Молекула нуклеиновой кислоты для воздействия на пути репарации двухцепочечных разрывов днк и ее применение

МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПУТИ РЕПАРАЦИИ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ РАЗРЫВОВ ДНК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к композициям и способам взаимодействия с репарацией двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Изобретение раскрывает новые двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, действующие в качестве приманки и захватывающие голокомплекс ферментов, отвечающих за обнаружение DSB в ДНК, передачу сигнала о наличии DSB и/или пути репарации, в частности пути негомологичного соединения концов (NHEJ) при репарации DSB. Изобретение раскрывает применение таких молекул в качестве вспомогательных композиций для применения вместе с повреждающими ДНК способами лечения, особенно радиотерапией или химиотерапией, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем в эффективном количестве для внесения в ядро опухолевой клетки для временной нейтрализации их способности к репарации ДНК и запуска их гибели.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭНСТИТЮ КЮРИ; САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК ( СНРС); МЮЗЕУМ НАСЬОНАЛЬ Д'ИСТУАР НАТЮРЕЛЬ; (ИНСЕРМ) ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (FR) 017418 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к композициям и способам воздействия на пути репарации ДНК в клетках млекопитающих. Изобретение, в частности, относится к молекулам нуклеиновых кислот, взаимодействующим с путями распознавания повреждений ДНК, передачи сигнала о повреждении и/или репарации, в частности, негомологичного соединения концов (NHEJ) при репарации двухцепочечного разрыва (DSB), а также к их применениям, особенно для запуска клеточной смерти в опухолях, подвергаемых противораковым терапиям. Изобретение раскрывает новый класс молекул нуклеиновых кислот, называемых "DSB-приманка" или "Dbait", которые можно применять в различных терапевтических состояниях у субъектов млекопитающих для воздействия на пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Предшествующий уровень техники Радиотерапия и химиотерапия, сами по себе или в сочетании с хирургией, являются основными терапевтическими орудиями в борьбе с раком. Ионизирующая радиация прямо или опосредованно вызывает двухцепочечные разрывы (DSB) и запускает гибель клеток/тканей (некроз или апоптоз). Цитотоксическое действие ионизирующей радиации образует основу радиотерапии, которая широко применяется для лечения рака человека. Эффективность радиотерапии в настоящее время ограничена радиационной устойчивостью отдельных опухолей (например, глиобластомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи) и побочными эффектами, обусловленными облучением прилежащих нормальных тканей (например, при лечении рака груди и шейки матки). В последние годы много исследований сфокусировано на биологических механизмах, связанных с ответом на ионизирующую радиацию, с целью проникновения в природу сложного феномена, лежащего за радиационной чувствительностью или радиационной устойчивостью опухолевых клеток. Понимание различных путей, которые осуществляют тонкую регуляцию ответа на ионизирующую радиацию, является важным шагом к идентификации молекулярных мишеней для новых лекарств и терапий, которые совместно с радиотерапией могут улучшить вероятность полного избавления от опухолей, обладающих большой устойчивостью к радиации, таких как опухоли мозга или головы и шеи. Применение химиотерапевтических агентов может приводить к повреждению ДНК, включая прямые или непрямые двухцепочечные разрывы. Примерами наиболее часто применяемых семейств химиотерапевтических агентов (химических цитотоксинов) являются ингибиторы топоизомераз I или II (камптотецин, топотекан, эпирубицин, этопозид), агенты, сшивающие ДНК (цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин), алкилирующие ДНК агенты (кармустин, дакарбазин) или антиметаболические агенты (5 фторурацил, гемцитабин, капецитабин), а также ингибиторы митотического веретена (паклитаксель, доцетаксель, винорелбин). Недавний прогресс в развитии биологических лекарственных средств (моноклональных антител,цитокинов/ингибиторов киназы, иммунотерапии/вакцин) доказал их эффективность и специфичность по отношению к подгруппе опухолей. Но их часто применяют в сочетании с химическими цитотоксинами. Несмотря на значительный прогресс в развитии новых цитотоксических лекарств, лекарственная устойчивость при проведении химиотерапии по-прежнему является основной клинической проблемой в лечении рака. Понимание механизма лекарственной устойчивости, связанной с поглощением/выводом лекарств, метаболической деградацией, мутагенезом мишени, усиленной репарацией, передачей сигнала клеточной смерти (апоптозом и некрозом), является важным для обеспечения эффективности химиотерапии и улучшения терапевтического индекса лекарства, особенно в случае отдельных устойчивых к терапии опухолей. Совмещение химиотерапии и радиотерапии широко применяется при лечении рака. Не будучи до конца выясненным, биологическое действие цитотоксинов основывается на таких клеточных механизмах, как нарушение клеточного цикла или повреждение ДНК, которые также являются важными для индуцированной радиацией клеточной смерти, приводя к дополнительному или даже лучшему синергическому действию при сочетании различных терапий в терапии рака. За последнюю декаду проведено много исследований в этой области и сложность передачи сигнала в ответ на облучение начала обрисовываться. В этом отношении генами, представляющими особый интерес в качестве мишеней для ионизирующей радиации, являются те, которые включены в регуляцию механизмов индуцированной радиацией клеточной смерти, например апоптоза или репарации ДНК. Поскольку DSB является самым летальным из всех повреждений ДНК, эффективность ионизирующей радиации понижается при усилении репарации ДНК. Два механизма вовлечены в репарацию двухцепочечных разрывов: негомологичное соединение концов (NHEJ, независимый от последовательности путь) и гомологичная рекомбинация (HR, зависимый от последовательности путь) (см. обзор Jackson, 2002). Воздействие на гены, вовлеченные в эти два основных пути репарации DSB, до сих пор приводило к небольшой или умеренной радиационной чувствительности в зависимости от применяемых подходов и линий раковых клеток (Belenkov et al., 2002;-1 017418 Белки Ku (например, Ku70 и Ku80) и ДНК-ПК являются важными для репарации DSB, индуцированных радиацией или химическим воздействием. Если репарацию повреждения нельзя провести вовремя, то клетка гибнет. Поэтому они представляют потенциально интересные мишени для повышения чувствительности (сенсибилизации) клеток и тканей мишени к радиотерапии и химиотерапии. Многие подходы были испытаны и применены в попытках ингибировать эти ключевые белки (Ku70/Ku80, ДНК-ПК и т.д.), участвующие в NHEJ-пути, преобладающем в клетках млекопитающих: 1) ингибиторы PI3K (фосфатидилинозит-3-киназы) (например, ДНК-ПК, ATM ATR) (Boulton et al.,2000; DurantKarran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004); 2) отрицательные доминанты и пептиды (С-концевой участок KU80) (Marangoni et al., 2000; Kim etal., 2002); 3) вариабельные фрагменты одноцепочечных антител (scFv) (ДНК-PKc) (Li et al. 2003); 4) РНК аптамер (SELEX: связывающий РНК Ku) (YooDynan, 1998); 5) антисмысловая цепочка (Ku70, Ku80, ДНК-PKc) (Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al.,2002); 6) si-РНК (ДНК-PKc) (Peng et al., 2000). Невзирая на эти гигантские усилия, сочетание воздействия на гены, включенные в репарацию ДНК,с терапиями рака все еще находится на стадии эксперимента, и клинические исследования пока что не показали какого-либо доказанного улучшения. Стоит заметить, что вышеописанные подходы разделяют одно обще свойство: они нацелены на одиночный эффектор (белок), включенный в сложный каскад (например, NHEJ) с возможностью обходных путей или компенсации. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение относится к новым композициям и способам воздействия на пути репарации ДНК в клетках млекопитающих. Изобретение, в частности, относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые взаимодействуют неспецифичным к генам способом с путями распознавания повреждения ДНК, передачи сигнала и/или репарации повреждения, а также к их применению, в частности, для запуска клеточной смерти в опухолях, подвергаемых противораковой терапии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что чувствительность клеток к терапиям, вызывающим прямое или опосредованное повреждение ДНК, может быть усилена путем применения (химически модифицированных или нет) коротких двухцепочечных молекул ДНК, которые действуют, имитируя разорванные фрагменты ДНК, и опознаются как участки двухцепочечных разрывов, индуцированных повреждающими ДНК способами лечения (т.