Способ идентификации низкомолекулярных веществ, имитирующих эпитопы млекопитающих, и способ получения специфических анти-идиотипических моноклональных антител

007182 Настоящее изобретение относится к способу идентификации низкомолекулярных веществ, имитирующих эпитопы млекопитающих, и к способу получения специфических антиидиотипических моноклональных антител. Специалисту известны способы получения иммунологических связывающих молекул, в частности антител. Общепринятые способы основываются на иммунизации подопытных животных с помощью веществ, к которым должны вырабатываться антитела. Для усиления иммунного ответа обычно добавляют адъюванты, которые содержат сильнодействующие иммуногены. Достигаемый за счет однократной или многократной иммунизации иммунный ответ у подопытного животного можно использовать в форме поликлональных антисывороток или иммортализовать путем гибридомной технологии и, в случае необходимости, осуществляют моноклонирование путем дифференциации. Альтернативно, можно также использовать содержащуюся в клетках генетическую информацию о структуре антител для получения синтетических связывающих молекул, как, например, одноцепочечные антитела (scFv). Все эти способы основываются на первоначальной иммунизации подопытного животного и поэтому зависимы от качества продуцируемого за счет этого иммунного ответа. При этом нужно учитывать,что для иммортализации иммунного ответа с помощью гибридомной технологии для иммунизации используют почти исключительно мышей, так как соответствующие иммортализированные миеломные клетки имеются только в случае используемых в лаборатории грызунов. При обычной иммунизации мышей или кроликов хороших иммунных ответов достигают только тогда, когда соответствующий белок распознается подопытным животным как "чужеродный". Это проблематично в частности тогда, когда в случае релевантными структурами являются структуры, которые сохранились в течение длительного периода эволюции. Во многих случаях особый интерес должно также представлять определение структуры веществ,действующих как иммуногенные. Поскольку ими являются, например, простые пептиды и белки, их можно идентифицировать с помощью полученных иммунологических связывающих молекул и выделять и охарактеризовывать хроматографическими способами. Точное выяснение структуры осуществляют затем, например, путем секвенирования белка. В случае иммуногенных структур, однако, речь идет о соединениях сложной структуры, охарактеризовывание которых затруднено, например, на счет доли липидных структур, так как такие соединения при очистке часто теряют свою структуру и, таким образом, более не распознаются иммунологическими связывающими молекулами. В таком случае представляли бы большой интерес вещества, обладающие идентичными пространственными структурами, так как их, быть может, можно было бы использовать в качестве компонента вакцин для проведения иммунизации. Задачей настоящего изобретения является преодоление указанных проблем и недостатков уровня техники. На фиг. 1 представлено схематическое пояснение предлагаемого согласно изобретению способа. На фиг. 2 представлен агарозный гель со вставками некоторых членов библиотеки фагов. На фиг. 3 представлена диаграмма оценки исследования путем проточной цитометрии. Согласно одному аспекту изобретения задача решается способом идентификации низкомолекулярных веществ, имитирующих эпитопы млекопитающих, включающим следующие стадии: а) выделение структур, содержащих эпитопы, которые участвуют в синцитиальном слиянии клеткаклетка трофобласта для получения эпитопного препарата;b) иммунизацию немлекопитающих с помощью эпитопного препарата для получения иммунного ответа;c) иммортализацию иммунного ответа для получения библиотеки антител;d) селекцию антител в отношении эпитопов для получения специфических моноклональных антител, способных связывать указанные эпитопы млекопитающих и ингибировать синцитиальное слияние клетка-клетка трофобласта млекопитающих,е) идентификацию низкомолекулярных веществ, содержащих указанные эпитопы, по высокому сродству связывания с полученными на стадии d) специфическими моноклональными антителами из соответствующей библиотеки, при этом эпитопы выбраны из группы, включающей эпитопы, которые образуются или высвобождаются путем изменения конформации в результате связывания лиганда в мембранном белке,составные эпитопы, которые образуются путем ассоциации субъединиц, или эпитопы, которые образуются путем ассоциации веществ различных классов. Понятие "иммунологическая связывающая молекула" относится к молекуле, которая получается прямо или косвенно путем иммунизации и может связывать другие молекулы. Понятие охватывает в частности антитела и фрагменты антител, а также одноцепочечные антитела. Понятие "специфические иммунологические связывающие молекулы" означает, что эти связывающие молекулы связывают другие вещества с константой диссоциации Kd меньше, чем 10-5 моль/л, предпочтительно от 10-6 до 10-12 моль/л."