Антитело, специфичное в отношении интерлейкина-6 (ил-6) человека

В изобретении описаны молекулы антител, обладающие специфичностью в отношении антигенных детерминант ИЛ-6, терапевтические применения молекул антител и способы получения указанных молекул антител. 018044 Настоящее изобретение относится к молекулам антител, специфичным к антигенным детерминантам интерлейкина-6 (ИЛ-6). Настоящее изобретение также относится к терапевтическому применению молекул антител и способам получения молекул антител. ИЛ-6 является плейотропным мультифункциональным цитокином, образуемым клетками разных типов. Первоначально он был идентифицирован в качестве фактора дифференциации В-клеток (BSF-2),который индуцировал итоговую стадию созревания В-клеток и их трансформацию в клетки, продуцирующие антитела (Hirano и др., Nature, 324, 1986, cc. 73-76). Установлено, что ИЛ-6 играет центральную роль в иммунной регуляции, воспалении, гематопоэзе и онкогенезе. В иммунной системе ИЛ-6 индуцирует выработку антител В-клетками, увеличивая количество поликлонального иммуноглобулина. Он также индуцирует экспрессию рецептора интерлейкина-2 (ИЛ-2) на Т-клетках (Nomo и др., Immunol, letters, 15, 1987, cc. 249-253) и индуцирует выработку ИЛ-2 в активированных Т-клетках, тем самым, индуцируя и рост, и дифференциацию цитотоксических Т-клеток (Okada и др., J. Immunol., 141, 1988, cc. 1543-1549). Также установлено, что ИЛ-6 определяет дифференциацию моноцитов в макрофаги (Chomarat P. и др., Nature Immunol., 6, 2000, cc. 510-514). Функция ИЛ-6 не ограничивается иммунным ответом, поскольку он действует при гематопоэзе,тромбоцитопоэзе, формировании остеокластов, индукции ответа печеночной острой фазы, приводящей к повышению С-реактивного белка (CRP) и сывороточного амилоидного белка A (SAA). Известно, что он является ростовым фактором для эпидермальных кератиноцитов, клеток мезоглеи почки, клеток миеломы и плазмацитомы (Grossman и др., Prot Natl Acad Sci., 86, 1989, cc. 6367-6371, Horii и др., J. Immunol.,143, 1989, cc. 3949-3955, Kawano и др., Nature 332, 1989, 6159, cc. 83-85). ИЛ-6 вырабатывается клетками разнообразных типов, в том числе моноцитами/макрофагами, фибробластами, эпидермальными кератиноцитами, клетками сосудистого эндотелия, клетками мезоглеи почки, глиальными клетками, хондроцитами, Т- и В-клетками, а также некоторыми опухолевыми клетками (Akira и др., FASEB J., 4, 1990, cc. 2860-2867). В отличие от опухолевых клеток, которые конститутивно вырабатывают ИЛ-6, здоровые клетки не экспрессируют ИЛ-6, пока не произойдет соответствующей стимуляции. ИЛ-6 является гликопротеином, состоящим из 184 аминокислот, с молекулярной массой 21-28 кДа в зависимости от посттрансляционных модификаций. Другие сплайсированные варианты обнаружены в клетках некоторых типов (Kishimoto и др., 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254). Комплекс рецептора ИЛ-6 (ИЛ 6 Р) состоит из двух функционально различных мембранных белков: цепи специфического связывания массой 80 кДа (gp80) и цепи трансдукции сигнала массой 130 кДа (gp130). Хотя ИЛ-6 не может непосредственно связывать gp130, он может связывать ИЛ-6 для образования обладающего высоким сродством трехкомпонентного комплекса ИЛ-6/ИЛ-6P/gp130. ИЛ-6 Р связывает ИЛ-6 с низким сродством, однако, ИЛ-6R не имеет внутриклеточного домена сигнальной транедукции, следовательно, одно только подобное лигирование не приводит к клеточной активации. Сходным образом экспрессия ИЛ-6 Р на поверхности клетки не означает, что клетка способна отвечать на стимуляцию ИЛ-6. Протеолитическое расщепление приводит к высвобождению растворимого ИЛ-6 Р (рИЛ-6 Р, sgp80), который может связывать циркулирующий ИЛ-6 и повышать период полураспада ИЛ-6. Для активации клетки ИЛ-6 сначала связывается либо с ИЛ-6 Р, либо с рИЛ-6 Р, затем гетеродимерный комплекс ИЛ-6/ИЛ-6 Р ассоциирует с гликопротеином gp130 на поверхности клеток. Образующийся трехкомпонентный гетерокомплекс связывает другой комплекс, ИЛ-6/ИЛ-6 Р/gp130, в результате возникает сигнальная трансдукция (Bravo,Heath, EMBO J., 19, 2000, cc. 2399-2411, Boulanger и др., Science, 300, 2003, 5628, cc. 2101-2104), поскольку и связанный с клеткой, и растворимый ИЛ-6 воздействуют на клеточную активацию. Передача сигнала через ИЛ-6 через связанный с клеткой ИЛ-6 Р называется цис-передачей сигнала, а активация клетки через растворимый ИЛ-6 Р называется транс-передачей сигнала. Клетки, экспрессирующие gp130,но не экспрессирующие ИЛ-6 Р, могут стимулироваться ИЛ-6 через рИЛ-6 Р. Известно, что антитела грызунов, нейтрализующие ИЛ-6 человека, способны влиять на связывание ИЛ-6 человека с ИЛ-6 Р (сайт 1) или с gp130 (сайты 2 и 3) (Kalai и др., Eur. J. Biochem. 249, 1997, cc. 690700, Brakenhoff и др., Journal of Immunology, 145, 1990, cc. 561-568, Wendling и др., Journal of Rheumatology, 29, 1993, cc. 259-262). В патенте US 5856135 описана трансформация антител человека в ИЛ-6 с блокированием связывания ИЛ-6 с ИЛ-6 Р. Эти антитела были получены из мышиного моноклонального антитела SK2, в котором комплементарно детерминируемые области (complementarity determining regions - CDR) из вариабельной области мышиного антитела SK2 трансплантируют в вариабельные области антитела человека. Также известны нейтрализующие автоантитела человека к ИЛ-6 (Hansen и др., Eur. J. Immunol, 25,1995, 348-354). В WO 2004039826 описано применение в терапии сайта I химерного анти-ИЛ-6-антитела грызуна/человека. Гуманизированное моноклональное антитело к рецептору ИЛ-6 человека находится на III фазе клинических исследований лечения ревматоидного артрита (Kishimoto, Annu Rev. Immunol. 23, 2005, cc. 121). Также установлено, что это же антитело эффективно на II фазе исследования лечения болезни Крона. Также была установлена эффективность антител анти-ИЛ-6 и анти-ИЛ-6R для лечения заболевания типа волчанки у мышей линии NZB/W F1 (Fink и др., J. Clin. Invest. 94, 1994, с. 585, Mihara и др., Clin.Exp. Immunol. 112, 1998, с. 397). Нейтрализующее антитело к рецептору ИЛ-6 грызунов подавляет колиты, что было установлено на адаптивной трансферной моделе заболевания (Yamamoto и др., Journal ofImmunology, 164, 2000, с. 4878, Atreya и др., Nature Med. 6, 2000, с. 583). Последнее исследование также показало эффективность антирецепторного антитела у мышей с "выбитым" ИЛ-10 на моделе колита и на моделе TNBS воспаления кишечника. В настоящем изобретении выявлено нейтрализующее анти-ИЛ-6 антитело с высоким сродством,которое особенно эффективно in vivo, что было показано, например, на описанной в настоящем изобретении моделе in vivo. Остатки аминокислот в вариабельных доменах антитела обычно обозначаются по системе нумерации, разработанной Kabat и др. Эта система основана Kabat и др. и представлена в кн.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Министерство здравоохранения и социальных служб США, NIH, США (в настоящем изобретении обозначается "системой нумерации Kabat и др." (см. выше). Эта система применяется в настоящем изобретении, если в определенных случаях специально не указано иначе. Обозначение остатков по нумерации Kabat не всегда непосредственно соответствуют линейной нумерации остатков аминокислот. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или дополнительное число аминокислот, что по строгой системе нумерации Kabat соответствует укорочению или инсерции структурного компонента либо каркасного участка, либо комплементарно детерминируемой области (CDR) основной вариабельной доменной структуры. Точная нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем сличения остатков аминокислот в последовательности антитела с "эталонной" последовательностью, нумерованной по Kabat.CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены по остаткам 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDR-H3) согласно системе нумерации Kabat. Однако по системе нумерации Chothia(Chothia С, Lesk A.M., J. Mol. Biol., 196, 1987, cc. 901-917), петлевой эквивалент CDR-H1 имеет протяженность от остатка 26 до остатка 32. Таким образом, CDR-H1 в контексте настоящего изобретения включает остатки 26-35 согласно описанной комбинации системы нумерации Kabat и определению топологической петли по Chothia.CDR вариабельного домена легкой цепи локализованы по остаткам 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDRL2) и 89-97 (CDR-L3) согласно системе нумерации Kabat. В контексте настоящего изобретения понятие "нейтрализующее антитело" означает антитело, способное нейтрализовать биологическую сигнальную активность ИЛ-6, например, блокированием сайта 3 связывания ИЛ-6 с рецептором gp130. Антитела для применения в настоящем изобретении могут быть получены с помощью какого-либо соответствующего метода, известного в данной области техники. Полипептид ИЛ-6 или экспрессируемый клеткой полипептид может быть применен для получения антител, специфически распознающих ИЛ-6. Полипептид ИЛ-6 может быть "зрелым" полипептидом или его биологически активным фрагментом или производным. Предпочтительно полипептид ИЛ-6 является зрелым полипептидом. Полипептиды ИЛ-6 могут быть получены с помощью процессов, хорошо известных в данной области, с применением генетически сконструированных клеток-хозяев, обладающих системами экспрессии, или они могут быть выделены из природных биологических источников. В настоящем изобретении понятие "полипептиды" относится к пептидам, полипептидам и белкам. Они употребляются взаимозаменяемо, если специально не указано иначе. Полипептид ИЛ-6 может в некоторых случаях быть частью более крупного белка, например гибридного белка, например гибридизированного с аффинной меткой. Антитела, вырабатываемые против полипептида ИЛ-6, могут быть получены, если иммунизация животного необходима,введением полипептидов в организм животного, предпочтительно не в организм человека, используя хорошо известные и рутинные протоколы, см., например, кн.: "Handbook of Experimental Immunology",1986, т. 4, под ред. D.M. Weir, изд-во Blackwell Scientific Publishers, Оксфорд, Великобритания). Могут быть иммунизированы многие теплокровные животные, например кролики, мыши, крысы, овцы, коровы,свиньи. Однако наиболее предпочтительными являются мыши, кролики, свиньи и крысы. К антителам, используемым в настоящем изобретении, относятся целые антитела и их функционально активные фрагменты или производные, и они могут быть, но ими перечень не ограничивается,моноклональными, гуманизированными, полностью принадлежащими человеку или химерными антителами. Моноклональные антитела могут быть приготовлены какими-либо методами, известными в данной области, например методом применения гибридом (Kohler, Milstein, Nature, 256, 1975, cc. 495-497), методом триом, методом гибридом В-клеток человека (Kozbor и др., Immunology Today, 4, 1983, с. 72) и EBVгибридомным методом (Cole и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985, cc. 77-96, Alan R Liss,Inc., 1985). Антитела для применения в настоящем изобретении также могут быть получены, используя методы антител единичных лимфоцитов путем клонирования и экспрессии кДНК вариабельной области иммуноглобулина, полученной от единичных лимфоцитов, выбранных для наработки специфических антител способами, например, описанными Babcook J. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15), 1996, cc. 784378481, в патентах WO 92/02551, WO 2004/051268 и в международной патентной заявке WO 2004/106377.-2 018044 Гуманизированными антителами (к которым относятся CDR-пересаженные антитела) являются молекулы антител негуманизированных видов, имеющих одну или несколько комплементарно детерминируемых областей (CDR) от негуманизированных видов и каркасную область от молекулы иммуноглобулина человека (см., например, US 5585089, WO 91/09967). Следует учитывать, что может потребоваться только перенести специфичные детерминируемые области CDR, а не целые CDR (см., например, Kashmiri и др., Methods, 36, 2005, cc. 25-34). Гуманизированные антитела могут необязательно дополнительно включать один или несколько остатков каркасного участка, полученных не от человека, а от других видов, от которых были получены CDR. Химерными являются антитела, кодируемые генами иммуноглобулина, которые были созданы методом генной инженерии таким образом, что гены легкой и тяжелой цепей составлены из сегментов генов иммуноглобулина, принадлежащих к разным видам. Антитела для применения в настоящем изобретении также могут быть получены различными методами фагового дисплея, известными в данной области техники, в том числе описанными Brinkman и др.