Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков

СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ ИЛИ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ПТИЦ И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ АНТИТЕЛ И БЕЛКОВ Изобретение в целом относится к области продуцирования рекомбинантных белков. Более конкретно, изобретение относится к применению линий эмбриональных стволовых клеток птиц,названных EBx, для продуцирования белков и, более конкретно, гликопротеинов, таких как антитела. Изобретение полезно для продуцирования подтипа моноклонального антитела IgG1,обладающего высокой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью. Изобретение относится к применению таких антител в качестве лекарства для лечения раков и воспалительных заболеваний. Изобретение в целом относится к области продуцирования рекомбинантных белков. Более конкретно, изобретение относится к применению линий эмбриональных стволовых клеток птиц, названныхEBx, для продуцирования белков и, более конкретно, гликопротеинов, таких как антитела. Изобретение полезно для продуцирования подтипа моноклонального антитела IgG1, обладающего высокой клеточноопосредованной цитотоксической активностью. Изобретение относится к применению таких антител в качестве лекарства для лечения раков и воспалительных заболеваний. Гликопротеины опосредуют многие незаменимые функции у людей, включая катализ, передачу сигнала, межклеточное сообщение и молекулярное распознавание и связывание. Многие гликопротеины применены в терапевтических целях. Олигосахаридный компонент белка может влиять на свойства, релевантные для эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к протеазной атаке, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетику и специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от специфичных структур олигосахаридов. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока посредством взаимодействий со специфичными белками, связывающими углеводы, тогда как другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-81 (1996. Примеры гликопротеинов включают эритропоэтин (EPO), активатор тканевого плазминогена (TpA), интерферон бета(IFN-), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), человеческий хорионический гонадотропин (hCG) и терапевтические моноклональные антитела (Mab). Большинство антител содержит углеводные структуры при консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, где каждый изотип обладает отдельным расположением N-сшитых углеводных структур, которые по-разному влияют на сборку, секрецию или функциональную активность белка (WrightMorrison (1997). Trends Biotech. 15:26-32). Биологическая активность некоторых G иммуноглобулинов зависит от присутствия и от типа гликановой структуры на молекуле и, в частности, на ее Fc-компоненте. Продемонстрировано влияние присутствия или отсутствия гликансодержащих остатков на способность антитела к взаимодействию с эффекторными молекулами (Fc-рецепторами и комплементом). Ингибирование гликозилирования человеческого IgG1 путем культивирования в присутствии туникамицина вызывает, например, 50-кратное снижение сродства этого антитела к рецептору FcRI,присутствующему на моноцитах и макрофагах (Leatherbarrow et al. (1985), Molec. Immun., 22:407-415). На связывание с рецептором FcRIII также влияет потеря углеводов на IgG, поскольку описано, что негликозилированный IgG3 не способен к индукции лизиса типа АЗКЦ (антителозависимой клеточной цитотоксичности) посредством рецептора FcRIII клеток NK (Lund et al. (1990), Molec. Immun. 27:11451153). Однако, кроме необходимого присутствия этих гликансодержащих остатков, точнее, необходима гетерогенность их структуры, которая может приводить в результате к различиям в способности к инициации эффекторных функций. Молекулы IgG всех человеческих и мышиных подклассов имеют N-олигосахарид, присоединенный к СН 2 домену каждой тяжелой цепи (при остатке Asn 297 для человеческих IgG). Общая структураN-сшитого олигосахарида на IgG является структурой комплексного типа, характеризующейся маннозил-хитобиозной сердцевиной (Man3-GlcNac2-Asn) с делением или без деления пополамGlcNac/L-фукозой (Fuc), и другими вариантами цепи, включающими присутствие или отсутствие галактозы (Gal) и сиаловой кислоты (см. фиг. 17). Кроме того, олигосахариды могут содержать ноль (G0),один (G1) или два (G2) Gal (см. фиг. 17). Структура присоединенного N-сшитого углевода может значительно варьировать в зависимости от степени процессинга и может включать комплексные олигосахариды с высоким содержанием маннозы, как многократно разветвленные, так и двухантенные. Типично существует гетерогенный процессинг сердцевинных олигосахаридных структур, присоединенных при конкретном сайте гликозилирования, так что даже моноклональные антитела существуют в виде множественных гликоформ. Наблюдали профили галактозилирования, которые являются вариабельными в зависимости от индивидуума (человеческие сывороточные IgG1). Эти различия, вероятно, отражают различия в активности галактозилтрансфераз и других ферментов между клеточными клонами этих индивидуумов (Jefferis et al. (1990), Biochem J. 268:529-537). Подобным образом, показано, что основные различия в гликозилировании антител встречаются между клеточными линиями, и даже минорные различия наблюдают для данной клеточной линии, выращенной в различных условиях культивирования, включая состав культуральной среды, плотность клеток, рН, обогащение кислородом (Lifely et al. (1995), Glycobiology. 5 (8):813-22; Kumpel et al. (1994), Hum. Antibodies and hybridomas. 5:143-151). Проведены исследования, чтобы изучить функцию олигосахаридного остатка при биологических активностях антитела. Boyd et al. (1995), Mol. Immunol. 32:1311-1318) показали, что сиаловая кислота IgG не обладает эффектом на АЗКЦ. В нескольких сообщениях показано, что остатки Gal усиливают АЗКЦ(Kumpel et al. (1994), Hum. Antib. Hybrid. 5:143-151; Kumpel et al. (1995), Hum. Antib. Hybrid. 6:82-88). Делящий пополам GlcNac, который представляет собой остаток бета-1,4-GlcNac, перенесенный на сердцевинный остаток бета-маннозы (Man), включенный в биологический остаток терапевтических антител явил эффект фукозилированного олигосахарида на эффекторные функции антитела; Fuc-недостаточныйIgG1 показал увеличенное в 50 раз связывание с FcRIII и усиленную АЗКЦ. В настоящее время широкий ряд рекомбинантных белков для терапевтических применений (т.е. рака, воспалительных заболеваний и т.п.) состоит из гликозилированных моноклональных антител. По терапевтическим и экономическим причинам существует большой интерес в получении высокоспецифичной активности антител. Одним из путей к получению большого прироста эффективностей при сохранении простого способа продуцирования в клеточной линии и потенциального избегания значительных нежелательных побочных эффектов является усиление естественных, клеточно-опосредованных эффекторных функций Mab. Следовательно, конструирование олигосахаридов IgG может привести в результате к оптимизированной АЗКЦ, которую рассматривают как основную функцию некоторых терапевтических антител, хотя антитела обладают множественными терапевтическими функциями (например, связывание антигена, индукция апоптоза и комплементзависимая клеточная цитотоксичность (КЗКЦ. Фирма,подобнаяN-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTIII), которая катализирует добавление делящего пополам остатка GlcNac к N-сшитому олигосахариду, в линии клеток яичника китайского хомячка (CHO) и показала более высокую АЗКЦ продуцируемого антитела IgG1 (WO 99/54342; WO 03/011878;WO 2005/044859). В результате удаления или вытеснения фукозы из участка Fc-антитело KYOWAHAKKO KOGYO (Токио, Япония) обладает усиленным связыванием Fc и улучшенной АЗКЦ, и, следовательно, эффективностью Mab (US 6946292). Более недавно в Laboratoire Franais du Fractionnement et desBiotechnologies (LFB) (Франция) показали, что отношение Fuc/Gal в олигосахариде Mab должно быть равно или ниже чем 0,6, чтобы получить антитела с высокой АЗКЦ (FR 2861080). Однако все еще остается необходимость в обладании альтернативными способами продуцирования человеческих моноклональных антител в клетке, пригодными для широкомасштабного продуцирования,которые не были схематически разработаны, для экспрессии или для ингибирования соответствующей гликозилтрансферазы, а также такими, которые обеспечивают постоянное гликозилирование человеческого типа с усиленными клеточно-опосредованными эффекторными функциями. Это составляет цель настоящего изобретения. В настоящее время авторы изобретения продемонстрировали, что неожиданно моноклональное антитело, экспрессируемое в линии эмбриональных стволовых клеток птиц EBx, проявляет паттерн гликозилирования, подобный человеческому. Авторами изобретения также сделано открытие, что большая доля популяции антител IgG1, продуцируемых в клетках EBx, имеет общую структуру N-сшитого олигосахарида двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, которые являются в высокой степени галактозилированным. Примерно половина популяции антител IgG1 содержит структуру N-сшитого олигосахарида двухантенного типа, которая не является фукозилированной и которая придает сильную активность АЗКЦ антителам. В настоящем изобретении предложены эмбриональные стволовые клетки птиц EBx, предпочтительно эмбриональные стволовые клетки кур или уток EBx, и более предпочтительно клетки ЕВ 14 кур или клетки ЕВ 24 и ЕВ 66 уток, сконструированные генноинженерным способом для экспрессии белков рекомбинантным путем, и более конкретно антител, фрагментов антител или гибридных белков, которые включают фрагменты антител с повышенной активностью АЗКЦ. Линии эмбриональных стволовых клеток птиц EBx представляют собой клеточные линии, разработанные фирмой ВИВАЛИС (VIVALIS) (Нант, Франция), которая воспользовалась преимуществом ее практического опыта и профессиональных знаний в биологии птиц и в эмбриональных стволовых клетках (ЭС) птиц, чтобы предпринять разработку новых стабильных линий клеток птиц, которые удовлетворяют промышленным и законодательным спецификациям. Используя собственный способ (см.WO 03/076601), автор изобретения создал серию хорошо охарактеризованных и документированных клеточных линий (т.е. "клетки EBx") без стадий генетической, химической или вирусной иммортализации. В предпочтительном воплощении клетки птиц по настоящему изобретению представляют собой клетки кур или уток. Клетки EBx получены, используя полностью документированный 2-стадийный способ, и учитывая все законодательные требования (например, регулярный мониторинг санитарного состояния стад кур и уток, использование сыворотки из стран, свободных от губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, использование проназы вместо трипсина, доступность сертификатов происхождения для всех компонентов, включенных в процесс). Стадия 1. Культивирование и размножение in vitro ЭС клеток кур или уток. Эмбриональные стволовые клетки уникальны в том, что они (i) могут самостоятельно обновлятьсяin vitro бесконечно долго в виде недифференцированных клеток; (ii) обладают неограниченной регенеративной способностью; (iii) сохраняют стабильный хромосомный состав; (iv) экспрессируют высокие уровни теломеразы и специфичных маркеров клеточной поверхности. Несмотря на множество усилий во всем мире, ЭС клетки успешно выделены только из очень ограниченного числа видов (мыши, человека,обезьян). Автор изобретения направил значительные ресурсы, накопленные за последние годы, на выделение и получение стабильной линии ЭС клеток из различных видов птиц, в основном из кур и уток. Эти исследовательские усилия привели к успешному выделению и характеристике куриных ЭС клеток [Painet al. 1999. Cell Tissues Organs. 165: 212-219] и утиных ЭС клеток. Затем автор изобретения разработал собственные методики, которые дали возможность эффективного культивирования in vitro и широкомасштабного размножения куриных и утиных ЭС клеток без индукции дифференциации. Стадия 2. Извлечение клеток EBx. Затем автор изобретения предложил собственный способ извлечения стабильных, прикрепленных или суспензионных, непрерывных клеточных линий из ЭС клеток птиц. Этот способ включает прогрессивное исключение сыворотки, фидерных клеток и ростовых факторов из клеточной культуральной среды и адаптацию клеток к суспензионной культуре. Эти линии клеток птиц эмбрионального происхождения сохраняли большинство желаемых признаков ЭС клеток (т.е. неопределенно долгую пролиферацию,экспрессию ЭС-специфичных маркеров, таких как теломераза, стабильность кариотипа), но в дополнение проявляли новые промышленно благоприятные характеристики (рост в суспензии в средах, свободных от сыворотки, вплоть до высоких плотностей клеток). На основе их привлекательных биологических свойств авторы изобретения выбрали несколько линий куриных клеток EBx для дальнейшей разработки, таких как суспензионные линии куриных клеток ЕВ 14 (см. WO 03/076601 и WO 05/007840) или EBv13. Альтернативно авторы изобретения отобрали несколько линий утиных клеток EBx для дальнейшей разработки, таких как ЕВ 24, ЕВ 26, ЕВ 66. Клеточные линии EBx по изобретению являются "непрерывными", поскольку они обладают характеристиками культивирования in vitro в течение продолжительного периода времени. Преимущественно клетки по изобретению способны к пролиферации по меньшей мере 50 поколений, по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. 250 поколений не составляет предел времени, поскольку полученные клетки все еще живы, и их все еще можно пересевать для дополнительных пассажей. Без связи с теорией постулировано, что клетки по изобретению можно культивировать "непрерывно" настолько долго, насколько теломераза экспрессируется клетками. Действительно, принимают, что высокий уровень экспрессии теломеразы клетками птиц по изобретению ответственен за генетическую стабильность (т.е. птичьи клетки EBx по изобретению являются диплоидными) и непрерывный клеточный рост. Под "пассажем" подразумевают перенос или пересев клеток, с разведением или без разведения, из одного культурального сосуда в другой. Понятно, что в любое время клетки могут быть перенесены из одного сосуда в другой, некоторая часть клеток может быть потеряна, и, следовательно, может иметь место разведение клеток: либо преднамеренное, либо непреднамеренное. Этот термин является синонимом термину "субкультура". Число пассажей равно числу моментов, когда клетки в культуре, которые растут либо в суспензии, либо при прикреплении, субкультивируют или переносят в новый сосуд. Этот термин не является синонимом удвоения популяции или поколения, который представляет собой время,необходимое клеточной популяции для воспроизведения один раз; т.е. грубо говоря, время воспроизведения для каждой клетки в популяции. Например, утиные или куриные ЭС имеют время удвоения популяции (ВУП) примерно 40 ч. Клетки птиц EBx по изобретению имеют ВУП примерно менее чем 30 ч,обычно менее чем 24 ч и предпочтительно менее чем 20 ч. Для клеток EBx обычно проводят один пассаж через каждые 3 поколения. Под "диплоидом" подразумевают, что клетки по изобретению имеют две копии (2n) каждой хромосомы, обычно одну от материнской и одну от отцовской клетки. Тот факт, что линии клеток птиц EBx по изобретению являются непрерывными и диплоидными(т.е. генетически стабильными), составляет примечательный и уникальный признак, поскольку эти термины обычно являются антагонистами. Так, раковые клетки и/или иммортализованные клетки, полученные путем химической, физической (УФ-облучение, рентгеновское или гамма-облучение и т.п.) или генетической модификации (вирусная трансформация, гиперэкспрессия онкогенов и т.п.), представляют собой непрерывные клетки, поскольку они способны неопределенно долго реплицироваться в культуре,но они не являются генетически стабильными, поскольку они проявляют полиплоидные кариотипы. С другой стороны, первичные клетки, такие как эмбриональные фибробласты цыпленка, MRC5, WI38, которые представляют собой нетрансформированные клетки, не являются непрерывными, поскольку они имеют конечную продолжительность жизни после нескольких поколений, но они являются генетически стабильными (т.е. диплоидными) клетками. В настоящем изобретении термины "клеточная линия" и "клетки" следует использовать без отличия. Термин "птичий", "птица", "aves" или "ava", как используют здесь, подразумевают одинаковое значение, и их следует использовать без отличия. "Птицы" относятся к любому виду, подвиду или расе организма таксономического класса "ava". В предпочтительном воплощении "птицы" относятся к любому животному таксономического отряда."Пластинчатоклювые" (т.е. утка, гусь, лебедь и родственные виды). Отряд пластинчатоклювых содержит примерно 150 видов птиц в трех семействах: Anhimidae(шпорцевые гуси), Anseranatidae (полулапчатый гусь) и Anatidae, которое включает более 140 видов водоплавающих птиц, среди них уток, гусей и лебедей. Все виды в этом отряде в высокой степени адаптированы к существованию в водоемах на поверхности воды. Все они являются лапчатоногими для эффективного плавания (хотя некоторые впоследствии стали в основном наземными)."Куриные" (т.е. куры, перепела, индюк, фазан и родственные виды). Куриные представляют собой отряд птиц, содержащий кур, индюков, перепелов и фазанов. Примерно 256 видов находится по всему миру."Голубеобразные" (т.е. голубь и родственные виды). Отряд птиц Голубеобразные включает очень широко распространенных горлиц и голубей. В соответствии с предпочтительным воплощением птица по изобретению выбрана среди птиц, которые не содержат провирусных последовательностей вируса лейкоза птиц типа Е (ALV-E) и эндогенного птичьего вируса (EAV) в их геноме. Специалист в данной области техники способен определить, присутствуют ли последовательности ALV-E и EAV в геноме птицы (Johnson et Heneine, 2001, J. Virol. 