Апоптин-ассоциированный белок

005933 Настоящее изобретение относится к области апоптоза. Апоптоз представляет собой активный и программируемый физиологический процесс для удаления избыточных, измененных или злокачественных клеток (Earnshaw, 1995, Duke et al., 1996). Апоптоз характеризуется сжатием клеток, сегментацией ядра, конденсацией и расщеплением ДНК на фрагменты с размерами доменов, у большинства клеток за этим следует внутринуклеосомная деградация. Апоптические клетки разделяются на окруженные мембранами апоптические тельца. Наконец, соседние клетки и/или макрофаги будут быстро фагоцитировать эти умирающие клетки (Wyllie et al., 1980, White, 1996). Клетки, выращенные в условиях культуральной среды, и клетки из материалов тканей могут анализироваться на предмет того, являются ли они апоптотическими, с помощью агентов, окрашивающих ДНК, таких как, например, DAPI, который сильно и равномерно окрашивает нормальную ДНК, в то время как апоптотическая ДНК окрашивается слабо и/или неравномерно (Noteborn et al., 1994, Telford et al., 1992). Процесс апоптоза может инициироваться с помощью разнообразных регуляторных стимулов (Wyllie, 1995, White 1996, Levine", 1997). Изменения в количестве выживших клеток играют важную роль в патогенезе заболеваний человека, например, при развитии злокачественных опухолей и аутоимунных заболеваний, где наблюдается ускоренная пролиферация или замедленное умирание клеток (Кеrr et al.,1994, Paulovich, 1997). Продемонстрировано, что различные химиотерапевтические соединения и излучение индуцируют апоптоз в клетках опухоли, во многих случаях, с помощью белка р 53 дикого типа (Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995, McDonell et al., 1995). Многие опухоли, однако, приобретают мутацию относительно р 53 во время их развития, что часто коррелирует с плохой восприимчивостью к терапии злокачественных опухолей. Определенные трансформирующие гены туморогенных ДНК-вирусов могут инактивировать р 53,непосредственно связываясь с ним (Teodoro, 1997). Примером такого агента является супер-Т-антиген ДНК опухоли вируса SV40. Для нескольких (лейкозных) опухолей, высокий уровень экспрессии протоонкогена Всl-2 или Всr-abl ассоциируется с сильной устойчивостью к различным химиотерапевтическим агентам, индуцирующим апоптоз (Hockenberry 1994, Sachs and Lotem, 1997). Для таких опухолей с недостатком функционального р 53 (представляющих более чем половину от всех опухолей), разрабатываются альтернативные способы противоопухолевой терапии на основе индукции апоптоза, независимого от р 53 (Thompson 1995, Paulovich et al., 1997). Исследуются факторы,вовлеченные в индуцирование апоптоза, которые не требуют р 53 и/или не могут быть блокированы антиапоптотическими активными факторами, такими как факторы, подобные Всl-2 или Всr-ab1. Эти факторы могут быть частью отличного пути апоптоза или могут находиться (далеко) по ходу процесса, чем соединения, ингибирующие апоптоз. Апоптин представляет собой малый белок, полученный из вируса куриной анемии (CAV; Noteborn и De Boer, 1995, Noteborn et al., 1991, Noteborn et al., 1994; 1998a), который может индуцировать апоптоз у линий злокачественных и трансформированных клеток человека, но не у нетрансформированных культур клеток человека. In vitro апоптин не способен индуцировать программированную смерть клеток у нормальных лимфоидных, дермальных, эпидермальных, эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц. Однако когда нормальные клетки трансформируются, они становятся восприимчивыми к апоптозу с помощью апоптина. Долговременная экспрессия апоптина в нормальных фибробластах человека доказывает, что апоптин не имеет токсической или трансформирующей активности в этих клетках (Danen-vanOorschot, 1997 и Noteborn, 1996). В нормальных клетках, апоптин находится преимущественно в цитоплазме, в то время как в трансформированных или злокачественных клетках, то есть клетках, характеризуемых гиперплазией, метаплазией, дисплазией или аплазией, он находится в ядре, что доказывает, что локализация апоптина является связанной с его активностью (Danen-van Oorschot et al. 1997). Апоптин-индуцированный апоптоз происходит в отсутствие функционального р 53 (Zhuang et al., 1995a) и не может быть блокирован Bcl-2, Bcrab1 (Zhuang et al., 1995), или Bcl-2-ассоциированным белком BAG-1 (Danen-Van Oorschot, 1997 а, Noteborn, 1996). Следовательно, апоптин представляет собой терапевтическое соединение для селективного разрушения клеток опухолей, или другой гиперплазии, метаплазии, аплазии или дисплазии, особенно для тех клеток опухолей, которые становятся устойчивыми к (химио)терапевтической индукции апоптоза из-за недостатка функционального р 53 и (сверх)-экспрессии Bcl-2 и других апоптоз-ингибирующих агентов(Noteborn и Pietersen, 1998). Очевидно, что даже пред-злокачественные, минимально трансформированные клетки являются чувствительными к индуцирующему гибель воздействию апоптина. Кроме того,Noteborn и Zhang (1998) показали, что апоптин-индуцированный апоптоз может быть использован при диагностике склонных к малигнизации клеток и при лечении склонных к малигнизации клеток. Тот факт, что апоптин не индуцирует апоптоз у нормальных клеток человека, по крайней мере, неin vitro, показывает, что токсическое воздействие лечения апоптином in vivo будет очень низким. Noteborn и Pietersen (1998) и Pietersen et al. (1998) предоставили доказательства того, что экспрессируемый аденовирусом апоптин не имеет острого токсического воздействия in vivo. Кроме того, на мышах nude показано, что апоптин имеет сильную противоопухолевую активность.-1 005933 Однако для дальнейшего расширения ряда терапевтических соединений против злокачественных опухолей или против аутоиммунных заболеваний, доступных в данной области, являются желательными дополнительные терапевтические соединения, которые создаются, чтобы работать сами по себе, последовательно или вместе с апоптином, особенно в тех случаях, где р 53 является (частично) нефункциональным. Настоящее изобретение относится к новым возможностям терапии, например, новым способам сочетанной терапии или новым терапевтическим соединениям, которые могут работать сами по себе, последовательно, или вместе с апоптином, особенно в тех, где р 53 является (частично) нефункциональным. В первом воплощении, настоящее изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или ее функциональному эквиваленту или фрагменту, кодирующему апоптинассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз, сам по себе или в сочетании с другими индуцирующими апоптоз веществами, такими как апоптин. Белковое вещество здесь определяется как вещество, содержащее пептид, полипептид или белок, необязательно модифицированный, например,с помощью гликозилирования, миристилирования, фосфорилирования, добавления липидов, с помощью гомологической или гетерологической ди- или мультимеризации, или любых других (посттрансляционных) модификаций, известных в данной области. Апоптин-ассоциированный здесь определяется как принадлежащий к системе веществ, специфически вовлеченных в последовательность событий, находящихся в каскаде апоптоза, настолько, насколько он индуцируется апоптином, предпочтительно, к тем веществам, которые являются специфически вовлеченными в путь апоптоза, независимого от р 53. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или ее функциональному эквиваленту или фрагменту, кодирующему апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз. Более предпочтительно, кодируемое апоптин-ассоциированное белковое вещество локализуется совместно с другими веществами,индуцирующими апоптоз, например, с апоптином, когда оба индуцирующих апоптоз вещества присутствуют в одной и той же клетке. В нормальных нетрансформированных клетках оба индуцирующих апоптоз белка совместно локализуются в цитоплазме, в то время как в трансформированных или злокачественных клетках оба белка, индуцирующих апоптоз, совместно локализуются в ядре. В другом воплощении, апоптин-ассоциированное вещество является способным к связыванию с фактором транскрипции мышей YY1, который, как показано ранее, связывается с гомологом ААР-1 мышей RYBP (Garcia et al.,1999). В наиболее предпочтительном воплощении выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота или ее функциональный эквивалент или фрагмент, кодирующий апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз, получают из библиотеки кДНК, предпочтительно, библиотеки кДНК позвоночных, например, полученной от домашней птицы, но более предпочтительно, из библиотеки кДНК млекопитающих, где указанная библиотека кДНК предпочтительно содержит кДНК человека. В другом воплощении настоящее изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, или ее функциональному эквиваленту или фрагменту, кодирующему апоптинассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз, способное к гибридизации с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз, как показано на фиг. 1 или 2, в частности, кодирующей новый белок, способный вызывать апоптоз или его функциональный эквивалент или фрагмент, называемый апоптин-ассоциированный белок 1, сокращенно упоминаемый здесь как ААР-1. Разумеется, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, или ее функциональный эквивалент или фрагмент, кодирующий дополнительное апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное ассоциироваться с белком ААР-1, также предусматриваются здесь, средства и способы для получения такого дополнительного белка, расположенного в каскаде апоптина, следуют из подробного описания таковых, приведенного здесь. В частности, настоящее изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или ее функциональному эквиваленту или фрагменту, кодирующему апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз и являющееся, по меньшей мере, на 70% гомологичным, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичным молекуле нуклеиновой кислоты или ее функциональному эквиваленту, или функциональному фрагменту, кодирующему апоптинассоциированное белковое вещество, как показано на фиг. 1 или 2. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Примеры такого вектора приведены в подробном описании,представленном здесь, такого как вектор pMT2SM-AAP-1-а или b, вектор pMT2SM, экспрессирующий Мус-меченную кДНК ААР-1-а или AAP-1-b, плазмида, экспрессирующая фрагмент апоптинассоциированного белка, векторы сверхэкспрессии E.coli, такие как pMAL и рЕТ 22b, содержащие нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением, и так далее. Эти и другие векторы являются, например, пригодными для использования при нахождении дополнительных апоптин-2 005933 ассоциированных белковых веществ из системы, как определено выше, или для (сверх)экспрессии белка,кодируемого нуклеиновой кислотой, в соответствии с настоящим изобретением. Еще в одном воплощении настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением, указанный вектор, содержит носитель для доставки гена, делая настоящее изобретение очень полезным в генной терапии. Путем снабжения носителя для доставки гена нуклеиновой кислотой в соответствии с настоящим изобретением и путем нацеливания указанного носителя на клетку или клетки, которые являются сверхпролиферирующими и/или имеющими, как показано, пониженные скорости гибели, указанный носитель для доставки гена снабжает указанную клетку или клетки необходимыми средствами для апоптоза, обеспечивая далеко идущие терапевтические возможности. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Примеры включают трансформированные или трансфицированные клетки бактерий или дрожжей, как здесь описано в подробном описании. Предпочтительной является клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением, которая является трансформированной эукариотической клеткой, такой как клетка дрожжей или клетка позвоночного, такая как клетки млекопитающих или Cos, трансформированные или трансфицированные нуклеиновой кислотой или вектором в соответствии с настоящим изобретением. Такие клетки, как правило, являются способными экспрессировать или производить белковое вещество, способное вызывать апоптоз, со способностью ассоциироваться с апоптином. Настоящее изобретение, кроме того, относится к выделенному или рекомбинантному апоптинассоциированному белковому веществу, способному вызывать апоптоз. Как, например, показано здесь на фиг. 4, экспрессия такого апоптин-ассоциированного белкового вещества в клетках, таких как клетки опухолей, или другие сверх-пролиферирующие клетки, вызывает апоптотический процесс. Оно может это делать само по себе, или в присутствии других индуцирующих апоптоз веществ, таких как апоптин, а особенно тех, которые не зависят от р 53, показывая, что также и в тех случаях, где (функциональный) р 53 отсутствует, апоптоз может быть индуцирован с помощью вещества в соответствии с настоящим изобретением. Когда апоптин-ассоциированное белковое вещество, способное вызывать апоптоз, используется вместе с другим индуцирующим апоптоз веществом, например, апоптином, оба белковых вещества совместно локализуются в цитоплазме нормальных клеток и не приводят к апоптозу. При этом в трансформированных или в злокачественных клетках оба апоптоз-индуцирующих белка совместно локализуются в ядре и индуцируют апоптоз. Настоящее изобретение также относится к белковое вещество в соответствии с настоящим изобретением, которое связывается с фактором транскрипции YY1,который, как уже показано, связывается с гомологом ААР 1 мышей RYBP. В частности, настоящее изобретение относится к белковому веществу в соответствии с настоящим изобретением, кодируемому нуклеиновой кислотой в соответствии о настоящим изобретением, например, содержащему по меньшей мере часть последовательности аминокислот, как показано на фиг. 3, или его функциональный эквивалент или функциональный фрагмент, способный вызывать апоптоз сам по себе или в сочетании с другими индуцирующими апоптоз веществами, такими как апоптин. Настоящее изобретение также относится к выделенному или синтетическому антителу, специфическираспознающему белковое вещество или его функциональный эквивалент или функциональный фрагмент в соответствии с настоящим изобретением. Такое антитело может, например, быть получено путем иммунизации экспериментального животного с помощью апоптин-ассоциированного белкового вещества или его иммуногенного фрагмента, или эквивалента и отбора поликлональных антител у указанного иммунизированного животного (как показано здесь в подробном описании), или его можно получить с помощью других способов, известных в данной области, например, производства моноклональных антител, или (одноцепочечных) антител, или связывающихся белков, экспрессированных от рекомбинантной нуклеиновой кислоты, полученной из библиотеки нуклеиновых кислот, например, получают с помощью методик выявления с помощью фагов. С помощью такого антитела настоящее изобретение также относится к белковому веществу, специфически распознаваемому таким антителом в соответствии с настоящим изобретением, например, получаемому с помощью иммунопреципитации, вестерн-блоттинга, или других иммунологических методик,известных в данной области. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию нуклеиновой кислоты, вектора,клетки-хозяина, или белкового вещества в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования апоптоза, например, как показано на фиг. 4. В частности, такое использование предусматривается, когда указанный апоптоз является независимым от р 53. В частности, такое использование также предусматривается как дополнительно включающее использование нуклеиновой кислоты, кодирующей апоптин, или ее функционального эквивалента или фрагмента, или использование апоптина или его функционального эквивалента или фрагмента. Как можно увидеть на фиг. 4, объединение этих апоптин-индуцирующих веществ увеличивает процент апоптоза в обрабатываемых клетках опухоли. Такое использование, как предусматривается настоящим изобретением, является особенно полезным с терапевтической точки зрения. Настоящее изобретение предусматривает вместе с этим фармацев-3 005933 тическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяин или белковое вещество в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, такая фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предусматривается как дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую апоптин, или ее функциональный эквивалент или фрагмент, или апоптин, или его функциональный эквивалент или фрагмент. Такая фармацевтическая композиция, в частности, относится к индуцированию апоптоза, например,когда указанный апоптоз является независимым от р 53, для лечения заболевания, где наблюдается усиленная пролиферация клеток или замедленная гибель клеток, как происходит, как правило, в случае, когда указанное заболевание включает злокачественную опухоль или аутоиммунное