(Advances in Immunology, 57, 1994, cc. 191-280), а также описанными в патентах WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, US 5698426, 5223409,5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108. Антителами, в полной мере являющимися антителами человека, являются те антитела, в которых вариабельные области и константные области (если они имеются) и в тяжелой, и в легкой цепях все происходят от человека или в значительной степени идентичны последовательностям, происходящим из организма человека, причем необязательно от того же антитела. К примерам антител, в полной мере являющихся антителами человека, могут относиться антитела, полученные, например, методами фагового дисплея, описанными выше, и антитела, вырабатываемые мышами, у которых гены вариабельных и константных частей иммуноглобулина грызунов замещены на соответствующие части генов человека, например, согласно описанному в общих чертах в ЕР 0546073 B1, US 5545806, US 5569825, US 5625126,US 5633425, US 5661016, US 5770429, ЕР 0438474 B1 и ЕР 0463151 B1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека и содержащее тяжелую цепь, в котором вариабельный домен тяжелой цепи включает по меньшей мере одну область CDR, имеющую последовательность SEQID NO: 5 для CDR-H1, CDR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 6 для CDR-H2 и CDR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 7 для CDR-H3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, включающее тяжелую цепь, в котором по меньшей мере две из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 вариабельного домена тяжелой цепи выбраны из следующих: последовательности SEQ ID NO: 5 для CDR-H1, последовательности SEQ ID NO: 6 для CDR-H2 и последовательности SEQ ID NO: 7 для CDR-H3. Например, антитело может включать тяжелую цепь, в которойCDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 5 и CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 6. В другом варианте антитело может включать тяжелую цепь, в которой CDR-H1 имеет последовательностьSEQ ID NO: 5 и CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 7, или антитело может включать тяжелую цепь, в которой CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 6 и CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 7. Чтобы не было неопределенности, следует иметь в виду, что все перестановки включены. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, включающее тяжелую цепь, в котором вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 5 для CDR-H1, последовательность SEQID NO: 6 для CDR-H2 и последовательность SEQ ID NO: 7 для CDR-H3. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, включающее легкую цепь, в котором вариабельный домен легкой цепи включает по меньшей мере одну из областей CDR, имеющих последовательностьNO: 10 для CDR-L3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, включающее легкую цепь, в которой по меньшей мере две области из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 вариабельного домена легкой цепи выбраны из следующих: последовательности SEQ ID NO: 8 для CDR-L1, последовательности SEQ ID NO: 9 для CDR-L2 и последовательности SEQ ID NO: 10 для CDR-L3. Например, антитело может включать легкую цепь, в которойCDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 8, a CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 9. В другом варианте антитело может включать легкую цепь, в которой CDR-L1 имеет последовательностьSEQ ID NO: 8, a CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 10, или антитело может включать легкую цепь, в которой CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 9, a CDR-L3 имеет последователь-3 018044 ность SEQ ID NO: 10. Чтобы не было неопределенности, следует иметь в виду, что все перестановки включены. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека и включающее легкую цепь, в которой вариабельный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 8 для CDR-L1, последовательность SEQ ID NO: 9 дляCDR-L2 и последовательность SEQ ID NO: 10 для CDR-L3. Следует учитывать, что одно или несколько замещений, добавлений и/или делеций аминокислот может быть произведено в областях CDR, предусмотренных настоящим изобретением, без существенного изменения способности антитела связываться с ИЛ-6 и нейтрализовывать действие ИЛ-6. Действие аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть легко установлено специалистом в данной области, например, с помощью методов, описанных в примерах для определения связывания ИЛ 6 и нейтрализации. Соответственно в одном из примеров настоящего изобретения предусмотрено антитело, специфичное для ИЛ-6 человека, включающее одну или несколько областей CDR, выбранных изCDRH-1 (SEQ ID NO: 5), CDRH-2 (SEQ ID NO: 6), CDRH-3 (SEQ ID NO: 7), CDRL-1 (SEQ ID NO: 8),CDRL-2 (SEQ ID NO: 9) и CDRL-3 (SEQ ID NO: 10), в которых одна или несколько аминокислот в одной или нескольких CDR замещено на другую аминокислоту. Молекулы антител настоящего изобретения предпочтительно включают комплементарную легкую цепь или комплементарную тяжелую цепь соответственно. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению включает тяжелую цепь, в которой вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 5 для CDR-H1, последовательность SEQ ID NO: 6 для CDR-H2 и последовательность SEQ ID NO: 7 для CDR-H3, и легкую цепь, в которой вариабельный домен легкой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 8 для CDR-L1, последовательность SEQ ID NO: 9 для CDR-L2 и последовательность SEQ ID NO: 10 для CDR-L3. В одном из примеров настоящего изобретения предусмотрено антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, включающее тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 5 для CDR-H1, последовательность SEQ ID NO: 6 для CDRH-2 и последовательность SEQ ID NO: 7 для CDRH-3, и легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 8 для CDR-L1, последовательность SEQ ID NO: 9 для CDR-L2 и последовательность SEQ ID NO: 10 для CDR-L3, в котором одна или несколько аминокислот в одной или нескольких CDR замещено на другие аминокислоты. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQID NO: 2. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 2. В контексте настоящего изобретения понятие "идентичность" означает, что в любом положении сравниваемых последовательностей конкретный аминокислотный остаток у данных последовательностей один и тот же. В контексте настоящего изобретения понятие "близкие последовательности" означает, что в каком-либо определенном положении в сравниваемых последовательностях аминокислотный остаток у обеих последовательностей одного типа. Например, лейцин может быть замещен на изолейцин или валин. К другим аминокислотам, которые могут быть замещены друг на друга, относятся, но ими не ограничиваются, следующие аминокислоты: фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты с ароматическими боковыми цепями),лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты с основными боковыми цепями),аспартат и глутамат (аминокислоты с кислотными боковыми цепями),аспарагин и глутамин (аминокислоты с амидными боковыми цепями) и цистеин и метионин (аминокислоты с серусодержащими боковыми цепями). Степени идентичности и близости могут быть легко подсчитаны (кн.: "Computational Molecular Biology", 1988, под ред. Lesk A.M., изд-во Oxford University Press, Нью-Йорк, кн.: "Biocomputing. Informatics and Genome Projects", 1993, под ред. Smith D.W., изд-во Academic Press, Нью-Йорк, кн.: "Computer"Sequence Analysis Primer", 1991, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во М Stockton Press, Нью-Йорк). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает легкую цепь, причем вариабелный домен легкой цепи включает последовательность SEQ IDNO: 4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения-4 018044 включает легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, на 60% идентичную или близкую последовательности SEQ ID NO: 4. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 4. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQID NO: 2, и легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность SEQ IDNO: 4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 2, а вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ IDNO: 4. Предпочтительно антитело включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения является антителом крысы, в котором вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность SEQID NO: 2, а вариабельный домен легкой цепи включает последовательность SEQ ID NO: 4. Это антитело крысы обозначается в настоящем изобретении "132 Е 09" или в качестве "донорского" антитела. Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи крысиного антитела 132 Е 09 представлены в виде последовательностей SEQ ID NOS: 1 и 2 соответственно. Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи антитела крысы 132 Е 09 представлены в виде последовательностей SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно. Последовательности CDR SEQ ID NOS: 5-10 являются производными антитела крысы 132 Е 09. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения является CDR-пересаженным антителом. В контексте настоящего изобретения понятие "CDRпересаженное антитело" относится к антителу, в котором тяжелая и/или легкая цепь содержит одну или несколько областей CDR (включая, при необходимости, одну или несколько модифицированных CDR) донорского антитела (например, антитела крысы), пересаженных в каркасный участок вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи акцепторного антитела (например, антитела человека). См. обзорVaughan и др., Nature Biotechnology, 16, 1998, cc. 535-539. Предпочтительно одна или несколько CDR получено от крысиного антитела 132 Е 09 (SEQ ID NOS: 5-10). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительнее переносить не целую область CDR, а только один или несколько из числа специфически детерминируемых остатков какой-либо из CDR, описанных в настоящем изобретении выше, в каркасный участок антитела человека (см., например, Kashmiri и др., Methods, 36, 2005,cc. 25-34). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения только специфически детерминируемые остатки от одной или нескольких CDR, описанных в настоящем изобретении выше, переносятся в каркасный участок антитела человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения только специфически детерминируемые остатки из каждой CDR, описанной в настоящем изобретении выше, переносятся в каркас антитела человека. Если CDR или специфически детерминируемые остатки являются пересаженными, может применяться какая-либо соответствующая последовательность каркасного участка акцепторной вариабельной области независимо от класса/типа донорского антитела, от которого получены CDR, включая каркасные участки крысы, мыши, обезьяны и человека. Предпочтительно CDR-пересаженное антитело настоящего изобретения содержит по меньшей мере один вариабельный домен, включающий акцепторные каркасные участки человека, а также одну или несколько CDR, являющихся производными донорского антитела, согласно описанному выше. Таким образом, предусмотрено нейтрализующее CDR-пересаженное антитело, в котором вариабельный домен включает акцепторные каркасные участки человека и донорские области CDR других видов, предпочтительно крысы. Примерами каркасных участков человека, которые могут использоваться в настоящем изобретении,являются KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ (Kabat и др., см. выше). Например, KOL иNEWM могут применяться в тяжелой цепи, REI может применяться в легкой цепи, a EU, LAY и РОМ могут применяться и в легкой цепи, и в тяжелой цепи. В другом варианте могут применяться последовательности зародышевой линии клеток человека; с этими последовательностями можно ознакомиться на сайте: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/ В CDR-пересаженном антителе настоящего изобретения необязательно, чтобы акцепторные тяжелая и легкая цепи были производными одного антитела, и они могут при необходимости включать цепи смешанного состава, обладающие каркасными участками от разных цепей. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каркасный участок тяжелой-5 018044 цепи CDR-пересаженного антитела настоящего изобретения является производным последовательности 1-4 3-72 подгруппы VH3 человека вместе с JH4 (показано на фиг. 2, SEQ ID NOS: 19 и 20). Таким образом, предусмотрено нейтрализующее CDR-пересаженное антитело, включающее по меньшей мере одну донорскую CDR, не принадлежащую человеку, в которой каркасный участок тяжелой цепи является производным последовательности 1-4 3-72 подгруппы человека вместе с JH4. Последовательностью JH4 человека является последовательность: (YFDY)WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20). Мотив YFDY составляет часть CDR-H3 и не составляет части каркасного участка 4 (Ravetch, J.V. и др., Cell, 27, 1981, cc. 583591). Донорская последовательность является последовательностью 132 Е 09 VH (SEQ ID NO: 2), показанной на фиг. 2, причем донорские области CDR (SEQ ID NOs: 5, 6 и 7) подчеркнуты. Предпочтительный каркасный участок для легкой цепи CDR-пересаженного антитела является производным последовательности 2-1-(1) 012 подгруппы VK1 зародышевой линии клеток человека вместе с JK2 (SEQ ID NO: 21 и 22) (см. фиг. 2). Таким образом, предусмотрено нейтрализующее CDRпересаженное антитело, включающее по меньшей мере одну донорскую область CDR, не принадлежащую человеку, причем каркасный участок легкой цепи является производным последовательности 2-1(1) 012 подгруппы VK1 человека вместе с JK2. Структура последовательности JK2 следующая:(YT)FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 22). Мотив YT является частью CDR-L3 и не является частью каркасного участка 4 (Hieter, Р.