Моноклональные иммунологические связывающие молекулы" представляют собой такие молеку-1 007182 лы, которые могут продуцироваться множеством клеток, причем все клетки, однако, экспрессируют идентичные связывающие молекулы. Понятие "иммортализация иммуного ответа" означает, что полученный иммунный ответ переводится в форму, которая позволяет клеткам продуцировать in vitro в течение более продолжительного периода времени соответствующие связывающие молекулы. Понятие "библиотека иммунологических связывающих молекул" означает множество различных связывающих молекул, которые еще связаны с их информационной ДНК таким образом, что путем дифференциации членов можно получать моноклональные связывающие молекулы, в частности, библиотеки одноцепочечных антител в библиотеках фагов. Понятие "селекция иммунологических связывающих молекул" означает способ, в случае которого тестируют связывающую способность связывающих молекул в отношении веществ и выделяют молекулы, которые проявляют особенно высокое сродство связывания. В случае этого способа, на первой стадии получают эпитопные препараты. В принципе, пригодны любые эпитопы, однако, предпочтительны эпитопы, которые экспрессируются на поверхностях клеток, в частности, трофобластов или опухолевых клеток, или эпитопы, которые участвуют в слиянии клеткавирус, или об эпитопах присущих организму антител. Таким образом полученные структуры используют для иммунизации немлекопитающих, причем, в случае необходимости, добавляют обычные адъюванты. После получения иммунного ответа этот иммунный ответ иммортализуют, то есть ответственные за иммунный ответ нуклеотидные последовательности немлекопитающего переводят в систему, в которой иммунный ответ можно использовать путем экспрессии полинуклеотидной информации. Особенно предпочтительным способом для этого является переведение нуклеотидной последовательности с помощью полимеразной цепной реакции или подобных систем в scFv-фрагмент, который связывают с фагом для получения библиотеки фагов. Таким образом полученная библиотека фагов содержит широкий спектр всех имеющихся у немлекопитающих и в частности образовавшихся путем иммунизации структур антител. Так как фактически только незначительное число содержащихся в библиотеке иммунологических связывающих молекул обладает высоким сродством к желательным эпитопам, необходимо включать по меньшей мере одну стадию селекции, с помощью которой концентрируют высокоаффинные связывающие молекулы. Это можно осуществлять, например, путем фиксации эпитопных структур на твердой фазе, с которой инкубируют всю библиотеку иммунологических связывающих молекул, чтобы путем стадии промывки удалить слабоаффинные связывающие молекулы. Остающиеся высокоаффинные связывающие молекулы затем путем соответствующей дифференциации можно переводить в моноклональные специфические иммунологические связывающие молекулы. Соответствующие технологии известны специалисту как "пэннинг" и описаны, например, в лабораторном руководстве В.К. Kay, J. Winter, J.McCafferty "Phage display of peptides and proteins", Academic Press, San Diego (1996). Согласно предпочтительному варианту осуществления, в случае содержащих используемые эпитопы структур речь идет также об антителах, так что этим путем можно получать антиидиотипические связывающие молекулы. При этом, само собой разумеется, также с помощью предлагаемого согласно изобретению способа могут быть получены соответствующие антитела или фрагменты антител. Способ в частности пригоден для консервативных эпитопов. "Консервативными эпитопами" млекопитающих являются в частности, такие, которые а) встречаются у различных видов млекопитающих иb) имеют относительно незначительные видовые различия, а также, в известных случаях,с) отличаются тем, что, по меньшей мере в случае млекопитающих, позволяют определять консенсусные последовательности или консенсусные структуры, причем пункт с) имеет значение только тогда,когда речь идет об эпитопе, с помощью которого на основании его вещественной природы получают сведения о последовательности. Консервативные эпитопы млекопитающих являются в большей степени иммуногенными у немлекопитающих, чем у млекопитающих. Здесь, в частности, наряду с этим производимым от филогенеза понятием, под понятие "консервативные эпитопы" подпадают все онтогенетически релевантные человеческие эпитопы, которыеa) экспрессируются в человеческой