е. субстраты, имитирующие DSB). Как показано в примерах, молекулы согласно изобретению являются эффективными как in vitro, так и in vivo и могут применяться для придания или усиления чувствительности любой опухолевой клетки к повреждающей ДНК терапии рака. Объект изобретения, таким образом, относится к коротким двухцепочечным молекулам ДНК, называемым также молекулами "DSB приманки" (сокращенно Dbait), способным усиливать ответ устойчивых к лечению опухолей на радиотерапию и химиотерапию. Как будет раскрыто ниже, молекулы Dbait действуют, привлекая и связывая весь комплекс ферментов системы репарации ДНК и таким образом воздействуя на процессы распознавания разрыва ДНК, передачи сигнала и/или репарации. Этот новый подход назван "ДНК-приманка". В предпочтительном осуществлении изобретение относится к молекуле Dbait, которая является молекулой нуклеиновой кислоты, где упомянутая молекула включает двухцепочечную часть по меньшей мере из 24 п.н. (пар нуклеотидов), имеет по меньшей мере один свободный конец, лишена CpG, обладает менее чем 70% идентичностью последовательности с любым геном в геноме человека, включает один или несколько фосфоротиоатов или нуклеотидов с метилфосфонатным скелетом на конце каждой цепочки или по меньшей мере на 3'-конце цепочки и где упомянутая молекула является субстратом для связывания, по меньшей мере, белка Ku, включенного в NHEJ-путь репарации двухцепочечных разрывов(DSB). Предпочтительно молекулу Dbait выбирают из группы, состоящей из Dbait32Ha, Dbait32Hb,Dbait32Hc, Dbait32Hd, Dbait32Hc-3'mp, Dbait32Hc-5'3'mp, Dbait32Hc-Cy3, Dbait32Hc-Cy5 и Dbait32HdFITC. Еще более предпочтительно молекула Dbait является Dbait32Hc. Дополнительным объектом настоящего изобретения является композиция, включающая молекулуDbait и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В конкретном осуществлении композиция подходит для орального введения или для внутривенной, внутриопухолевой или подкожной инъекции, или для внутричерепной или внутриартериальной инъекции или инфузии, или для топикального применения. Дополнительный объект изобретения относится к молекуле Dbait в комбинации с (а) физическим и/или химическим агентом(ами), которые могут прямо или опосредованно вызывать двухцепочечные разрывы ДНК. Конкретно, изобретение относится к фармацевтическому продукту, включающему молекулу Dbait согласно изобретению и химический агент, который может прямо или опосредованно вызывать двухцепочечный разрыв ДНК, в качестве комбинированного препарата для применения при лечении рака. Предпочтительно молекулу Dbait следует вводить до или одновременно с химическим агентом.-2 017418 Дополнительным объектом настоящего изобретения является способ лечения пролиферативного нарушения (например, рака) путем комбинации молекулы Dbait и терапии, которая прямо или опосредованно вызывает повреждение ДНК. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению молекулы Dbait согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения рака, предназначенного для применения в комбинации с повреждающей ДНК противораковой терапией. Конкретно,повреждающую ДНК противораковую терапию выбирают из радиотерапии и химиотерапии. Предпочтительно молекулу Dbait следует вводить до радиотерапии. Альтернативно, молекулу Dbait следует вводить до или одновременно с химиотерапией. В конкретном осуществлении молекулу следует вводить орально или путем внутривенной, внутриопухолевой или подкожной инъекции, или путем внутричерепной или внутриартериальной инъекции или инфузии, или путем топикального введения. Предпочтительно рак выбирают из рака ЦНС, головы и шеи, прямой кишки, печени, желудочно-кишечного тракта, мочеполового тракта, легких, кожи, рака груди и шейки матки. Другой объект изобретения относится к применению молекул Dbait для получения противоракового терапевтического вспомогательного средства для усиления эффективности лечения рака, особенно опухолей, плохо поддающихся радио- и/или химиотерапии. Дополнительным объектом изобретения является способ усиления чувствительности опухолей к повреждающей ДНК терапии рака, способ, включающий введение субъекту молекулы Dbait, как определено выше. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению молекулы Dbait согласно изобретению для получения лекарственного средства для усиления чувствительности опухоли к повреждающей ДНК противораковой терапии. Конкретно, повреждающую ДНК противораковую терапию выбирают из радиотерапии и химиотерапии. Предпочтительно молекулу Dbait следует вводить до радиотерапии. Альтернативно, молекулу Dbait следует вводить до или одновременно с химиотерапией. В конкретном осуществлении молекулу следует вводить орально или путем внутривенной, внутриопухолевой или подкожной инъекции, или путем внутричерепной или внутриартериальной инъекции или инфузии, или путем топикального введения. Предпочтительно рак выбирают из рака ЦНС, головы и шеи, прямой кишки,печени, желудочно-кишечного тракта, мочеполового тракта, легких, кожи, рака груди и шейки матки. Дополнительным объектом изобретения является способ лечения рака, где способ включает введение субъекту молекулы Dbait в комбинации с повреждающей ДНК противораковой терапией. Дополнительным объектом настоящего изобретения является композиция для применения в сочетании с повреждающим ДНК лечением, в частности радиотерапией или химиотерапией, где упомянутая композиция включает по меньшей мере одну молекулу Dbait в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем в эффективном количестве для введения в ядро опухолевой клетки. Изобретение можно применять для придания или усиления чувствительности к терапии рака при различных типах рака у субъектов млекопитающих, конкретно у людей, таких как солидные раки и лейкозы, особенно устойчивые к радио- и химиотерапии раки. Краткое описание чертежей Фиг. 1.1. Анализ сдвига полос (сдвига электрофоретической подвижности), проведенный с различными 32 Р-мечеными молекулами Dbait в присутствии различных количеств ядерного экстракта (0, 10, 20,40, 80, 160, 320 Гн/мкл) из клеток Нер 2. Полосы со сдвигом пронумерованы как 1 и 2. Полоса 3 представляет собой лунку, в которую помещен образец. Фиг. 1.2. Идентификация присутствия белков Ku в полосах с замедленной подвижностью различных 32 Р-меченых молекул Dbait, включающих белки из ядерного экстракта клеток Hep2 (0, 20, 80,320 Гн/мкл). На линии -Ku показано, в каких случаях антитела против Ku (анти-Ku) добавлены (+) или не добавлены (-) к реакции связывания перед нанесением образца на гель. Полосы со сдвигом подвижности пронумерованы как 1, 2 и 3, и звездочка добавлена к номеру в случае полос, проявляющих изменение подвижности после связывания антител против Ku. Фиг. 1.3. Анализ соединения концов ДНК в присутствии 20 мкг белков ядерного экстракта из клеток Нер 2. Верхняя панель: лигирование 0,2 мкМ 32 Р-меченых фрагментов ДНК в отсутствие и в присутствии 20 мкМ Dbait в 20 мкл буфера для анализа за различные периоды времени. Полосы 1-4 показывают исходные фрагменты ДНК из 605 п.н. (мономер [1]), продукты лигирования, мигрирующие как димеры[2], тримеры [3] или тетрамеры [4]. Нижняя панель: процент продуктов лигирования рассчитывают и приводят в виде функции от времени (ромбы - без Dbait, кружки - с 200 нМ Dbait32H) и в виде функции от химической структуры молекул Dbait (через 2 ч инкубации с 200 нМ различных Dbait). Фиг. 1.4. Анализ активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) в 1,5 мкг ядерного белкового экстракта из клеток Нер 2 в присутствии 2 мкг молекул Dbait различной длины, последовательности и химической структуры, включая модифицированные скелеты: Dbait32ss и Dbait32css являются двумя одноцепочечными ДНК из 32 нуклеотидов; Dbait32C является двухцепочечной гантелеобразной ДНК из 32 п.н. (без свободного тупого конца); Dbait8H, Dbait16H, Dbait24H и Dbait32H являются двухцепочечными ДНК в форме шпильки с ножками из 8, 16, 24 и 32 п.н. соответственно. Dbait32H, Dbait32Hb,Dbait32Hc и Dbait32Hd являются двухцепочечными ДНК в форме шпильки из 32 п.н. с различными последовательностями, но с одним и тем же составом оснований; Dbait32d-F и DbaitHc-су 3 являютсяDbait32Hd и Dbat32Hc, с тагами из флуоресцеина и цианина 3 соответственно; Dbait32H-po является полноцепочечным фосфодиэфиром Dbait32H, по сравнению с другими молекулами Dbait, имеющими 3 п.