75:3605-3612; Weissmahr et al., 1997, J. Virol. 71:3005-3012). Предпочтительно птица выбрана из группы,включающей пластинчатоклювых (т.е. утку, гуся, лебедя), индюков, перепелов, японских перепелов, цесарок, павлинов. Следовательно, клетки, выделенные из такой птицы, не продуцируют репликационнокомпетентные ALV-E и/или EAV частицы. В предпочтительном воплощении птица по настоящему изобретению выбрана среди группы, включающей уток, гусей, лебедей, индюков, перепелов и японских перепелов, цесарок и павлинов. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица представляет собой утку, более предпочтительно пекинскую или мускусную утку. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица представляет собой пекинскую утку. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных линий клеток уток, выделенных из эмбриональных стволовых клеток (ЭС), где указанные линии клеток уток не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы. Примерами линий клеток уток EBx по изобретению являются ЕВ 24, ЕВ 26, ЕВ 66 или их субклоны, такие как ЕВ 24-12. Согласно второму предпочтительному воплощению птица по изобретению выбрана среди птиц, которые не содержат в их геноме полноразмерных провирусных последовательностей ALV-E, но в конечном счете содержат провирусные последовательности EAV. Специалист в данной области техники способен определить, частичные или полноразмерные последовательности ALV-E и EAV присутствуют в геноме птицы (Johnson and Heneine, 2001). Путем скрещивания отобрано несколько линий кур, которые не содержат полноразмерных провирусных последовательностей ALV-E (т.е. линия ev-0) и, следовательно, не продуцируют инфекционных ретрочастиц ALV-E, таких как: линия 0 домашних кур из стада птицы Ист Лансинга Министерства сельского хозяйства США (линия ELL-0). Куры линии-0 Ист Лансинга не содержат никаких эндогенных вирусных локусов (ev), относящихся к ALV (Dunwiddie and Faras, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:5097-5101); линия 22 кур белый леггорн Чарльз-Ривер (SPAFAS); линии DE и РЕ 11 из Национального института агрономических исследований (Domaine deMagneraud, Сюржер, Франция). Таким образом, клетки, выделенные из птиц ev-0, не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных частиц ALV-E. Согласно предпочтительному воплощению птица представляет собой домашнюю курицу ev-0 (Gallus Gallus подвид domesticus), предпочтительно выбранную среди ELL-0, линии 22, DE и РЕ 11. Обычно куры ev-0 все же содержат провирусную последовательность EAV, но в такой степени, что инфекционные изоляты EAV не идентифицированы. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных линий клеток кур, выбранных из эмбриональных стволовых клеток (ЭС) линий кур ev-0, где указанные линии клеток кур ev-0 не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы. Согласно третьему воплощению птица по изобретению выбрана среди птиц, которые содержат полноразмерные и/или неполные провирусные последовательности ALV-E и EAV в их геноме, но которые не способны продуцировать репликационно-компетентные ретрочастицы ALV-E и EAV. Специалист в данной области техники способен определить, инфекционные и/или неинфекционные ретрочастицыALV-E и/или EAV продуцируются клетками птиц (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). Предпочтительно птица выбрана из группы, содержащей кур, свободных от особых патогенов (SPF),предпочтительно из линии Valo. Примером линии клеток кур EBx по изобретению является линия клеток EBv13. В настоящем изобретении под термином "эндогенная ретровирусная частица" или "эндогенная ретрочастица", термины, которые можно использовать без отличия, понимают ретровирусную частицу или ретровирус, кодируемый и/или экспрессируемый провирусными последовательностями ALV-E или EAV,присутствующими в некоторых геномах клеток птиц. Известно, что у птиц провирусные последовательности ALV-E присутствуют в геноме домашней курицы (за исключением кур линии-0), банкивскойEAV присутствуют у всех родов gallus, которые включают домашнюю курицу, курицу линии-0, банкивскую джунглевую курицу, зеленую джунглевую курицу, серую джунглевую курицу, цейлонскую джунглевую курицу и родственные виды (см. Resnick et al., 1990, J. Virol., 64:4640-4653). Под "репликационно-компетентным" подразумевают, что эндогенные ретровирусные частицы являются инфекционными, т.е. что такие ретровирусные частицы способны инфицировать клетки птиц по изобретению и реплицироваться в них. Способ основания непрерывных диплоидных линий клеток птиц, названных EBx, по изобретению включает две стадии:(а) выделение, культивирование и размножение эмбриональных стволовых (ЭС) клеток из птиц, которые не содержат полноразмерных эндогенных провирусных последовательностей или их фрагмента,склонного к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц, более конкретно провирусных последовательностей EAV и/или ALV-Е или их фрагмента, в полной культуральной среде, содержащей все факторы, дающие возможность их роста, и в присутствии фидерного слоя, а также с добавлением животной сыворотки; возможно, указанная полная культуральная среда может содержать добавки, такие как дополнительные аминокислоты (т.е. глутамин и т.п.), пируват натрия,бета-меркаптоэтанол, белковый гидролизат не животного происхождения (т.е. дрожжевой экстракт, растительные гидролизаты и т.п.);(б) пассаж путем модификации культуральной среды, чтобы получить полное исключение указанных факторов, указанного фидерного слоя, указанной сыворотки и, возможно, указанных добавок, и дальнейшее получение прикрепленных или суспензионных линий клеток птиц, названных EBx, которые не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы, способных к пролиферации в течение длительного периода времени, в базовой среде в отсутствие экзогенных факторов роста, фидерного слоя и животной сыворотки. Модификация культуральной среды стадии б) способа основания клеточных линий EBx, чтобы получить прогрессивное или полное исключение факторов роста, сыворотки и фидерного слоя, может быть произведена одновременно, последовательно или отдельно. Последовательность отнятия культуральной среды может быть выбрана среди: фидерный слой/сыворотка/факторы роста; фидерный слой/факторы роста/сыворотка; сыворотка/факторы роста/фидерный слой; сыворотка/фидерный слой/факторы роста; факторы роста/сыворотка/фидерный слой; факторы роста/фидерный слой/сыворотка. В предпочтительном воплощении последовательность отнятия составляет: факторы роста/фидерный слой/сыворотка. В соответствии с предпочтительным воплощением эмбриональные стволовые клетки птиц согласно стадии а) изобретения собирают из птичьих эмбрионов в момент откладки яиц, т.е. когда яйцо отложено. Согласно Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228) откладка яиц соответствует приведенным ниже стадиям развития согласно классификации Eyal-Giladi (EYAL-GILADI's classification:table and a new look at the first stages of the development in the chick". "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337): мускусная утка: стадия VII,цесарка: стадия VII-VIII,индюк: стадия VII-VIII,пекинская утка: стадия VIII,курица: стадия X,японский перепел: стадия XI,гусь: стадия XI. Предпочтительно утиные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки стадии а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) примерно на стадии VIII (откладка яиц) классификации Eyal-Giladi, более предпочтительно примерно на стадии VII для мускусной утки и примерно на стадии VIII для пекинской утки. Предпочтительно куриные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, предпочтительно от линии кур ev-0 стадии а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) примерно на стадии X (откладка яиц) классификации Eyal-Giladi. Альтернативно птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии со стадией а) по изобретению собирают из эмбриона перед откладкой яйца. Основные ограничения, встречающиеся перед откладкой яйца, составляет тот факт, что яйцо приходится извлекать из кур хирургическим путем и что количество ЭС клеток на эмбрион менее важно. Кроме того, на очень ранних стадиях развития птичьего эмбриона ЭС клетки не очень хорошо индивидуализированы, что затрудняет культивирование in vitro ЭС клеток. Специалист в данной области техники способен определить временную рамку перед откладкой яйца, которая дает возможность собирать птичьи ЭС клетки. Альтернативно птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии со стадией а) по изобретению можно собирать из эмбриона птицы после откладки яйца вплоть до вылупления. Однако птичьи эмбриональные стволовые клетки прогрессивно вступят в дифференциацию с образованием дифференцированных тканей; однако предпочтительно собирать птичьи ЭС недолго после откладки яйца. Специалист в данной области техники способен определить временную рамку после откладки яйца, которая дает возможность собирать птичьи эмбриональные стволовые клетки. Эти птичьи эмбриональные стволовые клетки характеризуются медленным временем удвоения, составляющим между 48 и 72 ч при культивировании при 39C. Не связываясь с теорией, определенные условия клеточной культуры птичьих ЭС клеток с последующим прогрессивным отнятием ростовых факторов, фидерного слоя и сыворотки дает возможность адаптировать и отобрать клетки, которые сохраняют большую часть желаемых признаков ЭС клеток(стабильность кариотипа, неопределенно долгую пролиферацию, экспрессию маркеров ЭС), но в дополнение проявляют промышленно благоприятные характеристики, такие как рост в суспензии вплоть до высоких плотностей клеток в среде, свободной от сыворотки. Теломераза составляет один из важнейших маркеров ЭС. Вследствие пролонгированной и поддерживаемой экспрессии теломеразы на протяжении пассажей клеток клетки EBx являются непрерывными (т.е. бессмертными), но, кроме того, являются генетически стабильными (т.е. диплоидными). В настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий птиц, выделенных из ЭС клеток (названных клеточными линиями EBx или клетками EBx), где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы, где указанный способ включает приведенные ниже стадии: а) выделение эмбриона(ов) птицы, предпочтительно из утки или из курицы, предпочтительно курицы ev-0, на стадии развития, включающей стадии от примерно стадии VI классификации Eyal-Giladi"General Morphology" Dev. Biol., 49:321-337) и до вылупления, предпочтительно около откладки яйца. Предпочтительно геном указанной птицы не содержит эндогенных провирусных последовательностей,склонных к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц; б) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) стадии а) в базовой культуральной среде с добавлением: инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и цилиарного нейротрофического фактора (ЦНТФ); животной сыворотки и возможно, факторов роста, выбранных из группы, содержащей интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина 6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (ФСК) и фактор роста фибробластов (ФРФ); в) высев суспензии ЭС клеток, полученных на стадии б), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа; г) возможно, исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей IL-6, IL-6R,ФСК, ФРФ, из культуральной среды в течение ряда из нескольких пассажей от 1 до примерно 15 пассажей, и дальнейшее культивирование птичьих ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей IL-6, IL-6R,ФСК, ФРФ, из культуральной среды осуществляют одновременно в течение одного пассажа. Обычно исключение IL-6, IL-6R, ФСК, ФРФ проводят примерно при пассаже от 10 до 15; д) исключение ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды и дальнейшее культивирование птичьих ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно исключение факторов роста, выбранных из группы, содержащей ИФР-1 и ЦНТФ, из культуральной среды осуществляют одновременно в течение одного пассажа. Обычно исключение ИФР-1 и ЦНТФ проводят примерно при пассаже от 15 до 25. Альтернативно исключение ИФР-1 и ЦНТФ проводят путем прогрессивного снижения в течение нескольких пассажей (по меньшей мере 2 пассажей и примерно вплоть до 15 пассажей); е) прогрессивное снижение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, чтобы получить полное исключение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток; ж) возможно, прогрессивное снижение концентрации добавок в культуральной среде, чтобы получить полное исключение добавок после по меньшей мере одного пассажа; и з) возможно, прогрессивное снижение концентрации животной сыворотки в культуральной среде,чтобы получить полное исключение животной сыворотки после нескольких пассажей; и и) получение прикрепленных линий клеток птиц, названных EBx, выделенных из ЭС клеток, способных к пролиферации в базовой среде в отсутствие факторов роста, фидерного слоя, возможно, без животной сыворотки и добавок, и где указанные непрерывные диплоидные линии клеток птиц предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц; к) возможно, дополнительная адаптация указанных прикрепленных линий клеток птиц EBx к условиям суспензионной культуры; л) возможно, дополнительное субклонирование указанных клеток птиц EBx, например, путем ограничительного разведения. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения непрерывных диплоидных линий клеток птиц, названных EBx, выделенных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (ЭС), где указанные линии клеток птиц не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц, и указанный способ включает стадии: а) выделение эмбриона(ов) птицы на стадии развития около откладки яйца, где геном указанной птицы не содержит эндогенных провирусных последовательностей, склонных к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц; б) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) стадии а), в базовой культуральной среде с добавлением по меньшей мере: инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и цилиарного нейротрофического фактора (ЦНТФ) и сыворотки млекопитающих, такой как фетальная бычья сыворотка; в) высев суспензии ЭС клеток, полученных на стадии б), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа; д) исключение ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа; е) прогрессивное снижение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, чтобы получить полное исключение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток; з) прогрессивное снижение концентрации указанной сыворотки млекопитающих в культуральной среде, чтобы получить полное исключение сыворотки млекопитающих после нескольких пассажей; и и) получение прикрепленных линий клеток птиц EBx, выделенных из ЭС клеток, способных к пролиферации в базовой среде в отсутствие факторов роста, фидерного слоя и сыворотки млекопитающих, и где указанные непрерывные диплоидные линии клеток птиц предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы; к) возможно, дополнительная адаптация прикрепленных линий клеток птиц EBx к условиям суспензионной культуры, предпочтительно путем стимуляции роста в виде суспензии, более предпочтительно путем переноса прикрепленных линий клеток птиц EBx, полученных на стадии з), на другую подложку, обладающую низкими характеристиками прикрепления, чем исходная подложка (т.е. такую,как подложка для прикрепления Ultra Low). Стадию к) адаптации прикрепленных линий клеток птиц EBx к условиям суспензионной культуры, когда ее проводят, можно осуществлять в другом предпочтительном воплощении перед стадией ж) прогрессивного снижения концентрации сыворотки млекопитающих в культуральной среде. В другом предпочтительном воплощении в базовую культуральную среду на стадии б) способа получения непрерывных диплоидных линий клеток птиц согласно настоящему изобретению дополнительно добавляют фактор роста, выбранный из группы, содержащей интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина 6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (ФСК) и фактор роста фибробластов (ФРФ), и указанный способ дополнительно включает стадию г): г) возможное исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей IL-6, IL-6K ФСК, ФРФ, из культуральной среды и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. В более предпочтительном воплощении, когда проводят стадию г), стадию д) исключения ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды осуществляют после стадии г) исключения всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей IL-6, IL-6R, ФСК, ФРФ, из культуральной среды. Согласно изобретению "базовая культуральная среда" означает культуральную среду с классическим составом среды, который сам по себе дает возможность, по меньшей мере, выживания клеток, и,даже лучше, роста клеток. Примерами базовой среды являются ВМЕ (базовая среда Игла), MEM (минимальная среда Игла), среда 199, DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), GMEM (модифицированная Глазго среда Игла), DMEM-HamF12, Ham-F12 и Ham-F10, среда дульбекко, модифицированная по способу Исков, среда Мак-Коя 5 А, RPMI 1640, GTM3. Базовая среда содержит неорганические соли(например, CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4 и т.п.), аминокислоты, витамины (тиамин, рибофлавин, фолиевую кислоту, D-Ca пантотенат и т.