Полностью человеческая высокопродуктивная система получения усовершенствованных антител и белков

ПОЛНОСТЬЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКАЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНАЯ СИСТЕМА ПОЛУЧЕНИЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫХ АНТИТЕЛ И БЕЛКОВ Настоящее изобретение относится к способу получения композиции молекулы белка, имеющей определенный характер гликозилирования, включающему: (а) введение в клетку-хозяин, которая представляет собой иммортализованную клетку крови человека по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере часть указанного белка; (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продукцию указанной композиции молекулы белка; и (с) выделение указанной композиции молекулы белка. 017622 Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к подходящим для применения в биотехнологии способам получения композиций белковых молекул, в частности композиций молекул антител, которые позволяют получать продукт с повышенной активностью, и/или с повышенным выходом, и/или с повышенной гомогенностью и человеческим гликозилированием. Настоящее изобретение также относится к новым клеткам-хозяевам, нуклеиновым кислотам и композициям молекулы белка. Введение Основной особенностью и задачей промышленности является получение рекомбинантных белков,причем производительность, стоимость, гомогенность и активность белков представляют собой ключевые характеристики, которые все еще требуют оптимизации. Гликозилирование также представляет собой ключевой аспект высокопродуктивного производства гомогенных рекомбинантных гликопротеинов,который обуславливает ряд критических проблем при их получении. Каждая клеточная линия, используемая в существующих в настоящее время производствах, несет в себе ряд проблем, которые в основном связаны со сложностью, а также с видовой специфичностью, тканевой специфичностью и сайтспецифичностью гликозилирования. Следовательно, оптимизация продукционных систем по гликозилированию остается одним из главных аспектов оптимизации. Как правило, это объясняется тем, что различия в характере гликозилирования зачастую оказывают существенное влияние на активность, иммуногенность, биодоступность и период полужизни белковых молекул. Подробный обзор гликозилирующих свойств разных клеточных линий, полученных из разных видов, в том числе, не относящихся к млекопитающим, опубликован Jenkins et al. (Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry, Nat Biotechnology, 1996, 14: 975-981). Антитела являются основными инструментами диагностики и исследования и могут стать самым большим семейством терапевтических средств. Более десяти терапевтических средств на основе рекомбинантных антител присутствуют на рынке и сотни находятся в стадии клинической разработки. Основной особенностью и задачей промышленности является получение рекомбинантных антител ("rMAb"),причем производительность, стоимость, гомогенность и активность антител представляют собой ключевые характеристики, которые все еще требуют оптимизации. Почти все имеющиеся на рынке терапевтические rMAb получают в клеточных линиях грызунов, таких как хомяки (СНО) и мыши (NS0 или Sp2/0). Несомненное большинство находящихся в разработке rMAB получают в клетках грызунов, и еще многие находятся в разработке, однако ни одно из антител не оптимизировано в достаточной степени по производительности, стоимости, гомогенности и активности. Гликозилирование также является важным аспектом высокопродуктивного производства гомогенных и активных rMAb, который обусловливает ряд критических проблем при их получении. Каждая клеточная линия, используемая в существующих в настоящее время производствах, несет в себе ряд проблем, которые в основном связаны со сложностью, а также с видовой специфичностью, тканевой специфичностью и сайт-специфичностью гликозилирования [Обзор: Royston Jefferis, CCE IX: Glycosylation ofRecombinant Antibody Therapeutics; Biotechnol. Prog. 2005, 21, 11-16]. Следовательно, оптимизация систем получения белков, в особенности, антител, по гликозилированию остается одним из главных аспектов оптимизации. Настоящее изобретение относится к новым системам экспрессии на основе иммортализованных клеток крови человека, в частности, на основе клеток миелоидного лейкоза. Такие клетки позволяют значительно улучшить такие характеристики продукции гликозилированных белков, в особенности, антител, как активность, выход и/или гомогенность. Уровень техники изобретения Белки представляют собой разнородную группу, члены которой сильно различаются по функциям и местоположению. Большинство белков, которые потенциально могут использоваться в качестве терапевтических средств, являются гликозилированными, например, многие гормоны (например, гормон роста,гликагон, FSH и LH), факторы роста (например, GM-CSF, G-CSF, VEGF и эритропоэтин), цитокины (например, IL-2, IL-7, Интерферон-альфа и -бета, TNF-альфа), антикоагулянты (например, лепирудин, десирудин), факторы свертывания крови (например, факторы VII, VIII и IX), вакцины (например, антиген гепатита В) и антитела. Существующие клеточные системы продукции не способны продуцировать белки со своеобразным человеческим гликозилированием. Прокариотические клеточные системы (например, бактерии) и большая часть эукариотических клеточных систем (например, дрожжи, клетки насекомых и растений) синтезируют белки с отсутствием гликозилирования, или гликаны, которые сильно отличаются от углеводных цепей человека. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) представляют собой широко используемую продукционную систему, которая способна гликозилировать белки подобно клеткам человека. Однако существуют важные различия, например, в галактозилировании, фукозилировании, частичном гликозилировании N-ацетилглюкозаминами, и особенно в разных аспектах сиалилирования. Указанные различия влияют на активность, биодоступность, иммуногенность и период полужизни. В то время, когда разрабатывались данные системы продукции, было достаточным получать терапевтические белки, по меньшей мере, с некоторой степенью активности. Однако сегодня значительные-1 017622 усилия направлены на повышение активности терапевтического белка с целью (i) уменьшения числа и величины вводимых доз терапевтических белков, (ii) снижения стоимости лечения и (iii) уменьшения побочных эффектов. Основная стратегия повышения биоактивности белков заключается в увеличении периода их полужизни в сыворотке и, как следствие, их биодоступности. Этого можно достичь, например, с помощью процесса, называемого пэгилирование, в котором некоторые формы полиэтиленгликоля добавляют/химически присоединяют к получаемому белку. ПЭГ увеличивает молекулярную массу и, следовательно, период полужизни. Однако данный процесс связан с некоторыми проблемами. Например, почти во всех случаях пэгилирование уменьшает активность белка как клеточного эффектора, повторное введение людям часто вызывает неблагоприятный иммунный ответ в виде генерирования нейтрализующих антител, и/или процесс получения белка требует дополнительной химической модификации, что делает процесс многостадийным и увеличивает его стоимость, затраты на его осуществление и время проведения. Существуют подобные системы-носители (например, НЕSилирование или присоединение альбумина), которые имеют сравнимые недостатки. Для увеличения периода полужизни рекомбинантных белков в сыворотке также можно использовать модификацию углеводных цепей, например гликозилирование белков. Такие технологии фокусируются на максимизации степени сиалилирования рекомбинантного гликопротеина. Сиаловые кислоты являются наиболее распространенными концевыми моносахаридами на поверхности эукариотических клеток, и принято считать, что чем выше степень сиалилирования гликопротеина, тем больше период его полужизни в сыворотке. Это можно объяснить наличием в печени некоторых рецепторов, таких как рецептор асиалопротеина, которые связывают циркулирующие несиалилированные белки и направляют их в клетку для последующей деградации. В организме человека и большинства млекопитающих присутствуют разные классы антител, а именно, IgG, IgM, IgE, IgA, IgD. В то время как для диагностических или исследовательских целей используются молекулы антител всех классов, в состав большинства присутствующих на рынке или находящихся в стадии разработки терапевтических средств на основе антител входят IgG и реже IgM. КлассIgG человека дополнительно подразделяют на четыре подкласса, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Базовая структура IgG включает две легкие цепи и две тяжелые цепи, которые содержат два участка Fab, в состав каждого из которых входит один вариабельный домен, содержащий антигенсвязывающий участок, и один константный домен, один участок Fc, содержащий другие константные домены и участки взаимодействия с лигандами, и гибкий шарнирный участок, который соединяет участки Fab и Fc. Антитела могут существовать в виде полноразмерных молекул, или в виде фрагментов антител, таких как фрагментыFab, или одноцепочечные Fv, которые содержат два вариабельных участка тяжелой и легкой цепей, соединенные линкером. На фиг. 18 показано антитело IgG. Рекомбинантные антитела для терапевтического применения чаще всего получают в виде химерных, гуманизированных или так называемых полностью человеческих белковых последовательностей,обладающих пониженной иммуногенностью. Однако на самом деле полностью человеческие молекулы получить достаточно трудно, поскольку посттрансляционные модификации в клетках грызунов или СНО, в которых осуществляют продукцию антител, такие как, например, гликозилирование, отличаются от модификации антител человека, происходящей в сыворотке человека. Различия в модификациях, особенно в характерах гликозилирования, могут оказывать существенное влияние на активность и иммуногенность получаемого антитела. На активность антитела оказывает влияние ряд факторов. С одной стороны, антитело обладает определенной специфичностью, которая определяется вариабельным участком антитела ("V-участок"),расположенным во фрагменте Fab, содержащем некоторые последовательности, участки CDR, Vучастка. Они играют ключевую роль в определении конкретных специфичности и аффинности антитела. Следовательно, V-участки имеют определяющее значение для характеристик связывания эпитопа и варьируют от антитела к антителу. Аффинность антитела определяет силу и кинетику связывания одного связывающего участка антитела с его эпитопом. Поскольку одна молекула антитела любого класса или подкласса содержит от двух до десяти идентичных вариабельных участков, сила и кинетика связывания антитела зависят от числа связывающих участков, доступных для связывания с эпитопами, а также от доступности эпитопов на антигене или клетке-мишени, и определяются как авидность. Другим фактором, имеющим большое значение для применения антитела в диагностике и особенно в терапии, является число участков связывания антитела на структуре- или клетке-мишени, а также скорость интернализации антитела. Указанные факторы влияют на активность антитела и его пригодность для применения, особенно, в терапии. С другой стороны, существует несколько эффекторных механизмов, имеющих отношение к терапевтическому действию антитела, причем некоторые антитела действуют посредством только одного механизма, а другие посредством сочетания разных эффекторных механизмов. Одна из стратегий включает присоединение антител или фрагментов антител к эффекторным молекулам, которые опосредуют терапевтический эффект, например, к иммунной эффекторной молекуле, такой как интерлейкин 2, если целью является укрепление иммунной системы, или к токсинам или радиоизотопам, если целью является-2 017622 уничтожение клеток-мишеней, как, например, при противоопухолевой терапии. Радиомеченные антитела или фрагменты антител также можно использовать для диагностики in vivo. Другая стратегия включает применение немеченых, так называемых "голых" антител, и может иметь важные преимущества, такие как пониженная токсичность, более простая организация процесса,применение фрагментов природных иммунных эффекторов или инициирование терапевтических эффектов в отсутствие дополнительных эффекторных молекул. Большое число исследований было проведено для выяснения механизмов осуществления активности и характера действия антител, а также для разработки антител с использованием полученных данных. К наиболее важным активностям и эффектам относятся антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (называемая в данном описании"активность ADCC"), комплемент-зависимая цитотоксичность (называемая в данном описании "активность CDC"), фагоцитоз-опосредованная цитотоксичность (называемая в данном описании "фагоцитарная активность"), рецептор-опосредованная активность (называемая в данном описании "рецепторопосредованная активность"), которые включают целый набор разных эффектов и активностей. Рецептор-опосредованная активность, как правило, реализуется путем связывания антитела с молекулой или рецептором на клетке-мишени, или путем предотвращения связывания некоторых молекул с клеткой-мишенью, что может приводить к индуцированию или ингибированию определенных эффектов в данных клетках, таких как антагонистическая или агонистическая активность, или рецепторная блокада антитела, приводящая, например, к индукции или ингибированию апоптоза или пролиферации клетокмишеней, или к секреции или ингибированию секреции некоторых молекул клеткой-мишенью, или блокирование или инициирование некоторых других рецептор-опосредованных событий, таких как взаимодействия между молекулами и клетками, или между клетками. Активность ADCC, активность CDC и фагоцитарная активность представляют собой цитотоксические активности, которые опосредуются Fcфрагментом антитела (называемые в данном описании "активности, опосредуемые фрагментом Fc"), тогда как рецептор-опосредованные активности, афинность, авидность и специфичность антитела, в основном, определяются связывающим участком антитела, который находится во фрагменте Fab. Активности, опосредуемые фрагментом Fc, реализуются посредством иммунологических эффекторных клеток, таких как клетки-киллеры, естественные клетки-киллеры и активированные макрофаги,или разных компонентов комплемента, путем связывания с эффекторными лигандами, такими как FcгаммаRI, Fc-гаммаRII, Fc-гаммаRIII, компонент комплемента Clq, неонатальный рецептор Fc (FcRn) и др. Показано, что подкласс IgG1 человека обладает самой высокой активностью ADCC и CDC среди класса молекул IgG человека. Преимущественным эффекторным механизмом IgM является активность CDC. Активность ADCC и активность CDC реализуются в результате связывания участка Fc, константного участка антитела, с рецепторами Fc, такими как Fc-гaммaRI, Fc-гаммaRII, Fc-гаммaRIII эффекторных клеток, или с компонентами комплемента, такими как Clq. Важные аминокислотные остатки находятся в шарнирном участке и, в частности, во втором домене константного участка ("домен Сгамма 2"). Для проявления активности большое значение имеет связывание углеводной цепи с доменами Сгамма 2. Углеводная цепь связывается с аминокислотой аспарагин 297 (Asn-297) домена Сгамма 2 (N-гликозидсвязанные углеводные цепи). Конец углеводной цепи, который связывается с аспарагином, называют восстанавливающим концом, а противоположный конец называют невосстанавливающим концом. Участок Fc антитела IgG содержит два углевод-связывающих центра. На фиг. 18 показана структура молекулы IgG с указанием положения, в котором обычно можно обнаружить углеводные структуры. Кроме того, описывается химическая структура и композиция указанных углеводных структур. Из активностей, опосредованных фрагментом Fc, предположительно две зависят от гликозилирования антитела. Показано, что удаление сахарной цепи из фрагмента Fc антитела приводит к исчезновению активности CDC и ADCC и, кроме того, восстановление остатков галактозы в таких N-гликанах вызывает уменьшение активности CDC [Boyd et al., Molecular Immunol., 32, 1311, (1995); US 6946292]. Далее,описано, что некоторые антитела, экспрессированные в клетках крысы, обладают более высокой активностью ADCC [Lifely et al., Glycobiology,1995 Dec;5(8):813-22; WO 00/61739], чем такие же антитела,экспрессированные в клетках хомяков и крыс. Обе публикации позволяют предположить, что указанные различия в ADCC активности антител обусловлены разным гликозилированием, однако это еще не доказано. Lifely et al. 1995 предположили, что биссекторный (присутствующий в точке разветвления) Nацетилглюкозамин ("bisecGlcNAc") отвечает за увеличение ADCC активности антитела, в то время какWO 00/61739 описывает, что значительное уменьшение количества фукозы, альфа 1-6-связанной с Nацетилглюкозамином, на восстанавливающем конце N-гликанов ("фукоза кора") приводит к уменьшению активности ADCC. Кроме того, описано, что экспрессия в клетках СНО рекомбинантного ферментаGnTIII, который отвечает за присоединение сахара bisecGlcNAc к N-гликанам, приводит к увеличениюADCC активности некоторых антител, экспрессирующихся в данных клетках, по сравнению с такими же антителами, экспрессирующимися в клетках СНО, не трансфицированных рекомбинантным GnTIII [US 6602684, Umana et al., Nature Biotechn 17: 176-180 (1999)]. Также было описано, что нокаут гена FUT8 в клетках СНО, который приводит к утрате фукозного ядра, может повышать ADCC активность некоторых антител, экспрессируемых в таких клетках FUT8 KO СНО [US 6946292]. Полученные результаты также демонстрируют большое значение характера гликолизирования для активности антитела, а также его-3 017622 сложность. Однако "чужеродное" и, следовательно, не оптимизированное гликозилирование может приводить не только к снижению активности, но и к повышению иммуногенности. В основе используемых в настоящее время систем экспрессии и продукции белков, в частности антител, как правило, лежат клеточные линии грызунов, например клеточные линии хомяков, мышей или крыс, такие как СНО, ВНК, NS0,Sp2/0 и YB2/0. Известно, что в неоптимальных условиях клетки грызунов могут продуцировать ряд аномально гликозилированных белковых продуктов, которые обладают пониженной активностью