Новые иммуногенные эпитопы для иммунотерапии

НОВЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ ЭПИТОПЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ Изобретение относится к аминокислотным последовательностям пептидов, образованных из опухолеассоциированных антигенов, которые способны связываться с комплексами МНС как одного, так и другого класса и вызывать иммунный ответ, а также применение указанных пептидов для лечения заболеваний.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE) 018456 Изобретение относится к новым аминокислотным последовательностям пептидов, образованных из опухолеассоциированных антигенов, которые способны связываться с комплексами МНС как одного, так и другого класса и вызывать иммунный ответ. Уровень техники Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной,исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Конкретные элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101112; Zeh H J , Perry-Lalley D , Dudley M.E., Rosenberg S.A., Yang J.C.; J Immunol. 1999, 162(2):989-94; Highavidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumour efficacy.). В частности,CD8-положительные Т-клетки (TCD8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 аминокислотных остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIPS) (Schubert U., Anton L.C., Gibbs J., NorburyC.C., Yewdell J.W., Bennink J.R.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA). Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления эндогенных белков, DRIPS, и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются (Cresswell P. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259-93). Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и МНС класса II распознаются CD4 положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.CD4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и, поэтому, идентификация CD4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Kobayashi,H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J.antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A . 100(15):8862-7) CD4+ Т-клетки могут приводить к локальному увеличению уровней IFN (Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H,Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumour rejection by CD8+T cells; Cancer Res. 2003 J;63(14):4095-4100). При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам(АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом, у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas С., Gitsioudis G.,Schoor O., Altenberend F., Mller M., Kramer B., Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J., Wernet D., Stenzl A.,Rammensee H.G., Klingel K., Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). На моделях млекопитающих животных, например, мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток ЦТЛ (т.е., CD8-положительных Т-лимфоцитов), CD4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирования визуализирования опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (IFN) (Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+ T-cell-mediated tumor rejectioncells. Immunity. 12:677-686). К тому же было показано, что CD4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами HLA класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (Ab) (Kennedy, R.C.,М.Н. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody produc-1 018456tion and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами HLA класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (ТАА)(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Так как конститутивная экспрессия молекул HLA класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Mach, В., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, Dengjel и соавторам недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 04 023 546.7, ЕР 05 019 254.1;Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas С., Gitsioudis G., Schoor O., Altenberend F., Mller M., Kramer B.,Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J., Wernet D., Stenzl A., Rammensee H.G., Klingel K., Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якори") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "соединительный элемент", определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Rammensee H. G., Bachmann J. andStevanovic, S; MHC Ligands and Peptide Motifs, ChapmanHall 1998). В зависящей от МНС класса I иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС класса I, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР). Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков,таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также быть уникальными для опухолевых клеток, например, как продукты мутировавших генов или альтернативных открытых рамок считывания (ОРС) или белкового сплайсинга (Vigneron N., Stroobant V., Chapiro J., Ooms A., Degiovanni G., Morel S., van der Bruggen P., Boon T., Van den Eynde B.J. Anantigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome, Science 2004 Apr 23; 304 (5670):587-90.). Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ ("раковый тестикул"), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника. Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, PSA (простата-специфический антиген) и PSMA (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями (кроссовер), такими как bcr/abl в лимфомах. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Linehan W.M.,Walther M.M., Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170(6 Pt 1):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р 53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL, и HER-2/neu,могут аккумулировать мутации, приводящие к высокому уровню экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found.Symp. 1994 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака. Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто бывают образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или апоптозе. В дополнение мишени нисходящего пути белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, кос-2 018456 венно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol.Immunoether. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). В обоих случаях необходимо иметь эпитопы в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу. Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть изолированы у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии в сопоставлении между опухолевыми и нормальными тканями (Lemmel С, Weik S.,Eberle U., Dengjel J., Kratt Т., Becker H.D., Rammensee H.G., Stevanovic S. Nat. Biotechnol. 2004 Apr.; 22(4):450-4, T. Weinschenk, С Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W.Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62 (20):5818-5827, 2002.). Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не обеспечивает точной информацией относительно использования антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Причиной тому то, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций ("эффекторная Т-клетка"). Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типаTH1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, представляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций,которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как CD8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и CD4 положительными ЦТЛ (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для пептидов, которые способны связываться с комплексами МНС любого класса. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлены масс-спектры ESI-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированный пептид (TUMAP) PCN-002 из пробы карциномы толстой кишки ССА 707 (фиг. 1a),TOP-002 из пробы глиобластомы GB1006 (фиг. 1b), РТР-001 из пробы глиобластомы GB1006 (фиг. 1c),GAL-001 из пробы почечно-клеточной карциномы RCC190 (фиг. 1d), CHI-001 из пробы глиобластомыGB1002 (фиг. 1e), JAK-001 из пробы глиобластомы GB1002 (фиг. 1f), AKR-001 из пробы немелкоклеточного рака легкого NSCLC-Pool 2 (фиг. 1g) и FNI-001 из пробы карциномы поджелудочной железы РС 330(фиг. 1h), которые были презентированы рестриктированным по МНС класса I образом. На фиг. 2 представлены масс-спектры ESI-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированный пептид (TUMAP) CEA-009 из пробы рака желудка GC-Pool 2 (фиг. 2 а), TGFBI-006 из пробы рака желудка GC-Pool 1 (фиг. 2b), TGFBI-007 из пробы глиобластомы GB6002 (фиг. 2 с), TGFBI008 из пробы глиобластомы GB1004 (фиг. 2d), TGFBI-009 из пробы немелкоклеточного рака легкогоNSCLC-Pool 1 (фиг. 2 е) и TGFBI-010 из пробы глиобластомы GB6002 (фиг. 2f) которые были презентированы рестриктированным по МНС класса II образом. На фиг. 3 представлены экспрессионные профили двух генов, кодирующих глиобластомаассоциированные пептиды РТР-001 (фиг. 3 а) и CHI-001 (фиг. 3b). Экспрессия этих генов отсутствует или находится на низком уровне в нормальных тканях, в то время как она увеличена более чем в 250 раз в пробах глиобластомы (GB1006T по GB1011T; NCH359T и NCH361T).-3 018456 На фиг. 4 показаны аффинности связывания выбранных пептидов по отношению к HLA-A0201,как показали измерения по методике EpI ELISA в соответствии с Sylvester-Hvid, С, Kristensen, N, Blicher,T, Ferre, H, Lauemoller, SL, Wolf, XA, Lamberth, K, Nissen, MH, Pedersen, LO, and Buus, S; 2002, Establishment of a quantitative ELISA capable of determining peptide - MHC class I interaction, Tissue Antigens, 59,251-258. Анализ был ограничен пептидами, о которых известно, что они связываются с МНС класса I. Аффинность пептидов, связывающихся с HLA-DR не могла быть измерена в данном анализе. На фиг. показан тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации ODC-001 иNOX-001-специфических CD8+ лимфоцитов из периферической крови. ПК, обогащенные на лунку 1106CD8+ здорового донора HLA-A0201 + HD100 стимулировались еженедельно микросферами, связанными с анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/ODC-001 (верхняя секция) или анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/NOX-001 (нижняя секция). После трех стимуляций in vitro клетки были окрашены антителом CD8 FITC плюс тетрамеры A0201/NOX-001 РЕ иA0201/ODC-001 APC. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов или CD8+ лимфоцитов (правая секция), и цифрами обозначена процентная доля тетрамера+ среди лимфоцитов CD8+. На фиг. 6 представлена иммуногенность in vitro TGFBI-004, обнаруженного IFN ELISPOT после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали и рестимулировали повторно TGFBI-004, а затем инкубировали с релевантным TGFBI-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом, соответственно. Анализ после IFN ELISPOT был произведен на ELISPOT-ридере (CTL, Cleveland, США). ФГА-иономицин служил положительным контролем. Цифры соответствуют количеству положительных точек. На фиг. 7 представлена иммуногенность in vitro TGFBI-004, обнаруженного методом ICS после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали аутологичными ДК с нагруженным TGFBI-004 и рестимулировали аутологичными МПК плюс TGFBI-004. Для считывания клетки инкубировали с релевантным TGFBI-004 (лунки 1,2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом, соответственно. В дополнение к внутриклеточному окрашиванию IFN, клетки были также окрашены антителами CD4-FITC и CD8-PerCP. Анализ проводили на четырехцветном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, Германия). На фиг. 8 представлен анализ ELISPOT выработки IFN линиями Т-клеток при рестимуляции in vitro пептидом NOX-001. А. Т-клеточная линия 7+ донора НВС-154 (отсортированы CD8+ NOX-001 тетрамер+); В. Т-клеточная линия 7- донора НВС-154 (отсортированы CD8+ NOX-001 тетрамер). Отсортированные клетки CD8+ NOX-001 тетрамер+ (А.) и CD8+ NOX-001 тетрамер-(В.) анализировали методом IFN ELISPOT после рестимуляции нерелевантным (MLA-001) (верхние лунки) и релевантным (NOX-001) (нижние лунки) пептидом (10 мкг/мл). Цифры соответствуют количеству положительных точек. На фиг. 9 показаны аффинности пептидов к HLA-A0201, содержащихся в настоящем изобретении. Константы диссоциации (KD) пептидов Р 116 HLA класса I и вирусного пептида-маркера HBV-001 были измерены основанным на методике ELISA анализом (см. примеры). Детальное описание изобретения В первом аспекте изобретение обеспечивает пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы SEQ ID1 по SEQ ID29 или ее вариант, который на 80% гомологичен SEQ ID1 по SEQ ID29, или вариант, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом. В настоящем изобретении термин "гомологичный" относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее "гомология" определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму ClustalW (Nucleic Acid Res.,22(22): 4673 4680 (1994). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Vector NTI, GENETYX или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных, такие как, например, http://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/. Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Fong, L., Hou, Y.,Rivas, A., Benike, С., Yuen, A., Fisher, G.A., Davis, M.M., and Engleman, E.G.; 2001, Altered peptide ligandof antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide, Eur.J Immunol, 2006, 36, 1805-1814). На табл. 1 представлены пептиды, их номера последовательностей (SEQ ID ), а также информация о родительских белках. Таблица 1. Пептиды настоящего изобретения Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20C20orf42 является белком фокальной адгезии, задействованным в присоединении актинового цитоскелета к плазменной мембране и в опосредованных интегрином клеточных процессах. ДефицитC20orf42 как результат мутаций с потерей функции приводит к синдрому Киндлера, аутосомальному рецессивному генодерматозу, характеризующемуся образованием волдырей на коже, прогрессивной атрофией кожи, светочувствительностью и, изредка, к канцерогенезу (Herz, С., Aumailley, M., Schulte, С.,Schlotzer-Schrehardt, U., Bruckner-Tuderman, L. and Has, С.; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J Biol Chem., 2006, 281, 36082-36090). Недавно сообщалось о серьезном поражении желудочно-кишечного тракта с гемоколитом у пациента с мутацией с потерей функции (Sadler, E., Klausegger, A., Muss, W, Deinsberger, U., Pohla-Gubo, G., Laimer,M., Lanschuetzer, C., Bauer, J.W. and Hintner, H.; Novel KIND1 gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol, 2006, 142, 1619-1624). В контексте раковых заболеваний C20orf42 описывался в исследованиях, занимающихся изучением экспрессии генов в окружении, имеющем отношение к раку. Как было обнаружено, он был гиперэкспрессирован в 70% случаев рака толстой кишки и 60% случаев рака легких (n = 10). Нормальная тканевая экспрессия при нозерн-блоттинге (Northern Blot) была ограничена нейромышечными тканями (Weinstein,E.J., Bourner, M., Head, R., Zakeri, H., Bauer, С. and Mazzarella, R.; URP1: a member of a novel family of PHcarcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216). Кроме того, C20orf42 был идентифицирован как ген, участвующий в TGFопосредованной клеточной миграции и опухолевой инвазии (Kloeker, S., Ma-5 018456NOX1 является чувствительным к факторам роста ферментом, который катализирует образование реактивных форм кислорода, высшего оксида (О 2-) и перекиси водорода (Н 2 О 2). Его экспрессия была первоначально выявлена в толстой кишке, простате, матке и пролиферирующих васкулярных гладкомышечных клетках (Suh, Y.A. et al. 1999, Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl. Nature 401, 79-82). Его экспрессия связана с рядом биологических реакций, включая клеточную пролиферацию,ангиогенез и активацию клеточных сигнальных путей (Harper, R.W., Xu, С, Soucek, K., Setiadi, H. andNOX1 высоко экспрессирован в толстой кишке, но его функция в кишечной физиологии или патологии до сих пор плохо изучена. В нормальных тканях экспрессия NOX1 была низкой в подвздошной кишке, средней в восходящей ободочной кишке и высокой в нисходящей ободочной кишке. Статистических различий по экспрессии NOX1 не наблюдалось между пробами, взятыми из аденом, хорошо или плохо дифференцированных аденокарцином толстой кишки. NOX1 был высоко экспрессирован в эпителиальных клетках толстой кишки, как в криптах, так и на люминальной поверхности. В заключение,NOX1 является ферментом, который конститутивно экспрессирован в эпителии толстой кишки и не ассоциирован напрямую с генезом опухоли (Szanto, I. et al. Expression of NOX1, a superoxide-generatingNADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease. JPathol. 2005, 207, 164-176). Иммуногистохимия показала, что NOX1 был конститутивно экспрессирован в поверхности слизистых клеток. Аденомы и хорошо дифференцированные аденокарциномы повышали уровень экспрессииNOX1. Ядерный фактор (NF)-kappaB был преимущественно активирован в клетках аденомы и аденокарциномы, экспрессирующих в избытке NOX1, позволяя предположить, что NOX1 может стимулироватьNF-kappaB-зависимые антиапоптотические каскады реакций в опухолях толстой кишки (Fukuyama, M. etBiol Chem. 2002,277, 15393-15399). Недавно предполагалось, что реактивные формы кислорода индуцируют эндотелиальный апоптоз,который впоследствии индуцирует экспрессию различных адгезивных молекул для опухолевых клеток. Это указывает на то, что при остановке выделения ROS (реактивные формы кислорода) препятствование рецидиву опухоли на отдаленных участках может быть обоснованным (Ten, K.M., van der Wal, J.B.,Sluiter, W., Hofland, L.J., Jeekel, J., Sonneveld, P. and van Eijck, C.H.; The role of superoxide anions in thedevelopment of distant tumour recurrence, Br.J. Cancer, 2006, 95, 1497-1503). Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA)PCNA был обнаружен в ядре и является ко-фактором ДНК-полимеразы дельта. Кодируемый белок выступает в качестве гомотримера и помогает увеличить процессивность синтеза ведущей нити во время репликации ДНК. Поэтому он экспрессирован во всех пролиферирующих клетках, в особенности опухолевых клетках, и используется в качестве маркера для детекции пролиферации. ДНК-топоизомераза II ТОР 2 А и ТОР 2 В кодируют изоформы ДНК-топоизомеразы, фермента, который контролирует и меняет топологическое состояние ДНК во время транскрипции. Данный ядерный фермент задействован в таких процессах, как конденсация хромосом, сепарация хроматид и снятие торсионного напряжения,которое возникает во время транскрипции и репликации ДНК. ДНК-топоизомераза катализирует временный разрыв и воссоединение двух нитей дуплекса ДНК, который позволяет нитям пройти сквозь друг друга, меняя тем самым топологию ДНК. Две изоформы данного фермента существуют, как предполагается, как продукты явления дупликации гена. Ген, кодирующий альфа-форму, локализован в хромосоме 17, а бета-ген локализован в хромосоме 3. ТОР 2 А является мишенью для нескольких противораковых агентов, а ряд мутаций в этом гене были ассоциированы с развитием резистентности к лекарственным средствам. Ген ТОР 2 А расположен смежно с онкогеном HER-2, наиболее часто амплифицируемым онкогеном при раке груди, на хромосомной локализации 17q12-q21, и либо амплифицирован, либо делетирован, с одинаковой частотой, в почти 90% случаев первичных опухолей груди с амплификацией HER-2 (Jarvinen, Т.А. and Liu, E.T.; Topoisomerase II alpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-morecommon than anticipated, Cytopathology, 2003, 14, 309-313). Более того, об амплификациях ТОР 2 А сообщалось и в связи с другими видами рака. Без ТОР 2 А невозможны репликация ДНК и деление клетки. Поэтому он стал основной мишенью многих лечебных схем при лечении опухолей, хотя точный механизм уничтожения клеток остается неясным (Kellner, U., Sehested, M., Jensen, P.B., Gieseler, F. and Rudolph, P.; Culprit and victim - DNA topoisom-6 018456erase II, Lancet Oncol, 2002, 3, 235-243). Успех данного подхода ограничивается возникновением спонтанной резистентности, и индуцированное медикаментами повреждение ДНК может увеличить злокачественность. Последние данные позволяют предположить, что амплификация и делеция ТОР 2 А может сказываться как в чувствительности, так и резистентности к ТОР 2 А-ингибирующей химиотерапии, в зависимости от специфического генетического дефекта на локусе ТОР 2 А. Неясно, имеет ли сходство участие ТОР 2 В в раковых заболеваниях с ТОР 2 А, или же между этими двумя изоформами имеется существенная разница. ТОР 2 В может, по крайней мере, быть дополнением в активности ТОР 2 А (Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta oftype II DNA topoisomerase, J Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054). Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5 Карциномоэмбриональный антиген (СЕА = СЕАСАМ 5), 180 кДа, является обильно гликозилированным мембранным белком, состоящим из трех С 2 Ig-подобных повторяющихся звеньев, примыкающих к N-концевому Ig V-подобному участку и С-концевому участку, который включает участок сцепления гликофосфатидилинозитола (Hegde, P., Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K., Dharap, S., Earle-Hughes, J,Gay, C., Nwokekeh, N.U., Chen, T., Saeed, A.I., Sharov, V., Lee, N.H., Yeatman, T.J. and Quackenbush, J;DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797). Являясь онкофетальным антигеном, СЕА экспрессируется во время эмбрионального развития, но и также, на низком уровне, в желудочно-кишечном эпителии взрослых. Однако СЕА гиперэкспрессирован в высокой степени в опухолях человека, включая 90% случаев желудочно-кишечного, колоректального рака и рака поджелудочной железы, 70% клеток немелкоклеточного рака легких и 50% случаев рака груди (Thompson, J.A., Grunert, F. and Zimmermann, W.; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives, J Clin Lab Anal, 2005, 5, 344-366). Из-за своего высокого уровня экспрессии в опухолевых клетках и секреции в сыворотку СЕА широко использовался в качестве опухолевого маркера(Sikorska, H., Shuster, J., and Gold, P; Clinical applications of carcinoembryonic antigen, Cancer Detect.Prev.,1988, 12, 321-355) и является стандартным сывороточным маркером для мониторинга колоректального рака (Locker, G.Y., Hamilton, S., Harris, J., Jessup, J.M., Kemeny, N, Macdonald, J.S., Somerfield, MR, Hayes,DF, and Bast, R.C., Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal cancer, J Clin Oncol, 24, 5313-5327). Несмотря на гиперэкспрессию СЕА в опухолевых клетках, раковые пациенты обычно не дают иммунного ответа на данный антиген (Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, and Bonfanti, G; Delayed cutaneoushypersensitivity reaction to carcinoembryonic antigen in cancer patients, Tumouri, 1982, 68, 473-475). Иммунная система обычно становится толерантной к СЕА, потому что он в нормальном случае экспрессирован в организме на низком уровне. Однако в сериях клинических исследований вакцин была продемонстрирована иммуногенность СЕА (Sarobe, P, Huarte, E, Lasarte, JJ, and Borras-Cuesta, F; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Cancer Drug Targets., 2004, 4, 443-454), в особенности при колоректальном раке (КРР) (Mosolits, S, Ullenhag, G, and Mellstedt, H; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results, Ann.Oncol,2005, 16, 847-862), и СЕА является опухолеассоциированным антигеном (ТАА) с обширным количеством вакцин, протестированных на данном виде опухоли (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what weknow and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84). Несколько цитотоксических и хелперных Т-клеточных эпитопов были описаны для СЕА (Crosti, M,Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, and Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopesfrom carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867), позволяющих проведение ряда основанных на пептидах клинических исследований вакцин против КРР (Babatz, J, Rollig, С, Lobel, В, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, and Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccinationCAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005, 11, 5993-6001). Данные и другие клинические исследования на данный момент продемонстрировали безопасность вакцинаций СЕА и доказательства для