Композиции прокариотической фенилаланин-аммиак-лиазы и способы применения указанных композиций

КОМПОЗИЦИИ ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ ФЕНИЛАЛАНИН-АММИАК-ЛИАЗЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ КОМПОЗИЦИЙ Изобретение направлено на фенилаланин-аммиак-лиазу (PAL), продуцируемую прокариотами, где такая прокариотическая PAL представляет собой такую, где вариант PAL имеет более высокую фенилаланин-превращающую активность и/или пониженную иммуногенность по сравнению сPAL дикого типа. Изобретение, таким образом, обеспечивает композиции бактериальной PAL и ее биологически активных фрагментов, мутантов, вариантов и аналогов, а также способы получения,очистки и применения таких композиций для терапевтического и промышленного назначения. Перекрестная ссылка на родственные заявки Заявка на данное изобретение является частичным продолжением заявки США 11/807227, поданной 25 мая 2007 г., которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте. Область изобретения Настоящим изобретением обеспечиваются прокариотическая фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и композиции на ее основе, а также оптимизация таких композиций для повышения каталитической активности и стабильности PAL с одновременным снижением иммуногенности и/или протеолитической чувствительности PAL. Также настоящим изобретением обеспечивается применение такой оптимальной композиции PAL для терапевтического и промышленного назначения. Предпосылки изобретенияPAL представляет собой фермент, отсутствующий у млекопитающих, который широко распространен в растениях (Koukol, et al., J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hanson, et al., The Enzymes. 7:75-166Commun. 1358-1359 (2003 и может рекомбинантно продуцироваться в Escherichia coli. Репрезентативный перечень PAL включает Q9ATN7 Agastache rugosa; 093967 Amanita muscariaUstilago maydis (головневый гриб); P45735 Vitis vinifera (виноград); и Q8VXG7 Zea mays (кукуруза). Различные исследования сфокусированы на применении фермента фенилаланин-аммиак-лиазы(PAL, EC 4.3.1.5) для фермент-заместительной терапии для лечения фенилкетонурии (PKU) (Hoskins, etPKU представляет собой врожденное нарушение аминокислотного метаболизма, которое возникает в результате нарушенной активности печеночной фенилаланингидроксилазы (PAH), фермента, ответственного за метаболизм фенилаланина. Пациенты с PAH мутациями, которые приводят к PKU и гиперфенилаланинемии (HPA), демонстрируют повышенные уровни фенилаланина, нарушенную физиологию нервной системы и пониженное развитие познавательной способности. У пациентов с тяжелой формойPKU существует потенциальная возможность необратимой умственной отсталости, если уровни фенилаланина не будут поддерживаться на низком уровне при помощи диетических ограничений. PAL преобразует фенилаланин в аммиак и коричную кислоту, безвредный метаболит, который далее метаболизируется и выделяется в моче в виде гиппурата (Hoskins et al. (1980), ibid; Hoskins, et al., Biomed MassSpectrom. 11(6):296-300 (1984. Существующая терапия PKU включает соблюдение на протяжении всей жизни диеты с низким содержанием аминокислоты фенилаланина (Levy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96(5):1811-1813 (1999. Такую лечебную диету трудно соблюдать (Matalon, et al., Genet. Med. 6(1):27-32 (2004); Woolf, et al., Arch.Dis. Child. 33(167):31-45 (1958); Kim, Mol Ther. 10(2):220-224 (2004, и она не всегда устраняет вредные неврологические эффекты, которые могут быть вызваны повышенными уровнями фенилаланина(Sarkissian, et al., Mol. Genet. Metab. 69:188-194 (2000. Менее чем идеальный контроль режима питания во время беременности может привести к врожденным дефектам (Levy, (1999), ibid). Кроме того, очень трудно для PKU/HPA пациентов жить нормальной жизнью, следуя при этом ограничительной диете, и лечебная диета может быть связана с дефицитом некоторых питательных веществ, и дефицит некоторых таких веществ является вредным для развития головного мозга (Levy, (1999), ibid). Большинство диетических продуктов с низким содержанием фенилаланина имеют органолептические свойства, которые являются настолько неудовлетворительными, что компрометируют такое лечение (Levy (1999), ibid). Поэтому разработка терапевтического лечения могла бы заменить или дополнить существующую лечебную диету и предотвратить неврологические поражения у пациентов с PKU, особенно у пациентов с наиболее тяжелыми формами этого заболевания. В 1999 году Scriver с коллегами представили сообщение о проведенных ими начальных исследованиях по применению фермента PAL из Rhodosporidium toruloides (Sarkissian, et al. (1999), ibid) для фермент-заместительной терапии в случаях PKU. Исследование мышиной модели PKU и HPA продемонстрировало, что введение PAL (либо путем интраперитонеальной инъекции, либо перорально, с использованием PAL в сочетании с ингибитором апротининпротеазы, либо PAL, рекомбинантно экспрессируемого и присутствующего внутри клеток E.coli) было связано с более низкими уровнями фенилаланина в плазме крови. Кроме того, предварительные исследования, где описывается применение PAL для пациентов с PKU, показали снижение уровней фенилаланина при использовании PAL при введении в форме желатиновых капсул с энтеросолюбильным покрытием (Hoskins, et al. (1980), ibid) или при использовании экстракорпоральной фабрики фермента (Ambrus, et al., Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987. Эти исследования говорят о том, что PAL защищен против протеолитического разложения, существенные снижения уровней Phe в плазме можно достичь при пероральном введении. Также было предложено применение PAL для лечения рака на основании способности этого фермента ограничивать поступление фенилаланина из питательных веществ в раковые клетки и, таким образом, ингибировать рост опухоли (Fritz, et al., J. Biol. Chem. 251(15):726 (1976); Roberts, et al., Cancer Treat(6):1063-1068 (1979); Wieder, et al., J. Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979. Однако вводимая путем внутривенной инъекции пегилированная PAL быстро выводилась из кровотока после 13-й инъекции. Кроме того, PAL-опосредованное снижение фенилаланина предотвращало пролиферацию мышиного лейкоза и метастатической меланомы (Abell, et al., Cancer Res. 33:2529-2532 (1973); Roberts, et al. (1976),ibid; Shen, et al. (1977), ibid). Бактериальная PAL из морской бактерии Streptomyces maritimus может служить в качестве важного источника бактериостатического агента энтероцина. S.maritimus PAL, EncP, катализирует начальную стадию синтеза энтероцина, которая представляет собой преобразование фенилаланина в коричную кислоту (Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002.PAL можно использовать для промышленного синтеза метилового эфира L-фенилаланина (для продукции аспартама) (D'Cunha, et al., Enzyme and Microbiol. Technology. 19(6):421-427 (1996); Hamilton, etal., Trends in Biotechnol. 3(3):64-68 (1985 и других замещенных производных L-фенилаланина, которые используют в качестве фармацевтических предшественников (патентная заявка США 20020102712).PAL также может иметь сельскохозяйственное применение, где PAL участвует в начальном ферментативном процессе, приводящем к фенилпропаноидам, которые продуцируют лигнины, кумарины и флаваноиды в растениях, грибах и бактериях. Таким образом, модуляция активности PAL может влиять на различные сельскохозяйственные явления, такие как побурение плодов. Кроме того, моделирование лекарственных средств на основе структуры для конструкции активного центра ингибиторов PAL может привести к эффективным гербицидам (Рорре, et al. (2003), ibid). Хотя PAL потенциально имеет различные промышленные и терапевтические применения, применение PAL может быть ограничено пониженной специфической активностью и протеолитической нестабильностью. Подобно другим терапевтическим белкам, применение PAL в качестве ферментной терапии связано с некоторыми недостатками, такими как иммуногенность и протеолитическая чувствительность. Кроме того, необходим тонкий баланс между сродством к субстрату и активностью фермента для достижения и поддержания контроля уровней фенилаланина в плазме в нормальных, немного узких, пределах при расстройствах, характеризующихся гиперфенилаланемией. До сих пор не было предпринято никаких согласованных попыток для улучшения этих параметров из-за недостаточной информации о структуре и биохимических свойствах этого белка. Таким образом, остается потребность в молекулах PAL с оптимальными кинетическими характеристиками, включая сильную каталитическую активность и больший период биологической полужизни,большую биохимическую стабильность и/или ослабленную иммуногенность. Краткое описание изобретения Некоторые бактериальные PAL были уже идентифицированы как часть HAL/PAL семейства, включая, но не ограничиваясь этим, PAL из Streptomyces maritimus (также известная как EncP, SEQ ID NO:5,фиг. 4), PAL/HAL из Nostoc punctiforme (Accession ZP00105927 из Nostoc punctiforme ATCC 29133,submitted October 1, 2004, NCBI Microbial Genomes Annotation Project) (SEQ ID NO:2, фиг. 4), PAL/HAL из Anabaena variabilis (Gene ID 3679622, Ava3988 фенилаланин/гистидин-аммиак-лиаза [Anabaena variabilis ATCC 29413, March 31, 2006 (SEQ ID NO:4, фиг. 4), фотосинтетический прокариот Anacystis nidulans (Lofflehardt, Z. Naturforsch. 31(11-12):693-9 (1976, грамотрицательные бактерии из семействаPAL была оценена в Streptomyces maritimus (Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002. Цианобактерии, такие как Anabaena и Nostoc, были исследованы в отношении их продукции биоактивных натуральных продуктов, которые образуются через смешанные поликетидные-пептидные биосинтетические пути (Moore, B.S., Natural Products Reports. 22(5):580-593 (2005); Becker, et al., Gene. 325:35-42(2004); Hoffman, et al., Gene 311:171-180 (2003. Настоящее изобретение основано на открытии, что прокариотические или бактериальные PAL могут служить в качестве эффективного лечения PKU и других расстройств. В настоящем изобретении рассматриваются композиции бактериальной PAL и ее биологически активных фрагментов, мутантов, вариантов и аналогов с улучшенными свойствами, такими как более сильная каталитическая активность, более высокая биохимическая стабильность и для терапевтического применения ослабленная иммуногенность и большая биологическая полужизнь. Настоящее изобретение также обеспечивает способы получения и очистки бактериальной PAL и ее биологически активных фрагментов, мутантов, вариантов и аналогов и способы применения таких композиций для терапевтического и промышленного назначения. Как это используется в настоящем описании, "бактериальная PAL" и "прокариотическая PAL" используются взаимозаменяемо и означают (1) PAL дикого типа из прокариотических организмов, включая, но не ограничиваясь этим, PAL из Streptomyces maritimus (также известна как EncP, SEQ ID NO:5,фиг. 4), Nostoc punctiforme (SEQ ID NO:2, фиг. 4), Anabaena variabilis (SEQ ID NO:4, фиг. 4), Anacystisnidulans (Lofflehardt (1976), ibid), Photorabdus luminescens TT01 (Williams, et al. (2005), ibid) и Streptomyces verticillatus (Bezanson, et al. (1970), ibid); (2) фрагменты, мутанты, варианты и аналоги таких ферментов дикого типа, которые сохраняют подобную (т.е. по меньшей мере 50%) каталитическую активность в отношении фенилаланина и которые в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения демонстрируют повышенную каталитическую активность, и/или больший период полужизни, и/или пониженную иммуногенность; и (3) химически модифицированные варианты таких ферментов дикого типа,их фрагментов, мутантов, вариантов и аналогов, связанные с другими химическими фрагментами, которые обеспечивают другие благоприятные эффекты, такие как повышенный период полужизни. Например, любые ссылки на способы получения или применения прокариотической PAL, ее фрагментов, мутантов, вариантов, аналогов или их химически модифицированных вариантов и композиции такого фермента(ферментов) либо для терапевтических, либо для промышленных целей означают ссылки на способы получения, применения или формулирования всех таких ферментов дикого типа, их фрагментов, мутантов, вариантов, аналогов или их химических модификаций. В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает бактериальную PAL и ее биологически активные фрагменты, мутанты, варианты или аналоги. Один вариант воплощения представляет собой бактериальную PAL из Nostoc punctiforme (SEQ ID NO:2) или ее биологически активный фрагмент, мутант,вариант или аналог. Другой вариант воплощения представляет собой бактериальную PAL из Anabaenavariabilis (SEQ ID NO:4) или ее биологически активный фрагмент, мутант, вариант или аналог. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения варианты сохраняют остатки активного центра дикого типа в положениях, соответствующих Ser 210 Ala-Ser-Gly триада (211-213), Asp214, Leu 215,Asn270, Val269, Leu266, Leu 134, His137, Lys468, Glu496, Gln 500 в PAL из Rhodosporidium toruloides или консервативную замену(ы) этого(их) остатка(ов) активного центра, из которых Ala-Ser-Gly триада в положении 211-213, как считают, представляет собой сайт связывания для фенилаланина. Желательные варианты могут включать белки, в которых один или несколько цистеиновых остатков были заменены другим аминокислотным (например, сериновым) остатком для уменьшения агрегации белка, которая может быть связана с пониженной активностью фермента, повышенной иммуногенностью и/или другими неблагоприятными эффектами in vivo. Желательные варианты могут включать гибридные белки, в которых фермент является слитым с другим гетерологичным полипептидом, таким как нативная или модифицированная константная область иммуноглобулина или его фрагмента, которая сохраняет спасенный эпитоп, известный из уровня техники как увеличивающий период полужизни. В настоящем изобретении также рассматриваются химически модифицированные варианты таких полипептидов, которые связаны с химическим фрагментом, что обеспечивает другие благоприятные эффекты. Например, из уровня техники известно, что неспецифическое или сайт-специфическое (например,N-концевое) связывание водорастворимых полимеров с полипептидами увеличивает период полужизни и связывание с химическими фрагментами также может понизить иммуногенность и улучшить стойкость к протеазе. Такую бактериальную PAL выделяют и очищают в соответствии со способами по настоящему изобретению, и она, таким образом, присутствует в количествах, которые делают возможным использование этого фермента в терапевтических целях. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения используют кДНК, кодирующую полную бактериальную PAL или бактериальную PAL дикого типа. Однако в других вариантах воплощения можно использовать кДНК, кодирующую ее биологически активный фрагмент или мутант. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает композиции оптимизированной бактериальной PAL, полученной методами молекулярной инженерии на основе структуры, и/или химически-модифицированных (например, пегилированных) форм PAL. Конкретные варианты воплощения предусматривают оптимальные композиции PAL с улучшенной специфической активностью, повышенной стабильностью, пониженной иммуногенностью и/или протеолитической чувствительностью,подходящие для терапевтического применения. Один вариант воплощения представляет собой пегилированную форму Nostoc punctiforme PAL с улучшенной специфической активностью. Другой вариант воплощения представляет собой пегилированную форму Anabaena variabilis PAL с улучшенной специфической активностью. В различных вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование PAL варианта описано со ссылкой на отношение PAL:ПЭГ или ПЭГ:PAL. Как это используется в настоящем описании и если не указано иное, отношение "PAL:ПЭГ" относится к отношению лизиновых остатков в PAL варианте к молекулам PEG в реакции пегилирования. Подобным образом, как это используется в настоящем описании и если не указано иное, отношение "ПЭГ:PAL" относится к отношению молекул PEG к лизиновым остаткам в PAL варианте в реакции пегилирования. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении рассматриваются пегилированные варианты PAL с пониженной иммуногенностью. Другой вариант воплощения представляет собой пегилированную форму Nostoc punctiforme PAL (NpPAL) варианта с пониженной иммуногенностью. Другой вариант воплощения представляет собой пегилированную форму Anabaena variabilis PAL (AvPAL) варианта с пониженной иммуногенностью. Конкретные варианты воплощения предусматривают NpPAL или AvPAL варианты, в которых пегилирование достигается путем взаимодействия NpPAL или AvPAL варианта с водорастворимым полимером, например полиэтиленгликолем (ПЭГ). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование достигается путем взаимодействия, один раз, NpPAL илиAvPAL варианта с PEG при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В одном варианте воплощения PAL вариант представляет собой AvPAL вариант и пегилирование достигается с использованием PAL:ПЭГ отношения 1:3. В настоящем изобретении также рассматривается повторное пегилирование пегилированных PAL вариантов для достижения пониженной иммуногенности. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование достигается путем взаимодействия, два раза или более, NpPAL илиAvPAL варианта с PEG, каждое пегилирование при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В некоторых вариантах воплощения пегилирование достигается путем взаимодействия 2, 3, 4, 5 раз или более, NpPAL илиAvPAL варианта с PEG, каждое пегилирование при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В одном варианте воплощения PAL вариант представляет собой AvPAL вариант, и пегилирование достигается с использованием PAL:ПЭГ отношения 1:3 как для первой, так и для второй реакций пегилирования. В некоторых вариантах воплощения биологически активные сайты PAL дикого типа в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы, как это желательно, для оптимизации кинетических характеристик PAL. В одном варианте воплощения модифицированная PAL обладает активностью, достаточной для снижения, но также и поддержания уровней фенилаланина в плазме в оптимальных пределах от около 120 примерно до 240 мкМ. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL имеет kcat по меньшей мере около 0,1 s-1 или более чем около 0,5 s-1. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения биологически активная модифицированная PAL имеет kcat по меньшей мере около 0,2 s-1 или более чем около 1,0 s-1. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL имеет Km от около 10 примерно до 1000 мкМ. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL имеет Km от около 100 примерно до 1000 мкМ. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL демонстрирует ферментативную активность, которая превышает активность белка дикого типа от около 2 примерно до 1000 раз. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL демонстрирует ферментативную активность, которая превышает активность белка дикого типа примерно на 10-100%. Такие биологически активные модифицированные белки PAL могут быть образованы с использованием способов, хорошо известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез. В следующих вариантах воплощения настоящее изобретение предусматривает использование бактериальной PAL, которая метаболизирует фенилаланин (т.е. преобразует фенилаланин в другое вещество),для получения лекарственного средства для лечения дефицита активности PAH у млекопитающих, в частности у человека, а также фармацевтическую композицию, содержащую бактериальную PAL, для использования в лечении дефицита активности PAH. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает высокоочищенную PAL, выделенную из бактерий,или ее биологически активный фрагмент, мутант или аналог, отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения препараты содержат бактериальную PAL с чистотой более чем 95, 96, 97, 98, 99, 99,2, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 или 99,9%. В других вариантах воплощения относительная специфическая активность бактериальной PAL в соответствии с настоящим изобретением составляет более чем около 110% от специфической активностиPAL дикого типа. Во втором аспекте настоящее изобретение представляет новые способы использования композицийPAL для терапевтического и промышленного назначения. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении рассматриваются способы лечения расстройств, вызванных, полностью или частично, дефицитом активности PAH, путем введения терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей бактериальную PAL, субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Дефицит активности PAH можно наблюдать, например, как уровни активности 50% или менее, 25% или менее, 10% или менее либо 1% или менее, по сравнению с нормальными уровнями активности PAH, и это может проявляться в виде повышенных уровней фенилаланина, например как при гиперфенилаланемии, легкой формы фенилкетонурии или классической тяжелой фенилкетонурии. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения заболевание представляет собой фенилкетонурию (PKU). В конкретных вариантах воплощения изобретения субъект является таким, у которого диагностировано присутствие мутантной фенилаланингидроксилазы (PAH). Мутантная PAH может включать мутацию в каталитическом домене PAH. Примеры таких мутаций включают, но не ограничиваются этим, мутации F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, Р 211 Т, R241C, R261Q, A300S,L308F, А 313 Т, K320N, А 373 Т, V388M E390G, А 395 Р, P407S и Y414C. Также рассматривается способ лечения субъекта, имеющего концентрацию фенилаланина в плазме выше нормальной (например, более чем 180 или 360 мкМ), включающий введение этому субъекту композиции бактериальной PAL в количестве, эффективном для обеспечения снижения концентрации фенилаланина в плазме у субъекта. Субъект должен, очевидно, иметь концентрацию фенилаланина в плазме более чем 180 мкМ до введения бактериальной PAL. Более конкретно, субъект имеет концентрацию фенилаланина в плазме от 120 до 200 мкМ. В других вариантах воплощения субъект имеет концентрацию фенилаланина в плазме от 200 до 600 мкМ. В следующих вариантах воплощения изобретения субъект имеет концентрацию фенилаланина в плазме от 600 до 1200 мкМ. Еще один класс субъектов, подлежащих лечению, включает субъектов, которые имеют неограниченные концентрации фенилаланина в плазме более чем 1200 мкМ. В конкретных вариантах воплощения изобретения субъектом является ребенок младшего возраста,более конкретно - ребенок младшего возраста, имеющий концентрацию фенилаланина в плазме более чем 1200 мкМ. В настоящем изобретении рассматриваются способы лечения ребенка младшего возраста,страдающего фенилкетонурией, включающие введение композиции бактериальной PAL такому субъекту в количестве, эффективном для обеспечения снижения концентрации фенилаланина в плазме у этого ребенка младшего возраста, где возраст ребенка составляет от 0 до 3 лет, и ребенок младшего возраста имеет концентрацию фенилаланина в плазме от около 360 примерно до 4800 мкМ. До введения бактериальной PAL ребенок младшего возраста имеет концентрацию фенилаланина от около 1200 мкМ, и введение бактериальной PAL снижает концентрацию фенилаланина в плазме примерно до 1000 мкМ. В других вариантах воплощения до введения бактериальной PAL ребенок младшего возраста имеет концентрацию фенилаланина от около 800 мкМ, и введение PAL снижает концентрацию фенилаланина в плазме примерно до 600 мкМ. В следующих вариантах воплощения изобретения до введения PAL ребенок младшего возраста имеет концентрацию фенилаланина от около 400 мкМ, и введение PAL снижает концентрацию фенилаланина в плазме примерно до 300 мкМ. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения терапевтические способы, рассматриваемые в настоящем описании, должны снижать концентрацию фенилаланина в плазме у этого ребенка младшего возраста до концентрации от около 120 примерно до 360 мкМ или от около 120 примерно до 240 мкМ. Также в настоящем описании рассматривается способ лечения беременной женщины, страдающей гиперфенилаланинемией (HPA), включающий введение этому субъекту бактериальной PAL, отдельно или в сочетании с ограничивающей белки диетой, где введение бактериальной PAL, отдельно или в сочетании с ограничивающей белки диетой, является эффективным для снижения концентрации фенилаланина в плазме субъекта по сравнению с концентрацией в отсутствие совместного введения. В некоторых вариантах воплощения изобретения субъект имеет неограниченную концентрацию фенилаланина в плаз-5 018443 ме более чем 180 мкМ, но менее чем 600 мкМ. В других вариантах воплощения субъект имеет неограниченную концентрацию фенилаланина в плазме более чем 500 мкМ, но менее чем 1200 мкМ. В следующих вариантах воплощения изобретения субъект имеет неограниченную концентрацию фенилаланина в плазме более чем 1200 мкМ. Беременные женщины с концентрацией фенилаланина в плазме более чем 1200 мкМ являются особенно привлекательными кандидатами для такого типа лечения, так же как и субъекты, которые представляют собой женщин репродуктивного возраста, которые предполагают возможность беременности. В тех вариантах воплощения изобретения, в которых субъект имеет концентрацию фенилаланина в плазме более чем 1200 мкМ, способ дополнительно включает введение субъекту ограничивающей белки диеты. В настоящем изобретении описываются способы лечения классической тяжелой фенилкетонурии(PKU) у субъекта, включающие введение этому субъекту бактериальной PAL или ее биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или аналога, где введение бактериальной PAL является эффективным для снижения концентрации фенилаланина в плазме субъекта по сравнению с концентрацией в отсутствие введения бактериальной PAL. Субъект, выбранный для лечения в соответствии со способами по настоящему изобретению, должен иметь повышенную концентрацию Phe в плазме, при этом такая концентрация может быть более чем 1800 мкМ в отсутствие терапевтического лечения. Другие варианты воплощения изобретения рассматривают субъекта, который имеет концентрацию фенилаланина в плазме более чем 1000 мкМ в отсутствие терапевтического режима. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способы совместного введения по настоящему изобретению снижают концентрацию фенилаланина в плазме субъекта менее чем до 600 мкМ. В одном варианте воплощения концентрация снижается менее чем до 500 мкМ. В другом варианте воплощения изобретения совместное введение снижает концентрацию фенилаланина в плазме субъекта до значения от около 120 примерно до 360 мкМ. В другом варианте воплощения изобретения концентрация фенилаланина в плазме субъекта снижается до значения от около 120 примерно до 240 мкМ. Некоторые варианты воплощения изобретения включают оптимизацию дозирования в соответствии с потребностями организма, который нужно лечить, например млекопитающих или человека, для эффективного уменьшения симптомов заболевания. PAL можно вводить в виде одной суточной дозы, несколькими дозами в течение суток, в виде одной недельной дозы или в виде нескольких доз в неделю. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения PAL терапия не является непрерывной, но скорееPAL вводят ежедневно до тех пор, пока концентрация фенилаланина в плазме у субъекта не снизится менее чем до 360 мкМ. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения, где концентрацию фенилаланина в плазме субъекта отслеживают ежедневно, PAL вводят, когда наблюдается 10% повышение концентрации фенилаланина в плазме. В других вариантах воплощения дозы вводят один раз в неделю. В настоящем изобретении рассматриваются дозы по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,05 мг/кг, и они могут быть увеличены до 0,1, 0,5, 1,0 мг/кг или выше в неделю. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения доза составляет 1, 0,1 или 0,01 мг/кг/неделя. Рассматриваются различные парентеральные или непарентеральные пути введения, включая пероральный, чрескожный, через слизистую оболочку, внутрилегочный (включая аэрозолированный), внутримышечный, подкожный или внутривенный, которыми доставляют эквивалентные дозы. Также специально предусматривается введение путем болюсной инъекции или инфузии непосредственно в суставы или CSF, например, путем интратекального, интрацеребрального, интравентрикулярного введения, через поясничную пункцию или через cisterna magna. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения дозы доставляются подкожным или пероральным путем. Также предусматривается другие средства повышения активности PAL у субъектов, представляющих собой человека, включая генную терапию. Перенос PAL гена возможен через различные пути, известные из уровня техники, включая вирусные векторы, гомологичную рекомбинацию или прямую ДНК инъекцию. Этот аспект охватывает варианты воплощения изобретения, представляющие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие, полностью или частично, бактериальную PAL или ее биологически активный мутант или аналоги, которые можно вводить in vivo в клетки, испытывающие дефицитPAH. В другом варианте воплощения изобретения бактериальную PAL также можно вводить в сочетании с ограничивающей белки диетой. Ограничивающая белки диета, вводимая в способах, описанных в настоящем описании, представляет собой такую диету, которая является фенилаланин-ограничивающей диетой, где общее потребление фенилаланина субъектом ограничивается менее чем до 600 мг/день. В других вариантах воплощения ограничивающая белки диета представляет собой фенилаланинограничивающую диету, где общее содержание фенилаланина ограничивается менее чем до 300 мг/день. В следующих вариантах воплощения изобретения ограничивающая белки диета представляет собой диету, дополненную аминокислотами, такими как тирозин, валин, изолейцин и лейцин. Также рассматривается композиция, включающая бактериальную PAL и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Композиция также может включать медицинскую белковую добавку. В других вариантах воплощения композиция PAL представляет собой часть формулы для детей младшего возраста. В следующих вариантах воплощения изобретения белковая добавка не содержит фенилаланина. Белко-6 018443 вая добавка может быть усилена L-тирозином, L-глутамином, L-карнитином в концентрации 20 мг/100 г добавки, L-таурином в концентрации 40 мг/100 г добавки и селеном. Она также может включать рекомендованные суточные дозы минералов, например кальция, фосфора и магния. Добавка также может включать рекомендованную суточную дозу одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы,включающей L-лейцин, L-пролин, L-лизинацетат, L-валин, L-изолейцин, L-аргинин, L-аланил, глицин,L-аспарагин моногидрат, L-триптофан, L-серин, L-треонин, L-гистидин, L-метионин, L-глутаминовую кислоту и L-аспарагиновую кислоту. Кроме того, добавка может быть усилена рекомендованными суточными дозами витаминов A, D и Е. Добавка может включать количество жира, которое обеспечивает по меньшей мере 40% энергии добавки. Такая добавка может быть представлена в форме порошковой добавки или в форме белкового брикета. В настоящем изобретении рассматриваются способы лечения различных форм роста опухоли и рака, включая, но не ограничиваясь этим, лимфобластный лейкоз, опухоли молочной железы и меланомы. В настоящем изобретении рассматриваются способы использования бактериальной PAL для коммерческого получения фенилаланина из аммиака и циннамата. Фенилаланин используют в аспартаме,подсластителе и других пищевых продуктах, включая напитки, крупы, пирожные, яичные и сырные блюда, животные жиры, масла, рыбу и другие морские продукты, мясо и мясные продукты, молоко и молочные продукты, орехи, соусы и приправы, супы, сахар, джемы и пасты и овощи. Также предусматривается, что бактериальную PAL можно использовать для получения гербицидов и антимикробных средств, включая энтероцин и эритромицин. В третьем аспекте настоящее изобретение представляет способ получения прокариотической PAL или ее биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или аналога в количествах, которые делают возможным терапевтическое использование этого фермента. Настоящее изобретение предусматривает PAL, продуцируемую бактериями, включая, но не ограничиваясь этим, Streptomyces, Sorangium, Pseudomonas и цианобактерии, такие как Nostoc и Anabaena. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения PAL продуцируется бактериальными видами Streptomyces maritimus, S.verticillatus, Soragiumcellulosum, Nostoc punctiforme, Nostoc tobacum, Anabaena variabilis и Pseudomonas putida. В другом варианте воплощения изобретения активность прокариотического фермента PAL генерируют с использованием кДНК или ДНК последовательностей, которые происходят из последовательностей, когда-то описанных как кодирующие HAL активность или характеризующие PAL-HAL мотив, но обладающие ключевыми PAL остатками, которые отличны от HAL. В широком варианте воплощения способ включает стадию трасформации кДНК или ДНК, кодирующей, полностью или ее часть, прокариотическую PAL или ее биологически активный фрагмент, мутант, вариант или аналог в клетке, подходящей для ее экспрессии. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения используют вектор экспрессии для переноса ДНК в подходящую клетку или клеточную линию для ее экспрессии. В одном варианте воплощения трансформация кДНК происходит вE.coli и рекомбинантная бактериальная PAL сверхэкспрессируется как гибридный белок. В следующем варианте воплощения способ получения прокариотической PAL включает следующие стадии:(а) выращивание клеток, трансформированных кДНК, кодирующей всю или биологически активный вариант, фрагмент или мутант прокариотической PAL, в подходящей питательной среде до подходящей плотности с получением посевной культуры;(b) введение трансформированных клеток в биореактор;(с) подача подходящей питательной среды в биореактор и(d) выделение трансформированных клеток из среды, содержащей фермент. В одном варианте воплощения сверхэкспрессия рекомбинантной PAL происходит в виде октагистидил-меченого по N-концу гибридного белка в векторе, таком как Е.coli BL21(DE3)/pLyseS (Invitrogen), с индуцибельным промотором, например с IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид). В другом варианте воплощения изобретения сверхэкспрессия рекомбинантной PAL происходит в клеткахE.coli BL21(DE3)/pLysS без N-концевой метки. В другом варианте воплощения изобретения способ получения прокариотической PAL включает следующие стадии:(1) выращивание посевной культуры для биореактора/ферментера из глицеринового исходного раствора во встряхиваемых колбах;(2) введение такой посевной культуры в контролируемый биореактор по партиям;(3) выращивание указанной культуры в дополненной глюкозой среде, pH (7,8), 20% растворимого кислорода, взбалтывание до 1200 об/мин, 30 С до тех пор, пока плотность клеток не достигает значения(4) индукция указанной культуры при помощи 0,4 мМ IPTG;(5) выращивание указанной культуры при пониженной температуре, составляющей от 22 до 26C,до достижения изменения активности 0,1 IU(иммунизирующих единиц)/мл (приблизительно 40-48 ч, и(5) сбор бактерий путем непрерывного центрифугирования. В одном варианте воплощения клеточная культуральная среда типично имеет определенный состав,и она состоит из белка дрожжевого экстракта, пептона-триптона, глюкозы, глицерина, касаминокислот,-7 018443 следовых количеств солей и фосфатно-буферных солей. В четвертом аспекте настоящее изобретение представляет способ очистки бактериальной PAL или ее биологически активного фрагмента, мутанта или аналога. В соответствии с первым вариантом воплощения трансформированную клеточную массу выращивают и разрывают, оставляя неочищенный рекомбинантный фермент. Экзогенные вещества обычно отделяют от неочищенной массы для предотвращения засорения колонок. Хроматографическую очистку осуществляют с использованием одной или нескольких хроматографических смол. Затем очищенный белок формулируют в буфер, предназначенный для обеспечения стабильной активности в течение длительного периода времени. В другом варианте воплощения изобретения способ очистки бактериальной PAL включает следующие стадии:(b) обработка лизата нагреванием для инвактивации вирусов;(с) осветление этого лизата с использованием второй стадии непрерывного центрифугирования и/или глубокой фильтрации;(d) пропускание осветленного лизата через стадию фильтрации с активированным углем;(е) пропускание фильтрата из (d) через конечную стадию фильтрации (как с использованием фильтра Sartorious Sartopore 0,2 мкм);(f) пропускание конечного фильтрата через хроматографическую смолу гидрофобного взаимодействия, например, бутил-гидрофобную хроматографию;(g) пропускание элюата из (f) через анионную хроматографическую смолу, например Q ионообменную колонку;(h) извлечение конечного продукта путем буферного обмена с тангенциальной проточной фильтрацией и(i) стерилизация конечного продукта. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что одну или несколько хроматографических стадий можно опустить или заменить или что порядок осуществления хроматографических стадий можно изменить в рамках настоящего изобретения. В конце, можно осуществить соответствующие стадии стерилизации, если это желательно. В пятом аспекте настоящее изобретение предусматривает скрининговые анализы для идентификации бактериальной PAL, которая может предотвращать, уменьшать или лечить повышенные уровни фенилаланина, путем контактирования клетки, содержащей повышенные уровни фенилаланина, с бактериальной PAL и определения, снижает ли бактериальная PAL такие повышенные уровни фенилаланина. Такие скрининговые анализы могут также включать стадии создания вариантов, которые включают консервативные или неконсервативные замены в активных сайтах, например Gly 142, Thr-Ser-Gly триадаStreptomyces maritimus, которые являются эквивалентыми остаткам Ser 210, Ala-Ser-Gly триада (211-213),Asp214, Leu 215, Asn270, Val269, Leu266, Leu 134, His 137, Lys468, Glu496, Gln 500 в PAL изRhodosporidium toruloides, в областях, смежных с активными сайтами, или по всей последовательности полипептида с последующим испытанием вариантов на in vitro фенилаланин-преобразующую активность. В некоторых вариантах воплощения изобретения способ представляет собой высокопродуктивный анализ. В одном варианте воплощения полные геномы бактериальных видов секвенируют и скринируют на присутствие PAL гомологов с использованием подхода на основе биоинформатики. В другом варианте воплощения изобретения каталитическую активность PAL белкового продукта таких гомологов подтверждают, например, путем испытания способности преобразовывать фенилаланин в циннамат in vitro. В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы использования композиций бактериальной PAL для диагностики заболеваний, включая, но не ограничиваясь этим, расстройства, вызванные, полностью или частично, дефицитом активности PAH. В одном варианте воплощения бактериальную PAL используют для измерения уровней фенилаланина в образцах крови. В следующем варианте воплощения в настоящем изобретении рассматриваются диагностический набор, включающий бактериальную PAL, для использования в перманентном контроле образцов крови субъектов с повышенными уровнями фенилаланина. Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения должны быть очевидны из следующего далее подробного описания. Однако должно быть понятно, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и описывают конкретные варианты воплощения настоящего изобретения, представлены исключительно в целях иллюстрации, поскольку специалистам в данной области, исходя из этого подробного описания, будут очевидны различные изменения и модификации, не выходящие за рамки сути и объема настоящего изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1 А. Последовательность гена PAL Nostoc punctiforme (SEQ ID NO:1). Фиг. 1B. Последовательность белка PAL Nostoc punctiforme (SEQ ID NO:2). Фиг. 2 А. Последовательность гена PAL Anabaena variabilis (SEQ ID NO:3). Фиг. 2 В. Последовательность белка PAL Anabaena variabilis (SEQ ID NO:4). Фиг. 3. Дерево родства ароматических аминокислотных аммиак-лиаз из прокариотов и эукариотов. Последовательности были получены из GenBank (номера доступа указаны в скобках) и их сравнивали путем выравнивания при помощи ClustalX (1.83) с использованием метода объединения с ближайшим соседом (Neighbor Joining Method). Фиг. 4. Сравнительный анализ последовательностей цианобактериальных белков PAL N.punctiforme(SEQ ID NO:6). Остатки активных сайтов, которые соответствуют PAL или HAL активности, выделены. Фиг. 5. Эффект (А) непегилированной NpPAL (1,0 IU/мл) и (В) пегилированной NpPAL 1:3 PAL:ПЭГ (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1,0 IU/мл) на уровни фенилаланина (мкМ) в течение 12-дневного периода. Фиг. 6. Эффект (А) непегилированной AvPAL (1,0 IU/мл) и (В) пегилированной AvPAL 1:3 PAL:ПЭГ (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1,0 IU/мл) на уровни фенилаланина (мкМ) в течение 12-дневного периода. Фиг. 7. Эффект пегилированной NpPAL 1:3 PAL:ПЭГ (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation)(1,0 IU/мл) на уровни фенилаланина (мкМ) в 90-дневном исследовании хронической толерантности. Фиг. 8 А. Последовательность белка фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) Anabaena variabilis с заменой цистеина на серин в положении 64 (AvPALC64S, SEQ ID NO:7). Фиг. 8 В. Последовательность белка PAL Anabaena variabilis с заменой цистеина на серин в положении 318 (AvPALC318S, SEQ ID NO:8). Фиг. 8 С. Последовательность белка PAL Anabaena variabilis с заменой цистеина на серин в положении 503 (AvPAL C503S, SEQ ID NO:9). Фиг. 8D. Последовательность белка PAL Anabaena variabilis с заменой цистеина на серин в положении 565 (AvPALC565S, SEQ ID NO:10). Фиг. 8E. Последовательность белка PAL Anabaena variabilis с заменами цистеина на серин в положениях 503 и 565 (AvPALC565SC503S, SEQ ID NO:11). Замены цистеин на серин выделены жирным шрифтом. Фиг. 9 А. Эффект замен цистеина на серин в положении 565 или обоих положениях 565 и 503 непегилированной AvPAL на in vitro специфическую ферментативную активность PAL после инкубации в течение разных периодов времени при 37C. Фиг. 9 В. Эффект замен цистеина на серин в положении 565 или обоих положениях 565 и 503 пегилированной AvPAL на in vitro специфическую ферментативную активность PAL после инкубации в течение разных периодов времени при 37C. Фиг. 10 А. Эффект замен цистеина на серин в AvPAL на образование белковых агрегатов в растворе по данным анализа методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (левая панель) или в природных условиях (правая панель). Фиг. 10 В. Эффект замен цистеина на серин в AvPAL на образование белковых агрегатов в растворе по данным анализа SEC-ВЭЖХ. Фиг. 11. Эффект замен цистеина на серин в положениях 565 и 503 (двойной мутант) в AvPAL на сайт-специфическое пегилирование при различных концентрациях ПЭГ. Фиг. 12. Эффект обработки AvPAL 0,05% раствором Tween-80 или 10 мМ EDTA на образование белковых агрегатов в растворе по данным анализа SEC-ВЭЖХ. Фиг. 13 А. Эффект обработки AvPAL дитиотреитолом (DTT) на образование белковых агрегатов в растворе по данным анализа SEC-ВЭЖХ. Фиг. 13 В. Эффект обработки AvPAL DTT и N-этилмалеимидом (NEM) на образование белковых агрегатов в растворе по данным анализа SEC-ВЭЖХ. Фиг. 14. Эффект замен цистеина на серин в положениях 565 и 503 (AvPALC565SC503S) в пегилированной AvPAL на in vivo уровни фенилаланина (Phe) у ENU2 мышей, которым вводили 0,25 IU (верхняя панель), 1,0 IU (средняя панель) или 4,0 IU (нижняя панель) фермента, по сравнению с ENU2 мышами, которым вводили носитель или 4,0 IU пегилированного AvPAL дикого типа. Фиг. 15. Эффект замен цистеина на серин в положениях 565 и 503 (AvPALC565SC503 S) в пегилированной AvPAL на массу тела ENU2 мышей, которым вводили 0,25 IU, 1,0 IU или 4,0 IU фермента, по сравнению с ENU2 мышами, которым вводили носитель или 4,0 IU пегилированного AvPAL дикого типа. Фиг. 16. Эффект замен цистеина на серин в положениях 565 и 503 (AvPAL C503S/565S) в пегилированном AvPAL на in vivo уровни фенилаланина (Phe) у ENU2 мышей, которым вводили 4 IU фермента при различных AvPAL:ПЭГ отношениях 1:1,6 (верхняя панель), 1:2,4 (средняя панель) или 1:3 (нижняя панель), по сравнению с ENU2 мышами, которым вводили носитель или 4,0 IU пегилированного AvPAL дикого типа при AvPAL:ПЭГ отношении 1:3. Фиг. 17. Эффект замен цистеина на серин в положениях 565 и 503 (AvPALC565SC503S) в пегилированной AvPAL на массу тела ENU2 мышей, которым вводили 4,0 IU фермента при различныхAvPAL:ПЭГ отношениях: 1:1,6, 1:2,4 или 1:3, по сравнению с ENU2 мышами, которым вводили носитель или 4,0 IU пегилированного AvPAL дикого типа при AvPAL:ПЭГ отношении 1:3. Фиг. 18. Эффект повторного пегилирования пегилированного AvPAL C565SC503S на специфическую in vitro активность AvPAL.(Верхняя панель). Восстановление специфической активности rAVPAL-ПЭГ, сначала пегилированного при PAL:ПЭГ отношении 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG, заштрихованные круги), после повторного пегилирования при различных PAL:ПЭГ отношениях и концентрациях лизиновых остатков и(Нижняя панель). Восстановление специфической активности rAVPAL-ПЭГ, сначала пегилированного при PAL:ПЭГ отношении 1:1 (2 мМ лизиновых остатков: 2 мМ PEG, заштрихованные квадраты) или 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG, заштрихованные круги), после повторного пегилирования при различных PAL:ПЭГ отношениях и концентрациях лизиновых остатков и PEG молекул, как указано. Фиг. 19 А. Эффект повышения отношения PAL:ПЭГ в реакции повторного пегилирования на общее пегилирование rAVPAL-ПЭГ, сначала пегилированного при PAL:ПЭГ отношении 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG), по данным анализа методом капиллярного гель-электрофореза (CGE). Фиг. 19 В. Эффект повышения отношения PAL:ПЭГ в первой реакции пегилирования на общее пегилирование rAVPAL-ПЭГ, где реакцию повторного пегилирования осуществляют при фиксированномPAL:ПЭГ отношении 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG), по данным анализа CGE. Фиг. 20. Эффект повторного пегилирования AvPALC565SC503S, сначала пегилированного приPAL:ПЭГ отношении 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG), на процент пегилирования специфических лизиновых остатков в AvPAL после повторного пегилирования при различных PAL:ПЭГ отношениях и концентрациях лизиновых остатков и PEG молекул, как указано. Лизиновый остаток в положении 2 (К 2) является 100% пегилированным во всех испытываемых условиях (не показано). Фиг. 21. Эффект повторного пегилирования AvPALC565SC503S, сначала пегилированного приPAL:ПЭГ отношении 1:3 (2 мМ лизиновых остатков: 6 мМ PEG) и повторно пегилированного при том жеPAL:ПЭГ отношении и концентрации лизиновых остатков и PEG молекул, на in vivo уровни фенилаланина (Phe) в плазме у ENU2 мышей при подкожном введении, как показано в табл. 14. Подробное описание изобретения Хотя PAL представляет собой фермент, широко распространенный в высших растениях, который катализирует неокислительное дезаминирование фенилаланина до коричной кислоты на коммитированной ступени к фенилпропаноидным метаболитам (Hahlbrock, et al., Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989, PAL встречается только в нескольких бактериях, где он участвует в бензоил-CoA биосинтезе в "S.maritimus" (Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002 и Sorangium cellulosum(Bezanson, et al., Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970. Бактериостатическое средство энтероцин представляет собой натуральный продукт морской бактерии "Streptomyces maritimus", биосинтез которого включает ряд необычных характерных особенностей (Hertweck, et al., Chem. Biol. 11:461-468 (2004); Piel, et al.,Chem. Biol. 7:943-955 (2000); Piel, et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5415-5416 (2000); Xiang, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 101:15609-15614 (2004. Среди них, образование редкой поликетидсинтазы (PKS), стартового звена бензоил-кофермента А (CoA) (Moore, et al., Nat. Prod. Rep. 19:70-99 (2002. Начальная биохимическая реакция включает преобразование аминокислоты L-фенилаланина в коричную кислоту при помощи новой бактериальной фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL, ЕС 4,3,1,5) EncP (Xiang, et al., J. Biol.Chem. 277:32505-32509 (2002. Активация коричной кислоты до ее CoA тиоэфира с последующим одним циклом бета-окисления дает бензоил-CoA (Hertweck, et al., Chem. Bio. Chem. 2:784-786 (2001);Hertweck, et al., Tetrahedron. 56:9115-9120 (2000); Xiang, et al., J. Bacterid. 185:399-404 (2003, который стимулирует PKS энтероцина типа II на удлинение цепи с семью молекулами малонил-CoA. Был охарактеризован первый прокариотический PAL-кодирующий ген (encP) (SEQ ID NO:5), и его инактивация приводит к отмене de novo коричной кислоты и синтеза энтероцина в "S.maritimus"(2002. Биосинтез энтероцина может быть восстановлен в encP-инактивированных мутантах через пополнение коричной или бензойной кислот, а также добавление плазмидного encP. Кроме того, гетерологичная экспрессия encP гена под контролем ermE промотора в Streptomyces coelicolor приводила к продукции коричной кислоты в ферментированных культурах (Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509(2002. Ген encP кодирует состоящий из 522 аминокислот белок, который значительно менее чем эукариотические PAL почти на 200 аминокислотных остатков. Хотя его последовательность является гомологичной растительным PAL, таким как из Petroselinum crispum (Rother, et al., Eur. J. Biochem. 269:30653075 (2002 (CAA57056, 30% идентичности и 48% сходства), он скорее имеет большую гомологию с бактериальными гистидин-аммиак-лиазами (HALs, EC 4.3.1.3), такими как из Pseudomonas putidaSEQ ID NO:6, фиг. 4) и с тирозин-аммиак-лиазой (TAL) из Rhodobacter capsulatus (Kyndt, et al., FEBS Lett. 512:240-244 (2002 (фиг. 3). Гомология включает консервативный сериновый остаток активного центра в положении 143 фенилаланин/гистидин/тирозинового семейства аммиак-лиаз, который является возможным предшественником модифицированного дегидроаланинового остатка в 4-метилиденимидазол-5 оновой (MIO) простетической группе (Langer, et al., Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001); Poppe, Curr. Opin.Chem. Biol. 5:512-524 (2001); Schwede, et al., Biochemistry. 27:5355-5361 (1999. EncP имеет наибольшую гомологию последовательности с AdmH (AAO39102, 63% идентичности и 76% схожести), предполагаемой фенилаланинаминомутазой, участвующей в биосинтезе андримиды в Pantoea agglomerans, которая является родственной тирозинаминомутазе Sgc4 из Streptomyces globisporus (Christenson, et al., J. Am.Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003); Christenson, et al., Biochemistry. 42:12708-12718 (2003. Следует отметить, что, поскольку encP имеет более близкую гомологию с человеческим белком (HAL), encP может быть потенциально менее иммуногенным. Также, поскольку они являются очень схожими, вероятно можно мутировать encP таким образом, чтобы он был похож на человеческий HAL, гуманизированный вариант encP.HAL и PAL, как было показано, имеют общий механизм для химически затрудненного удаления аммиака из гистидина и фенилаланина, соответственно. Что касается этих двух ферментов, сверхэлектрофильная простетическая группа 5 метилен-3,5-дигидроимидазол-4-он (MIO) активирует некислотные бета водородные атомы их соответствующих субстратов путем воздействия по типу реакции ФриделяКрафтса по ароматическому кольцу. Сигма комплекс, который образуется, препятствует экстракции протонов путем исключения доступа для каких-либо оснований к связывающему "карману" фермента. Образование экзоциклической двойной связи является ключевым в удалении аммиака, реароматизации и фрагментации. Простетическая MIO группа восстанавливается, и образуется продукт уроканат или циннамат (Рорре, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44:3668-3688 (2005. В силу высокой гомологии между HAL и PAL, консервативные области HAL и PAL называют консервативной областью HAL/PAL. Эта высокая гомология может создавать некоторые двусмысленности в базах данных, таких как NCBI, в отношении потенциальной ферментативной активности "PAL-HAL" белка, приводящие к неправильному обозначению, например, как с последовательностями белков, указанными в базе данных NCBI для Nostoc punctiforme и Anabaena variabilis. Поэтому некоторые PAL ферменты могут быть неправильно обозначены как HAL ферменты. Хотя активные сайты PAL и HAL очень схожи, можно предсказать, что они отличаются некоторыми ключевыми остатками (Calabrese et al.,Biochemistry. 43(36):11403-11416 (2004); Xiang et al. (2002), ibid; Williams et al. (2005), ibid). В частности,в HAL метионин 382 и глутамин 414 из Pseudomonas putida (SEQ ID NO:6) являются высококонсервативными во всех HAL, но всегда заменены во всех PAL, описанных к настоящему времени (эукариотических или прокариотических), лизином и глутамином соответственно (фиг. 4). Таким образом, можно сказать, что все белки с "PAL-HAL" областью и имеющие гомологи лизина 382 и глутамина 414 имеют последовательность, обозначенную как белок с PAL активностью. Это относительно недавно описанное обозначение PAL (Williams et al. (2005), ibid) позволяет правильно обозначать некоторые ферменты отHAL до PAL и может быть использовано для идентификации некоторых новых PAL ферментов из уже опубликованной базы данных генов и белков. Настоящее изобретение относится к композициям таких прокариотических PAL и их биологически активных фрагментов, мутантов и вариантов и к их применениям для терапевтического и промышленного назначения. А. Определения. Если не указано иное, следующие термины, используемые в настоящем описании, включая описание и формулу изобретения, имеют указанное ниже значение. Следует иметь в виду, что, как это используется в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают соответствующие формы множественного числа, если только из контекста явно не следует иное. Определение стандартных химических терминов можно найти в справочной литературе, включая Careyand Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, vols. A and В (Plenum Press, New York 1992). Для осуществления на практике настоящего изобретения используют, если не указано иное, традиционные способы химического органического синтеза, масс-спектрометрию, методы препаративной и аналитической хроматографии, методы химии белков, биохимии, рекомбинантной ДНК и фармакологии, известные специалистам в данной области. См., например, Т.Е. Creighton, Proteins: Structures and MolecularEnzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990). Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные выше или ниже в настоящем описании,включены в настоящий патент посредством ссылки во всей их полноте. В тексте используют следующие аббревиатуры аминокислот:"Полинуклеотид" относится к полимеру, состоящему из нуклеотидных звеньев. Полинуклеотиды включают природные нуклеиновые кислоты, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота ("ДНК") и рибонуклеиновая кислота ("РНК"), а также аналоги нуклеиновых кислот. Нуклеиново-кислотные аналоги включают такие аналоги, которые включают не встречающиеся в природе основания, нуклеотиды, которые задействованы в связях с другими нуклеотидами, отличных от природной фосфодиэфирной связи,или которые включают основания, присоединенные через связи, отличные от фосфодиэфирных связей. Таким образом, нуклеотидные аналоги включают, например и без ограничения, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, фосфорамидаты, боранофосфаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA) и подобные. Такие полинуклеотиды можно синтезировать, например, с использованием автоматического ДНК синтезатора. Термин "нуклеиновая кислота" типично относится к большим полинуклеотидам. Термин "олигонуклеотид" типично относится к коротким полинуклеотидам, как правило, не более чем около 50 нуклеотидов. Должно быть понятно, что, когда нуклеотидная последовательность представлена ДНК последовательностью (т.е. А, Т, G, С), это также включает РНК последовательность (т.е. А, U, G, С), в которой "U" заменяет "Т"."кДНК" относится к ДНК, которая комплементарна или идентична мРНК, либо в одноцепочечной,либо в двухцепочечной форме. Для описания полинуклеотидных последовательностей в настоящем изобретении используют традиционную систему обозначения: левый конец одноцепочечной полинуклеотидной последовательности обозначается как 5'-конец; левое направление двухцепочечной полинуклеотидной последовательности указывается как 5'-направление. Направление от 5'- к 3'-присоединения нуклеотидов к зарождающимся РНК транскриптам указывается как направление транскрипции. Цепь ДНК, имеющая такую же последовательность, как мРНК, указывается как "кодирующая цепь"; последовательности в цепи ДНК с такой же последовательностью, как мРНК, транскрибированная из этой ДНК, и которые расположены 5-' к 5'-концу РНК транскрипта, называются "расположенные слева последовательности"; последовательности в цепи ДНК с такой же последовательностью, как мРНК, и которые расположены 3'- к 3'-концу кодирующего РНК транскрипта, называются "расположенные справа последовательности"."Комплементарный" относится к топологической совместимости или совместимости вместе взаимодействующих поверхностей двух полинуклеотидов. Таким образом, две молекулы иогут быть описаны как комплементарные, и более того, характеристики контактных поверхностей являются комплементарными друг другу. Первый полинуклеотид является комплементарным второму полинуклеотиду, если нуклеотидная последовательность первого полинуклеотида является идентичной нуклеотидной последовательности полинуклеотид-связывающегося партнера, второго полинуклеотида. Таким образом, полинуклеотид с последовательностью 5'-ТАТАС-3' является комплементарным полинуклеотиду, имеющему последовательность 5'-GTATA-3'. Нуклеотидная последовательность является "по существу, комплементарной" ссылочной нуклеотидной последовательности, если последовательность, комплементарная рассматриваемой нуклеотидной последовательности, является, по существу, идентичной ссылочной нуклеотидной последовательности."Кодирующий" относится к присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, свойству служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, которые имеют либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот и являются результатом этого биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, продуцируемой этим геном, продуцирует белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая цепь,используемая в качестве матрицы для транскрипции, гена или кДНК могут быть указаны как кодирую- 12018443 щие белок или другой продукт этого гена или кДНК. Если не указано иное, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность", включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют ту же самую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать интроны."Рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, имеющему последовательности,которые не соединены вместе естественным образом. Амплифицированный или сборный рекомбинантный полинуклеотид может быть включен в подходящий вектор, и такой вектор можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина. Клетка-хозяин, которая включает рекомбинантный полинуклеотид, называется "рекомбинантная клетка-хозяин". Ген затем экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине с получением, например, "рекомбинантного полипептида". Рекомбинантный полинуклеотид может выполнять также и некодирующую функцию (например, промотор, репликатор, рибосомасвязывающий сайт и т.д.)."Последовательность контроля экспрессии" относится к нуклеотидной последовательности в полинуклеотиде, которая регулирует экспрессию (транскрипцию и/или трансляцию) нуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней."Функционально связанный" относится к функциональной взаимосвязи между двумя частями, где активность одной части (например, способность регулировать транскрипцию) приводит к действию на другую часть (например, транскрипция последовательности). Последовательности контроля экспрессии могут включать, например и без ограничения, последовательности промоторов (например, индуцибельного или конститутивного), энхансеров, терминаторов транскрипции, инициирующий кодон (т.е. ATG),сигналы сплайсинга для интронов и терминирующие кодоны."Вектор экспрессии" относится к вектору, включающему рекомбинантный полинуклеотид, включающий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, экспрессию которой нужно осуществить. Вектор экспрессии включает достаточно цисдействующих элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут поставляться клеткойхозяином или in vitro системой экспрессии. Векторы экспрессии включают все векторы, известные из уровня техники, такие как космиды, плазмиды (например, "голые" или содержащиеся в липосомах) и вирусы, которые включают рекомбинантный полинуклеотид."Амплификация" относится к любым средствам, при помощи которых копируется полинуклеотидная последовательность, и, таким образом, получают большее количество полинуклеотидных молекул,например, путем обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и лигазной цепной реакции."Праймер" относится к полинуклеотиду, который способен специфически гибридизоваться с определенной полинуклеотидной матрицей и обеспечивающий точку инициации для синтеза комплементарного полинуклеотида. Такой синтез происходит, когда полинуклеотидный праймер помещают в условия,в которых индуцируется синтез, т.е. в присутствии нуклеотидов, комплементарной полинуклеотидной матрицы и агента для полимеризации, такого как ДНК полимераза. Праймер типично является одноцепочечным, но может быть и двухцепочечным. Праймеры типично представляют собой дезоксирибонуклеиновые кислоты, но широкий ряд различных синтетических и природных праймеров является полезным для многих применений. Праймер является комплементарным матрице, с которой он должен гибридизоваться, чтобы служить в качестве сайта для инициации синтеза, но необязавательно должен отражать точную последовательность этой матрицы. В таком случае, специфическая гибридизация праймера с матрицей зависит от жесткости условий гибридизации. Праймеры могут быть мечеными, например хромогенными, радиоактивными или флуоресцентными, группами и их можно использовать в качестве детектируемых фрагментов."Зонд", когда используется со ссылкой на полинуклеотид, относится к полинуклеотиду, который способен специфически гибридизоваться с определенной последовательностью другого полинуклеотида. Зонд специфически гибридизуется с целевым комплементарным полинуклеотидом, но необязавательно должен отражать точную комплементарную последовательность матрицы. В таком случае специфическая гибридизация зонда с целевым полинуклеотидом зависит от жесткости условий гибридизации. Зонды могут быть мечеными, например хромогенными, радиоактивными или флуоресцентными, группами и их можно использовать в качестве детектируемых фрагментов. Первая последовательность является "антисмысловой последовательностью" по отношению ко второй последовательности, если полинуклеотид, последовательность которого представляет собой первую последовательность, специфически гибридизуется с полинуклеотидом, последовательность которого представляет собой вторую последовательность."Гибридизующийся специфически с", или "специфическая гибридизация", или "селективно гибридизоваться с" относится к связыванию, удвоению или гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты,преимущественно, с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях, когда эта последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Термин "жесткие условия" относится к условиям, в которых зонд будет гибридизоваться преимущественно с его целевой субпоследовательностью и в меньшей степени или совсем не будет гибридизо- 13018443 ваться с другими последовательностями. "Жесткая гибридизация" и "жесткие условия промывки гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как сазерн- и нозернгибридизации, являются зависимыми от последовательностей и являются разными при различных параметрах условий окружающей среды. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationacid probe assays", Elsevier, New York. Как правило, очень жесткие условия гибридизации и промывки выбирают таким образом, чтобы они были примерно на 5 С ниже, чем термическая точка плавления(Tm) для специфической последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется с идеально подходящим зондом. Очень жесткие условия выбрают так, чтобы они были равны Tm для конкретного зонда. Примером жестких условий гибридизации для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более чем 100 комплементарных остатков, на фильтре в сазерн- или нозернблоттинге является 50% раствор формалина с 1 мг гепарина при 42C, с гибридизацией, осуществляемой в течение ночи. Примером высокожестких условий промывки является 0,15 М NaCl при 72C в течение около 15 мин. Примером жестких условий промывки является 0,2SSC промывка при 65C в течение 15 мин (описание SSC буфера см. в Sambrook, et al. (1989), ibid). Часто промывке в высокожестких условиях предшествует промывка в менее жестких условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером условий промывки средней жесткости для дуплекса, например, более чем из 100 нуклеотидов является 1SSC при 45C в течение 15 мин. Примером условий промывки низкой жесткости для дуплекса,например, более чем из 100 нуклеотидов является 4-6SSC при 40C в течение 15 мин. Как правило, отношение сигнала к шуму 2 (или больше) по сравнению с наблюдаемым для несвязанного зонда в конкретном анализе гибридизации указывает на детекцию специфической гибридизации."Полипептид" относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, их родственных природных структурных вариантов и их синтетических неприродных аналогов, связанных через пептидные связи, его природным структурным вариантам и синтетическим неприродным аналогам. Синтетические полипептиды можно синтезировать, например, с использованием автоматического синтезатора полипептидов. Термин "белок" типично относится крупным полипептидам. Термин "пептид" типично относится коротким полипептидам. Для описания полипептидных последовательностей в настоящем изобретении используют традиционную систему обозначения: левый конец полипептидной последовательности является аминоконцом; правый конец полипептидной последовательности является карбоксиконцом."Консервативная замена" относится к замене в полипептиде аминокислоты функционально схожей аминокислотой. Ниже представлены шесть групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) алании (А), серии (S), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V) и 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W). Аминокислоты также можно сгруппировать следующим образом:(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro и"Аллельный вариант" относится к любой из двух или более полиморфных форм гена, занимающих тот же генетический локус. Аллельные варианты возникают естественным путем через мутацию и могут привести к фенотипическому полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности."Аллельные варианты" также относятся к кДНК, полученным из мРНК транскриптов генетических аллельных вариантов, а также белков, кодируемых ими. Термины "идентичный" или "процент идентичности", в контексте двух или более полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при их выравнивании и сравнительном анализе на максимальное соответствие, как это измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального наблюдения. Фраза "по существу, гомологичный" или "по существу, идентичный" в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, как правило, относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые имеют идентичность нуклеотидов или аминокислотых остатков по меньшей мере 40, 60, 80, 90, 95, 98% при выравнивании и сравнении на максимальное соответствие, как это измерено с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального наблюдения. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения существенная идентичность существует по области последовательностей, которая составляет в длину по меньшей мере около 50 остатков, по области, составляющей по меньшей мере около 100 остатков, или по области, составляющей по меньшей мере около 150 остатков. В другом варианте воплощения изобретения последовательности являются, по существу, идентичными по всей длине любого или обоих сравниваемых биополимеров. Для сравнения последовательностей типично одна последовательность выполняет роль контрольной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемые и контрольные последовательности вводят в компьютер, обозначают координаты субпоследовательностей, если это необходимо, и обозначают параметры программы алгоритма последовательностей. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности последовательности для исследуемой последовательности(ей) относительно контрольной последовательности на основании заданных параметров. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить, например,при помощи алгоритма локальной гомологии SmithWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), при помощи алгоритма выравнивания для определения гомологии NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970), методом поиска идентичности PearsonLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444 (1988), путем компьютеризированной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем визуального наблюдения. Одним примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает выравнивание множества последовательностей из группы соответствующих последовательностей с использованием прогрессивных попарных совмещений для демонстрации соответствия и процента идентичности последовательностей. Он также строит дерево или дендограмму, показывающую образование кластерных взаимосвязей,используемых для создания совмещения. PILEUP использует упрощение способа прогрессивного совмещения FengDoolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). Используемый способ является аналогичным способу, описанному HigGlnsSharp, CABIOS. 5:151-153 (1989). Программа может выравнивать для сопоставления до 300 последовательностей, каждая из которых имеет максимальную длину 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарной подгонки двух наиболее схожих последовательностей, образуя кластер двух подобранных последовательностей. Этот кластер затем параллельно выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером подобранных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают путем простого продления попарной подгонки двух индивидуальных последовательностей. Конечное выравнивание достигается с использованием ряда прогрессивных попарных подгонок. Программу запускают путем обозначения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для областей сравнения последовательностей и путем определения параметров программы. Например, контрольную последовательность можно сравнивать с другими исследуемыми последовательностями для определения такой взаимосвязи между этими последовательностями, как процент идентичности, с использованием следующих параметров: оценка дефолт пробела (3,00), оценка длины дефолт пробела(0,10) и средневзвешенные концевые пробелы. Другим алгоритмом, который является полезным для осуществления множественных параллельных выравниваний последовательностей, является Clustal W(Thompson, et al., Nucleic Acids Research. 22:4673-4680 (1994. Другим примером алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан вAltschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программа для осуществления BLAST анализов является публично доступной через the National Center for Biotechnology Information. Этот алгоритм включает сначала идентификацию высокооцениваемых пар последовательностей (HSP) путем определения коротких слов в длину W в исследуемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно-оцениваемому пороговому счету Т при совмещении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т указывается как пороговый счет для соседнего слова (Altschul etal. (1990), supra). Эти исходные попадания соседних слов действуют как затравки для инициации поисков для выявления более длинных HSP, содержащих их. Попадания слов затем продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока кумулятивный счет совмещений не увеличится. Кумулятивный счет определяют с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров М (наградное очко за пару совпадающих остатков; всегда 0) и N (штрафное очко за несовпадающие остатки; всегда 0). Для аминокислотных последовательностей используют счетную матрицу для определения кумулятивного счета. Продление попаданий слов в каждом направлении останавливают, когда кумулятивный счет совпадений падает на количество X от его максимально достигнутого значения; кумулятивный счет снижается до нуля или ниже из-за аккумуляции одного или нескольких отрицательно оцениваемых совмещений остатков или при достижении конца какой-либо из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве дефолтов длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве дефолтов длину слова (W) 3, ожидание (E) 10 и матрицу для определения счета BLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915(1989. В дополнение к подсчету процента идентичности последовательностей, BLAST алгоритм также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, KarlinAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873-5787 (1993. Одним критерием сходства, обеспечиваемымBLAST алгоритмом, является наименьшая суммарная вероятность (P(N, которая обеспечивает указание вероятности, с которой может возникать случайное совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с контрольной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой менее чем около 0,1, менее чем около 0,01 или менее чем около 0,001. Еще одним показателем того, что две нуклеиново-кислотные последовательности или два полипептида являются, по существу, идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно-активным с полипептом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид типично является, по существу, идентичным второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативными заменами. Еще одним показателем того, что две нуклеиново-кислотные последовательности являются, по существу, идентичными, является то, что эти две молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, как описано в настоящем изобретении."