трофобластной ткани, в человеческой эмбриональной ткани и/или в злокачественных дегенерированных клетках и тканях, а также в тканях, находящихся в промежуточных стадиях между нормальной и злокачественной дегенерированной тканью иb) не экспрессируются в соответствующих злокачественным дегенерированным клеткам нормальных, дифференцированных типически для тканей, зрелых клетках и тканях иc) характеризуются тем, что в случае млекопитающих они являются, как правило, в меньшей степени иммуногенными, чем у немлекопитающих, которые не имеют ни трофобласта, ни плаценты,d) характеризуются тем, что они важны в качестве вирусных оболочечных и слитых белков при слиянии вирус-клетка или слиянии клетка-клетка трофобласта или имеют значение для слияния клеткаклетка, соответственно, происходят от генов вирусных слитых белков, которые во время филогенеза интегрировались в соответствующий геном млекопитающего (так называемые эндогенные ретровирусные гены, ERV).-2 007182 Предлагаемый согласно изобретению способ пригоден в частности для эпитопов, которые нельзя или только с трудом можно определять биохимически или с помощью молекулярной биологии, в частности для эпитопов, которые образуются или высвобождаются путем изменения конформации в результате связывания лиганда в мембранном белке, для составных эпитопов, которые образуются путем ассоциации субъединиц, или для эпитопов, которые образуются путем ассоциации веществ различных классов,как, например, комплексы мембранных липидов или мембранных белков. Структурно пригодны любые эпитопы, в частности, белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и комбинации этих групп веществ. Другими эпитопами, для которых способ согласно изобретению может иметь особое значение, являются:a) эпитопы, которые образованы олиго- или полимерными углеводами, независимо от того, находятся они автономно или в сочетании с белками, липидами или нуклеиновыми кислотами;b) эпитопы, которые образуются путем ассоциации субъединиц на поверхности клеток, в частности,рецепторных молекул, а также контактных молекул вирус-клетка, клетка-клетка и клетка-матрикс. Предпочтительными видами для иммунизации являются птицы, в частности, куры, а также земноводные, в частности, Xenopus laevis. Следующим аспектом изобретения является способ получения специфических антиидиотипических моноклональных антител, в котором в качестве эпитопного препарата используют моноклональные антитела, полученные на стадии d) вышеописанного способа путем селекция антител в отношении эпитопов для получения специфических моноклональных антител, способных связывать указанные эпитопы млекопитающих и ингибировать синцитиальное слияние клетка-клетка трофобласта млекопитающих, и проводят стадии b) -d) вышеописанного способа. Соответствующие молекулы, имитирующие нативную структуру первоначально используемых эпитопов, могут быть выбраны из принципиально других классов веществ; они обладают подобными стереохимическими свойствами. В дальнейшем их называют также "миметики". Предлагаемый согласно изобретению способ поясняется подробнее путем ссылки на представленную на фиг. 1a схему. Путем иммунизации получают антитела, которые направлены к эпитопу. Релевантные для распознавания эпитопа структуры концентрируют путем иммортализации в библиотеке и селекционируют. С помощью этих связывающих молекул из библиотеки низкомолекулярных веществ можно идентифицировать низкомолекулярное вещество, которое несмотря на другую химическую структуру обладает такими же связывающими свойствами, как и первоначальный эпитоп. Его называют также"миметик эпитопа". На фиг. 1b представлен особый случай предлагаемого согласно изобретению способа, где в качестве несущей эпитоп структуры используют антитело. Таким же способом получают миметики, которые имитируют структуру первоначально используемого антитела."Низкомолекулярные вещества" представляют собой алифатические и/или ароматические структуры с количеством атомов углерода вплоть до 200, которые необязательно могут содержать одну или несколько функциональных групп, таких как гидроксил, карбонил, карбоксил, сложноэфирная группа, простая эфирная группа, аминогруппа, амидная группа, фосфатная группа, сульфатная группа, предпочтительно пептиды с количеством аминокислот вплоть до 50, предпочтительно менее, чем 30 аминокислот. Предпочтительным видом млекопитающего, эпитопы которого представляют интерес, является человек. Как поясняется дальше, однако, особый интерес могут представлять также эпитопы домашних животных, таких как кошка и собака, или вредителей, таких как крыса, мышь. Библиотека низкомолекулярных веществ предпочтительно содержит пептиды, в частности, в форме библиотеки