А., и др., J. Biol. Chem., 257, 1982, cc. 1516-1522). Донорская последовательность является последовательностью 132 Е 09 VL (SEQ ID NO: 4), показанной на фиг. 2, причем донорские CDR(SEQ ID NOs 8-10) подчеркнуты. Кроме того, в CDR-пересаженном антителе настоящего изобретения каркасные участки не должны иметь точно ту же последовательность, что и у акцепторного антитела. Например, необычные остатки могут быть заменены более распространенными остатками для данного класса или типа акцепторной цепи. В другом варианте выбранные остатки в акцепторных каркасных участках могут быть заменены таким образом, что они соответствуют остатку, выявляемому в том же положении в донорском антителе (см. Reichmann и др., Nature, 332, 1998, cc. 323-324). Такие изменения следует свести к минимуму, необходимому для восстановления сродства донорского антитела. Протокол для выбора остатков в акцепторных каркасных участках, которые может потребоваться изменить, представлены в WO 91/09967. Предпочтительно в молекуле CDR-пересаженного антитела настоящего изобретения, если акцепторная тяжелая цепь содержит последовательность 1-4 3-72 VH3 человека вместе с JH4, тогда акцепторные каркасные участки тяжелой цепи включают, помимо одной или нескольких донорских областейCDR, донорский остаток, по меньшей мере, в положении 49 (по нумерации Kabat и др., см. выше). Соответственно, предусмотрено CDR-пересаженное антитело, в котором, по меньшей мере, остаток в положении 49 вариабельного домена тяжелой цепи является донорским остатком. Предпочтительно в молекуле CDR-пересаженного антитела настоящего изобретения, если акцепторная легкая цепь содержит последовательность 2-1-(1) 012 подгруппы VK1 человека вместе с последовательностью JK2, тогда не используют донорских остатков в акцепторных каркасных участках легкой цепи и пересаживают только одну или несколько донорских областей CDR. Донорские остатки являются остатками донорского антитела, т.е. антитела, от которого происходятCDR, которое в настоящем изобретении является антителом 132 Е 09 крысы. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрено антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность gH13 (фиг. 2, SEQ ID NO: 11). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь, в которой вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 11. Предпочтительно антитело содержит тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 11. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает антитело, в котором вариабельная область легкой цепи включает последовательность gL10 (фиг. 2, SEQ ID NO: 13). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает легкую цепь,причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 13. Предпочтительно антитело содержит легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 13. Предпочтительно CDR-пересаженное антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, включающую последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11), и легкую цепь, включающую последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 13. Предпочтительно антитело содержит тяжелую цепь, в которой вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95-6 018044 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, в которой вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 13. Молекулы антител настоящего изобретения могут представлять полноразмерную молекулу антитела, включающую тяжелую и легкую цепи полной длины или их фрагмент и могут быть представлены,однако не только ими, Fab, модифицированными Fab, Fab', F(ab')2, Fv, антителами с одним доменом,scFv, двух-, трех- или тетравалентными антителами, Bis-scFv, двойными антителами, тройными антителами, четвертичными антителами или эпитопсвязанными фрагментами какой-либо из указанных выше последовательностей (см., например, Holliger, Hudson, Nature Biotech. 23(9), 2005, cc. 1126-1136, Adair,Lawson, Drug Design Reviews-Online 2(3), 2005, cc. 209-217). Способы создания и получения фрагментов таких антибиотиков хорошо известны в данной области (см., например, Verma и др., Journal of Immunological Methods, 216, 1998, cc. 165-181). К фрагментам других антител для применения в настоящем изобретении относятся фрагменты Fab и Fab', описанные WO 2005/003169, WO 2005/003170 и WO 2005/003171. Поливалентные антитела могут быть мультиспецифичными или моноспецифичными (см.,например, WO 92/22853 и WO 05/113605). Домены константной области молекулы антитела настоящего изобретения, если они имеются, могут быть выбраны в зависимости от конкретной функции молекулы антитела, в особенности от эффекторных функций, которые могут быть необходимы. Например, доменами константной области могут быть домены IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, могут применяться домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3, если молекула антитела предназначена для терапевтического применения и необходимы эффекторные функции антитела. В другом варианте изотипыIgG2 и IgG4 могут применяться, если молекула антитела предназначена для терапевтических целей и эффекторные функции антитела не требуются, например для простого блокирования активности ИЛ-6. Следует учесть, что также могут применяться варианты последовательностей доменов данной константной области. Например, могут применяться молекулы IgG, в которых серин в положении 241 заменен пролином, что было описано Angal и др., Molecular Immunology, 30 (1), 1993, cc. 105-108. Наиболее предпочтительным является константный домен IgG4, включающий такую замену. Специалистам в данной области следует учитывать, что антитела могут претерпевать различные посттрансляционные модификации. Тип и степень этих модификаций часто зависят от линии клеток-хозяев, используемых для экспрессии антитела, а также от условий культивирования. К таким модификациям могут относиться вариации гликозилирования, окисления метионина, формирования дикетопиперазина, изомеризации аспартата и дезамидирования аспарагина. Обычная модификация представляет потерю С-концевого основного остатка (например, лизина или аргинина) из-за действия карбоксипептидаз (см. публикацию Harris R.J.Journal of Chromatography 705, 1995, cc. 129-134). Следовательно, может отсутствовать С-концевой лизин тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 16. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело, предусмотренное в настоящем изобретении, является нейтрализующим антителом, специфичным в отношении ИЛ-6 человека, в котором константная область тяжелой цепи представляет константную область IgG4 человека, в которой серин в положении 241 замещен на пролин согласно публикации Angal и др. (см. выше). Соответственно, настоящее изобретение предусматривает антитело, в котором тяжелая цепь включает или состоит из последовательности SEQ ID NO: 16. Предпочтительно константная область легкой цепи является областью с-карра. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело, в котором тяжелая цепь включает или состоит из последовательности SEQ ID NO: 16, а легкая цепь включает или состоит из последовательности SEQ ID NO: 18. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь,причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 16. Предпочтительно антитело включает тяжелую цепь, причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает легкую цепь,причем легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 18. Предпочтительно антитело включает легкую цепь, причем легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 18. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 16, а легкая цепь включает последовательность,которая по меньшей мере на 60% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 18. Предпочтительно антитело включает тяжелую цепь, причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 16, и легкую цепь, причем легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95-7 018044 или 98% идентична или близка последовательности SEQ ID NO: 18. В настоящем изобретении также предусмотрена специфическая область или эпитоп ИЛ-6 человека,который связывается антителом настоящего изобретения, в частности антителом, включающим какуюлибо из комплементарно детерминируемых областей: CDR-H1 (SEQ ID NO: 5), CDR-H2 (SEQ ID NO: 6),CDR-H3 (SEQ ID NO: 7), CDR-L1 (SEQ ID NO: 8), CDR-L2 (SEQ ID NO: 9) или CDR-L3 (SEQ ID NO: 10),например антителом 132 Е 09 или антителами, включающими последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11) вариабельной области тяжелой цепи и/или последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13) вариабельной области легкой цепи. Специфическая область или эпитоп полипептида ИЛ-6 человека могут быть идентифицированы каким-либо соответствующим способом картирования эпитопа, известным в данной области, в комбинации с каким-либо из антител, предусмотренных в настоящем изобретении. К таким способам относится скрининг пептидов разной длины, являющихся производными ИЛ-6, для связывания антитела настоящего изобретения с наименьшими фрагментами, способными специфически связываться с антителом, содержащим последовательность или эпитоп, распознаваемый антителом. Пептиды ИЛ-6 могут быть получены синтетически или путем протеолитического расщепления полипептида ИЛ-6. Пептиды, связывающие антитело, могут быть идентифицированы, например, методом масс-спектрометрии. В другом примере ЯМР-спектроскопия может быть применена для идентификации эпитопа, связанного антителом настоящего изобретения, что описано в приводимых в настоящем изобретении примерах. После идентификации фрагмент эпитопа, который связывает антитело настоящего изобретения, может применяться при необходимости в качестве иммуногена для получения дополнительных нейтрализующих антител,которые связывают тот же эпитоп. В одном из примеров эпитоп ИЛ-6 человека, связываемый антителом настоящего изобретения,включает, по меньшей мере, остатки аминокислот S47, С 50, Е 93, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, А 153,Q156, Q159 и S169 ИЛ-6 человека (нумерация остатков по Boulanger и др., Science, 300, cc. 2101-2104). В одном из примеров эпитоп ИЛ-6 человека, связываемый антителом настоящего изобретения, включает остатки аминокислот S47, С 50, Е 93, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, А 153, Q156, Q159 и S169 и один или несколько остатков, выбранных из С 44, S53, А 58, V96, Q152, Q154, N155, W157, Т 163, L165 и Е 172. В одном из примеров эпитоп ИЛ-6 человека, связываемый антителом настоящего изобретения,включает остатки аминокислот С 44, S47, С 50, S53, А 58, Е 93, V96, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, Q152,А 153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т 163, L165, S169 и Е 172. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6, которое связывает эпитоп зрелого ИЛ-6 человека и включает остатки аминокислот S47, С 50, Е 93, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, А 153, Q156, Q159 и S169. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6, которое связывает эпитоп зрелого ИЛ-6 человека и включает остатки аминокислот S47, С 50, Е 93, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, А 153, Q156, Q159 и S169 и один или несколько остатков, выбранных из С 44, S53, А 58, V96, Q152, Q154, N155, W157, Т 163, L165 и Е 172. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6, которое связывает эпитоп зрелого ИЛ-6 человека и включает остатки аминокислот С 44, S47, С 50, S53, А 58, Е 93, V96, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, Q152, А 153,Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т 163, L165, S169 и Е 172. Следует учесть, что остатки, обозначенные выше, также могут быть пронумерованы, основываясь на нумерации аминокислот необработанного предшественника ИЛ-6 (Swiss Prot инвентарный номер Р 05231). Используя данную нумерацию остатки, перечисленные выше согласно нумерации Boulanger и др. и обозначенные выше С 44, S47, С 50, S53, А 58, Е 93, V96, R104, F105, Е 106, Т 149, K150, Q152, А 153,Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т 163, L165, S169 и Е 172, становятся остатками С 72, S75, С 78, S81, А 86,Е 121, V124, R132, F133, Е 134, Т 177, K178, Q180, А 181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, Т 191, L193, S197 и Е 200 соответственно. Предпочтительно антитело настоящего изобретения блокирует связывание рецептора gp130 с сайтом 3 ИЛ-6 человека. Антитела, которые перекрестно блокируют связывание антител настоящего изобретения с ИЛ-6,могут сходным образом использоваться для нейтрализации активности ИЛ-6. В связи с этим настоящее изобретение также предусматривает нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, которое перекрестно блокирует связывание какого-либо из антител, описанных выше, с ИЛ-6 человека и/или перекрестно блокировано в результате связывания ИЛ-6 is cross-blocked from binding IL-6 каким-либо из этих антител. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело, описанное в настоящем изобретении выше. В другом варианте осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующее нейтрализующее антитело связывается с эпитопом, который граничит и/или перекрывается с эпитопом, связываемым антителом, описанным в настоящем изобретении выше. В другом варианте осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующее нейтрализующее антитело данного объекта настоящего изобретения не связывает тот же эпитоп, что и антитело настоящего изобретения, или эпитоп, который граничит и/или перекрыва-8 018044 ется с указанным эпитопом. Перекрестно блокирующие антитела могут быть идентифицированы с помощью каких-либо соответствующих методов, известных в данной области, например с помощью конкурентного иммуноферментного анализа ELISA или BIAcore, в которых связывание перекрестно блокирующего антитела с ИЛ 6 человека предупреждает связывание антитела настоящего изобретения или наоборот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, которое перекрестно блокирует связывание антитела 132 Е 09, или антитела, у которого тяжелая цепь включает последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11), или антитела, у которого легкая цепь включает последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13), или антитела,включающего какую-либо из последовательностей CDR-H1 (SEQ ID NO: 5), CDR-H2 (SEQ ID NO: 6),CDR-H3 (SEQ ID NO: 7), CDR-L1 (SEQ ID NO: 8), CDR-L2 (SEQ ID NO: 9) или CDR-L3 (SEQ ID NO: 10),с ИЛ-6 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующие антитела, предусмотренные настоящим изобретением, ингибируют связывание 132 Е 09 или антитела, у которого тяжелая цепь включает последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11), или антитела, у которого легкая цепь включает последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13), или антитела, включающего какую-либо из последовательностей CDR-H1 (SEQ ID NO: 5), CDR-H2 (SEQ ID NO: 6), CDR-H3 (SEQ IDNO: 7), CDR-L1 (SEQ ID NO: 8), CDR-L2 (SEQ ID NO: 9) или CDR-L3 (SEQ ID NO: 10), с ИЛ-6 человека на 80% или более, на 85% или более, на 90% или более, на 95% или более. В другом варианте осуществления или дополнительно нейтрализующие антитела по данному объекту настоящего изобретения могут быть перекрестно блокированы в результате связывания с ИЛ-6 человека какого-либо из антител настоящего изобретения. Таким образом, также предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, которое перекрестно блокируется в результате связывания ИЛ-6 человека антителом 132 Е 09, или антителом, у которого тяжелая цепь включает последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11), или антитело, у которого легкая цепь включает последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13), или антитело, включающее какую-либо из областей CDR-H1 (SEQ IDNO: 5), CDR-H2 (SEQ ID NO: 6), CDR-H3 (SEQ ID NO: 7), CDR-L1 (SEQ ID NO: 8), CDR-L2 (SEQ ID NO: 9) или CDR-L3 (SEQ ID NO: 10). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве объекта предусмотрены нейтрализующие антитела настоящего изобретения, которые подавляются в результате связывания ИЛ-6 человека антителом 132 Е 09, или антителом, у которого тяжелая цепь включает последовательность gH13 (SEQ ID NO: 11), или антителом, у которого легкая цепь включает последовательность gL10 (SEQ ID NO: 13), или антителом, включающим какую-либо последовательность изCDR-H1 (SEQ ID NO: 5), CDR-H2 (SEQ ID NO: 6), CDR-H3 (SEQ ID NO: 7), CDR-L1 (SEQ ID NO: 8),CDR-L2 (SEQ ID NO: 9) или CDR-L3 (SEQ ID NO: 10) на 80% или более, на 85% или более, на 90% или более, или на 95% или более. Молекулы антител настоящего изобретения предпочтительно имеют высокое связывающее сродство с ИЛ-6 человека, предпочтительно выраженное в пикомолях. Сродство может быть измерено соответствующими методами, известными в данной области, включая метод BIAcore, описанный в примерах настоящего изобретения. Предпочтительно сродство измеряют, используя рекомбинантный ИЛ-6 человека, способом, описанным в примерах настоящего изобретения. Предпочтительно молекула антитела настоящего изобретения обладает связывающим сродством с ИЛ-6 человека в концентрации, составляющей менее 500 пМ. Соответственно в одном из вариантов настоящего изобретения молекула антитела настоящего изобретения обладает связывающим сродством в концентрации примерно от 1 до примерно 500 пМ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела настоящего изобретения обладает связывающим сродством в концентрации примерно от 1 до примерно 50 пМ. Предпочтительно молекула антитела настоящего изобретения обладает связывающим сродством с ИЛ-6 человека в концентрации примерно от 1 до примерно 20 пМ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения обладает связывающим сродством с ИЛ-6 человека в концентрации 8-12 пМ. Следует учитывать, что сродство антител, предусмотренных настоящим изобретением, может быть изменено соответствующими методами, известными в данной области техники. Настоящее изобретение также относится к вариантам молекул антител настоящего изобретения, обладающих улучшенным сродством с ИЛ-6 человека. Такие варианты могут быть получены с помощью ряда протоколов формирования сродства, включая мутирование областей CDR (Yang и др., J. Mol. Biol.,254, 1995, cc. 392-403), перемещение цепи (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc. 779-783), применение штаммов-мутаторов Е. coli (Low и др., J. Mol. Biol., 250, 1996, cc. 359-368), перемещение ДНК (Patten и др., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 1997, cc. 724-733), фаговый дисплей (Thompson и др., J. Mol. Biol., 256,1996, cc. 77-88) и половую ПЦР (Crameri и др., Nature, 391, 1998, cc. 288-291). Vaughan и др. (выше) обсуждают эти способы формирования сродства. Молекулы антитела настоящего изобретения предпочтительно нейтрализуют активность ИЛ-6, например, в анализах in vitro и in vivo, описанных в примерах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эти антитела связывают сайт 3 ИЛ-6 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное для ИЛ-6 человека и способное ингибировать активность 0,038 нМ ИЛ-6 человека-9 018044 на 50% в концентрации менее 100 пМ указанной ингибиторной активности, измеряемой по пролиферации клеток Т 1165, индуцируемой ИЛ-6. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрация антитела, ингибирующего ИЛ-6 на 50% менее 50 пМ, более предпочтительно менее 20 пМ. Предпочтительно ИЛ-6 человека, используемый в исследовании, является рекомбинантным ИЛ-6 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело является гуманизированным антителом или антителом, полностью являющимся антителом человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее антитело, специфичное в отношении ИЛ-6 человека, которое способно ингибировать активность 3,84 нМ ИЛ 6 человека на 50% в концентрации менее 1 нМ, указанная ингибиторная активность измеряется по выработке МСР-1 эндотелиальными клетками пупочной вены человека (ЭКПВЧ) в ответ на ИЛ-6 и рИЛ-6 Р человека. Предпочтительно ИЛ-6 человека, используемый в данном исследовании, является рекомбинантным ИЛ-6 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело является гуманизированным антителом или антителом, полностью являющимся антителом человека. При необходимости антитело настоящего изобретения может быть конъюгировано с одной или несколькими эффекторными молекулами. Следует учитывать, что в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторная молекула может представлять единственную эффекторную молекулу, или две, или несколько таких молекул, связанных таким образом, что они формируют единую часть молекулы, которая может быть присоединена к антителам настоящего изобретения. Если есть потребность в получении фрагмента антитела, связанного с эффекторной молекулой, этот фрагмент может быть получен стандартными методами химического синтеза или рекомбинации ДНК, с помощью которых фрагмент антитела связан либо непосредственно, либо через связывающий агент с эффекторной молекулой. Методики конъюгирования таких эффекторных молекул с антителами хорошо известны в данной области (см. Hellstrom и др. в кн.: "Controlled Drug Delivery", 1987, 2-е изд., под ред. Robinson и др.,eds., 1987, cc. 623-53, Thorpe и др., Immunol. Rev., 62, 1982, cc. 119-58, Dubowchik и др., Pharmacology andTherapeutics, 83, 1999, cc. 67-123). К химическим методам относятся методы, описанные, например, в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03031581. В другом варианте, если эффекторная молекула является белком или полипептидом, связь может быть достигнута методами с применением рекомбинантной ДНК, например описанными в WO 86/01533 и ЕР 0392745. В контексте настоящего изобретения понятие "эффекторная молекула" относится, например, к антинеопластическим агентам, лекарственным средствам, токсинам, биологически активным белкам, например ферментам, другим антителам или фрагментам антител, синтетическим или природным полимерам, нуклеиновым кислотам и их фрагментам, например ДНК, РНК и их фрагментам, радионуклидам,особенно радиоиодитам, радиоизотопам, хелатным металлам, наночастицам и репортерным группам,например флуоресцирующим соединениям или соединениям, которые могут быть обнаружены методами ЯМР и спектрометрии электронного парамагнитного резонанса (СЭПР). Примерами эффекторных молекул являются цитотоксины или цитотоксические агенты, в том числе какие-либо агенты, вредные для клеток (например, убивающие клетки). К ним относятся комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспоррин, майтансиноиды, спонгистатины, ризоксин, галихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол,цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин,винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи. К эффекторным молекулам также относятся, но ими не ограничиваются, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиоэпахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин(CCNU), циклофосфан, бусульфан, дибромманит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлородиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее называвшийся дауномицином) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином),блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), каличеамицины или дуокармицины) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). К другим эффекторным молекулам могут относиться хелатные радионуклиды, например 111In и 90Y,177Lu, висмут 213, калифорнии 252, иридии 192 и вольфрам 188/ренин 188, или лекарственные средства, к которым относятся, но ими не ограничиваются, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин. К другим эффекторным молекулам относятся белки, пептиды и ферменты. К соответствующим ферментам относятся, но ими не ограничиваются, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. К соответствующим белкам, полипептидам и пептидам относятся, но ими не ограничиваются, иммуноглобулины, токсины, например абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин, белки, например инсулин, фактор некроза опухолей, -интерферон, -интерферон,фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов, активатор тканевого плазминогена, тромботический агент или антиангиогенный агент, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологиче- 10018044 ского ответа, например лимфокин, интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-6 (ИЛ-6),фактор стимуляции колоний гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF), фактор роста нервов (NGF) или другой ростовой фактор и иммуноглобулины. К другим эффекторным молекулам могут относиться вещества-индикаторы, применимые, например, в диагностике. К примерам веществ-индикаторов относятся различные ферменты, простатические группы, флуоресцирующие материалы, люминесцирующие материалы, биолюминесцирующие материалы, радиоактивные нуклиды, позитрон-эмитирующих металлов (для применения в позитронэмиссионной томографии) и нерадиоактивные ионы парамагнитных металлов. Основную информацию см. в US 4741900 по ионам металлов, которые могут конъюгировать с антителами, для их использования в качестве диагностикумов. К применимым ферментам относятся пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, -галактозидаза или ацетилхолинэстераза, к применимым простетическим группам относятся стрептавидин, авидин, биотин, к применимым флуоресцирующим агентам относятся умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламинфлуоресцеин, дансил хлорид и фикоэритрин, к применимым люминесцентным материалам относится люминол, к применимым биолюминесцентным материалам относятся люцифераза, люциферин, экворин, а к применимым радиоактивным нуклидам относятся 125I, 131I, 111In и 99 Тс. В другом примере эффекторная молекула (молекулы) могут повысить период полувыведения антитела in vivo, и/или понизить иммуногенность антитела, и/или повысить выработку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. К примерам пригодных эффекторных молекул данного типа относятся полимеры, альбумин, альбуминсвязывающие белки или альбуминсвязывающие соединения, например описанные в WO 05/117984. Если эффекторная молекула является полимером, она может быть синтетической или природной,например необязательно замещенной прямой или разветвленной цепью полиалкилена, полиалкенилленом или полиоксиалкиленом, или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например гомоили гетерополисахаридом. Частичные необязательные заместители, которые могут быть представлены на указанных выше синтетических полимерах, включая одну или несколько гидроксигрупп, метильных или метоксигрупп. К примерам отдельных синтетических полимеров относятся необязательно замещенные прямые или разветвленные цепи полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, поливинилового спирта или их производные, особенно необязательно замещенный полиэтиленгликоль, например метоксиполиэтиленгликоль или его производные. В частности к природным полимерам относятся полимеры на основе лактозы, амилозы, декстрана,гликогена или их производных. В контексте настоящего изобретения понятие "производные" относится к реакционноспособным производным, например тиол-селективные реакционноспособные группы, например имиды малеиновой кислоты и др. Реакционноспособная группа может быть связана с полимером непосредственно или через линкерный сегмент. Следует учитывать, что остаток такой группы может в некоторых случаях формировать часть продукта в виде линкерной группы между фрагментом антитела и полимером. Размер полимера при необходимости может варьировать, но обычно его молекулярная масса находится в диапазоне от 500 до 50000 Да, предпочтительно 5000-40000 Да и более, предпочтительно 2000040000 Да. Размер полимера, в частности, может быть выбран на основании намеченного применения данного продукта, например исходя из способности концентрироваться в определенных тканях, например опухолях, или от срока полураспада в кровяном русле (см. обзор Chapman, Advanced Drug DeliveryReviews, 54, 2002, cc. 531-545). Таким образом, например, если продукт предназначен для того, чтобы из кровяного русла перейти в ткань, например, при лечении опухолей, преимуществом может