Способ получения липазы, трансформированная клетка yarrowia lipolytica, способная продуцировать указанную липазу, и их применение

LIPOLYTICA, СПОСОБНАЯ ПРОДУЦИРОВАТЬ УКАЗАННУЮ ЛИПАЗУ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В изобретении представлен способ получения кислотоустойчивой рекомбинантной липазыYazrowia lipolytica, в котором используется культуральная среда без каких-либо продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, таких как триптон, пептон или молочная сыворотка, а также его применение. Рекомбинантный штамм Yarrowialipolytica, продуцирующий повышенное количество липазы Lip2, обозначенный YL-LIP2-6C и депонированный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M.), под номером Настоящее изобретение относится к способу получения липазы с использованием клеток дрожжейYarrowia lipolytica, продуцирующих кислотоустойчивую рекомбинантную липазу, причем указанный способ обеспечивает получение липазы, которая может быть применена в качестве лекарственного средства, настоящее изобретение также относится к штамму Yarrowia lipolytica, суперпродуценту кислотоустойчивой рекомбинантной липазы и к ее применениям. Пищевые продукты, ежедневно употребляемые людьми, состоят главным образом из липидов, белков и сахаров. Все перечисленные элементы подвергаются, перед их всасыванием, гидролизу, катализированному ферментами пищеварительного тракта. Поэтому нехватка какого-либо из указанных ферментов может вызвать расстройства пищеварения и привести к значительной недостаточности питания. Это,например, является причиной некоторых патологических состояний, таких как кистозный фиброз или экзокринная недостаточность поджелудочной железы, которые связаны с дефицитом панкреатической липазы. Обычно, чтобы устранить указанный дефицит, предлагают принимать вовнутрь экстракты поджелудочной железы. Однако эффективность подобной терапии ограничена тем, что ферменты, содержащиеся в указанных экстрактах (липазы, амилазы и протеазы) быстро инактивируются в кислой среде желудка. Поэтому было предложено использовать препараты липазы, которые являются устойчивыми в среде желудка, такие как, например, желудочные препараты липазы млекопитающих, полученные с помощью генной инженерии, такие как описанные в патенте Франции, опубликованном под номером 2699179, от имени INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA, или препараты микробных липаз, обладающие достаточной активностью в кислой среде [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)]. Из микробных липаз, которые являются активными в кислой среде, можно упомянуть, в частности,грибковые липазы, такие как липазы из Candida ernobii [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta.; 154,586-588 (1968)], из Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116(1997)], из Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)] или из Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)]. В дополнение к их активности при кислом рН указанные липазы имеют общие свойства являться устойчивыми в присутствии своих субстратов к расщеплению протеазами (трипсином, химотрипсином и пепсином) и являться устойчивыми к действию солей желчи (их активность сохраняется в присутствии 10 мМ таурохолата натрия). Использование Yarrowia lipolytica для получения целевого гена уже было описано. Таким образом, в заявке ЕР 1108043, от имени INRA и CNRS, описано применение интегративного вектора, включающего кассету экспрессии, несущую целевой ген и дзэтапоследовательности, соответствующие LTR-последовательностям ретротранспозона Ylt Yarrowialipolytica. Такой экспрессионный вектор обеспечивает негомологичную и случайную интеграцию нескольких копий целевой вставки в геномную ДНК штамма Yarrowia lipolytica без дзэтапоследовательности. Указанная система использовалась, в частности, для интеграции гена LIP2, кодирующего липазу, в ДНК Yarrowia lipolytica и обеспечивала, в условиях культивирования, которые не уточнялись, секрецию липазы на уровне в 10-15 раз выше по сравнению с нетрансформированными штаммами. В других работах описано применение такого же экспрессионного вектора, как и в заявке ЕР 1108043, связанной с получением рекомбинантной липазы в Yarrowia lipolytica (Международная заявкаal., Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, No. 8, p. 3283-3289 (2000. Так, например, в Международной заявке WO 01/83773, от имени Laboratoires MAYOLY SPINDLER,описано получение клона MS4 Yarrowia lipolytica (CNCM I-2294), включающего 10 копий кассеты экспрессии гена LIP2, интегрированных в его ДНК, а также его применение в получении липазы с выходом порядка 0,5 г липазы на 1 л культуры и каталитической активностью 12000 Е/мл, измеренной с использованием оливкового масла в качестве субстрата, при этом одна единица соответствует количеству фермента, способного катализировать образование 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин, другими словами в 200 раз больше по сравнению с исходным штаммом. Впрочем, способ получения липазы, описанный в данной заявке, имеет большой недостаток, так как в нем используются культуральные среды, содержащие бактопептон или бактотриптон. Указанные продукты, которые не описаны и содержат различные белковые гидролизаты, обычно используются в качестве источника азота и углерода. Следовательно,способ, описанный в данной заявке, не позволяет получать липазу, которая может непосредственно использоваться в качестве лекарственного средства. В работе PIGNEDE et al. (Journal of Bacteriology, 2000) более подробно описана внеклеточная липаза, кодируемая геном LIP2 Yarrowia lipolytica (штамм PO1d). В данной статье изучено следующее: секреция липазы в различных штаммах дикого типа (PO1d, в котором отсутствует Ylt1, и Е 150, в котором Ylt1 присутствует) и в различных рекомбинантных штаммах, включая JMY184 (POld-6-15) и JMY279 (PO1d6-17), и