фаговых пептидов. Пептиды включают предпочтительно 7-15 аминокислот, еще более предпочтительно 9 и более, соответственно, 12 и менее аминокислот. Использование предлагаемого способа поясняется далее следующими возможностями применения,однако не ограничивающими его объема. В международной заявке WO-A-93/06857 уже описана вакцина для контрацепции, где в качестве вакцины используют белковую композицию, полученную путем очистки из трофобластных мембран. Изза незначительной иммуногенности человеческих эпитопов в случае человека можно ожидать только незначительных успехов. В случае человека, ранний эмбрион имплантируют инвазивно в виде бластоцисты в стромальную часть эндометрия, то есть бластоциста проникает в эпителий матки и происходит интерстициальная имплантация. Проникающая популяция клеток представляет собой наружный эпителиальный слой клеток,так называемый трофобласт. Интерстициальная имплантация происходит в случае человека и ряда родственных млекопитающих, как, например, мыши и крысы. Во время всей беременности отдельные трофобластные клетки проникают в материнскую ткань вплоть до области эндометриальной/миометриальной переходной зоны, проникают в стенку маточных артерий и в этом месте заменяют эндотелий. При проникновении в маточный эпителий клетки трофобласта сливаются в синцитиальную структуру, процесс, который необходим для успешной имплантации. Процесс трофобластерного синцитиогенеза инициируется сигнальными эпитопами, о которых до сих пор известно только то, что в их возникновении-3 007182 прнимает участие "флип" фосфатидилсерина на наружной стороне клеточной мембраны. Так, известно,что:a) женщины с повышенным уровнем антител к фосфолипидам (например, при красной волчанке) сталкиваются с проблемами в отношении беременности и частично бесплодны;b) экстернализация фосфатидилсерина на наружной стороне клеточной мембраны непосредственно предшествует синцитиальному слиянию;c) антитела, которые вырабатываются к фосфатидилсерину у подопытных животных, in vitro могут ингибировать синцитиальное слияние."Флип" фосфатидилсерина не является трофобласт-специфичным явлением, а представляет собой событие, наступающее в рамках любого апоптоза в организме. Апоптотические клетки подвергаются слиянию редко и всегда только с идентичными клетками. Поэтому постулируются дальнейшие, возможно ассоциированные с фосфатидилсерином эпитопы, которые инициируют тканеспецифическое событие синцитиального слияния только в трофобласте, в случае генеза волокон скелетных мышц и в случае остеокластов. Так как в случае этих образующихся при участии фосфатидилсерина эпитопов речь не идет о чистых белковых эпитопах, биохимически их трудно выделить и характеризовать. С помощью предлагаемого согласно изобретению способа можно выделять пригодные в качестве вакцины вещества, которые ингибируют синцитиальное слияние. Для этого можно использовать, например, трофобластные препараты, чтобы иммунизировать кур. Так как у кур нет ни трофобласта, ни трофобластной имплантации, а также поскольку они вследствие этого имеют совсем другое, основывающееся на кладке оплодотворенных яиц воспроизводство, они способны продуцировать в достаточной степени иммунный ответ. Иммунный ответ затем можно иммортализовать, например, с помощью дисплейтехники фагов в виде библиотеки фагов. Из этих библиотек фагов выделяют такие одноцепочечные антитела, которые специфически связываются с трофобластными клетками. В качестве альтернативной или дополнительной стадии селекции можно подвергать селекции также такие одноцепочечные антитела,которые могут ингибировать синцитиальное слияние. Таким образом выделенные структуры антител можно снова использовать для выделения веществ, которые имитируют структуру трофобластных эпитопов. Библиотеки веществ, такие как библиотеки пептидов, которые, в случае необходимости, также могут быть в виде дисплей-библиотек фагов, например, можно подвергать скринингу. Так как в случае таким образом полученных пептидов речь идет об "имитаторах" первоначальных эпитопов, они могут стать основой для создания вакцин, которые после выработки антител у млекопитающего снова ингибирующе воздействуют на синцитиальное слияние и, таким образом, оказывают контрацептивное действие. Это контрацептивное действие, наряду с использованием в случае человека, также с особыми преимуществами может быть пригодным для применения в случае домашнего животного для нехирургической контрацепции, а также для борьбы с вредителями путем использования контрацептивных пищевых приманок. Согласно вышеуказанным принципам, можно реализовать следующие три контрацептивных применения предлагаемого в изобретении способа, соответственно, полученных