По существу чистый" или "выделенный" означает, что целевой тип является преобладающим присутствующим типом (т.е. в расчете на молярность его содержание более чем каких-либо других индивидуальных макромолекулярных типов в композиции), и, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, где целевой тип составляет по меньшей мере около 50% (на молярной основе) от всех присутствующих макромолекулярных типов. Как правило, по существу, чистая композиция означает, что около 80-90% или более макромолекулярных типов, присутствующих в композиции, составляет представляющий интерес очищенный тип. Целевой тип является очищенным, по существу, гомогенным(молекулы, присутствующие в виде примесей, не определяются в композиции традиционными методами детекции), если композиция состоит, по существу, из одного макромолекулярного типа. Молекулы растворителя, малые молекулы (500 Да), стабилизаторы (например, BSA) и элементарные ионы не рассматриваются как макромолекулярные типы в целях настоящего определения. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения соединения или конъюгаты по настоящему изобретению являются,по существу, чистыми или выделенными. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения соединения или конъюгаты по настоящему изобретению являются, по существу, чистыми или выделенными относительно макромолекулярных исходных веществ, используемых в их синтезе. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, по существу, очищенный или выделенный конъюгат PAL полипептида и активное вещество в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами."Природный", в применении к объекту, означает тот факт, что этот объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме(включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была специально модифицирована человеком в лаборатории, является природной."Дикий тип" (wt) является термином, относящимся к природной генетической форме организма. Дикий тип разграничивают с мутантной формой (организм с генетической мутацией). Термины "полипептид" и "белок" относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков,и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры,мультимеры и подобные охватываются этим определением. Как полноразмерные белки, так и их фрагменты охватываются этим определением. Эти термины также включают осуществляемые после экспрессии модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и подобные. Кроме того, в целях настоящего изобретения "полипептид" относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавки и замены (как правило, консервативные по своей природе),в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть избирательными, как, например, через сайт-направленный мутагенез, или могут быть случайными, как, например, через мутации, возникающие в связи с хозяевами, которые продуцируют белки, или ошибками в результате ПЦР-амплификации. Как это используется в настоящем описании, "аналог" или "производное" представляет собой соединение, например пептид, имеющий более чем около 70% сходства последовательности, но менее чем 100% сходства последовательности с данным соединением, например пептидом. Такие аналоги или производные могут состоять из не встречающихся в природе аминокислотных остатков, включая в качестве примера, но не ограничения гомоаргинин, орнитин, пеницилламин и норвалин, а также природных аминокислотных остатков. Такие аналоги или производные также могут состоять из одного или несколькихD-аминокислотных остатков и могут содержать непептидые взаимосвязи между двумя или более аминокислотными остатками. Термин "эффективное количество" означает дозу, достаточную для обеспечения желаемого результата на состояние здоровья, патологию и заболевание субъекта или для диагностических целей. Желаемый результат может включать субъективное или объективное улучшение у реципиента, принимающего такую дозу."Терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству средства, которое является эффективным для получения предполагаемого благоприятного эффекта на здоровье. Соответствующее "эффективное" количество в каждом индивидуальном случае может определить специалист в данной области путем рутинного экспериментирования."Профилактическое" лечение представляет собой лечение, которое вводят субъекту, который не демонстрирует признаков заболевания или демонстрирует только начальные признаки, в целях снижения риска развития патологии. Соединения или конъюгаты по настоящему изобретению можно вводить в качестве профилактического лечения для снижения вероятности развития патологии или для минимизации тяжести патологии, в случае ее развития."Терапевтическое" лечение представляет собой лечение, которое вводят субъекту, который демонстрирует признаки или симптомы патологии, в целях уменьшения или устранения этих признаков или симптомов. Признаки или симптомы могут быть биохимическими, клеточными, гистологическими,функциональными, субъективными или объективными. Соединения или конъюгаты по настоящему изобретению можно вводить в качестве терапевтического лечения или для диагностики."Диагностический" означает определение наличия или природы патологического состояния. Диагностические способы отличаются по их специфичности и селективности. Несмотря на то что конкретный диагностический способ может не поставить определенный диагноз состояния, достаточно того, если такой способ обеспечивает положительное указание, которое способствует постановке диагноза."Фармацевтическая композиция" относится к композиции, подходящей для фармацевтического применения для субъекта, которым является животное, включая человека и млекопитающих. Фармацевтическая композиция включает фармакологически эффективное количество PAL полипептида, а также включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция охватывает композицию, включающую активный ингредиент(ы) и инертный ингредиент(ы), образующий носитель, а также любой продукт, который является результатом, непосредственно или опосредованно, комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более из этих ингредиентов или диссоциации одного или нескольких из этих ингредиентов или другого типа реакций или взаимодействий одного или нескольких из этих ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению охватывают любую композицию, полученную путем смешивания соединения или конъюгата по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя."Фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому из стандартных фармацевтических носителей, буферов и эксципиентов, таких как фосфатно-буферный солевой раствор, 5% водный раствор декстрозы и эмульсии, такие как эмульсия масло-в-воде или вода-в-масле, и различные типы смачивающих веществ и/или адъювантов. Подходящие фармацевтические носители и композиции описаны вRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Фармацевтические носители зависят от предполагаемого способа введения активного вещества. Типичные способы введения включают энтеральный (например, пероральный) или парентеральный (например, путем подкожной,внутримышечной, внутривенной или интраперитонеальной инъекции либо путем местного введения,чрескожного введения или введения через слизистую оболочку). "Фармацевтически приемлемая соль" представляет собой соль, которую можно формулировать в соединение или конъюгат для фармацевтического применения, включая, например, соли металлов (натрия, калия, магния, кальция и т.д.) и соли аммиака или органических аминов. Под "фармацевтически приемлемым" или "фармакологически приемлемым" подразумевается вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. такое вещество можно вводить субъекту, не вызывая при этом каких-либо нежелательных биологических эффектов или взаимодействия неблагоприятным образом с каким-либо из компонентов композиции, в которой оно содержится. Термин "стандартная лекарственная форма", как это используется в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унифицированных доз для введения челове- 17018443 ку и субъектам, представляющим собой животнных, при этом каждая единица содержит предварительно определенное количество соединения или конъюгата по настоящему изобретению, рассчитанное как количество, достаточное для обеспечения желаемого эффекта, в ассоциации с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Характеристики новых стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению зависят от конкретного используемого соединения или конъюгата и от эффекта, которого хотят достичь, и фармакодинамики, связанной с каждым соединением или конъюгатом в организме хозяина. Под "физиологическим pH" или "pH в физиологических пределах" подразумевается pH в пределах от приблизительно 7,2 до 8,0 включительно, более типично в пределах от приблизительно 7,2 до 7,6,включительно. Как это используется в настоящем описании, термин "субъект" охватывает млекопитающих и не являющихся млекопитающими животных. Примеры млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, любого члена класса млекопитающих: человека, отличных от человека приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и подобных. Примеры не являющихся млекопитающими животных включают, но не ограничиваются этим, птиц, рыб и подобных. Этот термин не обозначает конкретный возраст или род. В различных вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование PAL варианта описано со ссылкой на отношение PAL:ПЭГ или ПЭГ:PAL. Как это используется в настоящем описании и если не указано иное, отношение "PAL:ПЭГ" относится к отношению лизиновых остатков в варианте PAL к молекулам ПЭГ в реакции пегилирования. Подобным образом, как это используется в настоящем описании и если не указано иное, отношение "ПЭГ:PAL" относится к отношению молекул ПЭГ к лизиновым остаткам в варианте PAL в реакции пегилирования. В. Белковая инженерия на основе структуры. Известны различные способы белковой инженерии с использованием рациональной оптимизации,основанной, прежде всего, на информации о структуре белка (Brannigan, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):964-970 (2002); Marshall, et al., Drug Discov. Today. 8(5):212-221 (2003. Систематичная замена структурных характеристик может привести к улучшенным свойствам белка и/или изменению специфичности в отношении субстрата. Передачу новой функции от одного члена семейства генов другому гомологичному члену можно осуществить путем введения ограниченного количества аминокислотных замен в непосредственной близости связывания с субстратом. Такие улучшения функции белка путем создания улучшенных белковых вариантов может привести к полезным белкам для промышленного,сельскохозяйственного и терапевтического применения (Bocanegra, et al., Biochemistry. 32(11):2737-2740(1993); Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996); Hayes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(25):1592615931 (2002); Voigt, et al., Nat. Struct. Biol. 9(7):553-558 (2002); Malashkevich, et al., Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995); Wells, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84(15):5167-5171 (1987); Wilks, et al., Science. 242(4885):1541-1544 (1988. С. Структура PAL. Пространственую структуру прокариотического PAL дикого типа можно определить с использованием методов рентгеновской кристаллографии. Белок PAL представляет собой гомотетрамер, где каждый мономер состоит в основном из альфа-спиралей и подразделяется на четыре домена: центральный каталитический домен, N-концевой домен и небольшой С-концевой домен со схожестью со структурой гистидин-аммиак-лиазы Pseudomonas putida (HAL, Schwede, et al., Biochemistry. 38(17):5355-5361 (1999 плюс дополнительный домен, включенный в С-концевой участок, который выступает из концов интактной молекулы тетрамера. Первые 25 N-концевых остатков не являются видимыми в структуре для всех четырех мономеров в тетрамере, и эта область, вероятно, является разупорядоченной. Петлевые области между остатками 109-123 и 350-353 являются разупорядоченными для мономера В, а области 103-123 и 350-353 являются разупорядоченными для мономеров А, С и D в PAL тетрамере. Рентгеновским методом были определены другие структуры PAL Rhodosporidium toruloides с использованием добавления циннамата и NH4 иона в процессе кристаллизации, разрешением 2,1 А (Р 3221 пространственная группа) и 2,7(Р 21 пространственная группа; Calabrese, et al., Biochemistry. 43(36):11403-11416 (2004. Более низкое значение pH, используемое для кристаллизации, и более низкое разрешение этих структур привели к более характерному беспорядку в структуре (особенно в N-концевых областях) и к неспособности однозначно отнести дополнительную электронную плотность, присутствующую на MIO кофакторе, за счет NH2 аддукта. Существует ряд родственных структур (см. DALI, Holm, et al., J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993 в этом семействе тетрамерных ферментов, которые катализируют удаление различных групп из карбоновых кислот, включая аммиак-лиазы (PAL, HAL и аспартат-аммиак-лиаза (AAL, фумаразу и аргиносукцинатлиазу (Schwede, et al., Biochemistry. 38 (17):5355-5361 (1999. Кроме того, 5-кристаллический белок хрусталика глаза птиц имеет аналогичную укладку, но представляет собой неферментативную форму этого структурного семейства (Schwede, et al. (1999), ibid). Полученные рентгеновским методом пространственые структуры HAL из P.putida (Rother, et al.,Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001); Schwede, et al., Biochemistry. 27:5355-5361 (1999) и позднее PAL изRhodosporidium toruloides (Calabrese, et al., Biochemistry. 43:11403-11416 (2004 выявили остатки активных сайтов этих тетрамерных ферментов, которые являются важными для связывания с субстратом, катализа и образования MIO. Все остатки активных сайтов в HAL присутствуют в ЕпсР, за исключением Н 83 и Е 414, которые заменены валиновым и глутаминовым остатками соответственно (Xiang, L., et al., J.Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002. Предполагают, что Н 83 в HAL связывает и ориентирует имидазольный фрагмент L-гистидина в активном центре и стабилизирует связанный с ферментом катионный промежуточный продукт, тогда как карбоксилатная группа в Е 414 может действовать как основание в катализе. Пространственную, с высоким разрешением, белковую кристаллическую структуру PAL можно использовать в способах, включающих белковую инженерию, для улучшения биохимических и биофизических свойств PAL и для повышения in vivo терапевтической эффективности PAL. Кроме того, структура обеспечивает информацию о том, какие области структуры являются наиболее гибкими (для перемещения и образования более компактной и стабильной формы PAL), какие остатки расположены вблизи активного центра (для мутации в целях повышения активности и/или минимизации размера белка, а также для обеспечения информации для основанной на структуре разработки ингибитора) и какие поверхностные местоположения являются близкими к иммуногенным (например, линейные эпитопы, идентифицированные в анализах картирования) и/или протеолитическим чувствительным сайтам (из анализов картирования протеазы), делая возможным введение сайт-специфических мутантов для направленного разрыва проблемных сайтов или, альтернативно, для поверхностного пегилирования или другой химической дериватизации для защиты чувствительных сайтов, присутствующих в природной PAL.D. Использование структурных координат PAL. Пространственную, с высоким разрешением, кристаллическую структуру PAL можно использовать в компьютеризированных способах выбора областей белка для мутации, модификации или сочетания мутации и модификации. Например, коммерчески доступная программа GETAREA рассчитывает поверхностную доступность для аминокислотных остатков на основании рентгеновских кристаллографических координат. Пространственную, с высоким разрешением, кристаллическую структуру также можно использовать в in-silico способах для построения лигандов для активного центра фермента. Например, коммерчески доступные программы для подбора и конструирования малых молекул на основе структуры можно использовать для конструирования ингибиторов PAL (Billett, et al., Biochim Biophys Acta. 524(1):219-230Alunni, et al., Arch. Biochem. Biophys. 412(2):170-175 (2003. Инженерия PAL на основе структуры. Выяснение достоверной пространственной структуры или структурной модели для конкретной макромолекулы делает рациональный дизайн продуктивным методом для оптимизации специфической структуры и/или функции указанной макромолекулы (Penning, et al., Chem Rev. 101(10):3027-3046(2001. Оптимизационные подходы включают, но не ограничиваются этим, перестройку специфичности кофермента (Bocanegra, et al., Biochemistry. 32(11):2737-2740 (1993, улучшение свойств стабильности белка (Malakauskas, et al., Nat. Struct. Biol. 5(6):470-475 (1998); Jiang, et al., Protein Sci. 10(7):1454-1465(2001); Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002); Filikov, et al., Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002); O'Fagain,Enz. Microb. Technol. 33:137-149 (2003); Cammett, et al., J. Mol. Biol. 327(1):285-297 (2003, перестройку свойств специчности в отношении субстрата (Hedstrom, et al., Science. 