п.) и другие компоненты, такие как глюкоза, бетамеркаптоэтанол, пируват натрия. Предпочтительно базовая среда представляет собой синтетическую среду. Кроме того, базовая среда по изобретению может быть дополнена добавками, выбранными из приведенной ниже группы: 0,1-5 мМ L-глутамина, предпочтительно между 2 и 3 мМ L-глутамина; 0,05-2 мМ пирувата натрия, предпочтительно между 0,1 и 1 мМ пирувата натрия; 0,1-2,5% заменимых аминокислот, предпочтительно около 1% заменимых аминокислот; 0,05-5 мМ бета-меркаптоэтанола, предпочтительно около 0,16 мМ бета-меркаптоэтанола; белкового гидролизата не животного происхождения. Для основания утиных клеток EBx по изобретению базовую среду предпочтительно дополняют белковым гидролизатом не животного происхождения. Белковый гидролизат не животного происхождения выбран из группы, состоящей из бактериального триптона, дрожжевого триптона, растительных гидролизатов, таких как соевые гидролизаты, или их смесей. В предпочтительном воплощении белковые гидролизаты не животного происхождения представляют собой дрожжевой гидролизат. Термин "гидролизат" включает продукт ферментативного переваривания соевого пептона или дрожжевого экстракта. Гидролизат может быть получен из множества препаратов соевого пептона или дрожжевого экстракта,соответственно, которые могут быть дополнительно ферментативно переварены (например, папаином) и/или образованы путем автолиза, термолиза и/или плазмолиза. Гидролизаты могут быть также получены коммерческим путем, такие как Yeastolate, Hy-Soy, Ну-Yeast 412 и Hi-Yeast 444, из таких источников,как JRH BioSciences (Lenaxa, KA), Quest International (Norwich, N.Y.), OrganoTechnie S.A. (France) илиDeutsche Hefewerke GmbH (Germany). Источники дрожжевых экстрактов также раскрыты в WO 98/15614. Источники дрожжевых экстрактов и соевых гидролизатов также раскрыты в WO 00/03000. Гидролизаты,используемые в средах по изобретению, предпочтительно очищены из сырой фракции, поскольку примеси, которые могут препятствовать эффективному культивированию, предпочтительно элиминируют во время этой очистки, улучшая посредством этого консистенцию гидролизата. Очистку можно проводить путем ультрафильтрации или хроматографии на сефадексе (например, на Sephadex G25 или SephadexG10 или эквивалентных материалах), ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, вытеснительной хроматографии или хроматографии с обращенной фазой. Предпочтительно очистку проводят путем ультрафильтрации, используя буфер с порогом отсечения 10 кДа. Эти методики известны в данной области техники. Используя эти способы, можно отобрать фракции, которые содержат соевый или дрожжевой гидролизат определенной молекулярной массы. Предпочтительно средние молекулярные массы соевого и дрожжевого гидролизатов предпочтительно составляют между примерно 220 и 375 Да. Предпочтительно дрожжевой гидролизат присутствует в среде для культивирования клеток. Дрожжевой гидролизат 50 Х (примерно 200 г/л), полученный, например, от JRH-BIOSCIENCES (Ref 58902), присутствует в среде для культивирования клеток при конечной концентрации, составляющей между примерно 0,1 Х и 2 Х, предпочтительно от примерно 0,5 Х до примерно 1 Х в культуральной среде. Соевый гидролизат можно также добавлять в среду для культивирования клеток. Соевый гидролизат 50 Х, полученный,например, от JRH-BIOSCIENCES (Ref 58903100 М), добавляют при конечной концентрации, составляющей между примерно 0,1 Х и 2 Х, предпочтительно примерно 1 Х, в культуральную среду. Альтернативно смесь соевого гидролизата и дрожжевого гидролизата можно добавлять в среду для культивирования клеток, как описано в US 2004/0077086. Согласно предпочтительному воплощению базовая среда по изобретению представляет собойDMEM-HamF12, которая дополнена 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1% заменимыми аминокислотами, 0,16 мМ бета-меркаптоэтанолом и возможно 1 Х дрожжевым гидролизатом. Под "полной культуральной средой" подразумевают базовую культуральную среду, дополненную или нет, предпочтительно базовую синтетическую среду с добавлением по меньшей мере одного фактора роста и животной сыворотки, пример полной культуральной среды описан в WO 03/076601,WO 05/007840, ЕР 787180, US 6114168, US 5340740, US 6656479, US 5830510 и в Pain et al. (1996,Development 122: 2339-2348). Альтернативно полная культуральная среда может представлять собой кондиционированную среду, предпочтительно BRL кондиционированную среду. Например, BRL кондиционированную среду готовят в соответствии с методиками, признанными в данной области техники,такими как описаны Smith and Hooper (1987, Dev. Biol. 121:1-9). Клетки BRL доступны из АТСС, номер по каталогу CRL-1442. В кондиционированную среду могут быть добавлены экзогенные факторы роста и животная сыворотка, как описано ниже. Термин "факторы роста", как используют здесь, означает фактор роста, необходимый для выживания и роста недифференцированных птичьих ЭС клеток в культуре в базовой культуральной среде. Можно схематически разделить два семейства факторов роста: цитокины и трофические факторы. Цитокины представляют собой, главным образом, цитокины, действие которых опосредовано рецептором,который связан с белком gp130. Так, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), интерлейкин 11, интерлейкин 6, рецептор интерлейкина 6, цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ), онкостатин и кардиотрофин имеют сходный способ действия с рекрутментом на уровне рецептора специфичной цепи и объединение последней с белком gp130 в мономерной или иногда в гетеродимерной форме. Трофическими факторами являются, в основном, фактор стволовых клеток (ФСК), инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) и фактор роста фибробластов (ФРФ), предпочтительно основной ФРФ (оФРФ) или человеческий ФРФ(чФРФ). Полная культуральная среда согласно изобретению содержит базовую культуральную среду, предпочтительно базовую синтетическую среду, и по меньшей мере один цитокин, действие которого опосредовано рецептором, который связан с белком gp130, и/или по меньшей мере один трофический фактор. Предпочтительно полная культуральная среда согласно изобретению содержит базовую культуральную среду и по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, состоящей из фактора, ингибирующего лейкоз (LIF), онкостатина, кардиотрофина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), цили-8 017964 арного нейротрофического фактора (ЦНТФ), интерлейкина 6 (IL-6), рецептора интерлейкина 6 (IL-6R),фактора стволовых клеток (ФСК), фактора роста фибробластов (ФРФ), интерлейкина 11 (IL-11). Согласно первому предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и по меньшей мере ИФР-1 и ЦНТФ. Согласно второму предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и по меньшей мере ИФР-1, ЦНТФ, IL-6 и IL-6R. Согласно третьему предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и, по меньшей мере, ИФР-1, ЦНТФ, IL-6, IL-6R, ФСК, ФРФ. Согласно другому воплощению полная культуральная среда представляет собой кондиционированную культуральную среду,содержащую факторы роста (т.е., например, экспрессируемые клетками BRL или STO) и, возможно, с добавлением по меньшей мере одного экзогенного фактора роста, выбранного из группы, содержащейLIF, ИФР-1, ЦНТФ, IL-6, IL-6R, ФСК, ФРФ, IL-11. Концентрация факторов роста ИФР-1, ЦНТФ, IL-6,IL-6R, ФСК, ФРФ, IL-11 в базовой среде или в кондиционированной культуральной среде составляет между примерно 0,01 и 10 нг/мл, предпочтительно от 0,1 до 5 нг/мл и более предпочтительно примерно 1 нг/мл. Культуральная среда по изобретению может также содержать в дополнение антибиотики, такие как,например, гентамицин, пенициллин и стрептомицин, для предотвращения бактериального заражения. Антибиотики можно добавлять в культуральную среду при ранних пассажах культуры ЭС клеток. Например, в культуральную среду можно добавлять гентамицин при конечной концентрации 10 нг/мл, пенициллин при конечной концентрации 100 ед./мл и стрептомицин при конечной концентрации 100 мкг/мл. В предпочтительном воплощении антибиотики не добавляют в культуральную среду во время поздних стадий способа основания непрерывных диплоидных линий клеток птиц по изобретению. Во время процесса основания птичьих эмбриональных стволовых клеток по изобретению эти клетки культивируют на слое фидерных клеток. Более предпочтительно фидерные клетки представляют собой животные клетки или клеточные линии, культивируемые с целью культивирования птичьих ЭС клеток. Альтернативно фидерные клетки можно заменить внеклеточным матриксом со связанными факторами роста. Фидерный матрикс здесь далее относят либо к фидерным клеткам, либо к внеклеточному матриксу. Фидерный матрикс, как используют здесь, конструируют в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Как отмечено выше, предпочтительно, чтобы фидерный матрикс был предварительно кондиционирован. Под термином "предварительно кондиционирован" подразумевают, что фидерный матрикс культивируют в присутствии среды в течение периода времени перед депонированием клеток, имеющих происхождение из диска бластодермы оплодотворенных птичьих яиц, в контакте с фидерным матриксом, например, периода времени, достаточного для инициации и установления продуцирования фидерным матриксом, например, факторов роста или других факторов; обычно фидерный матрикс предварительно кондиционируют путем культивирования самого фидерного матрикса в течение одних-двух суток перед депонированием клеток, имеющих происхождение из диска бластодермы оплодотворенных птичьих яиц, в контакте с фидерным матриксом. Фидерные клетки предпочтительно включают фибробласты мыши. Предпочтительны фибробласты STO, но первичные фибробласты также пригодны. Также, хотя настоящее изобретение описано в отношении использования фидерных матриксов из мышиных клеток, рассматривают, что можно также использовать фидерные матриксы, содержащие клетки от других видов грызунов (например, крыс); других видов млекопитающих (например,видов копытных животных, крупного рогатого скота, свиней); или видов птиц (например, Gallinacea, куры, индюка, утки, гуся, перепела, фазана). В другом воплощении фидерные клетки по изобретению могут быть трансфицированы экспрессионным вектором(ами), дающим возможность, например, конститутивной экспрессии факторов роста, таких как птичий ФСК, в клетках STO. Таким образом, этот "фидер" продуцирует фактор в форме, которая является растворимой и/или прикрепленной к плазматической мембране клеток. Таким образом, способ культивирования по настоящему изобретению может, возможно, включать основание монослоя фидерных клеток. Фидерные клетки подвергают митотической инактивации, используя стандартные методики. Например, фидерные клетки можно подвергнуть воздействию рентгеновского или гамма-излучения (например, 4000 рад гамма-излучения) либо можно обработать митомицином С (например, 10 мкг/мл в течение 2-3 ч). Методики митотической инактивации клеток также подробно описаны в информации, обычно посылаемой вместе с клетками из Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 (например, фидерные клетки STO доступны под номером по каталогу АТСС 1503). Монослои можно, возможно, культивировать до 80% конфлюэнтности, предпочтительно до примерно 90% конфлюэнтности и более предпочтительно до примерно 100% конфлюэнтности. Хотя конфигурация фидерных клеток в виде монослоя является предпочтительной конфигурацией для культуры, любую подходящую конфигурацию рассматривают как находящуюся в пределах объема настоящего изобретения. Так, например, слои, монослои,кластеры, агрегаты или другие ассоциации или группировки фидерных клеток рассматривают как входящие в объем настоящего изобретения и, в частности, рассматривают как входящие в значение термина В культуральную среду по изобретению добавляют животную сыворотку. Предпочтительно используемой животной сывороткой является фетальная животная сыворотка. Предпочтительна фетальная бычья сыворотка. Хотя настоящее изобретение описано в отношении использования фетальной бычьей сыворотки, однако рассматривают, что можно также использовать животную сыворотку, включающую сыворотку от других видов животных (например, кур, лошадей, свиней, копытных и т.д.). Конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляет между примерно 1 и 25%, предпочтительно между 5 и 20%, более предпочтительно между 8 и 12%. В предпочтительном воплощении конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляет примерно 10%. Согласно предпочтительному воплощению культуральная среда содержит примерно 10% фетальной сыворотки теленка. Настоящее изобретение также относится к непрерывным диплоидным линиям клеток птиц EBx. Клетки EBx представляют собой маленькие округлые (т.е. диаметром примерно 10 мкм) индивидуализированные клетки с временем удвоения примерно 30 ч или менее при 37 или 39C. Птичьи клеткиEBx, предпочтительно утиные EBx или куриные EBx ev-0, экспрессируют фенотип эмбриональных стволовых клеток с приведенными ниже характеристиками: высокое ядерно-цитоплазматическое отношение,эндогенная теломеразная активность,возможно, они могут экспрессировать один или более чем один дополнительный ЭС маркер, такой как маркеры щелочная фосфатаза, SSEA-1, EMA-1, ENS1,время удвоения короче, чем время удвоения птичьих ЭС клеток стадии а) способа по изобретению(от 48 ч до 72 ч при 39 С), примерно 30 ч или менее (предпочтительно 24 ч) при 37 С. Указанные клетки EBx предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы. Линии клеток птиц EBx по изобретению способны к неопределенно долгой пролиферации в базовой среде, в частности, такой как среда SAFC Excell, DMEM, GMEM, DMEMHamF12 или McCoy, свободной от экзогенных факторов роста, сыворотки и/или инактивированного фидерного слоя, возможно, дополненной различными добавками, обычно используемыми специалистами в данной области техники. Примерами добавок являются заменимые аминокислоты, витамины, пируват натрия и антибиотики. Утиные клетки EBx по изобретению обладают примечательным признаком роста в базовой культуральной среде, которая не дополнена глутамином. Кариотипирование птичьих клеток EBx по изобретению показало, что клетки EBx являются диплоидными и генетически стабильными на протяжении поколений. В настоящем изобретении предложены птичьи клетки EBx, предпочтительно куриные клеткиEBx или утиные клетки EBx, трансфицированные по меньшей мере одним экспрессионным вектором, включающим по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующую интересующий рекомбинантный белок или полипептид, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного белка в клетке. Экспрессионный вектор дополнительно включает по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую, по меньшей мере, последовательность ДНК, кодирующую селективный маркер, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного селективного маркера в клеткехозяине. Экспрессионные векторы содержат необходимые элементы для транскрипции и трансляции по меньшей мере одной интересующей кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны и практикуются специалистами в данной области техники, можно использовать для конструирования экспрессионных векторов, содержащих последовательности, кодирующие интересующие белки и полипептиды, а также соответствующие транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы. Эти способы включают методики рекомбинантных ДНК in vitro, методики синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Такие методики описаны, например, в Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, AMolecular Biology, John WileySons, New York, N.Y.). Пригодные экспрессионные векторы включают по меньшей мере одну экспрессионную кассету, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность ДНК,кодирующую интересующий гетерологичный белок (белки), которая оперативно сцеплена с регуляторным элементом и регуляторными последовательностями. По меньшей мере, экспрессионная кассета содержит последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую интересующий гетерологичный белок (белки), которая оперативно сцеплена с промоторной последовательностью. "Промотор", как используют здесь, относится к нуклеиново-кислотной последовательности, которая регулирует экспрессию гена. Термин "оперативно сцеплен", как используют здесь,относится к такой конфигурации кодирующих и регуляторных последовательностей, например, внутри экспрессионного вектора, чтобы достичь транскрипции и/или экспрессии кодирующей последовательности. Так, регуляторные последовательности, оперативно сцепленные с кодирующей последовательно- 10017964 стью, способны осуществлять экспрессию кодирующей последовательности и регулировать, в каких тканях, в какие временные точки в развитии или в ответ на какие сигналы и т.п., экспрессируется ген. Кодирующая последовательность оперативно сцеплена с транскрипционными регуляторными областями или находится под их контролем в клетке, когда ДНК полимераза должна связываться с кодирующей последовательностью и транскрибировать эту кодирующую последовательность в мРНК, которая может транслироваться в кодируемый белок. Регуляторные последовательности не обязательно должны находиться по соседству с кодирующей последовательностью, если они функционируют, чтобы направлять ее экспрессию. Так, например, промежуточные нетранслируемые или нетранскрибируемые последовательности могут присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, и промоторную последовательность можно все же считать "оперативно сцепленной" с кодирующей последовательностью. Такие промежуточные последовательности включают, но не ограничены ими, энхансерные последовательности, которые не транскрибируются или не связываются полимеразой. Термин "экспрессируемый" или "экспрессия", как используют здесь, относится к транскрипции нуклеотидной последовательности в молекулу нуклеиновой кислоты РНК, по меньшей мере, частично комплементарную области одной из двух нитей нуклеиновой кислоты кодирующей последовательности гена и/или к трансляции молекулы нуклеиновой кислоты РНК в белок или полипептид. Такая экспрессионная кассета дополнительно содержит регуляторные элементы или регуляторные последовательности, которые представляют собой те нетранслируемые области кассеты, кроме промоторов (например, 5'- и 3'-нетранслируемые области), которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Как используют здесь, термин "регуляторный элемент" и "регуляторные последовательности" включают промоторы, энхансеры и другие элементы,которые могут регулировать экспрессию гена. Стандартные учебники по молекулярной биологии, такие как Sambrook et al. Eds. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001),можно использовать для консультации по конструированию пригодных экспрессионных векторов, которые могут дополнительно включать точку начала репликации (ТНР) и селективные маркерные гены. Такие элементы могут варьировать по своей силе и специфичности. В зависимости от векторной системы можно использовать любое число пригодных транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Должно быть понятно, однако, что выбор пригодного экспрессионного вектора и комбинация функциональных элементов в нем зависят от множественных факторов, включая, например, тип белка,который нужно экспрессировать. Репрезентативные примеры экспрессионных векторов включают, например, бактериальные плазмидные векторы, включая экспрессионные и клонирующие векторы, такие как, но не ограниченные ими, pBR322, вирусные векторы животных, такие как, но не ограниченные ими,модифицированный птичий аденовирус, вирус кори, вирус гриппа, полиовирус, поксвирус, ретровирус и т.п., и векторы, образованные из нуклеиновой кислоты бактериофага, например плазмиды и космиды,искусственные хромосомы, такие как, но не ограниченные ими, дрожжевые искусственные хромосомы(YAC) и бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), и синтетические олигонуклеотиды, подобные химически синтезированным ДНК или РНК. Соответственно, термин "нуклеиново-кислотный вектор" или "вектор", как используют здесь, относится к природной или синтетической однонитевой или двунитевой плазмидной или вирусной молекуле нуклеиновой кислоты или к любой другой молекуле нуклеиновой кислоты, которую можно трансфицировать или трансформировать в клетки и реплицировать независимо от генома или внутри генома клетки-хозяина. Нуклеиновая кислота может быть встроена в вектор путем разрезания вектора ферментами рестрикции и лигирования участков вместе. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой РНК или ДНК. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую их вводят, например бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих. Другие векторы, такие как не эписомные векторы млекопитающих, интегрируют в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и, следовательно,реплицируется параллельно с геномом хозяина. Экспрессионная кассета для применения в системе экспрессии белка сконструирована таким образом, что содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую интересующий рекомбинантный белок, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, и, возможно, регуляторный элемент(ы) или регуляторную последовательность(и). Регуляторный элемент или регуляторные последовательности необходимы или требуются для правильной транскрипции и регуляции экспрессии гена. Эти последовательности предпочтительно выбраны из группы, состоящей из последовательностей транскрипционной инициации и терминации, энхансера, интрона, сайтов точки начала репликации, последовательностей полиаденилирования, пептидного сигнала и элементов изоляторов хроматина. Регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Энхансерные последовательности могут быть локализованы выше или ниже по ходу трансляции последовательностей промоторной области для оптимизации экспрессии гена. "Энхансер" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая действует с потенцированием транскрипции генов независимо от идентичности гена, положения после- 11017964 довательности по отношению к гену или ориентации последовательности. Векторы по настоящему изобретению возможно включают энхансеры. Примерами энхансеров являются немедленно-ранний энхансер CMV и ранний энхансер SV40. Интронная последовательность может быть локализована выше или ниже по ходу трансляции последовательности, кодирующей интересующий рекомбинантный белок, для оптимизации экспрессии гена. Согласно предпочтительному воплощению интронная последовательность локализована между промоторной последовательностью и последовательностью, кодирующей интересующий рекомбинантный белок. Интронная последовательность по изобретению предпочтительно выбрана из группы, состоящей из химерного интрона, состоящего из 5'-донорного сайта из первого интрона человеческого гена бета-глобина и ветви и 3'-акцепторного сайта из интрона гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Промоторные последовательности по изобретению предпочтительно выбраны из генов происхождения из млекопитающих или птиц или из вирусных генов млекопитающих или птиц. В предпочтительном воплощении промоторная последовательность имеет вирусное происхождение и выбрана из группы,состоящей из промотора человеческого или мышиного цитомегаловируса (CMV), промотора вируса саркомы птиц (ASV)xLN, раннего и позднего промоторов из вируса обезьян 40 (SV40) (Fiers et al. (1973),Nature. 273:113), промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV), промотора респираторно-синцитиального вируса, промотора MDOT, промотора вируса полиомы, промотора аденовируса 2, промотора вируса бычьей папилломы, основного позднего промотора аденовируса и функциональных участков каждого из этих промоторов. Согласно другому воплощению промоторная последовательность выбрана из группы, состоящей из мышиного промотора фосфоглицераткиназы, вируса лейкемии мышей (MLV), вируса опухоли молочной железы мышей(MMTV), промотора EiF4-альфа, химерного промотора EF1 альфа/HTLV, химерного промотора CAG (составного промотора, который объединяет немедленно-ранний энхансер человеческого CMV и модифицированный промотор и первый интрон куриного бета-актина) и промоторов птичьих генов и функциональных участков каждого из этих промоторов. Среди промоторов птичьих генов промотор предпочтительно выбран среди куриных промоторов, таких как промотор бета-актина, промотор, специфичный для яйцевода, промотор овомукоида, промотор овальбумина, промотор кональбумина, промотор овомуцина,промотор овотрансферина, промотор лизоцима, промотор гена ENS1 и функциональные участки каждого из этих промоторов. Согласно другому воплощению промоторы могут быть выбраны среди регулируемых промоторов,таких промоторов, которые придают индуцибельность конкретными соединениями или молекулами, например, глюкокортикоид-отвечающий элемент (GRE) вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV) индуцируется глюкокортикоидами (Chandler et al. (1983), Cell, 33: 489-499). Также можно использовать тканеспецифические промоторы или регуляторные элементы (Swift et al. (1984), Cell, 38: 639-646), если необходимо или желательно. Неограничивающие примеры других промоторов, которые могут быть полезны в настоящем изобретении, включают без ограничения промоторы PolIII (например, промоторыPolIII типа 1, типа 2 и типа 3), такие как промоторы HI, промоторы U6, промоторы тРНК, промоторы РНКазы MPR и функциональные участки каждого из этих промоторов. Типично функциональные терминаторные последовательности выбраны для использования в настоящем изобретении в соответствии с используемым промотором. Экспрессионный вектор по изобретению может дополнительно включать по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты,предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую селективный маркер, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного селективного маркера в клетке. Такой селективный маркер может придавать устойчивость клетке EBx, несущей вектор, чтобы дать возможность ее селекции в соответствующей селективной среде. Для способов по данному изобретению стабильная экспрессия, как правило, предпочтительна по сравнению с транзитной экспрессией, поскольку при ней достигают более воспроизводимых результатов, и она также более приспособлена к широкомасштабному производству. Соответственно, экспрессионные векторы по изобретению стабильно включаются в хромосомную ДНК клетки EBx. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам может быть дана возможность расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, а затем их переводят на селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантном векторе придает устойчивость к селекции и дает возможность селекции клеток, которые имеют стабильно интегрированный вектор в их хромосомах, и выращивают их до образования очагов, которые, в свою очередь,можно клонировать и размножать до клеточных линий. В предпочтительном воплощении используют устойчивость к антиметаболитам как основу селекции для приведенных ниже не ограничивающих примеров маркерных генов: DHFR, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 и O'Hare et al. (1981),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); GPT, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan and Berg (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); неомицин (NEO), который придает устойчи- 12017964 вость к аминогликозиду G418 (Wu and Wu (1991), Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev (1993), Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan (1993), Science, 260: 926-932; Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem.,62:191-21); и гигромицин В, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al. (1984), Gene,30:147) и пуромицин. В наиболее предпочтительном воплощении гены устойчивости к антибиотикам используют как основу селекции. Согласно предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к неомицину. Предпочтительно нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая NEO, представляет собой ген устойчивости к неомицину/канамицину TN5. Согласно другому предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к канамицину. Согласно другому предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к пуромицину. Альтернативно такие селекционные системы требуют, чтобы клетки EBx по изобретению были предварительно генетически модифицированы, чтобы проявлять соответствующий генотип (т.е. TK-,HGPRT-, ART-, DHFR-, GPT- и т.д.). Можно использовать ряд селекционных систем, включая, но не ограничиваясь ими, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK) (Wigler et al. (1977), Cell. 11: 223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT) (SzybalskaSzybalski (1992), Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 48: 202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al. 1980, Cell. 22: 817), которые можно использовать в клетках tk-, hgprt- или art- (APRT) соответственно. Способы, общеизвестные в данной области техники, технологии рекомбинантных ДНК можно рутинно применять для селекции желаемых рекомбинантных клеточных клонов, и такие способы описаны, например, в Ausubel et al. (1993) иKriegle (1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; in Chapters 12 and 13). Кроме того, уровни экспрессии экспрессируемой белковой молекулы можно повысить за счет амплификации вектора (обзор см. в BebbingtonHentschel, "The use of vectors based on gene amplificationfor the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New-York 1987). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей белок, является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, должно повысить число копий маркерного гена. Поскольку амплифицируемая область связана с геном, кодирующим белок, продуцирование белка одновременно повысится (Crouse et al. (1983), Mol. Cell. Biol., 3: 257). Векторы, которые несут нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтазу (GS) или дигидрофолатредуктазу (DHFR) в качестве селективных маркеров, можно амплифицировать в присутствии лекарств метионина сульфоксимина или метотрексата соответственно. Глутаминсинтазная экспрессионная система и ее компоненты подробно описаны в публикациях РСТ: WO 87/04462; WO 86/05807; WO 89/01036; WO 89/10404 иWO 91/06657. Кроме того, глутаминсинтазные экспрессионные векторы, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, имеются в продаже от поставщиков, включая, например, LonzaBiologies, Inc. (Portsmouth, NH). Клетки-хозяева, которые содержат кодирующую последовательность и которые экспрессируют биологически активные генные продукты (т.е. интересующий белок, селективный маркер и т.п.), можно идентифицировать с помощью по меньшей мере четырех общих подходов; (а) ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации; (б) присутствия или отсутствия функций "маркерного" гена; (в) оценки уровня транскрипции, который измеряют по экспрессии соответствующих мРНК транскриптов в клетке EBx, и(г) обнаружения генного продукта, который измеряют с помощью иммунологического анализа или по его биологической активности. При первом подходе присутствие кодирующей последовательности интересующего белка, встроенной в экспрессионный вектор, можно обнаружить с помощью ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации, используя зонды, содержащие нуклеотидные последовательности, которые гомологичны соответствующим кодирующим последовательностям, соответственно, либо их участкам или производным. При втором подходе система рекомбинантный экспрессионный вектор/хозяин может быть идентифицирована и отобрана на основании присутствия или отсутствия определенных функций "маркерного" гена (например, активности тимидинкиназы, устойчивости к антибиотикам, устойчивости к метотрексату и т.д.). Один или оба из векторов по изобретению могут содержать по меньшей мере одну точку начала репликации, чтобы дать возможность репликации векторных конструкций внутри клеток-хозяев. Согласно предпочтительному воплощению векторы по изобретению содержат одну бактериальную точку начала репликации, такую как F1 ORI, чтобы дать возможность репликации экспрессионного вектора в бактериях (например, в Е.coli) и точку начала репликации SV40, чтобы дать возможность проверки экспрессионного вектора путем быстрого транзитного анализа. Экспрессионный вектор по изобретению может дополнительно содержать хроматиновые изолирующие элементы. Хроматиновые изолирующие элементы по изобретению включают элементы границы(BE), участки прикрепления к матриксу (MAR), участки локусного контроля (LCR) и универсальные элементы, открывающие хроматин (UCOE). Элементы границы ("BE") или изолирующие элементы во многих случаях определяют границы в хроматине (BellFelsenfeld (1999), Curr. Opin. Genet. Dev. 9:191198) и могут играть роль в определении транскрипционного домена in vivo. У BE отсутствует собствен- 13017964 ная промоторная/энхансерная активность, но считают, что, вероятнее, они защищают гены от транскрипционного влияния регуляторных элементов в окружающем хроматине. Анализ блокирования энхансера обычно используют для идентификации изолирующих элементов. В данном анализе хроматиновый элемент помещают между энхансером и промотором и измеряют транскрипцию, активируемую энхансером. Показано, что элементы границы способны защищать стабильно трансфицированные репортерные гены против эффектов положения у дрозофилы, дрожжей и в клетках млекопитающих (Walters et al. (1999),Mol. Cell. Biol. 19:3714-3726). Участки прикрепления к матриксу ("MAR"; также известные как участки прикрепления к каркасу или участки прикрепления к каркасу/матриксу ("S/MAR" представляют собой последовательности ДНК, которые связывают изолированные ядерные каркасы или ядерные матриксы invitro с высоким сродством (Hart and Laemmli (1998), Curr. Opin. Genet. Dev. 8:519-525). Как таковые, они могут определять границы независимых хроматиновых доменов, так что только охваченные ими цисрегуляторные элементы регулируют экспрессию генов внутри домена. Элементы MAR могут усиливать экспрессию гетерологичных генов в культивируемых клеточных линиях (Kalos and Fournier (1995), Mol.Cell. Biol. 15:198-207. Участки локусного контроля ("LCR") представляют собой цис-регуляторные элементы, требуемые для исходной активации хроматина локуса и последующей транскрипции гена в их нативных локализациях (обзор в Grosveld, 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9:152-157). Наиболее широко охарактеризованные LCR представляют собой LCR глобинового локуса. Универсальные элементы, открывающие хроматин ("UCOE", также известные как "универсально действующие элементы, открывающие хроматин"), недавно описаны (см. WO 00/05393). Согласно предпочтительному воплощению хроматиновый изолирующий элемент по изобретению представляет собой элемент MAR. Предпочтительно элементMAR выбран среди 5'-MAR элементов куриного лизоцима, как описано в WO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, выбор подходящего вектора,например, плазмиды, компонентов для правильной транскрипции, экспрессии (промотора, контролирующих последовательностей и регуляторных последовательностей) и выделение белков, продуцируемых в клеточных экспрессионных системах, известны и рутинно определены и практикуются специалистами в данной области техники. Согласно одному воплощению клетки EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность CMV SEQ ID1 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один 5'-MAR элемент куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие MAR элементы, как описано в WO 2005/040377. Согласно второму воплощению клетки EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерная промоторная последовательность EF1 альфа/HTLV SEQ ID2 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один 5'-MAR элемент куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие MAR элементы, как описано в WO 2005/040377. Согласно одному воплощению клетки EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность RSV SEQ ID3 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один 5'-MAR элемент куриного лизоцима, как описано в Согласно предпочтительному воплощению интронная последовательность представляет собой последовательность SEQ ID4 или ее фрагмент или вариант, а последовательность полиаденилирования представляет собой последовательность SEQ ID5 или ее фрагмент или вариант. Когда интересующий рекомбинантный белок по изобретению представляет собой мультимерный белок, различные цепи указанного белка кодируются либо одним экспрессионным вектором, либо в различных экспрессионных векторах. В последнем случае различные экспрессионные векторы котрансфицируют либо одновременно, либо последовательно в клетку EBx. "Котрансфекция" означает способ трансфекции клетки EBx более чем одним экспрессионным вектором. Когда клетка котрансфицирована экспрессионным вектором, способным к экспрессии легкой цепи антитела, и вектором, способным к экспрессии тяжелой цепи антитела, вектор предпочтительно содержит независимо селективные маркеры. Когда единый экспрессионный вектор способен к экспрессии легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, этот вектор предпочтительно содержит по меньшей мере один селективный маркер. Теперь авторы изобретения неожиданно обнаружили, что уровень экспрессии антитела в клеткахEBx выше при трансфекции одним экспрессионным вектором, кодирующим тяжелую цепь и легкие цепи антитела, по сравнению с котрансфекцией двумя экспрессионными векторами, каждый из которых кодирует одну цепь антитела. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что при трансфекции одним вектором уровень экспрессии антитела в клетках EBx выше, когда в экспрессионном векторе содержатся в приведенном ниже порядке: первая кассета, кодирующая тяжелую цепь антитела, и вторая кассета, кодирующая легкую цепь антитела, где каждая кассета имеет один и тот же промотор. Действительно, сбалансированная экспрессия легкой и тяжелой цепей антитела из клеток EBx желательна с учетом того, что легкая и тяжелая цепи связаны вместе в молекуле антитела в эквимолярных соотношениях. Экспрессионный вектор дает возможность получения антитела в функциональной форме и его секреции с хорошими выходами. Таким образом, этот способ обеспечивает получение достаточных количеств функционального антитела для применения при иммунотерапии патологических расстройств. Клеточная линия по настоящему изобретению способна к продуцированию всех видов антител, которые обычно содержат эквимолярные соотношения легкой и тяжелой цепей. Изобретение, таким образом, включает человеческие антитела, где аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей гомологичны последовательностям антител, продуцируемых человеческими лимфоцитами in vivo или гибридомами in vitro. В изобретение также включены измененные антитела, такие как гибридные антитела, в которых тяжелая и легкая цепи гомологичны природному антителу, но объединены таким путем,который не встречается в природе. Например, биспецифическое антитело имеет рецепторы антигена,специфичные более чем к одному антигену. Константная область антитела может относиться к одному или другому участку связывания антигена или может принадлежать другому антителу. Измененные антитела, такие как химерные антитела, имеют вариабельные области от одного антитела и константные области от другого. Таким образом, химерные антитела могут представлять собой межвидовые химеры или межклассовые химеры. Такие химерные антитела могут иметь одну или более чем одну дополнительную модификацию для улучшения способности к связыванию антигена или для изменения эффекторной функции. Другой формой измененного антитела является гуманизированное антитело или антитело с привитым CDR, включая составное антитело, где участки гипервариабельных областей в дополнение к CDR перенесены на человеческую каркасную область. Дополнительные аминокислоты в каркасной или константной областях таких антител могут быть изменены. В определение измененного антитела включены Fab фрагменты, которые приблизительно эквивалентны участкам Y ветви тяжелой и легкой цепей; они могут включать неполные фрагменты или фрагменты, включающие участок области Fc. Таким образом, в пределы объема изобретения включено любое измененное антитело, в котором аминокислотная последовательность не представляет собой ту, которая существует в природе. Предпочтительно интересующий белок представляет собой моноклональное антитело, предпочтительно человеческое моноклональное антитело или измененное антитело, и клетку EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент,последовательность полиаденилирования; третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: вирусный промотор, ген устойчивости к антибиотику, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Однако объектом настоящего изобретения также является разработка клетки EBx, трансфицированной по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент,последовательность полиаденилирования; вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: вирусный промотор, ген устойчивости к антибиотику, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Согласно другому предпочтительному воплощению клетку EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор CMV SEQ ID1 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор CMV SEQ ID1 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Согласно другому предпочтительному воплощению клетку EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерный промотор EF1 альфа/HTLV SEQ ID2 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерный промотор EF1 альфа/HTLV SEQ ID2 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Согласно другому предпочтительному воплощению клетку EBx по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор RSV SEQ ID3 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор RSV SEQ ID3 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования; третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Гены легкой и тяжелой цепи могут составлять геномную ДНК или предпочтительно кДНК, и их клонируют, используя методики, известные в данной области техники (Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Second Edition, Maniatis et al., Cold Spring Harbor). Согласно другому воплощению клетка EBx по изобретению дополнительно содержит экспрессионный вектор, включающий, по меньшей мере, экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновокислотную последовательность, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую антиапоптический белок, оперативно сцепленный с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного антиапоптического белка в клетке. Антиапоптический белок выбран из группы, включающей белки семейства Bcl2 млекопитающих,птиц, амфибий и рыб. Согласно предпочтительному воплощению антиапоптический белок представляет собой член семейства птичьих Bcl2, названный NR13 (Lee et al., 1999, GenesDev. 13:718-728; Lalle etal., 2002, Biochem. J. 368:213-221). Пример экспрессионного вектора, кодирующего антиапоптический белок NR13, включает по меньшей мере: первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность CMV, RSV или химерного EF1 альфа/HTLV, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая антиапоптический белок NR13, последовательность полиаденилирования и вторую первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к пуромицину, последовательность полиаденилирования; возможно, третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор SV40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования; возможно, по меньшей мере один элемент 5'-MAR куриного лизоцима, как описано вWO 02/074969, или человеческие элементы MAR, как описано в WO 2005/040377. Согласно предпочтительному воплощению последовательность NR13 представляет собойSEQ ID6 или ее фрагмент или вариант. Далее в настоящем изобретении предложен способ продуцирования по меньшей мере одного интересующего биологического продукта в птичьей клетке EBx, где указанный способ включает стадии: а) получение клетки EBx согласно изобретению путем трансфекции по меньшей мере одним экспрессионным вектором; трансфекцию можно проводить либо на прикрепленных, либо на суспензионных клетках EBx; б) культивирование указанной трансфицированной клетки EBx в пригодных условиях и в клеточной культуральной среде и в) сбор интересующего биологического продукта из указанной трансфицированной клетки EBx,из клеточной культуральной среды и/или из указанной клетки EBx, и из указанной среды. Экспрессионные векторы, описанные здесь, можно вводить в клетки EBx с помощью ряда способов. В частности, можно проводить стандартные методики трансфекции, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как кальций-фосфатная преципитация, трансфекция, опосредованная ДЭАЭ-декстраном, электропорация, нуклеофекция (АМАХА Gmbh, GE), трансфекция, опосредованная липосомами (с использованием, например, технологии Липофектина или Липофектамина) или микроинъекция. Согласно предпочтительному воплощению на стадии а) клетки EBx, предпочтительно куриные или утиные клетки EBx, трансфицируют с помощью электропорации, более предпочтительно с помощью нуклеофекции, которая представляет собой оптимизированную технологию электропорации,разработанную АМАХА Gmbh (DE), по меньшей мере одним экспрессионным вектором в прикрепленной культуре в клеточной культуральной среде, свободной от сыворотки. Согласно предпочтительному воплощению на стадии а) клетки EBx, предпочтительно куриные или утиные клетки EBx, трансфицируют с помощью электропорации, более предпочтительно с помощью нуклеофекции, по меньшей мере одним экспрессионным вектором в суспензионной культуре в клеточной культуральной среде, свободной от сыворотки. Согласно другому предпочтительному воплощению на стадии а) клетки EBx, предпочтительно куриные или утиные клетки EBx, трансфицируют путем трансфекции, опосредованной липосомами, используя соединение, подобное липофектамину, и т.п., по меньшей мере одним экспрессионным вектором в прикрепленной или в суспензионной культуре в клеточной культуральной среде,свободной от сыворотки. Как используют здесь, термин "интересующий белок" относится к полимеру из аминокислот, связанных посредством пептидных связей. Термин "интересующий белок" включает белки, фрагменты бел- 17017964 ков, аналоги белков, полипептиды, олигопептиды, пептиды и т.п. Согласно изобретению под термином"интересующий биологический продукт" подразумевают либо мономерный "интересующий белок", либо композицию по меньшей мере из двух интересующих мономерных белков, составляющих мультимерный белок. Примерами мультимерного интересующего белка являются антитела, которые состоят из 4 интересующих мономерных белков (т.е. двух тяжелых и двух легких цепей). "Белок" или "биологический продукт", который не составляет естественную часть клеточного генома EBx, называют "гетерологичный белок" или "гетерологичный биологический продукт". В изобретении предложен интересующий биологический продукт, имеющий гликозилирование птичьих EBx. Более конкретно в изобретении предложено антитело, имеющее гликозилирование куриных EBx, более предпочтительно гликозилирование ЕВ 14 или EBv13, либо имеющее гликозилирование утиных EBx, более предпочтительно гликозилирование ЕВ 24, гликозилирование ЕВ 24-12, гликозилирование ЕВ 26, гликозилирование ЕВ 66. Культивирование указанных трансфицированных клеток EBx можно проводить в соответствии с методиками клеточных культур, хорошо известных специалистам в данной области техники. В целях понимания, но без ограничения, практикующим специалистам должно быть понятно, что клеточные культуры и серии культивирования для продуцирования белка могут включать три общих типа, а именно непрерывную культуру, периодическую культуру и периодическую культуру с подпиткой. При непрерывной культуре, например, добавление свежей культуральной среды (т.е. питательной среды) обеспечивают клеткам в течение периода культивирования, тогда как старую культуральную среду удаляют ежесуточно и продукт собирают, например, ежесуточно или непрерывно. При непрерывной культуре питательную среду можно добавлять ежесуточно, а можно добавлять непрерывно, т.е. в виде капель или инфузии. Для непрерывного культивирования клетки могут оставаться в культуре настолько долго, насколько желательно, пока клетки остаются живыми и поддерживаются условия окружающей среды и культивирования. При периодической культуре клетки первоначально культивируют в среде, и эту среду не удаляют, не заменяют, не добавляют, т.е. клетки не "подпитывают" новой средой ни во время, ни в конце серии культивирования. Желаемый продукт собирают в конце серии культивирования. Для периодических культур с подпиткой время серии культивирования увеличивают путем пополнения культуральной среды один или более чем один раз в сутки (или непрерывно) свежей средой во время серии, т.е. клетки "подпитывают" новой средой ("питательной средой") в течение периода культивирования. Периодические культуры с подпиткой могут включать различные режимы и периоды подпитки, как описано выше, например, ежесуточно, через каждые сутки, через каждые двое суток и т.д., более чем один раз в сутки или менее чем один раз в сутки и т.д. Кроме того, периодические культуры с подпиткой можно подпитывать непрерывно питательной средой. Затем описанный продукт собирают в конце серии культивирования/продуцирования. Настоящее изобретение предпочтительно включает периодические клеточные культуры с подпиткой. Согласно настоящему изобретению можно проводить клеточную культуру, и белки, предпочтительно гликопротеины, могут продуцироваться клетками в условиях для крупномасштабного или маломасштабного продуцирования белков, используя культуральные сосуды и/или аппараты для культур, которые общепринято применяют для культур клеток животных или млекопитающих. Как понятно специалистам в данной области техники, чашки для тканевых культур, Т-образные флаконы и роллерные флаконы типично используют в лабораторном масштабе. Для культивирования в большем масштабе (например, 3, 7, 20, 100, 500, 5000 л и т.д.) можно использовать методики, включающие, но не ограниченные ими, биореактор с псевдоожиженным слоем, биореактор с полыми волокнами,культуру в роллерном флаконе или системы биореакторов с механическим перемешиванием. Микроносители можно использовать или не использовать с роллерными флаконами или с системами биореакторов с механическим перемешиванием. Эти системы могут работать в периодическом, непрерывном режиме или в периодическом режиме с подпиткой. Кроме того, аппарат или систему культивирования можно оборудовать или не оборудовать клеточным сепаратором, используя фильтры, гравитацию, центрифужную силу и т.п. В способах культивирования клеток или способах по данному изобретению клетки можно поддерживать в ряде клеточных культуральных сред, т.