веществ:a) Слияние трофобластной клетки происходит уже не во время внутриматочного пассажа, а только во время имплантации, замедление синцитиального слияния достигается за счет выделенных в маточный секрет IgA-антител против фосфатидилсерина. С помощью полученных согласно предлагаемому в изобретении способу низкомолекулярных веществ можно нейтрализовать такие природные IgA-антитела. Преждевременное синцитиальное слияние резко препятствовало бы росту бластоцисты.b) Хотя контрацептивные антитела непригодны для долговременной контрацепции из-за необходимости внутривенного введения и возможных иммунологических реакций, эти антитела можно использовать в качестве эпитопнесущих структур. С помощью предлагаемого согласно изобретению способа, однако, можно идентифицировать низкомолекулярные вещества, которые обладают такой же связывающей способностью, как и эти антитела, и, в силу их низкомолекулярности, пригодны для контрацепции.II. Нарушение фертильности. При так называемом aPL-синдроме образуются направленные к фосфатидилсерину антитела, которые вызывают широкий спектр клинических симптомов от нарушений свертывания до нарушения беременности вплоть до бесплодия. Эти распознающие фосфатидилсерин антитела (PS-антитела) распознают структуры, которые принимали участие в синцитиальном слиянии. Так как aPL-синдром бывает с различными проявлениями, нужно исходить из того, что миметики, которых селекционируют по предлагаемому согласно изобретению способу по отношению к ингибирующим синцитиальное слияние антителам, с одной стороны, пригодны для диагноза и классификации aPL-синдрома, с другой стороны, локальное или системное введение миметиков за счет блокирования природных PS-антител пригодно для лечения aPL-синдрома.III. Диагностика опухолей и терапия. Предлагаемый согласно изобретению способ и соединения можно использовать, сверх того, также при диагностике опухолей и лечении. Вышеописанное прохождение через ткань эпителиальных клеток,которые отделились от их базальной мембраны, вне беременности можно наблюдать только в злокачест-4 007182 венных опухолях, в частности в происходящих от эпителиальной и железистой ткани карциномах. Инвазия злокачественных дегенерированных эпителиальных клеток имеет своего онтогенетического предшественника в инварионной трофобластной клетке. Поэтому обе инвазивные ситуации подобны:a) хотя злокачественные дегенерированные клетки генетически и фенотипически отличаются от нормальных клеток организма, против этих клеток нет никакого клинически эффективного иммунного ответа. В такой форме человеческий трофобласт не отторгается, хотя формально речь идет даже об аллогаплоидном трансплантате. В обоих процессах не достигают ожидаемого, опосредованного Т-клеткой иммунного ответа;b) многие молекулы, которые во время беременности экспрессируются в трофобласте, не встречаются в нормальных зрелых тканях. Однако, они могут снова экспрессироваться во время злокачественного перерождения. Те эпитопы, которые экспрессируются как во время эмбрионального периода, так и также в рамках канцерогенеза, называют "онкофетальные эпитопы". На основании значительных аналогий между инвазией трофобласта и инвазией опухоли, в области диагностики и терапии опухолей существует дальнейшая область применения иммунологических связывающих молекул согласно изобретению и низкомолекулярных веществ.IV. Противоинфекционные средства. Слияние вирус-клетка приводит к подобным промежуточным липид-белковым комплексам на поверхности клетки, которые также образуются при синцитиальном слиянии. Мембрана адено- и ретровируса происходит из инфицированной клетки и при экструзии из клетки обогащается слитыми белками,которые, соответственно, высококонсервативны в пределах группы вирусов. При инфицировании новой клетки в случае герпесвируса и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) происходит слияние с клеточной мембраной, событие, которое подобно слиянию клетка/клетка. При синцитиальном слиянии трофобласта центральное участие принимает оболочечный белок (синцитин) человеческих эндогенных вирусовmorphogenesis", Nature, 403, 785-789 (2000. В случае вирусных инфекционных заболеваний (как, например, цитомегаловирус, гепатит С, ВИЧ) могут также появляться PS-антитела, как правило, только пассажные. По предлагаемому согласно изобретению способу получения специфических связывающих молекул для причастных к слиянию эпитопов можно получать миметики, которые пригодны в качестве вакцины. Далее, благодаря использованию таким образом полученных антител, в качестве эпитопов согласно предлагаемому в изобретении способу можно получать низкомолекулярные миметики, которые обладают связывающими свойствами