н. с фосфоротиолатом на свободном тупом конце, за исключением DbaitHc-3'mp и Dbait32Hc-5'3'mp, у которых имеются 3 нуклеотида с метилфосфонатом на 3'-конце или на обоих 5'-и 3'- концах соответственно. Dbait32Hc5'5' имеет 3'-3' связь, проявляя таким образом 575' тупой конец; см. детали структур этих молекул Dbait в табл. 1.1 и 1.2. Данные представляют средние значения и стандартное отклонение по меньшей мере по трем независимым экспериментам. Фиг. 2.1. Анализ клоногенной выживаемости клеток HeLa после облучения 40.5Gy (с интервалом 2 ч) -лучами от источника излучения 137Cs в присутствии различных молекул Dbait. Панель А: зависимость от дозы нормализованного (приведенного) количества выживших клонов в присутствии Dbait32 иDbait32H. Панель Б: Нормализованные количества выживших клонов в присутствии различных молекулDbait в концентрации 83 нМ (концентрация в культуральной среде). Фиг. 2.2. Дополнительный анализ клоногенной выживаемости клеток HeLa после облучения 40.5Gy (с интервалом 2 ч) -лучами от источника излучения 137Cs в присутствии различных молекулDbait. Верхняя панель: зависимость от дозы нормализованного количества выживших клонов в присутствии Dbait32H и Dbait8H. Нижняя панель: нормализованное количество выживших клонов в присутствии 2 мкг различных молекул Dbait. Фиг. 2.3. Ингибирование усиленной радиацией незаконной интеграции линейного фрагмента плазмиды (2 мкг), несущего ген, кодирующий устойчивость к неомицину, с помощью 2 мкг молекулDbait32H. Фиг. 2.4. Дополнительный анализ ингибирования усиленной радиацией незаконной интеграции линейного фрагмента плазмиды (2 мкг), несущего ген, кодирующий устойчивость к пуромицину, различными молекулами Dbait32 (2 мкг). Верхняя панель: зависимость от дозы молекул Dbait32H в присутствии дробного облучения (40.5Gy) (заполненные кружки) или в отсутствие облучения (заполненные треугольники). Нижняя панель: эффективность интеграции плазмиды в присутствии 2 мкг различных молекул Dbait или 200 мкг ингибиторов ДНК-ПК (вортманнина или NU7026) и в присутствии (черные) и в отсутствие (серые) облучения. Фиг. 2.5. Иммунодетекция участков двухцепочечного разрыва (DSB), выявляемых как -Н 2 АХ foci в клетках HeLa, трансфицированных флуоресцентными молекулами Dbait32H-FITC, через 2 ч после 2Gy облучения. Левая панель: флуоресценция Dbait32H-FITC (светлые точки и пятна) и участки DSB, детектируемые по иммунофлуоресценции антитела -Н 2 АХ в ядрах. Правая панель: то же изображение ядер с участками DSB, детектируемыми по иммунофлуоресценции антитела -Н 2 АХ при окраске DAPI. Стрелки в левом нижнем углу показывают отсутствие сигналов Dbait32H-FITC и -H2AX в ядре. Стрелки в правом верхнем углу показывают совместно локализованные сигналы Dbait32H-FITC и -Н 2 АХ. Фиг. 2.6. Верхняя панель: фосфорилирование гистона Н 2 АХ с помощью PIKK. Цельные клеточные экстракты анализируют с помощью вестерн-блоттинга на уровень фосфорилированной формы гистона Н 2 АХ (-Н 2 АХ) относительно общего содержания белка Н 2 АХ. Клетки Нер 2 трансфицируют различными молекулами Dbait 32Hc, 24H, 16 Н и 8 Н в течение 5 ч или не трансфицируют. Их облучают под конец трансфекции, инкубируют в течение 1 ч и затем анализируют. Результаты представлены в виде гистограммы нормализованных отношений -Н 2 АХ/Н 2 АХ. Нижняя панель: кинетики устойчивости участковDSB, выявленных по наличию -H2AX foci с помощью проточной цитометрии (FACS) в облученных (IR) клетках: Dbait32Hc+IR (сплошная линия), (IR) только облучение (пунктирная линия) и без воздействия(точечная линия). Фиг. 3.1. FACS (сортировка клеток с помощью флуоресценции) анализ клеток GMA32 без воздействия, трансфицированных клеток самих по себе или клеток, трансфицированных различными молекулами Dbait с липофектамином, но без дополнительного облучения или обработки ингибиторами митоза. Фаза M1 представляет процент клеток на стадии sub-G1, указывающей на смерть клеток. Фиг. 3.2. Иммунодетекция участков репарации ДНК с помощью -H2AX (светлые точки или участки в ядрах) в клетках GMA32 без воздействия, клетках, трансфицированных самих по себе или трансфицированных различными молекулами Dbait с липофектамином. Окраску клеточных мембран и ядер проводят с помощью FITC-DiOC6 и DAPI. Фиг. 3.3. Анализ с помощью вестерн-блоттинга состояния фосфорилирования остатка серина 15 в р 53 в необработанных клетках GMA32, трансфицированных клетках самих по себе или в клетках, трансфицированных различными молекулами Dbait с липофектамином, но без дополнительного облучения или обработки ингибиторами митоза. Фиг. 3.4. Клоногенная выживаемость клеток GMA32, необработанных и обработанных облучением 4Gy или различными ингибиторами митоза (200 нМ нокозадолом, 100 нМ навелбином (винорелбином) или 200 нМ таксолом (паклитакселем в присутствии различных молекул Dbait. Фиг. 4.1. Рост гетеротрансплантата опухоли гортани человека у мышей, измеряемый как соотношение объема опухоли на момент времени t к исходному объему (Vt/Vi) в присутствии или в отсутствие лечения. Панель А: ветвь без лечения (n=38); панель Б: контрольная ветвь, где животные получают-4 017418 20 мкл культуральной среды (MEM) + облучение 32Gy в неделю (n=30); панель В: ветвь, где животные получают 1 нмоль (20 мкг) Dbait32H + облучение 32Gy в неделю (n=35). MEM или Dbait32H вводят путем внутриопухолевой инъекции за 5 ч до облучения. Отдельную дозу радиации (2Gy) дают через день три раза в неделю. Лечение продолжается 5 недель, общая доза облучения 30Gy. Точки представляют зависимость от времени объема опухоли у каждой мыши. Сплошные линии представляют наилучшее полиноминальное соответствие. Панель Г представляет график Каплана-Мейера для всех мышей, у которых увеличение объема опухоли (Vt/Vi)5. Фиг. 4.2. Распределение меченых цианином C3 Dbait32H в гетеротрансплантате опухоли Нер 2 у голых мышей. 20 мкг Dbait32H-Cy3 в смеси с Superfect (трансфицирующий агент) инъецируют в опухоль Нер 2 объемом 1,5 см 3. Мышей забивают через 6 ч после инъекции. Опухоли отделяют и делают срезы из замороженного состояния для анализов без фиксации. Для окрашивания ядер применяют DAPI. Фиг. 4.3. Радиосенсибилизация гетеротрансплантатов опухолей Нер 2 у голых мышей. Рост опухолей измеряют во время лечения (15 сеансов в течение 35 дней, серый фон) и после различных видов лечения в четырех группах по 10 животных (белый фон). Рост индивидуальных опухолей измеряют у каждого животного. Протокол лечения приведен сверху. Для каждого сеанса лечения 2 мкг Dbait32H в смеси с трансфицирующим агентом (PEI) инъецируют в опухоль за 5 ч до облучения дозой 2Gy. Среднее время для пятикратного увеличения объема опухоли в каждой группе также приведено. Значения р рассчитывают для группы, получившей комбинированное лечение, относительно группы, получившей только облучение. Фиг. 4.4. Верхняя панель: представление Каплана-Мейера выживания голых мышей с подкожными гетеротрансплантатами опухоли Нер 2. Протокол лечения приведен на фиг. 4.3. Включены пять групп: без лечения, трансфицированные плацебо и облученные, получившие комбинированное лечение радиацией и возрастающим количеством Dbait32H (20, 60 и 120 мкг/сеанс). Количество животных в каждой группе приведено в табл. 3.2. Серый фон показывает период лечения. Нижняя панель: изображения опухолей, представительные для трех групп (без лечения, получившие 20 и 60 мкг Dbait32H/сеанс вместе с облучением 2Gy), которые отобраны через 15 дней после начала лечения, под конец лечения (35 дней) и через 13 дней после окончания лечения (35+13 дней). Фиг. 4.5. Гистологический анализ гетеротрансплантатов опухоли Нер 2 в середине курса лечения(7 сеансов). Опухоли взяты через 20 дней после начала различных протоколов лечения, как указано. Их фиксируют в формалине и срезы ткани окрашивают гематоксилином, эозином и шафраном. Две опухоли анализируют для каждого протокола лечения путем микроскопии. Панель А: изображение представительных полей для каждого протокола. Масштаб соответствует 400 мм (панели 1-4) и 100 мм (панели 5-8). Цветные изображения предоставляются по запросу. Панель Б: степень некроза выражена как доля площади некротизированной ткани относительно площади анализируемого среза ткани. Количество митотических клеток и апоптических клеток оценивают при большом увеличении по представительным полям без некроза, включающим примерно 1000 клеток. Фиг. 4.6. Полученные с помощью ЯМР изображения гетеротрансплантата опухолей Нер 2 в середине курса лечения (7 сеансов). Три представительных изображения сечений показаны для опухолей без лечения, облученных опухолей (2 Gy/сеанс) и опухолей после комбинированного лечения с применениемDbait32H (20 мкг на сеанс) и облучения (2 Gy/сеанс). Опухоли обведены белой окружностью. Серая масса внутри опухоли показывает область некроза. Фиг. 4.7. Представление Каплана-Мейера выживаемости голых мышей с подкожными гетеротрансплантатами опухолей (Нер 2 - плоскоклеточная карцинома, U87 - глиобластома, LU1205 и SK28 - два типа меланомы). Период лечения показан как серая область. Фиг. 5.1. Панель