обладать низкомолекулярный полимер, например с молекулярной массой около 5 кДа. При тех вариантах использования, когда продукт сохраняется в системе кровообращения, преимуществом может обладать применение высокомолекулярного полимера, например с молекулярной массой 20000-40000 Да. К особенно предпочтительным полимерам относится полиалкиленовый полимер, например полиэтиленгликоль или особенно метоксиполиэтиленгликоль или его производные, особенно с молекулярной массой примерно от 15000 до примерно 40000 Да. В одном из примеров антитела для применения в настоящем изобретении присоединены к полиэтиленгликолевым (ПЭГ) частям молекулы. В одном из примеров антитело является фрагментом антитела, и молекулы ПЭГ могут быть присоединены через какую-либо доступную аминокислотную боковую цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, локализованную во фрагменте антитела, например какую-либо свободную амино-, имино-, тиоловую, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут естественным образом присутствовать во фрагменте антитела или могут быть вставлены во фрагмент, используя методы рекомбинантной ДНК (см., например, US 5219996, US 5667425, WO 98/25971). В одном из примеров молекула антитела настоящего изобретения является модифицированным фрагментом Fab, в котором модификация заключается в добавлении к С-концу его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот, которая позволяет присоединить эффекторную молекулу. Предпочтительно дополнительные аминокислоты формируют модифицированную шарнирную об- 11018044 ласть, содержащую один или несколько остатков цистеина, к которым эффекторная молекула может быть присоединена. Множественные сайты могут применяться для присоединения двух или нескольких молекул ПЭГ. Предпочтительно молекулы ПЭГ ковалентно связаны через тиоловые группы по меньшей мере одного остатка цистеина во фрагменте антитела. Каждая молекула, присоединенная к фрагменту модифицированного антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы в остатке цистеина, расположенном во фрагменте. Ковалентная связь может быть дисульфидной связью или, в частности, связью между серой и углеродом. Если применяют тиоловую группу в качестве точки присоединения соответствующим образом активированных эффекторных молекул, могут использоваться, например, тиолселективные производные, например малеимиды и производные цистеина. Активированный полимер может применяться в качестве стартового материала для приготовления фрагментов полимермодифицированного антитела, описанных выше. Активированный полимер может быть каким-либо полимером, содержащим тиоловую реакционноспособную группу, например -галогеновая карбоновая кислота или сложный эфир, например иодацетамид, имид, например имид малеиновой кислоты, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы коммерчески доступны (например, выпускаемые фирмой Nektar, ранее называвшейся Shearwater Polymers Inc., Хантсвилл, Алабама, США) или могут быть приготовлены из коммерчески доступных исходных материалов, используя обычные химические методики. Некоторые молекулы ПЭГ включают 20K метокси-ПЭГ-амин (фирма Nektar, ранее называвшаяся Shearwater, фирма Rapp Polymere и фирма SunBio) и М-ПЭГ-SPA (продукт фирмы Nektar, ранее называвшейся Shearwater). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является модифицированным фрагментом Fab или diFab, который является пэгилированным, т.е. ковалентно соединенным с ПЭГ"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Application", 1992, под ред. J. Milton Harris,изд-во Plenum Press, Нью-Йорк, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, под ред. J. Milton Harris и S. Zalipsky, изд-во American Chemical Society, округ Вашингтон, М. Aslam, A. Dent,"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, изд-во Grove Publishers,Нью-Йорк, Chapman A., Advanced Drug Delivery Reviews 54, 2002, cc. 531-545). В одном из примеров ПЭГ присоединен к цистеину в шарнирной области. В другом примере ПЭГ-модифицированный фрагмент Fab содержит группу имидмалеиновой кислоты, ковалентно связанную с одной тиоловой группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина может быть ковалентно связан с группой имида малеиновой кислоты, и к каждой из аминных групп остатка лизина может быть присоединен полимер метоксиполиэтиленгликоль с молекулярной массой примерно равной 20 кДа. Таким образом, общая молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к фрагменту Fab, примерно может составлять 40000 Да. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена молекула нейтрализующего антитела, специфичная в отношении ИЛ-6 человека, которая является модифицированным фрагментом Fab с тяжелой цепью, включающей последовательность SEQ ID NO: 11, и легкой цепью,включающей последовательность SEQ ID NO: 13, а также обладающим с С-конца тяжелой цепи модифицированной шарнирной областью, содержащей по меньшей мере один остаток цистеина, к которому присоединена эффекторная молекула. Предпочтительно эффекторной молекулой является ПЭГ, присоединенный с помощью методов, описанных в WO 98/25971 и WO 2004072116, в соответствии с которыми группа лизил-имидмалеиновой кислоты присоединена к остатку цистеина по С-концу тяжелой цепи и каждая аминогруппа остатка лизила ковалентно связана с остатком метоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой примерно 20 кДа. Таким образом, общая молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к антителу, составляет примерно 40 кДа. В другом примере эффекторные молекулы могут быть присоединены к фрагментам антител с помощью методов, описанных в международных патентных заявках WO 2005/003169, WO 2005/003170 иWO 2005/003171. В настоящем изобретении также предусмотрена выделенная последовательность ДНК, кодирующая тяжелую и/или легкую цепь(цепи) молекулы антитела настоящего изобретения. Предпочтительно последовательность ДНК кодирует тяжелую или легкую цепь молекулы антитела настоящего изобретения. Последовательность ДНК настоящего изобретения может включать синтетическую ДНК, например, образуемую химическим синтезом, кДНК, геномную ДНК или какую-либо их комбинацию. Последовательности ДНК, кодирующие молекулу антитела настоящего изобретения, могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, последовательности ДНК, кодирующие частично или полностью тяжелую и легкую цепи антитела, могут быть синтезированы в соответствии с определенными последовательностями ДНК или исходя из соответствующих аминокислотных последовательностей. ДНК, кодирующая последовательности акцепторных каркасных участков, в значительной степени доступна специалистам в данной области и может быть легко синтезирована на основе соответствующих известных аминокислотных последовательностей. Стандартные методики молекулярной биологии могут быть использованы для приготовления по- 12018044 следовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела настоящего изобретения. Требуемые последовательности ДНК могут быть полностью синтезированы или частично с помощью методов синтеза олигонуклеотидов. Также могут быть применены сайт-направленный мутагенез и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Примерами соответствующих последовательностей ДНК являются последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17. Нуклеотиды 1-57 в последовательности SEQ ID NO: 15 и 1-60 в последовательности SEQ ID NO: 17 кодируют последовательность сигнального пептида из антитела В 72.3 мыши (Whittle и др., Protein Eng. 1(6), 1987, cc. 499505.), которое расщепляют для получения молекулы нейтрализующего антитела настоящего изобретения. Соответственно, настоящее изобретение также предусматривает выделенную последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела настоящего изобретения, которая включает нуклеотиды 582008 последовательности SEQ ID NO: 15. Настоящее изобретение также предусматривает выделенную последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела настоящего изобретения, которая включает нуклеотиды 61-705 последовательности SEQ ID NO: 17. Настоящее изобретение также относится к клонирующему или экспрессирующему вектору, включающему одну или несколько последовательностей ДНК настоящего изобретения. В связи с этим в нем предусмотрен клонирующий или экспрессирующий вектор, включающий одну или несколько последовательностей ДНК, кодирующих антитело настоящего изобретения. Предпочтительно клонирующий или экспрессирующий вектор включает две последовательности ДНК, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь молекулы антитела настоящего изобретения соответственно. Предпочтительно вектор согласно настоящему изобретению включает последовательность, представленную SEQ ID NOS: 15 и 17. Нуклеотиды 1-57 в SEQ ID NO: 15 и нуклеотиды 1-60 в SEQ ID NO: 17 кодируют последовательность сигнального пептида из антитела В 72.3 мыши, которая наиболее предпочтительно расщепляется с образованием молекулы нейтрализующего антитела настоящего изобретения. Основные способы конструирования векторов, трансфекции и культивирования хорошо известны специалистам в данной области. В связи с этим см. кн. "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, под ред. F.M. Ausubel, изд-во Wiley Interscience, Нью-Йорк, и кн. "Maniatis Manual", изд-во Cold Spring HarborPublishing. В настоящем изобретении также предусмотрена клетка-хозяин, включающая один или несколько клонирующих или экспрессирующих векторов, включающих одну или несколько последовательностей ДНК, кодирующих антитело настоящего изобретения. Какие-либо соответствующие системы клеткахозяин/вектор могут быть применимы для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела настоящего изобретения. Могут быть применены бактериальные системы, например Е. coli и другие микробные системы, а также эукариотические системы экспрессии, например системы млекопитающих, см. Verma и др., Journal of Immunological Methods, 216, 1998, cc. 165-181. К числу применимых для этой цели клеток-хозяев относятся клетки СНО, NSO, миеломы или гибридомы. Примером соответствующих систем экспрессии является система экспрессии глутаминсинтетазы, описанная в WO 87/04462. В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения молекулы антитела по настоящему изобретению, включающее культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор настоящего изобретения в условиях, пригодных для осуществления экспрессии ДНК, кодирующей молекулу антитела настоящего изобретения, и выделения молекулы антитела. Молекула антитела может включать только полипептид тяжелой или легкой цепи, и в этом случае для трансфекции клетки-хозяина необходимо использовать только кодирующую последовательность или тяжелой, или легкой цепи. Для выработки продуктов, включающих и тяжелую, и легкую цепи, линия клеток может быть трансфецирована двумя векторами, из которых первый вектор кодирует полипептид легкой цепи, а второй вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. В другом варианте может применяться один вектор, включающий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи. Поскольку антитела настоящего изобретения применимы для лечения и/или профилактики патологического состояния, настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую или диагностическую композицию, включающую молекулу антитела настоящего изобретения в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентом, разбавителем или носителем. Следовательно, в настоящем изобретении предусмотрено применение антитела настоящего изобретения для получения лекарственного средства. Композиция может обычно предоставляться в виде части стерильной фармацевтической композиции, которая обычно включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно включать фармацевтически приемлемый адъювант. Настоящее изобретении также предусматривает способ приготовления фармацевтической или диагностической композиции, включающий добавление или смешивание молекулы антибиотика настоящего изобретения вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями. Молекула антитела может быть единственным действующим ингредиентом в составе фармацевти- 13018044 ческой или диагностической композиции или может дополняться другими действующими ингредиентами, включая другие антитела, например антитела к TNF, к ИЛ-1, к Т-клеткам, к IFN или к LPS, или ингредиенты, не являющиеся антителами, например ксантины. Фармацевтические композиции предпочтительно включают терапевтически эффективное количество антитела настоящего изобретения. Понятие "терапевтически эффективное количество" в контексте настоящего изобретения относится к количеству терапевтического агента, необходимого для лечения,облегчения или предупреждения соответствующего состояния или заболевания, или для проявления выявляемого терапевтического или профилактического действия. Для какого-либо антитела терапевтически эффективное количество может быть первоначально оценено либо в исследованиях, выполненных на культуре ткани, либо на модельных животных, обычно грызунах, кроликах, собаках, свиньях или приматах. Модельные животные также могут быть применены для определения диапазона концентраций и способа введения. Такая информация затем может быть применена для определения доз и путей введения людям. Точное терапевтически эффективное количество для человека может зависеть от тяжести заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы и пола субъекта, диеты, времени и частоты введений, комбинации (комбинаций) лекарственных средств, чувствительности и толерантности/ответной реакции на лечение. Это количество может быть определено обычным экспериментальным путем и зависит от решения врача. Обычно терапевтически эффективное количество может заключаться в диапазоне от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,1 до 20 мг/кг. Фармацевтические композиции могут быть традиционно представлены в единичных дозированных формах, содержащих заранее определенное количество действующего агента настоящего изобретения на дозу. Композиции могут вводиться пациенту отдельно или в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами (например, одновременно, последовательно или раздельно). Доза введения молекулы антитела настоящего изобретения зависит от природы состояния, подвергаемого лечению, степени имеющегося воспаления и назначения применения молекулы антитела - профилактического или для лечения определенного состояния. Частота дозирования может зависеть от периода полураспада молекулы антитела и длительности ее действия. Если молекула антитела имеет короткий период полураспада (например, 2-10 ч), может потребоваться введение одной или нескольких доз в сутки. В другом варианте, если молекула антитела имеет длинный период полураспада (например, 2-15 суток или 2-30 суток), может быть необходимо вводить дозу один раз в сутки, один раз в неделю или даже один раз в 1 или 2 месяца. Фармацевтически приемлемый носитель не должен индуцировать выработку антител у индивидуума, которому вводят композицию, а также не должен быть токсичным. Пригодные носители могут быть крупными медленно метаболизируемыми макромолекулами, например белками, полипептидами, липосомами, полисахаридами, полимолочными кислотами, полигликолевыми кислотами, полимерными аминокислотами, сополимерами аминокислот и частиц инактивированных вирусов. Могут быть применены фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот,например, гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, например ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты. Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, например воду, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, дополнительные вещества, например увлажнители, или эмульгирующие агенты, или рН-обеспечивающие буферные вещества могут присутствовать в таких композициях. Такие носители способствуют переработке фармацевтических композиций в таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии для употребления пациентом. Предпочтительными формами для введения являются формы, пригодные для парентерального введения, например, инъекцией или инфузией, например, болюсной инъекцией или непрерывной инфузией. Если продукт предназначен для инъекций или инфузий, он может быть в форме суспензии, раствора или эмульсии в масле или воде, и может содержать формирующие агенты, например суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В другом варианте молекула антитела может быть в сухой форме и восстанавливается перед применением соответствующей стерильной водой. Готовые композиции настоящего изобретения могут вводиться непосредственно субъекту. Субъектами могут быть животные. Однако предпочтительно, если композиции адаптированы для введения людям. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться каким-либо из способов, к которым относятся, но ими не ограничиваются, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное,внутримозговое, внутри желудочковое, чрескожное (например, см. WO 98/20734), подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, подъязычное, внутривлагалищное или ректальное способы введения. Гипоспреи также могут применяться для введения фармацевтических композиций настоящего изобретения. Обычно терапевтические композиции могут приготовляться в виде инъекционных форм, либо растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких растворителях перед инъекцией.- 14018044 Непосредственное введение композиций обычно производится инъекцией (подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной) или введением в межтканевое пространство. Композиции также могут вводиться внутрь повреждения. Введение доз может осуществляться по схеме введения одной дозы или многих доз. Следует учитывать, что действующий ингредиент в композиции может быть молекулой антитела. В этом случае он чувствителен к разрушению в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композиция вводится через желудочно-кишечный тракт, она должна содержать агенты, защищающие антитело от разрушения, но высвобождающие антитело после его всасывания в желудочно-кишечном тракте. Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей приведено в кн. "Remington'sPharmaceutical Sciences", 1991, изд-во Mack Publishing Company, Нью-Йорк. Также рассматривается возможность введения антитела настоящего изобретения с помощью применения генной терапии. Для этого последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы антитела под контролем соответствующих компонентов ДНК, вводят пациенту таким образом,что цепи антитела экспрессируются с последовательностей ДНК и собираются на месте. Настоящее изобретение также предусматривает молекулу антитела для лечения воспалительных заболеваний. Предпочтительно молекула антитела может применяться для понижения воспалительного процесса или для предупреждения воспалительного процесса. В настоящем изобретении также предусмотрена молекула настоящего изобретения для применения в лечении и/или профилактике патологического заболевания, которое опосредовано ИЛ-6 или ассоциировано с повышенным уровнем ИЛ-6. Настоящее изобретение также предусматривает применение молекулы антитела согласно настоящему изобретения для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики патологического расстройства, опосредованного ИЛ-6 или ассоциированного с повышенным уровнем ИЛ-6. Предпочтительно патологическое состояние выбрано из группы, включающей инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, ассоциированный с инфекцией, артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, системное появление симптомов ювенильного идиопатического артрита, системную красную волчанку (СКВ), астму, воспаление тазовых органов, болезнь Альцгеймера, болезнь Крона, язвенный колит, синдром раздраженной кишки,болезнь Кастлемана, анкилозирующий спондилит, дерматомиозит, увеит, болезнь Пейрони, заболевание брюшной полости, заболевание желчного пузыря, пилонидальное заболевание, перитонит, псориаз, васкулит, операционные рубцовые сращения, удар, диабет I типа, лаймский артрит, менингоэнцефалит, опосредованные иммунной системой воспалительные заболевания центральной и периферической нервной системы, например, рассеянный склероз и синдром Гийена-Барре, другие аутоиммунные расстройства,панкреатит, травму (хирургическое вмешательство), заболевание "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата, рак (и солидные опухоли, например, меланомы, гепатобластомы, саркомы, плоскоклеточная карцинома, переходно-клеточные формы рака, рак яичника, и злокачественные заболевания крови, в частности острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, а также рак желудка и толстой кишки), болезнь сердца, включая ишемические заболевания, например инфаркт миокарда, и атеросклероз, внутрисосудистую коагуляцию, резорбцию кости, ожоговых больных, остеопороз, периодонтит и гипохлоргидрию. Предпочтительно патологическим заболеванием является ревматоидный артрит или системная красная волчанка (СКВ). Настоящее изобретение также предусматривает молекулу антитела по настоящему изобретению для лечения или профилактики боли. Настоящее изобретение также предусматривает применение молекулы антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики боли. Молекула антитела настоящего изобретения может использоваться для какой-либо терапии, направленной на снижение действия ИЛ-6 в организме человека или животного. ИЛ-6 может циркулировать в организме или находиться на чрезмерно высоком уровне, находящемся в определенном месте организма, например в месте воспаления. Молекулу антитела настоящего изобретения предпочтительно используют для борьбы с воспалением. Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения людей и животных с риском развития заболевания, опосредованного ИЛ-6, способ, включающий введение субъекту эффективного количества молекул антитела настоящего изобретения. Молекула антитела настоящего изобретения также может применяться для диагностики, например диагностики in vivo и визуализации состояния заболевания, в котором участвует ИЛ-6. Настоящее изобретение дополнительно описывается с помощью приводимых ниже примеров, к которым приводятся следующие чертежи. Фиг. 1 показывает конструкцию пересаженного участка для последовательностей тяжелой (фиг. 2 а,SEQ ID NO: 11) и легкой цепей (фиг. 2 б, SEQ ID NO: 13) антитела 240.g1. Значокподчеркивает различия между донорскими:акцепторными:пересаженными последовательностями каркасного участка. CDR подчеркнуты одной чертой. Нумерация приводится по системе Kabat, за исключением последовательно- 15018044 сти CDR-H1, в которой приводится нумерация и по системе Kabat, и по системе Chothia. Дважды подчеркнутые последовательности являются остатки донорских каркасных участков, сохранившихся в пересаженных фрагментах. Фиг. 2 а показывает транслируемую последовательность 240.g1 тяжелой цепи IgG4, обозначающую границы интрона/экзона. Фиг. 2 б показывает транслируемую последовательность 240.g1 легкой цепи, обозначающую границы интрона/экзона. Фиг. 3 а показывает подавление пролиферации клеток Т 1165, индуцируемой рекомбинантным ИЛ-6 человека, производным от ИЛ-6 человека-млекопитающего, ИЛ-6 макаки-резус, ИЛ-6 макаки крабоеда и ИЛ-6 мыши, антителом 240.gl. Фиг. 3 б показывает подавление антителом 240.gl выработки МСР-1 в клетках ЭКПВЧ, индуцированной рекомбинантным ИЛ-6 человека и рИЛ-6 Р. Фиг. 3 в показывает подавление ИЛ-17-индуцированную выработку эндогенного ИЛ-6 и рИЛ-6 индуцированную выработку МСР-1 в клетках ЭКПВЧ антителом 240.g1. Антитело 240.g1 мощно ингибирует клетками ЭКПВЧ. Фиг. 4. Нейтрализация in vivo чИЛ-6-индуцированного белка SAA у мышей введениемCA030240.g1 (сайт 3 антитела) n=7-8/группу, за исключением ФСБ (n=6). Статистический анализ методом ANOVA с повторной проверкой Бонферрони, Р 0,01 при сравнении только с одним ИЛ-6. Манипуляции с ДНК и основные методики Штамм Е. coli INVF' (фирма Invitrogen) применяют для трансформации и обычного культурального роста. Ферменты рестрикции и модификации ДНК получают из фирм Roche Diagnostics Ltd. и NewEngland Biolabs. Плазмиды приготовляют, используя наборы для очистки Maxi Plasmid purification kits(фирма QIAGEN, номер в каталоге 12165). Реакции сиквенса ДНК проводят, используя набор ABI PrismBiosystems). Используют олигонуклеотиды фирмы INVITROGEN. Используют синтезированные гены фирмы Entelechon. Концентрации Fab и IgG определяют с помощью упорядоченного метода ELISA. Пример 1. Выделение 132 Е 09. Крыс иммунизируют подкожной инъекцией рекомбинантного ИЛ-6 человека (фирма Peprotech) с трехнедельным интервалом, сначала в полном адъюванте Фрейнда, а затем в неполном адъюванте Фрейнда. Через 1-2 недели после последней иммунизации у крыс удаляют селезенки и готовят из них суспензии, состоящие из отдельных клеток. Лимфоциты иммунизированных крыс культивируют в присутствии облученных клеток тифомы мышей EL4 и концентрированной среды Т-клеток кролика в течение 1 недели в 96-луночных планшетах для микротитрования. Супернатанты исследуют на наличие антител, специфичных в отношении ИЛ-6 человека, методом ELISA. Позитивные пробы затем исследуют на способность нейтрализовать биологические эффекты ИЛ-6 человека в линии клеток DS1 (Воск и др.,Cytokine, 5, 1993, cc. 480-489). Отдельные В-клетки, секретирующие антитело с соответствующей связывающей способностью,выделяют из лунок планшета для микротитрования методом выделенных лимфоцитных антител (Babcook и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, cc. 7843-7848, WO 92/02551), а гены вариабельной области легкой и тяжелой цепей клонируют через обратную транскрипцию ПЦР из отдельных В-клеток крыс. Вариабельные области экспрессируют в формате рекомбинантного IgG для подтверждения связывания и антитело 132 Е 09 отбирают для гуманизации и дальнейшего исследования. Последовательность вариабельной области крыс обозначают СА 03000240. Последовательности V-области представлены последовательностями SEQ ID NOS: l-4. Пример 2. CDR-пересаженные антитела 132 Е 09. Конструируют серии гуманизированных областей VL и VH, в которых гипервариабельные областиCDR плюс варьирующее число остатков каркасных участков из 132 Е 09 пересаживают в акцепторные каркасные участки V-области человека. Конструируют десять пересаженных областей VL (gL1-10) и гены выстраивают сборкой олигонуклеотидов и ПЦР-мутагенезом. Все из 13 пересаженных областей VH конструируют (gH1-13), используя два разных каркасных участка, VH3 1-4 3-72 и VH3 1-3 3-21. Пересаженные последовательности легкой цепи субклонируют в экспрессирующий вектор pKH10.1 легкой цепи человека, который содержит ДНК,кодирующую константную область С- человека (аллотип Km3). Пересаженные последовательности тяжелой цепи субклонируют в -4 человека экспрессирующем векторе pVhg4P FL, который содержит ДНК, кодирующую константную область -4 человека, содержащую мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область (Angal и др., см. выше). Плазмиды совместно трансфецируют в клетки линии СНО иin vivo исследуют у образуемых антител активность по связыванию ИЛ-6. Трансфекции в клетки СНО проводят по методу Lipofectamine 2000 согласно инструкциям производителя (фирма InVitrogen, номер в каталоге 11668). Из 13 полученных пересаженных тяжелых цепей две содержат только один остаток донорский кар- 16018044 