заболевание. Вместе с тем, настоящее изобретение относится к способу для лечения индивидуального носителя заболевания,при котором наблюдается увеличение пролиферации клеток или замедление гибели клеток, включающий лечение указанного индивидуума фармацевтической композицией в соответствии с настоящим изобретением. В частности, эти композиции содержат фактор в каскаде апоптоза, который является специфичным для трансформированных клеток. Следовательно, эти композиции являются главными для новых способов лечения, но также и для диагностики заболеваний, связанных с отклонениями в апоптическом процессе, такими как злокачественная опухоль и аутоиммунные заболевания. В области диагностики настоящее изобретение относится к способу для детектирования присутствия злокачественных клеток или клеток, которые склонны к малигнизации, в клетках образца, включающему трансфицирование клеток в указанном образце с помощью нуклеиновой кислоты или вектора в соответствии с настоящим изобретением, культивирование указанных клеток и определение процента апоптоза клеток в указанном образце. Например, можно сделать вывод, что локализация в клетке ААР-1 является отличной в туморогенных/трансформированных клетках по сравнению с нормальными нетрансформированными клетками. Кроме того, аккумуляция ААР-1 в ядре коррелирует с индукцией апоптоза, в то время как локализация в цитоплазме коррелирует с жизнеспособностью клеток и нормальной пролиферативной способностью. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу для детектирования присутствия злокачественных клеток или клеток, которые являются склонными к малигнизации, в клетках образца, содержащего трансфицированные клетки, в указанном образце, с помощью нуклеиновой кислоты или вектора в соответствии с настоящим изобретением и определения локализации белкового вещества, полученного из указанной нуклеиновой кислоты или вектора в клетках в указанном образце. В частности, настоящее изобретение предусматривает, когда присутствие указанного белкового вещества в указанных клетках детектируется с помощью иммуноокрашивания указанных клеток с помощью антител, например, с помощью иммунофлуоресцентного анализа, или другого иммунного анализа, известного в данной области. Предпочтительно, указанное антитело включает антитело в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу для идентификации предполагаемого вызывающего злокачественная опухоль агента, такого, который трансформирует гены или функциональные фрагменты, включающий воздействие на клетки в образце указанного агента, например, с помощью трансфицирования, или просто доставляя агент в среду, окружающую клетки, и детектирование присутствия злокачественных клеток или клеток, которые склонны к малигнизации, в клетках образца с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением. Дополнительно, настоящее изобретение относится к способу для детектирования склонности клеток образца к малигнизации и, тем самым, для детектирования склонности к малигнизации индивидуума,от которого были получены эти клетки, включающий воздействие на указанные клетки агента, вызывающего злокачественную опухоль, такого как уф-свет, и детектирование присутствия злокачественных клеток или клеток, которые являются склонными к малигнизации, в клетках образца, с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение будет объясняться более подробно в следующем далее подробном описании, которое не ограничивает изобретение. Подробное описание Авторы используют двухгибридную дрожжевую систему (Durfee et al., 1993) для идентификации апоптин-ассоциированных клеточных соединений, которые являются главными при индуцировании апоптоза. Используемая система представляет собой стратегию in-vivo для идентификации белков человека, способных к физическому ассоциированию с апоптином. Она используется для анализа библиотек кДНК на наличие клонов, кодирующих белки, способные к связыванию с белком, представляющим интерес (Fields и Song, 1989, Yang et al., 1992). Настоящее изобретение относится к, например, новому апоптин-ассоциированному белку, один из которых назван апоптин-ассоциированный белок 1, сокращенно ААР-1. Настоящее изобретение также относится к способу для индуцирования апоптоза путем вмешательства в функцию этого недавно открытого белка ААР-1 или его функциональных эквивалентов или фрагментов, и/или индукцию апоптоза посредством (сверх)экспрессии ААР-1 или родственного гена или его функциональных эквивалентов или фрагментов.-4 005933 Настоящее изобретение также относится к противоопухолевой терапии, основанной на вмешательстве в функцию белков, подобных ААР-1, и/или его (сверх)экспрессию. Белки, подобные ААР-1, как правило, не присутствуют в очень больших количествах в иммортализованных линиях клеток. Следовательно, ненормально высокий уровень белков, подобных ААР-1, будет приводить к индуцированию процесса, обратного трансформации клеток, а именно апоптозу. Настоящее изобретение, кроме того, относится к медиатору апоптин-индуцированного апоптоза, который является опухоле-специфичным. Настоящее изобретение относится к терапии для злокачественных опухолей, аутоимунных заболеваний или родственных заболеваний, которая основывается на белках, подобных ААР-1, самих по себе или в сочетании с апоптином и/или с соединениями, подобными апоптину. Конструирование pGBT9-VP3 Для конструирования затравочной плазмиды, которая делает возможной идентификацию апоптинассоциированных белков посредством гибридной системы дрожжей-два, плазмида рЕТ-16b-VP3 (Noteborn, неопубликованные результаты) обрабатывается NdeI и BamHI. Фрагмент ДНК NdeI-BamHI длиной 0,4 т.п.н. выделяют из легкоплавкой агарозы. Плазмида pGBT9 (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto,USA) обрабатывается с помощью рестрикционных ферментов EcoRI и BamHI. Фрагмент ДНК длиной примерно 5,4 т.п.н. выделяют и присоединяют к линкеру EcoRI-NdeI и к фрагменту ДНК длиной 0,4 т.п.н., содержащему апоптин-кодирующие последовательности, начиная с его собственного кодона инициирующего ATG. Конечная конструкция, содержащая ген слияния последовательности GAL4 связывающего домена и апоптин под регуляцией промотора ADH дрожжей, называется pGBT-VP3 и, как доказано с помощью рестрикционно-ферментного анализа и секвенирования ДНК в соответствии с методом Зангера (1977), является правильным. Все стадии клонирования в основном осуществляются так, как описано Maniatis et al. (1992). Плазмида pGBT-VP3 очищается путем центрифугирования в градиенте CsCl и колоночной хроматографии вSephacryl S500 (Pharmacia). Библиотека кДНК, меченной по домену активации GAL4 Экспрессирующий вектор рАСТ, содержащий кДНК из В-клеток человека, трансформированных вирусом Эпштейн-Барр, полученный путем слияния с доменом транскрипционной активации GAL4, используется для детектирования апоптин-ассоциированных белков. Библиотека кДНК рАСТ получается из библиотеки кДНК лямбда-АСТ, как описано Durfee et al. 1993. Штаммы бактерий и дрожжей Штамм E.coli JM109 трансформировали плазмидами pGBT9 и pGBT-VP3. Штамм бактерий electromax/DH10B используют для трансформации, необходимой для извлечения апоптин-ассоциированных рАСТ-кДНК, и получают от GIBCO-BRL, USA. Штамм дрожжей Y190 используют для скрининга библиотеки кДНК и всех других трансформаций,которые являются частью используемой гибридной системы дрожжей два. Среды Для выбора лекарственных средств, чашки со средой Luria Broth (LB) для E.coli дополняют ампициллином (50 микрограмм на мл). Среды с дрожжами YPD и SC приготавливают так, как описано Rose etal. (1990). Трансформация компетентного штамма дрожжей Y190 с помощью плазмид pGBT-VP3 и рАСТкДНК, и скрининг на активность бета-галактозидазы Штамм дрожжей Y190 делается компетентным и трансформируется в соответствии со способами,описанными Klebe et al. (1983). Клетки дрожжей сначала трансформируются с помощью pGBT-VP3, а затем трансформируются с помощью рАСТ-кДНК, и эти трансформированные клетки дрожжей выращивают на безгистидиновых чашках, также не содержащих лейцина и триптофана. Фильтры Hybond-N накладываются на колонии дрожжей, которые являются гистидинпозитивными, и им дают возможность полностью намокнуть. Фильтры снимают и погружают в жидкий азот с целью пермеабилизации дрожжевых клеток. Фильтры оттаивают и кладут той стороной, которая соприкасалась с колониями, вверх, на бумагу Whattman 3MM в чашку Петри с Z-буфером (на литр: 16,1 гNa2HPO47H2O, 5,5 г NaH2PO4H2O, 0,75 г