в отношении ингибирующих слияние антител и, таким образом,могут применяться в качестве противоинфекционных средств. В случае генерализованных, угрожающих жизни вирусных инфекций также можно использовать полученные согласно изобретению антитела к слитой структуре вирус-клетка для пассивной иммунизации. Пример. Следующие осуществления представляют собой пример применения способа согласно изобретению. Пример охватывает стадии иммунизации немлекопитающего с помощью различных антигенных препаратов, составление библиотеки фагов, а также селекцию специфических иммунологических связывающих молекул в смысле данного способа. Иммунизация животных. Иммунизировали 12 кур породы "белый леггорн" в возрасте 6-18 месяцев. Протоколы иммунизации основывались на опубликованной стандартной схеме (M. Gassmann и др.,FASEB J., 4, 2528-2532 (1990 и включали первую инъекцию антигенного препарата (см. таблицу 2) в полном адъюванте Freund, за которой следовали две бустер-инъекции в промежуток времени, соответственно, 2-4 недели. Бустер-инъекции осуществляли с неполным адъювантом Freund. B случае, если иммунизировали с помощью живых человеческих клеток, на инъекцию вводили один миллион клеток без адъюванта (см. также таблицу 2). Спустя 5 дней после последней инъекции иммунизированных животных умерщвляли, удаляли селезенку и в стерильном изотоническом растворе доставляли в лабораторию. Препарация спленоцитов, общей РНК и кДНК В стерильных условиях селезенку разрезали на 8-10 маленьких кусков. Эти куски, далее, в пробирке Elvehjem с помощью пригодного пестика осторожно вручную суспендировали в 3 мл стерильного изотонического солевого раствора. Эту суспензию фильтровали через фильтр из высококачественной стали(150 меш), содержащиеся в фильтрате селезеночные клетки осаждали путем центрифугирования (400 g, 5 мин, комнатная температура) и затем в буфере для лизиса (0,15 M NH4Cl; 1 мМ KНСО 3; 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты; рН = 7,2) селективно лизировали эритроциты. Из остающихся спленоцитов выделяли общую РНК, а также получали кДНК за счет обратной транскрипции с помощью олиго-dT-праймеров. Полимеразные цепные реакции (PCR) для получения библиотек. Праймеры, которые можно использовать для амплификации вариабельных областей легкой (Vk) и тяжелой (Vh) цепи кДНК иммуноглобулина, представлены в таблице 1 (J. Andris-Widhorf, С. Rader, P.I.by phage display", J. Immunol. Methods, 242, 159-181 (2000. PCR осуществляли при использовании сле-5 007182 дующих параметров: начальную денатурацию проводили в течение 1 мин при температуре 94 С, затем следовали 30 циклов с денатурацией в течение 15 с при температуре 94 С, отжигом в течение 15 с при температуре 56 С и элонгацией в течение 90 с при температуре 74 С. Праймеры вводят область трансгрессии, которая требуется для PCR со сплайсингом, перекрыванием и удлинением при создании кодирующих scFv сегментов. PCR приводит к продуктам величиной примерно 350 пар оснований. После тщательной очистки продуктов их используют для PCR со сплайсингом, перекрыванием и удлинением. Полимеразная цепная реакция со сплайсингом, перекрыванием и удлинением. Эквимолярные количества (по 100 нг) амплификатов Vk и Vh использовали в PCR со сплайсингом,перекрыванием и удлинением. Далее, реакционные смеси содержали в сочетании пару специальных определенных праймеров (см. таблицу 1; J. Andris-Widhopf, C. Rader, P.I. Steinberger, R. Fuller, C.F. Barbas,III "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J. Immunol.Methods, 242, 159-181 (2000, которые, в частности, вводят в продукт необходимые для рестрикции и лигирования места рестрикционного расщепления. После начальной денатурации в течение 1 мин при температуре 94 С следовали 35 циклов с денатурацией в течение 15 с при температуре 94 С, отжигом в течение 15 с при температуре 56 С и элонгацией в течение 120 с при температуре 74 С. Желательный продукт имеет величину примерно 750 пар оснований. Вектор и лигирование. Использовали вектор pComb3H-SS (C.F. Barbas, 3rd. Curr. Opin. Biotechnol., 4, 526-530 (1993); R. Biassoni и др., Semin. Cancer Biol., 9, 13-18 (1999); D.L. Siegel и др., J. Immunol. Methods, 206, 73-85 (1997);monoclonal antibody fragments by phage display", J. Immunol. Methods, 242, 159-181 (2000. Этот вектор, а также вышеуказанные праймеры составлены и получены в Scripps Research Institut,La Jolla, Калифорния, США, специально для дисплея фагов библиотек антител. Перед лигированием вектор линеаризировали путем рестрикции с помощью Sfi I. Так как вектор содержит два асимметричных места расщепления этого фермента рестрикции, после рестрикции и очистки вектора возможно непосредственно, без дальнейшей