Могут быть получены варианты последовательностей с заменами, которые, согласно предсказаниям, могут оказывать, а могут и не оказывать минимальное или благотворное влияние на активность, и могут быть тестированы на предмет их способности связываться с A-FN и/илиED-A фибронектина и/или в отношении какого-либо иного требуемого от них свойства. Варианты аминокислотной последовательности вариабельного домена любого из VH- и VLдоменов, последовательности которых описаны в настоящем изобретении специально, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, как было сказано выше. Конкретные варианты могут включать одно или более изменений в последовательностях аминокислотных остатков (добавление, делецию, замену и/или вставку аминокислотного остатка), могут иметь менее чем примерно 20 изменений, менее чем примерно 15 изменений, менее чем примерно 10 изменений, менее чем примерно 5 изменений, возможно, 5, 4, 3, 2 или 1. Изменения могут быть произведены в одной или более каркасных областях и/или в одной или более областях CDR. Обычно изменения не приводят к потере функции, так что связывающий элемент, содержащий измененную таким образом аминокислотную последовательность, может сохранить способность связываться с A-FN и/или ED-A фибронектина. Например, он может сохранить в количественном отношении такое же связывание, что и связывающий элемент, в котором не произведено модификаций, например, как показано на основании измерений в описанном в настоящем изобретении анализе. Связывающий элемент, содержащий измененную таким образом аминокислотную последовательность, может обладать улучшенной способностью связываться с A-FN и/или ED-A фибронектина. Новые VH- или VL-области, несущие полученные из CDR последовательности согласно изобретению, могут быть получены с использованием случайного мутагенеза одного или более выбранных VHи/или VL-генов, чтобы вызвать мутации внутри полного вариабельного домена. В некоторых воплощениях внутри полного вариабельного домена или набора CDR производят одну или две аминокислотных замены. Другой способ, который может быть использован, связан с тем, чтобы направить мутагенез наCDR-области VH- или VL-генов. Как указано выше, аминокислотная последовательность CDR, по существу, как в настоящем изобретении указано, может встречаться в виде CDR в вариабельном домене антитела человека или его существенной части. HCDR3-последовательности, по существу, как в настоящем изобретении указано,представляют собой воплощения настоящего изобретения и, например, каждый из них может содержаться в HCDR3 в вариабельном домене антитела человека или существенной его части. Вариабельные домены, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены или произведены из любой зародышевой линии или в результате реаранжировки человеческого вариабельного домена, или же могут быть синтетическим вариабельным доменом на основе консенсусных или истинных последовательностей известных человеческих вариабельных доменов. Вариабельный домен может быть произведен из не-человеческого антитела. CDR-последовательность согласно изобретению (например,CDR3) может быть введена в репертуар вариабельных доменов, лишенных CDR (например, CDR3), с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Например, у Marks et al. (1992) описаны способы продуцирования репертуаров вариабельных доменов антитела, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5'-конец или на соседнюю с 5'-концом область вариабельного домена, используются в сочетании с консенсусными праймерами для третьей каркасной области человеческих VH-генов, чтобы обеспечить репертуар вариабельных VH-доменов, лишенных CDR3. Marks и др. дополнительно описали то, как этот репертуар можно скомбинировать с CDR3 конкретного антитела. С помощью аналогичной технологии последовательности согласно изобретению, произведенные из области CDR3, могут быть смешаны (перетасованы) с репертуаром VH- или VL-доменов, лишенных CDR3, а смешанные полные VH- или VLдомены скомбинированы с родственным VH- или VL-доменом, с получением связывающих элементов согласно изобретению. Затем этот репертуар может быть воспроизведен в соответствующей системе хозяина, так, чтобы система фагового дисплея согласно международной заявке WO 92/01047, которая во всей полноте включена в настоящее описание в виде ссылки, или последующему обширному списку литературы, включая Kay, WinterMcCafferty (1996), с тем, чтобы можно было произвести селекцию связывающих элементов. Репертуар может насчитывать количество, приблизительно составляющее от 104 индивидуальных связывающих элементов до, например, по меньшей мере 105, по меньшей мере 106, по меньшей мере 107, по меньшей мере 108, по меньшей мере 109 или по меньшей мере 1010. Сходным образом, можно перенести одну, или более, или же все три области CDR в репертуар VHили VL-доменов, а затем подвергнуть их скринингу на предмет селекции связывающего элемента или связывающих элементов в отношении A-FN и/или ED-A фибронектина. Можно использовать одну или более из областей HCDR1, HCDR2 и HCDR3 антитела H1, В 2, С 5,D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9, или набора областей HCDR, и/или можно использовать одну или более из областей LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9, или набора областей HCDR антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 или G9. Сходным образом, можно использовать другие описанные в настоящем изобретении VH- и VLдомены, наборы CDR и наборы HCDR и/или наборы LCDR.A-FN и/или ED-A фибронектина можно использовать в скрининге на предмет селекции связывающих элементов, например, молекул антитела, для применения в получении лекарственного средства для лечения опухолевых метастазов. Как указано в настоящем изобретении, можно осуществлять также скрининг репертуара. В некоторых воплощениях существенная часть вариабельного домена иммуноглобулина будет включать по меньшей мере все три области CDR вместе с находящимися между ними каркасными областями. Указанная часть может включать также по меньшей мере приблизительно 50% каждой или обеих из первой и четвертой каркасных областей, при этом эти 50% составляют 50% С-концевой первой каркасной области и 50% N-концевой области четвертой каркасной области. Дополнительными остатками вN-концевой или С-концевой области существенной части вариабельного домена могут быть те остатки,которые аномально ассоциированы с природно возникающими областями вариабельного домена. Например, конструирование связывающих элементов согласно изобретению, осуществляемое методами рекомбинантных ДНК, может приводить к введению N- или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, вводимыми для облегчения клонирования или других манипуляционных стадий. Другие манипуляционные стадии включают введение линкеров для соединения вариабельных доменов согласно изобретению с дополнительными белковыми последовательностями, включая константные области антитела,другие вариабельные домены (например, при продуцировании димерных антител) или детектируемые/функциональные метки, что в настоящем описании можно найти в более подробном изложении. Хотя в некоторых аспектах настоящего изобретения связывающие элементы и содержат пару VH- иVL-доменов, одиночные связывающие домены на основе последовательностей либо VH-, либо VLдоменов образуют дальнейшие аспекты настоящего изобретения. Известно, что одиночные иммуноглобулиновые домены, в частности, VH-домены, способны специфическим образом связывать антигенымишени. Например, см. выше обсуждение dAb-доменов. В случае любого из одиночных связывающих доменов эти домены могут быть использованы для скрининга комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменный связывающий элемент,способный связываться с A-FH и/или ED-A фибронектина. Это может быть достигнуто с помощью методов скрининга фагового дисплея с применением так называемого иерархического двуединого комбинаторного подхода, как описано в документе WO 92/01047, во всей полноте включенном в настоящее описание в виде ссылки, в котором индивидуальная колония, содержащая клон либо Н-, либо L-цепи, используется для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или Н), и полученный в результате двухцепочечный связывающий элемент отбирают в соответствии с технологией фагового дисплея, той, что описана в данной ссылке. Эта технология описана также и у Marks, 1992. Связывающие элементы согласно изобретению могут дополнительно включать константные области антитела или их части, например константные области человеческого антитела или их части. Например, VL-домен может быть прикреплен своей С-концевой областью к константным доменам легкой цепи антитела, включая человеческие С- или С-цепи, например С-цепи. Сходным образом, связывающий элемент на основе VH-домена может быть прикреплен своей С-концевой областью к полной или частичной (например, СН 1- домен) тяжелой цепи иммуноглобулина, полученной из антитела любого изотипа,например IgG, IgA, IgE и IgM, и любого из субклассов этих изотипов, в частности IgG1 и IgG4. Любая синтетическая константная область или же другой вариант константной области, которая обладает этими свойствами и стабилизирует вариабельные области, также применима в воплощениях настоящего изобретения. Связывающие элементы согласно изобретению можно пометить детектируемой или функциональной меткой. Меткой может быть любая молекула, которая продуцирует или которую можно стимулировать к продуцированию сигнала, включая, но не ограничиваясь перечисленным, флуоресцентные метки,радиоактивные метки, ферменты, хемилюминесцентные метки или фотосенсибилизирующие средства. Таким образом, связывание может быть детектировано и/или измерено путем детектирования флуоресценции или люминесценции, радиоактивности, ферментативной активности или поглощения света. Детектируемые метки могут быть прикреплены к антителам согласно изобретению с привлечением обычных химических методов, известных в данной области. Известен целый ряд способов, посредством которых метка может продуцировать сигнал, детектируемый извне, например путем визуального наблюдения, такой как электромагнитное излучение, теплота и химические реагенты. Метка может быть также связана с другим связывающим элементом, который связывается с антителом согласно изобретению или с