КСl и 0,246 г MgSO47H2O, рН 7,0), содержащим 0,27% бетамеркаптоэтанола и 1 мг/мл X-gal. Фильтры инкубируют в течение по меньшей мере 15 мин или в течение ночи. Выделение плазмид из дрожжей Объединенную ДНК из клеток дрожжей, которые являются гистидин- и бета-галактозидазаположительными, приготавливают с использованием метода глузулаза-щелочного лизиса, как описаноHoffman и Winston (1987) и используют для трансформирования бактерий Electromax/DH10B с помощью электропорации, используя Bip-Rad GenePulser в соответствии с указаниями производителя. Трансформанты помещают в планшеты на среды LB, содержащие антибиотик ампициллин. Выделение апоптин-ассоциированных клонов рАСТ Посредством анализа колоний на фильтре, колонии лизируются и гибридизуются с радиоактивномеченным 17-мерным олигомером, который является специфичным для рАСТ (см. также раздел Анализ-5 005933 последовательностей). Плазмида ДНК выделяется из рАСТ-клонов, и посредством расщепления XhoI анализируются на присутствие вставки кДНК. Анализ последовательностей Субклоны, содержащие последовательности, кодирующие апоптин-ассоциирующиеся белки, секвенируются с использованием дидезокси-NTP согласно методу Зангера, который производится Eurogentec,Seraing, Belgium. Используемый секвенируемый праймер представляет собой рАСТ-специфичный 17 мер, состоящий из последовательности ДНК 5'-TACCACTACAATGGATG-3'. Последовательности апоптин-ассоциирующейся кДНК сравнивают с известными генными последовательностями из EMBL/Genbank. Конструирование pMAL-AAP1 и рЕТ 22b-AАР 1 Для конструирования плазмид сверхэкспрессии белков, которые делают возможным производство и выделение апоптин-ассоциированного белка, используются плазмиды pMALTB и рЕТ 22b. ПлазмидpMALTB представляет собой производное pMAL-C2 (New England Biolabs), в котором сайт фактора Ха заменен сайтом тромбина. Плазмид pMALTB обрабатывают BamHI и SalI, и т.п.н. фрагмент ДНК длиной 7,0 выделяют из геля агароза/ТВЕ (набор для гель-экстракции QIAGEN). Последовательность ААР-1,кодирующая открытую рамку считывания, получают с помощью ПЦР на pACT-AAP-1b с помощью прямого праймера: 5'AACGGGATCCGGCGGCATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC 3' и обратного праймера: 5'AAAAGTCGACTCAGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACAT 3'; 0,7 т.п.н. ПЦР-фрагмент расщепляется с помощью BamHI и SalI, и выделяется из геля агароза/ТВЕ (набор для гель-экстракцииQIAGEN). Конечная конструкция, содержащая продукт слияния гена МBР и гена ААР-1 под регуляциейIPTG, индуцируемого tac промотором называют pMAL-AAP-1. Плазмида pET22b (Novagen) обрабатывается NdeI и NotI, и 5,5 т.п.н. фрагмент ДНК выделяют из геля агароза/ТВЕ (набор для гель-экстракции QIAGEN). Последовательность ААР-1, кодирующая открытую рамку считывания, получается с помощью ПЦР на pACT-AAP-1b с прямым праймером: 5' GGGAATTCCATATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC 3' и обратным праймером: 5' AAGGAAGTACGCGGCCGCGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACATGT 3' ; продукт PCR обрабатывают NdeI и NotI, и 0,7 т.п.н. фрагмент выделяют из геля агароза/ТВЕ (набор для гель-экстракции QIAGEN). Конечную конструкцию, содержащую продукт слияния гена ААР 1 и хвоста (His)6 под регуляцией индуцируемого IPTG Т 71 ас промотора, называют рЕТ 22b-ААР 1. Обе конструкции являются правильными, как показано с помощью рестрикционноферментативного анализа и секвенирования ДНК в соответствии с методом Зангера (1977). Все стадии клонирования осуществляются в основном так, как описано Maniatis et al. (1992). Штаммы бактерий для сверхэкспрессии МВР-ААР 1 и ААР 1-(His)6 Для производства белка с помощью плазмиды pMAL-AAP1 используется штамм Е. coli B834(DE3), а для плазмиды рЕТ 22b-ААР 1 используется штамм Е. coli BL21(DE3). Оба штамма получают отNovagen. Результаты и обсуждение Апоптин специфически индуцирует апоптоз в трансформированных клетках, таких как линии клеток, полученные из опухолей человека. Для идентификации основных соединений на этом каскаде специфичного к трансформации клеток и/или специфичного к опухоли апоптоза, проводится генетический скрининг с помощью дрожжей. Авторы используют библиотеку кДНК человека, которая базируется на векторе плазмиды рАСТ, содержащую полные копии кДНК, полученные из В-лимфоцитов человека,трансформированных вирусом Эпштейн-Барр (Durfee et al., 1993). Конструирование bait-плазмиды, экспрессирующей слитый генный продукт домена связывания ДНК GAL4 и апоптина Для изучения возможности существования апоптин-ассоциированных белков в библиотеке трансформированных/туморогенных кДНК человека, должна быть сконструирована так называемая baitплазмида. Для этой цели полная область кодирования апоптина, с примыкающими примерно 40 парами оснований вниз от гена апоптина клонируется на сайте многократного клонирования плазмида pGBT9. Конечная конструкция, называемая pGBT-VP3, анализируется с помощью рестрикционноферментативного анализа и секвенирования области слияния между апоптином и доменом связывания ДНК GAL4. Ген (фрагмент), кодирующий апоптин-ассоциированный белок, определяется путем трансактивацииGAL4-чувствительного промотора в дрожжах. Ген апоптина сливается с доменом связывания ДНК GAL4 плазмиды pGBT-VP3, при этом все кДНК, полученные из трансформированных В лимфоцитов человека, сливаются с доменом активацииGAL4 плазмиды рАСТ. Если одно из белковых веществ, кодируемых указанными кДНК, связывается с апоптином, домен связывания ДНК GAL4 будет находиться вблизи домена активации GAL4, что приводит к активации чувствительного к GAL4 промотора, который регулирует репортерные гены HIS3 и-6 005933 Клоны, дрожжей, содержащие плазмиду, экспрессирующую апоптин, и плазмиду, экспрессирующую фрагмент апоптин-ассоциированного белка, могут расти в безгистидиновой среде, и будут окрашиваться в голубой цвет при анализе с помощью бета-галактозидазы. Впоследствии, плазмида со вставкой кДНК, кодирующей апоптин-ассоциированный белок, может быть выделена и охарактеризована. Перед тем, как авторы смогут сделать это, они должны определить, что трансформация клеток дрожжей с помощью плазмиды pGBT-VP3, самой по себе или в сочетании с пустым вектором рАСТ, не приводит к активации промотора, чувствительного к GAL4. Идентификация апоптин-ассоциированных белков, кодируемых кДНК, полученными от линии трансформированных В лимфоцитов человека Авторы обнаружили две колонии дрожжей, которые при трансформировании с помощью pGBTVP3 и рАСТ-кДНК способны расти на безгистидиновой среде (также не содержащей лейцина и триптофана) и окрашиваются в голубой цвет при анализе с помощью бета-галактозидазы. Эти результаты указывают на то, что наблюдаемые колонии дрожжей содержат, наряду с затравочной плазмидой pGBTVP3, также и плазмиду рАСТ, кодирующую потенциальный апоптин-ассоциированный белок. Плазмида ДНК выделяется из положительной колонии дрожжей, которая трансформируется в бактерии. Посредством исследования с гибридизацией на фильтре, с использованием рАСТ-специфичного меченного ДНК-зонда, могут быть определены клоны, содержащие плазмиду рАСТ. После этого ДНК рАСТ выделяют и расщепляют с помощью рестрикционного фермента XhoI, который указывает на присутствие вставки кДНК. Наконец, плазмиды рАСТ, содержащие вставку кДНК, секвенируются с использованием метода Зангера (Sanger et al., 1977). Описание апоптин-ассоциированных белков Генетический скрининг дрожжей на апоптин-ассоциированные белки приводит к обнаружению двух клонов кДНК, А и В, содержащих, один тип белка, а именно, новый белок, названный апоптинассоциированный белок 1, сокращенно ААР-1. кДНК ААР-1-b набирает открытую рамку считывания с кодоном инициации ATG, при этом последовательность кДНК ААР-1-а содержит частичную открытую рамку считывания ААР-1, которая является полностью гомологичной последовательности ДНК AAP-1-b. Определенные последовательности ДНК для клонов ААР-1-а и AAP-1-b кДНК показаны на фигурах 1 и 2, соответственно. Последовательность аминокислот, полученная из обнаруженной последовательности ДНК клона AAP-1-b, которая представляет собой полную последовательность ААР-1 а.