А: протокол лечения для трех групп/ветвей трансгенных мышейK-RasV12GApc1638N среднего возраста 12 недель: контрольная группа (без лечения), группа, получавшая 5FU+CPT11, группа, получавшая 5FU+CPT11 и Dbait32H. Проведены три цикла лечения. Каждый цикл состоит из внутрибрюшной инъекции 0,6 мг 5FU и 0,6 мг СРТ 11 вместе с оральным введением 0,1 мгDbait32H три раза в неделю с последующей одной неделей отдыха. Количество мышей, включенных в каждую группу, указано в скобках. Конечной точкой является время выживания. Панель Б: график Каплана-Мейера кривых выживаемости для трех групп. Панель В: среднее время выживания для трех групп, как показано на панели Б. Фиг. 5.2 Среднее количество опухолей пищеварительного тракта на животное по данным макроксопии или гистологического исследования для групп, получавших 5FU+CPT11 и 5FU+CPT11 иDbait32H. Количество животных в каждой группе указано в скобках. Всех мышей забивают через две недели (18 недель) после завершения протокола, приведенного на верхней панели. Среднее значение для контрольной ветви (группа без лечения, n=101) составляет 30,8 на животное (данные не приведены). Фиг. 5.3. Анализ ткани пищеварительного тракта с помощью флуоресцентной микроскопии. Панель А: схема протокола (i.p. - внутрибрюшинная инъекция, о. - оральное введение). Панель Б: флуоресценция молекул Dbait32H-FITC (слева) или иммунофлуоресценция меченых -Н 2 АХ (справа) на сечении ткани опухоли размером 5 мкм у животного, получившего лечение по протоколу, приведенному на панели А.-5 017418 Нижние части показывают детали (наблюдаемые с помощью линзы 63) зоны, указанной в верхней части (наблюдаемой с помощью линзы 10, белый квадрат). Совместная локализация флуоресцентныхDbait32H-FITC и меченых -Н 2 АХ участков представлена в виде светлых точек на фоне окрашенногоDAPI ядра. Осуществление изобретения Как обсуждалось выше, изобретение раскрывает новый класс терапевтических молекул, которые могут взаимодействовать не геноспецифическим образом с системами репарации ДНК в клетках млекопитающих. Эти новые молекулы, называемые молекулами Dbait, являются субстратами голокомплекса белков, включенных в путь негомологичного соединения концов (NHEJ) (не зависимый от последовательности путь), конкретно белков Ku и ДНК-ПК и могут нейтрализовать способность клеток к репарации ДНК, усиливая, таким образом, их чувствительность к повреждающим ДНК способам лечения. Изобретение, таким образом, относится к таким молекулам, их получению и их терапевтическому применению, в частности для лечения пролиферативных заболеваний в комбинации с повреждающими ДНК способами лечения. Молекулы Dbait согласно настоящему изобретению можно определить с помощью ряда характеристик, таких как их минимальная длина, наличие по меньшей мере одного свободного конца и наличие двухцепочечной части. Как обсуждается ниже, важным свойством молекул Dbait является то, что их точная нуклеотидная последовательность не оказывает существенного влияния на их активность. Дополнительно, молекулы Dbait могут содержать модифицированный и/или неприродный скелет. Соответственно, первый объект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, где упомянутая молекула включает двухцепочечную часть, состоящую по меньшей мере из 16 п.н.,обладает по меньшей мере одним свободным концом и связывает хотя бы Ku-комплекс, включенный вNHEJ-путь. Молекула предпочтительно является молекулой нечеловеческого происхождения (т.е. ее нуклеотидная последовательность и/или конформация (например, шпилька) не встречается, как таковая, в клетке человека), более предпочтительно является молекулой рекомбинантного и/или синтетического происхождения. Согласно механизму действия молекул Dbait, последовательность молекул Dbait, если и играет, то малую роль. Соответственно, в противоположность молекулам, применяемым в данной области ранее для специфичного к гену/белку воздействия (например, противосмысловые цепочки, антиген, si-РНК,аптамер, рибозим и т.д.), молекулы Dbait могут не обладать какой-либо значительной степенью гомологии или идентичности последовательности известных генов, промоторов, усилителей, 5'- или 3'вышележащих последовательностей, экзонов, интронов и т.д. Иными словами, действие молекул Dbait,состоящее во взаимодействии с путем NHEJ, является не зависимым от последовательности, и молекулыDbait могут обладать менее 70%, даже менее 50% идентичности последовательности любого гена в геноме человека. Такой не зависимый от последовательности механизм действия является отличительным признаком молекул Dbait, который явственно отличает их от других специфичных к генам или специфичных к белкам (зависимых от последовательности) терапевтических агентов, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, небольшие взаимодействующие РНК (si-РНК, sh-РНК и mi-РНК) и иммуностимулирующие CpG олигонуклеотиды, а также аптамеры, сконструированные для отлавливания специфических белков. В предпочтительном осуществлении последовательность молекул Dbait обладает общей степенью идентичности последовательностям нуклеиновых кислот человека менее примерно 70, 60, 55 или 50%. Способы определения идентичности последовательности хорошо известны в данной области техники и включают, например, Blast. В отдельном осуществлении молекула Dbait не гибридизуется в жестких условиях с геномной ДНК человека. Типичными жесткими условиями являются такие, которые позволяют отличить полностью комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты от частично комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты (см., например, Sambrook et al.). В предпочтительном осуществлении последовательность молекул Dbait лишена CpG во избежание хорошо известных иммунологических реакций, опосредованных толл-подобными рецепторами, если такой эффект нежелателен. CpG относится к динуклеотиду, состоящему из цитозина и следующего за ним гуанина. Принимая во внимание механизм их действия, длину молекул Dbait можно варьировать до тех пор,пока ее достаточно для правильного связывания белкового Ku-комплекса. В экспериментальном разделе показано, что минимальная длина молекул Dbait составляет примерно 16 п.н. для обеспечения связывания Ku-комплекса. Предпочтительно молекулы Dbait включают 16-200 п.н. и наиболее предпочтительно 24-100 п.н. Конкретные примеры молекул Dbait содержат 24 п.н., наиболее предпочтительно 32 пары оснований. Как показано в примерах, такая длина достаточна для связывания Ku-комплекса, включающего белки Ku и ДНК-ПК.-6 017418 Особенно предпочтительные молекулы Dbait включают 24-100 п.н. и более предпочтительно 32-100 п.н. Молекулы Dbait согласно изобретению должны иметь по меньшей мере один свободный конец для имитации двухцепочечных разрывов. Упомянутый свободный конец может быть свободным тупым концом или 5'-3'-выступающим концом. В конкретном осуществлении они содержат только один свободный конец. В другом конкретном осуществлении они содержат два свободных конца. Молекулы Dbait могут быть линейными или предпочтительно сделанными в форме шпильки двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. В таком случае петля может быть нуклеиновой кислотой или другими химическими группами, известными специалисту в данной области техники, предпочтительно линкером, таким как гексаэтиленгликоль или тетрадезокситимидилат (Т 4). В предпочтительном осуществлении молекулы Dbait обладают следующими признаками: 1) двухцепочечные молекулы Dbait способны захватываться клетками/тканями организма внутрь клеточного ядра при применении с фармацевтически приемлемыми носителями/вспомогательными веществами; 2) по меньшей мере один свободный конец молекул Dbait узнается голокомплексом ферментов, вовлеченных в процессы распознавания DSB повреждения, передачи сигнала о повреждении и/или репарации; 3) по меньшей мере один свободный конец молекул Dbait с помощью упомянутого комплекса включается в состав геномной ДНК клеток опухоли. В конкретном осуществлении молекулы Dbait не подлежат репликации из-за своей структуры и/или скелета. В этой связи молекулы Dbait согласно изобретению могут иметь исключительно или в основном(примерно на 50%) природный фосфодиэфирный скелет, или химически модифицированный фосфодиэфирный скелет, или другой скелет с химическими группами или смесью химических групп, так что модифицированная двухцепочечная ДНК сохраняет свойство быть субстратом голокомплекса, вовлеченного в NHEJ-путь, в частности белков Ku и ДНК-ПК, а также путей распознавания DSB и передачи сигнала. Преимущественно химические модификации предназначены для придания стабильности молекуламDbait и/или предотвращения их дополнительной репликации (потенциальной причины мутагенного действия) при их интеграции в геном, если таковая происходит. Они могут также включать