255(5049):1249-1253 (1992); Failla,et al., Fold Des. 1:35-42 (1996); Malashkevich, et al., Nat. Struct. Biol. 2(7):548-553 (1995); Wilks, et al.,Biochemistry. 31(34):7802-7806 (1992); Feil, et al., Protein Eng. 10(3):255-262 (1997); Whittle, et al., 3 Biol.Chem. 276(24):21500-21505 (2001, изменение специфичности связывания с лигандом или рецептором(Cunningham, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(8):3407-3411 (1991); Reddy, et al., Nat. Biotechnol. 14(13):1696-1699 (1996); Doyle, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 4(1):60-63 (2000 и перестройку биологической активности (Chen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90(12):5618-5622 (1993); Sarkar, et al., Nat.Biotechnol. 20:908-913 (2002); Blatt, et al., 3 Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996. Моделирование на основе структуры можно использовать для получения вариантов PAL, включая рациональные мутанты, такие как усечения, делеции, инсерции, варианты сплайсинга, точечные мутации, замены, химеры, мутанты с перестройкой петли, мутанты с изменением петли, поверхностьмаскирующие мутанты, а также стохастически полученные мутанты (в том числе мутанты, полученные в результате направленной эволюции, отдельно или в сочетании с рационально разработанными мутантами). Кроме того, можно получить варианты PAL, включающие мутанты PAL, где мутации были введены для сайт-специфического пегилирования и/или других химических дериватизаций. Мутанты PAL для использования в таких способах включают любой вариант PAL, обладающий, по существу, такой же функциональной активностью, как PAL R.toruloides дикого типа, включая варианты, фрагменты и химические производные родительского белка PAL. Оптимизация белка методом направленной эволюции. Методы направленной эволюции включают осуществление мутаций в гене (генах), представляющем интерес, неспецифическим образом для более полного использования больших областей мутационного пространства белка. Существуют различные способы направленной эволюции, включая склонную к ошибкам ПЦР и мутагенез со случайными инсерциями и делециями (RID), для внесения разнообразия по всей последовательности ДНК и более сфокусированные или "направленные" образующие разнообразие способы, такие как сайт-насыщенный мутагенез и другие способы мутагенеза на основе олигонуклеотидов (Brannigan, et al., (2002), ibid). Кроме того, использовали методы рекомбинации ДНК последовательности для сочетания выгодных сайтов мутации и одновременного удаления вредных мутаций с получением новых ДНК последовательностей (например, методы перегруппировки ДНК, StEP, RACHITT,ITCHY). Наконец, структурно-основанные методы направленной эволюции использовали для перестройки белков для получения терапевтической пользы (методы комбинаторной инженерии на основе структуры, SCOPE, и автоматизированного моделирования белков, PDA). В основе метода SCOPE лежит подход полурациональной белковой инженерии, в котором используют информацию о структуре белка в сочетании с приемами манипулирования ДНК для разработки и создания множества библиотек перекрещивающихся вариантов белков из негомологичных генов (O'Maille, et al., J. Mol. Biol. 321(4):677-691(2002. В PDA компьютерное предварительное скринирование мутационного пространства позволяет включать только те мутации, которые совместимы со специфической укладкой белка, таким образом уменьшая количество вариантов последовательности до размера, который поддается экспериментальному скринингу (патент США 6403312; Dahiyat, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(19):10172-10177(1997); Dahiyat, et al., Protein Sci. 6(6):1333-1337 (1997); Hayes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(25):15926-15931 (2002) Orencia, et al., Nature Struct. Biol. 8:238-242 (2001. Существует огромное количество примеров, где использование направленной эволюции (в сочетании с эффективным отбором или протоколом скрининга) приводило к улучшению каталитической функции и биофизических свойств (например, пониженной иммуногенности, повышенной стабильности),исходя из исходного типа фермента, осуществления мутаций этого вида для изменения и/или улучшения функции (Vasserot, et al., Drug Discovery Today. 8(3):118-126 (2003. Например, успешные мутанты были получены с использованием направленной эволюции и других методов "случайного" мутагенеза для ряда различных белков (Триоза-фосфатизомераза, Hermes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87(2):696-700(2001); Аспартат-аминотрансфераза, Rothman, et al., Protein Science. 13(3):763-772 (2004); L-аспартаза,Wang, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276(1):346-349 (2000) и лактат-дегидрогеназа, Wilks, et al.,Biochemistry. 31(34):7802-7806 (1992). Эти исследования постоянно демонстрировали пользу применения приемов "случайного" мутагенеза для разработки улучшенных вариантов фермента с повышенной стабильностью, активностью и резистентностью к путям расщепления. Структурный анализ эволюционирующих белковых клонов приводит к проникновению в сущность молекулярных изменений, которые связаны с получаемым улучшением физических и химических свойств (Orencia, et al., in Advances in Protein Chemistry: Evolutionary proteindesign, F.H. Arnold, Editor, Academic Press: San Diego, p. 227-259 (2001. Преимущества, достигаемые методами направленной эволюции, особенно очевидны в свете повторяющегося возникновения благоприятных мутаций, которые включают остатки неактивных сайтов, с некоторыми сайтами мутации, расположенными на расстоянии 15-20 от областей активных сайтов фермента, которые имеют благоприятный эффект (Oue, et al., J. Biol. Chem. 274(4):2344-2349 (1999. Направленная эволюция и другие методы неспецифического мутагенеза, в сочетании с процедурами отбора и скрининга, можно использовать для разработки более протеолитически стабильных и химически стойких форм PAL для использования в промышленных целях или, альтернативно, для фермент-заместительной терапии, например для леченияE. Модифицированный PAL. В проведенных ранее экспериментах были описаны модифицированные формы PAL, такие как PAL мутанты (Schuster, et al., FEBS Lett. 349(2):252-254 (1994); Schuster, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92Pol. 49(1):51-61 (2000); Rother, et al., Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002 и HAL мутанты (Taylor, et al.,J. Biol. Chem. 269(44):27473-27477 (1994); Baedeker, et al., Eur. J. Biochem. 269 (6):1790-1797 (2002. Оптимизация кинетики PAL - прокариотические мутанты с повышенной каталитической активностью. Биологически активные сайты PAL дикого типа в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы, если это желательно, для оптимизации кинетических характеристик PAL. Km,концентрация субстрата, которая дает полумаксимальную активность, тесно связана с терапевтической эффективностью PAL для поддержания уровней Phe в приемлемых пределах, т.е. от 120 до 240 мкМ. Km представляет сродство фермента к субстрату. Путем контролирования сродства можно ограничивать или контролировать эффективность любого фермента по отношению к субстрату при различных концентрациях. Например, если Km составляет 1000 мкМ (Rhodosporidium toruloides), активность фермента будет снижена примерно до 12,5% при уровнях Phe в крови 240 мкМ и примерно до 3% при уровнях Phe в крови 60 мкМ. Если Km составляет 240 мкМ, активность фермента будет снижена примерно до 50% при уровнях Phe в крови 240 мкМ и примерно до 12% при уровнях Phe в крови 60 мкМ. Если Km составляет 120 мкМ, активность фермента будет снижена примерно до 70% при уровнях Phe в крови 240 мкМ и примерно до 35% при уровнях Phe в крови 60 мкМ. Оптимально, терапевтической целью могло бы быть получение фермента с достаточной активностью для снижения, но также и поддержания Phe в оптимальных пределах примерно 120-240 мкМ. Фермент с высоким значением Km (т.е. 1000 мкМ) будет быстро терять активность по мере падения уровней Phe до нормальных пределов, а также будет требовать непрактичного введения высококонцентрированных или больших объемов доз. С другой стороны, фермент с очень низким значением Km может быстро истощать уровни Phe, что может быть фатальным для гиперфениланемий, но может быть полезным для лечения рака. В некоторых вариантах воплощения биологически активный модифицированный PAL имеет kcat по меньшей мере около 0,1 s-1 или более чем около 0,5 s-1. В других вариантах воплощения биологически активный модифицированный PAL имеет kcat по меньшей мере около 0,2 s-1 или более чем около 1,0 s-1. В других вариантах воплощения биологически активная модифицированная PAL имеет Km в пределах примерно 10-1000 мкМ. В других вариантах воплощения биологически активный модифицированный PAL имеет Km в пределах 100-1000 мкМ. В других вариантах воплощения биологически активный модифицированный PAL демонстрирует ферментативную активность, которая примерно в 2-1000 раз больше активности белка дикого типа. В других вариантах воплощения изобретения биологически активный модифицированный PAL демонстрирует ферментативную активность, которая примерно на 10-100% выше активности белка дикого типа. Такие биологически активные модифицированные PAL белки могут быть получены с использованием способов, хорошо известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез. Было показано, что все остатки активных сайтов в HAL присутствуют в EncP, за исключением Н 83 и Е 414, которые заменены валиновым и глутаминовым остатками, соответственно (Xiang, L., et al., J.Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002. Была исследована роль Н 83 в HAL в связывании и ориентации имидазольного фрагмента L-гистидина в активном центре и в стабилизации связанного с ферментом катионного промежуточного продукта (Xiang, et al., J. Bacteriology. 187(12):4286- 4289 (2005); Xiang, et al., J.Bacteriology. 188(14):5331 (2006. Было сделано предположение, что карбоксилатная группа Е 414 может действовать как основание в катализе. В этом исследовании EncP мутанты были получены методом сайтнаправленного мутагенеза для оценки вклада V83 в образование коричной кислоты при помощи EncP. Замена валина гистидином приводила к образованию мутанта, V83H, который отличался утратой PAL активности. Замена валина аланином давала в результате мутант, V83A, который был более активным,чем EncP V83A дикого типа, имел несколько более низкое сродство к L-фенилаланину, с Km 120 мкМ против 23 мкМ для фермента дикого типа. Однако в сравнении с EncP дикого типа V83 А имел более высокое значение kcat и был более активным по сравнению с ферментом дикого типа. Специфические варианты белка: варианты, имеющие пониженную иммуногенность. В настоящее время существует ряд стратегий, используемых для снижения иммуногенности белка. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения модификации, которые вводят для минимизации иммунного ответа, не разрушают структуру, функцию или стабильность макромолекулы. Эффективные используемые стратегии включают увеличение содержания последовательностей человека (химеры и/или другие "гуманизационные" подходы), улучшение свойств в растворе, удаление эпитопов антител, введение химической дериватизации (такой как пегилирование) и/или идентификация и удаление агретопов МНС. Для вводимых путем инъекции терапевтических средств проблемы in vivo иммунореактивности можно решить путем осуществления картирования эпитопов с последующим рациональным мутагенезом для модификации и/или какой-либо другой мутации этих сайтов иммуногенности, отдельно и в сочетании с сайт-специфическим пегилированием (Hershfield, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(2003, или другими способами химической дериватизации для снижения иммунореактивности белка до приемлемого уровня. Модификация антигенных поверхностных участков белка снижает иммуногенность(Chirino, et al., Drug Discov. Today. 9(2):82-90 (2004. Один способ улучшения включает конструкцию белков меньшего размера, которые сохраняют каталитическую активность (например, для измерения активности используют анализ определения спектральной поглощательной способности). Второй способ улучшения, сочетающий белковую инженерию с ELISA скринингом, также можно использовать для идентификации мутантов с пониженной иммунореактивностью. Еще один способ вносит точечные мутации для дополнительных поверхностных Lys участков для дериватизации пегилированием, и такой способ, как было показано в испытании с ферментом пуриннуклеозидфорсорилазой, снижает иммуногенность (Hershfield, et al. (1991), ibid). Альтернативный путь включает использование мутации остатков,расположенных в областях белкового эпитопа, для удаления иммунодоминантных сайтов (Yeung, et al., J.Immunol. 172(11):6658-6665 (2004. В подходе, который является аналогичным гуманизации антител,гомологичные петлевые области и/или остатки из человеческих антител используют для замещения в соответствующих петлевых областях гомологичного белка. Улучшение свойств белков в растворе может повысить специфическую активность фермента и/или понизить иммуногенность. Одним свойством, типичным для бактериально экспрессируемых рекомбинантных белков, при их нахождении в растворе является образование белковых агрегатов, например, в результате образования межцепочечных дисульфидных связей, гидрофобных взаимодействий и/или двухвалентных катионов (Chi, et al., Pharm. Res. 20(9):1325-1336 (2003. Агрегация рекомбинантно экспрессируемых белков может усилить иммунный ответ (Hermeling, et al., Pharm Res. 21(6):897-903 (2994);Schllekens, Nephrol Dial Transplant. 20(suppl 6):vi3-9 (2005. Один способ улучшения включает замещение поверхностных цистеиновых остатков другими аминокислотными остатками (например, серином) для минимизации возможности образования межцепочечных дисульфидных связей. Например, замена двух поверхностных цистеиновых остатков сериновыми остатками уменьшала агрегацию хоризматлиазы с незначительными эффектами на активность фермента (Holden, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1594(1):160-167 (2002. Удаление сайтов терапевтического протеолитического процессинга белка также может обеспечить снижение иммуногенности путем предотвращения протеасомального процессинга, предотвращая, таким образом, разрушение и процессинг до пептидных фрагментов для связывания антигенпредставляющих клеток. Подобное явление наблюдали при изменении фланкирующих областей для класса II МНС детерминант, предотвращая открытость для автореактивных T-клеток (Maverakis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA. 100(9):5342-5347 (2003. Картирование эпитопов. Терапевтические эпитопы белка можно рассчитать с использованием ряда алгоритмов или определить экспериментальным путем с использованием in vitro или in vivo подходов. Компьютерные программы, такие как "Peptide Companion" и "Protean" в наборе программ Lasergene от DNAStar, традиционно используют для определения поверхностных эпитопных областей белка на основе химического состава и конформации белка. Иммуногенные области в последовательности белка представляют собой области наивысшей рассчитанной гидрофильности на основании индекса гидрофильности и антигенности на основании амфипатичности и других конформационных параметров рассчитанных областей поверхности белка. Альтернативно, агретопы в последовательности белка могут быть размещены на основании компьютерно моделированных предсказаний потенциального связывания HLA (Robinson, et al., Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003); De Groot, et al., Novartis Found. Symp. 254:57-72 (2003. Кроме того, эпитопы могут быть идентифицированы с использованием in vitro биохимических (Tangri, et al., Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002 и in vitro клеточных анализов (Stickler, et al., J. Immunother. 23(6):654-660 (2000);Stickler, et al., J. Immunol. Methods. 