касного участка (Ala) в положении 49 и их получают, используя оба из двух разных каркасных участков тяжелой цепи. Пересаженный участок VH3 1-3 3-21 плохо экспрессируется в клетках СНО и показывает пониженное сродство в отношении ИЛ-6. Напротив, пересаженный участок, использующий каркасный участок VH3 1-4 3-72, экспрессируется хорошо и сохраняет сродство донорского антитела. Этот пересаженный участок тяжелой цепи, включающий только один остаток донорского каркасного участка, выбирают в комбинации с пересаженным участком легкой цепи gL10, в который были перенесены толькоCDR. Фиг. 1 показывает выверку между донорской последовательностью крысы 132 Е 09 и акцепторными каркасными участками человека. Акцепторный каркасный участок тяжелой цепи является последовательностью VH3 1-3 3-72 зародышевой линии клеток человека с каркасным участком 4, поступающим от данной части JH-области человека зародышевой линии клеток JH4. Акцепторный каркасный участок легкой цепи является последовательностью VK1 2-1-(1) O12 зародышевой линии клеток человека с каркасным участком 4, поступающим от данной части JK-области человека зародышевой линии клеток JK2. Пересаженные последовательности для gH13 и gL10 показаны на фиг. 1 (SEQ ID NOS: 11, 12, 13 и 14). Это пересаженное антитело обозначают CA03000240.g1. Оно было получено в виде целого IgG4,включающего замену серина на пролин в положении 241, согласно описанному выше. Полностью трансплантированные последовательности тяжелой и легкой цепи показаны на фиг. 2 а и 2 б соответственно. Полная аминокислотная последовательность тяжелой цепи показана в виде последовательности SEQ IDNO: 16, а легкой цепи показана в виде последовательности SEQ ID NO: 18. Последовательности ДНК,кодирующие тяжелую и легкую цепь, показаны в виде последовательности SEQ ID NO: 15 и 17 соответственно. Нуклеотиды 1-57 в последовательности SEQ ID NO: 15 и на фиг. 2 а кодируют последовательности сигнального пептида мышиного антитела В 72.3 VH, а нуклеотиды 1-60 в SEQ ID NO: 17 и на фиг. 2 б кодируют последовательности сигнального пептида мышиного антитела В 72.3 VL. Мышиное антитело В 72.3 описано в публикации Whittle и др., Protein Eng. 1(6), 1987, cc. 499-505. Пример 3. Связывающее сродство. Измерения связывающего сродства антитела СА 030 00240. g1. Методика BIAcore осуществляет мониторинг связывания между биомолекулами в реальном времени, причем без необходимости в нанесении метки. Один из этих взаимодействующих агентов, называемый лигандом, либо иммобилизован непосредственно, либо захвачен на иммобилизованной поверхности, а другой агент, называемый аналитом, течет в растворе над связывающей поверхностью. Сенсор выявляет изменение массы на поверхности сенсора, поскольку аналит связывается с лигандом для формирования комплекса на поверхности. Это изменение соответствует процессу ассоциации. Процесс диссоциации подвергают мониторингу после замены аналита буфером. В исследовании сродства методомBIAcore лигандом является антитело CA03000240.g1 в виде целого IgG4, а аналитом является ИЛ-6 человека. Прибор.Biacore 3000, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Сенсорный чип. СМ 5 (чистый для анализа) имеет номер в каталоге: BR-1001-14, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Чипы хранят при температуре 4 С.AB, Упсала, Швеция. Набор BIAmaintenance хранят при 4 С. Набор для присоединения амина. Номер в каталоге: BR-1000-50, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид. Готовят раствор в концентрации до 75 мг/мл в дистиллированной воде и хранят в виде аликвот объемом 200 мкл при -70 С.N-гидроксисукцинимид. Готовят раствор в концентрации до 11,5 мг/мл в дистиллированной воде и хранят в виде аликвот объемом 200 мкл при -70 С. 1 М этаноламин гидрохлорид-NaOH рН 8,5. Хранят в виде аликвот объемом 200 мкл при -70 С. Буферы. Прогонный буфер: HBS-EP (содержит 0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% поверхностно-активное соединение Р 20). Номер в каталоге: BR-1001-88, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Буфер хранят при 4 С. Буфер для иммобилизации: ацетат 5,0 (в виде 10 мМ ацетата натрия рН 5,0). Номер в каталоге: BR1003-51, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Буфер хранят при 4 С. Захват лиганда. Аффинно-чистый фрагмент F(ab')2 козьего человеческого антитела к IgG, специфический Fc фрагмент. Номер в каталоге фирмы Jackson ImmunoResearch Inc (Пенсильвания, США): 109-006-098. Реагент хранят при 4 С. Аналит. Рекомбинантный ИЛ-6 человека (фирма RD Systems Europe Ltd, Абингдон, Оксфорд. Номер в ка- 17018044 талоге 206-IL-050, номер лота А 131402 А) хранят при -70 С и оттаивают каждый раз для каждого анализа. Рекомбинантный ИЛ-6 макаки крабоеда и рекомбинантный ИЛ-6 макаки-резус получают кратковременной трансфекцией клеток СНО. Материал применяют в качестве не очищенного и не оцененного количественно супернатанта культуры клеток. Раствор для регенерации. 40 мМ HCl получают разведением в дистиллированной воде исходного 11,6 М раствора (фирмаIgG, специфический Fc фрагмент (фирма Jackson ImmunoResearch) иммобилизируют на сенсорном чипе СМ 5 через аминное связывание для захвата примерно 5000 единиц ответа. Буфер HBS-EP (10 мМHEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% Surfactant P20, BIAcore AB) применяют в качестве прогонного буфера со скоростью тока 10 мкл/мин. Инъекцию 10 мкл CA030240.g1 в концентрации 4 мкг/мл применяют для захвата иммобилизованным человеческим антителом к IgG-Fc. ИЛ-6 человека титруют над захваченным антителом CA030240.g1 в различных концентрациях при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхность создают инъекцией 10 мкл 40 мМ HCl, затем инъекцией 5 мкл 5 мМ NaOH при скорости потока 10 мкл/мин. Фоновые кривые связывания субстрата анализируют, используя программное обеспечение BIAevaluation (версия 3.2) с последующими стандартными процедурами. Кинетические параметры определяют по установленному алгоритму. В настоящем исследовании применяют одну партию антитела CA030240.g1. Сродство измеряют при концентрациях ИЛ-6 человека 20 нМ или ниже. Величину сродства определяют для CA030240.g1 в диапазоне 9,02-10,50 пМ при среднем значениисреднеквадратичное отклонение 9,760,74 пМ (табл. 1.1). Нельзя измерить сродство с ИЛ-6 человека, иммобилизованном на чипе BIAcore, поскольку иммобилизация ИЛ-6 приводит к потере нативной конформации. Поскольку нельзя подсчитать ИЛ-6 макаки крабоеда или макаки-резус, соответственно нельзя определить истинные кинетические параметры их взаимодействия с CA03000240.g1. Однако визуальный анализ сенсорограмм связывания показывает, что CA03000240.g1 связывает эти формы ИЛ-6 приматов примерно с таким же сродством, что и ИЛ-6 человека. Таблица 1.1 Сродство CA030 240.g1 с ИЛ-6 человека Пример 5. Исследования нейтрализации in vitro. Эффективность антитела СА 030 00240.g1, далее сокращенного обозначаемого "240.g1", определяют двумя разными методами. В первом методе используют ИЛ-6-зависимую линию клеток мыши, обозначаемую Т 1165, которая пролиферирует в ответ на ИЛ-6 мыши, макаки-резус, макаки крабоеда и человека. Такую прямую передачу сигнала ИЛ-6 рецептору ИЛ-6 на поверхности клетки в сцеплении с субъединицей сигнального рецептора, обозначаемой gp130, называют цис-сигнализацией. Во втором методе используют эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ЭКПВЧ), которые стимулируют ИЛ-6 вместе с растворимым ИЛ-6-рецептором со считыванием выработки хемоаттрактантного белка моноцитов(monocyte chemoattractant protein-1- МСР-1). В этом методе ИЛ-6 также вносят экзогенно или могут получить стимулированием ЭКПВЧ цитокинным интерлецкином-17 (ИЛ-17). Эти два варианта исследования называют транс-сигнализацией, поскольку ЭКПВЧ не экспрессируют ИЛ-6 Р и могут только отвечать, т.е. вырабатывать МСР-1, если и ИЛ-6, и ИЛ-6 Р вносят экзогенно. С помощью этих разных исследований можно получить величины ДН 50 (доза нейтрализации 50%) для 240.g1 против ИЛ-6 человека (рекомбинантного и природного), макаки-резус, макаки крабоеда и мыши. Материалы. Культуральная среда. Культуральная среда для клеток Т 1165 - RPMI1640, обогащенная 10% фетальной сыворотки теленка, пенициллином (100 Ед/мл), стрептомицином (50 мкг/мл), глутамином (2 мМ) и 10 нг/мл рекомбинантного ИЛ-6 человека, фирма RD systems, Великобритания. Культуральная среда для клеток ЭКПВЧ - минимальная среда большого объема для эндотелиаль- 18018044 ных клеток (LVECBM) фирмы TCS Cellworks, Великобритания, добавка для роста большого объема эндотелиальных клеток фирмы TCS Cellworks, Великобритания, и добавка антибиотиков фирмы TCS Cellworks, Великобритания. Антитело СА 030 00240.g1 получают самостоятельно в концентрации 6,83 мг/мл в ФСБ. ИЛ-6 человека фирмы RD systems, Великобритания, человека-млекопитающего - производный ИЛ-6 (получают самостоятельно из клеток СНО после трансфекции ИЛ-6 человека 10017108/67), ИЛ-6 макаки-резус (получают самостоятельно из клеток СНО после трансфекции ИЛ-6 макаки-резус 10017108/67), ИЛ-6 макаки крабоеда (получают самостоятельно из клеток СНО после трансфекции ИЛ-6 макаки крабоеда 10017108/67), ИЛ-6 мыши получают от фирмы RD systems, Великобритания. Человеческое антитело к МСР-1 захваченное антитело (555055) и рекомбинантный белок МСР-1 человека(890225), фирмы BD Biosciences, Калифорния. Стрептавидин-HRP (AMDEX) фирмы Amersham bioscience, Великобритания. Тромбин фирмы Merck Biosciences, Дармштадт, Германия. Растворимый ИЛ-6 Р фирмы RD systems, Великобритания. ИЛ-17 человека фирмы RD systems, Великобритания. Исследование клеток Т 1165 - планшет CellTiter 96 фирмы AQueous Promega, Калифорния. ТМ Blue (фирма Serologicals, Джорджия). Измерение активности антитела 240.g1 с применением ИЛ-6-зависимой пролиферации клеток Т 1165. Клетки Т 1165 оттаивают за 4 суток перед применением и культивируют в среде RPMI1640, обогащенной 10% ФСТ, антибиотиками, глутамином и 10 нг/мл ИЛ-6 человека. Жизнеспособность клеток подвергают мониторингу с применением вытеснения трипана синего и используют только клетки, жизнеспособные по меньшей мере на 90%. Перед применением клетки дважды промывают в средеRPMI1640 без ИЛ-6 человека. Затем клетки подсчитывают и распределяют в планшеты с 96 лунками с плоским дном в количестве 510 клеток на лунку. В отдельных планшетах серийные разведения 240.g1 инкубируют в присутствии рекомбинантного ИЛ-6 человека, или человека-млекопитающего ИЛ-6 (также называемого ИЛ-6 СНО человека), или ИЛ-6 макаки-резус, или ИЛ-6 макаки крабоеда в фиксированной концентрации 1 нг/мл (0,038 нМ). Предварительно смешанный комплекс 240.g1 и ИЛ-6 затем переносят в лунки, содержащие клетки Т 1165, которые инкубируют в течение 48 ч при 37 С во влажной атмосфере с 5% СО 2. Во время последних шести часов инкубации вносят 20 мл продукта CellTiter 96 AQueous для определения количества пролифелирующих клеток. Подавление ИЛ-6-зависимой пролиферации в клетках Т 1165, вызванное 240.g1, выражают в виде процента подавления в лунках, обработанных только ИЛ 6, за вычетом показателей контрольных лунок, которые содержат клетки, но не содержат ИЛ-6. Активность антитела 240.g1 против рекомбинантного ИЛ-6 человека, производного человекамлекопитающего ИЛ-6, ИЛ-6 макаки-резус, ИЛ-6 макаки крабоеда и ИЛ-6 мыши индуцирует пролиферацию клеток линии Т 1165 (см. фиг. 3 а). Антитело 240.g1 мощно ингибирует активность рекомбинантного ИЛ-6 человека, производного человека-млекопитающего ИЛ-6, ИЛ-6 макаки-резус, ИЛ-6 макаки крабоеда, но не активность ИЛ-6 мыши. Величина ДН 50 для рекомбинантного ИЛ-6 человека составляет 1,10,5 нг/мл (7,263,3 пМ). Величина ДН 50 для производного человека-млекопитающего ИЛ-6, составляет 3,62,4 нг/мл (23,7615,84 пМ). Величина ДН 50 для ИЛ-6 макаки-резуса составляет 2,21,1 нг/мл (14,527,26 пМ). Величина ДН 50 для ИЛ-6 макаки крабоеда составляет 5,41,1 нг/мл (35,647,26 пМ). Измерение активности 2401.g1 с применением ИЛ-6 и растворимого ИЛ-6 рецептора, индуцированной выработкой МСР-1 в клетках ЭКПВЧ. ЭКПВЧ (фирма TCS Cellworks, Великобритания) выращивают в минимальной среде большого объема для эндотелиальных клеток (LVECBM) и пассируют в культуре не более пяти раз. Клетки выращивают до 75% слияния и затем используют. Клетки разъединяют, используя трипсин/EDTA, ресуспендируют и однократно отмывают в свежей среде LVECBM. Затем клетки подсчитывают и помещают в 96 луночные с плоским дном планшеты в количестве 2104/клеток на лунку. Затем клетки культивируют в течение ночи при 37 С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО 2. На следующий день клетки отмывают в свежей среде с добавлением биотинилированного тромбина (3 Ед/мл) и на время откладывают. В отдельных планшетах серийные разведения 240.g1 инкубируют вместе с рекомбинантным ИЛ-6 человека(50 нг/мл, 3,84 нМ) и рИЛ-6 Р в фиксированной концентрации 500 нг/мл (10,15 нМ). Кроме того, 240.g1 также инкубируют с рекомбинантным ИЛ-17 человека (25 нг/мл, 1,18 нМ), который стимулирует у ЭКПВЧ выработку ИЛ-6, и рИЛ-6 Р в фиксированной концентрации 500 нг/мл (10,15 нМ). Предварительно перемешанный комплекс 240.g1 и ИЛ-6/рИЛ-6 Р или ИЛ-17/рИЛ-6-Р затем переносят в лунки, содержащие ЭКПВЧ, которые инкубируют в течение 24 ч при 37 С во влажной атмосфере с 5% СО 2. После периода инкубации клеточный супернатант собирают и определяют уровни МСР-1 человека методомELISA-сэндвич (протокол приводят ниже). Ингибирование за счет 240.g1 выработки МСР-1, индуцированной ИЛ-6/рИЛ-6 Р или ИЛ-17/рИЛ-6 Р, выражают в виде процента подавления лунок, обработанных ИЛ-6/рИЛ-6 Р или ИЛ-17/рИЛ-6 Р, минус контрольные лунки, содержащие клетки, но без стимуляции. Кроме того, контроли вносят для выявления ответа клеток на добавление ИЛ-6 человека в отсутствии рИЛ-6 Р.