стадии рестрикции, направленное клонирование. Параллельно этому, также продукт PCR со сплайсингом, перекрыванием и удлинением рестриктировали с помощью фермента и продукт рестрикции очищали. Составление библиотек фаговых антител. Полученный вектор (14 мкг) и продукт PCR (10 мкг) в присутствии 20 Ед. Т 4-лигазы инкубировали вместе в течение ночи при температуре 4 С, продукты реакции преципитировали с помощью этанола и ресуспендировали в 50 мкл бидистиллированной воды. С помощью этого раствора ДНК трансформировали электрокомпетентные E. coli (XL-1 Blue). Количество трансформантов определяли путем титрования на планшетах с LB-ампициллином (J. Sambrook, E.F. Fritisch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, N.Y.) и библиотеки фагов собирали после суперинфекции трансформированных E. coli с помощью фага-помощника М 13 КO7. Находящиеся в фаговой форме библиотеки хранили как по отдельности, так и также в виде смешанной общей библиотеки (кумулятивная библиотека). Для того, чтобы получить впечатление о разнообразии библиотеки и исключить доминирование некоторых немногих клонов, образцы полос 9 случайно выбранных клонов анализировали путем рестрикции вставки (см. фиг. 1). Для контроля разнообразия кумулятивной библиотеки произвольно выбирали 9 клонов, выделяли плазмиду и вставки амплифицировали путем осуществления PCR. Продукты PCR очищали, подвергали рестрикции с помощью MspI, отделяли на 2% агарозном геле и окрашивали с помощью этидиумбромида. Ряды проб располагали слева направо по возрастающей нумерации следующим образом: ряд 1: шкала величин 100 пар оснований; ряд 2: ФХ 174/НаеIII; ряд 3-11: клоны 1-9. Это показывает, что в библиотеке не доминируют немногие клоны. Селекция специфических фаговых антител из кумулятивной библиотеки. В качестве антигена для селекции выбирали комбинацию фосфатидилсерина с бета-2 гликопротеином 1 (GP1). Известно, что аутоантитела к этому комбинированному эпитопу связаны с нарушениями синцитиального слияния. Аутоантитела характеризуются тем, что они связываются с фосфатидилсерином, который появляется на наружной стороне клеток незадолго до слияния, в присутствииGP1. Для получения антител со специфичностью, которая у них сопоставима, осуществляли следующую стратегию селекции: 1) 0,1 мкг фосфатидилсерина растворяли в 100 мкл этанола и помещали в лунку (ячейку) для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) при температуре 37 С; 2) лунку промывали 3 раза в течение 5 мин с помощью бидистиллированной воды; 3) лунку инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 С с забуференным фосфатом (рН = 7,2) изотоническим солевым раствором (содержащим 10 % фетальной телячьей сыворотки). Параллельно этому, также селекционируемые фаги инкубировали с тем же самым раствором в тех же самых условиях в не загруженной фосфатидилсерином лунке. Телячья сыворотка при этом служит в качестве блокирующего реагента, как также в качестве источника GP1. Человеческий и бычий GP1 представляют собой высокогомологичные белки, которые оба распознаются человеческими аутоантителами;-6 007182 4) суспензию фагов помещали в содержащую фосфатидилсерин лунку и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 С; 5) после этого времени инкубации содержащую фаги суспензию удаляли из лунки и промывали по меньшей мере 3 раза по 5 мин с помощью забуференного фосфатом (рН = 7,2) изотонического солевого раствора (содержащего 10% фетальной телячьей сыворотки) для удаления неспецифически связывающих фагов, а также таких фагов, которые сами реагируют с GP1; 6) связывающие фаги элюировали с помощью глицинового буфера (рН = 2,2), раствор нейтрализовали и полученные фаги использовали для инфекции E. coli XL-1 Blue. После амплификации элюированных фагов в E. coli в течение ночи собирали продуцированные фаги и в стадии 1 снова вводили в цикл. Таким образом, стадии 1-5 осуществляли последовательно в целом пять раз. При этом результативность стадий промывки в стадии 5 в случае каждого цикла повышалась за счет более продолжительной промывки. Из полученной после последнего цикла популяции фагов выделяли 15 случайных клонов и приготовляли суспензию моноклональных фагов путем культивирования в течение ночи. Выделенные клоны, а также неселекционированные фаги кумулятивной библиотеки тестировали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа для фагов на их реакционную способность в отношении фосфатидилсерина. Для этого осуществляли стадии 1-5 как описано выше. Затем инкубировали лунки с поставляемым готовым мышиным антителом к фагам, а также со связанным с пероксидазой антителом к мышиным иммуноглобулинам. Пероксидазу обнаруживали путем хромогенной реакции и