индукции иммунного ответа против данного антигена (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yetTGFBI был первым геном, идентифицированным в качестве TGF-бета-индуцированного в клеточной линии человеческой аденокарциномы легких. Он кодирует секретируемый внеклеточный матричный белок, который, как предполагается, задействован в присоединении клеток и формировании внеклеточной матрицы. Как было показано, TGFBI находится среди генов с наиболее значительно повышенным уровнем при колоректальном раке, и он также экспрессирован на высоком уровне в аденомах. Результаты количественной ПЦР демонстрируют сильное повышение, как в неочищенных опухолях, так и очищенных эпителиальных клетках опухоли. Соответственно, проведенные in situ эксперименты по гибридизации показали, что TGFBI экспрессирован во многих видах клеток, как в стромальных, так и эпителиальных компартментах (Buckhaults, P, Rago, С, St, CB, Romans, KE, Saha, S, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW;Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Cancer Res., 2001, 61,6996-7001). При мета-анализе исследований, изучающих экспрессию генов при колоректальном раке, было установлено, что TGFBI является одним из всего девяти генов, которые были описаны как содержащиеся многократно в повышенном количестве (4 исследования для TGFBI) (Shih, W, Chetty, R, and Tsao, MS;Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol. Rep., 2005, 13, 517-524). В человеческих тканях поджелудочной железы наблюдалось повышение уровня TGFBI мРНК в 32,4 раза при раке поджелудочной железы в сравнении с нормальными контрольными тканями. Гибридизационный анализ in situ показывает, что TGFBI мРНК был экспрессирован, в основном, в раковых клетках внутри опухолевой массы поджелудочной железы (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc,M, Friess, H, and Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1588, 1-6). В модели in vitro было установлено, что TGFBI является геном, способствующим ангиогенезу. К тому же резко повышенный уровень экспрессии TGFBI был обнаружен в нескольких видах опухолей. Антисмысловые олигонуклеотиды к TGFBI блокировали как экспрессию генов, так и образование эндотелиальных трубок in vitro, заставляя предположить, что TGFBI может играть ведущую роль во взаимодействиях в эндотелиальной клеточной матрице (Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard,C, and Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171). Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторного типа, Zetal (PTPRZ1)PTPRZ1 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок I типа с двумя цитоплазматическими тирозин-белковыми фосфатазными доменами, одним альфа-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. Экспрессия этого гена индуцирована в раковых клетках желудка (Wu, CW, Li,AF, Chi, CW, and Lin, WC; Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues, CancerLett., 2006, 242, 95-103), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (Harroch, S, Furtado, GC, Brueck, W, Rosenbluth, J, Lafaille, J, Chao, M, Buxbaum, JD, anddemyelinating lesions, Nat. Genet., 2002, 32, 411-414) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии (Wang, V, Davis, DA, Haque, M, Huang, LE, and Yarchoan, R; Differential gene up-regulation byhypoxia-inducible factor-lalpha and hypoxia-inducible factor-2 alpha in HEK293T-cells, Cancer Res., 2005, 65,3299-3306). Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (Lu, KV, Jong, KA, Kim, GY, Singh, J, Dia, EQ, Yoshimoto, K, Wang, MY, Cloughesy, TF, Nelson, SF, and Mischel, PS; Differential induction of glioblastoma migration and growth by two formsof pleiotrophin, J Biol Chem., 2005, 280, 26953-26964). Кроме того, PTRPZ1 часто амплифицируется на уровне геномной ДНК в глиобластоме (Mulholland,PJ, Fiegler, H, Mazzanti, С, Gorman, P, Sasieni, P, Adams, J, Jones, ТА, Babbage, JW, Vatcheva, R, Ichimura,K, East, P, Poullikas, C, Collins, VP, Carter, NP, Tomlinson, IP, and Sheer, D; Genomic profiling identifies discrete deletions associated with translocations in glioblastoma multiforme, Cell Cycle, 2006, 5, 783-791).JAKMIP2 был идентифицирован в качестве одной из многих известных или предполагаемых мишеней нисходящего пути белков PAX3-FKHR, которые были сильно гиперэкспрессированы в ARMS (Paediatric rhabdomyosarcoma, alveolar subtype) (Lae, M, Ahn, E, Mercado, G, Chuai, S, Edgar, M, Pawel, B, Olshen, A, Barr, F, and Ladanyi, M; Global gene expression profiling of PAX-FKHR fusion-positive alveolar andPAX-FKHR fusion-negative embryonal rhabdomyosarcomas, J Pathol, 2007, 212, 143-151). Фибронектин 1 (FN1) Фибронектин является высокомолекулярным гликопротеином, содержащим около 5% углеводов, и связывающимся с рецепторными белками, которые заполняют клеточную мембрану и называются интегринами. Кроме интегринов они также связываются с компонентами внеклеточной матрицы, такими как коллаген, фибрин и гепарин. Существуют несколько изоформ фибронектина, каждая из которых является продуктом отдельного гена. FN играют важнейшую роль в поддержании нормальной клеточной морфологии, клеточной адгезии, миграции, гемостаза, тромбоза, заживления ран, дифференциации и пролиферации (Hynes, RO; Fibronectins, Sci. Am., 1987, 254, 42-51). Полимерный фибронектин, sFN, получают in vitro при обработке растворимого фибронектина пептидом 76-аа, III1-С (называемым Anastellin), который образован из повтора первого типа III в фибронектине. Исследования с мышами, имеющими опухоли, in vivo показали, что систематическое введение Анастеллина или sFN подавляло рост опухоли, ангиогенез и метастазы (Yi, M and Ruoslahti, E; A fibronectin fragment inhibits tumour growth, angiogenesis, and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98,620-624). Ангинекс является синтетическим пептидом из 33 аминокислот, который первоначально был смоделирован для воспроизведения бета-складчатой структуры антиангиогенных белков. Было показано,что ангинекс вызывает полимеризацию фибронектина, и он неактивен у мышей, которые испытывают недостаток в плазменном фибронектине (Akerman, ME, Pilch, J, Peters, D, and Ruoslahti, E; Angiostaticpeptides use plasma fibronectin to home to angiogenic vasculature, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2005, 102,2040-2045). В одном из исследований изучалось влияние FN на D-галактозамин (GalN)/липополисахарид(LРS)-индуцированной молниеносной печночной недостаточности у мышей. Результаты позволяют предположить, что FN предохранял от GalN/LPS-индуцированной печночной недостаточности с помощью механизма, включающего ингибирование активации NF-kappaB, который вызывал снижение количества TNF-alpha и приводил к повышению уровня ИЛ-10, а повышение Bcl-xL индуцировало блокаду апоптических сигналов, при которых подавлялся апоптоз гепатоцитов, вызванный GalN/LPS (Qiu, Z,Kwon, AH, Tsuji, К, Kamiyama, Y, Okumura, T, and Hirao, Y; Fibronectin prevents D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced lethal hepatic failure in mice, Shock, 2006, 25, 80-87). Другие результаты указывают на то, что FN стимулирует пролиферацию клеток карциномы легких человека и снижает апоптоз invitro посредством индуцирования экспрессии гена СОХ-2 и биосинтеза PGE2 (Han, S, Sidell, N, RoserPage, S, and Roman, J; Fibronectin stimulates human lung carcinoma cell growth by inducing cyclooxygenase-2(COX-2) expression, Int. J Cancer, 2004, 111, 322-331). Как было показано, фибронектин (FN) подвержен альтернативному сплайсингу исключительно во время органогенеза и генеза опухоли. Один такой сплайс-вариант, экстрадомен-В (ED-B) FN, обычно отсутствует в нормальных взрослых тканях, и он был предложен в качестве маркера ангиогенеза опухолиcell lung carcinoma, Exp.Lung Res., 2005, 31, 701-711). Mhawech и соавторы показали, что опухоли головы и шеи с положительным окрашиванием по EDB приводили к значительно более низкой общей выживаемости пациентов (Mhawech, P, Dulguerov, P, Assaly, M, Ares, С, and Allal, AS; EB-D fibronectin expressionin squamous cell carcinoma of the head and neck, Oral Oncol., 2005, 41, 82-88). Экспрессия фибронектина регулирует ангиогенез и васкулогенез и участвует в ответной реакции головного мозга на ишемию и пароксизм. Генная экспрессия фибронектина была значительно повышена(р 0,05) в фибробластах SWS (Синдром Стерджа-Вебера-Краббе) по сравнению с фибробластами из нормальной кожи при SWS (Comi, AM, Hunt, P, Vawter, MP, Pardo, CA, Becker, KG, and Pevsner, J; Increased fibronectin expression in sturge-weber syndrome fibroblasts and brain tissue, Pediatr. Res., 2003, 53,762-769). Концентрация фибронектина была значительно выше при раке яичника в сравнении с доброкачественными опухолями яичника и нормальным яичником. Концентрация фибронектина значительно повышена у пациентов с раком яичника с рецидивирующей болезнью в сравнении с пациентами с раком яичника без рецидива. Экспрессия образованных из опухоли матриолитических ферментов и фибронектина важны для роста опухолей яичника (Demeter, A, Szirmai, К, Olah, J, Papp, Z, and Jeney, A; Elevatedexpression of matrix metalloproteinase-9, and fibronectin concentration in recurrent epithelial ovarian cancer,Orv. Hetil, 2004, 145, 1617-1624). Тот факт, что FN был одним из всего двух генов, которые были в значительно пониженном количестве из 1.176 проанализированных генов в рамках исследования, подчеркивает гипотезу, что FN может вести себя как важный ген-супрессор метастазов при раке груди (Urtreger, AJ,Werbajh, SE, Verrecchia, F, Mauviel, A, Puricelli, LI, Kornblihtt, AR, and Bal de Kier Joffe ED; Fibronectin isdistinctly downregulated in murine mammary adenocarcinoma cells with high metastatic potential, Oncol. Rep.,2006, 16, 1403-1410). В докладе сообщается, что были обнаружены три растворимых фибронектиновых пептида (RGD,-9 018456CS-1 и FN-C/H-V), вызывающих апоптоз легочных фибробластов. Апоптоз появлялся при нарушении адгезии (аноикоз). Использование малых фибронектиновых пептидов для способствования апоптозу фибробластов обосновывается в дальнейшем исследовании в качестве возможной антифибротической терапии (Hadden, HL and Henke, CA; Induction of lung fibroblast apoptosis by soluble fibronectin peptides,Am.J Respir.Crit Care Med, 2000, 162, 1553-1560). В другом исследовании было продемонстрировано, что фибронектин (FN) стимулирует пролиферацию клеток немелкоклеточного рака легких человека(NSCLC). Оно показывает, что FN увеличивает количество белка ММР-9, экспрессию мРНК и желатинолитическую активность в клетках NSCLC (Han, S, Ritzenthaler, JD, Sitaraman, SV, and Roman, J; Fibronectin increases matrix metalloproteinase 9 expression through activation of c-Fos via extracellular-regulatedkinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in human lung carcinoma cells, J Biol Chem., 2006, 281,29614-29624). В одном исследовании было изучено, могут ли подавляющие опухоль эффекты от соединений витамина D (VD) быть опосредованы механизмами, которые управляют клеточной адгезивностью. Введение небольшой интерферирующей РНК против FN привело к понижению уровня экспрессии FN и уменьшило клеточную адгезивность к коллагеновой матрице типа I. Эта находка придает особое значение FN при моделировании клеточной адгезивности при раке щитовидной железы и, по крайней мере,частично в опосредовании действия VD на рост опухолевых клеток (Liu, W, Asa, SL, and Ezzat, S; lalpha,25-Dihydroxyvitamin D3 targets PTEN-dependent fibronectin expression to restore thyroid cancer cell adhesiveness, Mol. Endocrinol., 2005, 19, 2349-2357). Генерирование опухолеассоциированных изоформ FN позволяет разработку специфических лигандов (например, антител), которые могут быть использованы для селективной доставки терапевтических веществ к участкам распространения опухоли. FN используется в качестве мишени для биомолекулярного вмешательства как для разработки ингибирующих молекул, блокирующих взаимодействие FN с интегринами и другими рецепторами на поверхности клетки, так и для разработки основанной на лигандахtarget for tumour therapy, Int. J Cancer, 2005, 118, 1331-1339). В одном исследовании было продемонстрировано, что лечение при экспрессии in vivo рекомбинантного полипептида CBD-Hepll фибронектина,называемого СН 50, сильно ингибировало рост опухоли, инвазию опухоли и ангиогенез. Генная терапия СН 50 не только продлевала продолжительность жизни мышей, имеющих гепатокарциному, но и также подавляла рост и инвазивную способность опухоли в селезнке и распространение ее метастазов в печень. Подводя итог, данные находки предполагают потенциальную пользу от СН 50 в генной терапии против рака печени (Liu, Y, Huang, В, Yuan, Y, Gong, W, Xiao, H, Li, D, Yu, ZR, Wu, FH, Zhang, GM, andFeng, ZH; Inhibition of hepatocarcinoma and tumour metastasis to liver by gene therapy with recombinant CBDHepII polypeptide of fibronectin, Int. J Cancer, 2007 121 (1) 184-92). Фибронектин (FN) имеет криптический функциональный сайт (последовательность YTIYVIAL внутри 14-го типа III повтора), противодействующий клеточной адгезии к внеклеточной матрице. 