е. базовых культуральных сред, как общеизвестно в данной области техники. Например, эти способы применимы для использования с большими объемами клеток, поддерживаемых в клеточной культуральной среде, в которую могут быть добавлены нутриенты и тому подобное. Типично "клеточная культуральная среда" (также называемая "культуральная среда") представляет собой термин, который понятен практикующим специалистам в данной области техники и известен как относящийся к питательному раствору, в котором выращивают клетки, предпочтительно животные клетки или клетки млекопитающих, и который обычно обеспечивает по меньшей мере один или более чем один компонент из приведенного ниже: источник энергии (обычно в форме углевода, такого как глюкоза); все незаменимые аминокислоты, и обычно двадцать основных аминокислот плюс цистеин; витамины и/или другие органические соединения, типично требующиеся при низких концентрациях; липиды или свободные жирные кислоты, например линолевая кислота; и микроэлементы, например неорганические соединения или встречающиеся в природе элементы, которые типично требуют- 18017964 ся при очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне. Клеточная культуральная среда может быть также дополнена таким образом, что содержит ряд возможных компонентов, таких как гормоны и другие факторы роста, например инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, сыворотка и тому подобное; соли, например, кальция, магния и фосфата, и буферы, например ГЭПЭС; нуклеозиды и основания, например аденозин, тимидин, гипоксантин; а также белковые и тканевые гидролизаты, например гидролизованный животный белок (пептон или пептоновые смеси, которые могут быть получены из животных субпродуктов, очищенный желатин или растительный материал); антибиотики, например гентамицин; и защитные агенты для клеток, например полиол Pluronic(Pluronic F68). Предпочтительна клеточная питательная среда, которая свободна от сыворотки и свободна от продуктов или ингредиентов животного происхождения. Клетки EBx по изобретению адаптированы для культивирования в условиях, свободных от сыворотки. Можно использовать имеющиеся в продаже среды, и они включают, например, среду Ham's F12(Sigma, St. Louis, МО), модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM, Sigma), среду Optipro (Invitrogen, Carlsbad, CA) или среду Excell (SAFC, Lenexa, KS). К вышеуказанным примерным средам могут быть добавлены вышеописанные дополнительные компоненты или ингредиенты, включая возможные компоненты, в соответствующих концентрациях или количествах, по необходимости или желанию, и,как должно быть известно и использовано на практике специалистами в данной области техники, используя рутинные навыки. Кроме того, условия клеточной культуры, пригодные для способов по настоящему изобретению, представляют собой те, которые типично применяются и известны для периодического, периодического с подпиткой или непрерывного культивирования клеток, где внимание уделяют рН, например, от примерно 6,5 до примерно 7,5; растворенному кислороду (O2), например, между примерно 5-90% насыщения воздухом и диоксидом углерода (CO2), встряхиванию и увлажнению, в дополнение к температуре. После сбора интересующий биологический продукт обычно концентрируют. После его получения в концентрированной форме можно использовать любую стандартную методику, такую как препаративный диск-электрофорез в геле, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, разделительная хроматография по размеру, изоэлектрическое фокусирование и тому подобное, для очистки, выделения и/или идентификации гетерологичного белка. Специалисты в данной области техники могут также легко сконструировать средства для аффинной хроматографии очистки гетерологичного белка, особенно для тех случаев, в которых известен партнер связывания гетерологичного белка, например, антитела. Выделение моноклональных антител упрощено, а безопасность повышена благодаря отсутствию дополнительных человеческих или животных белков в культуре. Отсутствие сыворотки дополнительно повышает надежность системы, поскольку использование синтетических сред, как рассмотрено здесь, усиливает воспроизводимость. Примеры интересующих белков, которые можно успешно продуцировать способом по данному изобретению, включают без ограничения цитокины, рецепторы цитокинов, факторы роста (например,EGF, HER-2, FGF-альфа, FGF-бета, TGF-альфа, TGF-бета, PDGF, IGF-1, IGF-2, NGF), рецепторы факторов роста, включая фрагмент их белка. Другие неограничивающие примеры включают гормоны роста(например, человеческий гормон роста, бычий гормон роста); инсулин (например, А-цепь инсулина и В-цепь инсулина), проинсулин, эритропоэтин (EPO), колониестимулирующие факторы (например,G-CSF, GM-CSF, M-CSF); интерлейкины (например, IL-1 - IL-12); сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецептор (VEGF-R), интерфероны (например, ИФН-альфа, бета и гамма), фактор некроза опухоли (TNF) и его рецепторы (TNFR-1 и TNFR-2), тромбопоэтин (ТРО), тромбин, натрийуретический пептид головного мозга (BNP); факторы свертывания крови (например, фактор VIII, фактор IX,фактор Виллебранда и тому подобное), антисвертывающие факторы; тканевой активатор плазминогена(ТРА), урокиназу, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), кальцитонин, белки CD (например, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD25,CD33, CD44, CD45, CD71 и т.д.), белки CTLA (например, CTLA4); Т-клеточные и В-клеточные рецепторные белки, костные морфогенетические белки (BMP, например, ВМР-1, ВМР-2, ВМР-3 и т.д.), нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор костного происхождения (BDNF), нейротрофины, например реннин, ревматоидный фактор, RANTES, альбумин, релаксин, макрофагальный ингибиторный белок (например, MIP-1, MIP-2), вирусные белки или антигены, поверхностные мембранные белки, белки ионных каналов, ферменты, регуляторные белки, антитела, иммуномодуляторные белки(SOD), рецепторные белки, связанные с G-белком (GPCR), нейромодуляторные белки, белки и пептиды,связанные с болезнью Альцгеймера (например, А-бета) и другие, как известно в данной области техники. Гибридные белки и полипептиды, химерные белки и полипептиды, а также фрагменты или участки, или мутанты, варианты или аналоги любого из вышеупомянутых белков и полипептидов также включены среди пригодных белков, полипептидов и пептидов, которые можно продуцировать способами по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении интересующий белок представляет собой гликопротеин, и предпочтительно вирусный белок. Примеры вирусных белков (субъединиц), которые можно продуцировать в способах согласно изобретению, включают без ограничения белки от энтеровируса, такого как риновирус, афтовирус или вирус полиомиелита, вируса герпеса, такого как вирус простого герпеса, вируса псевдобешенства или вируса бычьего герпеса, ортомиксовируса, такого как вирус гриппа, парамиксовируса, такого как вирус псевдочумы птиц, респираторно-синцитиального вируса, вируса эпидемического паротита или вируса кори, ретровируса, такого как вирус иммунодефицита человека, или парвовируса или паповавируса, ротавируса или коронавируса, такого как вирус трансмиссивного гастроэнтерита, или флавивируса, такого как вирус клещевого энцефалита или вирус желтой лихорадки, тогавируса, такого как вирус коревой краснухи или вирус восточного, западного или венесуэльского энцефаломиелита лошадей, вируса, вызывающего гепатит, такого как вирус гепатита А или гепатита В, пестивируса, такого как вирус холеры свиней, или рабдовируса, такого как вирус гидрофобии. Согласно другому воплощению интересующий белок представляет собой бактериальный белок. В другом предпочтительном воплощении интересующий биологический продукт представляет собой антитело. Термин "антитело", как используют здесь, относится к поликлональным и моноклональным антителам и их фрагментам, а также их эквивалентам иммунологического связывания. Термин "антитело" относится к гомогенной молекулярной единице или к смеси, такой как продукт поликлональной сыворотки, полученной из множества различных молекулярных единиц, и широко охватывает природные формы антител (например, IgD, IgG, IgA, IgM, IgE) и рекомбинантные антитела, такие как одноцепочечные антитела, химерные и гуманизированные антитела и полиспецифичные антитела. Термин "антитело" также относится к фрагментам и производным всего вышеуказанного, и может дополнительно включать его любые модифицированные или производные варианты, которые сохраняют способность к специфичному связыванию эпитопа. Производные антитела могут включать белок или химическую группировку, конъюгированные с антителом. Моноклональное антитело способно селективно связывать антиген-мишень или эпитоп. Антитела могут включать, но не ограничены ими, поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), гуманизированные или химерные антитела, камелизованные антитела, одноцепочечные антитела (scFv), Fab фрагменты, F(ab')2 фрагменты, фрагменты Fv (sdFv), связанные дисульфидным мостиком, антиидиотипические (anti-Id) антитела, интратела, синтетические антитела и фрагменты, связывающие эпитоп, любого из вышеуказанного. Термин "антитело" также относится к гибридному белку, который включает область, эквивалентную области Fc-иммуноглобулина. Предпочтительные антитела в пределах объема настоящего изобретения включают те, которые содержат аминокислотные последовательности приведенных ниже антител: антитела анти-HER2, включающие антитела, содержащие вариабельные области тяжелой и легкой цепи huMAb 4D5-8 (Carter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США 5725856) или трастузумаб, такой как Герцептин; антитела анти-CD20, такие как химерное антитело анти-CD20 "С 2 В 8", как в патенте США 5736137 (Ритуксан), химерный или гуманизированный вариант антитела 2 Н 7, как в патенте США 5721108, или тозитумомаб (Бексксар); анти-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993), и Международная публикацияWO 95/23865); антитела анти-VEGF, включающие гуманизированные антитела и/или антитела созревшей аффинности анти-VEGF, такие как гуманизированное антитело анти-VEGF huA4.6.1 Авастин (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Международная публикацияWO 96/30046 иWO 98/45331); антитела анти-PSCA (WO 01/40309); антитела анти-CD40, включая S2C6 и его гуманизированные варианты (WO 00/75348); анти-CDI la (патент США 5622700, WO 98/23761); анти-EGFR(химерное или гуманизированное антитело 225, как в WO 96/40210); антитела анти-CD3, такие как OKT3(см. патент США 5693762); антитела анти-CD4, такие как антитело сМ-7412 (Choy et al. ArthritisRheum 39(1):52-56 (1996; антитела анти-CD52, такие как Кампат-1 Н (Riechmann et al., Nature 332:323337 (1988); антитела против раково-эмбрионального антигена (РЭА), такие как hMN-14 (Sharkey et al.,Cancer Res. 55 (23 Suppl):5935s-5945s (1995); антитела анти-ЕрСАМ, такие как 17-1 А (Панорекс); антитела анти-GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или с 7 Е 3 Fab (Реопро); антитела анти-RSV, такие как MEDI-493(Синагис); антитела анти-CMV, такие как Протовир; антитела против гепатита, такие как антитело антиНерВ Оставир; антитело против почечно-клеточного рака человека, такие как ch-G250; антитело античеловеческий 17-1 А (3622W94); антитело против рака прямой и ободочной кишки человека (А 33); антитело против меланомы человека R24, направленное против ганглиозида GD3; антитело против чешуйчатоклеточной карциномы человека (SF-25); и антитела против человеческого лейкоцитарного антигена(HLA), такие как SmartID10 и антитело анти-HLA DR Онколим (Lym-1). В настоящем изобретении предложен способ продуцирования антитела, при котором культивируют трансфицированную клетку EBx по настоящему изобретению. Культуру клеток EBx можно проводить в средах, содержащих сыворотку, или предпочтительно в средах, свободных от сыворотки и белка. Полученное в результате антитело можно очистить и изготовить его препарат в соответствии со стандартными методиками. Экспрессия обеих цепей Mab по существу в эквимолярных соотношениях обеспечивает оптимальные выходы функционального антитела, которое нужно получить. Трансфицирован- 20017964 ные клетки EBx по изобретению, и более конкретно куриные клетки EBx и утиные клетки EBx,способны продуцировать по меньшей мере 10 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, предпочтительно по меньшей мере 15 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, более предпочтительно по меньшей мере 25 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, даже более предпочтительно по меньшей мере 35 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре. Две цепи собираются внутри клетки, а затем секретируются в культуральную среду в виде функционального антитела. Антитело, гликозилированное клетками EBx, сохраняет антигенсвязывающую способность и эффекторную функциональность. Интересно, что теперь авторы изобретения продемонстрировали, что антитело, фрагмент антитела или гибридные белки, которые включают область, эквивалентную области Fc-иммуноглобулина, продуцируемые способом по изобретению, обладают повышенной Fc-опосредованной клеточной токсичностью. Например, антитело подтипа IgG1, продуцируемое в птичьих клетках EBx, предпочтительно в куриных клетках ЕВ 14, обладает повышенной активностью АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в клетках гибридомы и CHO. Это достигнуто в результате обеспечения интересующих антител паттерном гликозилирования птичьихEBx, более предпочтительно паттерном гликозилирования куриных EBx или паттерном гликозилирования утиных EBx. В частности, трансфицированные птичьи клетки EBx по изобретению дают возможность экспрессии большой доли антител или их фрагмента, несущих общую N-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, который в высокой степени галактозилирован и не фукозилирован и который придает сильную активность АЗКЦ антителам. Среди популяции рекомбинантных антител, продуцируемых в клетках EBx, доля нефукозилированных антител составляет по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 35% и более предпочтительно по меньшей мере 45% антител или выше. Таким образом, в изобретении предложен рекомбинантный полипептид, продуцируемый трансфицированной клеточной линией EBx, предпочтительно линией утиных клеток ЕВ 66, где рекомбинантный полипептид характеризуется как имеющий примерно 20%, более предпочтительно примерно 35% и даже более предпочтительно примерно 45% нефукозилированных N-сшитых олигосахаридных структур. Точнее, в изобретении предложено рекомбинантное моноклональное антитело, продуцируемое трансфицированной клеточной линией EBx, предпочтительно линией утиных клеток ЕВ 66, где указанное антитело характеризуется как имеющее примерно 45% или более нефукозилированных N-сшитых олигосахаридных структур. Указанное антитело характеризуется как имеющее примерно 35% или более нефукозилированных N-сшитых олигосахаридных структур G0, G1 и G2. Изобретение также относится к антителу или популяции антител, продуцируемым в клетке EBx,предпочтительно в утиной клетке ЕВ 66, и обладающим повышенной активностью АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в гибридомной клеточной линии или клеточной линии CHO дикого типа, предпочтительно CHO-K1 и CHO-DG44. Антитело предпочтительно выбрано среди IgG и более предпочтительно среди IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Более предпочтительно антитело представляет собойIgG1 или IgG3. Платформа продуцирования белков клетками EBx, следовательно, полезна для повышенияFc-опосредованной клеточной цитотоксичности против нежелательных клеток, опосредованной иммуноглобулином или его фрагментом или любой биологической молекулой, несущей Fc-область иммуноглобулина или область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина. В изобретении предложена популяция антител (или иммуноглобулина), продуцируемая в клетках EBx и имеющая профиль гликозилирования EBx, где указанная популяция антител или их фрагментов содержит большую долю антител, гдеFc-область несет общую N-сшитую фукозилированную олигосахаридную структуру двухантенного типа,которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, который является галактозилированным, и большую долю антител, где Fc-область несет общую N-сшитую нефукозилированную олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, который являются галактозилированным. Указанная популяция антител характеризуется тем, что имеет примерно 45% нефукозилированных N-сшитых олигосахаридных структур, которые придают сильную активность АЗКЦ указанным антителам. Большинство этих антител, т.е. более чем 60%, предпочтительно более чем 75%,более чем 85% и даже более чем 95% этих антител из популяции антител, продуцируемой в клетках EBx,не содержит остатков сиаловой кислоты на N-сшитой олигосахаридной структуре двухантенного типа,которая сшита с Fc-областью. Большую долю остатков сиаловой кислоты составляет Nацетилнейраминовая кислота (NeuAC); действительно, более чем 80%, предпочтительно более чем 90% и предпочтительно более чем 95% остатков сиаловой кислоты составляет NeuAc, которая, как известно,является не иммуногенной у человека. Остальную небольшую долю остатков сиаловой кислоты составляет N-гликолилнейраминовая кислота (NeuGc). Как используют здесь, термин Fc-опосредованная клеточная цитотоксичность включает антителозависимую клеточную цитотоксичность и клеточную цитотоксичность, опосредованную Fc-гибридным белком, содержащим человеческую Fc-область. Она представляет собой иммунный механизм, приводящий к лизису "клеток-мишеней антитела" "человеческими иммунными эффекторными клетками". "Чело- 21017964 веческие иммунные эффекторные клетки" представляют собой популяцию лейкоцитов, которые проявляют Fc-рецепторы на их поверхности, посредством которых они связываются с Fc-областью антител или Fc-гибридных белков и осуществляют эффекторные функции. Такая популяция может включать, но не ограничена ими, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и/или естественные киллерные (NK) клетки. Клетки-мишени антител представляют собой клетки, связываемые антителами илиFc-гибридными белками. Как используют здесь, термин повышенная Fc-опосредованная клеточная цитотоксичность определяют либо как увеличение числа "клеток-мишеней антител", которые претерпевают лизис в данное время, при данной концентрации антитела или Fc-гибридного белка, в среде, окружающей клетки-мишени, по механизму Fc-опосредованной клеточной цитотоксичности, определенной выше,и/или как снижение концентрации антитела или Fc-гибридного белка в среде, окружающей клеткимишени, необходимой для достижения лизиса данного числа "клеток-мишеней антител", в данное время,по механизму Fc-опосредованной клеточной цитотоксичности. Повышение Fc-опосредованной клеточной цитотоксичности является относительным к клеточной цитотоксичности, опосредованной тем же антителом или Fc-гибридным белком, продуцируемыми другим типом клеток-хозяев, таким как, например, гибридомы, с использованием таких же стандартных способов продуцирования, очистки, изготовления препарата и хранения, которые известны специалистам в данной области техники. Под антителом,обладающим повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), подразумевают антитело, как этот термин определен здесь, обладающее повышенной АЗКЦ, которую определяют любым пригодным способом, известным обычным специалистам в данной области техники. Один из принятых анализов АЗКЦ in vitro состоит в следующем. 1) В анализе используют клетки-мишени, которые известны как экспрессирующие антиген-мишень,распознаваемый участком антитела, связывающим антиген. В анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные из крови случайно выбранного здорового донора, в качестве эффекторных клеток. 