подложкой. Меченые связывающие элементы, например scFv, меченные детектируемой меткой, могут быть использованы для диагностики in vivo, ex vivo или in vitro, и/или для терапии. Например, радиоактивно меченные связывающие элементы (например, связывающие элементы,конъюгированные с радиоактивным изотопом) могут быть использованы в радиодиагностике и радиотерапии. Радиоактивные изотопы, которые могут быть конъюгированы со связывающим элементом согласно изобретению, включают изотопы, такие как 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In,97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, S8Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh и 177Lu. Например, связывающий элемент согласно изобретению, меченный детектируемой меткой, может быть использован для обнаружения, диагностики или мониторинга опухолевых метастазов и/или опухолевых метастазов у человека или животного. Связывающий элемент может быть введен человеку или животному, обычно пациенту-человеку, и затем можно определить наличие или отсутствие антитела на участке, отдаленном от участка, который занят в настоящее время или который ранее был занят первичной опухолью у человека или животного; локализация молекулы антитела на участке, отдаленном от участка, который занят в настоящее время или который ранее был занят первичной опухолью у человека или животного, свидетельствует о наличии опухолевых метастазов и/или метастазирования опухоли. Связывающий элемент согласно изобретению может быть использован для производства диагностического продукта для применения в диагностике опухолевых метастазов. Настоящее изобретение относится также к способу обнаружения или диагностики опухолевых метастазов у человека или животного, включающему стадии:(a) введения человеку или животному связывающего элемента согласно изобретению, например,меченного детектируемой меткой, которая связывается с изоформой ED-A фибронектина и/или с ED-A фибронектина, и(b) определения наличия или отсутствия связывающего элемента на участке, отдаленном от участка, который занят в настоящее время или который ранее был занят первичной опухолью у человека или животного; где локализация связывающего элемента на участке, отдаленном от участка, который занят в настоящее время или который ранее был занят первичной опухолью у человека или животного, свидетельствует о наличии опухолевых метастазов, причем связывающий элемент является меченным детектируемой меткой, а наличие или отсутствие детектируемой метки может быть определено путем детектирования метки. Связывающий элемент согласно изобретению может быть использован также для измерения уровней антигена в конкурентном анализе, иными словами, способом измерения уровня антигена в образце с использованием связывающего элемента согласно изобретению является способ конкурентного анализа. Это относится к случаю, когда не требуется физического отделения связанного антигена от несвязанного. Одной из возможностей является такое связывание репортерной молекулы со связывающим элементом, при котором связывание как таковое вызывает физическое или оптическое изменение. Репортерная молекула может прямо или опосредованно порождать детектируемые сигналы, которые могут быть оценены количественно. Связывание репортерных молекул может быть прямым или опосредованным, ковалентным, например, через пептидную связь, или нековалентным. Связывание через пептидную связь может произойти в результате рекомбинантной экспрессии слияния генов, кодирующих антитело и репортерную молекулу. Конкурентные анализы могут быть использованы также в картировании эпитопов. В одном случае картирование эпитопов может быть использовано для идентификации эпитопа, связанного со связывающим элементом. Такой эпитоп может быть линейным или конформационным. Конформационный эпитоп может содержать по меньшей мере два различных фрагмента A-FN или ED-A фибронектина, причем эти фрагменты должны находиться на расстоянии друг от друга, когда происходит пространственная упаковка A-FN или ED-A фибронектина, и они приобретают свою третичную или четвертичную структуру,с образованием конформационного эпитопа, который распознается элементом, связывающимся с A-FN или ED-A фибронектина. В конкурентном анализе может быть использован пептидный фрагмент антигена, в частности пептид, включающий или в основном состоящий из представляющего интерес эпитопа. Может быть использован пептид, содержащий последовательность эпитопа плюс одну или более аминокислот на любом из его концов. Связывающие элементы согласно изобретению могут быть такими, что их связывание с антигеном будет ингибироваться пептидом, включающим данную последовательность или состоящим из нее. В дальнейших аспектах настоящего изобретения используется конъюгат или слияние связывающего элемента согласно изобретению и молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени в областях повреждения, и антитела, направленного против компонента внеклеточного матрикса, который присутствует в таких областях повреждения. Например, биоцидной или цитотоксической молекулой может быть интерлейкин-2 (IL-2), доксорубицин, интерлейкин-12 (IL-12), интерферон-гамма (IFN-), фактор некроза опухоли альфа (TNF-) или тканевый фактор (предпочтительно,укороченный). Такие конъюгаты могут иметь терапевтическое применение, например, для лечения опухолевых метастазов и/или опухоли, как указано в настоящем описании. Продуцирование и применение слияний или конъюгатов связывающих элементов с биоцидными или цитотоксическими молекулами описано, например, в заявке WO 01/62298, которая включена в настоящее описание в виде ссылки. В одном аспекте изобретение относится к способу лечения метастазирования опухоли и/или опухолевых метастазов, включающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент согласно изобретению. Связывающий элемент может быть конъюгатом (i) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени в результате клеточного взаимодействия, и (ii) элемента, связывающегося с изоформой ED-A фибронектина и/или с ED-A-доменом фибронектина. В другом аспекте изобретение относится к применению связывающего элемента согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухоли. Связывающий элемент может быть конъюгирован или слит с молекулой, которая, как в настоящем изобретении описано, оказывает биоцидное или цитотоксическое действие. Связывающий элемент может быть конъюгатом (i) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое дей- 14018985 ствие на клетки-мишени в результате клеточного взаимодействия, и (ii) элемента, связывающегося с человеческим фибронектином согласно изобретению. В дополнительном аспекте изобретение относится к конъюгату (i) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени в результате клеточного взаимодействия, и(ii) элементу, связывающемуся с человеческим фибронектином согласно изобретению, для применения в способе терапевтического лечения организма человека или животного. Такое лечение может быть лечением опухолевых метастазов и/или метастазирования опухоли. Еще в одном дополнительном аспекте изобретения предложен конъюгат (i) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени в результате клеточного взаимодействия, и (ii) элемента, связывающегося с человеческим фибронектином согласно изобретению. Такой конъюгат предпочтительно включает слитый белок, содержащий биоцидную или цитотоксическую молекулу и указанный связывающий элемент, или, когда связывающий элемент является двухцепочечным или мультицепочечным, слитый белок, содержащий биоцидную или цитотоксическую молекулу и компонент полипептидной цепи указанного связывающего элемента. Предпочтительно, чтобы связывающий элемент был одноцепочечным полипептидом, например одноцепочечной молекулой антитела, таким какscFv. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен слитый белок, содержащий биоцидную или цитотоксическую молекулу и одноцепочечную Fv-молекулу антитела согласно изобретению. Биоцидная или цитотоксическая молекула, которая оказывает свое действие на клетки-мишени в результате клеточного взаимодействия, может взаимодействовать непосредственно с клеткой-мишенью,может взаимодействовать с мембрано-связанным рецептором на клетке-мишени или искажать электрохимический потенциал клеточной мембраны. Молекулы, которые взаимодействуют с мембраносвязанным рецептором, включают хемокины, цитокины и гормоны. Соединения, которые искажают электрохимический потенциал клеточной мембраны, включают гемолизин, ионофоры, лекарственные средства, действующие на ионные каналы. В предпочтительных иллюстративных воплощениях молекулой является интерлейкин-2, тканевый фактор (предпочтительно, укороченный) или доксорубицин. В других воплощениях может быть использован интерлейкин-12, интерферон-гамма, IP-10 и фактор некроза опухоли альфа (TNF-). Как дополнительно обсуждается ниже, специфический связывающий элемент предпочтительно является антителом, или же он содержит антигенсвязывающий участок антитела. Удобно, когда специфический связывающий элемент может быть одноцепочечным полипептидом, таким как одноцепочечное антитело. Это создает удобство при продуцировании слитого белка, содержащего одноцепочечное антитело и биоцидную или цитотоксическую молекулу (например, интерлейкин-2 или тканевый фактор). В других воплощениях антигенсвязывающий участок антитела получают путем объединения VH-домена антитела и VL-домена антитела в раздельных полипептидах, например, в полном антителе или во фрагменте антитела, таком как Fab-фрагмент или димерное антитело. Когда специфический связывающий элемент является двухцепочечной или мультицепочечной молекулой (например, Fab-фрагментом или целым антителом, соответственно), биоцидная или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована в виде слитого полипептида с одной или более полипептидными цепями в специфическом связывающем элементе. Связывающий элемент может быть конъюгирован с биоцидной или цитотоксической молекулой путем образования пептидной связи, т.