22-мерный FN-пептид, содержащий данный сайт,именуемый FNIII14, ингибирует бета 1 интегрин-опосредованную адгезию без связывания с интегринами. Исследование показывает, что FNIII14 обладает потенциалом для воспрепятствования клеточным метастазам лимфомы (Kato, R, Ishikawa, T, Kamiya, S, Oguma, F, Ueki, M, Goto, S, Nakamura, H, Katayama,T, and Fukai, F; A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin, Clin Cancer Res., 2002, 8, 24552462). Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)EGFR играет важную роль в регуляции нормальной клеточной пролиферации, дифференциации и выживаемости. По этой причине в ряде видов человеческих опухолей статус EGFR часто изменен и обычно соотносится с плохим прогнозом. В опухолевых клетках он способствует их росту и выживаемости посредством различных дивергентных сигнальных путей (Maehama, T and Dixon, JE; The tumour suppressor, PTEN/MMACl, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,J Biol Chem., 1998, 273, 13375-13378). Нарушения EGFR являются одним из наиболее распространенных молекулярных отклонений от нормы в глиобластомах (Zawrocki, A and Biernat, W; Epidermal growth factor receptor in glioblastoma, Folia Neuropathol., 2005, 43, 123-132). Амплификация EGFR и гиперэкспрессия мРНК являются частым явлением в глиомах высокой степени злокачественности астроцитного происхождения, и они всегда сильно ассоциированы с увеличенным уровнем белка EGFR (Wong, AJ, Bigner, SH, Bigner, DD, Kinzler, KW, Hamilton, SR, and Vogelstein,B; Increased expression of the epidermal growth factor receptor gene in malignant gliomas is invariably associated with gene amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1987, 84, 6899-6903;Chaffanet, M, Chauvin, C,Laine, M, Berger, F, Chedin, M, Rost, N, Nissou, MF, and Benabid, AL; EGF receptor amplification and expression in human brain tumours, 1992, Eur. J Cancer, 28, 11-17). О гиперэкспрессии белка без генной амплификации сообщалось в 27% случаев глиобластом (GBM), однако также сообщалось, что менее злокачественные астроцитомы и олигодендроглиомы демонстрируют экспрессию EGFR без прохождения генной амплификации (Reifenberger, J, Reifenberger, G, Ichimura, K, Schmidt, ЕЕ, Wechsler, W, and Collins, VP;Epidermal growth factor receptor expression in oligodendroglial tumours, Am J Pathol, 1996, 149, 29-35). Прогностические выводы из амплификации/гиперэкспрессии EGFR при опухолях головного мозга противоречивы. Некоторые авторы не обнаружили никакого влияния EGFR амплификации/гиперэкс- 10018456 прессии на выживаемость пациентов (Olson, JJ, Barnett, D, Yang, J, Assietti, R, Cotsonis, G, and James, CD;glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes,Brain Pathol, 1998, 8, 655-667; Waha, A, Baumann, A, Wolf, HK, Fimmers, R, Neumann, J, Kindermann, D,Astrahantseff, K, Blumcke, I, von, DA, and Schlegel, U; Lack of prognostic relevance of alterations in the epidermal growth factor receptor-transforming growth factor-alpha pathway in human astrocytic gliomas, J Neurosurg , 1996, 85, 634-641), в то время как другие делают вывод, что эти изменения были негативным прогностическим фактором (Etienne, MC, Formento, JL, Lebrun-Frenay, С, Gioanni, J, Chatel, M, Paquis, P, Bernard, C, Courdi, A, Bensadoun, RJ, Pignol, JP, Francoual, M, Grellier, P, Frenay, M, and Milano, G; Epidermalof survival in astrocytic tumours given definitive irradiation, Int. J Radiat. Oncol. Biol Phys., 1996,34,809-815). Существует немного лечебных подходов к молекуле EGFR на раковой клетке. Особенно тщательно исследованные включают: терапию со специфическим антителом с использованием невооруженных антител или антител, конъюгированных с токсинами, липосомами или нуклидами, и применение ингибиторов рецепторной тирозинкиназы. Имеется несколько видов моноклональных антител, направленных против EGFRwt. Их применение приводит к блокировке доступа к рецептору его лигандов (цетуксимаб) и/или быстрой интернализации рецептора (ABX-EGF) (Sridhar, SS, Seymour, L, and Shepherd, FA; Inhibitors of epidermal-growth-factor receptors: a review of clinical research with a focus on non-small-cell lung cancer, Lancet Oncol, 2003, 4, 397-406). Так как EGFRwt встречается также на поверхности нормальных клеток, то побочные эффекты могут ограничить его использование.EGFR гиперэкспрессирован при плоскоклеточной карциноме головы и шеи (HNSCC), где уровни экспрессии соотносятся с сокращением выживаемости. Терапии, блокирующие EGFR, показали свою ограниченную эффективность в клинических исследованиях и, в первую очередь, когда они были скомбинированы со стандартной терапией. EGFRvIII экспрессируется в HNSCC, где он способствует улучшению роста и резистентности для нацеливании на дикий вид EGFR. Эффективность в борьбе против опухоли стратегий нацеливания EGFR может быть улучшена при добавлении EGFRvIII-специфического блокирования (Sok, JC, Coppelli, FM, Thomas, SM, Lango, MN, Xi, S, Hunt, JL, Freilino, ML, Graner, MW,Wikstrand, CJ, Bigner, DD, Gooding, WE, Furnari, FB, and Grandis, JR; Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting, Clin Cancer Res.,2006, 12,5064-5073). Другая стратегия представляет собой селективное индуцирование отмирания клеток глиобластомы и других раковых клеток, которые гиперэкспрессируют рецептор EGF. С использованием невирусного вектора доставки, нацеленного на рецептор EGF, синтетическая анти-пролиферативная dsPHK (полиинозин-цитозин [poly IC]), сильный активатор апоптоза, была нацелена селективно на раковые клетки. Нацеленный на EGFR poly IC индуцировал быстрый апоптоз у клеток-мишеней in vitro и in vivo. Доставка в опухоли EGFR-нацеленного poly IC индуцировала полную регрессию образовавшихся ранее внутричерепных опухолей у голых мышей без очевидных побочных токсических эффектов на нормальной ткани головного мозга. Спустя один год после завершения лечения у прошедших лечение мышей не было рака,и они были здоровы (Shir, A, Ogris, M, Wagner, E, and Levitzki, A; EGF receptor-targeted synthetic doublestranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer, and adenocarcinoma tumours in mice, PLoS. Med, 2006Jan; 3(1):e6. Epub 2005 Dec 6). Применение небольших интерферирующих РНК (siPHK) стало эффективным и высокоспецифическим инструментом для модуляции генной экспрессии, и обширный ряд онкогенов был успешно "выключен". siPHK-опосредованное снижение уровня EGFR было продемонстрировано в двух установленных клеточных линиях глиомы с разными уровнями экспрессии EGFR (U373 MG, LN18). Уровень экспрессии EGFR мРНК и белка был снижен на 70-90%. Однако лечение siPHK не производило ингибирующего эффекта на клеточную пролиферацию, миграцию и статус активации, связанных с EGFR сигнальных каскадов. В соответствии с данными результатами анализ генной экспрессии с микрочипами показал только небольшие, хотя и специфические изменения в паттернах экспрессии. В заключение, эти данные указывают на то, что специфическое снижение уровня EGFR может быть недостаточным для монотерапевтического подхода при лечении злокачественной глиомы (Vollmann, A, Vornlocher, HP,Stempfl, T, Brockhoff, G, Apfel, R, and Bogdahn, U; Effective silencing of EGFR with RNAi demonstrates nonEGFR dependent proliferation of glioma cells, Int. J Oncol., 2006, 28,1531-1542). Несколько проведенных клинических исследований показали многообещающие результаты. Например: h-R3 является гуманизированным моноклональным антителом, которое распознает внешний- 11018456 домен EGFR с высокой аффинностью, ингибируя активацию тирозинкиназы. Для оценки безопасности, иммуногенности и предварительной эффективности h-R3 с пациентами с недавно поставленным диагнозом глиомы высокой степени злокачественности проводилось исследование фазы I/II (Ramos, ТС, Figueredo, J, Catala, М, Gonzalez, S, Selva, JC, Cruz, TM, Toledo, C, Silva, S,Pestano, Y, Ramos, M, Leonard, I, Torres, O, Marinello, P, Perez, R, and Lage, A; Treatment of high-gradeEKB-569 является сильным, низкомолекулярным, селективным и необратимо действующим ингибитором рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который был разработан в качестве противоракового агента. Исследование фазы 1 с эскалацией дозы проводилось для японских пациентов. Основываясь на критериях RECIST, протекание болезни было стабильным, но радиографически наблюдалась регрессия опухоли (Yoshimura, N, Kudoh, S, Kimura, T, Mitsuoka, S, Matsuura, K, Hirata, K, Matsui, K, Negoro, S, Nakagawa, K, and Fukuoka, M; EKB-569, a new irreversible epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitor, with clinical activity in patients with non-small cell lung cancer with acquired resistance to gefitinib, Lung Cancer, 2006, 51, 363-368). Гефитиниб, специфический ингибитор ассоциированной с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) тирозинкиназы, продемонстрировал эффективность в подгруппе пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), для которых была безуспешной стандартная химиотерапия. Также сообщалось о противоопухолевом эффекте при метастазах в головном мозге от NSCLC. Кроме того, мутацииEGFR показали сильную взаимосвязь с чувствительностью к гефитинибу для NSCLC. Была проанализирована эффективность гефитиниба при метастазах в головном мозге от NSCLC и оценена взаимосвязь этой эффективности с мутациями EGFR. Гефитиниб оказался эффективным для лечения метастазов головного мозга в подгруппе пациентов. Данные позволяют сделать предположение о возможной взаимосвязи между эффективностью гефитиниба в лечении метастазов головного мозга и мутациями EGFRCHI3L2 был первоначально идентифицирован в хондроцитах. Его часто описывали как антигенмишень при ревматическом артрите. Релевантной взаимосвязи CHI3L2 с раком установлено не было. Имелось подозрение, что хитиназа-3-подобные белки стимулируют пролиферацию человеческих клеток соединительной ткани, например, фибробластов, посредством активирования внеклеточной сигналрегулируемой киназы и опосредованных РКВ (протеинкиназа) сигнальных путей (Recklies AD, White С,Ling Н; The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase- and protein kinase Bmediated signalling pathways; Biochem J. 2002; 365:119-126). У мышей был обнаружен сильно повышенный уровень хитиназа-3-подобных белков в моделях индуцированного хеликобактериями рака желудкаCancer Sci. 2007 (3): 284-293) Даблкортин и СаМ киназа-подобный белок 2 (DCAMKL2) Белок DCX, ассоциированный с микротрубочками (МТ), играет важную роль в развитии коры головного мозга млекопитающих. Сообщалось об идентификации протеинкиназы, даблкортин киназы-2(DCAMKL2), с доменом (DC), высоко гомологичным DCX. DCAMKL2 имеет активность по связыванию с микротрубочками, ассоциированную с их DC-доменом, и активность протеинкиназы, опосредованную киназным доменом, они организованы в структуру, при которой оба домена функционально независимы. Гиперэкспрессия DCAMKL2 стабилизирует цитоскелет МТ по отношению к вызванной холодом деполимеризации. Автофосфорилирование DCAMKL2 сильно снижает его аффинность для МТ.DCAMKL2 и DCX мРНК являются специфическими для нервной системы и экспрессируются во время периода отслоения коры головного мозга. Уровень DCX снижается