а.,представлена на фиг. 3. Конструирование вектора экспрессии для идентификации белка ААР-1 в клетках млекопитающих Чтобы изучить, действительно ли клонированные кДНК ААР-1-а и AAP-1-b кодируют продукты(апоптин-ассоциированных) белков, авторы производят следующие эксперименты. ДНК-плазмида pMT2SM содержит главный поздний промотор аденовируса 5 (MLP) и SV40 ori, что делает возможными высокие уровни экспрессии посторонних генов в трансформированных клетках млекопитающих, таких как трансформированные SV-40 клетки Cos. Кроме того, вектор pMT2SM содержит Мус-метку (аминокислоты: EQKLISEEDL), которая находится в рамке с чужеродным генным продуктом. Эта Мус-метка делает возможным распознавание, например, апоптин-ассоциированных белков посредством Мус-метка-специфического антитела 9 Е 10. Векторы pMT2SM, экспрессирующие Мус-меченные кДНК ААР-1-а или AAP-1-b, конструируются следующим образом. Клоны кДНК ААР-1-а и pACT-AAP-1-b расщепляются с помощью рестрикционного фермента Xhol, и вставки кДНК выделяются. Вектор экспрессии pMT2SM расщепляется с помощьюXhol и обрабатывается с помощью кишечной щелочной фосфатазы теленка, и сшиваются с выделенными вставками кДНК ААР-1. С помощью анализа последовательностей идентифицируются pMT2SM конструкции, содержащие кДНК ААР-1-а или AAP-1-b в правильной ориентации. Синтез Мус-меченного белка ААР-1 анализируется путем трансфицирования клеток Cos с помощью плазмид pMT2SM-AAP-l-a или pMT2SM-AAPl-b. В качестве отрицательного контроля, клетки Cosmock-трансфицируются. Через два дня после трансфицирования, клетки лизируются, и осуществляется вестерн-блоттинг анализ с использованием Мус-метка-специфичного антитела 9 Е 10. Клетки Cos, трансфицированные pMT2SM-AAP-l-a и pMT2SM-AAP-1-b, как показано, синтезируют специфически Мус-меченый продукт ААР-1 с ожидаемым размером примерно 33 кДа (ААР-1-а) или 35 кДа (AAP-1-b). Как ожидается, лизаты mock-трансфицированных клеток Cos не содержат белкового продукта, взаимодействующего с Мус-метка-специфичными антителами. Эти результаты указывают на то, что авторы способны выделить кДНК, которые являются способными производить белковый продукт со способностью к ассоциации с апоптоз-индуцирующим белком апоптином. Совместная иммунопреципитация Мус-меченного белка ААР-1 с апоптином в системе трансформированных клеток млекопитающих Затем, авторы анализируют ассоциирование апоптина и белка ААР-1 посредством совместной иммунопреципитации, используя Мус-метка-специфичное антитело 9 Е 10. Антитела 9 Е 10, как показано, не связываются непосредственно с апоптином, что делает возможным использование 9 Е 10 для осуществле-7 005933 ния совместной иммунопреципитации с (myc-меченными) апоптин-ассоциирующимися белками и апоптином. Для этой цели клетки Cos совместно трансфицируются плазмидой pCMV-VP3, кодирующей апоптин, и плазмидой pMT2SM-ААР-1-а. В качестве отрицательного контроля, клетки трансфицируютсяpCMV-VP3, экспрессирующим апоптин, и плазмидой pcДHK3.1.LacZ-myc/His-LacZ, кодирующей mycмеченную бета-галактозидазу, которая не ассоциируется с апоптином. Через два дня после трансфицирования, клетки лизируют в буфере, состоящем из 50 мМ Трис (7,5),250 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,1% Triton X100, 1 мг/мл Na4P2O7 и свежедобавленных ингибиторов протеазы, таких как PMSF, Trypsine-ингибитор, Leupeptine и Na3VO4. Специфичные белки иммунопреципитируются, как описано Noteborn et al. (1998), используя Мус-метка-специфичные антитела 9 Е 10, и анализируются с помощью вестерн-блоттинга. Окрашивание продуктов вестерн-блоттинга с помощью антител 9 Е 10 и антител 111.3, которые специфично направлены против myc-метки и апоптина, соответственно, показывает, что "объединенные" лизаты клеток содержат апоптин и Мус-меченный белок ААР-1 или продукт бета-галактозидазы. Иммунопреципитация Мус-меченных продуктов ААР-1 сопровождается иммунопреципитацией продукта апоптина в 16 кДа. В противоположность этому, иммунопреципитация myc-меченной бетагалактозидазы не приводит к значительной совместно преципитации белка апоптина. В целом, производятся три независимых эксперимента по иммунопреципитации, которые все демонстрируют связывающую способность апоптина по отношению к белку ААР-1. Эти результаты указывают на то, что новый определенный белок ААР-1 является способным к специфической ассоциации с апоптином не только на фоне дрожжей, но также и в системе трансформированных клеток млекопитающих. Сверхэкспрессия нового белка ААР-1 в трансформированных клетках человека индуцирует процесс апоптоза. В дополнение, авторы исследовали, обладает ли ААР-1 апоптотической активностью. Сначала, авторы анализировали внутриклеточную локализацию нового белка ААР-1 в трансформированных клетках человека. Для этой цели клетки Saos-2, полученные от остеосаркомы человека, трансфицируются, как описано Danen-van Oorschot (1997), плазмидой pMT2SM-AAP-1-а или pMT2SM-AAP-1-b, кодирующейDAPI, которое окрашивает ядерную ДНК, показано, что как частичный, так и нативный белок ААР-1 присутствует в ядре клетки. На самом деле, он локализуется совместно со структурами хроматин/ДНК. Наконец, авторы исследовали, приводит ли (сверх)экспрессия обеих кДНК, кодирующих нативный или частичный белок ААР-1, к индуцированию апоптоза. Через четыре дня после трансфицирования,большая часть ААР-1-положительных клеток аберрантно окрашиваются DAPI, что указывает на индуцирование апоптоза (Telford, 1992, Danen-van Oorschot, 1997). Совместное экспрессирование апоптина и обоих белков ААР-1 в клетки опухоли человека, такие как клетки Saos-2, приводит к более быстрому процессу апоптоза, чем экспрессия одного только апоптина или белка ААР-1. Результаты апоптотической активности нативного белка ААР-1 представлены на фиг. 4. Тот факт, что белок ААР-1 может индуцировать апоптоз в р 53-минус клетках Saos-2, указывает на то, что ААР-1 может индуцировать р 53-независимый апоптоз. Эти результаты говорят, что ААР-1,может быть использован в качестве противоопухолевого агента в случаях, где другие (химио)терапевтические агенты не работают. Кроме того, обнаружение того, что как апоптин, так и ААР-1,индуцируют р 53-независимый путь, указывает на то, что ААР-1 участвует в апоптин-индуцированном каскаде апоптоза. Совместная локализация апоптина и ААР-1 в клетках опухоли человека Для обнаружения возможной совместной локализации апоптина и ААР-1 в трансформированных клетках человека, плазмиды, кодирующие апоптин и ААР-1, трансфицируются в клетки Saos-2. Экспрессия ААР-1 и апоптина отслеживается с помощью непрямой иммунофлюоресценции посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием специфических антителmAb myc 9E10 против myc-метки на ААР-1 и pAb VP3-C против С-окончания апоптина. Клетки, совместно трансфицированные плазмидой, кодирующей ААР-1, и плазмидой, кодирующей апоптин, экспрессируют эти белки преимущественно в ядре. Как апоптин, так и ААР-1 имеет гранулярные структуры и описанные выше характерные структуры. Посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, ясно демонстрируется частичная совместная локализация ААР-1 и апоптина в этих ядерных структурах. В качестве вывода, авторы идентифицировали апоптин-ассоциированный белок, а именно, новый белок ААР-1, который присутствует в ядре и способен индуцировать (р 53-независимый) апоптоз в клетках опухоли человека. Более того, когда ААР 1 и апоптин экспрессируются в одной и той же клетке, оба индуцирующих апоптоз белка совместно локализуются в ядре клеток опухоли человека.-8 005933 В нормальных диплоидных клетках человека ААР-1 локализуется в цитоплазматических структурах. Затем авторы исследовали, ведет ли ААР-1 в нормальных диплоидных нетрансформированных клетках человека подобным же образом, как было обнаружено для ААР-1 в клетках опухоли человека. Для этой цели, диплоидные фибробласты человека VH10 (Danen-Van Oorschot, 1997) трансфицируются с использованием Fugene в соответствии с протоколом поставщика (Roche, Almere, TheNetherlands), плазмидой pMT2SM-AAP-1b, кодирующей myc-меченный нативный белок ААР. Параллельно, полученные из опухоли человека клетки Saos-2 также трансфицируются плазмидой pMT2SMAAP-1b. С помощью непрямой иммунофлюоресценции, используя myc-метка-специфичное антитело 9E10,показано, что в нормальных диплоидных фибробластах VH10 белок ААР-1 локализуется в цитоплазме. Как ожидается, в клетках опухоли человека Saos-2 ААР-1 локализуется в ядре. Кроме того, авторы исследовали воздействие совместной экспрессии ААР-1 и апоптина в фибробластах человека VH10 на внутриклеточную локализацию ААР-1, как описано для клеток, экспрессирующих только ААР-1. Данные по иммунофлюоресценции показывают, что как апоптин, так и ААР-1 локализуются в цитоплазматических структурах. Эти данные указывают на то, что