оверпродукция липазы, в частности, трансформантом JMY184. В указанной статье PIGNEDE etal. сравнивается продукция липазы штаммами дикого типа, мутантными штаммами и рекомбинантными штаммами, полученными согласно вышеописанному способу (Международная заявка WO 01/83773). Штаммы дикого типа секретируют 30-50 Е липазы/мл, тогда как мутантные штаммы, полученные путем воздействия N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (NNNG), продуцируют в 25 раз больше липазы, то есть 1200 Е/мл при оптимальных условиях культивирования, включающих среду, содержащую пептон(среда для прекультуры) и среду, содержащую молочную сыворотку (среда ферментации) (также см.DESTAIN et al., 1997). Рекомбинантные штаммы получают при помощи конструкции, включающей генLIP2, регулируемый РОХ 2-промотором, и посредством негомологичной интеграции, мультикопийной и случайной, указанной кассеты экспрессии. PIGNEDE et al. получили стабильные трансформанты (например, штамм JMY184), которые продуцируют 2000 Е/мл при неоптимизированных условиях, то есть в среде YPDH (включающей 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л бактопептона, 10 г/л глюкозы и 10 г/л оливкового масла), что соответствует приблизительно 0,5 г липазы/л культуры. Также как и выше, препараты липазы, описанные PIGNEDE et al. и DESTAIN et al., не подходят для применения в медицине, а более конкретно для приготовления лекарственных препаратов, так как их производство требует использования культуральных сред, содержащих пептоны или сыворотки. Продолжая свою работу, группа PIGNEDE (Applied and Environmental Microbiology, 2000) изучила штаммы Yarrowia lipolytica, трансформированные вектором, включающим кассету экспрессии гена LIP2. Авторы установили, что в 8 из полученных трансформантов число копий кассеты экспрессии гена LIP2 составило 6-16 (10 копий в среднем), что приводит к 2-15 актам интеграции указанной кассеты в различные локусы. Штамм JMY184, таким образом, включает 12 копий кассеты экспрессии гена LIP2, интегрированной в 4 различных локуса. Авторы, кроме того, более конкретно изучили данный трансформантJMY184. Они подтвердили, что штамм JMY184 продуцирует 0,5 г липазы/л культуры с активностью 1500 Е/мл на богатой среде YPDH (которая содержит бактопептон) (по сравнению с 50 Е/мл для штамма дикого типа PO1d), что измеряли с использованием оливкового масла в качестве субстрата. Указанные значения позволяют рассчитать специфическую активность, соответствующую приблизительно 3000 Е/мг липазы. Авторы дополнительно указывают, что оптимизированная продукция липазы в ферментере с использованием штамма JMY184 позволяет получить препараты, обладающие активностью до 10000 Е/мл. Однако условия культивирования, которые обеспечили данный результат, не описаны. В данной статье авторы дополнительно изучили стабильность полученных трансформантов, в частности клонаJMY184, в культуре и показали их стабильность в 120 поколениях. PIGNEDE et al. предположили, что при оптимизации продукции липазы основными факторами, которые следует принять во внимание, являются стабильность трансформантов и условия культивирования. Кроме того, они показали, что между числом копий интегрированного гена LIP2 и оверпродукцией липазы существует существенная корреляция. Однако для продукции липазы единственными культуральными средами, указанными в данной статье, являлись среды, которые содержат пептоны, например богатая среда YPDH. Способы получения липазы из предыдущего уровня техники, даже при том, что они позволяют получать липазу с повышенными выходами, не подходят для производства липазы, используемой в медицинских целях. Фактически, все обычно используемые микробиологические среды содержат неохарактеризованные смеси и/или продукты животного происхождения, такие как пептоны, триптоны или молочную сыворотку. Таким образом, существует потребность в разработке системы, позволяющей получать препараты рекомбинантной липазы, подходящей для применения в медицине. В целях решения указанной проблемы авторы настоящего изобретения разработали способ получения липазы, который лучше соответствует указанным требованиям, чем способы получения липазы предыдущего уровня техники. Более конкретно, авторы настоящего изобретения разработали способ получения липазы, в котором используемая культуральная среда не содержит вышеуказанных продуктов, то есть не содержит каких-либо продуктов животного происхождения и каких-либо неохарактеризованных смесей, таких как пептон, триптон или молочная сыворотка. Авторы настоящего изобретения дополнительно выбрали новый рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica, продуцирующий липазу Lip2, который, при объединении с указанным способом, дополнительно позволяет значительно повысить выход продуцируемой липазы. Таким образом, целью настоящего изобретения является способ получения липазы с использованием штамма Yarrowia lipolytica, трансформированного вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы, отличающийся тем, что используемая культуральная среда не содержит продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, таких как пептон, триптон или молочная сыворотка. Более конкретно, целью настоящего изобретения является способ получения липазы, включающий:a) стадию культивирования клеток Yarrowia lipolytica, трансформированных экспрессионным вектором, включающим кассеты экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы, в условиях, обеспечивающих продукцию липазы;b) стадию выделения полученной таким образом липазы из супернатанта указанной культуры,при этом указанный метод отличается тем, что стадию а) культивирования проводят в среде, не содержащей продукты животного происхождения или неохарактеризованные смеси, состоящие из белковых материалов животного происхождения (например, молочной сыворотки) или продуктов их фермен-2 017963 тативного расщепления (например, триптона или пептона). Согласно предпочтительному варианту осуществления указанного способа указанная культуральная среда согласно стадии а) включает в качестве источника азота неорганический азот и предпочтительно сульфат аммония; источник углерода, выбранный из источников углерода углеводной природы, многоатомных спиртов, таких как глицерин, а также источников углерода липидной природы, таких как жирные кислоты и ацилглицерины; и неорганические соли, микроэлементы и витамины. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления указанного способа стадия а) включает:a1) стадию прекультивирования трансформированных клеток Yarrowia lipolytica, как определено выше, в среде, содержащей источник углерода углеводной природы; и а 2) стадию ферментации с указанными клетками, включающую фазу роста клеток в среде, содержащей источник углерода углеводной природы, и фазу синтеза липазы в среде, содержащей в качестве единственного источника углерода жирную кислоту, выбранную из триглицеридов с короткой, средней или длинной цепью. Таким образом, ферментацию выполняют, во-первых, для того, чтобы обеспечить рост клеток, например, в присутствии источника углерода углеводной природы, и, во-вторых, при условиях, обеспечивающих биосинтез указанной липазы, например, в присутствии в качестве единственного источника углерода химического индуктора жирно-кислотного типа, такого как триглицерид с короткой цепью (например, трибутирин), триглицерид со средней цепью (например, триоктаноин или триоктаноилглицерин) или триглицерид с длинной цепью (например, оливковое масло или триолеин). Предпочтительно ферментацию проводят при постоянном рО 2 от 15 до 25% и рН предпочтительно меньше 6,5. Ферментация может быть проведена, например, при расходе воздуха приблизительно 1 vvm,где одна единица vvm соответствует 1 об. воздуха на 1 об. жидкости в 1 мин (например, для 30 литрового ферментера 1 vvm равна 30 л/мин, а для 5-литрового ферментера 1 vvm равна 5 л/мин). Согласно существенному признаку указанного варианта осуществления стадию a1) прекультивирования выполняют до достижения показателя OD600 3-10 в 1 мл, а в стадии а 2) ферментации указанная фаза синтеза липазы начинается, когда OD600 культуры достигает значения 60-70 в 1 мл. Согласно другому существенному признаку указанного варианта осуществления стадию b) начинают, когда OD600 достигает значения 300-350 в мл. Стадия b) может дополнительно включать:b1) выделение липазы из указанного супернатанта культуры;b2) очистку липазы, полученной в b1). Указанные две стадии выполняют обычными способами, известными как физическое разделение(фильтрация, хроматография, центрифугирование) или физико-химическое разделение (осаждение). Выделение липазы из супернатанта может быть выполнено специалистом, квалифицированным в данной области техники, например с использованием методики, выбранной из тангенциальной фильтрации через полое волокно, фронтальной фильтрации и непрерывного или периодического центрифугирования. Очистка липазы заключается, в частности, в уменьшении биопримесей, то есть присутствия микроорганизмов, и может быть выполнена с помощью любой подходящей методики очистки, известной квалифицированному специалисту, например с помощью методики, выбранной из фильтрации, фракционного осаждения, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и гельфильтрационной хроматографии. Необязательно, способ получения липазы согласно настоящему изобретению может также включать стадию концентрирования или обогащения, состоящую из повышения концентрации липазы в препарате. Такая стадия может быть проведена, например, после стадии очистки. Также она может проводиться одновременно с указанной стадией очистки. Способ получения согласно изобретению позволяет, в частности, получать рекомбинантную липазу в количествах приблизительно 1-3 г очищенной липазы на 1 л супернатанта культуры. В особенно предпочтительном варианте способ согласно изобретению обеспечивает получение препарата рекомбинантной липазы с каталитической активностью более 15000 Е/мл супернатанта культуры. Предпочтительно указанный препарат имеет активность более 20000 Е/мл супернатанта культуры. Указанные значения определяют при рН 6, используя триоктаноин в качестве субстрата. Указанное значение активности для препарата липазы представляет наибольший интерес в контексте разработки фармацевтических продуктов. Практически теперь стало возможно вводить уменьшенные дозы липазы, полученной способом согласно изобретению, сохраняя достаточную эффективность, чтобы получить желаемый терапевтический эффект, который может состоять, например, в коррекции мальабсорбции жира, являющейся следствием недостаточности поджелудочной железы, связанной с дефицитом липазы. Тот факт, что липаза Lip2 теперь может быть получена с применением рекомбинантных штаммовYarrowia lipolytica, без необходимости в продуктах животного происхождения, как в случае способа согласно изобретению, составляет значительное преимущество и сильно способствует применению липазы в медицинских целях. Экспрессионный вектор, используемый при получении рекомбинантных клеток Yarrowia lipolytics,используемых в способе настоящего изобретения, представляет собой интегративный вектор, несущий по меньшей мере одну копию гена LIP2 и элементы для регулирования экспрессии. Указанный вектор затем может быть встроен либо в плазмидную ДНК, либо в геномную ДНК дрожжей. Одним из примеров наиболее предпочтительного интегративного вектора является вектор JMP6 или вектор JMP10, как описано в Международной заявке WO 01/83773. Вектор JMP6 включает кассету экспрессии гена LIP2,кодирующего предшественник Lip2p липазы Lip2 Yarrowia lipolytica, перед которым расположен промотор Yarrowia lipolytica ацил-СоА оксидазы АСО 2, называемый РОХ 2. Вектор JMP10 также включает генLIP2, перед которым расположен промотор Yarrowia lipolytica липазы Lip2. Указанные два промотора индуцируются триглицеридами и жирными кислотами. В каждом из указанных векторов кассета экспрессии и промотор размещены между дзэта-последовательностями, как описано выше. Интеграция может быть направленной, то есть сайт-специфической, или случайной. Таким образом, когда трансформированный штамм Yarrowia lipolytica не несет дзэта-последовательности (как, например, в случае штаммаPO1d), интеграция кассеты экспрессии рассеяна по геномной ДНК указанного штамма. С другой стороны, когда штамм Yarrowia lipolytica включает дзэта-последовательности (как, например, в случае штамма Е 150), интеграция главным образом управляется на уровне данных последовательностей. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего способа, трансформированный штамм Yarrowia lipolytica предпочтительно представляет собой штамм, называемый YL-LIP26C, депонированный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M.), ул. DocteurRoux 28, 75724 Париж Cedex 15, 15 декабря 2005, под номером 1-3542. Указанный штамм YL-LIP2-6C генетически стабилен. В целях настоящего изобретения выражения "стабильный", "генетически стабильный", "генетическая стабильность", а также их варианты, используются в отношении сохранения того же числа локусов интеграции целевой нуклеиновой кислоты в ДНК рассматриваемого клона по меньшей мере в 30 поколениях. Указанное число, 30 поколений, выбрано в качестве основы для определения генетической стабильности, так как авторы настоящего изобретения заметили, что это соответствует количеству удвоения популяции клеток, достаточному для продуцирования липазы с применением способа, включающего по меньшей мере одну стадию прекультивирования рекомбинантных клеток Yarrowia lipolytica и одну стадию получения липазы в соответствующих условиях ферментации. В целях настоящего изобретения поколение определяется удвоением популяции клеток и может быть вычислено согласно формуле Y=Х 2g,где Y представляет собой популяцию клеток в момент времени t (выраженную, например, как плотность культуры), X представляет собой начальную популяцию клеток в момент времени t0, a g представляет собой число поколений, необходимых для перехода популяции клеток от значения X до значения Y. Предпочтительно клон является генетически стабильным, когда по меньшей мере 90% проанализированных колоний по меньшей мере через 30 поколений содержат то же число локусов целевого гена, как и исходный клон. Таким образом, из примеров очевидно, что клон YL-LIP2-6C является стабильным, так как почти 100% колоний, проанализированных через 100 поколений, содержат 6 локусов гена LIP2 (причем один локус соответствует эндогенному гену LIP2 + 5 локусов интеграции кассеты экспрессии генаLIP2). Неожиданно, когда в способе согласно изобретению использовали указанный конкретный штамм,авторы настоящего изобретения успешно получили рекомбинантную липазу в большом количестве с лучшим контролем над указанным получением. Авторы настоящего изобретения, безусловно, добились успеха в повышении выхода при получении липазы и, в частности, смогли получить примерно 1-3 г чистой липазы с 1 л супернатанта культуры. Также удалось получить препараты липазы, обладающие активностью около 20000 Е/мл. В целях настоящего изобретения активность липазы соответствует ее ферментативной активности. Каталитическая активность раствора липазы выражается в единицах (U) на 1 мл проанализированного раствора. Определенная активность выражена как единица (U) в мг очищенного белка (липаза). Одна единица соответствует количеству фермента, способного к катализации выпуска 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин. Удельная активность липазы меняется в зависимости от природы триглицерида, используемого в качестве субстрата. В дополнение к повышению выхода при получении липазы авторы настоящего изобретения также смогли обеспечить лучшую воспроизводимость способа получения, улучшить гомогенность конечного продукта и улучшить условия очистки липазы. Таким образом, указанные различные модификации позволяют получать липазу, удовлетворяющую требованиям, предъявляемым при использовании в медицине. Фактически, в контексте своего исследования авторы настоящего изобретения обнаружили, что липаза Lip2 активна при уровне рН выше 3 и приблизительно до рН 8 с максимальной активностью при рН 5-6. С другой стороны, липаза необратимо инактивируется при инкубировании в течение 2 ч при рН 3 или 8,5. Удельная активность липазы Lip2 была также проанализирована в зависимости от различных субстратов, и, таким образом, было определено, что при рН 4 очищенная липаза обладает активностью приблизительно 10760 Е/мг, приблизительно 16920 Е/мг и приблизительно 12260 Е/мг с триглицеридами с короткой цепью (трибутирин), триглицери-4 017963 дами со средней цепью (триоктаноин) и триглицеридами с длинной цепью (оливковое масло) соответственно. Наконец, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что липаза Lip2 активна в присутствии солей желчи, при этом активность повышается при увеличении концентрации солей желчи. Указанная активность в присутствии солей желчи ранее наблюдалась только у желудочной липазы и панкреатической липазы в присутствии колипазы. Таким образом, применение липазы Lip2 с высокой удельной активностью не требует присутствия колипазы. Клон YL-LIP2-6C содержит несколько копий кассеты экспрессии указанной липазы Lip2 с 5 актами интеграции гена LIP2 в различные локусы. В условиях, подходящих для продуцирования липазы, клонYL-LIP2-6C продуцирует большее количество липазы, чем трансформированные штаммы Yarrowialipolytica предыдущего уровня техники. Липаза продуцируется с выходом более 1 г/л супернатанта культуры, то есть с большим выходом, чем у клонов предыдущего уровня техники, описанных выше. Целью настоящего изобретения также является препарат липазы, который может быть получен способом согласно изобретению. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный препарат липазы обладает активностью, равной по меньшей мере 15000 Е/мл, предпочтительно более 20000 Е/мл, при измерении активности, как указано выше. Дополнительно целью изобретения является применение препарата липазы согласно изобретению при получении лекарственного средства, предназначенного для лечения патологии, связанной с нарушением усвоения жира (например, жирных кислот с короткой, средней или длинной цепью), в частности,связанным с недостаточностью поджелудочной железы, в частности экзокринной недостаточностью поджелудочной железы. Целью изобретения также является лекарственное средство, отличающееся тем, что оно включает препарат липазы, как определено выше. Целью настоящего изобретения также является клетка Yarrowia lipolytica, трансформированная вектором экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клон, обозначенный как YL-LIP2-6C, депонированный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M.), ул. Docteur Roux 28, 75724 Париж Cedex 15, 15 декабря 2005, под номером 1-3542. Целью настоящего изобретения дополнительно является применение клетки, определенной выше, в получении дрожжевой кислотоустойчивой липазы. В дополнение к предыдущим признакам изобретение также включает другие признаки, которые последуют из приведенного ниже описания, которое относится к примерам осуществления способа, который является целью настоящего изобретения, а также к сопровождающим чертежам, где: фиг. 1 представляет собой общую методику контроля генетической стабильности клона YL-LIP2-6C в ходе осуществления способа получения липазы; фиг. 2 представляет собой изменение оптической плотности при 600 нм (OD600 нм, ось Y слева) и изменение скорости роста (h-1, ось Y справа) с течением времени (часы, ось X) в ходе процесса ферментации; стрелка указывает индукцию синтеза липазы; фиг. 3 представляет собой саузерн-блоттинг числа актов интеграции гена LIP2 в различные локусы генома 23 колоний (дорожки 24-43), собранных в момент Т 33, соответствующий концу ферментации,приблизительно через 100 ч после начала ферментации; число копий 1-6: 6 локусов гена LIP2 (5 локусов интегрировавшейся кассеты экспрессии гена LIP2 + один локус эндогенного гена LIP2); М: маркер молекулярной массы; фиг. 4 представляет собой скрининг продукции рекомбинантной липазы клоном YL-LIP2-6C в ходе осуществления способа получения, от Т 16 до Т 33, с помощью ДСН-ПААГ электрофореза; стрелка указывает индукцию синтеза липазы (Т 17, 48 ч ферментации); М: маркер молекулярной массы; пять дорожек на правой части геля соответствуют известным количествам (от 2,5 до 20 мкг) очищенной липазыLip2; фиг. 5 представляет собой анализ с помощью ДСН-ПААГ электрофореза чистоты липазы в супернатанте на момент времени Т 33 (конец процесса ферментации); MW: маркер молекулярной массы; контроль Lip2 F5: количество липазы Lip2 варьирует от 1 до 10 мкг; супернатант YL-LIP2-6C: объемы проанализированного супернатанта, мкл; фиг. 6 представляет собой масс-спектр рекомбинантной липазы, продуцированной клоном YLLIP2-6C, полученный с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Пример 1. Материалы и методы. 1. Использованные среды. Приведенные конечные концентрации представляют собой концентрации в стоковых растворах. Необогащенная минимальная среда 02130S Обогащенная среда 02130S дополнительно включает следующие добавки: Состав раствора неорганических солей Раствор аммиака, 14%. Раствор пеногасителя: Struktol J673, разбавленный 1/10 (Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28,22113, Гамбург, Германия). 2. Выделение геномной ДНК и саузерн-блоттинг. а) Выделение геномной ДНК. Осадок клеток, полученный из 4 мл культуры, суспендировали в 0,5 мл буфера с сорбитолом (0,9 М сорбитола; 0,1 М трис-HCl, рН 8,0; 0,1 М ЭДТА). Затем добавляли 50 мкл Zymolase 20T (6 мг/мл) (Eu-6 017963romedex, 67458 Mundolsheim Cedex, Франция), 50 мкл 0,28 М раствора 2-меркаптоэтанола, после чего раствор инкубировали в течение 1 ч при 37 С с перемешиванием (180 об/мин). Раствор подвергали центрифугированию, а осадок суспендировали в 0,5 мл буфера ТЕ (50 мМ трис-HCl, рН 8; 20 мМ ЭДТА). К раствору добавляли 50 мкл 10% раствора ДСН, после чего раствор перемешивали переворачиванием и инкубировали в течение 20 мин при 65 С. Затем к раствору добавляли 0,2 мл 5 М ацетата калия, перемешивали и держали во льду в течение 30 мин с последующим центрифугированием в течение 5 мин. Супернатант переносили в 1,5-мл пробирку, а затем добавляли 0,8 мл 100% этанола, заранее охлажденного во льду. Раствор перемешивали переворачиванием, а затем центрифугировали. После удаления супернатанта к раствору добавляли 0,4 мл буфера ТЕ, содержащего 100 мг/мл РНКазы (Invitrogen, США),после чего раствор инкубировали в течение 1 ч при 37 С. После добавления 1 мл 100% этанола, заранее охлажденного во льду, раствор мягко перемешивали, пока ДНК не выпадало в осадок, а затем центрифугировали. Супернатант удаляли, а затем осадок ДНК сушили в открытой пробирке на столе, суспендировали в 100 мкл стерильной воды и инкубировали при 4 С в течение ночи.b) Рестрикция HindIII. Концентрацию геномной ДНК измеряли, определяя поглощение при 260 нм (А 260) и 280 нм (А 280). 1 мкг геномной ДНК смешивали со стерильной водой до конечного объема 42,5 мкл. К раствору добавляли 5 мкл буфера (5 Х) и 2,5 мкл Hindi II (50 Е/мкл) (Invitrogen, США) и инкубировали при 37 С в течение 4 ч.c) Саузерн-блоттинг. Переносы саузерн выполняли по методике из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection" от компании Roche Diagnostic.d) Методика мечения пробы. Пробу, соответствующую полноразмерному гену, кодирующему липазу Lip2, получали с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК с ДНК-полимеразой Phusion DNA polymerase (Finzyme) и следующими праймерами: прямой праймер: 5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3' (SEQ ID NO: 1); обратный праймер: 5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3' (SEQ ID NO: 2). После реакции ПЦР пробу очищали путем выделения из геля при помощи набора "Nucleospin Extract II" (Macherey Nagel). Затем очищенную пробу подвергали холодному мечению (дигоксигенин) при помощи набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection" от Roche.e) Разделение геля, перенос ДНК и детектирование сигнала. 