или являются иммуногенными. Также известно, что клетки грызунов зкспрессируют углеводные структуры, которые имеют существенные отличия от углеводов, экспрессирующихся в клетках человека, включающие присутствие нечеловеческих сахаров и уменьшение числа некоторых человеческих сахарных фрагментов, что приводит к экспрессии в данных клетках иммуногенных, менее эффективных белков с более низким выходом или субоптимальными структурными требованиями или субоптимальной укладкой. Большинство клеток грызунов экспрессируют, например, N-гликолилнейраминовую кислоту ("NeuGc"),вариант N-ацетилнейраминовой кислоты ("NeuNAc"), которая не присутствует у людей и является для них иммуногенной, и/или иммуногенную модификацию галактоза альфа(1-3) галактоза ("Gal[альфа]13Gal"), и/или они не содержат важных углеводов, таких как альфа 2-6-связанная NeuNAc, или в данных клетках отсутствует bisecGlcNAc. Существуют также и другие, известные и неизвестные, различия. Также известно, что при продукции в клетках грызунов профили гликоформ в основном являются гетерогенными, как и клон-специфичные профили гликоформ, которые могут сильно варьировать от клона к клону в клетках СНО, NS0 или Sp2/0 и зависят от способа продуцирования и условий культивирования. Кроме того, для получения белков используют системы экспрессии, включающие клетки человека,такие как, например, клетки Hek 293, полученные из клеток почек эмбрионов человека, или клеточная система PerC6(R), полученная из отдельной клетки сетчатки человека, которые иммортализуют с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Однако такие клеточные линии, хотя зачастую являются более предпочтительными, чем нечеловеческие клеточные системы, имеют ряд недостатков. Они осуществляют уникальное гликозилирование в соответствии с механизмом, присущим клеткам данного типа. Однако в зависимости от продуцируемого белка они могут не обеспечивать профиль гликозилирования, оптимизированный в отношении активности и/или периода полужизни белка в сыворотке. В частности, при использовании данных клеток трудно достичь определенных степени и характера сиалилирования. Например, известные в данной области клеточные системы зачастую не способны обеспечить детектируемый уровень альфа 2-6-сиалилирования, которое имеет беольшое значение для периода полужизни в сыворотке. Приведенные факты позволяют сделать вывод, что еще сохраняется потребность в альтернативных и/или усовершенствованных системах экспрессии и продукции, позволяющих дополнительно оптимизировать производительность, гомогенность и/или активность антитела. Кроме того, приведенные факты свидельствуют о том, что пока не ясно, какие углеводные структуры и, в особенности, какие человеческие углеводные структуры являются оптимальными для повышения активности или гомогенности белков, в частности антител, и какой характер гликозилирования должна обеспечивать клеточная линия, в особенности, клеточная линия человека, чтобы оптимизировать активность белка, в частности антитела. Следовательно, существует потребность в системах экспрессии, позволяющих получать продукты, характер гликозилирования которых отличается от характера гликозилирования продуктов, получаемых с помощью систем экспрессии, известных в данной области. Настоящее изобретение предлагает решение указанных проблем путем применения новых систем экспрессии на основе иммортализованных линий клеток крови человека, в особенности, клеток миелоидного лейкоза. Применение иммортализованных клеток крови человека имеет преимущество по сравнению с системами предыдущего уровня техники, заключающееся в том, что характер гликозилирования в данных клетках отличается от характера гликозилирования в других известных клеточных системах человека, полученных из другой ткани (например, почки или сетчатки). Такие различия могут оказывать благоприятное влияние на активность, гомогенность и выход продукта. Кроме того, клетки можно трансфицировать и выращивать в суспензии в отсутствии сыворотки. Следовательно, в соответствии с первым вариантом осуществления, предоставляется способ получения белковой композиции, включающий следующие стадии:(a) введение в клетку-хозяин, которая представляет собой иммортализованную клетку крови человека по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере часть указанного белка;(b) культивирование указанной клетки-хозяина, обеспечивающее продукцию указанной композиции молекулы белка; и(c) выделение указанной композиции молекулы белка. Способ, в котором используются иммортализованные клетки крови человека, позволяет улучшить активность, выход и/или гомогенность продуцируемых белков, в частности антител. Этот факт является неожиданным, поскольку до настоящего времени отсутствовали данные, свидетельствующие о том, что иммортализованные клетки крови человека и, в особенности, клетки миелоидного лейкоза, можно ис-4 017622 пользовать для получения белков, в частности антител, с относительно улучшенными свойствами. Хотя для экспрессии антител используют некоторые лейкемические клетки крысы, механизм гликозилирования в клетках человека и крысы сильно различается, из-за чего последние могут экспрессировать углеводные фрагменты, иммуногенные для человека, такие как NeuGc и Gal[альфа]1-3Gal. Описано, что лейкемическая клетка крысы YB2/0 продуцирует антитела с повышенной активностью ADCC вследствие более высокого уровня bisecGlcNAc или вследствие эффективной понижающей регуляции фукозного ядра. Еще более неожиданным является то, что настоящее изобретение позволяет решить данную проблему с использованием иммортализованных клеток крови человека, в частности миелоидных клеток,поскольку ранее было показано, что клеточная линия К 562 - клетки миелоидного лейкоза - не экспрессирует фермент для bisecGlcNAc, этот факт описан и показан гибридизацией гена GnTIII [Yoshimura M etal., Cancer Res. 56(2): 412-8 (1996)], и не экспрессирует ген FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, отвечающую за добавление фукозы к кору (белковая часть протеогликана), как показано методом ПЦР-ОТ [пример 1]. Это неожиданно, поскольку клетки К 562 не устойчивы к обработке лектином, так как они прочно связываются лектином LCA, что свидетельствует об отсутствии или сильно пониженной регуляции фукозилирования кора. Данные по профилю гликозилирования клеток К 562 позволяют предположить, что эти клетки не будут улучшать активность экспрессируемых в них антител, поскольку отсутствует механизм гликозилирования, обеспечивающий желательную активность. Неожиданным также является то, что с помощью способа по настоящему изобретению можно генерировать и получать белки,в частности антитела, характеризующиеся более высокой активностью связывания, более высокой гомогенностью и/или более высоким выходом, чем белки, полученные с использованием существующих в настоящее время систем экспрессии. Стратегия настоящего изобретения заключается в получении подходящих клеточных линий человека, позволяющих получить систему, способную продуцировать белковые продукты с полным набором посттрансляционных модификаций, максимально приближающихся к человеческим, и, следовательно, не обладающие иммуногенными свойствами, или обладающие менее интенсивными иммуногенными свойствами и/или более высокой активностью в организме человека. Целью настоящего изобретения является предоставление специально подобранного гликозилирования для каждого экспрессируемого белка/антитела. Вследствие того факта, что углеводные структуры являются очень сложными, механизм гликозилирования в клетках включает несколько сотен ферментов, участвующих в их синтезе, а экспрессия данных ферментов является видоспецифичной и тканеспецифичной, основная стратегия авторов настоящего изобретения по достижению человеческого характера гликозилирования включает предоставление биотехнологически подходящих человеческих систем экспрессии, обеспечивающих экспрессию белков, в частности антител, с оптимизированным характером гликозилирования. Поскольку оптимизированный характер гликозилирования может варьировать от белка к белку и от антитела к антителу, настоящее изобретение предлагает клеточную линию, способную обеспечивать разные характеры гликозилирования, что позволяет выбрать для продукции клеточную линию, обеспечивающую характер гликозилирования, оптимизированный для соответствующего белкового продукта/антитела. Следовательно, настоящее изобретение относится к подходящим для применения в биотехнологии способам получения композиций белковых молекул, в частности композиций молекул антител, которые позволяют получать продукт с повышенной активностью, и/или с повышенным выходом, и/или с повышенной гомогенностью и полностью человеческим гликозилированием. Настоящее изобретение также предлагает новые клетки-хозяева, нуклеиновые кислоты и композиции молекул. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения белковой композиции,предпочтительно композиции молекулы антитела, обладающей заданным характером гликозилирования,который включает следующие стадии:(a) введение в иммортализованную клетку крови человека, используемую в качестве клеткихозяина по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или по меньшей мере одну часть белка;(b) культивирование указанной клетки-хозяина, обеспечивающее продукцию указанной композиции молекулы белка; и(с) выделение указанной композиции молекулы белка, обладающей заданными характеристиками гликозилирования. При получении композиции белка, в частности композиции антитела, обладающего улучшенными свойствами, в соответствии с настоящим изобретением, выбирают клетку-хозяин, способную продуцировать композицию белка/антитела, имеющего по меньшей мере одну из нижеследующих характеристик гликозилирования:(i) Отсутствие NeuGc на детектируемом уровне. Как указано выше, гликозилирование NeuGc может вызывать иммунный ответ у людей. Следовательно, желательно по возможности избегать соответствующего гликозилирования. Такого гликозилирования можно избежать путем применения иммортализованных клеток крови человека, в частности путем-5 017622 применения в качестве клетки-хозяина клетки миелоидного лейкоза человека.(ii) Степень галактозилирования, относящаяся ко всем углеводным структурам или к углеводным структурам одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, повышена по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Обнаружено, что остатки галактозы в основном связаны с остатками GlcNAc на антеннах Nгликанового комплекса антител связью бета-1-4, однако также присутствуют связи бета-1,3. Впрочем,они обычно встречаются в трехантенных структурах. Степень галактозилирования оказывает значительное влияние на активность, в особенности, связанную с антителами. Показано, что уменьшение количества галактозы приводит к снижению активности CDC. Следовательно, высокая степень галактозилирования может быть предпочтительным фактором. Галактозилирование также может играть важную роль и для других белков. При рассмотрении общей углеводной структуры белковой молекулы учитываются все акты гликозилирования белковой молекулы. Если углеводные структуры анализируются по одному конкретному участку гликозилирования, основное внимание уделяется конкретной углеводной структуре (структурам), такой как, например, углеводная структура (структуры), присоединенная к Asn 297 Fc-фрагмента молекулы антитела (также см. фиг. 18). При анализе соответствующей конкретной структуры определяют содержание/состав данной конкретной структуры. При определении указанной характеристики также можно рассматривать все углеводные элементы и конкретные углеводные цепи (указанные термины являются синонимами).(iii) Количество структур G2 на всех углеводных структурах или на углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% выше по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. В частности, если с помощью способов по настоящему изобретению получают антитело, высокое количество структур G2 является благоприятным фактором. Термин "структура G2" относится к характеру гликозилирования антитела, при котором галактоза присутствует на обоих концах биантенной структуры, связанной с Fc-фрагментом (также см. фиг. 18). Если присутствует одна молекула галактозы,структуру называют G1, если галактоза отсутствует, структуру называют GO. Характер гликозилирования G2 зачастую улучшает CDC-активность антител. Следовательно, предпочтительно, чтобы в получаемой композиции белка/антитела количество структур G2 было выше по меньшей мере на 10, 20, 30,40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 95% или даже больше, чем на 100%. В настоящем описании описаны подходящие клеточные линии, обеспечивающие характер гликозилирования с относительно высоким уровнемG2. Поскольку высокая степень галактозилирования обычно оказывает благоприятное влияние на CDCактивность антител, зачастую предпочтительно, чтобы содержание структур G2 и/или G1 составляло 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или даже более 95% во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования белка, в частности, молекулы антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления содержание структур G2 составляет более 35%(40, 45, 50, 55, 60, 65 или более 70%) во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка.(iv) Количество структур G0 во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% ниже по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Как указано выше, высокая степень галактозилирования обычно является благоприятным фактором. Следовательно, клеточные линии, предпочтительно, выбирают так, чтобы избежать образования структур G0. Предпочтительно, содержание структур G0 составляет ниже 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90% или еще ниже. В соответствии с другим вариантом осуществления менее 22%(20, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6%, менее 5%) структур G0 присутствует на всех углеводных структурах или на углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка.(v) Отсутствие концевого Gal[альфа]1-3Gal на детектируемом уровне. Как указано выше, гликозилирование Gal[альфа]1-3Gal может вызывать иммунный ответ у людей. Данное гликозилирование осуществляется посредством механизма, в процессе которого второй остаток галактозы присоединяется к первому остатку галактозы по положению альфа 1,3 с образованием высокоиммуногенного дисахарида Gal[альфа]1-3Gal. Применение в качестве клеток-хозяев иммортализованных клеток крови человека, в особенности, клеток миелоидного лейкоза человека, позволяет избежать(vi) Содержание фукозы во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% меньше по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Остатки фукозы обнаружены на разных участках разветвленного N-гликана, в частности: соединенные связью альфа 1,6 с остатком GlcNAc, примыкающим к аминокислотной цепи; соединенные связью альфа 1,3 и альфа 1,4 с расположенным на антенне остатком GlcNAc; соединенные связью альфа 1,2 с расположенным на антенне остатком Gal. На присоединенных к антителу N-гликанах подавляющее большинство остатков фукозы соединено связью 1,6 с проксимальным остатком GlcNAc (так называемое "фукозное ядро"). Обнаружено, что отсутствие фукозного ядра на восстанавливающем конце N-гликана, присоединенного к антителу, повышает ADCC-активность антитела в 25-100 раз. По причине данного благоприятного влияния на ADCC предпочтительно, чтобы содержание фукозы было по меньшей мере на 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000, 1500% или более чем на 2000% меньше, по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Настоящее изобретение также предлагает специально полученные рекомбинантные клеточные линии, которые обеспечивают относительно низкое общее фукозилирование. В соответствии с другим вариантом осуществления выбирают клетку-хозяин, способную продуцировать гликопротеин, содержащий по меньшей мере 10% (15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% или более 80%) углеводов среди общего количества углеводных структур или по меньшей мере в одной конкретной углеводной структуре в конкретном участке гликозилирования одной из молекул белка указанной композиции молекулы белка, которые не содержат фукозы. В отношении антител особенно предпочтительно, чтобы углеводные цепи с N-гликозидными связями, связанные с фрагментом Fc, содержали восстанавливающий конец, в состав которого входит GlcNAc, где углеводные цепи не содержат фукозу,связанную с 6 положением GlcNAc в восстанавливающем конце углеводной цепи.(vii) По меньшей мере одна углеводная структура содержит биссекторный GlcNAc. Обычно биссекторный N-ацетилглюкозамин (bisGlcNAc) присоединен посредством связи бета 1,4 к центральному остатку маннозы структуры триманнозильного ядра N-гликанов, обнаруженных в антителах. Присутствие биссекторного GlcNAc, присоединенного к центральному остатку маннозы комплексаFc фрагмент антитела-N-гликан, повышает ADCC-активность антител. В соответствии с другим вариантом осуществления указанную клетку-хозяин выбирают так, чтобы указанный продуцируемый белок содержал больше углеводных структур среди всех углеводных элементов (или по меньшей мере в одной конкретной углеводной цепи в конкретном участке гликозилирования молекулы белка) молекул белка указанной композиции молекулы белка, которые не содержат фукозы и биссекторного GlcNAc, чем соответствующих углеводных структур, которые содержат биссекторныйGlcNAc и не содержат фукозы. В соответствии с другим вариантом осуществления указанную клетку-хозяин выбирают так, чтобы указанный продуцируемый белок содержал больше углеводных структур среди всех углеводных элементов (или по меньшей мере в одной конкретной углеводной цепи в конкретном участке гликозилирования молекулы белка) молекул белка указанной композиции молекулы белка, которые содержат больше биссекторного GlcNAc и фукозы, чем соответствующих углеводных структур, которые содержат биссекторный GlcNAc и не содержат фукозы.