экспрессия ААР-1 и/или апоптина не приводит к внутриядерной локализации одного или другого в нормальных диплоидных клетках (человека). Совместная локализация апоптина и ААР-1 в фибробластах человека Для определения возможной совместной локализации апоптина и ААР-1 в нетрансформированных клетках, плазмиды, кодирующие апоптин и ААР-1, трансфицируются в клетки VH10. Экспрессия ААР-1 и апоптина отслеживается с помощью непрямой иммунофлюоресценции посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием специфических антител mAb myc 9E10 противmyc-метки на ААР-1 и pAb VP3-C против С-окончания апоптина. Клетки просматриваются на (совместную) локализацию апоптина и ААР-1 и на индуцирование апоптоза путем ядерного окрашивания с помощью DAPI. Клетки, совместно трансфицированные плазмидой, кодирующей ААР-1, и плазмидой, кодирующей апоптин, экспрессируют эти белки преимущественно в цитоплазме. Как апоптин, так и ААР-1, имеют нитевидную и иногда гранулярную структуру. Посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, ясно показано, что совместная локализация ААР-1 и апоптина происходит в этих цитоплазматических структурах. Подобные же цитоплазматические структуры наблюдаются в отношении ААР-1,когда он экспрессируется сам по себе, или наоборот, когда апоптин экспрессируется сам по себе. Таким образом, в присутствие или отсутствие апоптина, ААР-1 имеет цитоплазматическую локализацию и нитевидно-аггрегированные структуры в нетрансформированных фибробластах человека. В качестве вывода, авторы идентифицировали апоптин-ассоциированный белок, а именно, ААР-1,который по-разному локализуется в диплоидных нетрансформированных клетках человека и в туморогенных клетках человека. Эти результаты показывают, что ААР-1 функционирует различными способами в нормальных диплоидных клетках и в туморогенных клетках. Далее, когда ААР-1 и апоптин экспрессируются в одну и ту же нормальную-нетрансформированную клетку, оба индуцирующих апоптоз белка совместно локализуются в цитоплазме. Воздействие на индуцирование ковалентной связи сигнала ядерной локализации супер-Т антигенаSV40 и белка апоптина В следующих далее экспериментах авторы исследовали, приводит ли экспрессия рекомбинантного белка, состоящего из апоптина и сигнала ядерной локализации LT антигена SV40 (аминокислоты Nконец-пролин-пролин-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин-С-конец супер-Т антигена SV40, ковалентно связанные с N-окончанием апоптина) к индуцированию апоптоза в не- и трансформированных клетках человека. Рекомбинантный белок называют NLS-апоптином. Для этой цели нетрансформированные фибробласты человека VH10 и трансформированные клетки,полученные из остеосаркомы человека Saos-2 (Danen-van Oorschot et al., 1997), трансфицируются плазмидой, кодирующей рекомбинантный белок NLS-апоптин. У трансформированных клеток человека, экспрессия NLS-апоптина приводит к ядерной локализации апоптина и индуцированию апоптоза. Экспрессия NLS-апоптина у нормальных фибробластов человека, однако, приводит к ядерной локализации апоптина, но не к индуцированию апоптоза. Это указывает на то, что "внедрение" переносимого апоптина в ядро само по себе не приводит к его апоптотической активности. Апоптин, видимо, требует дополнительного события, связанного с опухолью. Воздействие экспрессии NLS-апоптина на ААР-1 в нормальных фибробластах человека Затем, авторы исследуют, может ли экспрессия NLS-апоптина влиять на внутриклеточную локализацию ААР-1 и/или на его апоптическую активность в нормальных фибробластах человека. Для этой цели клетки VH10 совместно трансфицируются плазмидами, кодирующими NLS-апоптин или ААР-1. Посредством непрямой иммунофлюоресценции и окрашивания DAPI, используя флуоресцентную микроскопию, четко установлено, что как NLS-апоптин, так и ААР-1, локализуются в ядре без индуцирования апоптоза. Это указывает на то, что "внедрение" переносимого ААР-1 с помощью NLS-апоптина в-9 005933 ядро само по себе не приводит к апоптотической активности ААР-1. ААР-1, подобно апоптину, видимо,требует дополнительного события, связанного с опухолью, чтобы стать апоптотическим в ядре трансформированных клеток. ААР-1 не индуцирует апоптоза в диплоидных нетрансформированных клетках человека В следующих далее экспериментах, авторы исследуют, способен ли ААР-1, сам по себе или в сочетании с апоптином, так же индуцировать апоптоз в диплоидных нетрансформированных фибробластах человека, как наблюдалось для туморогенных/трансформированных клеток человека. Для этой цели клетки VH10 трансфицируются плазмидой pMT2SM-AAP-l-b, как описано выше. Трансфицированные клетки анализируются с помощью прямой иммунофлюоресценции, используя mycметка-специфичные и/или апоптин-специфичные антитела и окрашивание DAPI. DAPI окрашивает интактную ДНК иным образом, чем апоптическую ДНК (Telford et al., 1992). Анализ ясно показывает, что фибробласты VH10, содержащие белок ААР-1, сам по себе или как ААР-1, так и апоптин, не подвергаются апоптозу. Полученные результаты показывают, что связанные с апоптином белки, такие как ААР-1, могут вести себя иным образом в "здоровых" клетках, если сравнивать с клетками опухоли. Диагностический анализ на раковые клетки На основании настоящего сообщения, авторы делают вывод, что внутриклеточная локализация ААР-1 является отличной в туморогенных/трансформированных клетках человека, если сравнивать с нормальными нетрансформированными клетками человека. Более того, аккумуляция ААР-1 в ядре коррелирует с индуцированием апоптоза, при этом цитоплазматическая локализация коррелирует с жизнеспособностью и нормальной пролиферативной способностью клетки. Следовательно, авторы являются способными разработать диагностический анализ для идентификации злокачественных клеток (человека) по сравнению с нормальными "здоровыми" нетрансформированными клетками. Анализ заключается в трансфицировании "подозрительных" клеток (человека), например, происходящими из человека, плазмидой, кодирующей ААР-1, или в инфицировании клеток векторами вирусов,экспрессирующими ААР-1. После этого клетки будут исследоваться 1) на способность подвергаться апоптозу с помощью сверхэкспрессии гена ААР-1 и 2) на изменение локализации ААР-1 с цитоплазмы на ядро. Внутриклеточная локализация ААР-1 может быть определена, используя иммунофлюоресцентный анализ с помощью моноклональных антител, специфичных к ААР-1 и/или специфичных к метке, присоединенной к ААР-1, такой как описанная здесь myc-метка. Если процент апоптоза и/или внутриядерной локализации ААР-1 в анализируемых клетках, экспрессирующих ААР-1, является значительно более высоким, чем в ААР-1-положительных контрольных "здоровых" клетках, можно сделать вывод, что анализируемые клетки становятся туморогенными/трансформированными. В качестве положительного контроля, для экспрессирования ААР-1 будут использоваться известные туморогенные клетки человека. Совместная экспрессия супер-Т антигена SV40 и ААР-1 приводит к изменению локализации ААР-1 и индуцированию апоптоза Авторы исследовали воздействие экспрессии трансформирующих генов на ААР-1-индуцированный апоптоз у нормальных клеток человека, полученных от здоровых индивидуумов. Для этой цели, диплоидные фибробласты человека VH10 совместно временно трансфицируются плазмидой pMT2SM-AAP-1b,кодирующей нативный белок ААР-1, и либо плазмидой pR-s884, кодирующей супер-Т антиген SV40,либо плазмидой pCMV-neo, для отрицательного контроля (Noteborn и Zhang, 1998). С помощью непрямой иммунофлюоресценции, клетки анализируются на ААР-1-индуцированный апоптоз. Нормальные клетки VH10 не подвергаются апоптозу, когда ААР-1 трансфицируется плазмидой для отрицательного контроля. Результаты показывают, как и ожидалось, что экспрессия ААР-1 не способна индуцировать апоптоз у нормальных диплоидных клеток человека, подтверждая рассмотренные выше данные. Однако нормальные диплоидные фибробласты человека, экспрессирующие как ААР-1, так и супер-Т антиген SV40, подвергаются ААР-1-индуцированному апоптозу. Переход нормальных клеток человека от устойчивости к ААР-1 к восприимчивости к ААР-1, вероятно, может быть объяснен тем фактом, что белок ААР-1 переходит от цитоплазматической локализации к внутриядерной локализации. Этот переход становится виден уже через 2 дня после трансфекции плазмид, кодирующих супер-Т антиген SV40, преобразующий белок. Можно сделать вывод, что имеет место некое событие, в данном примере, благодаря экспрессии трансформирующего