миметики сахаров, например 2'-О-алкилрибозу, 2'-О-алкил-С 4' разветвленную рибозу, циклобутилы или другие карбоциклы или гекситол вместо пентофуранозильной группы. Предпочтительные молекулы Dbait включают одну или несколько химических групп на конце одной или обеих цепочек. Предпочтительные химические группы включают фосфоротиоаты. Альтернативно, предпочтительные Dbait включают нуклеотиды с метилфосфонатным скелетом. Другие модифицированные скелеты согласно изобретению включают фосфорамидаты, морфолинонуклеиновые кислоты, замкнутые нуклеиновые кислоты с 2'-О-, 4'-С метилен/этиленовым мостиком,пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и короткоцепочечные алкилы или циклоалкилы в качестве связки между сахарами, или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические различной длины связки внутри сахаров, или любые модифицированные нуклеотиды, известные специалисту в данной области техники. Патент US5677437 описывает гетероароматические олигонуклеозидные связки. Связки с азотом или содержащими азот группами также можно применять для получения миметиков олигонуклеотидов(патенты U.S.5792844 и 5783682). Патент U.S.5637684 описывает олигомерные соединения фосфорамидата и фосфоротиоамидата. Известны также олигонуклеотиды, имеющие морфолиновые структуры в скелете (патент U.S.5034506). В других осуществлениях, относящихся, например, к скелету из пептида и нуклеиновой кислоты (ПНК), фосфодиэфирный скелет олигонуклеотида может быть заменен полиамидным скелетом, основания могут быть связаны прямо или опосредованно с азаатомами азота полиамидной цепи. Другие синтетические олигонуклеотиды могут содержать звенья замещенных сахаров, включающие одну из следующих групп в положении 2': ОН, SH, OCH3, SCH3, F, OCN,ОСН 2 СН 2 ОСН 3, O(CH2)nNH2 или О(СН 2)nCH3, где n составляет от 1 до примерно 10; С 1-С 10-низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил или аралкил; Cl, Br, CN, CF3, OCF3, O-S- или N-алкил, O-, Sили N-алкенил, SOCH3, SO2CH3, ONO, NO, N3. Упомянутые неспособные к репликации элементы могут быть включены по внутренней позиции или располагаться на конце двухцепочечного фрагмента. Они могут включать а) звено, которое не может применяться в качестве матрицы для репликации ДНК, например цепочку из полиэтиленгликолей, предпочтительно гексаэтиленгликолевую цепочку, или любую углеводородную цепочку, при необходимости прерванную и/или замещенную одним или более гетероатомом, например кислородом, серой, азотом или гетероатомными или гетероциклическими группами, включающими один или более гетероатом; б) звено,которое является блокирующим элементом, поскольку оно не подвержено действию ДНК полимераз или экзонуклеаз, например любые 3'-модифицированные нуклеотиды или другие элементы, известные специалисту в данной области; в) природный олигонуклеотид, например Tn, применяемый в петле шпилькообразного фрагмента, например тетрадезокситимидилат (T4).-7 017418 Упомянутые цепочки получают путем химического синтеза, полубиосинтеза или биосинтеза, любого способа амплификации с последующим применением любых способов экстракции и препаративных способов и любой химической модификации. Биологическую активность молекул Dbait можно измерять путем анализов in vitro и на основе клеточных культур, как описано, например, в примерах 2 и 3, и/или с помощью анализов in vivo, как описано в примерах 4 и 5. Самым простым и релевантным анализом является анализ активности ДНКзависимой протеинкиназы (см. пример 2, фиг. 1.4). Этот простой анализ до сих пор оказывался предсказательным относительно активности молекул Dbait in vivo. Однако другие анализы, основанные на клеточных культурах, например анализ ингибирования усиленной облучением незаконной интеграции также является релевантным (см. пример 3, фиг. 2.3 и 2.4). В конкретном осуществлении молекулы Dbait согласно изобретению способны активировать ДНКПК. В конкретном осуществлении молекулы Dbait согласно изобретению способны ингибировать усиленную радиацией незаконную интеграцию ДНК. В другом конкретном осуществлении молекулы Dbait согласно изобретению связывают Kuкомплекс in vitro, например, как определяют по сдвигу электрофоретической подвижности в геле. ТакойKu-комплекс может включать один или несколько белков Ku самих по себе, например Ku70 и/или Ku80,или комбинацию одного или нескольких Ku-белков и по меньшей мере одного белка ДНК-ПК. В другом конкретном осуществлении молекулы Dbait согласно изобретению проникают в ядро. Наиболее предпочтительно молекулы Dbait согласно изобретению сочетают несколько или все из вышеперечисленных характеристик. Эксперименты, проведенные на клеточных культурах и на гетеротрансплантатах опухолей у голых мышей и на генетически модифицированных мышах, показывают, что молекулы Dbait согласно изобретению запускают смерть клеток/тканей опухолей, подвергнутых действию радио- и/или химиотерапии. Изобретение, таким образом, также относится к вспомогательным композициям для применения в сочетании с повреждающими ДНК способами лечения, где упомянутые композиции включают молекулуDbait, как определено выше, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем/вспомогательным веществом в эффективном количестве для введения в ядра опухолевых клеток. Изобретение также относится к способу усиления восприимчивости опухолей к противораковым терапиям, включающим в сочетании введение в раковые клетки/ткани молекул Dbait, как определено выше; и индукцию в клетках разрывов ДНК с помощью повреждающих ДНК способов воздействия. Согласно осуществлению изобретения на упомянутом этапе введения в ядро применяют трансфицирующий агент. На базе протокола, применяемого при исследованиях in vivo, изобретение предоставляет основу для разработки клинического протокола применения молекул Dbait в комбинации с радиотерапией или химиотерапией. Соображения, рассматриваемые при составлении протокола, таковы, что молекулы Dbait должны находиться в ядрах клеток, когда имеет место событие, ведущее к повреждению ДНК. Поэтому молекулы Dbait предпочтительно следует вводить до радиотерапии, однако их можно давать одновременно с химиотерапевтическими агентами в зависимости от способа введения и фармакокинетики каждого лекарства. Типичный протокол включает введение молекул Dbait до облучения, например за 5 ч. Применение дробного облучения особенно эффективно, например, 152Gy в течение 6 недель или 65Gy в течение 2 недель. Преимущественно упомянутый способ включает сочетание лечения молекулами Dbait с двойной химиотерапией. Например, 5FU и СРТ 11 инъецируют вместе 3 раза в течение 3 последовательных дней,разделенных полной неделей отдыха. Альтернативно, лечение молекулами Dbait сочетают с радиотерапией. Для специалиста в данной области это легко приспособить к людям, конкретно в зависимости от веса/поверхности тела пациента. В предпочтительном осуществлении молекулы Dbait являются химически модифицированными молекулами Dbait, как определено выше и согласно другой практике в терапии человека. В другом осуществлении молекулы Dbait не являются химически модифицированными и соответствуют фрагментам природной нуклеиновой кислоты, но проявляют характеристики химически модифицированных фрагментов, в частности имеют количество пар нуклеотидов и свойства, определенные в отношении упомянутых химически модифицированных молекул Dbait. Более конкретно, разрыв цепочек ДНК достигается с помощью ионизирующей радиации (радиотерапия) или химической реакции (химиотерапия).-8 017418 Такой способ является новым терапевтическим вспомогательным способом в сочетании с повреждающими ДНК терапиями для лечения заболеваний, происходящих от неконтролируемой пролиферации клеток, в частности рака. Иными словами, Dbait в основном предназначены для применения в качестве противораковой терапии, но могут также применяться при многих противопролиферативных лечениях,например при лечении псориаза. Этот способ предназначен для лечения пролиферативных нарушений. Они могут быть незлокачественными, например псориаз и пролиферативный стеноз/рестеноз сосудов. Они могут быть злокачественными. Пораженный орган или район может быть легкими и бронхами, головой и шеей, желудочнокишечным трактом, прямой кишкой, мочеполовым трактом, гинекологическими органами, грудью, эндокринными железами, кожей, ретиной, ЦНС, кроветворными органами, метастазами известных или неизвестных первичных участков поражения, остаточными органами (например, тимусом). Гистологическая природа может быть эпителиальной, плоскоклеточной карциномой, аденокарциномой, переходной карциномой, производной фибробластов/ангиобластов (саркомы), нейрональной,глиальной производной, эндокринной, карциноидной, желудочно-кишечной стромой, эндотельальной,гематопоэтической, эмбриональной. Изобретение также относится к применению упомянутых не модифицированных химически молекул Dbait для получения противоракового лекарства для лечения опухолей, особенно опухолей, обладающих высокой устойчивостью к радио- и/или химиотерапии, где упомянутые лекарства применяют в сочетании связывающим разрыв ДНК (т.