постнатально, тогда как высокий уровень DCAMKL2 сохраняется до взрослого возраста, позволяя предположить, что последовательностьDC имеет ранее не известные функции в зрелой нервной системе. В симпатических нейронах DCAMKL2 располагается у клеточного тела и терминальных сегментах аксонов и дендритов.DCAMKL2 может представлять собой зависимое от фосфорилирования переключение для обратимого управления динамикой МТ в районе конуса роста нейрона. Паттерны экспрессии, функциональные активности, регуляция и локализация DCAMKL2 позволяет предположить, что он функционирует параллельно или сообща с другими членами семейства генов DC (генов, кодирующих домен DC) в процессах,важных для развития нервной системы и, потенциально, в тех, которые характерны для зрелой нервной системы. DCAMKL2 состоит из двух функциональных и независимых доменов, связывающегося с и стабилизирующего МТ домена (последовательность DC) и киназного домена с активностью белковой фосфотрансферазы. Предполагалось, что последовательность DC играет ведущую роль в трансдукции внеклеточных стимулов и их внутриклеточных сигналов в изменения динамики МТ. В частности, основываясь на спо- 12018456 собности к взаимодействию с МТ по модели, регулируемой фосфорилированием, и локализации у терминальных сегментов аксонов и дендритов, регионов, в которых МТ динамически нестабильны,DCAMKL2 следует рассматривать как потенциального кандидата-медиатора быстрых цитоскелетных перестроек, которые происходят в ответ на нейронные сигнальные процессы (Edelman, AM, Kim, WY,Higgins, D, Goldstein, EG, Oberdoerster, M, and Sigurdson, W; Doublecortin kinase-2, a novel doublecortinrelated protein kinase associated with terminal segments of axons and dendrites, JBiol Chem., 2005, 280, 85318543). АТФ-чувствительный калиевый канал внутреннего выпрямления 10 (KCNJ10) Основная функция калиевых каналов внутреннего выпрямления (Kir) заключается в установлении высокой калиевой (K+) селективности мембраны глиальных клеток и строго негативного мембранного потенциала покоя (МПП), что является характерными физиологическими чертами глии. Классическая особенность Kir - это то, что K+ движется во внутрь, когда МПП отрицателен по отношению к потенциалу равновесия для K+ (Е(K, но при более положительных потенциалах ингибируются потоки наружу. Чертой глии ЦНС является ее специфическая экспрессия подвида KCNJ10, который является основным проводником K+ в мембранах глиальных клеток и играет ключевую роль в установлении глиального МПП. И, поэтому ,Kir и, в частности, KCNJ10 являются ключевыми регуляторами глиальных функций,которые, в свою очередь, определяют нервную возбудимость и проведение аксонов (Butt, AM and Kalsi,A; Inwardly rectifying potassium channels (Kir) in central nervous system glia: a special role for Kir4.1 in glialfunctions, J Cell Mol. Med, 2006, 10, 33-44). Пониженный уровень калия и глютаматные буферные способности астроцитов сказываются в чрезмерной возбудимости нейронов и абнормальной синаптической трансмиссии. Каналы KCNJ10, в первую очередь, отвечают за значительную гиперполяризацию кортикальных астроцитов и, скорее всего,играют важную роль в регуляции содержания калия. Значительное ингибирование удаления глютамата в астроцитах с разрушением KCNJ10 подчеркивает роль мембранной гиперполяризации в этом процессеpotassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes, Glia 2006, 55 (3), 274-281). Пространственная регуляция содержания внеклеточного K(+) за счет KCNJ10 в центральной нервной системе может осуществляться только благодаря неравномерному распределению KCNJ10 по поверхности глиальной клетки. Наблюдалась неверная локализация KCNJ10 в различных опухолях головного мозга человека (астроцитомы низкой и высокой степени злокачественности и олигодендроглиомы),позволяя предположить, что может быть нарушена способность глиальных клеток к регуляции содержания, приводя к притоку воды (цитотоксическому отеку) (Warm, A, Mittelbronn, M, and Wolburg, H; Redistribution of the water channel protein aquaporin-4 and the K+ channel protein Kir4.1 differs in low- and highgrade human brain tumours, Acta Neuropathol. (Berl), 2005, 109, 418-426). KCNJ10 был также представлен в повышенном количестве в астроцитах поврежденного головного мозга. Была выдвинута следующая гипотеза: в астроцитах при нормальных условиях AQP4 объединяет транспортировку воды с опосредованным KCNJ10 отводом K+, однако при патологических состояниях AQP4 содействует оттоку жидкости из отека головного мозга, a KCNJ10 регулирует возросшую концентрацию внеклеточного K+ (Saadoun, S,Papadopoulos, MC, and Krishna, S; Water transport becomes uncoupled from K+ siphoning in brain contusion,bacterial meningitis, and brain tumours: immunohistochemical case review, J Clin Pathoi, 2003, 56, 972-975)."Вариантом" данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как HLA-A или -DR, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ,которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из банка данных, определенные позиции связывающихся с HLA-A пептидов являются типичными "якорными" остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу HLA-связывающей бороздки. Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу,не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано. В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы "коровой последовательностью", имеющей конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факуль- 13018456 тативно, N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и всех или подклассов клонов Т-клетки, распознающих естественную копию). N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанием ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном,они могут иметь молекулярный вес меньше, чем 100000, предпочтительно меньше, чем 50000, более предпочтительно меньше, чем 10000, и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее, чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и их варианты, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100,предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15 или 16 аминокислот. В соответствии с этим, встречающиеся в природе или искусственные варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине. Примеры для таких встречающихся в природе вариантов по длине приведены в табл. 1 для SEQID11 и 12 и 21 и 24, соответственно. Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному HLA-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, например, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Аналогично с эпитопами МНС II класса предпочтительно, чтобы остатки,которые примыкают к связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС I класса или презентировать пептид ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для выявления истинного эпитопа во время процессинга. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот. Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примере 4 настоящего изобретения или в литературе для различных аллелей МНС II класса (например, Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M,Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB50101 and DRB11501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4): 1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammenseediscordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12): 17651776). В особенно предпочтительном воплощении изобретения пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID1 по SEQ ID29."Состоящий преимущественно из" подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из SEQ ID1 по SEQ ID29 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на N- и/или С-конце фрагменты аминокислот,которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.- 14018456 Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению является белком слияния, который включает, например, 80 N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р 33, в дальнейшем "Ii"), как взятая из банка данных NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497 (Strubin, M., Mach, В. and Long,E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptidewith an unusual transmembrane polarity EMBO J. 1984, 3 (4), 869-872). Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей. В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями(-CO-NH-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Meziere etal J. Immunol. 1997, 159, 3230-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Тхелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи NH-CO вместо пептидных связей CONH, намного более устойчивы к протеолизу. Непептидной связью, является, например, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -СН=СН-, -СОСН 2-,-СН(ОН)СН 2-, и -CH2SO-. Патент США 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-CH2-NH) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NaCNBH3. Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов. Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, D-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный L-изомер. Более того, по крайней мере, один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению. Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе R.Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS),амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела "Current Protocols" в журнале "Protein Science", Eds. Coligan et al.(John WileySons NY 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков. Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов,таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. На веб-сайтах фирм Pierce Chemical Company и Sigma-Aldrich и других представлена информация о специфических реагентах. Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств. К- 15018456 реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. N-(3-(диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты. Диэтилпирокарбонат является, например, реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала. Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков. Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина, хлорамина Т. Тетранитрометан и N-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди. В последних исследованиях по модификации триптофана используются N-бромсукцинимид, 2 гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3 Н-индол (BPNSскатол). Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с PEG-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия. Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным воплощением изобретения. В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu и соавторов J. Org. Chem. 1981, 46, 3433, и в прилагающихся ссылках. Временная защита N-аминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в N,N-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6 триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются Стерминальными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина(кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотно-лабильное производное 4 гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного N,N-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезированного пептида. В дополнение возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, Bruckdorfer T,Marder О, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantitiesfor drugs of the future Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb; 5(1):29-43 и ссылки, процитированные здесь). Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая позволяет получить сырой пептид без поглотителей при лиофилизации водной фазы. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Calbiochem-Novabiochem (Великобритания) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Великобритания. Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода. Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (FAB), а также массспектрометрический анализ MALDI и ESI-Q-TOF.- 16018456 Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид),кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК,ПНК, ЦНК, РНК, мРНК и siPHK или их комбинацией как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК. Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, США. Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению использует полимеразную цепную реакцию, как раскрыто у Saiki и соавторов (1988) Science 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы. Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом,ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей,для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клеткихозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те,что раскрыты в патентах США : 4,440,859, выданном 3 апреля 1984 на имя Rutter et al, 4,530,901, выданном 23 июля 1985 на имя Weissman, 4,582,800, выданном 15 апреля 1986 на имя Crowl, 4,677,063, выданном 30 июня 1987 на имя Mark et al, 4,678,751, выданном 7 июля 1987 на имя Goeddel, 4,704,362, выданном 3 ноября 1987 на имя Itakura et al, 4,710,463, выданном 1 декабря 1987 на имя Murray, 4,757,006,выданном 12 июля 1988 на имя Toole, Jr. et al, 4,766,075, выданном 23 августа 1988 на имя Goeddel et al и 4,810,648, выданном 7 марта 1989 на имя Stalker, которые все включены сюда путем ссылки. ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция. Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам. Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для ко-трансформации желаемой клетки-хозяина. Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых здесь идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен. Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. coli и Bacillus subtilis), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки колоректального рака или глиобластомы, как те, что имеются в наличии в АТСС Cell Biology Collection. Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих pSVL имеется в наличии в Pharmacia, Pis- 17018456cataway, NJ, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является pMSG,имеющийся также в наличии в Pharmacia. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являютсяpRS403-406 и pRS413-416, и они, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla,CA 92037, США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (YIps) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Ycps). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники. Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами в некоторых случаях и типично являются штаммом Е. coli, таким как, например, Е.RR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур American Type Culture Collection(ATCC) of Rockville, MD, США ( АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС какCCL61, NIH эмбриональные клетки швейцарской мыши NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС какCRL 1658, почечные клетки обезьяны COS-1, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650 и клетки 293,являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Cohen и соавторыProc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2110 и Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у Sherman и соавторов (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Beggs) Nature 1978, 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и DEAEдекстран или липосомальные составы, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных. Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител. Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее,другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением. В предпочтительном воплощении клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным белком слияния, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), на данный момент проходят исследования в целях лечения рака простаты (Sipuleucel-T) (Small EJ, Schellhammer PF, Higano CS, Redfern CH, Nemunaitis JJ, Valone FH, Verjee SS, Jones LA, Hershberg RM.; Placebo-controlled phase 3 trial of(Provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy; Cancer. 2006; 107(1):67-74) Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида или его варианта. Этот способ включает культивирование клетки-хозяина и изолирование пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды. В другом воплощении пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.с.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшной (i.p.) инъекции,внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - s.c, i.d., i.p.,- 18018456i.m. и i.v. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются i.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. Вводиться могут дозы, к примеру, между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G,Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Nfeller M, Eriksen JA, Gaudemack G; Telomerasepeptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Важным аспектом настоящего изобретения является способ in vitro для получения активированных ЦТЛ. Способ, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном человеческими молекулами МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации ЦТЛ антиген-специфическим образом. Антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительным образом достаточное количество антигена используется с антигенпрезентирующей клеткой. В случае эпитопа МНС класса II, используемого в качестве антигена, ЦТЛ являются CD4 положительными хелперными клетками, предпочтительным образом типа TH1. Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и, предпочтительно, если клетка в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса II, то клетка является дефектной для сигнальных путей процессинга или презентации антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ. Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулы МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на обозначенную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Молекула МНС II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro. Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т 2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена. Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т 2 человека имеется в наличии в AmericanType Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговымCRL 1992; клеточная линия дрозофилы линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговымCRL 19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается у Karre и Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин не экспрессировала молекулы МНС класса I до трансфекции. Предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Т-клеточной костимуляции, такую как любая из В 7.1, В 7.2, ICAM-1 и LFA 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных GenBank и EMBL. Аналогично, в случае использования эпитопа МНС класса I в качестве антигена, ЦТЛ являютсяCD8-положительными хелперными клетками. Молекулы МНС класса I могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и, предпочтительно, чтобы клетка в естественных условиях не экспрессировала молекулы МНС класса I (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса I,то она является дефектной для сигнальных путей процессинга или презентации антигена В этом случае для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса I, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ. Если антигенпрезентирующая клетка трансфецирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащийSEQ ID1 по SEQ ID29 или вариант такой аминокислотной последовательности. Для генерации ЦТЛ in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах,описанных у Peoples et al Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92, 432-436 и Kawakami et al (1992) J Immunol 148,638-643 при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Plebanski и соавторы (1995) Eur J Immunol 25, 1783-1787 для приготовления ЦТЛ используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Jochmus и соавторы (1997) J Gen Virol 78, 1689-1695 описывают получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Hill и соавторы (1995) J Exp Med 181, 2221-2228 и Jerome и соавторы (1993) J Immunol 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. S. Walter и соавторы (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Ram- 19018456MHC/anti-CD28-coated microspheres J Immunol 2003 Nov 15; 171 (10):4974-8) описывают прайминг Тклеток in vitro с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток, который является также подходящим методом генерирования Т-клеток против выбранного пептида При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и отдельный метод детально описывается в патентеWO 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т 2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, Porta и соавторы Virology 1994, 202, 449-955,который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов). Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов по изобретению, полезны для терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми способами по изобретению. Активированные ЦТЛ, полученные с помощью приведенного выше способа будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID1 по 29. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавал клетку при взаимодействии посредством его ТКР с комплексом HLA/пептид (например, соединение). ЦТЛ полезны в способе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ. ЦТЛ, введенные пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше(т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если донор является здоровым индивидом. "Здоровым индивидом" обозначается, что индивид имеет в общем хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, для которых можно легко провести анализы и выявить. Клетками-мишенями для CD4-положительных ЦТЛ in vivo в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС классаRes., 2006, 12, 4163-4170). ЦТЛ по изобретению могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ по уничтожению клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Данный способ включает введение пациенту эффективного числа ЦТЛ, как определено выше. В понятие "аберрантно экспрессированный" мы включаем значение, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии или что ген является "молчащим" в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием "гиперэкспрессирован" мы подразумеваем, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани. ЦТЛ могут быть получены способами, известными из уровня техники, например, теми, что описаны выше. Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса ЦТЛ хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (Rosenberg, SA, Lotze, MT, Muul, LM, Chang, AE, Avis, FP,Leitman, S, Linehan, WM, Robertson, CN, Lee, RE, Rubin, JT, et al., A progress report on the treatment of 157Rosenberg, SA; Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science,2006, 314(5796): 126-129). Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, полезна для лечения нарушений, характеризующихся ускользанием клеток от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами). Предпочтительно, если медикамент является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента,или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться invitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то может быть полезно,чтобы клетки были трансфецированными, чтобы ко-экспрессировать иммуностимулирующие цитокины,такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Ожидается, что пептиды настоящего изобретения стимулируют CD4 или CD8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного CD. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют CD4 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CDS-положительные Тклетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют CD8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4 положительные Т-клетки. CD4- и CD8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении. В одном аспекте изобретения вакцина включает, по крайней мере, один пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов по изобретению или дополнительных пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II. Предпочтительно, когда пептиды по изобретению используются в вакцине или медикаменте по изобретению, они присутствуют в качестве соли, такой как, например, но не ограничиваясь ими, соль ацетата или соль хлорида. Пример 7 обеспечивает исследования вакцины IMA-910, которая содержит некоторые из пептидов настоящего изобретения, и описывает приготовление вакцины с использованием пептидов в их солевой форме и с их размером частиц. Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, например, у S. Pascolo: Vaccination with messenger RNA Methods Mol Med 2006, 127; 23-40; R. Stan, JD Wolchok and AD Cohen DNA vaccines against cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2006, 3; 613-636 или A Mahdavi and BJ Monk Recent advances in humanpapillomavirus vaccines. Curr Oncol Rep 2006, 6, 465-472. Полинуклеотидные вакцины легки в приготовлении, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "генпистолета". Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гиперва- 21018456 риабельного участка (CDR), как описывается выше. Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Тн) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают,но не ограничиваются, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA,dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Имиквимод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune,LipoVac, MF59, монофосфорил липид А, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V,Монтанид ISA-51, OK-432, ОМ-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторная система PepTel, микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848,Бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон Aquila's QS21, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox, Quil или Superfos. Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonaldDM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1): 1827; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, TNF-a), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, IL-1 и IL4) (амер. патент 5,849,589, специфически включнный сюда в его целостности путм ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, IL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis TumorImmunol. 1996 (6):414-418). Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах CpG также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, CpG-олигонуклеотиды при активации врожднной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR), в основном TLR9. Вызванная CpG активация TLR9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации TH1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи CD4 Тклеток. Отклонение в сторону TH1, вызванное стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), который обычно способствует отклонению в сторону TH2. CpG-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без CpG, в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg,Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, JUNE 2006, 471484). В патенте США 6,406,705 B1 описывается комбинированное применение CpGолигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом CpG TLR9 является dSLIM(контурный иммуномодулятор двойного действия) компании "Mologen" (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с TLR, такие как РНК, связывающаяся сTLR 7, TLR 8 и/или TLR 9. Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными CpG (например, CpR, Idera), Poly(I:C), таким как AmpliGen, не-CpG бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, XL-999, СР 547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, анти-CTLA4 и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются dSLIM, BCG, OK432, ALDARA, PeviTer и Juvlmmune. Предпочтительным образом, медикаменты настоящего изобретения являются активными против рака. Рак может быть неметастатическим или метастатическим, в частности раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия,- 22018456 раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов,раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой кожи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не-Ходжкина и миеломой. Наиболее предпочтительно,чтобы неопластическое заболевание, лечащееся способом актуального изобретения, было колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка,раком почки, гастроинтестинальной стромальной опухолью (GIST) или глиобластомой. Так как пептиды по изобретению были изолированы из глиобластомы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, легкого, почки или желудка, медикамент по изобретению будет особенно полезен, если вид рака, подвергающегося лечению, будет глиобластомой, колоректальным раком, раком поджелудочной железы, легкого, почки или желудка. Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака. Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител,масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей. Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками. Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина". Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть "нацеливание" радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как PET(позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата. В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему (а) контейнер,содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (b) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (i) применению раствора или (ii) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. Указанное оборудование может включать один или более (iii) буфер, (iv) разбавитель, (v) фильтр, (vi) иглу или (vii) шприц. Контейнер является,предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована. Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например,двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для использования или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке мо- 23018456 жет быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций,как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения. Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например,раствор бикарбоната натрия). При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет, предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя,включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению. Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента. Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению,укомплектованный для применения в комбинации с ко-введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере. Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом,шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельнуюдозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования. Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение былоs.c, и, наиболее предпочтительно, i.d. Введение может производиться инфузионным насосом. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Примеры 1. Синтез и структура. Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Fmoc. После очистки на препаративной ВЭЖХ, проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (ацетат или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды TUMAP вводят в виде солей ацетата за исключением IMA-CCN-001, который применяется в виде соли хлорида -это обусловлено техническими причинами во время процесса производства. 2. Идентификация опухолеассоциированных пептидов (TUMAPs), презентируемых на поверхности клетки. Пробы тканей. Опухолевые и здоровые ткани пациентов были предоставлены несколькими различными клиническими центрами (см. табл. ниже). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции TUMAPs при -80 С. Изоляция пептидов HLA из проб тканей. Пептидные пулы HLA из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколомHLA-A6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 49, 571-576 (1999 при использовании НLА-А 02-специфического антитела ВВ 7.2 или HLA-A, -В, -Сспецифического антитела W6/32, CNBr-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации. Детекция пептидов TUMAPs масс-спектрометрическим анализом с ESI-жидкостной хроматографией (ESI-LCMS). Полученные пулы пептидов HLA были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (CapLC, Waters), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролтном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (Q-TOF Ultima, Waters), снабженном источником ESI. Пептидные пулы наносили на предколонку С 18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм i.d.250 мм) с обратнофазным материалом С 18 в 5 мкм (Dionex). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (PicoTip, New Objective) использовали для введения в источник микро-ESI. Временем интеграции для TOF-анализатора было 1,9 с со временем задержки между измерениями в 0,1 с. Затем определяли последовательности пептидов анализом индуцированного столкновением (CID) масс-спектра (ESI-LCMS/MS). Идентифицированную последовательность пептида TUMAP подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида TUMAP с фрагментационным образцом синтетического сравниваемого пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 и фиг. 2 представлены примеры спектров, полученных из опухолевой ткани для TUMAPs,ассоциированных с МНС класса I, (фиг. 1a-1h) и TUMAPs, ассоциированных с МНС класса II (фиг. 2a2f). 3. Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению. Идентифицированные в качестве презентированных на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС пептиды, скорее всего, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания для ткани, из которой они были образованы. Для минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации такими пептидами, изобретатели фокусировали свое внимание на тех пептидах, которые образованы из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей. Идеальный пептид будет образован из белка, являющегося уникальным для опухоли и не присутствующего ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с идеальной экспрессией, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, из которых они были образованы и генерировали экспрессионные профили генов. Источники РНК и приготовление. Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены несколькими различными клиническими центрами (см. табл. 2) после получения формы информированного согласия от каждого пациента. Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) с последующей очисткой на RNeasy (QIAGEN, Hilden, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей. Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (Ambion, Huntingdon, Великобритания; Clontech, Heidelberg, Германия; Stratagene, Amsterdam, Нидерланды; BioChain, Hayward, CA, США). РНК нескольких индивидов (от двух до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были изолированы из проб крови 4 здоровых добровольцев. Качество и количество проб суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе Agilent 2100(Agilent, Waldbronn, Германия) с использованием лабораторного оборудования RNA 6000 Pico LabChipKit (Agilent). Эксперименты с микрочипами. Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов Affymetrix Human Genome (HG) U133 А или HG-U133 Plus 2.0(Affymetrix, Santa Clara, CA, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством Affymetrix (http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expressionmanual.affx). Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием Superscript RTII (Invitrogen) и олигоdТ-Т 7 праймера (MWG Biotech, Ebersberg, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию inU133 Plus 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидинфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды). Изображения сканировали на Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) или Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), а данные анализировали в программе GCOS (Affymetrix) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовали 100 генов "домашнего хозяйства", предоставленных Affymetrix (http://www. affymetrix.com/support/technical/maskfiles.affx). Относительные значения экспрессии были подсчитаны с показаний сигнальной программы, и значение нормальной пробы было произвольно задано значением 1,0. Экспрессионные профили всех пептидов настоящего изобретения проявляют высокую экспрессию соответствующего гена в опухолевой ткани, в то время как он не экспрессировался, или же лишь на очень низком уровне, в нормальных тканях. На фиг. 3 представлены такие профили для генов специфических для глиобластомы пептидов РТР 001 (ген: PTPRZ1, фиг. 3 а) и CHI-001 (ген: CH3L2, фиг. 3b). 