продукта, полученного из ДНК опухоли, который приводит к перемещению сверхэкспрессированного ААР-1 из цитоплазмы в ядро, после чего следует индуцирование апоптоза. Диагностический анализ на индуцирующие злокачественная опухоль гены, агенты и на склонность к малигнизации, основывающийся на ААР-1-индуцированном апоптозе Основываясь на настоящем сообщении, авторы являются способными разработать диагностический анализ для идентификации индуцирующих злокачественная опухоль и/или трансформирующих агентов или генов. Первый тип анализа заключается в трансфицирования "нормальных" клеток, например, происходящих от человека, плазмидой, кодирующей ААР-1, или в инфицировании клеток векторами вирусов, экс- 10005933 прессирующими ААР-1, вместе с плазмидой, кодирующей предполагаемый трансформирующий/индуцирующий злокачественная опухоль ген. Впоследствии клетки исследуются 1) на способность подвергаться апоптозу с помощью сверхэкспрессирования гена ААР-1 и 2) на изменение локализации ААР-1 от цитоплазмы к ядру. Внутриклеточная локализация ААР-1 может быть определена, используя иммунофлюоресцентный анализ, с помощью моноклональных антител, специфичных к ААР-1 и/или специфичных к метке, присоединенной к ААР-1, такой как описанная здесь myc-метка. Если процент апоптоза и/или внутриядерной локализации ААР-1 в нормальных клетках, совместно экспрессирующих ААР-1 и предлагаемый трансформирующий/индуцирующий злокачественную опухоль ген, является значительно более высокой,чем в ААР-1-позитивных контрольных клетках, экспрессирующих контрольную плазмиду, можно сделать вывод, что анализируемый ген действительно имеет трансформирующую/индуцирующую злокачественную опухоль активность. Второй пример диагностического теста основывается на обработке культивируемых нормальных диплоидных клеток, предполагаемым канцерогенным агентом. Этот агент может добавляться, например,в культивируемую среду, в течение различных отрезков времени. Впоследствии, клетки трансфицируются плазмидой, кодирующей ААР-1. Этот подход также может быть осуществлен путем, сначала, трансфицирования/инфицирования нормальных диплоидных клеток, а затем обработки клеток агентом, подлежащим тестированию. Последующие стадии анализа являются такими же, как описано для описанного в настоящем разделе первого типа диагностического анализа. Если процент апоптоза и/или внутриядерной локализации ААР-1 в нормальных клетках, экспрессирующих ААР-1 и предполагаемый канцерогенный агент, является значительно более высоким, чем у ААР-1-положительных контрольных клеток, экспрессирующих контрольный агент, можно сделать вывод, что анализируемый агент действительно имеет трансформирующую/индуцирующую злокачественную опухоль активность. Третий пример диагностического теста основывается на обработке культивируемых нормальных диплоидных клеток, полученных от биопсии кожи потенциально склонного к малигнизации индивидуума, предназначенных для тестирования и культивирования в соответствующей среде. Затем клетки облучаются УФ, впоследствии трансфицируются плазмидой, кодирующей ААР-1, или инфицируются вектором вируса, экспрессирующим ААР-1, или клетки сначала трансфицируются/ инфицируются, а затем облучаются. Параллельно, диплоидные клетки от нормального здорового индивидуума используются в качестве контроля. Следующие далее стадии анализа являются такими же, как описано в этом разделе для описанного первого типа диагностического анализа. Если после облучения УФ, процент апоптоза и/или внутриядерной локализации ААР-1 в диплоидных клетках, полученных от потенциально склонного к малигнизации индивидуума, является значительно более высоким, чем у УФ обработанных ААР-1-положительных контрольных клеток, можно сделать вывод, что анализируемый индивидуум является склонным к малигнизации. ААР-1 и YY1 ассоциируются друг с другом в трансформированных клетках Гомолог ААР-1 для мышей RYBP (Garcia et al., 1999) может взаимодействовать с YY1. YY1 может активировать или подавлять транскрипцию клеточных и вирусных белков. Взаимодействия белок-белок могут влиять на активность YY1. ААР-1 может, в принципе, взаимодействовать с YY1. Взаимодействие между ААР-1 и YY1 могло бы оказывать влияние на активность YY1, что приводит к подавлению или активированию транскрипции. Транскрипция генов могла бы быть важной для апоптотической активности апоптина и/или ААР-1. Чтобы установить, образует ли ААР-1 комплекс с YY1 in vitro, плазмиды, кодирующие ААР-1 иYY1 (pCMV-HAVY-1; любезно предоставлены Dr Yang Shi, Harvard Medical School, Boston, USA) совместно трансфицируются в клетки Cos. В качестве отрицательного контроля, YY-1 экспрессируется совместно с LacZ. Клетки лизируются, и проводят иммунопреципитационный анализ с использованием антител, специфичных против myc-метки ААР-1 (или LacZ), анти-myc 9 Е 10, и против YY1, анти-YY1. Получаемые в результате комплексы анализируются с помощью методик вестрен-блоттинга. В лизатах клеток, как и ожидалось, обнаруживается ААР-1 и/или YY1, и/или LacZ. В клетках, трансфицированных ААР-1 и YY1, ясно видно, что когда авторы осуществляют иммунопреципитацию с помощью антител, специфичных к myc-меченному ААР-1, обнаруживаются как ААР 1, так и YY1. Результаты блоттинга демонстрируют полосу при 32 кДа (ААР-1) и полосу при 67 кДа(YY1). Дополнительно, авторы осуществляют иммунопреципитацию с использованием специфичных антител для YY1. Снова по результатам вестерн-блоттинга обнаруживаются как YY1, так и ААР-1. В клетках, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей только ААР-1, может быть обнаружен только ААР-1. Клетки, трансфицированные плазмидой, кодирующей YY1, демонстрируют экспрессию YY1, ААР-1 не обнаруживается. Чтобы исключить а-специфичное связывание ААР-1 с YY1, клетки трансфицируются ААР-1 и LacZ, и осуществляются иммунопреципитации с помощью антител, специфичных к LacZ. Хотя белок LacZ ясно виден по результатам вестерн-блоттинга, белка ААР-1 не видно.- 11005933 Следовательно, полученные результаты демонстрируют, что ААР-1 специфически связывается с фактором YY1, связанным с транскрипцией. Получение и выделение МВР-ААР 1 и AAP1-(His)6 Чтобы исследовать возможность получения белков слияния МВР-ААР-1 и ААР-1-(His)6, нуклеиновая кислота ААР-1, кодирующая открытую рамку считывания, клонируется в кассетах для сверхэкспрессии белков pMALTB и рЕТ 22b. Индуцирование клеток E.coli в соответствии с инструкциями производителей (Novagen) приводит к производству растворимого слитого белка. Выделение слитого белка МВР-ААР 1 с помощью афинной хроматографии (амилозная смола. NewEngland Biolabs) и ионообменной хроматографии (High-S, Biorad) приводит к получению белка с полным набором аминокислот и с чистотой от 90 до 95 %. Эксклюзионная хроматография (Pharmacia Superose 6HR 10/30) этого белка показывает, что значительная часть препарата МВР-ААР 1, видимо, ведет себя как различные частицы, гомотример или гомотетрамер. Эти данные говорят о том, что рекомбинантный ААР-1 (в форме слитого белка с МBP) является способным к достижению правильной конформации и является, вероятно, биологически активным. Выделение белка AAP1-(His)6 с помощью аффинной хроматографии с комплексами металлов (Ni2+NTA, QIAGEN) ведет к получению образца белка с чистотой 80%. В качестве вывода, слияние ААР 1 с МBР приводит к получению растворимого ААР-1 правильной конформации, который, вероятно, является биологически активным. Получение поликлональных антител, направленных против белков AАР-1 Для производства поликлональных антител против белков ААР-1 синтезируется предполагаемый иммуногенный пептид (пептид ААР-1 состоит из аминокислот N/окончание-CTKTSETNHTSRPRLKС/окончание; EuroGentec SA, Belgium). После этого кроликам делают инъекцию специфичными пептидами согласно стандартным процедурам производителя. Сыворотка, полученная от кроликов, которым делали инъекцию пептида ААР-1, как показано посредством анализов ELISA и Вестерн-блоттинга, является специфичной для указанных выше продуктов ААР-1. Эти результаты говорят о том, что авторы генерировали специфичные антитела, которые могут быть использованы для детектирования апоптинассоциированного белка ААР-1. В качестве вывода авторы предоставили доказательства того, что вмешательство специфичных факторов в функцию белков ААР-1 приводит к индуцированию апоптоза. Способы терапии, базирующиеся на индуцировании (р 53-независимого) апоптоза, являются возможными с использованием вмешательства в функцию белков