е. повреждающим) лечением, конкретно радиотерапией или химиотерапией.In vivo химически модифицированные или немодифицированные молекулы Dbait вводят любым подходящим способом с соответствующим приемлемым носителем/вспомогательным веществом, например оральным, внутривенным, внутриопухолевым или путем подкожной инъекции, или путем топикального ведения, или другими. Дополнительным объектом настоящего изобретения является композиция для применения в сочетании с повреждающим ДНК лечением, в частности радиотерапией или химиотерапией, где упомянутая композиция включает по меньшей мере одну молекулу Dbait в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем в эффективном количестве для попадания в ядра опухолевых клеток. Например, при применении путем введения внутрь опухоли упомянутое эффективное количество составляет по меньшей мере 0,01 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 0,5 мг на 1 см 3 опухоли. Эффективное количество можно вводить по ежедневному протоколу лечения(например, 5 дней в неделю в течение от 3 до 6 последовательных недель или 3 раза в неделю в течение от 3 до 6 последовательных недель). Альтернативно, эффективное количество по меньшей мере 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,5 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см 3 опухоли можно вводить по еженедельному протоколу лечения в течение 3-6 последовательных недель, например. При использовании других путей введения специалист в данной области может легко приспособить количество для получения эффективного количества молекул Dbait в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,01 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 0,5 мг на 1 см 3 опухоли, в частности, при ежедневном протоколе или для получения эффективного количества молекул Dbait в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,5 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см 3 опухоли, в частности, при еженедельном протоколе лечения. Конечно, дозировка и схема лечения могут быть изменены специалистом в данной области в соответствии со схемой проведения химиотерапии и/или радиотерапии. Дополнительный объект настоящего изобретения относится к применению молекул Dbait, как определено выше, для получения лекарственного средства для усиления клеточной (например, опухолевой) чувствительности к повреждающей ДНК терапии. Дополнительный объект настоящего изобретения относится к применению молекул Dbait, как определено выше, для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с повреждающей ДНК противораковой терапией. Предпочтительно повреждающую ДНК противораковую терапию выбирают из радиотерапии и химиотерапии. Также предпочтительно вводить молекулу до радиотерапии и/или до, и/или одновременно с химиотерапией. Другие характеристики и преимущества изобретения приведены в нижеследующих примерах со ссылкой на приложенные фигуры и таблицы.-9 017418 Примеры Молекулярные и клеточные исследования, а также анализы гетеротрансплантатов, устойчивых к действию радиации опухолей человека (плоскоклеточная карцинома головы и шеи, глиобластома, меланома), у голых мышей и индуцированного двойной мутацией K-RasV12GApc1638N рака пищеварительного тракта у трансгенных мышей проводят с целью: 1) определить биологические активности молекул Dbait; 2) оценить подход с применением ДНК-приманки путем применения молекул Dbait для сенсибилизации к противораковым терапиям; 3) прояснить молекулярные и клеточные механизмы, обусловливающие наблюдаемую сенсибилизацию, опосредованную Dbait. Результаты этих исследований приведены и суммированы в примерах. Пример 1. Конструкция, синтез и получение молекул Dbait. Созданы два типа молекул Dbait: линейные или шпилькообразные двухцепочечные фрагменты ДНК. В случае молекул в форме шпильки применяют гексаэтиленгликолевый линкер или тетрадезокситимидилат в качестве петли. Конец(цы) ножки двухцепочечной ДНК могут быть защищены от химической деградации под действием 3'-экзонуклеаз путем вставки фосфоротиоатов, метилфосфонатов или 3'-3' связки между нуклеотидами. В принципе, можно применять другие химические модификации при том условии, что они совместимы со связыванием Ku70/Ku80 и активацией ДНК-ПК (MartenssonHammarten, 2002). Проанализированы различные молекулы Dbait с различной длиной ножки из 8 п.н. (Dbait8H), 16 п.н. (Dbaitl6H), 24 п.н. (Dbait24H), 32 п.н. (Dbait32H), а также различные последовательности ножки. Сконструирован также фрагмент двухцепочечной ДНК в форме гантели (Dbait32C) с обоими концами, закрытыми гексаэтиленовыми петлями, в качестве контроля. К отдельным молекулам Dbait через Т присоединены метки: флуоресцеин (Dbait32H-FITC), цианин 3 (Dbait32H-Cy3), цианин 5 (Dbait32Hc-Cy5) или биотин- 10017418 Таблица 1.1. Последовательности и химические структуры молекул Dbait В табл. 1.1 заглавными буквами показаны нуклеотиды с фосфодиэфирным скелетом. Заглавными буквами жирным шрифтом показаны нуклеотиды с фосфоротиоатным скелетом. Сплошные полуокружности символизируют гексаэтиленгликолевый линкер. Dbait32H-T4 содержит четыре тимина (Т 4) в качестве линкера вместо гексаэтиленгликолевого линкера. Dbait32C является молекулой в форме гантели (без свободных концов). Dbait32Hc-5'5' имеет смешанную последовательность (тот же состав азотистых оснований, но в другом порядке, см. Dbait32Hb в табл. 1.1) и 3'-3' связь. Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc иDbait32Hd имеют одинаковый нуклеотидный состав, но в разном порядке по сравнению с последовательностью Dbait32H.- 11017418 Таблица 1.2. Последовательности и химические структуры различных меченых молекул Dbait В табл. 1.2 заглавными буквами показаны нуклеотиды с фосфодиэфирным скелетом. Заглавными буквами жирным шрифтом показаны нуклеотиды с фосфоротиоатным скелетом. Прописными буквами жирным шрифтом показаны нуклеотиды с метилфосфонатным скелетом. Сплошные полуокружности символизируют гексаэтиленгликолевый линкер. Указаны различные меченые (цианином 3 или 5, FITC) молекулы Dbait8Hc, Dbait32H, Dbait32Hc и Dbait32Hd. Таблица 1.3. Последовательности и химические структуры молекул Dbait из 64 п.н. Dbait64 и В табл. 1.3 заглавными буквами показаны нуклеотиды с фосфодиэфирным скелетом. Заглавными буквами жирным шрифтом показаны нуклеотиды с фосфоротиоатным скелетом. Сплошные линии символизируют гексаэтиленгликолевый линкер. Все молекулы Dbait получены путем автоматизированного синтеза олигонуклеотидов в твердой фазе (Eurogentec, Belgium). Они очищены в денатурирующих условиях путем хроматографии HPLC с обращенной фазой. Капиллярный гель-электрофорез в денатурирующих условиях. Для контроля качества применяют масс-спектрометрию MALDI-TOF/LC-MS. Более 90% олигонуклеотидов имеют полную длину. Все образцы лиофилизируют перед отправкой заказчику. По получении все образцы растворяют в бидистиллированной воде. Концентрацию молекул Dbait рассчитывают по поглощению при 260 нм (CantorWarshaw, 1970) в денатурирующих условиях (6090C в зависимости от термальной стабильности молекул Dbait). Концентрацию молекул Dbait с флуоресцентными тагами рассчитывают по поглощению при соответствующей длине волны для конкретного красителя (FITC: =80000 M-1 см-1 при 490 нм; Су 3: =150000 M-1 см-1 при 550 нм; Су 5: =250000 M-1 см-1 при 650 нм). Фрагмент двухцепочечной ДНК в форме гантели получают путем отжига и лигирования с помощью Т 4 ДНК-лигазы (BioLabs) двух полушпилек, несущих гексаэтиленгликолевый линкер и обладающих выступающими комплементарными 3'-концами. На основе термодинамических и кинетических соображений применяют следующие протоколы для получения молекул Dbait соответственно их молекулярности. Для бимолекулярных молекул Dbait Dbait32, Dbait32-NH2, Dbait64 и Dbait64L). Смесь 1:1 маточных растворов (наивысшая возможная концентрация) каждой цепочки в бидистиллированной воде нагревают при 90C в течение 5 мин для полной денатурации каждой цепочки. Отжиг проводят путем постепенного возврата к комнатной температуре (образцы обычно оставляют в водяной бане) и получившиеся двухцепочечные молекулы хранят в виде аликвот при -20C. Для мономолекулярных молекул Dbait (шпильки). Раствор, содержащий 200 мкМ молекул Dbait в форме шпильки в бидистиллированной воде, следует нагревать при 90C в течение 5 мин для полной денатурации. Отжиг следует проводить путем охлаждения образцов в ледяной воде (0C). Аликвоты хранят при -20C.