281(1-2):95-108 (2003. Что касается белковой инженерии, относительное снижение иммуногенности можно отслеживать с использованием анализов, подобных in vitro клеточному анализу Stickler, et al. (Toxicol Sci. 77(2):280-289 (2004.Pepscan анализ (картирование эпитопов) включает использование библиотеки перекрывающихся пептидов, охватывающих области поверхности последовательности фермента, и зондирование при помощи кроличьих поликлональных антител, вырабатываемых против перекрывающихся пептидов, охватывающих всю белковую последовательность фермента, и, таким образом, выявление линейных эпитопов, присутствующих в ферменте. На основании пространственной структуры фермента осуществляют мутации экспериментально идентифицированных сайтов антигенности либо с использованием неспецифической мутации остатков области эпитопа для удаления сайтов распознавания эпитопа, либо с использованием сайт-специфической мутации для введения Lys или Cys остатков на поверхность около этих сайтов эпитопа для обеспечения участков для пегилирования для охвата и защиты этих сайтов от иммуногенного распознавания. ELISA скрининг этих потенциально неиммуногенных мутантов фермента (или пегилированных форм этих мутантов фермента) обеспечивает in vitro идентификацию субпопуляции мутантов фермента, которые демонстрируют пониженную иммунореактивность. Идентификация и мутация поверхностных остатков. Поверхностно-доступные остатки в иммуногенных областях фермента или около них могут быть идентифицированы. Эти местоположения могут представлять собой субпопуляцию общего количества доступных для растворителя поверхностных местоположений, присутствующих в белке, зависящих от пространственной близости к поверхности, а также пространственной близости к области иммуногенности/антигенности. Пространственную структуру белка, определенную с использованием рентгеновской кристаллографии, ЯМР или моделирования гомологии, можно использовать в коммерчески доступных программах для расчета доступной для растворителя области поверхности макромолекулы. С использованием программы GETAREA 1.1 (Fraczkiewicz, et al., J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998 получают в результате достоверную оценку доступности поверхности для R.toruloides PAL. GETAREA и PARAREA и подобные программы рассчитывают доступную для растворителя область поверхности с использованием континуум способов с параметрическим подходом на основании теоремы Gauss-Bonnet. PARAREA находит потенциальные точки пересечения в Gauss-Bonnet пути с использованием всех пар атомов в соседнем перечне каждого атома, тогда как GETAREA более эффективно рассчитывает доступные для растворителя вершины с использованием пересекающихся полупространств, определяемых плоскостями двухсферных пересечений. В природном PAL GETAREA идентифицировал 12 поверхностно-доступных Lys остатков, распределенных по всей поверхности тетрамерного PAL белка, а также один частично доступный поверхностный Cys остаток (Cys140). Эти положения являются непосредственно доступными для дериватизации пегилированием. Кроме того, пространственную структуру PAL можно использовать для идентификации дополнительных поверхностных остатков, доступных для сайт-направленного мутагенеза. Эти дополнительные сайты можно мутировать с использованием стандартных методов белковой инженерии для образования более привлекательных PAL мутантов с пониженной иммуногенностью, улучшенной протеолитической резистентностью, и/или улучшенной стабильностью/активностью. Стратегии для мутации белка для обеспечения мутантов белка с улучшенными свойствами, такими как пониженная иммуногенность, известны из уровня техники. Один популярный путь включает мутацию каждого неаланинового остатка в эпитопе до Ala и мутацию каждого аланинового остатка в эпитопе до Gly. Другие способы включают удаление заряженных и гидрофобных остатков из областей эпитопов либо путем мутации, либо путем делеции. Дополнительные стратегии мутации включают внесение сайтспецифических мутаций с последующим сайт-специфической химической дериватизацией. Усечения также можно использовать для получения улучшений белка. Основанный на биоинформатике анализ PAL относительно гистидин-аммиак-лиазы (HAL) сделал предположение об усеченных мутантах (остатки 23-716 и 1-564). Кроме того, анализ пространственной структуры PAL обеспечивает альтернативную область для усечения на основании отсутствия области С-концевого домена в структуре высокогомологичного HAL белка. Мутанты с делецией С-концевого домена, включая мутантов, где соответствующая петлевая область из HAL слита с последовательностью PAL для замещения выступающей области С-концевого домена в структуре PAL (рассчитано так, чтобы присутствовали основные области эпитопов), образуют меньшие, более прочные и предсказуемые, менее иммуногенные вариантыPAL. В другом способе можно использовать белковую инженерию с использованием рационального мутагенеза в сочетании с направленной эволюцией для получения мутантных форм PAL. Например, осуществление рационального расчета вместе с экспериментальным и комбинаторным расчетом дало улучшенную активность компстатина (Morikis, et al., Biochem. Soc. Trans. 32(1):28-32(2004. Сочетание рационального мутагенеза и направленной эволюции также является обнадеживающим (Bornscheuer, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2):137-143 (2001); Dwyer, et al., Science. 304(5679):19671971 (2004. Мутантные формы PAL, которые демонстрируют менее чем оптимальную ферментативную активность, могут быть эволюционно изменены в том, что касается их активности, при помощи белковой инженерии с использованием метода направленной молекулярной эволюции, где после стадии неспецифического мутагенеза следует процедура отбора мутантов, которые являются активными, с получением нового пула мутантов белка только из тех клонов, которые обладают активностью. Например, если специфический мутант PAL (который был разработан для введения поверхностного лизинового остатка вблизи эпитопсодержащей области этой структуры) является неактивным, осуществление направленной эволюции в этом мутанте (мутация неактивного мутанта и отбор трансформантов с активностью) приводит к образованию нового пула мутантов, содержащих эту выгодную мутацию (поверхностный участок лизина) плюс субпопуляции дополнительных случайных мутаций, расположенных по всей структуре,которые восстанавливают активность каждого активного клона. Кроме того, метод направленной эволюции молекулярного рода, который может скрещивать различные виды одного и того же белка или схожие последовательности разных белков (Crameri, et al. Nature, 391:288-291 (1998); Minshull, et al., Curr. Opin.Chem. Biol. 3(3):284-290 (1999, можно использовать для замещения последовательности человеческой гистидин-аммиак-лиазы для замены некоторых из наиболее иммуногенных областей PAL человеческой последовательностью, которая не будет распознаваться иммунной системой. Мутантные формы PAL можно получить путем получения гибридных вариантов белка на основе полурациональных подходов, таким образом делая возможным более направленный уровень конструирования белка по сравнению с чисто направленными эволюционными способами, а также обеспечивая более случайный уровень мутационной манипуляции для тех областей структуры белка, которые были идентифицированы с использованием таких настроенных методов белковой инженерии. Например, PDA метод включает образование компьютерно предварительно-скринированных библиотек вариантов белка,делая возможной более быструю оптимизацию свойств белка по сравнению с чисто произвольными или ненастроенными методами белковой инженерии (патент США 6403312; Dahiyat, Curr Opin Biotechnol. 10(4):387-390 (1999); Filikov, et al. (2002), ibid; Hayes, et al. (2002), ibid; Luo, P., et al. (2002), ibid). Подобным образом, SCOPE метод конструирует гибридные варианты фермента на основе "эквивалентных" субдоменов структуры, делая возможным создание множества библиотек пересекающихся вариантов белка исходя из негомологичных генов (O'Maille, et al. (2002), ibid). Подобным образом, способ, разработанный Voigt, et al., конструирует гибриды на основе применения расчетного алгоритма, который идентифицирует фрагменты белка, или "схемы", которые можно рекомбинировать без нарушения целостности пространственной структуры белка (Voigt, et al. (2002), ibid). Компьютеризированный анализ также может идентифицировать консервативные стержневые области структурно и функционально важных положений в укладке белка на основании отнесений вторичных структурных элементов (Mizuguchi, et al.,Bioinformatics 16(12):1111-1119 (2000. Мутантные формы PAL можно получить, следуя процедурам любого из способов, известных из уровня техники.HAL в качестве альтернативной замены фермента. Структура encP из Streptomyces maritimus была гомологично смоделирована на основании структуры P.putida HAL. Хотя и менее чем PAL, структура S.maritimus более подобна человеческому PAL, что делает encP возможно менее иммуногенной формой аммиак-лиазы для использования для полученияPAL методом белковой инженерии. Альтернативный способ для получения неиммуногенных вариантовPAL включает мутацию S.maritimus encP или другого прокариотического PAL для замены иммуногенных последовательностей последовательностями гистидин-аммиак-лиазы человека (HAL, Suchi, et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1216(2):293-295 (1993 с использованием мутации с последующим отбором encP или других прокариотических мутантов с активностью PAL, с получением "гуманизированного" encP или другого прокариотического белка PAL, который может быть далее пегилирован после стадий мутации и отбора на активность. Специфические варианты белка: варианты, имеющие пониженную чувствительность к протеазе. В настоящее время используют ряд стратегий для снижения чувствительности белка к протеазе. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения модификации, введенные для минимизации протеолитической чувствительности, не разрушают структуру, функцию или стабильность макромолекулы. Эффективные стратегии включают обеспечение фермента с активным центр-стабилизирующим видом, таким как конкурентный ингибитор (Gilbert, et al. (1981), ibid; патенты США 6548644; 6451986; 6433158; 6461849), химическую модификацию аминогрупп в чувствительных Lys и/или Arg сайтах для блокирования трипсинсвязывающих сайтов, мутацию химотрипсин-чувствительных Tyr, Phe и/или Trp остатков до менее нейтральных аминокислот для устранения подверженности расщеплению, лигирование или связывание PAL с другими защитными макромолекулами (такими как домены Fc антител или нетоксичные компоненты нейротоксина ботулина) и/или введение Lys или Cys сайтов около протеазачувствительных сайтов для последующей химической дериватизации при помощи ПЭГ или других химически защитных и стабилизирующих групп.F. Химически модифицированные варианты PAL. Химическую модификацию макромолекул можно осуществить неспецифическим путем (приводящим к смеси дериватизированных видов) или сайт-специфическим путем (на основе дериватизации, направленной на реактивность макромолекул дикого типа, и/или сайт-селективной модификации с использованием сочетания сайт-направленного мутагенеза и химической модификации), или, альтернативно, с использованием способов лигирования экспрессированного белка (Hofmann, et al., Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения химическую модификацию используют для снижения иммуногенности. Пегилирование представляет собой способ, который был продемонстрирован для снижения иммуногенности белков (Bhadra, et al., Pharmazie. 57(1):5-29(2002, но гликозилирование и другие химические процедуры дериватизации с использованием модификации путем фосфорилирования, амидирования, карбоксилирования, ацетилирования, метилирования,образования кислотно-аддитивных солей, амидов, сложных эфиров и N-ацил-производных также являются возможными (Davis, Science. 303:480-482 (2004. Пегилированные белки. Ряд различных реакций пегилирования PAL с использованием определенного диапазона отношений химического реагента ПЭГ к белку PAL могут обеспечивать ПЭГ-PAL производные для каждого способа модификации. Оптимальную степень пегилирования можно определить на основании остаточной активности, полученной для каждого дериватизированного вида PAL, с использованием анализа определения спектральной поглощательной способности в сочетании с PAGE и анализа с использованием природного геля для определения степени ПЭГ-дериватизации. После определения начальных пределов оптимальной модификации можно осуществить сравнительный кинетический анализ (включая определение Vmax иKm, констант связывания субстратов, протеолитической стабильности, зависимости активности от pH,зависимости активности от температуры) и определить иммунореактивность оптимального ПЭГ-PAL вида методом ELISA, иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Белковую инженерию также можно использовать для образования наиболее подходящего PAL мутанта для пегилирования с использованием оптимальных условий дериватизации путем сведения к минимуму размера PAL белка и только модификации наиболее антигенных областей поверхности PAL, стоимость ПЭГ модификации можно снизить,сохранив в то же время максимальную величину ферментативной активности и минимальную величину иммуногенности. Подобным образом, сайт-специфическое пегилирование можно использовать для получения производных фермента. Другие химические модификации, такие как фосфорилирование, или другие химические модификации Lys, Arg и Cys остатков можно использовать для маскировки иммуногенных областей и/или протеолитически чувствительных областей. Такие химические модификации включают в качестве репрезентативных примеров способ присоединения полимера по методу Bednarsaki и способ сшивания Altus Corporation для улучшения PAL стабильности, снижения иммуногенности и улучшения резистентности к протеазе. Bednarsaki продемонстрировал, что присоединение полимера улучшает температуростойкость белка (Wang, et al., J. Am. Chem. Soc. 114(1):378-380 (1992, и Altus Corporation было обнаружено, что сшивка с глутаральдегидом улучшает стабильность фермента. Чтобы определить, обеспечивает ли пегилирование улучшение in vivo терапевтического периода полужизни белка, такого как PAL, синтезируют множество различных ПЭГ:PAL конъюгатов, охарактеризовывают их in vitro и испытывают in vivo на уменьшение L-Phe. Для того чтобы оптимизировать потенциальные эффекты пегилирования, а также для идентификации предпочтительных участков присоединения ПЭГ применяют стратегию моделирования с варьированием длины полимера, конформации и степени присоединения ПЭГ. Способы получения пегилированного PAL по настоящему изобретению, как правило, включают следующие стадии:PAL с одной или несколькими группами ПЭГ; и(b) получение реакционного продукта(ов). Поскольку специфические сайты PAL модификации могут существенно изменить характеристическую активность конъюгата, использовали различные типы и количества ПЭГ. Химия, используемая для пегилирования PAL, включала ацилирование первичных аминов PAL с использованием NHS-сложного эфира метокси-ПЭГ (О-[(N-сукцинимидилоксикарбонил)метил]-O'-метилполиэтиленгликоль). Ацилирование при помощи метокси-ПЭГ-NHS или метокси-ПЭГ-SPA приводит к образованию амидной связи,которая обеспечивает элиминирование заряда из исходного первичного амина. Способы по настоящему изобретению обеспечивают, по существу, гомогенную смесь полимера:белкового конъюгата. "По существу, гомогенный", как это используется в настоящем описании, означает, что наблюдают только молекулы конъюгата полимер:белок. Конъюгат полимер:белок обладает биологической активностью, и представленные в настоящем изобретении "по существу, гомогенные" пегилированные PAL препараты представляют собой такие, которые являются достаточно гомогенными для демонстрации преимуществ гомогенного препарата, например простоты их клинического применения с предсказуемостью фармакокинетических свойств от партии к партии. Полимерные молекулы, рассматриваемые для использования в способах пегилирования, описанных в настоящем изобретении, могут быть выбраны из водорастворимых полимеров или их смеси. Водорастворимый полимер может быть выбран из группы, включающей, например, полиэтиленгликоль, монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, поли(N-винилпирролидон), гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин),НРМА, Fleximer.TM. и поливиниловый спирт, моно(C1-C10)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, тресилмонометокси ПЭГ, ПЭГ пропиональдегид, бис-сукцинимидилкарбонат PEG, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Выбранный полимер должен быть водорастворимым, так чтобы белок, к которому он присоединяется, не осаждался в водной среде, такой как физиологическая окружающая среда. Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения для терапевтического применения препарата, полученного как конечный продукт, полимер должен быть фармацевтически приемлемым. В некоторых вариантах воплощения водорастворимый полимер для использования в настоящем изобретении представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Как это используется в настоящем описании,полиэтиленгликоль, как предполагается, охватывают любую из форм PEG, которую используют для дериватизации других белков, такую как моно(C1-C10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль. Отношение молекул полиэтиленгликоля к молекулам белка будет варьировать, так же как их концентрация в реакционной смеси. Как правило, оптимальное отношение (в том, что касается эффективности реакции, когда нет никакого избыточного количества непрореагировавшего белка или полимера) можно определить на основании молекулярной массы выбранного полиэтиленгликоля и количества доступных реакционноспособных групп (типичноаминогруппы), которые присутствуют. Что касается молекулярной массы, как правило, чем больше молекулярная масса используемого полимера, тем меньше количество молекул полимера, которые могут связываться с белком. Подобным образом, при оптимизации этих параметров следует учитывать степень разветвленности полимера. Как правило, чем выше молекулярная масса (больше ответвлений), тем выше отношение полимер:белок. Настоящее изобретение предусматривает некоторые различные значения длины линейного ПЭГ полимера, включая, но не ограничиваясь этим, 5 и 20 кДа конъюгаты разветвленных ПЭГ полимеров с двумя ответвлениями, включая,но не ограничиваясь этим, 10 и 40 кДа. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения для реакций пегилирования, рассматриваемых в настоящем изобретении, средняя молекулярная масса составляет от около 2 примерно до 100 кДа (термин "около" означает 1 кДа). В других вариантах воплощения средняя молекулярная масса составляет от около 5 примерно до 40 кДа. Отношение водорастворимого полимера к PAL, как правило, составляет от 1:1 для моно-ПЭГ, 2:1 для ди-ПЭГ и т.д. Примеры 6-8 описывают эффекты пегилированных и непегилированных форм лизинового мутанта(NpPAL), и PAL, продуцируемого цианобактерией Anabaena variabilis (AvPAL), на уровни фенилаланина у ENU2 или BTBRenu2 мыши в течение 12-дневного периода. Эта животная модель является гомозиготным мутантом по локусу гена фенилаланингидроксилазы (PAH), что в результате дает животное с тяжелой гиперфенилаланемией. Таким образом, высокие уровни фенилаланина (Phe) в плазме делают это животное подходящей моделью для оценки способности фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) снижать уровень Phe в плазме. Эффекты пегилированной и непегилированной форм лизинового мутанта R91K PAL иNpPAL на уровни фенилаланина в этой PKU животной модели также оценивали в течение 90-дневного периода. Результаты показали, что пегилированные формы NpPAL и AvPAL обеспечивали большее снижение фенилаланина в PKU животной модели по сравнению с непегилированными NpPAL и AvPAL соответственно. Кроме того, такие эффекты пегилированного NpPAL по снижению повышенных уровней фенилаланина поддерживали в течение 10-недельного периода. Эти исследования показывают, что пегилирование PAL из цианобактерий Nostoc punctiforme и Anabaena variabilis является существенным для снижения уровней фенилаланина у мышей с PKU. Результаты говорят о том, что пегилированный вариант бактериального PAL может служить в качестве эффективного терапевтического средства в леченииPKU. В настоящем изобретении рассматриваются пегилированные варианты PAL с пониженной иммуногенностью. Один вариант воплощения представляет собой пегилированную форму варианта Nostoc punctiforme PAL (NpPAL) с пониженной иммуногенностью. Другой вариант воплощения представляет собой пегилированную форму варианта Anabaena variabilis PAL (AvPAL) с пониженной иммуногенностью. Конкретные варианты воплощения предусматривают варианты NpPAL или AvPAL, в которых пегилирование достигается путем взаимодействия варианта NpPAL или AvPAL с водорастворимым полимером,например полиэтиленгликолем (ПЭГ). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование достигается путем взаимодействия варианта NpPAL или AvPAL с ПЭГ один раз при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В одном варианте воплощения вариант PAL представляет собой вариантAvPAL, и пегилирование достигается с использованием PAL:ПЭГ отношения 1:3. Способы получения пегилированных вариантов PAL по настоящему изобретению описаны выше. В настоящем изобретении также рассматривается повторное пегилирование пегилированных вариантов PAL для снижения иммуногенности. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование достигается путем взаимодействия варианта NpPAL или AvPAL с ПЭГ 2 раза или более,при этом каждое пегилирование осуществляют при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения пегилирование достигается путем взаимодействия вариантаNpPAL или AvPAL с ПЭГ 2, 3, 4, 5 раз или более, при этом каждое пегилирование осуществляют при отношении PAL:ПЭГ по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:3 или по меньшей мере 1:4. В другом варианте воплощения изобретения вариант PAL представляет собой вариант AvPAL, и пегилирование достигается с использованием PAL:ПЭГ отношения 1:3 как для первой, так и для второй реакций пегилирования. Способы получения повторно пегилированных вариантов PAL по настоящему изобретению, как правило, включают следующие стадии:(а) взаимодействие варианта PAL с полиэтиленгликолем в условиях, при которых вариант PAL связывается с одной или несколькими группами ПЭГ;(с) взаимодействие пегилированного варианта PAL с полиэтиленгликолем в условиях, при которых пегилированный вариант PAL связывается с одной или несколькими группами ПЭГ в положениях, не занятых ПЭГ со стадии (а); и(d) получение реакционного продукта(ов). Поскольку специфические сайты PAL модификации могут существенно изменить характеристическую активность варианта, использовали различные типы и количества ПЭГ. Химия, используемая для пегилирования PAL, включала ацилирование первичных аминов PAL с использованием NHS-сложного эфира метокси-ПЭГ-(О-[(N-сукцинимидилоксикарбонил)метил]-O'-метилполиэтиленгликоль). Ацилирование при помощи метокси-ПЭГ-NHS или метокси-ПЭГ-SPA приводит к образованию амидной связи,которая обеспечивает элиминирование заряда из исходного первичного амина.G. Отбор и анализы скрининга. Для получения и скрининга активных вариантов PAL или HAL, для начальной экспрессии мутантных клонов можно использовать любую из известных векторных систем экспрессии, такую как His-tag система векторной экспрессии, способствуя высокопроизводительной очистке с использованием металохелатного комплекса для выделения варианта белка. Можно использовать трехъярусную систему скрининга для идентификации подходящих вариантов белка. Для начальной идентификации положительных клонов можно использовать трансформацию и отбор для роста в фенилаланин-ауксотрофном штаммеE.coli. Во втором раунде скрининга можно использовать определение оптической плотности OD290(Hodgins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 32:24 6-253 (1968, подходящее для высокопроизводительной обработки. В конце, скрининг на устойчивость к протеолизу (с использованием инкубации в присутствии протеазного коктейля) или, альтернативно, снижение иммуногенности (с использованием конкурентныхELISA анализов) можно использовать для идентификации подходящих вариантов белка. Н. Терапевтическое применение и введение оптимизированных белков PAL. 1. Различные формы гиперфенилаланемии (HPA). Настоящее изобретение направлено на лечение различных популяций HPA пациентов с использованием способов, которые включают применение PAL композиции либо отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими режимами для лечения HPA и/или PKU. В частности, предусматривается, что композиции PAL можно использовать для лечения популяции пациентов с концентрациями фенилаланина, которые являются достаточно низкими, чтобы в основном не прибегать к вмешательству диеты (т.е. пациенты со слабовыраженной HPA), пациентов с умеренной формой PKU, пациентов с классической или тяжелой формой PKU, и любой из субпопуляций вышеуказанных. Те пациенты, которые поддаются лечению композициями PAL для облегчения эффектов легкой формы HPA, включают беременных женщин и детей младшего возраста, концентрация в сыворотке у которых менее чем 200 мкМ. Различные популяции пациентов и их различные терапевтические потребности более подробно обсуждаются в этом разделе. Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения направлены на лечение классической тяжелой PKU путем введения субъекту диеты с ограничением белков в сочетании с композицией, включающей PAL или его биологически активный вариант, мутант или фрагмент, где совместное введение диеты с ограничением белков и PAL является эффективным для снижения концентрации фенилаланина в плазме указанного субъекта по сравнению с указанной концентрацией в отсутствие указанного совместного введения. Кроме того, в настоящем изобретении также рассматривается лечение беременной женщины, которая имеет HPA, путем введения ей диеты с ограничением белков в сочетании с PAL или его биологически активным производным так, чтобы совместное введение диеты с ограничением белков иPAL было эффективным для снижения концентрации фенилаланина в плазме беременной женщины по сравнению с концентрацией в отсутствие указанного совместного введения. В конкретных вариантах воплощения изобретения терапия предусматривается для пациента, у которого уровни Phe более чем 420 мкМ. Другие варианты воплощения настоящего изобретения предусматривают введение композицииPAL любому субъекту, который имеет HPA, характеризующуюся концентрацией Phe в плазме более чем 180 мкМ до введения PAL, в количестве, эффективном для обеспечения снижения такой концентрацииPhe в плазме пациента. Способы по настоящему изобретению будут полезными для лечения ребенка младшего возраста, имеющего PKU, характеризующуюся повышенными концентрациями Phe в пределах от более чем 300 мкМ, композициями PAL, описанными в настоящем изобретении. Под "ребенком младшего возраста" в настоящем изобретении подразумевается пациент, возраст которого составляет от 0 до 36 месяцев. Характеристики тяжелой классической PKU и способы ее лечения. Тяжелая PKU характеризуется концентрацией Phe в плазме более чем 1200 мкМ, и могут быть обнаружены концентрации вплоть до 4800 мкМ. Пациентов, которые имеют это расстройство, следует лечить при помощи не содержащей Phe диеты, чтобы довести концентрацию Phe в плазме до уровня, который является клинически приемлемым (типично, менее чем 600 мкМ или менее чем 300 мкМ). Эти пациенты способны максимально переносить только 250-350 мг диетического Phe в день (Spaapen et al., Mol.Genet Metab. 78:93-99 (2003. Как таковые, эти пациенты находятся на диете с Phe-ограничивающей формулой, начиная через 7-10 дней после рождения, и несут бремя такого диетического ограничения на протяжении остального периода их жизни. Любое облегчение строгих ограничений, связанных с режимом питания, который является обременительным для этих субъектов, было бы полезным. Ниже более подробно описаны испытания для диагностики у субъектов классической формы Phe. Эти испытания выявили, что пациенты с классической тяжелой PKU нуждаются в диете с низким содержанием фенилаланина (Lucke et al., Pediatr. Neurol. 28:228-230 (2003. Таким образом, предусматривается, что способы по настоящему изобретению включают определение, что пациент страдает от классической PKU, путем отслеживания концентрации Phe в плазме у субъекта. Пациента затем лечат путем введения композиций прокариотического PAL, отдельно или в совместном режиме введения диеты с низким содержанием белков и PAL, так, чтобы получить по меньшей мере 25% снижение концентраций Phe в плазме пациента. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способ будет обеспечивать 30% снижение концентрации Phe в плазме. В других вариантах воплощения способ будет обеспечивать 40, 50, 60, 70, 80, 90% или большее снижение концентрации Phe в плазме у субъекта (например, когда пациент с тяжелой классической PKU имеет концентрацию Phe 4800 мкМ, 90% снижение концентрации Phe даст концентрацию Phe в плазме 480 мкМ, концентрация, которая является достаточно низкой для необходимости небольшого диетического ограничения). Конечно, должно быть понятно, что способы лечения по настоящему изобретению (независимо от того, используют ли их для лечения тяжелой классической PKU или какой-либо другой HPA, описанной в настоящем изобретении) должны пытаться снизить концентрацию Phe в плазме пациента до уровней, по возможности наиболее близких к диапазону от около 120 до около 36015 мкМ или до оптимальных пределов от около 120 до около 240 мкМ. В некоторых вариантах воплощения концентрации Phe в плазме пациентов с классической PKU, которые проходят лечение, снижают от любого неограниченного значения концентрации Phe в плазме, которое более чем 1000 мкМ, до любого уровня Phe, который менее чем 600 мкМ. Конечно, даже если совместное лечение, включающее PAL и диету с ограничением белков, дает меньшее снижение концентрации Phe в плазме, например, до уровня в пределах 800-1200 мкМ, это следует рассматривать как клинически полезный результат терапии, поскольку пациенты, которые имеют концентрацию Phe в плазме в этих пределах, могут справиться с заболеванием, просто ограничивая количество белков в пище, по сравнению с диетой с Phe-ограничивающей формулой, таким образом получая заметное улучшение качества жизни субъекта, а также приводя к большему согласию пациента с диетическими ограничениями. Любое повышение диетических уровней Phe, которое может выдержать пациент в результате лечения, следует рассматривать как терапевтически эффективный результат. Например, предусматривается,что в результате введения PAL терапии пациент сможет увеличить потребление им/ею диетического Phe от 250-350 до 350-400 мг/день (т.е. фенотип Phe-толерантности пациента меняется от пациента с классической PKU до пациента с умеренной PKU). Конечно, было бы желательно, чтобы терапевтическое вмешательство, раскрываемое в настоящем описании, могло позволить пациенту увеличить потребление им/ею диетического Phe от 250-350 до 400-600 мг/день (т.е. фенотип Phe-толерантности пациента меняется от пациента с классической PKU до пациента с легкой формой PKU) или в некоторых случаях позволить пациенту увеличить потребление более чем 600 мг Phe/день (т.е. нормальное диетическое потребление). Характеристики BH4-нереспонсивных пациентов с PKU и способы лечения таких пациентов. Вторая группа пациентов, которых можно лечить с использованием способов по настоящему изобретению, включает субъектов, у которых были определены повышенные концентрации Phe в плазме,т.е. любая концентрация, которая более чем 200 мкМ, но у которых было диагностировано, что они являются нереспонсивными к BH4 терапии (как было определено при помощи испытания BH4 нагрузки,описанного ниже). Такие пациенты могут включать тех субъектов, которые имеют легкую форму PKU(т.е. концентрации Phe в плазме до 600 мкМ), субъектов, которые имеют умеренную форму PKU (т.е. концентрации Phe в плазме в пределах 600-1200 мкМ), а также пациентов, которые имеют классическую тяжелую форму PKU (т.е. концентрации Phe в плазме более чем 1200 мкМ). Пациентам, которые являются нереспонсивными к BH4 терапии, вводят PAL в сочетании с пониженным количеством белка в их рационе питания, чтобы снизить концентрации Phe в плазме пациентов. Способы по настоящему изобретению представляют собой такие способы, где введение PAL обеспечивает большее снижение концентраций Phe в плазме пациента, по сравнению со снижением, которое получают с использованием такого же диетического протокола при отсутствии PAL терапии. Диетические ограничения могут представлять собой диету, которая ограничивает потребление Phe путем обеспечения формулы синтетического медицинского белка, которая содержит пониженное количество Phe, или, альтернативно, диетическое ограничение может быть таким, которое просто требует, чтобы пациент ограничивал общее потребление им/ею белка, но, тем не менее, позволяет пациенту употреблять нормальные пищевые продукты в ограниченных количествах. Терапевтические результаты, обсуждаемые для пациентов с классической PKU, включены в этот раздел посредством ссылки. Терапевтические результаты для пациентов с умеренной формой PKU (т.е. пациенты, которые имеют неограниченную концентрацию Phe в плазме от 600 до 1200 мкМ) включают по меньшей мере 25% снижение концентраций Phe в плазме пациента. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способ обеспечивает 30% снижение концентрации Phe в плазме. В других вариантах воплощения способ обеспечивает 40, 50, 60, 70, 80, 90% или большее снижение концентрацииPhe в плазме у субъекта (например, когда пациент с умеренной классической формой PKU имеет концен- 28018443 трацию Phe 1000 мкМ 90% снижение концентрации Phe даст концентрацию Phe в плазме 100 мкМ, концентрация, которая является достаточно низкой для того, чтобы требовались незначительные или вообще никакие диетические ограничения). В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрации Phe в плазме у пациентов с умеренной формой PKU, которые проходят лечение, снижают от любого неограниченного значения концентрации Phe в плазме, которое составляет от 600 до 1200 мкМ, до любого уровня Phe в плазме, который менее чем 300 мкМ. В одном варианте воплощения лечение при помощи PAL (либо отдельно, либо в сочетании с диетическим ограничением) дает снижение концентрации Phe в плазме, например, до уровня в пределах 200-400 мкМ, что следует рассматривать как клинически полезный результат терапии, поскольку пациенты, которые имеют концентрацию Phe в плазме в этих пределах, могут справиться с заболеванием, просто ограничивая количество белков в пище, по сравнению с диетой с Phe-ограничивающей формулой. Действительно, во многих исследованиях указывается, что такие пациенты могут даже питаться нормальной пищей. Любое повышение диетических уровней Phe, которое может выдержать пациент в результате лечения, следует рассматривать как терапевтически эффективный результат. Например, предусматривается,что в результате введения PAL терапии (либо отдельно, либо в сочетании с другим терапевтическим вмешательством) пациент сможет увеличить потребление им/ею диетического Phe от 350-400 до 400-600 мг/день (т.е. фенотип Phe-толерантности пациента меняется от пациента с умеренной формой сPKU до пациента с легкой формой PKU). Конечно, было бы желательно, чтобы терапевтическое вмешательство, раскрываемое в настоящем изобретении, могло позволить пациенту увеличить потребление им/ею диетического Phe от 350-400 до более чем 600 мг Phe/день (т.е. нормальное диетическое потребление). Даже если пациент, который проходит лечение, является пациентом только с легкой формой PKU,т.е. диета допускает потребление Phe в количестве 400-600 мг/день, он получит пользу от терапии на основе PAL по настоящему изобретению, поскольку желательно получение нормализованной концентрации Phe в плазме, которая является по возможности более близкой к 36015 мкМ. Для таких пациентов,благоприятный терапевтический результат будет включать по меньшей мере 25% снижение концентраций Phe в плазме пациента. В одном варианте воплощения способ обеспечивает 30% снижение концентрации Phe в плазме. В другом варианте воплощения изобретения способ обеспечивает 40, 50, 60% или большее снижение концентрации Phe в плазме у субъекта (например, когда пациент с легкой формойPKU имеет концентрацию Phe 600 мкМ, 60% снижение концентрации Phe даст концентрацию Phe в плазме 360 мкМ, т.е. приемлемую нормальную концентрацию Phe в плазме). В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрации Phe в плазме у пациентов с легкой формой PKU, которые проходят лечение, снижают от любого неограниченного значения концентрацииPhe в плазме, которое составляет от 400 до 600 мкМ, до любого уровня Phe в плазме, который менее чем 100 мкМ. Конечно, даже если лечение при помощи PAL (либо отдельно, либо в сочетании с диетическим ограничением) дает меньшее снижение концентрации Phe в плазме, например, до уровня от 200 примерно до 400 мкМ, это следует рассматривать как клинически полезный результат терапии. Любое повышение диетических уровней Phe, которое может выдержать пациент в результате лечения, следует рассматривать как терапевтически эффективный результат. Например, предусматривается,что в результате введения PAL терапии (либо отдельно, либо в сочетании с другим терапевтическим вмешательством) пациент сможет увеличить потребление им/ею диетического Phe от 400-600 мг/день(т.е. фенотип Phe-толерантности пациента меняется от пациента с легкой формой PKU до пациента с легкой формой HPA), что позволяет пациенту потреблять более чем 600 мг Phe/день (т.е. нормальное диетическое потребление). Кроме того, даже если пациент представляет собой такого, у которого проявляются симптомы неPKU HPA, т.е. имеет повышенную концентрацию Phe в плазме до 600 мкМ, но в остальном может принимать пищу с нормальным содержанием белка, он получит пользу от PAL терапии по настоящему изобретению, поскольку было показано, что повышенные концентрации Phe имеют существенный эффект на IQ таких субъектов. Более того, как обсуждается ниже, терапевтическое вмешательство с применением PAL у субъектов с особыми требованиями, например у беременных женщин и детей младшего возраста, является особенно важным, даже если у таких пациентов уровни Phe в плазме находятся в пределах считающегося "безопасным" уровня менее чем 200 мкМ.PKU беременных и способы лечения этого заболевания. Метаболический контроль уровней Phe в плазме у женщин с PKU, которые планируют или уже являются беременными, является важным, поскольку могут быть серьезные последствия для плода, подверженного даже умеренно повышенным уровням Phe in utero, независимо от PAH статуса плода. Терапевтический контроль концентрации Phe в плазме особенно важен в первые три месяца беременности,поскольку невозможность достижения адекватного контроля приведет к расстройствам, включая микроцефалию, дефицит умственного развития и врожденное заболевание сердца. Например, в NIH Consensus Statement (vol. 17 3, October 2000) по фенилкетонурии сообщается, что подверженность плода уровням Phe у беременной женщины 3-10 мг/дл в приводит в 24% случаев к мик- 29