е. внутри слитого полипептида, содержащего указанную молекулу и специфический связывающий элемент или компонент его полипептидной цепи. См. публикации Taniguchi et al. (1983), Nature 302, 305-310; MaED-A et al. (1983), Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 10401047; Devos et al. (1983), Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323 в отношении информации по последовательностиIL-2, полезной при получении слитого полипептида, содержащего IL-2. Информация относительно последовательности укороченного тканевого фактора представлена у Scarpati et al. (1987), Biochemistry 26: 5234-5238, Ruf et al. (1991), J. Biol. Chem. 226: 15719-15725. Другие способы конъюгирования включают химическую конъюгацию, в частности, поперечное связывание с использованием бифункционального реагента (например, с помощью руководства по селекции поперечно-связывающих реагентов, DOUBLEPEAGENTS, Pierce). Когда желательно медленное высвобождение, например, когда биоцидной или цитотоксической молекулой является доксорубицин или другая молекула, которая искажает электрохимический потенциал клеточной мембраны, химическая конъюгация может происходить путем образования основания Шиффа (имин) между первичной аминогруппой специфического связывающего элемента (полипептид,такой как антитело или фрагмент антитела) и окисленным сахарным фрагментов (даунозамин) биоцидной или цитотоксической молекулы, такой как доксорубицин. Настоящее изобретение дополнительно относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей связывающий элемент согласно изобретению. Нуклеиновая кислота может включать ДНК и/или РНК. В одном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует CDR или набор областей CDR, или VH-домен или VL-домен, или же антигенсвязывающий участок антитела или молекулу антитела, например, scFv или IgG, например, IgGl, согласно изобретению, как было сказано выше. Предпочтительными нуклеотидными последовательностями являются нуклеотидные последовательности, кодирующие описанные в настоящем изобретении VH- и/или VL-домены. Настоящее изобретение включает также конструкты в виде плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессирующих кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, как указано выше. Настоящее изобретение включает также рекомбинантную клетку-хозяина, которая включает одну или более указанных выше конструкций. Как было установлено, нуклеиновая кислота, кодирующая любую область CDR или набор CDR, или VH-домен или VL-домен, или же антигенсвязывающий участок антитела или молекулу антитела, например scFv, или IgG1, или IgG4, как таковая образует один из аспектов настоящего изобретения, также как и способ продуцирования кодируемого ею продукта, причем этот способ включает экспрессию с кодирующей нуклеиновой кислоты. Удобно добиться экспрессии путем культивирования в подходящих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих указанную нуклеиновую кислоту. VH-домен или VL-домен, или связывающий элемент, образующиеся в результате экспрессии, могут быть изолированы и/или очищены с помощью любой подходящей технологии, а затем использованы по необходимости. Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может содержать ДНК или РНК и может быть полность или частично синтетической. Указанная в настоящем изобретении ссылка на нуклеотидную последовательность включает молекулу ДНК со специфической последовательностью и включает молекулу РНК со специфической последовательностью, в которой, если специально не указано иначе,тимин (Т) заменен урацилом (U). Еще в одном дополнительном аспекте предусмотрен способ продуцирования вариабельного VHдомена антитела, включающий инициацию экспрессии с кодирующей нуклеиновой кислоты. Такой способ может включать культивирование клеток в условиях, в которых продуцируется указанный вариабельный VH-домен антитела. Аналогичные способы продуцирования вариабельных VL-доменов и связывающих элементов, содержащих VH- и/или VL-домен, составляют дальнейшие аспекты настоящего изобретения. Способ продуцирования может включать стадию выделения и/или очистки указанного продукта. Способ продуцирования может включать включение продукта в состав композиции, включающей по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый наполнитель. Системы для клонирования и экспрессии полипептида в различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, клетки растений, нитчатых грибов, дрожжей и бакуловирусных систем и трансгенных растений и животных. Экспрессия антител и антительных фрагментов в прокариотических клетках является хорошо установленной в данной области. См., например, обзор Pluckthun, 1991. Обычно используемой бактериальной клеткой-хозяином является Е. coli. Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также хорошо известна специалистам в данной области как возможность продуцирования связывающего элемента - например, ChaddChamow (2001),AndersenKrummen (2002), LarrickThomas (2001). Линии клеток млекопитающих для экспрессии гетерологичного полипептида, доступные в данной области, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка, клетки NSO мышиной меланомы, клетки крысиной миеломы YB2/0, клетки эмбриональной почки человека, клетки эмбриональной сетчатки человека и многие другие. Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие, по необходимости, соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, последовательности терминатора, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности,маркерные гены и другие последовательности. Векторами могут быть, по необходимости, плазмиды,например фагмиды, или вирусы, например фаги. Более подробно см., например, SambrookPussell(2001). Многие известные технологии и методики, в которых описаны манипуляции с нуклеиновыми кислотами, например, при получении конструкций нуклеиновых кислот, мутагенезе, секвенировании,введении ДНК в клетки и генной экспрессии, а также анализ белков, подробно описаны у Ausubel, 1999. Дальнейший аспект настоящего изобретения связан с клеткой-хозяином, содержащей описанную в настоящем изобретении нуклеиновую кислоту. Такой клеткой-хозяином может быть клетка in vitro и может быть клетка в культуре. Такой клеткой-хозяином может быть клетка in vivo. To, что клетка-хозяин находится in vivo, может позволить реализацию внутриклеточной экспрессии связывающих элементов согласно изобретению в виде внутриклеточных антител, или "intrabodies". Внутриклеточные антитела могут быть использованы для генной терапии. Еще в одном аспекте предложен способ, предусматривающий введение нуклеиновой кислоты согласно изобретению в клетку-хозяина. Такое введение может быть осуществлено с использованием любой доступной технологии. Для эукариотических клеток подходящие технологии могут включать трансфекцию с применением кальций-фосфата, DEAE-декстран, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с помощью ретровируса или другого вируса, например вируса осповак- 16018985 цины, или, в случае клеток насекомых, бакуловируса. Для введения нуклеиновой кислоты в клеткихозяева, в частности эукариотические клетки, можно использовать системы на основе вируса или плазмиды. Плазмидная система может поддерживаться на эписомном уровне или может быть встроена в клетку-хозяина или в искусственную хромосому. Встраивание может быть либо случайным, либо оно может представлять собой нацеленную интеграцию одной или более копий в один или во множество локусов. В случае бактериальных клеток подходящие технологии могут включать трансформацию с применением хлористого кальция, электропорацию и трансфекцию с помощью бактериофага. Такое введение может сопровождаться инициацией или предоставлением возможности для экспрессии с нуклеиновой кислоты, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии, этого гена. Очистка экспрессированного продукта может быть достигнута способами, известными специалистам в данной области. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть интегрирована в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграция может быть стимулирована включением последовательностей, которые осуществляют промоцию рекомбинации с геномом, в соответствии со стандартными технологиями. Настоящее изобретение связано также со способом, который включает применение конструкции в экспрессирующей системе, как было указано выше, для экспрессирования связывающего элемента или полипептида, как указано выше. Связывающие элементы согласно изобретению сконструированы для использования в способах диагностики или лечения человека или животных, например человека. Связывающие элементы могут быть использованы в диагностике или лечении опухолевых метастазов и/или метастазирования опухолей. Соответственно, дальнейшие аспекты изобретения связаны со способами лечения, включающими введение предусмотренного связывающего элемента, фармацевтическими композициями, содержащими такой связывающий элемент, и применением такого связывающего элемента в изготовлении лекарственного средства для введения пациенту, например, в способе изготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции, предусматривающем создание рецептуры, содержащей связывающий элемент в составе с фармацевтически приемлемым наполнителем. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и будут подбираться специалистами в данной области, в зависимости от природы и способа введения выбранного активного соединения (соединений). Связывающие элементы согласно изобретению будут, как правило, вводить в виде фармацевтической композиции, которая, помимо связывающего элемента, может включает по меньшей мере один компонент. Таким образом, фармацевтические композиции согласно изобретению, а также таковые для применения согласно настоящему изобретению, могут содержать, помимо активного ингредиента, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны искажать эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или других веществ будет зависеть от пути введения, который может быть пероральным путем введения, введением путем ингаляции или путем инъекции, например внутривенной. Фармацевтические композиции для перорального введения, такие, например, как нанотела и пр.,также включены в объем настоящего изобретения. Такие пероральные композиции могут быть представлены в виде таблеток, капсул, порошков, жидкостей, или же они могут быть представлены в виде полутвердых форм. Таблетка может включать твердый носитель, такой как желатин или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, углеводороды, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены также физиологический солевой раствор, декстроза или другой раствор сахаридов, или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль. В случае внутривенных инъекций или инъекций на участке повреждения, активный ингредиент будет представлен в виде парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным,имеет соответствующие значение рН, изотоничность и стабильность. Все специалисты в сферах, связанных с данной областью, хорошо ориентируются в приготовлении соответствующих растворов с использованием, например, изотонических носителей, таких как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. В случае необходимости могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Специалистам в данной области известно много способов приготовления фармацевтических композиций. См., например,Robinson, 1978. Композицию можно вводить отдельно или в сочетании с другими видами лечения, одновременно или последовательно, или же в виде комбинированного средства в сочетании с другим терапевтическим агентом или агентами, в зависимости от того состояния, которое подвергается лечению. Связывающий элемент для A-FN и/или ED-A фибронектина может быть использован как часть комбинировнной терапии в сочетании с дополнительным медикаментозным компонентом. Комбинированное лечение может быть использовано для обеспечения значительных синергических эффектов, в частности, комбинация связывающего элемента, который связывается с A-FN и/или ED-A фибронектина, с одним или несколькими другими лекарственными средствами. Связывающий элемент для A-FN и/илиED-A фибронектина можно вводить одновременно или последовательно, или же в виде комбинированного средства в сочетании с другим терапевтическим средством или средствами, для лечения одного или более перечисленных в настоящем изобретении состояний. Например, связывающий элемент согласно изобретению может быть использован в сочетании с уже существующим терапевтическим средством для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухоли. Существующие терапевтические средства для лечения опухолевых метастазов и/или метастазирования опухоли включают доксорубицин, таксол, гемцитабин, сорафениб, мелфалан и авастин. Связывающий элемент согласно изобретению и один или более из перечисленных выше дополнительных лекарственных компонентов могут быть использованы в изготовлении лекарственного средства. Лекарственное средство может быть предназначено для раздельного или комбинированно введения индивидууму и, соответственно, может включать связывающий элемент в виде комбинированного лекарственного средства или в виде отдельных лекарственных средств. Раздельные лекарственные средства могут быть использованы для облегчения раздельного и последовательного или одновременного введения и создают возможность для введения компонентов различными путями, например, для введения пероральным и парентеральным путями. В соответствии с настоящим изобретением предлагаемые композиции можно вводить животным. Введение может осуществляться в "терапевтически эффективном количестве", которого должно быть достаточно для выявления улучшения состояния пациента. Такое улучшение, по меньшей мере, может представлять собой улучшение по меньшей мере одного симптома. Конкретно вводимое количество, а также скорость и временной график введения будут зависеть от природы и тяжести состояния, которое подвергают лечению, конкретного млекопитающего, которое подвергается лечению, клинического состояния индивидуального пациента, причины нарушения, участка, в который должна быть доставлена композиция, от типа связывающего элемента, способа введения, режима введения и других факторов,известных практикующим врачам. Ответственность за рекомендации в связи с лечением, например определением дозировок и пр., полностью ложится на лечащего врача и других врачей и может зависеть от тяжести симптомов и/или прогрессирования заболевания, которое подвергается лечению. Подходящие дозы антитела хорошо известны в данной области (Ledermann, 1991 и Bagshawe, 1991). Можно использовать специфические дозировки, указанные в настоящем изобретении или в Настольном справочнике врача (2003), в зависимости от типа вводимого лекарственного средства. Терапевтически эффективное количество или подходящую дозу связывающего элемента согласно изобретению можно определить путем сравнения его активности in vitro и активности in vivo на животной модели. Способы экстраполяции дозировок, эффективных для мышей и других тестируемых животных, на человека хорошо известны. Точная доза будет зависеть от целого ряда факторов, включая то, используется ли конкретное антитело для диагностики, профилактики или лечения, от размера и локализации участка, подвергаемого лечению,точной природы антитела (например, целое антитело, фрагмент антитела или димерное антитело), и природы какой-либо детектируемой метки или другой молекулы, прикрепленной к этому антителу. Обычно доза антитела варьирует в пределах от 100 мкг до 1 г в случае системного введения, и от 1 мкг до 1 мг в случае местного введения. Можно ввести начальную нагрузочную дозу, а затем последующие одну или несколько более низких доз. Антитело может быть целым антителом, например антителом IgG1 илиIgG4-изотипа. Это доза для однократного введения взрослому пациенту, которая может быть пропорционально сведена к детской или младенческой дозе, также как и пересчитана на случай антитела другого формата пропорционально молекулярному весу. Лечебное воздействие можно повторять ежедневно, два раза в неделю, с недельными или месячными интервалами, по усмотрению лечащего врача. В случае подкожного введения лечебное воздействие можно осуществлять каждые две или четыре недели, а в случае внутривенного введения - каждые четыре-восемь недель. В некоторых воплощениях настоящего изобретения лечебное воздействие является периодическим, и период между введениями составляет приблизительно две или более недель, например приблизительно три или более недель, приблизительно четыре или более недель, или же периодичность составляет приблизительно один раз в месяц. В других воплощениях настоящего изобретения лечебное воздействие может быть оказано перед и/или после операции, и оно может быть осуществлено путем введения или наложения непосредственно на анатомический участок хирургического воздействия. Дальнейшие аспекты и воплощения настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области в свете настоящего описания, включая и нижеследующие экспериментальные иллюстративные примеры. Экспериментальная часть Материалы и методы Животная модель Эксперименты на животных были одобрены Швейцарской федеральной ветеринарной Службой и предприняты в соответствии со Швейцарским Предписанием по защите животных. Проводили регулярный мониторинг мышей. При любых признаках боли или страдания или же в случае потери веса более чем на 15% животных умерщвляли. Самцам мышей Svl29 (RCC, Fullingsdorf, Switzerland) внутривенно путем инъекции вводили 106 мутантных клеток F9 мышиной тератокарциномы (Terrana et al. 1987), которые были предоставлены Dario Rusciano (SIFI, Catania, Italy). Через 3 недели после инъекции опухолевых клеток мышей использовали для in vivo биотинилирования, в экспериментах по таргетированию или для удаления органа для иммуногистохимии.In vivo биотинилирование Эксперименты по биотинилированию in vivo проводили так, как было описано ранее (Roesli et al. 2006, Rybak et al. 2005). Вкратце, грудную клетку анестезированных мышей вскрывали, осуществляя срединную стернотомию. Левый желудочек сердца пунктировали перфузионной иглой, а в правом предсердии делали маленький надрез, чтобы обеспечить отток перфузируемых растворов. Непосредственно вслед за этим осуществляли перфузию системы кровообращения, с давлением 100 мм Hg при скорости потока 1,5 мл/мин. На первой стадии перфузию осуществляли 15 мл раствора для биотинилирования(предварительно нагретого до 38 С), содержащего 1 мг/мл sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce, Rockford, IL,USA) в PBS, pH 7,4, обогащенного 10% (мас./об.) декстраном-40 (Amersham Biosciences, Uppsala,Sweden) в качестве вещества, увеличивающего объем плазмы крови. Таким образом, компоненты крови,которые могли бы принять участие в реакции биотинилирования, были изъяты из системы кровообращения в течение первых нескольких минут перфузии, и белки, содержащие доступный первичный амин (и определенные гликолипиды и фосфолипиды), в разных тканях могли быть модифицированы биотином. Для нейтрализации непрореагировавшего биотинилирующего реагента биотинилирование in vivo сопровождалось 10-минутной стадией промывания раствором 50 мМ Tris, 10% (мас./об.) декстрана-40, в PBS,рН 7,4, предварительно нагретого до 38 С. В процессе перфузии биотинилирующим реагентом (и в течение первых трех минут последующей перфузии блокирующим раствором) область вокруг сердца промывали раствором 50 мМ Tris в PBS, рН 7,4 (38 С), чтобы нейтрализовать поступающий извне непрореагировавший биотинилирующий реагент и избежать нежелательного мечения молекул на поверхности органов. После перфузии органы и опухоли извлекали, и свежие образцы либо мгновенно замораживали для приготовления гомогенатов органов, либо погружали, вдавлиявая в охлажденную матрицу (Microm,Walldorf, Germany), и замораживали в изопентане и в жидком азоте, с получением срезов из замороженных тканей для гистохиического анализа. Неперфузированных мышей использовали в качестве отрицательного контроля для анализов методами протеомики. Приготовление белковых экстрактов для анализов методами протеомики Образцы ресуспендировали в 40 мкл лизирующего буфера на 1 мг ткани (2% ДСН, 50 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, полный коктейль ингибитора протеиназы Е (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) в PBS,рН 7,4) и гомогенизировали с помощью измельчителя Ultra-Turrax T8 (IKA-Werke, Staufen, Germany). Гомогенаты подвергали действию ультразвука, используя установку Vibra-cell (Sonics, New Town, CT,USA), с последующими 15-минутной инкубацией при 99 С и 20-минутным центрифугированием при 15000g. Супернатант использовали в качестве полного белкового экстракта. Концентрацию белка определяли с помощью набора ВСА Protein Assay Reagent Kit (Pierce). Очистка биотинилированных белков Для каждого образца по 960 мкл