- 12017418 Пример 2. Биохимический анализ молекул Dbait. На первом этапе для исследования механизма действия молекул Dbait проводят серию анализов сдвига электрофоретической подвижности с различными молекулами Dbait, меченными радиоактивной меткой 32 Р, в присутствии ядерных белковых экстрактов из клеток Нер 2 по стандартному протоколу. Обычно 10 нМ 32 Р-меченых молекул Dbait инкубируют в присутствии различных концентраций ядерных белков (0, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 нг/мкл) при 30C в течение 10 мин в буфере ТВЕ. Затем образцы наносят на 5% акриламидный гель в неденатурирующих условиях. Электрофорез проводят при 95 В в течение 2 ч при 4C. Гель высушивают и сканируют с помощью электронной ауторадиографии (фосфоимиджера)(Molecular Dynamics). Фиг. 1.1 показывает образец расположения полос при титровании экстрактом ядерного белка из клеток Нер 2 различных молекул Dbait различной длины. За исключением случая самой короткой молекулы Dbait длиной 8 п.н. (Dbait8H), наблюдается до двух полос с замедленной подвижностью в случае более длинных молекул Dbait. Одна полоса с замедленной подвижностью наблюдается для молекул Dbait длиной 16 и 24 п.н. (Dbait16H и Dbait24H), тогда как две полосы с замедленной подвижностью наблюдаются для молекул Dbait длиной 32 п.н. (Dbait32H, Dbait32H-po и Dbait32). Для молекул Dbait из 32 п.н. интенсивность полосы с замедленной подвижностью 1 увеличивается и затем уменьшается при увеличении концентрации белка, тогда как интенсивность полосы с замедленной подвижностью 2 возрастает как функция концентрации ядерного белкового экстракта. Комбинация связывания антител и анализа сдвига электрофоретической подвижности с применением мышиного моноклонального антитела против Ku70 (Santa Cruz Biotechnology) выявляет, что полосы с замедленной подвижностью 1 и 2 содержат Ku-комплекс. Полосы 1 и 2 дополнительно сдвигаются до положения 1 и 2 при добавлении антитела против Ku70 (фиг. 1.2). По-видимому, полоса 1 несетKu70/80-комплекс, связанный с Dbait из 16-32 п.н., тогда как полоса 2 несет Ku70/80-комплексы, связанные с молекулами Dbait из 32 п.н. Контрольные эксперименты, проведенные с очищенными Ku-белками,подтверждают это толкование. Идентификация Ku-белков ясно показывает, что молекулы Dbait взаимодействуют с механикойNHEJ-пути зависимым от длины образом. Соединение концов ДНК измеряют путем инкубации 32 Р-меченых линейных фрагментов ДНК из 605 п.н. с ядерными экстрактами Нер 2 в присутствии различных молекул Dbait. Продукты лигирования мигрируют в виде димеров, тримеров или тетрамеров, начиная с мономера размером 605 п.о. Фиг. 1.3 показывает действие различных молекул Dbait на реакцию соединения концов ДНК в ядерных экстрактах клеток Нер 2. Приблизительно 16% 32 Р-меченых линейных двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами лигируются в димеры и тримеры в течение первых 2 ч инкубации. Количество продуктов лигирования с высоким молекулярным весом возрастает до 30% от всей внесенной ДНК через 16 ч. Когда Dbait32H добавляют к реакции в 100-кратном молярном избытке относительно линейного Р-меченого фрагмента, реакция сильно ингибируется. Сходное ингибирование активности соединения концов наблюдается также с экстрактами, полученными из клеток HeLa (данные не приведены). В большинстве экспериментов Dbait32 добавляют к ядерному экстракту одновременно с мечеными фрагментами ДНК. Когда Dbait32H инкубируют с экстрактом в течение 30 мин до добавления фрагментов, степень ингибирования оказывается сходной. В противоположность этому, когда Dbait32H добавляют через 30 мин после ядерного экстракта, ингибирования лигирования нет (данные не приведены). Эти данные указывают, что молекулы Dbait конкурируют в реакции соединения концов, но не вытесняют ДНК из образованного комплекса. Различные молекулы Dbait тестируют на их действие в бесклеточном анализе путем добавления молекул к ядерному экстракту и инкубации в течение 2 ч с фрагментами ДНК. На лигирование практически не оказывают влияния короткие молекулы (Dbait8H), одноцепочечные молекулы длиной 32 п.о.(Dbait32ss) или молекулы в форме гантели (Dbait32C). Dbait24H и Dbaitl6H, которые связывают только один гетеродимер Ku, ингибируют лигирование так же эффективно, как Dbait32H. Эти данные показывают, что лигирование фрагментов ДНК сильно ингибируется молекулами Dbait, способными захватывать Ku. Активность ДНК-ПК измеряют с применением набора для анализа активности ДНК-зависимой протеинкиназы SignaTECT (Promega, Madison, USA). Возрастающие количества ядерного экстракта из Нер 2(освобожденного от эндогенных ДНК путем ультрафильтрации на ДЭАЭ-сефарозе) анализируют в присутствии 250 нМ Dbait. Экстракт, биотинилированный пептидный субстрат и различные количества ядерного экстракта инкубируют в течение 5 мин при 30C с (-32 Р)АТФ согласно инструкциям производителя. Биотинилированный субстрат задерживают на мембране со стрептовидином, промывают и измеряют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Процент фосфорилирования рассчитывают путем деления связанной радиоактивности на общую радиоактивность (-32 Р)АТФ образца. Реакции (10 мкл) проводят в среде с 60 мМ KOAc, 100 мкг/мл БСА, 0,5 мМ Mg(Cl)2, 1 мкл 10X буфера для T4 ДНК-лигазы(Promega, Madison, USA). Ядерный экстракт и Dbait инкубируют в течение 2 мин до добавления 32 Р-меченой ДНК (10 нг). Образцы инкубируют различное время при 37C перед тем, как лигирование- 13017418 останавливают путем добавления 20 мМ ЭДТА и 1 мг/мл протеиназы K. Продукты лигирования анализируют путем электрофореза на 0,7% агарозном геле с последующей ауторадиографией и количественным определением с помощью фосфоимиджера. Фиг. 1.4 показывает активность ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) в присутствии ряда молекул Dbait (2 мкг) с различной длиной, последовательностями и химическими структурами, включая модифицированные скелеты, в 1,5 мкг ядерного белкового экстракта из клеток Нер 2. Киназная активность прямо зависит от длины и структуры двухцепочечной "ножки" молекулы Dbait. Высокая активация ДНК-ПК наблюдается с молекулами Dbait длиной 32 п.о., связанными с двумя димерными Kuкомплексами. Молекулы Dbait, связывающие только один Ku-димер (Dbait16H и Dbait24H), оказываются такими же неэффективными, как короткие Dbait8H, не связывающие Ku. Сходным образом, одноцепочечные Dbait32ss/Dbait32css и гантелеобразные Dbait32C, у которых нет свободных двухцепочечных концов, не активируют ДНК-ПК. Дополнительно, различные модификации скелета (фосфоротиоат, метилфосфонат, 3'-3'-связь) на свободном тупом конце (до 3 п.о.), а также присоединенные внутри лиганды(например, флуоресцентные красители) способны активировать ДНК-ПК. Стоит заметить, что активность ДНК-ПК, если и зависит от последовательности молекул Dbait, то незначительно, как показано с помощью Dbait32H, Dbait32Hb, Dbait32Hc и Dbait32Hd. Этот простой анализ бесклеточной активности ДНК-ПК указывает на то, что только длина (по меньшей мере примерно 32 п.о.) и двухцепочечная структуры ДНК со свободным концом молекулыDbait требуется для киназной активности, независимо от последовательности и химической модификации до определенной степени. Это согласуется с причастностью ДНК-ПК к NHEJ-пути, не зависимому от последовательности механизму соединения концов ДНК. Пример 3. In vitro активность молекул Dbait. Активность молекул Dbait в культуре клеток исследуют с помощью анализа клоногенной выживаемости в двух устойчивых к радиации клеточных линиях рака человека, полученных из карциномы шейки матки у женщин (HeLa) и из HNSCC (Нер 2) в сочетании с ионизирующей радиацией путем ингибирования незаконной интеграции экзогенных фрагментов ДНК и путем детектирования стойких участков DSB после облучения в клетках, трансфицированных молекулами Dbait. Известные клеточные линии человека Нер 2 (плоскоклеточная карцинома головы и шеи, HNSCC),LU1205 и SK28 (меланомы) применяют для исследований на животных. Исследования клеток в культуре проводят с применением Нер 2, HeLa S3 (карцинома эпителия шейки матки), МО 59K и MO59J (глиобластома). Клетки выращивают при 37C в монослойных культурах на полной среде DMEM, содержащей 10% инактивированной теплом сыворотки теленка (FBS; Invitrogen, Cergy Pontoise, France) и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин) в условиях 100% влажности, 95% воздуха и 5% СО 2. LU1205 выращивают в MCDB, содержащей 4% инактивированной теплом сыворотки теленка, 1% глутамина и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин). На стадии экспоненциального роста на платах на 6 ячеек клетки собирают и инкубируют с 700 мл полной среды DMEM, содержащей смесь молекул Dbait и реагента Superfect (Qiagen, Courtaboeuf, France) в соотношении 10 мкл Superfect на 1 мкг ДНК. Через 5 ч при 37C в стандартных условиях клетки промывают PBS и добавляют полную среду DMEM. Где указано, клетки облучают за один сеанс (10 Gy) через 5 ч после начала трансфекции или за четыре сеанса по 0,5 Gy с помощью источника радиации 37Cs(1 Gy/мин) через 3, 4, 5 и 6 ч после начала трансфекции и оставляют расти в течение двух недель. Когда измеряют интеграцию плазмид, добавляют 2 мкг плазмиды при трансфекции Dbait и добавляют пуромицин (1,7 мкг/мг) в среду роста через 48 ч после трансфекции. Эффективность плазмидной трансфекции рассчитывают путем анализа 10000 клеток на экспрессию GFP с помощью проточного цитометраFACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, USA). 