2 мкг HindIII перевара ДНК смешивали с буфером для нанесения, а затем наносили в 0,8% агарозный гель. Перенос выполняли при 50 V в течение 2 ч 30 мин, а затем ДНК переносили на мембрану Hybond+ (Amersham Bioscience). Число локусов гена LIP2 в геномной ДНК детектировали посредством гибридизации с меченой пробой на мембранах с последующей визуализацией при облучении рентгеном. 3. Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд. Концентрацию белка определяли при помощи метода Брэдфорд непосредственно в супернатанте ферментируемой культуры. Количество белков, определенное таким образом, сравнивали с известными количествами очищенной липазы Lip2. 20 мкл стандартных проб в соответствующих разведениях смешивали в пробирках с 1 мл разбавленного (в 5 раз) реактива, содержащего краситель. Затем поглощение пробы при OD595 сравнивали с поглощением приOD595 для контроля (разбавленный краситель). 4. Измерение удельной активности рекомбинантной липазы. Активность липазы измеряли потенциометрически при 37 С с помощью титратора с поддержанием постоянного значения рН (RADIOMETER). Используемый субстрат являлся триоктаноином. 10 мм субстрата эмульгировали в 15 мл реакционного буфера, содержащего 1 мм трис-HCl (рН 5,5), 150 мМ NaCl,5 мМ CaCl2 и 4 мМ тауродезоксихолат натрия (SIGMA). Единица удельной активности определена как 1 мкмоль жирной кислоты, выделяемой в 1 мин на 1 мг белка. 5. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ). 12 мкл пробы, включающей 25% смеси, содержащей ДСН и восстанавливающие агенты, нанесли на 4-12% бистрис-гель (Biorad). Электрофорез выполняли в течение 45 мин при 160 V. Затем гель анализировали окрашиванием с использованием Coomassie blue. 6. Определение молекулярной массы липазы Lip2, продуцированной клоном YL-LIP2-6C, с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (ионизация лазерной десорбцией в присутствии матрицы, времяпролетная). Масс-спектрометрический анализ с ионизацией методом лазерной десорбции выполняли, используя масс-спектрометр "Voyager Elite XL time of flight" от компании Perseptive Biosystems (Framingham, MA),с помощью азотного лазера, генерирующего пучок с длиной волны 337 нм. Масс-спектр в режиме определения положительных ионов получали, используя режим линейного и замедленного выделения с ускоряющим напряжением 25 кВ, сеточным током 0,3%, током ионопровода 0,3% и мертвым временем 1000 нс для белка Lip2. Каждый спектр представляет собой средний результат 100 импульсов лазера. Анализируемый материал смешивали с равным объемом насыщенного раствора синапиновой кислоты (Fluka),приготовленного в растворе, содержащем 50% (об./об.) раствор ацетонитрила в водном растворе трифто-7 017963 руксусной кислоты. Аликвоты по 2 мкл полученной смеси наносили на пластинку для проб из нержавеющей стали и сушили на открытом воздухе перед выполнением анализа. Внешнюю калибровку выполняли с помощью альфа-химотрипсиногена A (SIGMA). Приведенные значения являются средними значениями и соответствуют иону [М+Н]+. Пример 2. Конструирование экспрессионного вектора и получение клона YL-LIP2-6C. Штамм YL-LIP2-6 С получали путем трансформации штамма PO1d Yarrowia lipolytica без дзэтапоследовательностей экспрессионным вектором JMP6, описанным в заявке ЕР 1108043, включающим ген LIP2, кодирующий предшественник Lip2p липазы Lip2 Yarrowia lipolytica, перед которым расположен АСО 2-промотор. Указанная кассета фланкирована дзэта-последовательностями, как описано выше. Конструирование вектора JMP6 и трансформацию штамма PO1d выполняли согласно такой же методике,как и в заявке ЕР 1108043. Указанный штамм YL-LIP2-6C, включающий 5 различных локусов интеграции кассеты экспрессии гена LIP2, был депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (CNCM), ул. Docteur Roux 28, 75724 Париж Cedex 15, под номером 1-3542, 15 декабря 2005. Пример 3. Продукция липазы штаммом YL-LIP2-6C и проверка генетической стабильности YLLIP2-6C. Штамм YL-LIP2-6C использовали в способе получения липазы, включающем стадию прекультивирования и стадию ферментации, подходящую для получения липазы. Общая схема данного способа показана на фиг. 1. Затем липазу, полученную таким образом, анализировали на активность и качество. Кроме того, анализировали генетическую стабильность YL-LIP2-6C, определяя число локусов кассеты экспрессии гена LIP2. 1. Способ получения. Прекультуры и ферментация. Пробирку со стоковым раствором клона YL-LIP2-6C в глицерине размораживали и культивировали 5 мкл в 25 мл богатой среды 02130S, содержащей 1% (об./об.) раствора витаминов и 1% (об./об.) раствора микроэлементов, в 250-мл колбе Эрленмейера. Культуру инкубировали при 28 С в течение 36 ч при перемешивании (180 об/мин). Полученной прекультурой (25 мл) (прекультура 1) инокулировали 200 мл богатой среды 02130S в 2-литровой колбе Эрленмейера и выращивали культуру при 28 С в течение 36 ч при перемешивании (180 об/мин). Прекультурой 2, полученной таким образом (225 мл), инокулировали богатую среду 02130S в ферментере. В момент времени Т 0 процесса ферментации в культуру добавляли 2 мл раствора FeSO4. Каждые 69 ч к ферментируемой культуре добавляли 2-3 мл раствора витаминов и по прошествии 34 ч ферментации (Т 12) начинали подачу глюкозы. Подачу глюкозы постепенно увеличивали в течение 14 ч, а затем прерывали при Т 17 (соответствующем 48 ч ферментации), после чего начинали индукцию олеиновой кислотой. Подачу олеиновой кислоты постепенно увеличивали в течение последующих 54 ч, а затем при Т 33 (102 ч ферментации) плотность достигла OD600 340, и процесс ферментации остановили. Конечную культуру (3 л) центрифугировали (14000 об/мин). Супернатант отбирали и хранили при -20 С. Контроль культур. В ходе ферментации температуру, парциальное давление кислорода и рН контролировали и поддерживали при 28 С, 20% и 6,2 соответственно. Приблизительно каждые 3 ч отбирали пробу культуры и измеряли OD600 с целью контроля изменения скорости роста. Результаты показаны на фиг. 2. Два экстракта по 1 мл взятых проб центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин, а осадки и супернатанты поместили на -20 С. В табл. I показан контроль процесса ферментации. Очистка липазы. Необязательно выполняли дополнительную стадию очистки липазы. Липазу выделяли из культуры с помощью устройства тангенциальной микрофильтрации на керамической мембране (pilot Х 6 от PALL), задерживающей дрожжи с размером, больше чем предельное пропускание (0,1 мкм). Фильтрат, содержащий липазу, вначале выделяли в режиме концентрирования, а затем в режиме диафильтрования. Указанные стадии выполняли согласно рекомендации изготовителя с соответствующими модификациями. Затем концентрацию микроорганизмов, содержавшихся в фильтрате, уменьшали посредством фильтрования (0,2 мкм) (Millipore) с получением содержания микроорганизмов менее 10 КОЕ/мл. Используя устройство Profux M12 (Millipore), раствор липазы концентрировали до объема приблизительно 5 л и подвергали тангенциальной ультрафильтрации, используя стандартные мембраны Biomax 10 kDa Pellicon для удаления низкомолекулярных примесей. Ультрафильтрат, не содержащий липазы, отбрасывали. Раствор липазы затем очищали повторно, удаляя микроорганизмы, как указано выше, с получением содержания микроорганизмов менее 5 КОЕ/мл. Липаза, очищенная таким образом, может дополнительно подвергаться лиофилизации. 2. Определение характеристик рекомбинантной липазы, продуцированной YL-LIP2-6C. а) Контроль продукции липазы штаммом YL-LIP2-6C в ходе процесса ферментации. В каждой точке измерения пробу культуры подвергали центрифугированию, а супернатант анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. 75 мкл супернатанта смешивали с 75 мкл воды, а затем 5 мкл наносили на гель с 26 дорожками. Также наносили пробы, содержащие известные количества липазы Lip2. Результаты приведены на фиг. 4. Путем сравнения количества липазы, полученной в конце ферментации (Т 33), с градиентом известных количеств липазы Lip2, концентрацию липазы, полученной после 100 ч ферментации можно оценить как 1,5 г/л. Кроме того, авторы настоящего изобретения использовали способ получения липазы согласно изобретению на конечном объеме приблизительно 35 л, что позволило получить липазу с выходом 1-3 г с 1 л супернатанта культуры.b) Определение концентрации белка и оценка продукции рекомбинантной липазы. Концентрацию белка в супернатанте культуры определяли, как описано в примере 1 (метод Брэдфорд). Выполняли семь независимых измерений, при этом концентрация белка в супернатанте составила 2,3 г/л. Чистоту белка Lip2 в супернатанте оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Результаты приведены на фиг. 5. Степень чистоты составила приблизительно 70%. Таким образом, полученный выход липазы после ферментации с клоном YL-LIP2-6C составил 1,6 г/л.c) Измерение удельной активности рекомбинантной липазы, продуцированной YL-LIP2-6C. Удельную активность липазы, продуцированной клоном YL-LIP2-6C, измеряли, как описано в примере 1. Пробу, соответствующую супернатанту в ходе ферментации, разбавляли в 100 раз в буфере, содержащем 50 мМ Na2HPO4, 50 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, pH 6,0. Каталитическая активность, определенная при 37 С с триоктаноином в 3 независимых экспериментах, составила 21883,33 Е/мл супернатанта (табл. II). Исходя из предполагаемой концентрации липазы Lip2 в супернатанте (см. выше), удельная активность липазы, составляющая 13675 Е/мг, сопоставима с удельной активностью липазы, производимой для клинических исследований. Удельная активность липазы, продуцированной клоном YL-LIP2-6C,соответствует требованиям, предъявляемым к клиническим препаратам.d) Молекулярная масса рекомбинантной липазы. Масс-спектрометрию (см. пример 1) выполняли на супернатанте ферментируемой культуры после центрифугирования без очистки. Результат приведен на фиг. 6. Основной наблюдаемый пик соответствует молекулярной массе 37648 Да. Липаза Lip2, продуцированная YL-LIP2-6C, имеет приемлемую молекулярную массу, так как наблюдаемое значение соответствует требованиям, предъявляемым к клиническим препаратам, то есть 37500 +/- 1000 Да. Данный пример иллюстрирует отбор стабильного клона YL-LIP2-6C (в данном случае 100% проанализированных клонов после 30 поколений имеют то же число локусов гена Lip2, как и исходный клон). Кроме того, на генетическую стабильность указанного клона не влияют условия культивирования,используемые при получении липазы (в ходе выращивания прекультур, непосредственно перед ферментацией; непосредственно перед индукцией олеиновой кислотой синтеза липазы, в конце ферментации). 3. Генетическая стабильность клона YL-LIP2-6C. Генетическую стабильность клона YL-LIP2-6C в ходе осуществления способа получения липазы,включающего стадию прекультивирования и стадию ферментации, анализировали посредством определения числа актов интеграции кассеты экспрессии гена LIP2 в различные локусы ДНК Yarrowia lipolytica в колониях, отобранных в точках ТО, Т 17 и Т 33. а) Отбор колоний. Пробу прекультуры 2 (ТО, начало ферментации), пробу культуры в условиях ферментации при Т 17OD600 = 1 л, а затем в 1000 раз. По 10 мкл указанных разбавленных растворов сеяли на 3 чашки со средойYPD. Затем чашки инкубировали при 28 С в течение 48 ч, а затем поместили на 4 С до отбора колоний для анализа числа локусов. 