пастообразной смеси стрептавидин-сефарозы (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) трижды промывали в буфере A (NP40 1%, ДСН 0,1% в PBS), осаждали и смешивали с 15 мг полного белкового экстракта. Сбор биотинилированных белков выполняли в течение 2 ч при комнатной температуре во вращающемся миксере. Супернатант удаляли, а осадок трижды промывали буфером А, дважды - буфером В (0,1% NP40, 1 М NaCl в PBS), и один раз - 50 мМ бикарбонатом аммония. В конце осадок ресуспендировали в 400 мкл 50 мМ раствора бикарбоната аммония, и затем добавляли 20 мкл модифицированного трипсина свиньи, имеющего степень чистоты для секвенирования(сток-раствор - 40 нг/мкл в 50 мМ бикарбонате аммония) (Promega, Madison, WI, USA). Протеолитическое расщепление проводили в течение ночи при 37 С при постоянном перемешивании. Пептиды обессоливали, очищали и концентрировали на микроколонках С 18 (ZipTip C18, Millipore, Billerica, MA,USA). После лиофилизации пептиды хранили при -20 С. Нанокапиллярная ВЭЖХ с автоматизированной onlxne-фракцией, наносимой на планшеты для автоматической идентификации мишени MALDI Триптические пептиды отделяли с помощью высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой (ОФ ВЭЖХ), используя нано-масштабную систему ЖХ UltiMate и микро-автодозатор FAMOS (LCPackings, Amsterdam, The Netherlands), контролируемую программным обеспечением Chromeleon кислоты (TFA) в воде, мобильная фаза В представляет собой 80% ацетонитрил и 0,1% TFA в воде. Скорость потока составляет 300 нл/мин. Лиофилизированные пептиды, полученные в результате триптического переваривания биотинилированных белков, очищенных на основании их аффинности из 1,5 мг общего белка, растворяли в 5 мкл буфера А и наносили на колонку (внутренний диаметр: 75 мкм, длина 15 см, наполнена С 18 РерМар 100, 3 мкм, бусинки в 100 ; уплотнители ЖХ). Пептиды элюировали в градиенте 0-30% В в течение 7 мин, 30-80% В в течение 67 мин, 80-100% В в течение 3 мин и 100% В в течение 5 мин; колонку уравновешивали 100% А в течение 20 мин перед нанесением следующего образца. Элюированные фракции смешивали с раствором 3 мг/мл -циано-4-гидроксифенилакриловой кислоты, 277 пмоль/мл нейротензина (внутренний стандарт), 0,1% TFA и 70% ацетонитрила в воде и вносили в лунки 192-луночного планшета мишени MALDI с использованием on-line-системы Probot (Dionex). Скорость потока матричного раствора MALDI устанавливали на уровне 1,083 мкл/мин. Таким образом, каждая фракция, собираемая в течение 20 с, содержала 361 нл матричного раствора MALDI и 100 нл образца. Конечная концентрация нейротензина составляла 100 фмоль на лунку. MALDI-TOF/TOF массспектрометрия MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрический анализ проводили с помощью протеомного анализатора 4700 (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). Для выбора иона-предшественника все фракции измеряли MS-методом перед проведением тандемной масс-спектрометрии MS/MS. Максимум из 15 предшественников на образец отбирали для последующей фрагментации путем индуцированной столкновениями диссоциацией. Спектры обрабатывали и анализировали с помощью Всемирного СервераGlobal Protein Server Workstation (Applied Biosystems), в котором используется собственное программное обеспечение MASCOT (Matrix Science, London, UK) для сопоставления данных MS и MS/MS с базами данных по компьютерному моделированию расщепленных (переваренных) белков. Полученные данные были 'подвергнуты скринингу против мышиной базы данных, загруженной с начальной страницы NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Идентификация белков (при наномолярной концентрации), выполненная с использованием программного обеспечения MASCOT, была признана корректной, с 95% доверительным интервалом для наилучшего иона-предшественника. Масс-спектрометрические анализы MALDI-TOF и MALDI-TOF/TOF проводили с помощью протеомного анализатора 4700 (Applied Biosystems). Пептидные массы получали в интервале от 750 до 4000 m/z, с максимумом при 2000 m/z. MS-спектры были суммированы из 2000 импульсов неодимового лазера Nd: YAG-лазер работал при 355 нм и 200 Гц. Автоматизированную калибровку пластин предпринимали с использованием пяти пептидных стандартов (массы 900-2400 m/z; Applied Biosystems) в шести калибровочных лунках. Эту калибровку пластин использовали для внесения поправок в связи с погрешностями измерительного прибора для точного определения массы, и ее применяли ко всем MS- иMS/MS-спектрам. Кроме того, производили внутреннюю калибровку каждого MS-спектра, используя внутренний стандарт пептида, добавленного к матрице MALDI. Максимум из 15 предшественников на лунку с отношением сигнал-шум, составляющим 100, автоматически отбирали для последующей фрагментации путем индуцированной столкновениями диссоциации. MS/MS-спектры были суммированы из 2500-5000 лазерных импульсов. Спектры обрабатывали и анализировали с помощью Всемирного Сервера Global Protein Server Workstation (Applied Biosystems), в котором используется собственное программное обеспечение MASCOT (Matrix Science) для сопоставления данных MS и MS/MS с базами данных по компьютерному моделированию расщепленных белков. Исследуемыми параметрами MASCOT были:(i) мышиная база данных, загруженная с начальной страницы Европейского института биоинформатики (EBI) на 9-е сентября 2006: (ftp.ebi.ас.uk/pub/databases/SPproteomes/fasta/proteomes/59.(iii) дозволенное число пропущенных расщеплений: 1;(ix) максимальная оценка пептида: 1. Кроме того, был использован MS/MS-пик, фильтруемый в соответствии со следущими параметрами:(i) колебание массы: от 60 до 20 Да ниже массы предшественника;(iv) максимальное число пиков на спектр: 65. Антитела Выделение фрагмента scFv(Ll9) анти-ED-В-антитела было описано ранее (Pini et al. 1998). Родительское анти-ED-A-антитело было выделено из библиотеки ЕТН-2 с применением опубликованной методики (Giovannoni, Nucleic Acid Research, 2001, 29(5): E27). Созревание аффинности родительского анти-ED-А-антитела с получением высокоаффинных анти-ED-А-антител описано в следующем разделе. Созревание аффинности родительского анти-ED-А-антитела Родительское анти-ED-А-антитело (антитело, полученное из ЕТН-2) были использовано в качестве матрицы для создания библиотеки антител с развитой аффинностью. Вариабельность последовательности в области VH-CDR1 (зародышевая линия DP47) и VL-CDR1 (зародышевая линия DPK22) этой библиотеки вводили посредством ПЦР с использованием частично вырожденных праймеров для VH и для VL (все олигонуклеотиды были приобретены в компании Operon Biotechnologies, Cologne, Germany),руководствуясь способом, в котором образуются случайные мутации в положениях 31, 32 и 33 области, с использованием гель-очищенных VH- и VL-сегментов в качестве матриц. Объединенные VH-VL-фрагменты были дважды подвергнуты расщеплению под действием NcoI/NotI и клонированы в NcoI/NotI-расщепленный фагемидный вектор pHEM1 (Hoogenboom et al. 1991). Полученный в результате продукт лигирования был электропорирован в электрокомпетентные TG-1-клетки Е. coli, согласно Viti et al. 2000, с получением библиотеки, содержащей 1,5107 клонов индивидуальных антител, которые были подвергнуты скринингу на предмет выявления антител, которые с улучшенной аффинностью связываются с ED-A. Селекция анти-ED-А-антител Описанную выше библиотеку антител подвергали скринингу на предмет выявления антител, которые связываются с ED-A с большей аффинностью, чем аффинность родительского анти-ED-А-антитела,с использованием анализа BIAcore. Антиген (11 А 12), используемый при BIAcore-анализе, содержал EDA-домен фибронектина человека и имел следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 120): Нуклеотидная последовательность антигена (11 А 12) (SEQ ID NO: 121) является следующей: Нуклеотидную последовательность этого антигена амплифицировали методом ПЦР, используя праймеры, содержащие сайты рестрикции BamHI и BglII, соответственно, на 5'- и 3'-концах. Полученный в результате продукт ПЦР и вектор pQE12 (QIAGEN) были подвергнуты перевариванию под действием рестрикционной эндонуклеазы BamHI и BglII, а затем лигированию в реакции, содержащей отношение вставки к вектору, составляющее 3:1. Полученный в результате вектор секвенировали, чтобы подтвердить правильность последовательности. Антиген был получен следующим образом: Электрокомпетентные TG-1-клетки прекультивировали в 10 мл 2TY, Amp, 1% глюкозы электропорировали в присутствии 1 мкл ДНК Miniprep антигена 11 А 12. Затем прекультуру разбавляли 1:100 (8 мл в 800 мл 2TY, Amp, 0,1% Glucose) и растили до оптической плотности OD 600 порядка 0,4-0,6, а затем в течение ночи индуцировали под действием IPTG. На следующий день клетки осаждали, а супернатант фильтровали (Millipore 0,22 мкм). После центрифугирования и осветления культурального бульона 11 А 12 очищали на колонке Hitrap жидкостной хроматографии быстрого разрешения, FPLC. Никелевую(Ni)-колонку регенерировали следующим образом: колонку промывали 5 объемами колонки (CV) H2O,затем ее обрабатывали 3CV 0,5 М ЭДТА/0,2 М Tris, pH 8, чтобы смыть с колонки следы старого никеля. После этого колонку промывали 5CV Н 2 О. Потом на колонку наносили 2CV 100 мМ NiSO4, a после этого колонку промывали несколькими объемами CV Н 2 О. После этого колонку уравновешивали 5CV лизирующего буфера (20 мМ имидазол/250 мМ NaCl/PBS pH 7,4). Клеточный лизат фильтровали (Millipore 0,45 мкм) и наносили на колонку (вручную). Затем колонку вновь возвращали в систему FPLC, и через нее пропускали лизирующий буфер до тех пор, пока не устанавливался стабильный(константный) UVсигнал (приблизительно 3 CV). Затем запускали программу элюции: градиент от 0 до 100% элюирующего буфера (400 мМ имидазол/250 мМ NaCl/PBS pH 7,4) в 5CV. Фракции, содержащие элюированный антиген, собирали и диализовали в PBS в течение ночи. Экспрессия и очистка анти-ED-А-антител Анти-ED-А-антитела экспрессировали и подвергали очистке следующим образом: Электрокомпетентные TG-1-клетки прекультивировали в 10 мл 2TY, Amp, 1% глюкозы электропорировали в присутствии 1 мкл ДНК Miniprep одного из анти-ED-А-антител. Затем прекультуру разбавляли 1:100 (8 мл в 800 мл 2TY, Amp, 0,1% Glucose) и растили до оптической плотности OD 600 порядка 0,4-0,6, а затем в течение ночи индуцировали под действием IPTG. На следующий день клетки осаждали, а супернатант фильтровали (Millipore 0,22 мкм). scFv очищали на колонке с протеин А-сефарозой и использовали триэтиленимин для элюции scFv с колонки. Фракции, содержащие scFv, диализовали в PBS в течение ночи при 4 С. Фракции scFv были затем нанесены на колонку Супердекс-75, их смывали буфером PBS, протекающем со скоростью 0,5 мл/мин, и собирали фракции объемом по 0,25 мл. Мономерные фракции были использованы в BIAcore-анализе.BIAcore-чип промывали в течение ночи со скоростью потока 5 мкл/мин буфером HBS-EP,BIACORE, 0.01 М Hepes, pH 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактантом Р 20 (этот же самый буфер использовали и для анализа). Антиген (11 А 12) разбавляли до концентрации 50 мкг/мл в ацетатном буфере (рН 4,0), и СООН-группы на чипе активировали путем инъекции 50 мкл смеси N-гидроксисукцинимида (NHS) и этил-N-(диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). 