ААР-1. Примером такого фактора вмешательства является апоптин. Другой полученный из CAV белок, о котором известно, что он индуцирует апоптоз, и который известен также как повышающий активность апоптина, представляет собой VP2 (Noteborn et al., 1997). Описание фигур На фиг. 1 показана частичная последовательность вектора pMT2SM-AAP-1-a. Последовательность ДНК кДНК ААР-1-а выделена жирным шрифтом. На фиг. 2 демонстрируют частичную последовательность вектора pMT2SM-AAP-l-b. Последовательность ДНК AAP-1-b кДНК выделена жирным шрифтом. На фиг. 3 демонстрируют последовательность аминокислот анализируемой области апоптинассоциированного клона AAP-1-b (жирный шрифт). Кроме того, три аминокислоты с С-окончаниями HE-G сайта множественного клонирования рАСТ приведены для иллюстрации того, что последовательность аминокислот ААР-1 находится в рамке с доменом активации GAL4. Эта особенность доказывает,что область ААР-1 действительно синтезируется в клетках дрожжей. Необходимо отметить, что на фиг. 3 аминокислотное положение 23 соответствует первой аминокислоте белка, подобного ААР-1. Функциональные домены или фрагменты здесь могут, например, быть идентифицированы как домен связывания транскрипционного фактора, начинающийся от аминокислотного положения 1 (= 23 на фиг. 3) и заканчивающийся около позиции 54; мотив цинк-пальцев, домен взаимодействия белок-белок и/или взаимодействие белок-нуклеиновая кислота, начинающийся примерно от аминокислотного положения 25(= 47 на фиг. 3) примерно до 42; область, ассоциирующаяся с апоптозом, начинающаяся примерно от аминокислотного положения 32 и заканчивающаяся около позиции 226; сигнал внутриядерной локализации, протянувшийся примерно от аминокислотного положения 74 до примерно 81; и сигнал внутриядерной локализации, протянувшийся примерно от аминокислотного положения 102 до позиции 108, или в эквивалентных положениях в другом белке, подобном ААР-1. На фиг. 4 демонстрируют апоптотическую активность белка AAP-1-b в клетках Saos-2, когда он экспрессируется сам по себе (черные квадраты) или в сочетании с апоптином (белые квадраты). Процент апоптин-индуцированного апоптоза также указан (черные треугольники). Ссылки 1. Bellamy, C.O.C., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie, H. 1995. Cell death and diseases: Thevarious human hematologic malignant cells in vitro. Leukemia 9 SI, 118-120. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Нуклеиновая кислота, кодирующая ААР-1 и апоптин, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23250, приведенные на фиг. 3, или ее функциональный фрагмент или функциональный эквивалент. 2. Нуклеиновая кислота по п.1, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая ААР-1, содержит нуклеотиды 142-829, приведенные на фиг. 2, или ее функциональный фрагмент или функциональный эквивалент. 3. Белковая композиция, содержащая рекомбинантный ААР-1 и апоптин, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или ее функциональный фрагмент, или функциональный эквивалент. 4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1 или 2. 5. Средство доставки генов, содержащее нуклеиновую кислоту по п.1 или 2 или вектор по п.4. 6. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг.3, или ее функциональный фрагмент или функциональный эквивалент, и дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую апоптин. 7. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 или 2 или белковую композицию по п.3 или вектор по п.4 или средство доставки генов по п.5. 8. Способ получения белковой композиции по п.3, предусматривающий культивирование клеткихозяина по п.6 или 7 в благоприятных для экспрессии условиях и выделение указанной белковой композиции. 9. Применение нуклеиновой кислоты по п.1 или 2 или белковой композиции по п.3 в качестве фармацевтического препарата для лечения злокачественных опухолей и аутоиммунных заболеваний. 10. Способ индуцирования апоптоза in vitro в клетках, у которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели, предусматривающий введение в указанные клетки нуклеиновой кислоты по п.1 или 2 или белковой композиции по п.3. 11. Способ по п.10, где указанные клетки представляют собой злокачественные клетки или клетки,вовлеченные в аутоиммунное заболевание. 12. Применение нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, или белковой композиции по п.3, или вектора по п.4, или средства доставки генов по п.5, или клетки-хозяина по п.6 или 7 в приготовлении лекарственного препарата для лечения заболеваний, при которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели. 13. Применение по п.12, где указанные клетки представляют собой злокачественные клетки или клетки, вовлеченные в аутоиммунное заболевание. 14. Способ индуцирования апоптоза in vitro в клетках, у которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели, предусматривающий введение в указанные клетки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или ее функциональный фрагмент, или функциональный эквивалент. 15. Способ индуцирования апоптоза in vitro в клетках, у которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели, предусматривающий введение в указанные клетки ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или ее функциональный фрагмент, или функциональный эквивалент. 16. Способ по п.14 или 15, дополнительно предусматривающий введение в указанные клетки белка апоптина или нуклеиновой кислоты, кодирующей апоптин.- 14005933 17. Способ по п.14 или 16, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая ААР-1, содержит нуклеотиды 142-829, приведенные на фиг. 2, или ее функциональный фрагмент, или функциональный эквивалент. 18. Способ по любому из пп.14-17, где указанные клетки представляют собой злокачественные клетки или клетки, вовлеченные в аутоиммунное заболевание. 19. Применение нуклеиновой кислоты, кодирующей ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или ее функционального фрагмента, или функционального эквивалента в приготовлении лекарственного препарата для лечения заболеваний, при которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели. 20. Применение ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или его функционального фрагмента или функционального эквивалента в приготовлении лекарственного препарата для лечения заболеваний, при которых наблюдается усиленная клеточная пролиферация и пониженная интенсивность клеточной гибели. 21. Применение по п.19 или 20, дополнительно содержащее белок апоптин или нуклеиновую кислоту, кодирующую апоптин. 22. Применение по п.19 или 21, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая ААР-1, содержит нуклеотиды 142-829, приведенные на фиг. 2, или ее функциональный фрагмент, или функциональный эквивалент. 23. Применение по любому из пп.19-21, где указанное заболевание представляет собой злокачественную опухоль или аутоиммунное заболевание. 24. Способ определения присутствия злокачественных клеток или клеток, которые являются склонными к малигнизации, в образце клеток, предусматривающий трансфицирование клеток указанного образца нуклеиновой кислотой или вектором, кодирующей ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или функциональным фрагментом, или функциональным эквивалентом, и определение процента апоптоза клеток в указанном образце. 25. Способ определения присутствия злокачественных клеток или клеток, которые являются склонными к малигнизации, в образце клеток, предусматривающий трансфицирование клеток указанного образца нуклеиновой кислотой или вектором, кодирующей ААР-1, причем ААР-1 содержит аминокислоты 23-250, приведенные на фиг. 3, или функциональным фрагментом или функциональным эквивалентом, и определение внутриклеточной локализации белкового вещества, полученного с помощью указанной нуклеиновой кислоты или вектора в клетках в указанном образце. 26. Способ по п.25, где присутствие указанного белкового вещества в указанных клетках детектируется иммуноокрашиванием указанных клеток с помощью антитела. 27. Способ для идентификации предполагаемого вызывающего злокачественную опухоль агента,предусматривающий воздействие на образец клеток указанным агентом и определение присутствия злокачественных клеток или клеток, которые являются склонными к малигнизации, в образце клеток в соответствии со способом по любому из пп.24-26. 28. Способ по п.27, где указанный предполагаемый вызывающий злокачественную опухоль агент содержит ген или его функциональный фрагмент.