20 колоний, полученных из пробы, отобранной в начале ферментации (Т 0), 20 колоний, полученных из пробы, отобранной непосредственно перед индукцией (Т 17), и 100 колоний, полученных из пробы,отобранной в конце ферментации (Т 33), отдельно посеяли в 4 мл богатой среды 02130S и затем выращивали в течение 72 ч. Затем приготовили стоки в 30%-ном глицерине для выделения ДНК и саузернблоттинга ("Материалы и Методы").b) Определение числа актов интеграции гена LIP2 в различные локусы в 140 колониях, полученных из штамма YL-LIP2-6C. Результаты саузерн-блоттинга числа актов интеграции в различные локусы гена LIP2 для 20 колоний, отобранных в точке Т 0 (начало ферментации), 20 колоний, отобранных в точке 117 (48 ч ферментации) и 100 колоний, отобранных в точке Т 33 (100 ч ферментации), приведены на фиг. 3. Приведенные результаты показывают, что все проанализированные колонии содержат 6 локусов гена LIP2. Так как штамм дикого типа содержит копию эндогенного гена LIP2, штамм YL-LIP2-6C поэтому содержит 5 локусов интеграции кассеты экспрессии гена LIP2. Клон YL-LIP2-6C, таким образом, на 100% стабилен в процессе ферментации в течение 100 ч. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения рекомбинантной липазы, включающий:a) стадию культивирования клеток Yarrowia lipolytica, трансформированных вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы; иb) стадию выделения рекомбинантной липазы, продуцированной указанными клетками, из супернатанта культуры,где указанный способ отличается тем, что стадию а) культивирования выполняют в культуральной среде, не содержащей продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, состоящих из белковых материалов животного происхождения или продуктов их ферментативного расщепления, и тем, что указанная культуральная среда включает в качестве источника азота неорганический азот; источник углерода, выбранный из источников углерода углеводной природы, многоатомных спиртов, таких как глицерин, а также источников углерода липидной природы, таких как жирные кислоты и ацилглицерины; иa1) прекультивирование трансформированных клеток Yarrowia lipolytica в среде, содержащей источник углерода углеводной природы; и а 2) стадию ферментации, включающую фазу роста клеток в среде, содержащей источник углерода углеводной природы, и фазу синтеза липазы в среде, содержащей в качестве единственного источника углерода жирную кислоту, выбранную из триглицеридов с короткой, средней или длинной цепью. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ферментацию проводят при постоянном рО 2 от 15 до 25% и рН ниже 6,5. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что стадию a1) прекультивирования выполняют до достижения показателя OD600 3-10 в 1 мл, а в стадии а 2) ферментации указанная фаза синтеза липазы начинается, когда OD600 культуры достигает значения 60-80 в 1 мл. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что стадию b), в ходе которой выделяют липазу,начинают, когда OD600 достигает значения 300-350 в 1 мл. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что стадия b) включает:b1) выделение липазы из указанного супернатанта культуры;b2) очистку липазы, полученной в b1). 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанное выделение выполняют с использованием методики, выбранной из тангенциальной фильтрации через полое волокно, фронтальной фильтрации и непрерывного или периодического центрифугирования, а указанную очистку выполняют с использованием методики, выбранной из фильтрации, фракционного осаждения, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрационной хроматографии. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что стадия а) заключается в культивировании клона дрожжей Yarrowia lipolytica YL-LIP2-6C. 9. Препарат дрожжевой кислотоустойчивой рекомбинантной липазы, полученный способом, включающим:a) стадию культивирования клеток Yarrowia lipolytica, трансформированных вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы; иb) стадию выделения рекомбинантной липазы, продуцированной указанными клетками, из супернатанта культуры,где способ отличается тем, что стадию а) культивирования выполняют в культуральной среде, не содержащей продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, состоящих из белковых материалов животного происхождения или продуктов их ферментативного расщепления, а содержащей в качестве источника азота неорганический азот; источник углерода, выбранный из источников углерода углеводной природы и источников углерода липидной природы; и неорганические соли, микроэлементы и витамины,отличающийся тем, что указанный препарат обладает каталитической активностью при рН 6 по меньшей мере 15000 единиц в 1 мл супернатанта культуры, предпочтительно более 20000 единиц в 1 мл супернатанта культуры, причем одна единица соответствует количеству фермента, способному катализировать образование 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин, когда используемый субстрат является триоктаноином, и/или тем, что концентрация указанной липазы в указанном препарате выше, чем 1 г липазы на 1 л. 10. Применение препарата липазы по п.9 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения синдрома мальабсорбции жира, связанного с недостаточностью поджелудочной железы. 11. Клон дрожжей Yarrowia lipolytica C.N.C.M. YL-LIP2-6C, трансформированный вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой внеклеточной липазы, для получения кислотоустойчивой липазы. 12. Применение клетки по п.11 при получении дрожжевой кислотоустойчивой липазы. 13. Лекарственное средство, включающее препарат липазы по п.9 и предназначенное для лечения синдрома мальабсорбции жира, связанного с недостаточностью поджелудочной железы.