40 мкл антигена 11 А 12 наносили на чип путем инъекции и остаточные свободные СООН-группы блокировали 30 мкл этаноламина. После фильтрации через фильтр с порами в 0,22 мкм, по 20 мкл индивидуального бактериального супернатанта наносили на чип, в режиме реального времени производили мониторинг взаимодействия с антигеном.BIAcore-анализ 2 Значения kon, koff и KD родительского анти-ED-А-антитела и анти-ED-А-антител В 2, С 5, D5, С 8, F8,В 7 и G9 оценивали, используя метод резонанса поверхностного плазмона. Чип уравновешивали в течение ночи тем же самым буфером, который использовали и для анализа, со скоростью потока 5 мкл/мин. Всю процедуру покрытия осуществляли при этой скорости потока. Антиген 11 А 12 разбавляли 1:25 ацетатным буфером, рН 4,00 (предоставленным компанией BIACORE), до конечной концентрации 20 мкг/мл. Затем смешивали NHS и EDC и 50 мкл смеси инъецировали для активации СООН-групп на чипе CMS. Затем следовала инъекция 40 мкл антигена (это происходило приблизительно в течение 40). Затем инъецировали 30 мкл этаноламина, чтобы блокировать реактивность возможных свободных СООН-групп. Каждый образец анализировали при скорости потока 20 мкл/мин. 20 мкл неразбавленного мономерного белка (полученного после гель-фильтрации) наносили путем инъекции. Время диссоциации составляло приблизительно 200. Затем 10 мкл 10 мМ HCl наносили путем инъекции для регенерации чипа. Инъекцию мономерного белка повторяли при различных разведениях, т.е. после разведения 1:2 (в PBS) следовала регенерация под действием HCl. Затем производили третью инъекцию белка, при разведении 1:4, после чего вновь следовала регенерация под действием HCl. Значения kon, koff и KD для каждого антиED-A-антитела оценивали с помощью программного обеспечения BIAevaluation. Гистохимия Чтобы проконтролировать успешность биотинилирования in vivo, осуществляли последующее окрашивание биотинилированных структур, как описано в литературе (Pybak et al. 2005). Делали срез(10 мкм) свежезамороженных образцов, фиксировали ацетоном, последовательно инкубировали с комплексом стрептавидина: биотинилированной щелочной фосфатазы (Biospa, Milano, Italy) и с реагентомFast-Red TP (Sigma) [в присутствии 1 мМ левамизола для ингибирования эндогенной щелочной фосфатазы] и производили контрастное докрашивание раствором гематоксилина (Sigma). Иммуногистохимическое окрашивание scFv-антителами, несущими FLAG-метку, было осуществоено так, как описано выше (см., например, Brack et al. 2006). Вкратце, срезы инкубировали одновременно в присутствии фрагментов scFv (в конечной концентрации 2-10 мкг/мл) и моноклонального антиFlag-антитела М 2. Связанные антитела детектировали с помощью кроличьего антитела против мышиного иммуноглобулина (Dakocytomation, Glostrup, Denmark), а затем комплекса щелочной фосфатазы и мышиного моноклонального антитела против щелочной фосфатазы (Dakocytomation). Реагент Fast Red(Sigma) был использован в качестве субстрата фосфатазы и производили контрастное докрашивание срезов раствором гематоксилина (Sigma). Все срезы закрепляли с использованием Glycergel (Dakocytomation, Glostrup, Denmark) и изучали под микроскопом Axiovert S100 TV (Carl Zeiss, Feldbach, Швейцария) с использованием программного обеспечения Axiovision software (Carl Zeiss).In vivo нацеливание анти-ED-А-антителом Родительское анти-ED-А-антитело scFv метили коммерчески доступным производным инфракрасного флюорофора Alexa Fluor 750, сукцинидидиловым эфиром карбоновой кислоты (Invitrogen) согласно рекомендуемой методике. Меченое антитело отделяли от непрореагировавшего красителя путем гельфильтрации на колонке PD-10 (GE Healthcare). Уровень окрашивания, оцениваемый в соответствии с методикой окрашивания, рекомендуемой компанией Invitrogen, составлял 5 молекул красителя на одну молекулу антитела. Alexa 750-меченное родительское анти-ED-А-антитело scFv (в конечной концентрации 0,3 мг/мл) инъецировали (200 мкл/мышь, т.е. 60 мкг антитела/мышь) в хвостовую вену мышей Svl90 через 3 недели после инъекции опухолевых клеток F9DR. Мышиные органы извлекали через 6 ч после инъекции меченого антитела, и получали изображение с помощью самодельного устройства для визуализировали инфракрасной флуоресценции (Birchler et al. 1999), снабженного вольфрамовой галогеновой лампой, специальными для Alexa 750 фильтрами для спектров возбуждения и эмиссии, а также монохроматической CCD-камерой. Биораспределение димерного антитела F8 Димерное антитело F8 содержит одинаковые VH- и VL-домены, как и анти-ED-А-антитело F8, например, как в используемом scFv-формате. Димерное антитело F8 и анти-ED-А-антитело scFv F8 имеют различные линкерные последовательности между VH- и VL-доменами. Аминокислотной последовательностью линкера димерного антитела F8 является GSSGG (SEQ ID NO: 28) (нуклеотидная последовательность: gggtccagtggcggt [SEQ ID NO: 29]). Следовательно, последовательность линкера димерного антитела F8 насчитывает в длину пять аминокислот, в то время как в анти-ED-А-антителе scFv F8 длина линкера составляет 20 аминокислот (см. SEQ ID NO: 11). Сокращение длины линкера между VH- и VLдоменами означает, что межмолекулярное, а предпочтительно внутримолекулярное спаривание VH- иVL-доменов является предпочтительным. Следовательно, VL-домен одного полипептида F8 с большей вероятностью будет спариваться с VH-доменом другого полипептида F8, чем с VH-доменом того же самого полипептида F8. Димерное антитело F8 экспрессировали в TG1-клетках Е. coli следующим образом: ДНК, кодирующую димерное антитело F8, вводили в электрокомпетентные TG1-клетки Е. coli методом электропорации. Подвергнутые электропорации клетки Е. coli прекультивировали в 10 мл среды 2YT, Amp, 1% глюкозы. Прекультуру разбавляли 1:100 800 мл среды 2YT, Amp, 0,1% глюкозы, и культуру растили до оптической плотности OD 600 порядка 0,6. Затем экспрессию димерного антитела F8 индуцировали, используя 1 мМ IPTG. Экспрессированное димерное антитело F8 метили 125I следующим образом: 10 мкл стерильного PBS добавляли в пробирку с йодогеном (покрытую 50 мкл 0,1 мг/мл йодогена в хлороформе), затем добавляли 2 мкл 125I-натрий-йодида (200 мкКи) и инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин. Затем 400 мкл димерного антитела F8 при оптической плотности OD порядка 0,2 (60 мкг) добавляли к пробирке с йодогеном, инкубировали при комнатной температуре в течение 25 мин. Эту смесь в разведении 1/100 собирали с целью определения радиоактивности, содержащейся в этой смеси (обозначается как "INPUT"). Потом меченое димерное антитело F8 наносили на колонку эксклюзионной хроматографии (PD10: Сефадекс G-25 M, GE Healthcare), с тем, чтобы отделить йодированное димерное антитело F8 от свободного йода. Измеряли радиоактивность йодированного димерного антитела F8, и вычисляли процент йода, включенного в димерное антитело F8 (СРМ [импульсы в минуту] йодированного димерного антитела F8/CPM INPUT), составлявший от 30 до 40%. Четырем мышам-носителям опухоли F9 давали раствор Люголя в течение 2 дней (600 мкл в 300 мл), чтобы блокировать щитовидную железу, и каждую из этих мышей внутривенно инъецировали 200 мкл йодированного димерного антитела F8 (приблизительно 5-8 мкг йодированного димерного антитела F8 [18 мкКи] на мышь). Через 24 ч мышей умерщвляли, а опухоль, печень, легкие, селезенку, сердце, почки, кишечник, хвост и кровь извлекали (в контексте настоящего изобретения обобщенно обозначаются как мышиные "ткани") и использовали для подсчета радиоактивности. Уровень радиоактивности в каждом образце ткани измеряли на гамма-счетчике Perkin. "Выведение" рассчитывали путем деления процента инъецированной дозы (в СРМ) на вес этой ткани (в граммах) (% ID/г). Результаты Идентификация по-разному экспрессированных белков и варианты сплайсинга Химические методы протеомики на основе перфузии, используемые для сравнительного анализа доступных для этого белков в печени и в печеночных метастазах F9 (Terrana et al. 1987), изображены на фиг. 1 А. Эти опухоли порождают обширные очаги метастазирования на поверхности и внутри мышиной печени (фиг. 1 В). Под действием терминальной анеснезии мышей-опухоленосителей перфузировали 15 мл 1,8 мМ раствора сульфосукцинимидил-6-[биотинамидо]гексаноата (1 мг/мл) в PBS, рН 7,4, обогащенного 10% декстраном-40 в качестве вещества, увеличивающего объем плазмы крови. Эта процедура,которая обычно длилась 10 мин, позволяла удалить кровь из всех органов главного круга кровообращения и произвести селективное биотинилирование доступных белков, как в просвете сосудов, так и на аблюминальной области кровеносных сосудов. Фактически в результате этой процедуры все кровеносные сосуды печеночных метастазов F9 оказываются эффективно и селективно окрашенными, как было подтверждено последующим гистохимическим окрашиванием конъюгатами стрептавидина со щелочной фосфатазой (фиг. 1 С). В нормальной печени кровеносные сосуды были окрашены сильно, но имело место также и включение метки некоторыми синусоидными капиллярами, сходное с физиологической фильтрующей функцией печени (фиг. 1 С). Биотинилирование in vivo гасилось в результате перфузирования раствором, содержащим первичные амины. Впоследствии образцы печеночных метастазов отделяли от печени, гомогенизировали и использовали для восстановления биотинилированных белков в присутствии сильного детергента ДСН путем аффинной хроматографии