количество красителя определяли фотометрически в ридере для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA-Reader). Более высокая экстинкция указывает на более высокое число связывающих фагов. Результаты, полученные для 15 клонов, и кумулятивная библиотека представлены в таблице 3. Среди 15 клонов имеются несколько(1, 2, 4, 8, 10 и 15), которые намного сильнее связываются с фосфатидилсерином, чем фаги кумулятивной библиотеки. Это подтверждает успешное концентрирование и селекцию специфически связывающих антител из кумулятивной библиотеки. Тест на слияние. Таким образом клонированные фаговые антитела к GP1 и PHS (фосфатидилсерин) исследовали в тесте на слияние. Целью этого теста является определение функциональных свойств фагового антитела,которые безусловно не должны совпадать с его связывающей силой в отношении PHS, соответственно,GP1. Для этого используют клетки человеческой трофобластной клеточной линии АС-1 М 17, которые обладают спонтанной степенью слияния примерно 20-30% после посева в сосуды для культивирования. Клетки этой клеточной линии сначала размножают до достаточного количества и затем разделяют на две популяции, которые окрашивают с помощью различных, имеющихся в продаже флуоресцентных красителей (DiI и DiO, окрашивание согласно указаниям поставщика молекулярных проб, Европа BV,Лейден, Нидерланды). После того, как клетки были тщательно промыты (5 раз по 10 мин) для удаления промывкой возможно приставших, не интегрировавших в мембрану остатков красителя, клетки смешивают в случае популяции клеток и совместно при низкой плотности клеток инкубируют в течение 24 ч в стандартных условиях культивирования (5% диоксида углерода, 38 С, при влажности воздуха 90%) вHams F12 (10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики). После этой фазы культивирования клетки отделяют от дна чашки для культивирования с трипсином, суспендируют и в проточном цитометре определяют, сколько из имеющихся клеток за счет слияния проявило двойную флуоресценцию. На фиг. 3 приведен пример такой оценки теста на слияние в проточном цитометре. В контрольных условиях (фиг. 3 а, в присутствии неспецифического фага М 13) спонтанная степень слияния составляет 19%, в то время как клон 2 специфичных к GP1 фагов приводит к снижению степени слияния на 11%. Таблицы Таблица 1. Последовательности праймеров для амплификации Vh и Vk, а также PCR с перекрыванием и удлинением Таблица 3. Сравнение 15 клонов с исходной библиотекой согласно твердофазному иммуноферментному анализу (ELISA) фагов-9 007182 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ идентификации низкомолекулярных веществ, имитирующих эпитопы млекопитающих,включающий следующие стадии:a) выделение структур, содержащих эпитопы, которые участвуют в синцитиальном слиянии клеткаклетка трофобласта для получения эпитопного препарата;b) иммунизация немлекопитающих с помощью эпитопного препарата для получения иммунного ответа;c) иммортализация иммунного ответа для получения библиотеки антител;d) селекция антител в отношении эпитопов для получения специфических моноклональных антител, способных связывать указанные эпитопы млекопитающих и ингибировать синцитиальное слияние клетка-клетка трофобласта млекопитающих,e) идентификация низкомолекулярных веществ, содержащих указанные эпитопы, по высокому сродству связывания с полученными на стадии d) специфическими моноклональными антителами из соответствующей библиотеки,при этом эпитопы выбраны из группы, включающей эпитопы, которые образуются или высвобождаются путем изменения конформации в результате связывания лиганда в мембранном белке,составные эпитопы, которые образуются путем ассоциации субъединиц, или эпитопы, которые образуются путем ассоциации веществ различных классов. 2. Способ получения специфических антиидиотипических моноклональных антител, в котором в качестве эпитопного препарата для иммунизации используют моноклональные антитела, полученные на стадии d) п.1, и проводят стадии b-d) п.1 с получением специфических антиидиотипических моноклональных антител. 3. Способ по по п.1 или 2, отличающийся тем, что моноклональными антителами являются одноцепочечные антитела (scFv). 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что эпитопы экспрессируются на поверхности трофобласта. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком, домашним животным, таким как собака или кошка, или вредителем, таким как мышь или крыса. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что библиотека низкомолекулярных веществ содержит пептиды. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что библиотека низкомолекулярных веществ представляет собой библиотеку фаговых пептидов.