- 19018044 Иммуноферментный анализ МСР-1 методом ELISA. Планшеты Nunc Maxisorp покрывают анти-МСР-1 захватывающим антителом в концентрации 2 мкг/мл. Планшеты инкубируют при +4 С в течение ночи, затем дважды отмывают в ФСБ плюс 0,1% твин-20 (в промывочном буфере). Планшеты блокируют в течение 1 ч в ФСБ плюс 5% бычьего сывороточного альбумина. Затем планшеты 4 раза промывают промывочным буфером и вносят стандарты и образцы. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывают и биотинилируют анти-МСР-1 антителом, добавленным в концентрации 1 мг/мл. Планшеты инкубируют еще 2 ч и затем 4 раза промывают. Затем добавляют разведение стрептавидина-HRP 1:5000 и планшеты инкубируют 30 мин. Планшеты промывают последний раз 4 раза и вносят субстрат ТМВ. Колориметрические считывания производят при 630 нм, а фоновые считывания - при 492 нм. Концентрации МСР-1 определяют по стандартной кривой, используя логистическую кривую, основанную на четырех параметрах, с применением компьютерной программы Genesis II. Активность 240.g1 в ЭКПВЧ против транс-сигнализации, индуцированной рекомбинантным ИЛ-6 человека и рИЛ-6 Р, см. на фиг. 3 б. Антитело 240.g1 мощно ингибирует выработку клетками ЭКПВЧ выработку МСР-1, индуцированную рекомбинантным ИЛ-6 и рИЛ-6 Р. Величина ДН 50 составляет 6462 нг/мл (422409 пМ). Активность 240.g1 в ЭКПВЧ против транс-сигнализации, индуцированной эндогенным ИЛ-6 и рИЛ-6 Р, см. на фиг. 3 в. Антитело 240.g1 мощно ингибирует ИЛ-17-индуцированную выработку эндогенного ИЛ-6 и рИЛ-6-индуцированную выработку МСР-1 клетками ЭКПВЧ. Величина ДН 50 составляет 9370 нг/мл (614462 пМ). Заключение. Антитело 240.g1 способно нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного ИЛ-6 человека, человека-млекопитающего производный ИЛ-6, ИЛ-6 макаки-резус и макаки крабоеда, но не ИЛ-6 мыши в исследовании ИЛ-6 цис-сигнального пути. Кроме того, антитело 240.g1 может нейтрализовать ИЛ-6 транс-сигнализацию, индуцированную либо рекомбинантным, либо эндогенным ИЛ-6. Пример 6. Действие in vivo. Известно, что ИЛ-6 индуцирует белки острой фазы. У мышей наиболее известным белком острой фазы является амилоид сыворотки A (serum amyloid A - SAA). ИЛ-6 может действовать на рецептор мыши, поэтому можно ввести инъекцией ИЛ-6 человека в организм мыши и измерить выработку SAA в сыворотке. Мышам линии Balb/c вводят подкожно сайт-3-специфичное анти-чИЛ-6 антитело, CA030240.g1 целого IgG4. Через 24 ч мышам вводят внутрибрюшинно чИЛ-6 в дозе 30 мкг/кг (номер в каталоге фирмы Peprotech: 200-06, номер лота: 0203 В 16). Через 20 ч берут кровь пункцией в сердце и получают сыворотку для оценки сывороточного амилоида A (SAA) методом ELISA (номер лота фирмы Tridelta: 22KT022). На фиг. 4 показано, что индукция SAA, вызываемая чИЛ-6, подавляется CA030240.g1 со статистически существенным снижением SAA, установлена в дозах 0,3, 0,1 и 0,03 мг/кг.n=7-8 на группу, для ФСБ n=6. Статистический анализ методом ANOVA с повторной проверкой Бонферрони,Р 0,01 по сравнению с одним только ИЛ-6. Два последующих эксперимента подтверждают существенное подавление ИЛ-6 (в дозе 30 мкг/кг)индуцированного SAA за счет CA030240.g1 в дозах 0,3 и 0,1 мг/кг. Пример 7. Картирование эпитопа СА 030 00240.g1. Эпитоп ИЛ-6 человека, который распознает антитело CA03000240.g1, картируют, используя методику ЯМР с применением 240.g1 в качестве фрагмента Fab'. Для этого необходимо, чтобы ИЛ-6 человека экспрессировался в Е. coli и был равномерно помечен стабильными изотопами 15N/13 С/2 Н. Специфические по полной последовательности сквозные резонансные распределения получают для свободного ИЛ 6 и изменения в положении этих сигналов, индуцированных связыванием фрагмента Fab' антителаCA03000240.g1, выявляют, используя спектр 3D TROSY HNCO. Экспрессия и очистка рекомбинантного ИЛ-6 человека. ИЛ-6 человека приготовляют с помощью экспрессирующего вектора (pET3d) E. coli, содержащего кодирующую последовательность зрелой формы белка. Белок экспрессируют в клетках Tuner (DE3)pLysS, что приводит к высокому выходу нерастворимого продукта. 15N,15N/13 С и 15N/13 С/2 Н меченые образцы ИЛ-6 приготовляют из клеток, выращенных на соответствующим образом меченой обогащенной среде (фирма Celtone). ИЛ-6 очищают от трансформированных клеток Е. coli, используя хорошо отработанные методы. Сначала клетки собирают из 1 л культуральной среды и затем ресуспендируют в 40 мл буфера А [100 мМKCl, 2 мМ DTT, 10 мМ Tris-HCl рН 8,5, 25 мас.% сахарозы, таблетка растворимого ингибитора протеазы(фирма Boehringer)]. Добавляют 10 мл буфера В (300 мМ Tris-HCl рН 8,5, 100 мМ EDTA, 4 мг/мл лизоцима) и суспензию инкубируют на льду в течение 10-30 мин с периодическим перемешиванием. Затем добавляют 50 мл буфера С (1 М LiCl, 20 мМ EDTA, 0,5 об.% NP-40) и суспензию дважды пропускают через французский пресс при давлении 20000 фунтов на кв.дюйм. Затем гомогенат центрифугируют при 16000 g об/мин в течение 15 мин при 4 С и собирают осадок. Осадок повторно суспендируют в 40 мл- 20018044 буфера D [10 мМ Tris-HCl рН 8,5, 0,1 мМ EDTA, 0,5 М LiCl, 0,5 об.% NP-40, 1 мМ DTT, таблетка растворимой протеазы], пропускают через французский пресс и центрифугируют (см. выше). Эту стадию повторяют. Осадок затем ресуспендируют в 40 мл буфера Д [10 мМ Tris-HCl pH 8,5, 0,1 мМ EDTA, 0,5 об.% NP-40, 1 мМ DTT, таблетка растворимой протеазы] и пропускают через французский пресс, после чего центрифугируют согласно описанной ранее методике. Эту стадию повторяют. В итоге осадок растворяют в 6 мл 6 М GuHCl, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0 и осветляют центрифугированием при 48000 g в течение 30 мин при 4 С. Супернатант сохраняют и спектрофотометрически количественно определяют растворимый ИЛ-6. Растворимый ИЛ-6 разводят до концентрации 2,5 мг/мл в 5 М GuHCl, 50 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl,2 мМ GSH, 0,2 мМ GSSG, 1 мМ EDTA, рН 8,0 и инкубируют при 25 С в течение 1 ч. Затем образец дополнительно разводят по каплям до 250 мкг/мл в 50 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 2 мМ GSH, 0,2 мМ GSSG,1 мМ EDTA, pH 8,0 и инкубируют при 25 С в течение 3 ч. Какой-либо осадок, образованный на этой стадии, удаляют центрифугированием при 30000 g в течение 30 мин при 4 С. Просветленный материал диализируют против 50 мМ Tris-HCl, 10 об.% глицерина, рН 9,0 в течение не менее 16 ч при 4 С, при этот два раза меняют буфер. После диализа раствор просветляют центрифугированием при 30000 g в течение 30 мин при 4 С. Супернатант сохраняют и загружают в ионообменную колонку monoQ (фирма Amersham Biosciences) объемом 8 мл и элюируют линейным градиентом хлорида натрия (0-1,0 М). Фракции,содержащие ИЛ-6 повторного сворачивания, идентифицируют с помощью SDS-PAGE, затем объединяют и переводят в 25 мМ фосфате натрия, 100 мМ NaCl, 0,01 мас.% NaN3, pH 6,5. Фрагмент Fab' антитела CA03000240.g1 получают, очищают и перерабатывают в 25 мМ фосфате натрия, 100 мМ NaCl, 0,01 мас.% NaN3, pH 6,5. Комплексы в соотношении 1:1 между ИЛ-6 и фрагментомFab' антитела CA03000240.g1 получают с помощью ЯМР путем смешивания эквимолярных количеств белков в концентрации примерно 0,2-0,6 мМ. ЯМР-спектроскопия. ЯМР исследования проводят на образцах белков и комплексов, объемом 0,35 мл, в буфере, включающем 25 мМ фосфате натрия, 100 мМ хлорида натрия и 0,01 мас.% азида натрия, рН 6,5 (95% Н 2 О и 5% D2O). Комплекс 1:1 между 15N/13 С/2 Н меченым ИЛ-6 и немеченым фрагментом Fab' CA03000240.g1 получают для ЯМР анализа смешиванием эквимолярных количеств белков для достижения итоговой концентрации 0,1 мМ. Данные ЯМР получают при 25 С для свободного ИЛ-6 и для комплекса ИЛ 6:фрагмент Fab' антитела CA03000240.g1 на спектрометре 800 МГц Bruker Avance, оснащенном тройным резонансным (15N/13 С/2 Н) криозондом. Стандартные спектры HNCACB, CBCA(CO)NH и HNCOS., Bax A., J. Magn. Reson 96(2), 1992, с 432) применяют для получения специфических по полной последовательности сквозных резонансных распределений ( N, С и Н) для свободного ИЛ-6, используя 0,9 мМ равномерно N/С меченый образец. Изменения в положениях сквозных сигналов ИЛ-6, индуцированные связыванием фрагмента Fab' антитела CA03000240.g1, выявляют, используя спектр 3D TROSY-HNCO (Salzmann M. и др., Proc NatlAcad Sci USA, 95(23), 1998, cc. 13585-13590). Обычные параметры захвата для всех экспериментов 3D ЯМР представлены в табл. 1. Все спектры преобразуют, используя устройство NMRPipe (Delaglio F. и др., J. Biomol. NMR 6(3),1995, cc. 277-293), с линейным предсказанием, применяемым для продления эффективного времени исследования в N размерности данных 3D примерно до 30 мс. Умеренное повышение разрешающей способности применяют для всех размерностей, используя функцию смещенного синуса в квадрате. Анализ спектров выполняют, используя Sparky (Goddard Т.D., Kneller D. в кн. "G. SPARKY 3", Калифорнийский университет, Сан-Франциско). Анализ данных по Fab-связыванию. Методику минимального сдвига (Farmer В.Т. и др., Nat. Struct. Mol. Biol. 3(12), 1996, с. 995, MuskettF.W. и др., J. Biol. Chem. 273(34), 1998, cc. 21736-21743) применяют для определения изменений в положениях ЯМР сигналов ИЛ-6, возникающих в результате связывания фрагмента Fab' антителаCA03000240.g1. Изначально все пики в спектре 3D HNCO свободного ИЛ-6 и спектр 3D TROSY'HNCO ИЛ-6, связанного с gl32E09 Fab, фиксируют по центру. Величины химического сдвига 15N и 1 Н сквозных резонансов корректируют с учетом разницы температуры между спектрами комплекса и свободного белка (-0,8 промиль для 15N и -0,05 промиль для Н)(Baxter N.J., Williamson M.P., J. Biomol. NMR 9(4), 1997, cc. 359-369). Минимальное изменение в положении пиков между свободным и Fab-связанным ИЛ-6 получают, используя программное обеспечение Microsoft Excel для подсчета различия в объединенном химическом сдвиге в 15N, 13 С и 1 Н для каждого заданного пика в спектре HNCO в свободном белке по сравнению со всеми наблюдаемыми пиками в спектре TROSY-HNCO комплекса Fab. Общие различия химических сдвигов протонов, азота и углеродаопределяют по уравнению (уравнение 1), в котором HN, N и C соответствуют различиям в 1 Н, 15N и 13 С сдвигах между парами сравниваемых пиков HNCO и N и C являются коэффициентами масштаби- 21018044 рования 0,2 и 0,33, необходимыми для расчета различий в диапазоне химических сдвигов амидного протона, амидного азота и углерода. Для каждого отдельного пика HNCO минимальный сдвиг, индуцированный связыванием Fab, рассматривают в качестве наименьшей возможной величины комбинированного сдвига . Для идентификации Fab-связывающих сайтов (эпитопов) в ИЛ-6 гистограмму комбинированного минимального сдвига против белковой последовательности применяют для выявления областей ИЛ-6,содержащих существенным образом возмущенные сигналы. Если размер изменения комбинированного химического сдвига для отдельных аминокислот превышает пороговое значение среднего изменения объединенного химического сдвига для всех аминокислот плюс одно стандартное отклонение от среднего значения, эти остатки выбирают для дальнейшей оценки в качестве предполагаемых контактирующих остатков в Fab-связывающем сайте. Расположение изучаемых остатков в сайте связывания в итоге исследуют на структуре ИЛ-6 высокого разрешения (Xu G.Y. и др., J. Mol. Biol. 268(2), 1997, cc. 468-481) и только остатки, расположенные на поверхности белка, согласно оценке способны связывать Fab. Применяют два разных порога для идентификации остатков, связанных Fab, средний минимальный сдвиг +1 среднеквадратичное отклонение (0,143) средний минимальный сдвиг +2 среднеквадратичных отклонения (0,213). Установлено, что связывающий сайт антитела окружает сигнатурный остаток Trp157 критического сайта 3 (Boulanger и др., Science, 300, 2003, cc. 2101-2104). Используя нумерацию аминокислот Boulanger и др. (см. выше), установлено, что антитело 240g.1 связывает, по меньшей мере, следующие остатки (среднее + 2 среднеквадратичных отклонения (0,213: S47, С 50, Е 93, R104, F105, Е 106,Т 149, K150, А 153, Q156, Q159 и S169. Антитело может связывать все из следующих остатков (среднее + 1 среднеквадратичное отклонение (0,143: С 44, S47, С 50, S53, А 58, Е 93, V96, R104, F105, Е 106, Т 149,K150, Q152, А 153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Т 163, L165, S169 и Е 172. Следует учесть, что те же остатки также могут быть пронумерованы, основываясь на нумерации аминокислот непроцессированного предшественника ИЛ-6 (Swiss Prot инвентарный номер Р 05231). Используя данную нумерацию, антитело 240g.1 связывает, по меньшей мере, следующие остатки: S75, С 78,Е 121, R132, F133, Е 134, Т 177, K178, А 181, Q182, Q187 и S197. Антитело может связывать все из следующих остатков: С 72, S75, С 78, S81, А 86, Е 121, V124, R132, F133, Е 134, Т 177, K178, Q180, А 181, Q182,N183, Q184, W185, Q187, Т 191, L193,S197 и E200. Таблица 1 Основные параметры экспериментов методом ЯМР Прямое 1 Н измерение (F3 или F2) достигают при ширине полосы качания 14 промилей и времени захвата 85 мс. Следует учитывать, что настоящее изобретение описано только с помощью приведенных примеров,но они не ограничивают настоящее изобретение, и также могут быть осуществлены все модификации настоящего изобретения в рамках охвата формулы настоящего изобретения. Предпочтительными свойствами каждого варианта осуществления настоящего изобретения являются такими же для всех других вариантов осуществления настоящего изобретения с соответствующими изменениями. Все публикации,включая патенты и патентные заявки, но, не ограничиваясь ими, приводятся в настоящем описании в виде ссылок на их сущность.