на стрептавидиновой смоле (фиг. 1 А). Чтобы минимизировать риск, связанный с возможной диффузией белков в печени хозяина, печень, полученную из здоровых in vivo биотинилированных мышей, использовали для изучения кровеносных сосудов нормальной печени. Использование печени хозяина из мышей-носителей опухоли F9, тоже является проблематичным в силу того, что остается мало остаточной здоровой ткани, а также еще и потому, что на макроскопическом уровне трудно исключить наличие в ней микроскопических метастазов. В итоге для протеомного анализа были в общей сложности использованы образцы из 7 биотинилированных in vivo здоровых мышей и из 9 in vivo биотинилированных мышей-носителей опухоли F9. Кроме того, образцы из 2 здоровых и 3 небиотинилированных мышей-носителей метастазов были использованы в качестве отрицательного контроля. В результате после проведения стадий интенсивного промывания и триптического переваривания на смоле стрептавидинсвязанных белков из метастазов F9 и нормальной печени (полученных параллельно) была получена коллекция пептидов, которые можно было отделить, идентифицировать и сравнить, используя методы нано-ВЭЖХ и MALDI-TOF/TOF- масс-спектрометрии (Roesli et al. 2006). В итоге в общей сложности было идентифицировано различных пептидов в количестве 1291 (уровень значимости, по Mascot, составляет 95%), эти пептиды были сгруппированы с помощью системы программного обеспечения Mascot в 480 наборов разных пептидов. Несколько из этих пептидных наборов было обнаружено также и в образцах отрицательного контроля, полученных из небиотинилированных мышей (наподобие карбоксилаз, которые несут эндогенный биотин в качестве кофактора, кератины в качестве примесей или же белки, представленные в большом изобилии, такие как сывороточный альбумин). Из оставшихся 435 идентифицированных пептидных наборов 331 набор можно было однозначно отнести, на основании анализа с использованием системы программного обеспечения Mascot, к одному белку, тогда как 104 пептидных набора было отнесено к множественным (всего до 358) белкам. В большинстве случаев множественные белки, отнесенные к одному и тому же пептидному набору, принадлежат семейству родственных белков (например, иммуноглобулины) или даже могут относиться к одинаковым белкам с различными входными записями в базе данных. Из 435 разных пептидных наборов 117 были обнаружены исключительно в образцах с метастазами, 193 - только в образцах здоровой печени и 125 - в обоих типах тканей. Например, пептиды, соответствующие фибронектину (номер доступа Р 11276 в Национальном центре биотехнологической информации [NCBI]), были обнаружены в четырех образцах здоровой печени и восьми образцах с метастазами. Белки, обнаруженные как в образцах здоровой печени, так и в образцах с метастазами (например,фибронектин), могут присутствовать в этих двух разных типах образцов в существенно отличающихся количествах. В противном случае это должно отражаться на количестве образцов, в которых эти белки были детектированы, и/или на количестве пептидов (также как и на нормализованной интенсивности пептидных сигналов; (Scheurer et al. 2005, Scheurer et al. 2005, наблюдаемых в образцах печени и метастазов. Например, 38 триптических пептидов фибронектина (номер доступа Р 11276 в NCBI) было обнаружено только в образцах с метастазами, тогда как один пептид был обнаружен только в образцах здоровой печени. Одиннадцать пептидов было обнаружено в образцах обоих типов. Исключительное изобилие полученных из фибронектина пептидов, обнаруженных в печеночных метастазах, несмотря на тот факт, что печень является местом биосинтеза фибронектина, побудило авторов изобретения изучить различия в относительной степени изобилия пептидов и избыточной экспрессии доменов, полученных в результате альтернативного сплайсинга. В табл. 1 перечислены все фибронектиновые пептиды, идентифицированные методами протеомики. Мышиный фибронектин содержит два глобулярных экстрадомена типа III, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу: ED-A и ED-B(ffrench-Constant, 1995, Hynes, 1990, Kaspar et al. 2006). Кроме того, у мышей и человека сегмент IIICS подвергается разным схемам сплайсинга. Интересно то, что все три полученных из ED-A пептида, также как и пептиды, полученные из сегмента IIICS, были обнаружены только в опухолевых образцах. Пептиды, полученные из ED-B, не должны быть видимы при этом анализе, поскольку ED-B не содержит лизиновых остатков, а два аргинина служат причиной того, что образующиеся пептиды имеют слишком большой размер для того, чтобы их можно было детектировать. На фиг. 2 А на основе структуры фибронектиновых доменов показана локализация пептидов, идентифицированных в опухолевых образцах (Опухоль) и в образцах здоровой печени (Норма). На фиг. 2 В показана относительная интенсивность нормализованных MS-сигналов для двух пептидов-производных фибронектина: пептидIAWESPQGQVSR (SEQ ID NO: 16), который локализован внутри ED-A-домена, и пептидFLTTTPNSLLVSWQAPR (SEQ ID NO: 15), который локализован в домене 14. Последний пептид в большем количестве представлен в образцах с метастазами, но при этом он четко детектировался также и в эквивалентных образцах нормальной печени. В отличие от этого производные пептидов ED-A-домена дают четкие сигналы в областях метастазирования, но совсем не детектируются в нормальной печени(т.е. интенсивность сигнала ослаблена более чем в 100 раз). Иммуногистохимия Наиболее разительные различия между печеночными структурами и метастатическими новообразованными сосудами наблюдались на уровне ED-A- и ED-B-доменов фибронектина. В случае обоих доменов наблюдалось сильное и специфическое окрашивание метастатических кровеносных сосудов, тогда как в нормальной печени и фактически во всех нормальных органах (за исключением эндометрия в пролиферативной фазе и некоторых сосудов яичников) ответ всех иммуногистохимических анализов был отрицательным (фиг. 3 А). Важно также и то, что была обнаружена выраженная экспрессия ED-A в новообразованных сосудах в легочных метастазах и в печеночных метастазах у человека (фиг. 4). Нацеливание in vivo Для того чтобы проверить применимость ED-A в качестве мишени при лигандсвязанном нацеливании на метастазы, был предпринят эксперимент по нацеливанию in vivo с использованием метода визуализации флуоресценции в ближней инфракрасной области спектра. Родительское антитело метили флюорофором Alexa Fluor 750 и внутривенно инъецировали мышам-носителям метастазов F9. На извлеченных органах методом визуализации флуоресценции в ближней инфракрасной области спектра было продемонстрировано выраженное накопление вещества направленного действия в областях образования метастазов (фиг. 3 В). Селекция анти-ED-А-антителBIAcore-анализ 1 В результате проведения BIAcore-анализа получали график для каждого анти-ED-А-антитела, из которого путем анализа выводили уровень аффинности антитела в отношении конкретного антигена следующим образом: ось X на каждом графике соответствует времени, а ось Y соответствует резонансным единицам (Resonance Units, величина, которая характеризует аффинность связывания тестируемым антителом антигена, нанесенного на BIAcore-чип). На каждом графике обнаруживалось 3 пика и 1 минимум,которые соответствуют сменам буфера и, следовательно, никакого отношения к интерпретации полученных результатов не имеют. Восходящая часть кривой на каждом графике соответствует ассоциативной фазе. Чем отвеснее(круче) кривая в этой части графика, тем быстрее происходит ассоциация антитела с антигеном. Нисходящая часть каждого графика соответствует фазе диссоциации комплекса антиген-антитело. Чем кривая в этой части графика более пологая, тем медленнее диссоциация комплекса антиген-антитело. Все анти-ED-А-антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, B7, Е 8 и G9 давали более пологую кривую диссоциации, чем родительское анти-ED-А-антитело, из которого были получены указанные антитела,что указывает на то, что они связываются с ED-A, а следовательно, также и с A-FH, с большей аффинностью, чем родительское анти-ED-А-антитело. Графики, полученные для антител Е 5, F1, F8 и H1, соответствуют наиболее пологим кривым диссоциации из всех тестируемых в настоящем изобретении антиED-A-антител. Кривые ассоциации антител H1, С 5, D5, Е 5, С 8, F8 и F1 были более пологими, чем кривые, соответствующие родительскому анти-ED-А-антителу, тогда как кривые ассоциации, наблюдаемые в случае антител В 2, В 7, Е 8 и G9, оказались столь же крутыми, сколь и кривые ассоциации, наблюдаемые в случае родительского анти-ED-А-антитела. Однако поскольку для BIAcore-анализа антител H1,В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9 были использованы бактериальные супернатанты IPTGиндуцированных TG-1-клеток Е. coli, концентрация антител в тестируемых образцах была неизвестна, но она, вероятнее всего, была ниже, чем концентрация родительского анти-ED-А-антитела, используемого для сравнения. Следовательно, кривые ассоциации антител H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9 могли оказаться искусственно занижены из-за низких концентраций антител в образцах, используемых вBIAcore-анализе. Однако поскольку в BIAcore-анализе концентрация незначительно влияет на процесс диссоциации антитела от его антигена-мишени, пологие кривые диссоциации, наблюдаемые в случае антител H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9, показывают, что эти антитела связываются с ED-A по меньшей мере с равной, а вероятно, и с большей аффинностью, нежели родительское анти-ED-А- 25018985 антитело. Следовательно, с очень большой вероятностью, анти-ED-А-антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8,F8, F1, В 7, Е 8 и G9 дадут такие же или даже лучшие результаты, чем родительское анти-ED-А-антитело,если их использовать в одних и тех же исследованиях in vivo и иммуногистохимических исследованиях,проводимых, как в настоящем изобретении уже было описано, с использованием родительского антиED-А-антитела. Следовательно, данные, полученные при исследованиях in vivo и иммуногистохимических исследованиях с использованием родительского анти-ED-А-антитела, доказывают, что анти-ED-Аантитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9 могут быть использованы для лечения опухолевых метастазов.BIAcore-анализ 