(viii) Характер сиалилирования отличается от характера сиалилирования композиции по меньшей мере одной такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Влияние степени/характера сиалилирования на активность, период полужизни и биодоступность различается среди разных белков/антител. Следовательно, для каждой молекулы белка/антитела полезно определить оптимальный характер сиалилирования с помощью способа скрининга по настоящему изобретению перед началом продукции в наиболее подходящей клетке-хозяине, обеспечивающей желательный характер гликозилирования. Например, существует несколько публикаций, описывающих отрицательное влияние остатков сиаловой кислоты, присутствующих на гликане, соединенном с фрагментом Fc антитела, на нижеуказанные эффекты, например активность CDC и ADCC. Однако обнаружено, что высокая степень сиалилирования увеличивает период полужизни сиалилированных молекул. Таким образом, поскольку целесообразно использовать разные схемы сиалилирования в зависимости от продуцируемого белка/антитела, настоящее изобретение предлагает иммортализованные линии клеток крови человека, обладающие различными активностями сиалилирования и позволяющие получать белки/антитела с оптимизированным характером гликозилирования. В соответствии с одним из вариантов осуществления клетку-хозяин выбирают так, чтобы она продуцировала белок, имеющий пониженную степень сиалилирования и содержащий по меньшей мере на-7 017622 10% (предпочтительно на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90%, 95%) меньше сиаловых кислот во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [ATCCCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. В соответствии с одним из вариантов осуществления продукт не содержит NeuNAc на детектируемом уровне. В зависимости от продуцируемого белка/антитела сиаловые кислоты, в частности, NeuNAc, могут не оказывать влияния на активность белка/антитела. В данных случаях для получения более гомогенного продукта может быть полезно отсутствие сиаловых кислот при гликозилировании. Это обусловлено тем, что схема гликозилирования NeuNAc также может варьировать в конечной белковой композиции. Вариации в содержании NeuNAc могут приводить к получению менее гомогенного продукта, что может осложнять приемку продукта контролирующим органом. В случае белков/антител, активность которых не зависит от наличия гликозилирования NeuNAc, отсутствие гликозилирования NeuNAc может быть полезным с точки зрения повышения гомогенности. Однако термин "отсутствие детектируемого уровня NeuNAc" не означает, что NeuNAc обязательно и полностью отсутствует. Напротив, данный термин также охватывает структуры, имеющие достаточно низкое содержание NeuNAc (например, от 1 до 10%). Примером соответствующего белка является FSH. В соответствии с одним из вариантов осуществления продукт имеет пониженную степень сиалилирования и содержит по меньшей мере на 15% (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450%, 500%) меньше NeuNAc во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL9096] после экспрессии в данных клетках. Данный вариант осуществления является полезным, если нужно проводить экспрессию белка/антитела, на активность которого сиалилирование оказывает негативное влияние. Соответствующего гликозилирования (отсутствие или очень низкое количество сиаловых кислот, в особенности, NeuNAc) можно достичь путем применения клеток с дефицитом сиалилирования, таких какNM-F9 и NM-D4, в бессывороточной среде. В соответствии с другим вариантом осуществления продукт имеет повышенную степень сиалилирования, причем количество NeuNAc во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 15% (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450% или более чем на 500%) выше по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной изCHOdhfr- [ATCCCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Как указано выше, относительное увеличение степени сиалилирования может оказывать положительное влияние на период полужизни белка, продлевая его. В этих случаях предпочтительно использовать клеточную линию, обеспечивающую более высокую степень сиалилирования, чем клетки CHOdhfr[ATCCCRL-9096] и клетки с дефицитом сиалилирования (такие как, например, NM-F9 и NM-D4), в которых сиалилирование происходит только после добавления предшественника. Однако, даже если при выращивании указанных клеток с дефицитом сиалилирования добавить соответствующий предшественник, эти клетки могут обеспечить только приблизительно от 50 до 60% сиалилирования, наблюдающегося в иммортализованных клетках крови человека, не имеющих генетической мутации/дефекта, связанных с механизмом гликозилирования, необходимым для сиалилирования. Следовательно, для получения вариантов осуществления с высокой степенью сиалилирования предпочтительно использовать клеточные линии, способные обеспечивать относительно высокую степень сиалилирования, и не использовать NM-F9 и NM-D4. В соответствии с другим вариантом осуществления продукт содержит альфа 2-6-связанный NeuNAc. Кроме того, может присутствовать некоторое количество альфа 2-3-связанного NeuNAc. В некоторых белках/антителах присутствие гликозилирования NeuNAc оказывает благоприятное влияние на период полужизни белка/антитела. Присутствие альфа 2-6-связанного NeuNAc является предпочтительным, поскольку данный характер гликозилирования напоминает человеческий характер гликозилирования. Клетки грызунов обычно продуцируют альфа 2-3-связанный NeuNAc. Другие клеточные линии также не способны обеспечивать достаточную степень гликозилирования с альфа 2-6-связанным NeuNAc. Клеточными линиями, способными обеспечивать соответствующий характер гликозилирования,являются, например, NM-H9D8 и NM-H9D8-E6. В соответствии с другим вариантом осуществления используют клетку-хозяин, которая способна продуцировать белок, содержащий по меньшей мере на 20% больше заряженных углеводных цепей с Nгликозидной связью во всех углеводных структурах или по меньшей мере в одной конкретной углеводной цепи конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной компо-8 017622 зиции молекулы белка, по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr[АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Кроме того, следует учитывать распределение зарядов в углеводной цепи, которое также может оказывать влияние на свойства белков. Заряды в углеводных цепях несут такие химические группы, как,например, серосодержащие группы или сиаловая кислота. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления указанный продукт содержит по меньшей мере на 20% меньше заряженных углеводных цепей с N-гликозидной связью во всех углеводных структурах или по меньшей мере в одной конкретной углеводной цепи конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. В соответствии с другим вариантом осуществления выбирают клетку-хозяин, способную продуцировать гликопротеин, в котором по меньшей мере 2% (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40%, или более чем 45%) углеводных структур во всех углеводных структурах или по меньшей мере в одной конкретной углеводной цепи конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, содержат биссекторный GlcNAc. В соответствии с еще одним вариантом осуществления для продукции белка используют клеткухозяин, которая обеспечивает повышенную активность, повышенный выход и/или повышенную гомогенность продукта по сравнению с по меньшей мере одной композицией молекулы белка такой же молекулы белка,экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или обеспечивает повышенный средний или максимальный выход, который по меньшей мере на 10% выше, чем выход по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или обеспечивает повышенную гомогенность продукта, которая представляет собой повышенную гомогенность гликозилирования, где указанная композиция молекулы антитела имеет более низкую степень сиалилирования, чем по меньшей мере одна композиция молекулы антитела такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или если указанная молекула белка представляет собой молекулу антитела, то она обладает повышенной Fc-опосредованной цитотоксичностью, которая по меньшей мере в 2 раза выше, чем Fcопосредованная цитотоксичность по меньшей мере одной композиции молекулы антитела такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или если указанная молекула белка представляет собой молекулу антитела, то она обладает повышенным антиген-опосредованным или Fc-опосредованным связыванием, которое по меньшей мере на 50% выше, чем связывание по меньшей мере одной композиции молекулы антитела такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]. Как указано выше, соответствующие свойства можно получить путем оптимизации гликозилирования белка, как описано в настоящем описании. Неожиданным является то, что, изменяя профиль гликозилирования, можно изменить и улучшить профиль связывания некоторых антител. Подходящие клеткихозяева также описаны в настоящем описании. В соответствии с другим вариантом осуществления повышенная гомогенность указанной композиции молекулы белка представляет собой повышенную гомогенность гликозилирования указанной композиции молекулы белка, обладающей по меньшей мере одной из следующих характеристик: отсутствие NeuGc на детектируемом уровне; отсутствие NeuNAc на детектируемом уровне; содержание NeuNAc выше, чем в композиции такой же молекулы белка, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; присутствие детектируемых количеств альфа 2-6-связанной NeuNAc. В соответствии с другим вариантом осуществления выбирают клетку-хозяин, способную продуцировать композицию белка, содержащую молекулы белка, которые имеют один из нижеследующих характеров гликозилирования:(а) не содержат детектируемых количеств NeuGc,не содержат детектируемых количеств Gal[альфа]1-3Gal,имеют характер галактозилирования, указанный в п.2,имеют содержание фукозы, указанное в п.2,содержат bisecGlcNAc,содержат повышенное количество сиаловой кислоты по сравнению с композицией белка такой же молекулы белка, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096], или в клеточной линии с дефицитом сиалилирования, такой как NM-F9 и NM-D4.(b) не содержат детектируемых количеств NeuGc,не содержат детектируемых количеств Gal[альфа]1-3Gal,имеют характер галактозилирования, указанный в п.2,имеют содержание фукозы, указанное в п.2,содержат bisecGlcNAc,содержат повышенное количество сиаловой кислоты по сравнению с композицией белка такой же молекулы белка, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096].(с) не содержат детектируемых количеств NeuGc,не содержат детектируемых количеств Gal[альфа]1-3Gal,имеют характер галактозилирования, указанный в п.2,имеют содержание фукозы, указанное в п.2,содержат bisecGlcNAc,содержат 2-6 NeuNAc. Другие подходящие сочетания характеристик, обеспечивающие улучшенные свойства, описаны в табл. 9. В настоящем изобретении термин "молекула белка" относится к представляющему интерес белку или его активным фрагментам и/или мутантам, соответственно, можно использовать любой белок человека, предпочтительно любой гликопротеин человека. Термин молекула белка относится к любой молекуле полипептида или ее части. Молекулу белка могут кодировать одна или несколько нуклеиновых кислот. Она может продуцироваться по секреторному механизму или по частично секреторному механизму, или в виде слитого белка с партнером по слиянию. Предпочтительно белок секретируется в супернатант. Данный вариант осуществления является особенно полезным для всего процесса продукции, поскольку позволяет избежать, например, стадий сброса (например, с использованием форболовых эфиров). Примеры гликопротеинов млекопитающих включают такие молекулы, как цитокины и их рецепторы, например, факторы некроза опухоли TNF-альфа и TNF-бета; ренин; человеческий гормон роста и бычий гормон роста; фактор, высвобождающий гормон роста; паращитовидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь и В-цепь инсулина; гонадотропины, например, фолликулостимулирующий гормон (FSH), лютеинизирующий гормон (LH), тиреотропин и хорионический гонадотропный гормон человека (hCG); кальцитонин; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, фактор VII, тканевый фактор и фактор Виллебранда; факторы,препятствующие свертыванию крови, такие как белок С; предсердный натрийуретический фактор; легочное поверхностно-активное вещество; активаторы плазминогена, такие как урокиназа, человеческий мочевой и тканевый активатор плазминогена; бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; энкефалиназа; макрофагальный воспалительный белок человека; сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; А-цепь и В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; фактор роста эндотелия сосудов; рецепторы гормонов или факторов роста; интегрин; белок А и D; ревматоидные факторы; нейротрофические факторы, такие как костный нейротрофический фактор, нейротрофин-3, -4, -5, -6 и бета-фактор роста нервов; тромбоцитарный фактор роста; фибробластные факторы роста; эпидермальный фактор роста; трансформирующий фактор роста, такой как TGF-альфа и TGF-бета; инсулинподобный фактор роста -I и-II; белки, ингибирующие инсулинподобный фактор роста; белки CD, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD19; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок; интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF),например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1-IL-12; супероксиддисмутаза; Тклеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; фактор распада; антитела и иммуноадгезины; гликофорин A; MUC1. Многие из вышеуказанных гликопротеинов принадлежат к цитокинам, которые относятся к общему классу гормонов, встречающихся в клетках иммунной системы, и включают лимфокины, монокины и другие цитокины. Настоящее изобретение включает, без ограничения, гормоны, которые действуют местно и не циркулируют в крови, а также гормоны, которые при использовании в соответствии с настоящим изобретением вызывают изменение иммунного ответа субъекта. Примеры других подходящих имуномодуляторных цитокинов включают, без ограничения, интерфероны (например, IFN-альфа, IFN-бета иIFN-гамма), интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 и IL-12),факторы некроза опухоли (например, TNF-альфа и TNF-бета), эритропоэтин (ЕРО), лиганд FLT-3, макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD2 и ICAM. Полагают, что эритропоэтин стимулирует созревание клеток-предшественников с образованием эритроцитов, тогда как тромбопоэтин направляет клетки-предшественники по тромбоцитарному пути. CSF относится к семейству лимфоцинов, которые индуцируют дифференцировку клеток-предшественников,- 10017622 присутствующих в костном мозге, в конкретные типы зрелых кровяных клеток. Конкретный тип зрелой кровяной клетки, образовавшейся из клетки-предшественника, зависит от типа присутствующего CSF. Подобным образом, образование гранулоцитарно-макрофагальных колоний зависит от присутствия GMCSF. Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать цитокины других млекопитающих, обладающие значительной гомологией по отношению к формам IL-2, GM-CSF, TNF-альфа и др. человека,если показано, что они оказывают подобное действие на иммунную систему. Молекулы адгезии или вспомогательные молекулы, или их сочетания, могут применяться отдельно или в сочетании с цитокинами. Подобным образом, в настоящем изобретении можно использовать белки, которые являются практически аналогичными какому-либо конкретному белку, но имеют относительно минорные изменения в белковой последовательности. Хорошо известно, что некоторые небольшие изменения аминокислотной последовательности белка зачастую не влияют на функциональные возможности белковой молекулы и,следовательно, можно получить белки, которые функционируют как исходный белок по изобретению, но немного отличаются от известных в данное время последовательностей. В объем настоящего изобретения также входят соответствующие варианты, сохраняющие биологические функции. Предпочтительные гликопротеины могут быть выбраны из группы, включающей гликофорин А,ЕРО, G-CSF, GM-CSF, FSH, hCG, LH, интерфероны, интерлейкины, антитела и/или их фрагменты. Все упомянутые выше молекулы белков могут быть сопряжены с другими пептидными или полипептидными последовательностями, включающими, без ограничения, линкеры, активирующие молекулы или токсины. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует секреторную форму белка или его фрагмента. В предпочтительном варианте осуществления секреторная форма не содержит трансмембранные домены. В настоящем изобретении термин "композиция молекулы белка" относится к молекулам любого белка, экспрессированного с помощью способа по настоящему изобретению, в особенности, в клеткехозяине по настоящему изобретению, которые можно выделить. Указанная композиция молекулы белка содержит по меньшей мере одну молекулу белка. Указанная белковая композиция содержит по меньшей мере одну гликоформу молекулы белка. Указанная гликоформа молекулы белка представляет собой молекулу белка, которая имеет конкретное гликозилирование или содержит углеводную цепь, которая отличается от другой гликоформы такой же молекулы белка по меньшей мере на один сахарный элемент,например без ограничения, содержит дополнительный остаток галактозы, сиаловой кислоты, bisecGlcNAc, фукозы, или другую модификацию сахарного остатка, такую как, без ограничения, ацетилирование или сульфатирование. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция молекулы белка может содержать молекулы нескольких белков, экспрессированных в клетке-хозяине. В предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы белка по изобретению содержит в процентном соотношении больше молекул такой гликоформы или таких гликоформ молекулы белка,которые обеспечивают более высокую активность, чем у композиции молекулы белка такой же молекулы белка, полученной по меньшей мере из одной клеточной линии, выбранной из группы, включающей СНО, или CHOdhfr-, или ВНК, или NS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиную гибридому, предпочтительно, из CHOdhfr- [АТССCRL-9096], после экспрессии в данных клетках. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы белка по изобретению содержит в процентном соотношении больше молекул такой гликоформы или таких гликоформ молекулы белка, которые обеспечивают более высокую активность, чем у композиции молекулы белка такой же молекулы белка, полученной из клеточных линий СНО, или CHOdhfr-, или ВНК, или NS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиной гибридомы, предпочтительно CHOdhfr- [АТССCRL-9096], после экспрессии в данных клетках. В соответствии с настоящим изобретением термин "молекула антитела" относится к любому полноразмерному антителу или к фрагменту антитела, или к молекуле, содержащей фрагмент антитела. Указанное антитело может представлять собой любое антитело или молекулу иммуноглобулина любого класса или подкласса, или любую молекулу, содержащую по меньшей мере один домен иммуноглобулина, известный специалистам в данной области, и включает, без ограничения, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,IgM, IgA, IgD животного происхождения, например, полученные из такого животного, как человек,обезьяна, грызун, мышь, крыса, хомяк, кролик, верблюд, птица, курица или акула, кроме того, оно может представлять собой молекулу, которая содержит белковые последовательности антител, полученные из разных животных, такую как химерное или гуманизированное антитело, где, например, последовательности мыши и человека в разных соотношениях объединены в полноразмерные антитела, и/или присутствуют мутации, обусловливающие уменьшение иммуногенности или увеличение аффинности, как известно специалистам в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное полноразмерное антитело также может представлять собой описанное выше антитело, содержащее по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную или полипептидную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления указанное полноразмерное антитело представляет собой гуманизированный или химерный IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM человека, который содержит фрагмент Fc человека. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобре- 11017622 тения указанное полноразмерное антитело представляет собой гуманизированный или химерный IgG1,IgG4 или IgM человека, который содержит фрагмент Fc человека. Указанный фрагмент Fc человека содержит по меньшей мере одну последовательность из 20 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот, константного домена фрагмента Fc антитела человека, предпочтительно он содержит по меньшей мере один домен Fc антитела человека, более предпочтительно он содержит домен Сгамма 2 человека, и более предпочтительно, он содержит все константные домены фрагмента Fc антитела человека определенного класса или подкласса. Указанный фрагмент Fc также может содержать последовательности человека, в которых по меньшей мере одна аминокислота является мутантной. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула полноразмерного антитела представляет собой либо (i) полностью человеческое антитело, полученное, например, из продуцирующей антитело клетки человека или клеток крови, или из трансгенной мыши, у которой локус гена антитела мыши, по меньшей мере, частично заменен на последовательности антитела человека, либо (ii) гуманизированное полноразмерное антитело, в котором по меньшей мере часть вариабельных участков антитела мыши или крысы, таких как каркасные участки, или по меньшей мере одна аминокислота каркасного участка, заменены на последовательности человека, или которое содержит мутации, делающее антитело менее иммуногенным для человека, и которое содержит константные домены человека, либо (iii) химерное полноразмерное антитело, которое содержит вариабельный участок мыши или крысы и константные домены человека. Указанные полностью человеческие антитела, гуманизированные полноразмерные антитела и химерные полноразмерные антитела, а также способы получения, идентификации, тестирования, оптимизации и отбора указанных молекул антител, содержащих или не содержащих подходящие дополнительные последовательности, а также способы получения, идентификации, тестирования и отбора наиболее подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы антитела, известны специалистам в данной области. Указанный фрагмент антитела представляет собой фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере 20 аминокислот указанного полноразмерного антитела, предпочтительно, по меньшей мере 100 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент антитела содержит связывающий участок антитела, такой как Fab, F(ab)2, мультитела, содержащие несколько связывающих доменов, такие как диатела, триатела или тетратела, однодоменные антитела или аффитела. В другом предпочтительном варианте осуществления фрагмент антитела включает участок Fc, который содержит все константные домены или часть константных доменов, предпочтительно он содержит второй домен (домен Сгамма 2). В другом варианте осуществления фрагмент антитела представляет собой укороченное полноразмерное антитело, полученное путем удаления по меньшей мере одной аминокислоты, полипептидных участков или полноразмерных доменов. Указанные молекулы могут быть объединены с другими последовательностями, такими как линкеры, с целью стабилизации или улучшения связывания молекул. Указанная молекула, содержащая фрагмент антитела, представляет собой любую молекулу, которая содержит любой из указанных фрагментов антител или других доменов иммуноглобулинов по меньшей мере из 20 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления указанная молекула, содержащая фрагмент антитела, представляет собой слитую молекулу, в которой фрагмент антитела сливается с другими белковыми последовательностями, такими как эффекторные последовательности, например, цитокины, кофакторы стимуляции, токсины, или фрагменты других антител с образованием молекул, обладающих несколькими специфичностями связывания, таких как би- или триспецифичные антитела, или последовательности мультимеризации, такие как домены МВР (маннансвязывающего белка), обеспечивающие мультимеризацию связывающих доменов, или последовательности, облегчающие детекцию,очистку, секрецию или стабилизацию, такие как маркеры, сигналы локализации, линкеры и т.п. В другом предпочтительном варианте осуществления указанная молекула, содержащая фрагмент антитела, представляет собой слитую молекулу, которая содержит участок Fc полноразмерного антитела или его части,предпочтительно, второй константный домен (домен Сгамма 2). Указанные слитые молекулы получают с помощью генно-инженерных методов, где молекулы кодируются одной нуклеиновой кислотой или объединяются в результате совместной экспрессии по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, при этом слияние осуществляется посредством нековалентных или ковалентных белковых взаимодействий, или путем сочетания обоих таких взаимодействий. Слияние фрагмента антитела с другой полипептидной последовательностью или белковой молекулой на генном уровне можно осуществить с помощью методов генной инженерии, где обе части кодируются одной нуклеиновой кислотой, причем между ними могут необязательно присутствовать дополнительные аминокислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления указанные слитые молекулы содержат по меньшей мере один связывающий участок из такого фрагмента антитела, как однодоменное антитело или Fab, или связывающую последовательность,полученную не из антитела, такую как домен лектина, и фрагмент Fc или его части, содержащие второй домен (домен Сгамма). В другом предпочтительном варианте осуществления слитые молекулы содержатIL-2, IL-12, IL-15, GM-CSF, пептидный токсин или их фрагменты. Их сливают, например, с помощью генно-инженерных способов, где молекулы кодируются одной нуклеиновой кислотой или сливаются в результате совместной экспрессии по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, при этом слияние осуще- 12017622 ствляется посредством нековалентных или ковалентных белковых взаимодействий, или образуются в результате слияния из фрагмента антитела, такого как однодоменное антитело, Fab или Fab, связанный с последовательностью мультимеризации МВР. Все указанные молекулы антител или их фрагменты, а также способы получения, идентификации,тестирования и отбора указанных молекул антител, содержащих или не содержащих подходящие дополнительные последовательности, а также способы получения, идентификации, тестирования и отбора наиболее подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы антитела, известны специалистам в данной области. В соответствии с настоящим изобретением термин "композиция молекулы антитела" относится к молекулам любых антител, экспрессируемых в клетке-хозяине по настоящему изобретению, которые можно выделить. Указанная композиция молекулы антитела содержит по меньшей мере одну молекулу антитела. Указанная композиция антитела содержит по меньшей мере одну гликоформу (гликозилированную форму) молекулы антитела. Указанная гликоформа молекулы антитела представляет собой молекулу антитела, которая имеет конкретное гликозилирование или несет углеводную цепь, отличающуюся по меньшей мере на один сахарный элемент, например, без ограничения, содержит дополнительный остаток галактозы, сиаловой кислоты, bisecGlcNAc, фукозы, или другую модификацию сахара, включающую, без ограничения, ацетилирование или сульфатирование другой гликоформы той же молекулы антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция молекулы антитела может содержать более чем одну молекулу антитела, экспрессируемую в клетке-хозяине. В предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы антитела по настоящему изобретению содержит в процентном отношении больше молекул такой гликоформы или таких гликоформ молекул антител,которые обладают повышенной Fc-опосредованной клеточной цитотоксичностью и/или улучшенным связыванием, чем композиция молекулы антитела такой же молекулы антитела, полученной после экспрессии по меньшей мере в одной из клеточных линий, включающих СНО, или CHOdhfr-, или ВНК, илиNS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиную гибридому, предпочтительно, CHOdhfr- [АТССCRL-9096]. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы антитела по настоящему изобретению содержит в процентном отношении больше молекул такой гликоформы или таких гликоформ молекулы антитела, которые обладают повышенной Fc-опосредованной клеточной цитотоксичностью и/или улучшенным связыванием, чем композиция молекулы антитела такой же молекулы антитела,полученной после экспрессии по меньшей мере в одной из клеточных линий, включающих СНО, илиCHOdhfr- [АТССCRL-9096]. В соответствии с настоящим изобретением термин "клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека" наряду с эквивалентными выражениями включает любую клетку или клеточную линию, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, или любую миелоидную клетку или предшественника миелоидной клетки человека, или линию миелоидных клеток или предшественников миелоидных клеток человека, которую можно получить от пациента, страдающего лейкозом, или любую миелоидную клетку или предшественника миелоидной клетки человека, или линию миелоидных клеток или предшественников миелоидных клеток человека, которую можно получить от человека-донора, или клетку или клеточную линию, полученную из любой из указанных клеток-хозяев, или смесь клеток или клеточных линий, содержащую по меньшей мере одну из вышеуказанных клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека, или указанная иммортализованная клетка крови человека по изобретению также включает клетки или клеточные линии, полученные путем слияния по меньшей мере одной из вышеуказанных клеток-хозяев, в частности, полученной из клетки миелоидного лейкоза, с другой клеткой человеческого или животного происхождения, такой как, без ограничения, В-клетки, СНОклетки. Специалисты в данной области могут определить и использовать источники и способы получения, генерирования и/или иммортализации подходящих клеток и клеточных линий человека, подходящие для получения клеток-хозяев, полученных из клеток миелоидного лейкоза человека. Термин "клетка или клеточная линия, полученная из указанной клетки-хозяина" относится к любой клетке или клеточной линии, которую можно получить путем культивирования или клонирования указанной клетки-хозяина, полученной из клетки миелоидного лейкоза, которая предварительно может необязательно подвергаться мутации или генно-инженерным манипуляциям, которые включают селекцию полученных из указанной клетки-хозяина клеток или клеточных линий, обладающих желательными свойствами. Указанные культивирование и клонирование основаны на том факте, что клеточные клоны с разными свойствами можно получить из первичных клеточных культур, культур клеток и даже культур клеточных клонов после нескольких циклов пассирования и клонирования клеток, предпочтительно, с использованием способов клонирования одиночных клеток, таких как метод серийных разведений или клеточный сортинг с помощью проточной цитометрии. В предпочтительном варианте осуществления указанную клетку или клеточную линию, полученную из указанной клетки-хозяина, отбирают по связыванию с лектином или углевод-связывающим антителом. Указанную мутацию можно осуществить с помощью известного специалистам в данной области способа, с использованием физических, химических- 13017622 или биологических мутагенов, включающих без ограничения облучение, алкилирующие реагенты илиEMS (этилметансульфонат), белки, такие как лектины, или вирусные частицы. Указанную генноинженерную манипуляцию можно проводить с помощью известных специалистам в данной области способов, включающих "нокаут" генов посредством сайт-специфической гомологичной рекомбинации,применение транспозонов, сайт-специфический мутагенез, трансфекцию определенных нуклеиновых кислот, или сайленсинг генов или генных продуктов. Способы указанных культивирования и клонирования, указанные мутации и мутагены, а также указанные генно-инженерные манипуляции известны специалистам в данной области, некоторые их примеры подробно описаны в WO 2005/017130 А 2, US 2003/0115614 А 1 или в настоящем описании. Специалисты могут выбрать и/или адаптировать и/или модифицировать подходящий способ или сочетание способов для получения подходящей клетки или клеточной линии из указанной клетки-хозяина по изобретению. Указанные клетки или клеточные линии, полученные из указанной клетки-хозяина, отбирают на основании того, что свойства данных клеток должны превосходить свойства исходной клетки или клеточной линии, например, без ограничения, они должны обладать более коротким временем удвоения,способностью быстрее расти, способностью расти при повышенной плотности, продуцировать больше белка, расти в бессывороточных условиях и/или в среде, не содержащей белка, повышенной эффективностью клонирования, повышенной эффективностью при трансфекции ДНК, повышенной скоростью экспрессии композиции молекулы антитела, повышенной активностью композиции молекулы антитела,экспрессированной в такой клетке или клеточной линии, повышенной гомогенностью композиции молекулы антитела, экспрессированной в такой клетке или клеточной линии, и/или повышенной устойчивостью к масштабированию системы. Способы селекции таких клеток с улучшенными свойствами известны специалистам в данной области или описаны в настоящем описании. Настоящее изобретение предлагает способ получения клетки-хозяина по изобретению, включающий (а) инкубацию клетки миелоидного лейкоза человека с лектином или антителом, которое распознает десиалилированный эпитоп или эпитоп,не содержащий сиаловой кислоты, но не связывается или связывается гораздо слабее с сиалилированной формой эпитопа, и (b) выделение клеток, связанных с указанным лектином или антителом, и (с) культивирование выделенных клеток в течение подходящего времени, и (d) отбор клетки, клеток или клеточного клона, которые прочно связываются с лектином или антителом, связывающимся с эпитопом, содержащим сиаловую кислоту. Более предпочтительным является способ, в котором указанный лектин или указанное антитело,распознающее десиалилированный эпитоп или эпитоп, не содержащий сиаловой кислоты, представляет собой Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7 или PNA, и где указанная клетка миелоидного лейкоза человека представляет собой клетку линии К 5 62, KG-1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM АСС 2606], NM-D4 [DSMACC2605], NM-H9, Н 9, NM-H10. Способ получения клетки-хозяина по настоящему изобретению, обеспечивающей высокую степень сиалилирования и обладающей полезными биотехнологическими свойствами, такими как высокая скорость роста, включает (i) инкубацию клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению в качестве исходной клетки, предпочтительно, К 562, с лектином, или, предпочтительно, с антителом, которое распознает десиалилированный эпитоп или эпитоп, не содержащий сиаловой кислоты, но не связывается или связывается гораздо слабее с сиалилированной формой эпитопа, включающим без ограниченияNemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7 или PNA (лектин из Arachis hypogaea, агглютинин арахиса), предпочтительно связанный с магнитными шариками, и (ii) выделение клеток, связанных с указанным лектином или антителом, и (iii) культивирование выделенных клеток в течение подходящего времени, и (iv) отбор клетки, клеток или клеточного клона, предпочтительно, после клонирования отдельных клеток, которые прочно связываются с лектином или антителом, связывающимся с эпитопом, содержащим сиаловую кислоту, такую как SNA (агглютинин Sambucus nigra), или MAL (лектин Maackia amurensis), MAL I (лектинMaackia amurensis I), предпочтительно SNA. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина по изобретению, обеспечивающей высокую степень сиалилирования и обладающей полезными биотехнологическими свойствами, такими как высокая скорость роста, который включает (i) инкубацию К 562 с Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7 или PNA, связанным с магнитными шариками, и(ii) выделение клеток, связанных с указанным лектином или антителом, и (iii) культивирование выделенных клеток в течение подходящего времени, приблизительно от одной до 6 недель, и (iv) отбор клеточного клона после клонирования отдельных клеток, который прочно связывается с SNA. В предпочтительном варианте осуществления данные клетки сильнее связываются с SNA, чем исходная клетка, а в другом предпочтительном варианте осуществления они растут быстрее, чем исходная клетка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения исходную клетку обрабатывают этилметансульфонатом перед стадией (i). Специалисты в данной области могут выбрать условия и способы, подходящие для получения указанных клеток-хозяев, подходящих для применения в настоящем изобретении, и оптимизировать их. Более подробное описание некоторых стадий можно найти в WO 2005/017130 А 2 и WO 2005/080585 А 1. В соответствии с одним из вариантов осуществления в качестве клеток-хозяев используют иммор- 14017622 тализованные клетки крови человека, выбранные из нижеследующих групп 1-4:(a) группа 1, включающая клетки-хозяева, обладающие высокой сиалилирующей активностью, такие как К 562;(b) группа 2, включающая клетки-хозяева, в которых, вследствие генетического дефицита или подавления экспрессии (например, с помощью iPHK), сиалилирование отсутствует или присутствует на низком уровне; такие клетки включают NM-F9 [DSM АСС 2606], NM-D4 [DSM ACC2605] и GTX-2;(c) группа 3, включающая клетки-хозяева, обеспечивающие более высокую степень сиалилирования, чем К 562, такие как NM-H9 и NM-H9D8;(d) группа 4, включающая клетки-хозяева, в которых фукозилирующая активность отсутствует или присутствует на низком уровне, такие как NM-H9D8-E6 и NM H9D8-E6Q12. В предпочтительном варианте осуществления указанная полученная клеточная линия представляет собой NM-H9D8. В качестве наиболее предпочтительного клеточного клона, полученного с помощью описанного выше способа, выбран NM-H9D8, который задепонирован под номером DSM АСС 2806 в"DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Braunschweig (Germany), фирмой Glycotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Germany), 15 сентября 2006. Другие клеточные клоны, такие как NM-E-2F9, NM-C-2F5 или NM-H9D8-E6 (DSM АСС 2807) отбирают после инкубации исходных клеток с одним или несколькими лектинами с последующим клонированием отдельных клеток путем клеточного сортинга с помощью проточной цитометрии, используя либо процедуру позитивного отбора, либо сочетание позитивного и негативного отбора. Чтобы получить клеточные клоны со стабильными характеристиками, полученные клеточные клоны повторно клонируют, по меньшей мере однократно, методом серийных разведений, как указано выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная иммортализованная клетка крови человека, которая предпочтительно представляет собой клетку-хозяин миелоидного лейкоза, после выращивания продуцирует композицию молекулы белка/антитела по изобретению в отсутствие сыворотки. В более предпочтительном варианте осуществления указанную иммортализованную клетку крови человека, которая предпочтительно представляет собой клетку-хозяин миелоидного лейкоза, выращивают в отсутствие сыворотки. Кроме того, в эти клетки также можно ввести нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка/антитела, и композицию молекулы белка/антитела также можно выделить в бессывороточной среде. Возможность работать в бессывороточных условиях особенно важна при получении терапевтических белков, поскольку примеси сыворотки неприемлемы с точки зрения органов надзора и контроля. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, представляет собой клетку или клеточную линию К 562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], или клетку или клеточную линию, полученную из любой из указанных клеток-хозяев, или смесь клеток или клеточных линий, содержащую по меньшей мере одну из вышеуказанных клеток. Клетку-хозяин предпочтительно выбирают из группы, состоящей из NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8 [DSM ACC 2806], или NM-H9D8-E6 DSM АСС 2807, или NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856), GT2X (задепонированный под номером DSM АСС в "DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH" в Braunschweig (Germany), фирмой Glycotope GmbH, Robert-Rssle-Str. 10, 13125 Berlin (Germany) 7 сентября 2007), или из клетки или клеточной линии, полученной из любой указанной клеточной линии. Клетки NM-F9 [DSM АСС 2606] и NM-D4 [DSM ACC2605] задепонированы в Nemod BiotherapeuticsGmbHCo. KG1 Robert-Rssle-Str. 10, 13125 Berlin, Germany, где заявитель авторизован со ссылкой на депонированный биологический материал, описанный в настоящем описании. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека, по изобретению, представляет собой клетку или клеточную линию К 562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2 605], или клетку или клеточную линию, полученную из любой указанной клетки-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, представляет собой клетку или клеточную линию К 562, такую как К 562 [АТСС CCL-243], или клетку или клеточную линию, полученную из указанной клетки-хозяина. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, представляет собой клетку или клеточную линию К 562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC 2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, или NM-H9D8-E6, или GT-2X, или NM H9D8-E6Q12, или клетку или клеточную линию, полученную из любой указанной клетки-хозяина. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, представляет собой клетку, клетки или клеточную линию К 562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, или NM-H9D8-E6, или GT-2X, или NM H9D8-E6Q12, которая после выращивания продуцирует- 15017622 композицию молекулы антитела по изобретению в отсутствие сыворотки, причем в настоящем изобретении наиболее предпочтительно, если клетку, клетки или клеточную линию можно вводить в отсутствие сыворотки, и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу антитела, можно вводить в указанные клетки в отсутствие сыворотки, и композицию молекулы антитела можно выделять в отсутствие сыворотки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, представляет собой клетку, клетки или клеточную линию NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, GT-2X, или NM-H9D8-Еб, или NM M9D8-E6Q12, которая после выращивания продуцирует композицию молекулы антитела по изобретению в отсутствие сыворотки, причем в настоящем изобретении наиболее предпочтительно, если клетку, клетки или клеточную линию можно вводить в отсутствие сыворотки, и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу антитела, можно вводить в указанные клетки в отсутствии сыворотки, и композицию молекулы антитела можно выделять в отсутствие сыворотки. В соответствии с одним из вариантов осуществления иммортализованная клетка крови человека и клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека, не относятся к одной из дефицитных по сиалилированию клеточных линий NM-F9 и NM-D4, или к клетке или клеточной линии, полученной из любой указанной клетки-хозяина, обладающей такими же свойствами. Данный вариант осуществления является полезным, если требуется высокая степень сиалилирования. В указанных вариантах осуществления клетку-хозяин предпочтительно выбирают из группы, состоящей из К 562, NM H9D8, NMH9D8-E6, NM H9D8-E6Q12 и клеток-хозяев, полученных из любой указанной клетки-хозяина. Клеточные линии, описанные в настоящем изобретении, имеют время удвоения от 14 до 24 ч, т.е.,гораздо меньше, чем у других систем экспрессии млекопитающих, в зависимости от клеточной линии по изобретению. Кроме того, векторные системы с высоким уровнем экспрессии общего применения, подходящие для высокопродуктивной экспрессии антител в клеточных линиях человека, не известны, поскольку клетки человека обычно содержат ген DHFR и, следовательно, не позволяют применятьdhfr/метотрексатную систему амплификации. Следовательно, далее настоящее изобретение предлагает вариант осуществления, позволяющий увеличить выход продукта. В соответствии с этим вариантом осуществления в клетку-хозяин дополнительно вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивый к антифолату вариант DHFR. Дигидрофолатредуктаза, илиDHFR, используя NADPH в качестве донора электронов, восстанавливает дигидрофолиевую кислоту до тетрагидрофолиевой кислоты, которую можно превратить в разные тетрагидрофолатные кофакторы, используемые в химии 1-углеродного переноса. Антифолаты ингибируют фермент DHFR, вызывая гибель клетки. Чтобы получить нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивый к антифолату вариант DHFR,отбирают клетки, трансфицированные нуклеиновой кислотой, и затем амплифицируют нуклеиновые кислоты, которые нужно экспрессировать в клетках-хозяинах. Нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный антифолат-устойчивый вариант DHFR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок/антитело, подлежащий экспрессии в клетке-хозяине, можно вводить,например, в разных векторах. Предпочтительно вектор, кодирующий антифолат-устойчивый вариантDHFR, трансфицируют практически одновременно с вектором, который содержит нуклеиновую кислоту,кодирующую белок/антитело. Данный вариант осуществления способствует тому, что нуклеиновая кислота, кодирующая указанный подлежащий экспрессии белок/антитело, интегрируется в геном клеткихозяина в том же участке, что и нуклеиновая кислота, кодирующая устойчивый к антифолату вариантDHFR, это полезно в том случае, если нужно проводить амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок/антитело. Альтернативно, можно использовать векторную систему, которая содержит нуклеиновую кислоту,кодирующую по меньшей мере часть указанного подлежащего экспрессии белка, а также нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивый к антифолату вариант DHFR. Затем клетки-хозяева культивируют с указанным антифолатом. При этом указанные клеткихозяева, успешно трансфицированные нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный антифолатустойчивый вариант DHFR, могут расти, несмотря на присутствие антифолата. Таким образом отбирают успешно трансфицированные клетки. В соответствии с другим вариантом осуществления нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере часть указанного белка/антитела, амплифицируют, постепенно увеличивая концентрацию антифолата в культуре. Увеличение концентрации антифолата в культуральной среде приводит к увеличению числа копий устойчивого к антифолату варианта DHFR в геноме. Предположительно это является следствием событий рекомбинации в клетках. При этом число копий нуклеиновой кислоты,кодирующей по меньшей мере часть подлежащего экспрессии белка, также увеличивается, если нуклеиновая кислота, кодирующая указанный белок, располагается в геноме рядом с антифолан-устойчивым вариантом DHFR, что обеспечивается либо одновременной трансфекцией разных векторов, либо путем использования одного вектора, содержащего обе нуклеотидные последовательности. С помощью описанного способа получают клетки-хозяева, экспрессирующие белок/антитело с высоким выходом.- 16017622 Предпочтительно антифолат представляет собой метатрексат. Нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный белок, предпочтительно, молекулу антитела или ее часть, предпочтительно амплифицируют путем культивирования указанной клеткихозяина с антифолатом, предпочтительно метотрексатом, в течение по меньшей мере двух последовательных циклов, с увеличением концентрации указанного антифолата, предпочтительно метотрексата, по меньшей мере на 100% в каждом последующем цикле. Нуклеиновая кислота, подходящая для получения указанного антифолат-устойчивого вариантаDHFR, кодирует полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностейSEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1. Другие детали и варианты осуществления данной системы амплификации также подробно описаны ниже. Изобретение также относится к способу получения белка, предпочтительно, композиции молекулы антитела, включающему:(a) введение в клетку-хозяин, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, предпочтительно, молекулу антитела, или по меньшей мере один ее фрагмент, и по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид,имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно, последовательность SEQ ID NO:1; и(b) амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный белок, предпочтительно, молекулу антитела, или по меньшей мере один ее фрагмент, путем культивирования указанной клетки-хозяина с метотрексатом, предпочтительно, в течение по меньшей мере двух последовательных циклов, с увеличением концентрации метотрексата по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 100%, в каждом последующем цикле; и(c) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продукцию указанного белка, предпочтительно композиции молекулы антитела, и(d) выделение указанного белка, который предпочтительно представляет собой композицию молекулы антитела. Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции белка, предпочтительно композиции молекулы антитела, обеспечивающему повышенную активность и/или повышенный выход,и/или повышенную гомогенность продукта, и включающему:(a) введение в клетку-хозяин, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, предпочтительно, молекулу антитела, или по меньшей мере один ее фрагмент;(b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продукцию указанной композиции молекулы белка, которая предпочтительно представляет собой композицию молекулы антитела; и(с) выделение указанной композиции молекулы белка, которая предпочтительно представляет собой композицию молекулы антитела, обладающую повышенной активностью и/или получаемую с повышенным выходом, и/или имеющую повышенную гомогенность. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения композиции белка, предпочтительно, композиции молекулы антитела, обеспечивающему повышенную активность и/или повышенный выход, и/или повышенную гомогенность продукта, и включающему:(a) введение в клетку-хозяин, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, предпочтительно молекулу антитела, или по меньшей мере один ее фрагмент, и по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид,имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1; и(b) амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, путем культивирования указанной клетки-хозяина с метотрексатом, предпочтительно, в течение по меньшей мере двух последовательных циклов, с увеличением концентрации метотрексата по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 100%, в каждом последующем цикле; и(c) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продукцию указанной композиции белка, которая предпочтительно представляет собой композицию молекулы антитела; и(d) выделение указанной композиции белка, которая предпочтительно представляет собой композицию молекулы антитела, обладающую повышенной активностью и/или получаемую с повышенным выходом, и/или имеющую повышенную гомогенность. Указанная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, и указанная нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбран- 17017622 ную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1,могут представлять собой одну нуклеиновую кислоту или две отдельные нуклеиновые кислоты. Чтобы выбрать клетку-хозяин, подходящую для получения белка, обладающего оптимальным профилем гликозилирования, предпочтительно использовать способ скрининга/селекции по изобретению. После выбора подходящей клетки-хозяина с помощью способа селекции по изобретению, указанную клетку-хозяин используют для получения белка способом, описанным в п.1-20. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу селекции клетки-хозяина для получения белка, обладающего по меньшей мере одной из нижеследующих характеристик гликозилирования:(ii) степень галактозилирования во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, повышена по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr[АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках; и/или(iii) количество структур G2 во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% выше по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках; и/или(iv) количество структур G0 во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% ниже по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках; и/или(vi) количество фукозы во всех углеводных структурах или в углеводных структурах одного конкретного участка гликозилирования молекулы белка, входящей в состав указанной композиции молекулы белка, по меньшей мере на 5% меньше по сравнению с таким же количеством молекул белка, входящих в состав по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках; и/или(vii) по меньшей мере одна углеводная структура содержит биссекторный GlcNAc; и/или(viii) характер сиалилирования отличается от характера сиалилирования по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка, выделенной из CHOdhfr- [АТССCRL-9096] после экспрессии в данных клетках; включающему следующие стадии:(a) введение по меньшей мере в две разные иммортализованные клетки крови человека, используемые в качестве клеток-хозяев, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или по меньшей мере одну его часть; и(b) культивирование указанных по меньшей мере двух разных клеток-хозяев, где каждая отдельная клетка-хозяин продуцирует композицию белка, характер гликозилирования которой отличается от характера гликозилирования композиции белка, продуцируемой другой клеткой-хозяином;(c) выделение указанных композиций белка с разными характерами гликозилирования по меньшей мере из двух разных клеток-хозяев; и(d) отбор указанной клетки-хозяина, продуцирующей белковую композицию, обладающую по меньшей мере одной из характеристик гликозирования, перечисленных в пп. (i)-(viii). Описанные выше детали, касающиеся характера гликозилирования и клеточных линий, подходящих для получения указанного характера, также могут использоваться в способе скрининга для отбора клетки-хозяина, подходящей для использования в настоящем изобретении. Перед проведением способа получения, описанного в пп.1-20, предпочтительно выполнить соответствующую стадию скрининга, позволяющую выбрать клетку-хозяин, наиболее подходящую для получения композиции молекулы белка/антитела с оптимизированным характером гликозилирования. В соответствии с основной идеей данной системы скрининга представляющий интерес белок экспрессируется по меньшей мере в двух разных клеточных линиях, которые обеспечивают разный характер гликозилирования. Например, одна клеточная линия может продуцировать продукт с высокой степенью сиалилирования, а другая - с низкой степенью сиалилирования (или фукозилирования и/или галактозилирования), или даже с неизвестными характеристиками гликозилирования. Соответственно, продукты, полученные из разных клеточных линий, имеют характер гликозилирования, присущий соответствующей клеточной линии. Затем можно определить характеристики белков, продуцируемых в разных клеточных линиях, касающиеся их активности (например, ADCC и CDC в случае антител), аффинности, периода полужизни в сыворотке, а также другие важные характеристики. Полученные результаты позволяют выбрать клеточ- 18017622 ную линию, обладающую наилучшим механизмом гликозилирования, чтобы получить белок, оптимизированный по характеру гликозилирования. Поскольку решающие характеристики (например, аффинность, период полужизни в сыворотке и др.) варьируют, данный способ является особенно предпочтительным. Предпочтительно указанный продуцируемый белок имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик:(а) если белок представляет собой композицию молекулы антитела, он обладает повышенной Fcопосредованной клеточной цитотоксичностыо, которая по меньшей мере в 2 раза выше, чем Fcопосредованная клеточная цитотоксичность по меньшей мере одной композиции молекулы антитела такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или(b) если белок представляет собой композицию молекулы антитела, он обладает повышенным антиген-опосредованным или Fc-опосредованным связыванием, которое по меньшей мере на 50% выше, чем связывание по меньшей мере одной композиции молекулы антитела такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]; и/или(c) средний или максимальный выход указанной композиции молекулы белка по меньшей мере на 10% выше, чем выход по меньшей мере одной композиции молекулы белка такой же молекулы белка,экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096]. В соответствии с одним из вариантов осуществления по меньшей мере одна из указанных клетокхозяев представляет собой иммортализованную клетку крови человека, предпочтительно, клетку, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, такую как К 562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4[DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT- 2X, или клетку или клеточную линию, полученную из указанных клеток. По меньшей мере одна указанная клетка-хозяин, полученная из клетки миелоидного лейкоза человека, может быть выбрана из нижеследующих групп 1-4:(a) группа 1, которая включает клетки-хозяева, обладающие высокой сиалилирующей активностью,такие как К 562, или полученные из них клетки или клеточные линии;(b) группа 2, которая включает клетки-хозяева, в которых, вследствие генетического дефицита или подавления экспрессии (например, с помощью iPHK), сиалилирование отсутствует или присутствует на низком уровне, такие как NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] и GTX-2, или полученные из них клетки или клеточные линии;(c) группа 3, которая включает клетки-хозяева, обеспечивающие более высокую степень сиалилирования, чем К 562, такие как NM-H9 и NM-H9D8, или полученные из них клетки или клеточные линии;(d) группа 4, включающая клетки-хозяева, в которых фукозилирующая активность отсутствует или присутствует на низком уровне, такие как NM-H9D8-E6 и NM H9D8-E6Q12, или полученные из них клетки или клеточные линии. Предпочтительно по меньшей мере две или три клетки-хозяева, используемые в процедуре скрининга, выбирают из вышеуказанных групп. Однако чтобы расширить диапазон анализируемых характеров гликозилирования, в системе скрининга по изобретению можно использовать и другие клеткихозяева, полученные из дополнительного источника (например, из клеток Hek 293). Полученная клетка-хозяин предпочтительно продуцирует белок, в частности антитело, гликозилирование которого соответствует по меньшей мере одной из схем, приведенных в табл. 9. В настоящем изобретении термин "введение нуклеиновой кислоты" относится к любому известному специалистам в данной области способу введения нуклеиновой кислоты, или двух или более нуклеиновых кислот, в клетку-хозяин или клетки-хозяева млекопитающих с помощью способов, включающих,без ограничения, электропорацию, трансфекцию с использованием катионных липидов, фосфата кальция, DEAE-декстрана или инфицирование вирусными частицами, такими как аденовирусы или ретровирусы, или их сочетание. Специалисты в данной области могут выбрать способ, подходящий для введения одной или нескольких нуклеиновых кислот по изобретению, и оптимизировать его. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела,представляет собой любую нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент. Следовательно, молекулу антитела по изобретению может кодировать одна или несколько молекул нуклеиновых кислот. Указанная часть молекулы антитела, кодируемая указанной нуклеиновой кислотой, включает по меньшей мере одну последовательность из 20 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере 100 аминокислот молекулы антитела или константного и/или вариабельного домена молекулы антитела. Последовательность, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, может быть разделена по меньшей мере одной другой последовательностью, такой как, например, интрон. Последовательность домена может содержать по меньшей мере одну аминокислотную мутацию. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу белка,представляет собой любую нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент. Следовательно, молекулу белка по изобретению может кодировать одна или несколь- 19017622 ко молекул нуклеиновых кислот. Последовательность, кодирующая молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент, может быть разделена по меньшей мере одной другой последовательностью, такой как, например, интрон. Последовательность молекулы белка может содержать по меньшей мере одну аминокислотную мутацию. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, которая содержит по меньшей мере один вариабельный и/или по меньшей мере один константный домен молекулы антитела, более предпочтительно оба домена, более предпочтительно такой константный домен или константные домены, по меньшей мере часть которых представляет собой последовательность человека, еще более предпочтительно такие домены, которые содержат домен Сгамма 2 человека, и наиболее предпочтительно она содержит все константные домены фрагмента Fc антитела человека определенного класса или подкласса и вариабельный домен. В соответствии с одним из вариантов осуществления белок, в частности, молекула антитела, кодируется одной нуклеиновой кислотой. В другом предпочтительном варианте осуществления белок, в частности, молекула антитела, кодируется двумя нуклеиновыми кислотами или тремя нуклеиновыми кислотами. В другом предпочтительном варианте осуществления одна нуклеиновая кислота кодирует одну часть молекулы антитела, например, вариабельный и/или константный домен легкой цепи, а другая нуклеиновая кислота кодирует другую часть молекулы антитела, например вариабельный и/или по меньшей мере один константный домен тяжелой цепи. В соответствии с настоящим изобретением, если нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, это означает, что указанная нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность,выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQID NO:1. Число данных последовательностей может быть любым, при условии, что его можно успешно ввести в клетку-хозяин по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота кодирует один, два или три полипептида из группы последовательностей SEQ IDNO:1-9, более предпочтительно один полипептид, наиболее предпочтительно полипептид с последовательностью SEQ ID NO:1. В контексте настоящего изобретения указанная нуклеиновая кислота также может кодировать полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1, которая содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию при условии, что данная мутация не препятствует протеканию амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, в присутствии метотрексата, как описано в настоящем описании. Нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1, и нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, как описано в настоящем описании, могут входить в состав одной молекулы нуклеиновой кислоты или разных молекул нуклеиновых кислот. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отдельную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно последовательностьSEQ ID NO:1, можно ввести в клетку-хозяин по изобретению отдельно от указанной нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу антитела по изобретению или ее фрагменты. Это можно осуществить либо путем введения указанной отдельной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, одновременно, до или после введения указанной нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу антитела по изобретению или ее фрагменты. В предпочтительном варианте осуществления введение осуществляют параллельно, а в другом предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по изобретению уже содержит указанную отдельную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно, последовательность SEQ ID NO:1. Другие предпочтительные варианты осуществления описаны в примерах. Амплификацию стабильно введенной указанной нуклеиновой кислоты или нескольких копий указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или ее фрагмент, можно проводить по способу, описанному в данном разделе и примерах,с использованием метотрексата. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит по меньшей мере один другой генетический элемент, позволяющий проводить отбор клеток, в которые успешно введена нуклеиновая кислота, включающий, без ограничения, гены устойчивости к анти- 20017622 биотикам, такие как, без ограничения, генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину или неомицину. Кроме того, указанные нуклеиновые кислоты содержат один или несколько таких генетических элементов, как промоторы, энхансеры, участки полиаденилирования и/или интроны, обеспечивающие экспрессию молекулы антитела в клетках-хозяевах по изобретению, а также такие генетические элементы, как бактериальные репликаторы, промоторы и элементы, обеспечивающие отбор трансфицированных бактерий, такие как гены устойчивости к антибиотикам, необходимые для амплификации нуклеиновой кислоты в бактериях. Подходящие промоторы включают промотор немедленно-раннего гена IE цитомегаловируса(CMV), ранний промотор SV40, промотор ретровируса, промотор гена металлотионеина, промотор гена белка теплового шока, альфа-промотор SR, альфа-промотор EF-1 и др. Энхансер гена IE CMV человека можно использовать в сочетании с промотором. Перечисленные генетические элементы, а также другие, известные в данной области, могут быть выбраны специалистом в данной области, объединены, оптимизированы и введены в указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент. Предпочтительные варианты осуществления указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, или сочетания нуклеиновых кислот описаны в данном разделе и примерах, как и применение и сочетания предпочтительных генетических элементов, однако настоящее изобретение не ограничивается применением указанных вариантов осуществления и допускает, что специалисты в данной области могут их объединять и дополнительную оптимизировать. Специалисты в данной области могут выбрать и/или объединить подходящие генетические элементы, создать нуклеотидные векторы или элементы, подходящие для введения одной или нескольких нуклеиновых кислот по изобретению в клеточную линию в соответствии с настоящим изобретением. Указанная нуклеиновая кислота или сочетание нуклеиновых кислот, кодирующих белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, указанные дополнительные генетические элементы, а также способы их введения, такие как трансфекция в клетки-хозяева по изобретению с целью экспрессии композиции молекулы антитела, или в бактерии с целью амплификации, известны специалистам в данной области, как и способы конструирования, идентификации, тестирования, оптимизации, отбора и объединения указанных нуклеиновой кислоты или кислот, а также присоединения к ним подходящих дополнительных последовательностей, обеспечивающих отбор успешно трансфицированных клеток, и способы конструирования, идентификации, тестирования и отбора наиболее подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы антител. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны в примерах. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит генетический элемент, обеспечивающий отбор клеток-хозяев по изобретению, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, который включает, без ограничения, ген устойчивости к неомицину или пуромицину, более предпочтительно она также содержит промотор, такой как промотор EF-1 альфа или промотор CMV, более предпочтительно она также содержит энхансер CMV, более предпочтительно она также содержит генетический элемент, позволяющий проводить отбор бактерий,трансфицированных нуклеиновой кислотой, и генетический элемент, обеспечивающий репликацию, такой как репликатор ColE1, позволяющий проводить амплификацию указанной нуклеиновой кислоты в бактериях, и еще более предпочтительно она также содержит генетический элемент, обеспечивающий амплификацию указанной нуклеиновой кислоты в клетках COS, такой как репликатор SV40. Данные элементы известны специалистам в данной области, которые могут их выбирать, объединять, оптимизировать и использовать. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит одну нуклеотидную последовательность. Предпочтительно указанная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит дополнительно генетический элемент,кодирующий устойчивость к пуромицину, или устойчивость к неомицину, или нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно, последовательность SEQ ID NO:1. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую вариабельный домен и по меньшей мере один константный домен тяжелой и/или легкой цепи молекулы антитела. В еще болеепредпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую вариабельный домен и константный домен легкой цепи молекулы антитела, или вариабельный домен и все константные домены тяжелой цепи пол- 21017622 норазмерной молекулы антитела. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одна из указанных выше нуклеиновых кислот кодирует по меньшей мере один фрагмент молекулы антитела и содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую вариабельный домен и константный домен легкой цепи молекулы антитела, а вторая из указанных выше нуклеиновых кислот кодирует по меньшей мере один другой фрагмент молекулы антитела и содержит по меньшей мере одну последовательность,кодирующую вариабельный домен и по меньшей мере один константный домен, предпочтительно, все константные домены тяжелой цепи молекулы антитела, причем обе нуклеиновые кислоты вводят в одну клетку-хозяин по изобретению. Предпочтительно одна из указанных нуклеиновых кислот содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину, а другая указанная нуклеиновая кислота содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к неомицину. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент содержит по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, кодирующие две аминокислотные последовательности молекулы белка или по меньшей мере один ее фрагмент. Предпочтительно одна из указанных нуклеиновых кислот содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину, одна другая указанная нуклеиновая кислота содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к неомицину. Более предпочтительно одна из указанных нуклеиновых кислот содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину или устойчивость к неомицину, предпочтительно устойчивость к пуромицину, а одна другая указанная нуклеиновая кислота содержит также нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу белка или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит три нуклеотидные последовательности, кодирующие три аминокислотные последовательности молекулы белка или по меньшей мере один ее фрагмент. Предпочтительно одна из указанных нуклеиновых кислот содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину, другая указанная нуклеиновая кислота содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к неомицину, а следующая указанная нуклеиновая кислота содержит также нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно, последовательность SEQ ID NO:1. В более предпочтительном варианте осуществления одна из указанных нуклеиновых кислот содержит дополнительно генетический элемент, кодирующий устойчивость к пуромицину или устойчивость к неомицину, а другая указанная нуклеиновая кислота содержит также нуклеотидную последовательность,кодирующую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы последовательностейSEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1. В еще более предпочтительном варианте осуществления одна из указанных нуклеиновых кислот содержит последовательности,кодирующие вариабельный домен и константный домен легкой цепи, и, кроме того, нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, наиболее предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1, а другая указанная нуклеиновая кислота содержит последовательности, кодирующие вариабельный домен и по меньшей мере один константный домен, предпочтительно все константные домены тяжелой цепи молекулы антитела, и, кроме того, она содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивость к пуромицину или устойчивость к неомицину, предпочтительно устойчивость к пуромицину. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую вариабельный домен и константный домен легкой цепи молекулы антитела, и по меньшей мере одну последовательность, кодирующую вариабельный домен и по меньшей мере один константный домен, предпочтительно все константные домены тяжелой цепи молекулы антитела. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения константные домены, кодируемые описанными выше или в других разделах нуклеиновыми кислотами по изобретению, представляют собой константные домены IgG или IgM человека, предпочтительно IgG1, IgG4 или IgM человека,или их один домен, или сочетание доменов, в соответствии с чем предпочтительно используют геномные последовательности или последовательности, полученные из геномных последовательностей, которые содержат по меньшей мере один интрон и которые могут быть выбраны, сконструированы и оптимизированы специалистами в данной области. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок по изобретению, который предпочтительно представляет собой молеку- 22017622 лу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, дополнительно содержит промотор EF-1 альфа/энхансер CMV или промотор, полученный из промотора CMV, предпочтительно CMV-E. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок по изобретению, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, дополнительно содержит сигнальный пептид секреции, предпочтительно, Т-клеточный рецепторный сигнал секреции. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок по изобретению, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, дополнительно содержит сигнальный пептид секреции, предпочтительно, последовательность SEQ ID NO:10. Указанная нуклеиновая кислота или сочетание нуклеиновых кислот, кодирующих белок, который предпочтительно представляет собой молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, указанные дополнительные генетические элементы, а также способы их введения известны специалистам в данной области, как и способы конструирования, идентификации, тестирования, оптимизации, отбора и объединения указанных нуклеиновых кислот, а также присоединения к ним подходящих дополнительных последовательностей, обеспечивающих отбор успешно трансфицированных клеток, и способы конструирования, идентификации, тестирования и отбора наиболее подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы антител. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны в примерах. Введение нуклеиновой кислоты может быть транзиторным или стабильным. В соответствии с настоящим изобретением термин "амплификация нуклеотидной последовательности, кодирующей белок или молекулу антитела" или по меньшей мере один ее фрагмент, путем культивирования указанной клетки-хозяина в присутствии антифолата, в частности метотрексата, означает, что описанную в настоящем описании клетку-хозяин по изобретению, в которую введена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая подлежащий экспрессии белок, такой как, например, молекула антитела, или по меньшей мере один ее фрагмент, и по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивый к антифолату вариант DHFR, предпочтительно по меньшей мере, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1, культивируют в присутствии по меньшей мере одной концентрации антифолата, предпочтительно метотрексата. Обычно время культивирования для каждого цикла находится в интервале от одной до двух недель,типичные концентрации составляют приблизительно от 20 до 3000 нМ, предпочтительно приблизительно от 50 до 2000 нМ, более предпочтительно приблизительно от 100 до 2000 нМ. Продолжительность амплификации в присутствии антифолата/метотрексата, а также концентрация и соответствующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению, описаны в предпочтительных вариантах осуществления в примерах и могут быть оптимизированы специалистами в данной области. При получении разных белков/молекул антител и применении разных нуклеиновых кислот или нуклеотидных конструкций, или их сочетаний, описанных выше, оптимальные условия амплификации могут варьировать. Специалисты в данной области могут выбрать и оптимизировать наиболее подходящие условия и нуклеиновые кислоты по изобретению. Указанная амплификация приводит к внедрению в геном клетки-хозяина большего числа копий нуклеиновой кислоты, кодирующей белок/молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, чем в случае культивирования в отсутствии антифолата/метотрексата, или при отсутствии введения нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один устойчивый к антифолату вариант DHFR, в частности, полипептид, последовательность которого выбрана из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, и/или такая амплификация приводит к повышению продукции композиции молекулы белка/антитела. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная клетка-хозяин,используемая для амплификации нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу белка/антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, где в указанную клетку-хозяин вводят по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1, как описано в настоящем описании, включая его предпочтительные варианты осуществления, представляет собой клетку, полученную из клетки миелоидного лейкоза человека, предпочтительно клетку или клеточную линию KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NMC-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2 Х, или клетку, или клеточную линию, полученную из любой указанной клетки-хозяина, более предпочтительно клетку или клеточную линию К 562,NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6,NM-H9D8-E6Q12, GT-2 Х, или клетку или клеточную линию, полученную из любой указанной клеткихозяина, еще более предпочтительно клетку или клеточную линию NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4- 23017622 клетку или клеточную линию, полученную из любой указанной клетки-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную клетку-хозяин культивируют в течение по меньшей мере двух последовательных циклов в присутствии антифолата/метотрексата, причем в каждом последующем цикле концентрацию антифолата/метотрексата предпочтительно увеличивают по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100%. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную клетку-хозяин культивируют в течение по меньшей мере трех, более предпочтительно, четырех, более предпочтительно, 5, еще более предпочтительно, 6 последовательных циклов в присутствии антифолата/метотрексата, причем в каждом последующем цикле концентрацию антифолата/метотрексата предпочтительно увеличивают по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100%. Еще более предпочтительными являются концентрации антифолата/метотрексата приблизительно от 20 до 3000 нМ, более предпочтительно приблизительно от 50 до 2000 нМ, более предпочтительно приблизительно от 100 до 2000 нМ и еще более предпочтительно приблизительно 100, 200, 500, 1000, 2000 нМ, которые в предпочтительном варианте осуществления используют в последовательных циклах, начиная со 100 нМ. Неожиданным является то, что введение нуклеотидной последовательности, кодирующей вариантDHFR, устойчивый к антифолату, и предпочтительно по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, позволяет проводить амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную молекулу белка/антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, в клетке-хозяине, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека по изобретению, особенно в К 562, NM-F9 [DSM АСС 2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9,NM-C-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X, или клетке, или клеточной линии,полученной из любой указанной клетки-хозяина, путем культивирования в присутствии антифолата/метотрексата. Особенно неожиданным является то, что введение нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, позволяет проводить амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, в клетке-хозяине по изобретению, особенно в К 562, NM-F9 [DSMACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6, NM-H9D8E6Q12, GT-2X, или клетке или клеточной линии, полученной из любой указанной клетки-хозяина, путем культивирования с метотрексатом. Еще более неожиданным является то, что введение нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:1-9, позволяет также проводить амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, в клеткехозяине по изобретению, особенно, в К 562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X, или клетке или клеточной линии, полученной из любой указанной клетки-хозяина, путем культивирования указанной клетки-хозяина в течение по меньшей мере двух последовательных циклов в присутствии метотрексата, причем в каждом последующем цикле концентрацию метотрексата увеличивают по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100%. Еще более неожиданным является то, что введение нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, позволяет также проводить амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную молекулу антитела или по меньшей мере один ее фрагмент, в клетке-хозяине по изобретению, особенно, в К 562, NM-F9[DSM ACC2606], NM-D4 [DSM АСС 2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 или NM-H9D8-E6, NMH9D8-E6Q12, GT-2X, или клетке или клеточной линии, полученной из любой указанной клетки-хозяина,путем культивирования указанной клетки-хозяина в течение по меньшей мере двух последовательных циклов в присутствии метотрексата, причем в каждом последующем цикле концентрацию метотрексата увеличивают по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100%. В предпочтительном варианте осуществления термин "стабильная амплификация" означает, что такая амплификация позволяет получать композицию молекулы антитела с высоким выходом в течение по меньшей мере 35 поколений клетки-хозяина или циклов клеточного деления. Амплификацию стабильно введенной указанной нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу белка/антитела или ее фрагмент, можно проводить по способу, описанному выше и в примерах с использованием метотрексата. Другие предпочтительные варианты осуществления описаны в примерах. В предпочтительном варианте осуществления клетку-хозяин по изобретению, содержащую нуклеиновые кислоты по изобретению, предпочтительно используют после по меньшей мере одного цикла клонирования отдельных клеток и отбора клеточных клонов с подходящей экспрессией и секрецией указанной композиции белка/антитела. Предпочтительно указанные клонирование отдельных клеток и отбор- 24017622 клеточных клонов с подходящей экспрессией и секрецией указанной композиции белка/антитела проводят после по меньшей мере одного цикла амплификации в присутствии метотрексата, описанной в настоящем описании. В другом предпочтительном варианте осуществления указанные клеточные клоны дополнительно амплифицируют в течение по меньшей мере одного дополнительного цикла амплификации в присутствии метотрексата, предпочтительно, повышенной концентрации метотрексата, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно удвоенной концентрации метотрексата, и еще более предпочтительно с последующим циклом клонирования отдельных клеток и отбора клеточных клонов с подходящей экспрессией и секрецией указанной композиции белка/антитела. Используя эти предпочтительные варианты осуществления, можно выбрать клеточные клоны, обеспечивающие высокопродуктивную экспрессию. В соответствии с настоящим изобретением термин "культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продукцию указанной композиции молекулы антитела" или соответствующей композиции белков, как правило, означает, что клетку-хозяин по изобретению, содержащую по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка/антитела, предпочтительно предпочтительные варианты осуществления указанной нуклеиновой кислоты по изобретению, описанные в настоящем описании, культивируют в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы белка/антитела в виде композиции молекулы белка/антитела, предпочтительно секрецию в среду, предпочтительно, с высоким выходом, и/или высокой активностью, и/или высокой гомогенностью, как описано в настоящем описании. Специалисты в данной области могут выбрать наиболее подходящие условия культивирования, включающие, без ограничения, подходящие время, температуру, рН, атмосферу, питание,среду, добавки для среды, размеры сосуда или реактора и принципы, известные специалистам в данной области. Специалисты в данной области могут выбрать и оптимизировать наиболее подходящие условия. Предпочтительные варианты осуществления описаны в примерах, но не ограничиваются приведенными описаниями. Культивирование клеток по настоящему изобретению можно проводить с помощью любого общего способа культивирования животных клеток, обеспечивающего эффективную продукцию целевой композиции молекулы антитела, например, с использованием периодической культуры, цикличной периодической культуры, периодической культуры с подпиткой и перфузионной культуры. Предпочтительно, периодическую культуру с подпиткой и перфузионную культуру используют, чтобы повысить выход желательных полипептидов. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное культивирование проводят в отсутствии сыворотки, более предпочтительно, в среде, не содержащей белков, или в среде, не содержащей животных компонентов. Адаптация клеток-хозяев по изобретению к бессывороточной среде в соответствии с настоящим изобретением проходит удивительно быстро и является устойчивой. Адаптацию можно проводить, например, путем адаптации клеток, субкультивированных в среде, содержащей сыворотку, непосредственно к коммерчески доступной бессывороточной среде, или путем продолжительной адаптации, причем непосредственная адаптация к бессывороточной среде является предпочтительной и эффективной. В процессе адаптации к бессывороточной среде жизнеспособность клеток временно снижается, что иногда вызывает вымирание клеток. Следовательно, чтобы сохранить жизнеспособность клеток или поддержать ее на высоком уровне, при адаптации к бессывороточной среде клетки предпочтительно вносить в среду с плотностью 1105 - 5105 клеток/мл, предпочтительно, 2105 клеток/мл. После 4-7 дней культивирования в качестве клеток, адаптированных к бесклеточной среде, выбирают клетки, плотность которых достигает 5105 - 10105 клеток/мл. Адаптацию к бессывороточной среде также можно проводить путем последовательного разбавления среды, содержащей FCS, композицией бессывороточной среды (последовательная адаптация). Специалисты в данной области могут выбрать и оптимизировать наиболее подходящие условия. Предпочтительные варианты осуществления описаны в примерах, но не ограничиваются приведенными описаниями. После адаптации клеток по настоящему изобретению к бесклеточной среде можно получить клонированную клеточную линию, используя метод серийных разведений в 96-луночном планшете, колониеобразующий метод и т.п., причем клетки или клеточную линию выбирают, если их свойства обладают преимуществами по сравнению со свойствами исходной клетки или клеточной линии, такими как, без ограничения, более короткое время удвоения, ускоренный рост, способность расти при повышенной плотности, повышенная продуктивность, повышенная эффективность клонирования, повышенная эффективность трансфекции ДНК, повышенная скорость экспрессии композиции молекулы антитела, повышенная активность экспрессируемой в данной клетке композиции молекулы антитела, повышенная гомогенность экспрессируемой в данной клетке композиции молекулы антитела и/или повышенная устойчивость к масштабированию. Способы отбора клеток с предпочтительными свойствами известны специалистам в данной области или описаны в настоящем описании. В соответствии с настоящим изобретением термин "выделение указанной композиции молекулы антитела" или соответствующей композиции белков, как правило, означает, что композицию молекулы- 25017622 белка/антитела, экспрессируемую в указанной клетке-хозяине, содержащей по меньшей мере одну из описанных в настоящем описании нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу белка/антитела или ее фрагмент, извлекают из культуральной среды после культивирования или последующего обогащения или очистки композиции молекулы белка/антитела или частей указанной композиции молекулы белка/антитела с помощью известных в данной области способов. Указанная композиция молекулы белка/антитела в контексте настоящего изобретения также включает части указанной композиции молекулы белка/антитела, обогащенные некоторыми молекулами белка/антитела, описанные в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления композицию молекулы белка/антитела выделяют после культивирования путем отделения среды от клеток и/или клеточных остатков, например, методом центрифугирования. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы белка/антитела по изобретению выделяют или дополнительно обогащают, используя методы ультрафильтрации, преципитации или другие методы концентрирования, известные специалистам в данной области. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы белка/антитела по изобретению выделяют путем очистки композиции молекулы белка/антитела с помощью известных специалистам в данной области хроматографических методов, таких как, без ограничения, аффинная хроматография с использованием соответствующих аффинных веществ, таких как,без ограничения, белок А, белок G, антитела против антител, лектин, антитела против конкретного маркера, введенного в молекулу антитела, такого как HIS-маркер или myc-маркер, или антиген, или ионнообменная хроматография. Другие способы очистки или обогащения белков или некоторых гликоформ белков известны специалистам в данной области и могут быть выбраны, заимствованы, оптимизированы и использованы специалистами в данной области отдельно или в сочетании с описанными выше способами для выделения или дополнительной очистки, фракционирования или обогащения композиции молекулы белка по изобретению или ее фрагментов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы антитела по изобретению, преимущественно IgG, выделяют методом хроматографии с использованием белка А, перед которой необязательно проводят ультрацентифугирование. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы антитела по изобретению, преимущественно IgM, выделяют методом хроматографии с использованием антитела против IgM, перед которой необязательно проводят ультрацентифугирование. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы антитела по изобретению, обогащенную конкретными гликоформами молекулы антитела, выделяют методом аффинной хроматографии с использованием лектина, перед которой необязательно проводят ультрацентифугирование. Другие способы очистки или обогащения белков или некоторых гликоформ белков известны специалистам в данной области и могут быть выбраны, заимствованы, оптимизированы и использованы специалистами в данной области отдельно или в сочетании с описанными выше способами для выделения или дополнительной очистки, фракционирования или обогащения композиции молекулы антитела по изобретению или ее фрагментов. В предпочтительном варианте осуществления композицию молекулы антитела выделяют на колонке, содержащей белок А. В другом предпочтительном варианте осуществления композицию молекулы антитела выделяют на колонке, содержащей антитело против IgM. В соответствии с настоящим изобретением термин "повышенная активность" означает, что активность композиции молекулы белка и/или антитела по изобретению, экспрессированной в клетке-хозяине,полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, выше, чем активность композиции по меньшей мере одной такой же молекулы белка/антитела, экспрессированной по меньшей мере в одной из клеточных линий СНО, или CHOdhfr-, или ВНК, или NS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиной гибридомы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный термин означает, что активность композиции молекулы белка/антитела по изобретению, экспрессированной в клетке-хозяине,полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, выше, чем активность композиции такой же молекулы белка/антитела, экспрессированной в CHOdhfr- [АТССCRL-9096]. В случае антител указанная повышенная активность представляет собой повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность, или повышенную связывающую активность. В настоящем изобретении термин "активность" также относится к функции, или к ряду функций,выполняемых молекулой белка в биологическом контексте. В настоящем изобретении термин "повышенная активность", эквиваленты его содержания и его грамматические эквиваленты следует понимать как улучшенную или оптимальную активность в отношении выбранного применения, в соответствии с чем активность может быть либо приближена к предельному значению, будучи минимизированной или максимизированной, или она может соответствовать среднему значению, представляя собой более высокую или более низкую активность, чем активность соответствующей молекулы белка, полученной по- 26017622 средством предшествующего уровня техники. Улучшенная или повышенная активность в контексте настоящего изобретения также обозначает благоприятную активность с точки зрения ее биологического и/или фармацевтического понимания, например, улучшенные период полужизни в сыворотке, фармакокинетика, стабильность, биологическая активность, связывание, антигенность и/или иммуногенность. Например, биологическая активность композиции молекулы белка может быть повышена до некоторой степени в результате уменьшения неблагоприятных биологических эффектов, например, в результате уменьшения стимуляции неблагоприятных иммунных эффектов или пониженной иммуногенности. Активность композиции молекулы белка в соответствии с настоящим изобретением можно определить с помощью подходящего биологического анализа, позволяющего определять активность белка. Специалисты в данной области могут определить или разработать подходящие биологические анализы. В соответствии с настоящим изобретением такие биологические анализы включают, например, биологические анализы in vitro, в том числе клеточные, молекулярные или смешанные анализы, такие как анализы пролиферации, анализы апоптоза, анализы клеточной адгезии, анализы передачи сигнала, анализы миграции, анализы клеточной цитотоксичности, анализы фагоцитоза, анализы лизиса и анализы связывания. Такие биологические анализы также включают анализы in vivo, проводимые на животных моделях или на людях, такие как биораспределение, фармакокинетика, фармакодинамический тест, определение периода полужизни в сыворотке, определение биодоступности, определение эффективности, определение локализации, определение эффективности лечения и профилактики заболеваний, включающее в себя клинические исследования. Такие биологические анализы также включают химические, физические, физикохимические, биофизические и биохимические анализы, например, стабильности при изменении температуры, напряжения сдвига, давления, рН, а также при конъюгировании и др. Такие биологические анализы также включают анализы иммуногенности и/или антигенности, проводимые с целью улучшения свойств композиции молекулы белка, касающихся ее клинического применения. Специалисты в данной области могут определить активность или сочетание желательных активностей композиций молекулы белка. В предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы белка характеризуется повышенной активностью по меньшей мере в одной модели in vitro, и/или повышенной активностью по меньшей мере в одной модели in vivo, и/или повышенной стабильностью, и/или более продолжительным периодом полужизни в сыворотке, и/или более длительной биодоступностью, и/или улучшенной иммуногенностью, и/или улучшенной антигенностью, определяемыми по меньшей мере с помощью одного биологического анализа. Улучшение общей активности, которое в данном описании также называют повышенной активностью, позволяет получать фармацевтические средства с усовершенствованными свойствами, например, такими как применение более низких доз, более длительные интервалы времени введения, снижение побочных эффектов и отсутствие токсичности или пониженная токсичность продукта у людей или соответственных организмов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активность композиции молекулы белка по изобретению, экспрессированной в клетке-хозяине, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, превышает активность композиции по меньшей мере одной такой же молекулы белка,полученной в соответствии с предшествующим уровнем техники. Указанная повышенная Fc-опосредованная клеточнаяцитотоксичность представляет собой повышенную антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (активность ADCC), комплемент-зависимую цитотоксичность (активность CDC) и/или цитотоксичность, связанную с фагоцитозом (активность фагоцитоза). Повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность, в том числе активность ADCC,активность CDC или активность фагоцитоза можно определить разными способами, известными специалистам в данной области, некоторые из них подробно описаны в примерах, но не ограничиваются приведенными методами, причем способы, описанные в примерах, являются предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения. Указанная повышенная связывающая активность представляет повышенное связывание с эпитопом молекулы антитела, таким как эпитоп, антиген, другой полипептид, содержащий эпитоп, или клетка, содержащая эпитоп молекулы антитела, или повышенное связывание по меньшей мере с одним рецептором Fc, или другим эффекторным лигандом, включающим Fc-гаммaRI, Fc-гаммaRII, Fc-гаммaRIII и их подклассы, такие как Fc-гaммaRIIa, Fc-гаммaRIIIa, Fc-гаммaRIIIb, или компонент комплемента Clq, илиFcRn, или молекулу, или клетку, содержащую любой из указанных рецепторов Fc или эффекторных лигандов. Повышенная связывающая активность может представлять собой повышенную аффинность, повышенную авидность и/или более высокое число связывающих участков, или их сочетание. Причиной повышенной связывающей активности могут быть разные эффекты и активности, включающие, без ограничения, формы рецептор-опосредованной активности, описанные в разделе Уровень техники изобретения. Повышенную связывающую активность, авидность и рецептор-опосредованную активность можно определить с помощью по меньшей мере одного из разных способов, известных специалистам в данной области, таких как, без ограничения, анализ Biacore, анализ Скэтчарда, анализы с использованием методов ELISA или RIA, анализы с использованием метода проточной цитометрии, анализ индукции- 27017622 апоптоза в подходящих клетках-мишенях, анализы пролиферации подходящих клеток-мишеней, анализ антагонистической, агонистической и/или рецепторной блокады композиции молекулы антитела, такой как, без ограничения, ингибирование связывания, опосредованного межклеточными взаимодействиями,приведение в действие внутриклеточных молекулярных событий. Специалисты в данной области могут выбрать, и/или заимствовать, и/или модифицировать способ или сочетание способов, подходящие для анализа связывающей активности, авидности, числа связывающих участков и/или рецепторопосредованной активности. Способы по изобретению можно использовать для анализа способности антитела проявлять повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность, предпочтительно, активность ADCC, активность CDC и/или цитотоксичность, вызываемую фагоцитозом, и/или повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу молекулы антитела или, предпочтительно, по меньшей мере к одному рецептору Fc или другому эффекторному лиганду, как правило и/или в особенности, с использованием клеток-хозяев по изобретению и их предпочтительных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активность композиции молекулы белка/антитела по изобретению, экспрессированной в клетке-хозяине, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, выше, чем активность по меньшей мере одной композиции такой же молекулы антитела, полученной по меньшей мере из одной клеточной линии, выбранной из группы, включающей СНО, или CHOdhfr-, или ВНК, или NS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиной гибридомы, предпочтительно, CHOdhfr- [АТССCRL-9096], после экспрессии в данных клетках. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активность композиции молекулы белка/антитела по изобретению, экспрессированной в клетке-хозяине, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, по меньшей мере на 50% выше, чем активность композиции такой же молекулы антитела, экспрессированной в клеточной линии CHOdhfr- [АТССCRL-9096], более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 7 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 23 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 30 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 75 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 150 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 150 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 230 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 300 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 750 раз и наиболее предпочтительно более чем в 1000 раз. Не все биологические анализы могут демонстрировать повышенную активность, однако в зависимости от применения и свойств конкретной композиции молекулы белка, некоторые благоприятные биологические эффекты могут компенсировать другие, менее благоприятные, приводя к увеличению общей активности композиции молекулы белка в контексте настоящего изобретения. Например, конкретная композиция молекулы белка может демонстрировать гораздо более высокую активность, обусловленную связыванием с клетками через рецепторы с последующей индукцией вторичного эффекта, такого как пролиферация, однако она может иметь несколько пониженный период полужизни в сыворотке. В сочетании повышенная активность в большей степени вносит вклад в общую биоактивность, инициируя рецептор, чем компенсируя более короткую биодоступность. В другом примере и более короткий период полужизни, и повышенная активность в отношении инициации рецептора являются преимуществами. В следующем примере активность in vivo не улучшается, но повышается стабильность in vitro, которая оказывает благоприятное влияние на выход и хранение композиции молекулы белка. В следующем примере может потребоваться композиция с продолжительным периодом полужизни, но с более низкой активностью. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активность ADCC. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активность CDC. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную цитотоксичность, опосредованную фагоцитозом. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную связывающую активность по отношению по меньшей мере к одному рецептору Fc, предпочтительно FcRIIIA. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность и повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активность ADCC и повышенную свя- 28017622 зывающую активность по отношению к эпитопу. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активностьADCC, повышенную активность CDC, повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу и повышенную связывающую активность по отношению по меньшей мере к одному рецептору Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активность ADCC, повышенную цитотоксичность, опосредованную фагоцитозом, повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу и повышенную связывающую активность по отношению по меньшей мере к одному рецептору Fc. В наиболее предпочтительном варианте осуществления повышенная активность композиции молекулы антитела представляет собой повышенную активность ADCC, повышенную цитотоксичность, опосредованную фагоцитозом,повышенную активность CDC, повышенную связывающую активность по отношению к эпитопу и повышенную связывающую активность по отношению по меньшей мере к одному рецептору Fc. В соответствии с настоящим изобретением термин "повышенная гомогенность" означает, что композиция молекулы белка/антитела по изобретению, экспрессированная в клетке-хозяине по изобретению,полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, содержит меньше разных гликоформ, или больше предпочтительной гликоформы или предпочтительных гликоформ, или меньше по меньшей мере одной гликоформы молекулы антитела (предпочтительно, из гликоформ, которые составляют по меньшей мере 1% от всей композиции молекулы антитела как таковой), чем по меньшей мере композиция одной такой же молекулы антитела, выделенной из по меньшей мере одной из клеточных линий СНО, или CHOdhfr-,или ВНК, или NS0, или SP2/0, или PerC.6, или мышиной гибридомы после экспрессии в данных клетках. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный термин означает, что композиция молекулы антитела по изобретению, экспрессированная в клетке-хозяине по изобретению,полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, содержит меньше разных гликоформ или больше предпочтительной гликоформы или предпочтительных гликоформ, или меньше по меньшей мере одной гликоформы молекулы антитела, чем композиция такой же молекулы антитела, выделенная из клеточной линии CHOdhfr- [ATCCCRL-9096] после экспрессии в данных клетках. Сиалилирование является особенно проблематичным аспектом гетерогенности при получении и применении у людей. В предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы белка/антитела по изобретению имеет повышенную гомогенность вследствие того, что в ней отсутствует гликоформа, содержащая сиаловую, а именно, N-гликолилнейраминовую кислоту (NeuGc), причем в данном случае отсутствие гликоформы означает, что содержание данной гликоформы составляет менее 1% по отношению ко всем углеводным цепям, которые можно получить из очищенной композиции молекулы антитела, более предпочтительно, что углеводные цепи не детектируются с помощью способов,известных специалистам в данной области. Поскольку известно, что NeuGc может вызывать иммунный ответ у людей, это является большим преимуществом клеток-хозяев по изобретению по сравнению с такими системами продукции, как СНО, NSO, SP2/0. В предпочтительном варианте осуществления композиция молекулы белка/антитела по изобретению имеет повышенную гомогенность в отношении сиалилирования и содержит менее 5% гликоформ,более предпочтительно менее 3%, еще более предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно не содержит гликоформ композиции молекулы белка/антитела, содержащих сиаловую кислоту в детектируемых количествах, как описано в примерах. В другом предпочтительном варианте осуществления композицию молекулы белка/антитела с повышенной гомогенностью в отношении сиалилирования получают с использованием клетки-хозяина по изобретению, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, которая имеет дефект пути сахар-нуклеотидного предшественника и, следовательно, имеет дефицит или содержит пониженное количество СМР-сиаловой кислоты, что приводит к отсутствию или сильно пониженному сиалилированию углеводородных сахарных цепей молекул белков/антител, если клетки выращивают в бессывороточной среде. В еще более предпочтительном варианте осуществления такую композицию молекулы белка/антитела с повышенной гомогенностью в отношении сиалилирования можно получить с использованием NM-F9 [DSM ACC2606] или NM-D4 [DSM ACC2605] в качестве клетки-хозяина по изобретению, выращиваемых в бессывороточной среде, как описано более подробно в примерах. В следующем предпочтительном варианте осуществления композицию молекулы белка/антитела с повышенной гомогенностью в отношении сиалилирования получают с использованием клетки-хозяина по изобретению, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, которая имеет дефект по сахарнуклеотидному транспортеру GMP-сиаловой кислоты, или по меньшей мере по одной сиалилтрансферазе, что приводит к отсутствию или снижению сиалилирования углеводных сахарных цепей молекул белков/антител, если клетки выращивают в бессывороточной среде. Примерами являются NM-F9, NM-D4 иGT-2X. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию молекулы белка/антитела с повышенной гомогенностью в отношении сиалилирования получают с использованием клетки-хозяина по изобретению, полученной из клетки миелоидного лейкоза человека, которая обеспечивает повышенную степень сиалилирования. Указанная степень сиалилирования означает, что