4. Повторная детекция идентифицированных TUMAPs масс-спектрометрическим анализом с ESIжидкостной хроматографией (ESI-LCMS) в дополнительных опухолевых пробах.TUMAPs, идентифицированные способом ПРИМЕРА 1, систематически отслеживались на пробах колоректальных опухолей с помощью масс-спектрометрии. Полученные пулы пептидов HLA были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (CapLC, Waters), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролтном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (Q-TOF Ultima, Waters), снабженном источником ESI. Пептидные пулы наносили на предколонку С 18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм i.d.250 мм) с обратнофазным материалом С 18 в 5 мкм (Dionex). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15 до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (PicoTip, New Objective) использовали для введения в источник микро-ESI. Временем интеграции для TOF-анализатора было 1,9 с с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Для детекции дефинированных пептидов в рамках данного вида экспериментов ESILCMS проводили высокочувствительный скрининг на основе известных молекулярных масс и времени удерживания пептидов в хроматографической системе. Поэтому для выбора предшественников применялся список значений m/z предварительно идентифицированных пептидов (одно- и/или двухзарядные). Затем определяли последовательность анализом индуцированного столкновением (CID) масс-спектра(ESI-LCMS/MS). Последовательность пептида TUMAP была подтверждена сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида TUMAP с фрагментационным образцом синтетического сравниваемого пептида с идентичной последовательностью. Оценку выхода пептида HLA после очистки и воспроизводимость аналитической системы, включая время удерживания, производили с использованием интенсивности и времени удерживания избыточного эндогенного пептида HLA-A02(YLLPAIVHI, образованного из DDX5) в качестве внутреннего стандарта. Поэтому критерий включения пробы КРР для детекции предварительно идентифицированного пептида TUMAP в данных экспериментах был установлен на уровне минимальной интенсивности в 650 импульсов на измерение внутреннего двухзарядного стандартного сигнала (YLLPAIVHI) в эксперименте LCMS/MS в целях подтверждения успешной изоляции пептида HLA и правильности работы аналитической системы. На табл. 2 представлены результаты анализа проб при раке толстой и прямой кишки на различных стадиях, а также метастазов, возникающих из одного и того же первичного участка опухоли. Все пептиды HLA-A02 TUMAP были обнаружены на большинстве проб. Частота повторной детекции пептидовHLA-DR TUMAP была, в основном, ниже. Этого можно ожидать, так как для пептидов HLA II класса могут существовать несколько вариантов длин для каждой коровой последовательности. ODC-001, идентифицированный ранее TUMAP (M Diehl, кандидатская работа 1998, Университет г. Тюбинген) и, как известно, представленный в многочисленных опухолях кишечника, служил в качестве положительного контроля.- 26018456 Таблица 2. Повторная детекция пептидов TUMAP в пробах КРРdetermining peptide - MHC class I interaction, Tissue Antigens, 2002, 59, 251-258) и руководством производителя к ELISA EpI Kit. Приготовление пептидных растворов. Пептиды растворяли в DMSO + 0,5% TFA (Merck, Darmstadt, Германия) с концентрацией 10 мг/мл. Наивысшая концентрация пептидного рабочего раствора в данном анализе составила 200 мкМ, поэтому исходный раствор был разведен 1:50 в буфер пептидного раствора (PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 0,1% Lutrol-F68 и 10 мг/л Phenol red) до конечного объема в 100 мкл. С буфером пептидного раствора производили серийное пятикратное разведение. Рефолдинг комплексов HLA-A0201/пептид. В соответствии с руководством 2-кратно концентрированный раствор HLA-A0201 был приготовлен при смешивании 3 рН буфера (рН 6,6), Lutrol-F68, человеческого 2m, рекомбинантного HLAA0201 (все включены в оборудование ELISA EpI Kit) с PBS. Для процесса рефолдинга 15 мкл серийных разведений пептида и 15 мкл 2-кратно концентрированной смеси МНС смешивали в 96-луночных планшетах (Nunc, Rochester,NY, USA) и инкубировали при 18 С в течение 48 ч. Количественный подсчет для комплексов методом ELISA. Планшеты Maxisorp (Nunc, Rochester, Нью-Йорк) покрывали 5 мкг/мл антитела w6/32 в покрывающем буфере (рН 9,6), инкубировали в течение 24 ч при 4 С и блокировали 5% сухим обезжиренным молоком (Merck, Darmstadt, Германия) в PBS в течение ночи при 4 С. Стандартный МНС-комплекс (ELISA EpI Kit) разводили 2% сухим обезжиренным молоком в PBS(SMP/PBS) до концентрации 10 нМ. Приготавливали серийное 3,16-кратное разведение и переносили его на покрытый и заблокированный планшет Maxisorp. Комплексы пептид-МНС 10-кратно разводили 2%SMP/PBS, переносили в тот же самый планшет Maxisorp и инкубировали в течение 2 ч при 4 С. Антитела кролика анти-h2m (ELISA EpI Kit) добавляли в разведении 1:2500 в 2% SMP/PBS и инкубировали в течение 1 ч при 4 С. Амплификационный буфер (HRP-конъюгированный козий анти-кроличий полимер) и мышиная сыворотка (оба поставляются с оборудованием ELISA EpI Kit) разводили в 2% SMP/PBS, добавляли в планшеты и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Добавляли проявляющий буфер (тетраметилбензидин, ТМВ; ELISA EpI Kit), планшеты инкубировали, предохраняя от попадания света, в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,2 М серной кислоты (VWR, Darmstadt, Германия). Считывание планшетов производили при OD450 нм на ридере- 27018456 Результаты представлены на фиг. 4. Более низкое значение KD отражает более высокую аффинность к HLA-A0201. Аффинности связывания охватывают диапазон приблизительно четырех 102, но большинство пептидов имеют похожие аффинности связывания внутри одного промежутка 102 (С 20-001,ODC-001, PCN-001, ТОР-001). Аффинность MUC-001 примерно на один фактор 102 ниже в сравнении с большинством включенных лигандов, но, несмотря на это, MUC-001 был в состоянии индуцировать Тклеточный ответ, когда использовался в вакцине против почечной карциномы (Wierecky, J, Muller, MR,Wirths, S, Halder-Oehler, E, Dorfel, D, Schmidt, SM, Hantschel, M, Brugger, W, Schroder, S, Horger, MS,Kanz, L, and Brossart, P; Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendriticcells in metastatic renal cancer patients, Cancer Res., 2006, 66, 5910-5918). С другой стороны, NOX-001 имеет слегка повышенную аффинность связывания, a TGFBI-001 обладает самой высокой связывающей силой, имея в 100 раз более низкий показатель KD в сравнении с большинством пептидов. Выражая в абсолютных понятиях, показатели KD между 0,01 и 0,1 нМ, как те, что наблюдались для большинства пептидов, уже представляют собой высокую силу связывания. Похожие аффинности наблюдались также у пептидов, содержащихся в вакцине против почечно-клеточной карциномы IMA901,которая была успешно протестирована (Н. Singh-Jasuja, S. Walter, Т. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich,M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activityMayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster3017). Поэтому характеристики связывания пептидов настоящего изобретения достаточно сходны с характеристиками пептидов, которые, как было продемонстрировано, индуцировали in vivo Т-клеточный ответ. 6. Иммуногенность in vitro для пептидов, презентируемых МНС I класса. Прайминг in vitro CD8+ Т-клеток. Для проведения стимуляций in vitro искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-CD28, сначала были изолированы МПК(моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки HLA-A02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Colbe, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя "Katharinenhospital" г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала in vitro в Тклеточной среде (ТСМ), состоящей из RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Colbe, Германия), 100 U/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (Cambrex, Verviers, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Pro,Neustadt, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (Cambrex). Лимфоциты CD8+ были изолированы с использованием CD8+ MACS - оборудования для положительного отбора (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные CD8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (PromoCell, Heidelberg, Германия) и 10 U/мл ИЛ-2 (Chiron,Munich, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-CD28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, О, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ,Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded oncalibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978) с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы HLA-A0201, в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи,были получены в соответствии с методом, описанным в работе Altman и соавторов (Altman, JD, Moss,PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, JI, McMichael, AJ, and Davis, MM; PhenotypicNatl Acad Sci USA, 1987, 84, 4611-4615) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Nгидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (Perbio, Bonn, Германия). Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5,60 мкм(Bangs Labooratories, Illinois/США). рМНС использовали в качестве положительных и отрицательных контролей, это были A0201/MLA-001 (пептид ELAGIGILTV из модифицированного Melan-A/MART-1) и A0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI из DDX5) или A0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV), соответственно. 800.000 гранул / 200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина анти-CD28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при ко-инкубации 1106 CD8+ Т-клеток с 2105 промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (PromoCell) в течение 3-4 дней при 37 С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 U/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37 С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается у Altman, JD,- 28018456(BD, Heidelberg, Германия) на четырехцветном цитометре FACSCalibur (BD). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех CD8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа производили с помощью программы FCS Express (De Novo Software). Прайминг in vitro специфических лимфоцитов тетрамер+ CD8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что, по крайней мере, в одной подлежащей оценке простимулированной in vitro лунке одного здорового донора содержалась специфическая CD8+ Т-клеточная линия после стимуляции in vitro (т.е. данная лунка содержала, по крайней мере, 1% специфического тетрамера+ среди CD8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем). Пептиды настоящего изобретения исследовали вместе с пептидами с известной иммуногенностьюin vivo для сравнения. Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий,специфических для NOX-001 и ODC-001, представлено на фиг. 5. Результаты обобщены ниже, в табл. 3. Таблица 3. Иммуногенность in vitro пептидов по изобретению в сравнении с пептидами вакцины Здесь обобщаются результаты экспериментов по иммуногенности in vitro, проведенных изобретателями. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток CD8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки. 7. Иммуногенность in vitro для пептидов, презентируемых МНС II класса. Хелперные Т-клетки играют важную роль в содействии ЦТЛ при активации и поддержке иммунных ответов против опухолевых клеток. Поэтому пептиды МНС II класса были включены в вакцину IMA910.TGFBI-004, один из трех пептидов II класса, содержащийся в IMA910, был проверен на его иммуноген- 29