2) Анализ проводят в соответствии с приведенным ниже протоколом:i) РВМС выделяют, используя стандартные методики центрифугирования в градиенте плотности, и суспендируют при 5106 клеток/мл в клеточной культуральной среде RPMI;ii) клетки-мишени выращивают стандартными способами культивирования тканей, собирают, начиная с экспоненциальной фазы роста, при выживаемости выше чем 90%, промывают в клеточной культуральной среде RPMI, метят 100 мкКи 51Cr, дважды промывают клеточной культуральной средой и ресуспендируют в клеточной культуральной среде при плотности 105 клеток/мл;iii) 100 мкл вышеописанной конечной суспензии клеток-мишеней переносят в каждую лунку 96 луночного микротитрационного планшета;iv) антитело серийно разводят от 4000 до 0,04 нг/мл в клеточной культуральной среде, и 50 мкл полученных в результате растворов антитела добавляют к клеткам-мишеням в 96-луночном микротитрационном планшете, тестируя в трех повторах различные концентрации антитела, охватывающие весь приведенный выше диапазон концентраций;v) для контролей максимального высвобождения (MB) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, добавляют 50 мкл 2% (об./об.) водного раствора неионного детергента (Nonidet, Sigma, St. Louis) вместо раствора антитела (см. iv) выше);vi) для контролей спонтанного высвобождения (СВ) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, добавляют 50 мкл клеточной культуральной среды RPMI вместо раствора антитела (пункт iv;vii) затем 96-луночный микротитрационный планшет центрифугируют при 50g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4C;viii) 50 мкл суспензии РВМС (см. i) выше) добавляют в каждую лунку для получения отношения эффектор:клетка-мишень 25:1 и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу 5% CO2 при 37 С на 4 ч;ix) собирают свободную от клеток надосадочную жидкость из каждой лунки и количественно определяют экспериментально высвобожденную радиоактивность (ЭР), используя гамма-счетчик; х) процент специфичного лизиса вычисляют для каждой концентрации антитела согласно формуле(ЭР-МВ)/(МВ-СВ)100, где ЭР представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность (см. ix для данной концентрации антитела, MB представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность(см. ix для контролей MB (см. v и СВ представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность(см. ix для контролей СВ (см. vi. 3) "Повышенную АЗКЦ" определяют либо как увеличение максимального процента специфичного лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, тестируемом выше, и/или снижение концентрации антитела, необходимой для достижения половины максимального процента специфичного лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, тестируемом выше. Повышение АЗКЦ является относительным к АЗКЦ, измеренной вышеописанным анализом, опосредованной тем же антителом, продуцируемым другим типом клеток-хозяев, используя те же стандартные способы продуцирования, очистки, изготовления препарата и хранения, которые известны специа- 22017964 листам в данной области техники. Например, антитело подтипа IgG1, продуцируемое способом по изобретению, имеет повышенную активность АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в клетках гибридомы или CHO. Изобретение также относится к клеточной линии EBx, предпочтительно к линии утиных клеток ЕВ 66, полезной для продуцирования рекомбинантных полипептидов, предпочтительно моноклонального антитела, где указанная клеточная линия продуцирует гликозилированные полипептиды, характеризующиеся тем, что они обладают, по существу, сниженным содержанием фукозы по сравнению с тем же полипептидом, продуцируемым с использованием клеточной линии CHO. Примерно 55% или более антитела, продуцируемого клеточной линией ЕВ 66, не содержит фукозилированных олигосахаридных структур по сравнению примерно с 0-20% антитела, продуцируемого в клеточной линии CHO (ЕСАСС Ref.Q6911). Антитела, продуцируемые в клеточной линии ЕВ 66, содержат более высокое количество нефукозилированных форм G0 (15%) и G1 (13%) по сравнению с антителами, продуцируемыми в клеточной линии CHO (G0: примерно 2,5%; G1 примерно 7%). Клеточные линии EBx по изобретению могут быть, кроме того, выбраны по их устойчивости к лектину. Действительно, лектины можно использовать для селекции клеточных линий, экспрессирующих специфичный тип олигосахарида (RipkaStanley, 1986, Somatic. Cell Mol. Gen. 12:51-62). Можно использовать фукозоспецифичный лектин агглютинин Lens culinaris (LCA) для отбора клеточных линийEBx, экспрессирующих даже более низкие уровни фукозы. Например, клетки ЕВ 66 можно высевать в 96 луночные планшеты в среде, свободной от сыворотки, при плотности клеток 5000 клеток/лунка в присутствии различных концентраций лектинов LCA. После 5 суток проверяют выживаемость клеток, и редкие естественные варианты ЕВ 66, экспрессирующие сниженные уровни мРНК фукозилтрансферазыFUT8, можно отбирать и высевать в другой 96-луночный планшет в присутствии 50 мкг/мл LCA. После нескольких недель должны появиться устойчивые клоны EBx, которые можно размножать и характеризовать на их способность к продуцированию рекомбинантных полипептидов со сниженным содержанием фукозы. Настоящее изобретение относится к интересующему биологическому продукту согласно изобретению в качестве лекарства. Более конкретно, изобретение относится к антителу согласно изобретению в качестве лекарства. Более высокая цитотоксическая активность IgG, продуцируемого EBx, даст возможность уменьшить количество антитела, вводимого пациентам, и уменьшить затраты, связанные с лечением. Гликозилированные и негликозилированные продукты EBx (например, вирусные белки, антитела и т.п.) полезны в консервативной терапии для предупреждения и лечения различных расстройств человека и животных. Неограничивающим примером этих расстройств являются вирусные инфекционные заболевания, бактериальные инфекционные заболевания, раки (например, не-ходжкинская лимфома, множественная миелома, меланома и т.д.), инфекционные заболевания (СПИД, герпес, гепатит В, гепатит С и т.п.), аутоиммунные расстройства (например, рассеянный склероз, болезнь трансплантат против хозяина, псориаз, ювенильный диабет, болезнь Шегрена, заболевание щитовидной железы, тяжелая миастения, отторжение трансплантата, астма и т.д.), воспалительные расстройства (например, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и т.п.). В изобретении, таким образом, предложено применение гликозилированных и негликозилированных биологических продуктов EBx (например, антител, вирусных белков и т.п.) при изготовлении лекарственного средства для профилактического и терапевтического лечения любого из вышеупомянутых расстройств. Также предложен способ лечения человека, страдающего любым таким расстройством, при котором указанному индивидууму вводят профилактически или терапевтически эффективное количество гликозилированных и негликозилированных биологических продуктов EBx. Изобретение также охватывает применение биологического продукта согласно изобретению для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболеваний человека и животных. Такие фармацевтические композиции предпочтительно включают, в дополнение к биологическому продукту, физиологически приемлемый разбавитель или носитель, возможно в смеси с другими агентами, такими как, например, антибиотик. Пригодные носители включают, но не ограничены ими,физиологический солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, фосфатно-солевой буферный раствор с глюкозой и буферный солевой раствор. Альтернативно биологический продукт, такой как антитело, может быть лиофилизирован (высушен вымораживанием) и восстановлен для применения при необходимости путем добавления водного буферного раствора, как описано выше. Таким образом, в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая биологический продукт по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Дозировки таких биологических продуктов варьируют в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и от реципиента лечения. Для антитела дозировки, например, находятся в диапазоне от 1 до примерно 100 мг для взрослого пациента, предпочтительно 1-10 мг, обычно вводимые ежесуточно в течение периода между 1 и 30 сутками. Пути введения обычно являются парентеральными, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную и внутрибрюшинную инъекцию или доставку. Приведенные ниже примеры более подробно объясняют изобретение. Приведенные ниже примеры получения и примеры даны, чтобы обеспечить специалиста в данной области техники более четким пониманием и практикой настоящего изобретения. Настоящее изобретение, однако, не ограничено в объеме воплощениями, примеры которых приведены, которые предназначены только в качестве иллюстраций отдельных аспектов изобретения, и способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь станут очевидными специалистам в данной области техники на основании приведенного выше описания и сопроводительных графических материалов. Такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. Для остального описания сделана ссылка на приведенные ниже подписи к графическим материалам. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Исходный экспрессионный вектор без вставок: pVVS431 (pKNexp). Каркас вектора VIVALIS включает одну кассету устойчивости, чтобы дать возможность амплификации плазмиды в E.coli и селекции клонов после трансфекции экспрессионных векторов в клетках птиц. Ген nptII кодирует белок неомицинфосфотрансферазу и придает организму устойчивость к канамицину в прокариотах и к неомицину в эукариотах. Транскрипция направляется как прокариотическими, так и эукариотическими промоторами, клонированными в тандеме слева от гена nptII. кДНК, кодирующие интересующие белки, клонируют в пределах МСК (множественного сайта клонирования), локализованного в пустой экспрессионной кассете, несущей легко заменяемый промотор (т.е. промотор CMV), интрон и участок полиА. Фиг. 2 А и 2 Б. Химерное Mab IgG1 человека-мыши (каппа-легкая и тяжелая цепи) было любезно предоставлено MAT-Biopharma (Evry, France). Фиг. 2 А. Вектор, несущий промотор RSV, направляющий экспрессию легкой цепи IgG1: pVVS452(pRSV-IgG1-L). Фиг. 2 Б. Вектор, несущий промотор RSV, направляющий экспрессию тяжелой цепи IgG1: pVVS450(pRSV-IgG1-H). Фиг. 3 А и 3 Б. Двойные векторы, экспрессирующие как легкую, так и тяжелую цепи IgG1 под контролем промотора RSV. Фиг. 3 А. pVVS455 (pRSV-LH-IgG1). Фиг. 3 Б. pVVS460 (pRSV-HL-IgG1). Фиг. 4. Транзитная экспрессия IgG1 в утиных клетках EBx в среде, свободной от сыворотки.IgG1 был транзитно экспрессирован в утиных клетках EBx. Концентрацию IgG1 определяли с помощью ELISA через 24 и 48 ч после трансфекции. Концентрация антитела достигала примерно 4,5 мкг/мл в надосадочной жидкости клеточной культуры. Фиг. 5. Стабильная трансфекция, выделение клонов и скрининг на продуцирование IgG1. Панель А: Куриные клетки ЕВ 14 трансфицировали экспрессионным вектором IgG1 либо с промотором EF1/HTLV (слева), либо с промотором RSV (справа). 200 устойчивых колоний из трансфектантов куриных клеток ЕВ 14 собирали и пересевали в среду Excell 63066 (SAFC Biosciences), 0,25 мг/мл генетицина. Через 5 суток роста после посева проводили анализ ELISA для анализа продуцирования IgG1 от каждой собранной колонии. Панель Б: Только лучшие продуценты амплифицировали в 24-луночных планшетах. Панель В: Только лучшие продуценты амплифицировали и проводили пассажи в 6-луночных планшетах. Панель Г: Наконец, только лучшие продуценты выращивали до 175 см 2 флакона. Данная панель Г показывает пример продуктивности IgG1, наблюдаемой с помощью анализа ELISA, во время рутинного культивирования одного клона куриных клеток ЕВ 14 (промотор EF1/HTLV). Фиг. 6. Антитело IgG1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ 14 и в утиных клетках ЕВ 66. Фиг. 6 А. Антитело IgG1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ 14, в биореакторе с механическим перемешиванием. Стабильно трансфицированный клон куриных клеток ЕВ 14, экспрессирующий IgG1 (промоторEF1/HTLV), адаптировали к росту в суспензии в свободной от сыворотки среде ExCell (SAFCBioSciences). В 3-литровый биореактор с механическим перемешиванием (Applikon) засевали 0,4 млн клеток/мл. Затем проводили периодическую культуру; клеткам давали возможность расти в течение 13 суток. Клетки ЕВ 14 достигали максимальной плотности клеток 16 млн клеток/мл на сутки 10. Мониторинг концентрации IgG1 в клеточной культуральной среде проводили с помощью анализа ELISA. На сутки 12 максимальная концентрация IgG1 достигала 0,25 г/л. Продуктивность специфичного белка составляет около 10-20 пг/клетка/24 ч. Фиг. 6 Б. Антитело IgG1, продуцируемое в утиных клетках ЕВ 66 в биореакторе с механическим перемешиванием. Стабильно трансфицированный клон утиных клеток ЕВ 66, экспрессирующий IgG1, адаптировали к росту в суспензии в свободной от сыворотки среде ExCell (SAFC BioSciences). В 3-литровый биореактор с механическим перемешиванием (Applikon) засевали 0,4 млн клеток/мл. Затем проводили периодическую культуру; клеткам давали возможность расти в течение 13 суток. Клетки ЕВ 66 достигали максимальной плотности клеток 11 млн клеток/мл на сутки 11. Мониторинг концентрации IgG1 в клеточной культуральной среде проводили с помощью анализа ELISA. На сутки 11 максимальная концентрацияIgG1 достигала 0,07 г/л. Фиг. 7 А и 7 Б. Профиль гликозилирования антитела IgG1, продуцируемого в куриных клетках EBx. Фиг. 7 А. Анализ с помощью капиллярного электрофореза. Профиль гликозилирования IgG1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ 14, подобен профилю человеческих сывороточных молекул IgG. Фиг. 7 Б. Анализ с помощью масс-спектроскопии. Процент бесфукозного антитела IgG1 достигал 48% популяции антитела, продуцируемой в куриных клетках ЕВ 14, против только 2% антитела, продуцируемого в клетках CHO (данные из литературы). Фиг. 8. Подробный профиль гликозилирования антитела IgG1, продуцируемого в куриных клеткахEbx. Профиль гликозилирования IgG1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне куриных клеток ЕВ 14, анализировали с помощью анализа времяпролетного спектра ионизации лазерной десорбцией из матрицы (Maldi-Toff). Анализировали структуру N-олигосахарида, присоединенного к домену СН 2 каждой тяжелой цепи IgG1 при остатке Asn 297. Большинство антител IgG1, продуцируемых в этом курином клоне ЕВ 14, имело общую N-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, который является галактозилированным. Важная часть (48%) популяции антител IgG1 не является фукозилированной. Некоторая популяция имеет N-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа с делящим пополам GlcNac. Фиг. 9. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток антителом IgG1, продуцируемым в куриных клетках Ebx. Был разработан анализ для измерения активности ингибирования клеточной пролиферации иммуноглобулина IgG1, продуцируемого либо в куриных клетках ЕВ 14, либо в гибридоме. Антитело IgG1 направлено против маркера CD, экспрессируемого на поверхности человеческих опухолевых клеток. Опухолевые клетки выращивали в присутствии тритированного тимидина и инкубировали с моноцитами или естественными киллерными Т клетками, очищенными от нормального пациента, в присутствии иммуноглобулина IgG1. Этот анализ измеряет количество тритированного тимидина, включенного в пролиферирующие опухолевые клетки как следствие опосредованного IgG1 лизиса опухолевых клеток естественными киллерными клетками. После 4 суток в культуре низкое количество тритированного тимидина было включено в опухолевые клетки, обработанные NK клетками и антителом IgG1, продуцируемым в куриных клетках ЕВ 14, что указывает на то, что опухолевые клетки не пролиферируют. Напротив, высокий уровень Н 3-тимидина наблюдали в опухолевых клетках, обработанных клетками NK или моноцитами и антителом IgG1, продуцируемым в гибридоме, что указывает на то, что опухолевые клетки пролиферируют. IgG1, продуцируемый в куриных клетках ЕВ 14, проявляет лучшую клеточную антипролиферативную активность, чем то же антитело, продуцируемое в гибридоме. Фиг. 10. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела IgG1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ 14, по сравнению с клетками CHO. Стандартный анализ АЗКЦ проводили, используя естественные киллерные клетки от двух здоровых доноров. Клетки NK культивировали либо без интерлейкина 2 (IL-2), либо с 5 или 100 единицами IL-2. Опухолевые клетки, предварительно культивированные с радиоактивным хромом, инкубировали с иммуноглобулином IgG1 и клетками NK. Активность АЗКЦ оценивали как % высвобождения хрома в среду. Опухоль: Отрицательный контроль. Опухоль + противоопухолевый IgG1 из гибридомы (не химеризованный): Положительный контроль. Опухоль + противоопухолевый IgG1, продуцируемый в CHO. Опухоль + противоопухолевый IgG1, продуцируемый в куриных клетках ЕВ 14. Антитело IgG1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ 14, проявляет более высокую активность АЗКЦ по сравнению с тем же антителом IgG1, продуцируемым в клетках CHO. Фиг. 11. Анализ роста прикрепленных куриных клеток EBx, экспрессирующих антиапоптический ген NR13. Панель А: Описание векторов pVVS437 и pVVS438. pVVS437 несет только ген устойчивости к пуромицину. PWS438 дает возможность экспрессии устойчивости к пуромицину и куриного антиапоптического гена NR13. Прикрепленные куриные клетки EBx (ЕВ 45) трансфицированы векторами pVVS437 или pVVS438 и проведена селекция на эти клетки. Панель Б: Клоны объединили в популяцию или выделили и провели ОТ-ПЦР, используя суммарную РНК, выделенную из этих популяций или клонов, для обнаружения экспрессии гена NR13. Данная панель показывает, что клоны В 2, В 3 и С 1 экспрессируют антиапоптический ген NR13. Панель В: Анализ роста прикрепленных куриных клеток EBx (ЕВ 45), стабильно трансфицированных антиапоптическим геном NR13. Стабильно трансфицированные клетки EBx, которые экспрессируют белок NR13, культивировали при прикреплении в 100 мм чашках. Клетки EBx, которые не экспрессируют белок NR13, не выживают в культуре, и большинство их погибает после 6-7 суток в культуре. Только небольшая и стабильная доля EBx, экспрессирующих белок NR13, погибает в культуре, а большинство клеток NR13 EBx остается живым в течение более длительного периода времени в культуре. Фиг. 12. Профили гликозилирования антитела IgG1, продуцируемого в утиных клетках ЕВ 66 и в клетках CHO. Профиль гликозилирования IgG1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне утиных клеток ЕВ 66 и в клетках CHO, анализировали с помощью масс-спектрометрического анализаMALDI TOF. Анализировали структуру N-олигосахарида, присоединенного к домену СН 2 каждой тяжелой цепи IgG1 при остатке Asn 297. Большинство антител IgG1, продуцируемых в данном утином клоне ЕВ 66, имеет общую N-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым GlcNac, который является галактозилированным. Важная часть (примерно 55%) продуцируемой ЕВ 66 популяции антител IgG1 является нефукозилированной. Небольшая доля продуцируемой CHO популяции антител IgG1 не является фукозилированной (примерно 20%). Фиг. 13. Масс-спектрометрический анализ N-сшитых олигосахаридов, присоединенных к домену СН 2 тяжелой цепи IgG1 при остатке Asn 297, продуцируемого в утиных клетках ЕВ 66 или в клеткахCHO. Олигосахариды антитела Fc, высвобожденные путем расщепления PNG-азой F, были перметилированы и проанализированы с использованием МС MALDI-TOF в режиме положительного иона, используя матрицу DHB. Были обнаружены 3 основные гликоформы на IgG, продуцируемом обеими клеточными линиями, где продуцируемый ЕВ 66 IgG содержит более высокий процент нефукозилированных форм G0 и G1 по сравнению с CHO-продуцируемым IgG. Фиг. 14. Таблица процентного содержания трех основных фукозилированных и нефукозилированных гликоформ G0, G1 и G2 одного и того же антитела IgG1, продуцируемого в клетках ЕВ 66 и CHO Олигосахариды антитела Fc, высвобожденные путем расщепления PNG-азой F, были перметилированы и проанализированы с использованием МС MALDI-TOF в режиме положительного иона, используя матрицу DHB. Были обнаружены 3 основные гликоформы на IgG, продуцируемом обеими клеточными линиями. Продуцируемый ЕВ 66 IgG содержит более высокий процент нефукозилированных форм G0 иG1 по сравнению с CHO-продуцируемым IgG. Фиг. 15 А, 15 Б. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела IgG1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ 14, утиных клетках ЕВ 66 и клетках CHO. Фиг. 15 А. Активация клеток NK (Анализ клеток, секретирующих ИФН-). Активацию естественных киллерных клеток IgG1 оценивали путем обнаружения ИФН- с помощью проточной цитометрии. Клетки NK от двух здоровых доноров культивировали без интерлейкина 2 (IL-2) или с 5 или 100 единицами IL-2. Опухолевые клетки инкубировали с иммуноглобулином IgG1 и клетками NK. Обнаружение ИФН- измеряли путем внутриклеточного окрашивания анти-ИФН-, конъюгированного с фикоэритрином (ФЭ). Антитело IgG1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ 14 и утиных клетках ЕВ 66, проявляет более высокую активацию NK по сравнению с тем же антителом IgG1, продуцируемым в клетках CHO. Фиг. 15 Б. Активация клеток NK (Анализ CD107-положительных клеток). Активацию естественных киллерных клеток IgG1 оценивали путем анализа мобилизации CD107 с помощью проточной цитометрии. Клетки NK от двух здоровых доноров культивировали без интерлейкина 2 (IL-2) или с 5 или 100 единицами IL-2. Опухолевые клетки инкубировали с иммуноглобулиномIgG1 и клетками NK. Антитела анти-CD107, конъюгированные с ФИТЦ, использовали для обнаружения активированных клеток NK. Антитело IgG1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ 14 и утиных клетках ЕВ 66, проявляет более высокую активацию NK по сравнению с тем же антителом IgG1, продуцируемым в клетках CHO. Фиг. 16. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела IgG1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ 14, утиных клетках ЕВ 66 и клетках CHO. Стандартный анализ АЗКЦ проводили, используя очищенные естественные киллерные клетки от здорового донора. Клетки NK культивировали либо без интерлейкина 2 (IL-2), либо с 100 единицами IL2. Опухолевые клетки, предварительно культивированные с радиоактивным хромом, инкубировали с иммуноглобулином IgG1 при различных концентрациях в диапазоне от 0,8 до 5 мкг/мл и клетками NK. Активность АЗКЦ оценивали как % высвобождения хрома в среду. При не ограничивающих условиях ( 50 мкг/мл антитела) продуцируемый ЕВ 66 и ЕВ 14 IgG1 более эффективен по индукции киллинга опухолевых клеток, чем то же антитело, продуцируемое в клетках Фиг. 17. Потенциальная гетерогенность двухантенных олигосахаридных структур, присоединенных к домену СН 2 каждой тяжелой цепи IgG (при остатках Asn 297 для человеческих IgG). Фиг. 17 А. Маннозил-хитобиозная сердцевина (Man3-GlcNac2) показана сплошной темной линией, а дополнительные сахарные остатки, которые могут присутствовать (+/-), связаны с сердцевиной Man3GlcNac2 пунктирной линией. Фиг. 17 Б. Диаграмма N-сшитых двухантенных олигосахаридных структур комплексного типа, присоединенных к домену СН 2 каждой тяжелой цепи при остатках Asn 297 для человеческих IgG. Примеры Пример 1. Линия куриных клеток EBv13 от линии кур SPF VALO. 1.1. Сырье. Яйца. Свободную от особых патогенов (SPF) линию назвали Valo. Линия Valo представляет собой линию белых леггорнов, полученную и доставленную Lohmann из Германии. Яйца этих кур SPF, снабженные сертификатом анализа, тестируют на CAV, птичьи аденовирусы (группа 1, серотипы 1-12 и группа 3),EDS, вирус энцефаломиелита птиц, вирус лейкоза птиц/RSV (включая серотип ALV-J), вирус нефрита птиц, птичьи реовирусы, вирус оспы кур, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита(IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус гриппа типа А, вирус болезни Марека, микоплазмоз (Mg + Ms), Mycobacterium avium, вирус псевдочумы птиц, вирус ретикулоэндотелиоза, Salmonellapullorum, другие инфекции Salmonella, вирус ринотрахеита птиц (ART), Hemophilus paragallinarum. Яйца кур Valo подвергали только дезинфекции дезинфицирующим средством во избежание какого-либо риска заражения, связанного с манипуляцией с яйцами во время перевозки. Фидерные клетки. На первой стадии способа основания EBv13 клетки мышиного происхождения (клетки STO) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки подвергают митотической инактивации гамма-облучением (45-55 Грей) перед высевом на пластик. Эта доза облучения представляет собой сублетальную дозу, которая индуцирует полную остановку клеточного цикла, но все же дает возможность продуцирования факторов роста и внеклеточного матрикса, необходимых для стимуляции клеточного роста недифференцированных клеток. Клеточная линия STO была выделена A. Bernstein, Институт рака Онтарио, Торонто, Канада, из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов SIM (инбредные мыши Сандоз), и она была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер продукта STO: CRL-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили дважды в неделю, как правило, в понедельник и в среду. Экспоненциальные клетки диссоциировали и считали. Часть клеток высевали для поддержания жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения авторы изобретения готовили клеточную суспензию 10106 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали воздействию дозы 45-55 Грей и высевали на пластик. После высева чашки или планшеты, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 суток. Среда.EX-CELL 65195, 60947 и 65319 (SAFC, среда, изготовленная на заказ). Добавки. Глутамин (Cambrex,по каталогу ВЕ 17-605 Е). Пенициллин/стрептомицин (Cambrex,по каталогу ВЕ 17-602 Е). Заменимые аминокислоты (Cambrex,по каталогу ВЕ 13-114 Е). Пируват натрия (Cambrex,по каталогу ВЕ 13-115). Витамины (Cambrex,по каталогу 13-607 С). Бета-меркаптоэтанол (Sigma,по каталогу М 7522). Буфер и фиксаторы. ФСБ 1 Х (Cambrex,по каталогу BE17-516F). Параформальдегид 4% (Sigma,по каталогу Р 6148). Факторы. Использовали два различных рекомбинантных фактора: рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ) (Peprotech Inc, по каталогу 450-13); рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста I (ИФР 1) (Peprotech Inc, по каталогу 100-11). Эти факторы продуцировали в бактериях Е.coli. Фетальная бычья сыворотка. Необлученная фетальная бычья сыворотка (ФБС) (JRH,по каталогу 12103). Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и изготавливали в США. Животные, использованные для сбора, были обследованы министерством сельского хозяйства США и приемлемы для убоя. Эту сыворотку добавляли в среду во время культуры птичьих стволовых клеток. Данную партию не подвергали облучению во избежание разрушения критических белков или компонентов, идентифицированных как незаменимые для поддержания стволовых клеток в культуре. Облученная сыворотка (JRH,по каталогу 12107). Облученную партию, используемую в данной программе, также собирали в США. Эту облученную партию добавляли в качестве добавки в среду DMEM, используемую для культуры клеток STO или FED(фидерных клеток). Эти клетки не требуют, как стволовые клетки, специального качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Для минимизации высокой концентрации сыворотки в среде авторы изобретения адаптировали клетки STO к росту в присутствии только 4% ФБС. Диссоциирующие агенты. Проназа (Roche,по каталогу 165 921). Проназа представляет собой рекомбинантную протеазу, изготавливаемую Roche Diagnostics, Германия, используемую для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток. Трипсин ЭДТА (Cambrex,по каталогу ВЕ 17-161 Е). Трипсин используют для диссоциации клеток STO или FED и при поздних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к среде, свободной от сыворотки. Данный фермент свиного происхождения изготавливают асептически в соответствии со справочными условиями текущих правил организации производства и контроля качества лекарственных средств утвержденным способом стерильного фильтрования и тестируют в соответствии с современной Европейской Фармакопеей. Сырье, облученное перед изготовлением препарата, тестируют на свиной парвовирус в строгом соответствии с 9/Свод Федеральных правил 113.53. Неферментативный раствор для диссоциации клеток (Sigma,по каталогу С 5914). Данный агент диссоциации представляет собой готовый к употреблению препарат, используемый для мягкого открепления клеток от поверхности выращивания культурального сосуда. Его состав не содержит белок и дает возможность извлечения клеток без использования ферментов. Клеточные белки сохраняются, создавая возможность для иммунологических исследований, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Данный фермент использовали для открепления клеток перед анализом FACS (клеточным сортером с возбуждением флуоресценции) биологических маркеров, подобных ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и SSEA1 (стадиеспецифический эмбриональный антиген-1). 1.2. Способ основания клеточной линии EBv13. Яйца вскрывают, желток отделяют от белка во время вскрытия. Эмбрионы выделяют из желтка либо непосредственно с помощью пастеровской пипетки, либо с помощью мало абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумаги Whatmann 3 М), предварительно нарезав ее в форме перфорированного кольца с помощью пуансона. Диаметр перфорации составлял примерно 5 мм. Эти малые кольца стерилизовали,используя сухое тепло, в течение примерно 30 мин в печи. Это малое бумажное кольцо откладывают на поверхности желтка и центрируют на эмбрионе, который, таким образом, окружен бумажным кольцом. Затем последний вырезают с помощью маленьких ножниц и полностью извлекают и помещают в чашку Петри, заполненную ФСБ или физиологическим солевым раствором. Эмбрион, таким образом, вынесенный с помощью кольца, очищают от избытка желтка в среде, и эмбриональный диск, следовательно, свободный от избытка вителлина, собирают пастеровской пипеткой. Куриные эмбрионы Valo помещали в пробирку, содержащую физиологическую среду (1 Х ФСБ,Трис, глюкоза, среда и т.п.). Затем эмбрионы Valo механически диссоциировали и инокулировали на слое фидерных клеток STO в полной культуральной среде при 39 С. Фидерные клетки высевали в флакон примерно при 2,7104 клеток/см 2. Полная культуральная среда состоит из базовой коммерческой среды DMEM-HamF12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, с ИФР 1 и ЦНТФ при конечной концентрации 1 нг/мл, и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ, с исходной смесью антибиотиков, содержащей пенициллин при конечной концентрации 100 ед./мл и стрептомицин при ко- 28017964 нечной концентрации 100 мкг/мл. Вскоре после первых пассажей клеток смесь антибиотиков больше не добавляли в среду. Выражение вскоре понимают как означающее после первых 3-5 пассажей в целом. Когда птичьи ЭС клетки из куриных эмбрионов Valo переносят из одного культурального флакона в другой, засев культуральных флаконов проводят примерно между 7104/см 2 и 8104/см 2 птичьих ЭС клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно засев осуществляют примерно 7,3104/см 2(4106 клеток/55 см 2 или 4106 клеток/чашка 100 мм). Птичьи клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки стадии а), культивируют в течение нескольких пассажей в полной среде. При пассаже 15 полную среду истощают по факторам роста ИФР 1 и ЦНТФ. Истощение проводят непосредственно в одну стадию, от одного пассажа до другого. Эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки, культивируют в течение нескольких пассажей в полной среде без факторов роста ИФР 1 и ЦНТФ. Затем проводят истощение фидерных клеток после истощения факторов роста ИФР 1 и ЦНТФ путем прогрессивного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Практически одну и ту же концентрацию фидерных клеток использовали для 2-4 пассажей, затем более низкую концентрацию фидерных клеток использовали для дополнительных 2-4 пассажей и т.д. Флакон первоначально засевали примерно 2,7104 фидерных клеток/см 2, затем примерно 2,2104 фидерных клеток/см 2,затем примерно 1,8104 фидерных клеток/см 2, затем примерно 1,4104 фидерных клеток/см 2, затем примерно 1,1104 фидерных клеток/см 2, затем примерно 0,9104 фидерных клеток/см 2, затем примерно 0,5104 фидерных клеток/см 2. Затем флакон засевали от 6,5104 птичьих клеток/см 2 до 7,5104 птичьих клеток/см 2 и без фидерных клеток. Истощение фидерных клеток начинали примерно при пассаже 21 и заканчивали примерно при пассаже 65. Во время истощения фидерных клеток куриные ЭС клетки Valo высевали в культуральный флакон при более низкой концентрации, чем на стадии а), примерно от 4104 клеток/см 2 до 5104 клеток/см 2. При предположении, что клетки ЭС Valo находятся не в очень хорошей форме после снижения концентрации фидерных клеток во флаконе, тогда птичьи клетки культивируют в течение дополнительных пассажей с той же концентрацией фидерных клеток, после чего продолжают истощение фидерных клеток. Истощение сыворотки проводили после истощения факторов роста и фидерных клеток. В начале истощения сыворотки культуральная среда состояла из базовой коммерческой среды DMEM-HamF12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бетамеркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ. Куриные клетки Valo адаптировали к росту в среде, свободной от сыворотки, в двухстадийном процессе: во-первых, куриные клетки Valo быстро адаптировали к культуральной среде, состоящей из коммерческой среды, свободной от сыворотки (SFM), предпочтительно ExCell 60947 (SAFC Biosciences) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бетамеркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ. Как только была проведена эта быстрая адаптация к новой среде (DMEM-HamF12 на Excell 60947), проводят вторую стадию, состоящую в том, что начинают медленной адаптации к снижению концентрации животной сыворотки в среде SFM. Истощение сыворотки проводили путем прогрессивного снижения,начиная с 10% сыворотки, затем 7,5, затем 5, затем 2,5, затем 1,25, затем 0,75% концентрации сыворотки в клеточной культуральной среде SFM с конечным достижением 0% сыворотки в клеточной культуральной среде SFM. Истощение сыворотки начинали при пассаже 103 и заканчивали при пассаже 135. В конце процесса истощения сыворотки, когда остаточная концентрация сыворотки в среде SFM составляла либо 0,75%, либо 0%, начинали адаптацию зависимых от культуральной подложки клетокEBv13 к суспензионной культуре. Среди нескольких попыток, предпринятых для выделения изолятовEBv13, независимых от культуральной подложки, 62,5% попыток были успешными и дали возможность получить различные изоляты суспензионных клеток EBv13. Один изолят клеток EBv13 был отобран в соответствии со временем удвоения популяции (примерно 18 ч), оптимальной концентрации клеток во флаконной культуре (примерно 4 млн клеток/мл), жизнеспособности клеток, гомогенности клеточной культуры (присутствия и размера агглютинированных клеток) и легкости манипуляции с клетками. В конце истощения сыворотки куриные клетки Valo, зависимые от культуральной подложки, названные EBv13, были способны расти в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в среде, свободной от сыворотки. Затем клетки EBv13 адаптировали к росту при 37C путем прогрессивного снижения температуры клеточной культуры на 0,5C сутки.