2 Значения kon, koff и KD для каждого анти-ED-А-антитела оценивали с помощью программного обеспечения BIAevaluation. Значения kon, koff и KD родительского анти-ED-А-антитела и анти-ED-A-антител В 2, С 5, D5, С 8, F8, В 7 и G9 в отношении антигена 11 А 12 подробно представлены в табл. 3. Все анти-EDА-антитела В 2, С 5, D5, С 8, F8, В 7 и G9 имеют лучшие показатели KD в отношении антигена 11 А 12 по сравнению с родительским анти-ED-A-антителом, из которого они получены, и это свидетельствует о том, что они связываются с ED-A, а следовательно, также и с А-FN, с большей аффинностью, чем родительское анти-ED-А-антитело. Следовательно, можно сделать заключение, что, анти-ED-A-антитела H1,В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9 с исключительно большой вероятностью дадут такие же или даже лучшие результаты, чем родительское анти-ED-А-антитело, если их использовать в одних и тех же исследованиях in vivo и иммуногистохимических исследованиях, проводимых, как в настоящем изобретении уже было описано, с использованием родительского анти-ED-А-антитела. Следовательно, данные,полученные при исследованиях in vivo и иммуногистохимических исследованиях с использованием родительского анти-ED-A-антитела, являются доказательством того, что анти-ED-А-антитела В 2, С 5, D5,Е 5, С 8, F8, В 7 и G9 могут быть использованы для лечения опухолевых метастазов. Биораспределение димерного антитела F8 Процент от инъецированной дозы (ID) I125-меченного (йодированного) димерного антитела F8, определяемый на грамм (г) мышиной ткани, был очень сходным для печени, легких, селезенки, сердца, почек, кишечника, хвоста и крови, и во всех этих тканях, за исключением почечной, он составлял менее 2%ID/г (фиг. 8). В противоположность этому, опухоли F9 содержали в среднем приблизительно в четыре раза больший процент ID, чем любая другая из мышиных тканей, которые были подвергнуты анализу(фиг. 8). Это свидетельствует о том, что димерное антитело F8 было выборочно нацелено на мышиные опухоли. Процент ID, который был детектирован в остальных тканях, скорее всего, представляет собой фоновый уровень димерного антитела F8, присутствующий в организме мышей, или неспецифическое окрашивание остальных мышиных тканей. Как указано в настоящем описании, эксперименты по биораспределению были проведены на четырех мышах, и хотя процент ID, детектируемый на мышиную ткань,варьировал (см. пределы разброса ошибок на фиг. 8), процент димерного антитела F8, детектируемый в опухолях F9, был существенно выше, чем в любой из остальных тестируемых мышиных тканей. Исследование биораспределения проводили на первичных опухолях F9, и полученные результаты показали, что анти-ED-A-антитела согласно настоящему изобретению были избирательно нацелены на опухолевую ткань in vivo. Эти результаты являются дополнительным свидетельством в пользу того, что анти-ED-A-антитела согласно изобретению, как уже было отмечено в настоящем описании, могут быть использованы для достижения таких же или же лучших результатов, при их использовании в рамках одного и того же исследования in vivo и иммуногистологического исследования, чем результаты, полученные при использовании родительского анти-ED-А-антитела. Секвенирование Все анти-ED-А-антитела H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, B7, Е 8 и G9 являются scFv-антителами, и они были секвенированы с использованием стандартных методов. Нуклеотидная последовательность анти-ED-А-антитела H1 представлена на фиг. 6. Аминокислотная последовательность анти-ED-Аантитела HI1 представлена на фиг. 7. Предпочтительные нуклеотидные последовательности, кодирующие VH- и/или VL-домены антиED-А-антител В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9, идентичны нуклеотидным последовательностям,кодирующим VH- и/или VL-домены анти-ED-А-антитела H1, за исключением того, что нуклеотидные последовательности, кодирующие области CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи антитела H1, заменены перечисленными в табл. 2 нуклеотидными последовательностями, кодирующими области CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи соответствующего антитела. Некоторые предпочтительные нуклеотидные последовательности, кодирующие VH- и/или VLдомены анти-ED-A-димерного антитела F8, идентичны нуклеотидным последовательностям, кодирующим VH- и/или VL-домены анти-ED-A-антитела H1, за исключением того, что нуклеотидные последовательности, кодирующие области CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи антитела H1, заменены перечисленными в табл. 2 нуклеотидными последовательностями, кодирующими области CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи анти-ED-A-димерного антитела F8. Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей линкер, соединяющий VH- и VL-домены анти-ED-А-димерного антитела F8,является последовательность gggtccagtggcggt (SEQ ID NO: 29). Анти-ED-А-антитела В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8 и G9 имеют аминокислотные последовательности, идентичные аминокислотным последовательностям анти-ED-А-антитела H1, за исключением того, что аминокислотные последовательности областей CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи антитела H1 заменены перечисленными в табл. 2 аминокислотными последовательностями областей CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи соответствующего антитела. Аминокислотные последовательности VH- иVL-доменов анти-ED-А-димерного антитела F8 идентичны аминокислотным последовательностям антиED-A-антитела H1, за исключением того, что аминокислотные последовательности областей CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи антитела H1 заменены перечисленными в табл. 2 аминокислотными последовательностями областей CDR1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи анти-ED-А-антитела F8, а аминокислотная последовательность линкера в антителе Н 1 заменена линкерной аминокислотной последовательностью GSSGG (SEQ ID NO: 28). Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-A-антитела В 2 (SEQ ID NO: 21) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что VH-домен анти-ED-А-антитела Н 1 заменен последовательностью SEQ ID NO: 23. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела С 5 (SEQ ID NO: 41) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена анти-ED-А-антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 43. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-A-антитела D5 (SEQ ID NO: 51) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 53. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-A-антитела Е 5 (SEQ ID NO: 61) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 63. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела С 8 (SEQ ID NO: 71) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 73. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела F8 (SEQ ID NO: 81) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена в нем последовательностью SEQ ID NO: 83. VHдомены анти-ED-А-димерного антитела F8 имеют ту же самую аминокислотную последовательность,что и VH-домен анти-ED-А-антитела scFv F8 (т.е. SEQ ID NO: 81). Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела F1 (SEQ ID NO: 91) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 93. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела В 7 (SEQ ID NO: 101) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 103. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела Е 8 (SEQ ID NO: 111) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 113. Аминокислотная последовательность VH-домена анти-ED-А-антитела G9 (SEQ ID NO: 31) идентична аминокислотной последовательности VH-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VH-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 33. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела В 2 (SEQ ID NO: 22) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 26. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела С 5 (SEQ ID NO: 42) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела HI, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 46. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела D5 (SEQ ID NO: 52) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 56. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела Е 5 (SEQ ID NO: 62) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того, чтоCDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 66. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела С 8 (SEQ ID NO: 72) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 76. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела F8 (SEQ ID NO: 82) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того, чтоCDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 86. VL-домены антиED-А-димерного антитела F8 имеют ту же самую аминокислотную последовательность, что и VL-домен анти-ED-А-антитела F8 (т.е. SEQ ID NO: 82). Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела F1 (SEQ ID NO: 92) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того, чтоCDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 96. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела В 7 (SEQ ID NO: 102) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 106. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела Е 8 (SEQ ID NO: 112) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID 116. Аминокислотная последовательность VL-домена анти-ED-А-антитела G9 (SEQ ID NO: 32) идентична аминокислотной последовательности VL-домена анти-ED-А-антитела H1, за исключением того,что CDR1-область VL-домена антитела H1 заменена последовательностью SEQ ID NO: 36. Хоть и необязательно, но аминокислота в 5-ом положении VH-домена анти-ED-А-антител H1, В 2,С 5, D5, Е 5, С 8, F8, Fl, B7, Е 8, G9 может быть лейциновым остатком (L), а не валиновым остатком (V),как показано на фиг. 7 А. Помимо этого, или альтернативно, аминокислота в 18-ом положении VL-домена анти-ЕО-А-антител H1, В 2, С 5, D5, Е 5, С 8, F8, F1, В 7, Е 8, G9 может быть аргининовым остатком (R), а не лизиновым остатком (K), как показано на фиг. 7 С. Список литературы Все ссылки, повсеместно используемые в настоящем описании, включая и те, которые были цитированы выше, во всей полноте включены в настоящее описание.