3.1. Индуцированная клеточная смертность. Через 8 ч после трансфекции молекулами Dbait клеток HeLa и четырех сеансов дробного облучения по 0,5 Gy с интервалами в 2 ч (40,5 Gy), проведенного с помощью источника -излучения 137Cs, наблюдается значительное уменьшение клоногенной выживаемости по сравнению с нетрансфицированными клетками. Результаты приведены на фиг. 2.1, где на панели А показана зависимость от дозы нормализованного (приведенного) числа выживших клонов в присутствии Dbait32 и Dbait32H, а на панели Б показано нормализованное число выживших клонов в присутствии различных молекул Dbait в концентрации 83 нМ (концентрация в культуральной среде). Культура клеток находится в MEM, дополненной 10% сывороткой. В качестве трансфицирующего агента применяют Superfect (Qiagene) согласно инструкции производителя. Клоногенную выживаемость оценивают как количество обработанных клеток, образующих колонии относительно количества необработанных клеток. Действие зависит от длины и химической природы молекул Dbait зависимым от дозы образом. В этом исследовании молекулы Dbait в форме шпильки (Dbait32H, Dbait32-Т 4 и Dbait24H) и линейные двухцепочечные молекулы Dbait (Dbait64 и Dbait64L) значительно уменьшают клоногенную выживаемость. Следует заметить, что молекула Dbait32C в форме гантели, у которой нет свободных двухцепочечных концов (закрыты гексаэтиленгликолевым линкером с обоих концов), не проявляет никакого эф- 14017418 фекта. Химическая природа петли не имеет значения (Dbait32H по сравнению с Dbait32-T4). Эти наблюдения показывают, что молекулы Dbait могут эффективно повышать чувствительность клеток к ионизирующей радиации в культурах клеток. Фиг. 2.2 подтверждает предыдущие наблюдения и предоставляет дополнительные данные о том,что одноцепочечные или короткие молекулы Dbait из 8 п.н. не оказывают никакого действия. Дополнительно, она показывает, что действие не зависит от последовательности (Dbait32C по сравнению сDbait32Hc). Таблица 2.1. Клеточная выживаемость компетентных по ДНК-ПК клеток (MO59K) и дефицитных по ДНК-ПК клеток (MO59J) после воздействия радиации и Dbait Клетки разводят и рассевают для образования колоний во флаконы, которые затем облучают дозой 10 Gy и/или трансфицируют 2 мкг Dbait32Hc. В случае применения обоих воздействий облучение проводят через 5 ч после трансфекции. Выживаемость рассчитывают как количество клеток, образующих клоны после воздействия, поделенное на количество клеток, образующих клоны в необработанном образце. Среднее значение и стандартное отклонение (в скобках) рассчитывают по трем независимым экспериментам. Действие трасфекции Dbait32Hc на выживаемость клеток дикого типа и мутантных по ДНК-ПК клеток после -облучения оценивают по образованию колоний. Выживаемость после облучения уменьшается с 9,83% у нетрансфицированных клеток MO59K до 3,47% у клеток, трансфицированныхDbait32Hc. У соответствующей линии клеток мутанта ДНК-ПК-нуль, MO59J, в противоположность этому трансфекция Dbait32Hc не оказывает действия на выживаемость. Уровень выживаемости у облученных и трансфицированных Dbait32Hc клеток дикого типа близок к таковому у клеток мутанта ДНК-ПКнуль после облучения (3,47% по сравнению с 3,97%). Это предполагает, что Dbait32Hc ингибирует ДНКПК-зависимую репарацию у трансфицированных клеток дикого типа. 3.2. Ингибирование незаконной интеграции экзогенной ДНК молекулами Dbait. Известно, что ионизирующая радиация улучшает незаконную интеграцию экзогенной ДНК, процесс, называемый усиленная радиацией интеграция. Для этого исследования применяют культуру клетокHeLa. Клетки трансфицируют в течение 8 ч с применением 2 мкг линейной плазмиды, несущей ген, кодирующий устойчивость к неомицину, при трех различных соотношениях ДНК/Superfect (1:2, 1:5 и 1:10). Во время трансфекции клетки облучают согласно различным протоколам облучения: без облучения,одиночное облучение в 1 Gy и 2 Gy, а также облучение в 2 Gy, проведенное дробным способом дозами из 0,5 Gy каждые 2 ч (40,5 Gy). Интеграцию плазмид определяют путем селекции NeoR клеток, растущих на среде, содержащей 0,6 мг/мл G418. Интеграция плазмид существенно увеличивается при дробном облучении. Когда добавляют 2 мкг молекул Dbait32H в среду для трансфекции, усиленная радиацией интеграция пропадает (фиг. 2.3). Фиг. 2.4 предоставляет дополнительные данные, показывающие, что только молекулы Dbait из 32 п.н. (Dbait32H и Dbait32Hc) способны ингибировать усиленную радиацией незаконную интеграцию кольцевой плазмиды, несущей ген устойчивости к пуромицину, тогда как более короткие молекулы Dbait(Dbait16H, Dbait8H), одноцепочечные или молекулы Dbait в форме гантели (Dbait32ss и Dbait32C) оказываются неэффективными. В качестве контроля применяют Wortmann (Wort) и NU7026 (NU), являющиеся известными ингибиторами PI3K (включая ДНК-ПК). Эти эксперименты показывают, что усиленная радиацией незаконная интеграция экзогенной ДНК,которая нуждается в участии белков Ku, ДНК-ПК и ATM (Nimura et al., 2002), ингибируется молекуламиDbait из 32 п.о. независимым от последовательности образом, как ожидалось, поскольку механизм действия этих молекул Dbait осуществляется через захват белков, вовлеченных в NHEJ-путь. 3.3. Стойкость участков DSB после облучения в клетках, трансфицированных молекулами Dbait. Участки DSB в ядрах можно определять по иммуннофлуоресценции антител -Н 2 АХ, которые связываются с фосфорилированными Н 2 АХ (вариантом гистона Н 2 А). Большинство участков -Н 2 АХ появляется вскоре после облучения и исчезает по мере прогресса репарации DSB. Протоколы трансфекции и облучения сходны с таковыми, описанными выше. Для иммунодетекции клетки выращивают на поверхности покровного стекла в чашках Петри диаметром 5 см, трансфицируют 2 мкг Dbait32H-FITC, молекул Dbait, меченных FITC, с помощью Superfect (Qiagene) согласно инструкциям производителя. Через 4 ч после начала трансфекции клетки облучают (2 Gy), затем оставляют отдыхать в течение 2 ч в среде при 37C. После трех циклов промывки клетки фиксируют с помощью 2%PFA в течение 10 мин. После одной дополнительной промывки детектируют присутствие -Н 2 АХ с помощью кроличьих антител против -Н 2 АХ (4411-PC, Trevigen), разведенных в соотношении 1/100 в 1PBS, 1% БСА. Клетки промывают три раза с помощью 1PBS, 0,5% Тритон Х-100, затем инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре к козьими антителами против иммуноглобулина кролика,конъюгированными с родамином, при разведении 1/100 в 1PBS, 1% БСА. Клетки наблюдают с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Фиг. 2.5 показывает результаты, полученные на клетках HeLa, трансфицированных флуоресцентными молекулами Dbait32H-FITC, через 2 ч после облучения дозой 2 Gy. Левая панель: флуоресценция молекул Dbait32H-FITC (светлые точки и участки) и участки DSB, детектируемые по иммунофлуоресценсии с помощью антител -Н 2 АХ в ядрах; правая панель: то же изображение ядер с участками DSB,детектируемыми путем иммунофлуоресценции антител -Н 2 АХ на фоне окрашивания DAPI. Стрелки в левом нижнем углу показывают отсутствие сигнала Dbait32H-FITC и -Н 2 АХ в ядрах. Стрелки в верхнем правом углу показывают совместное расположение сигналов Dbait32H-FITC и -Н 2 АХ. Как показано на фиг. 2.5, участки DSB сохраняются в клетках HeLa, трансфицированных молекулами Dbait32H-FITC через 2 ч после облучения (2 Gy), как показано с помощью двойной флуоресцентной метки с применениемDbait32H-FITC и антител -Н 2 АХ. Стоит отметить, что участки DSB практически не детектируются в клетках, которые не были эффективно трансфицированы Dbait32H-FITC. Эти данные предполагают, что репарация DSB нарушена в клетках, эффективно трансфицированных Dbait32H, тогда как репарация ДНК завершена в клетках, которые трансфицированы не так успешно. Вестерн-блоттинг проводят с применением кроличьих моноклональных антител anti-phosphoThr68Chk2 (Cell Signaling Technology, Denver, USA), моноклональных антител против -актина клона АС-15(Sigma, MS, USA), антител против Н 2 АХ (Cell Signaling Technology, Denver, USA) и мышиных антител против фосфогистона Н 2 АХ (Ser139) (Upstate, Tempcula, CA, USA). На верхней панели фиг. 2.6 показан анализ с помощью вестерн-блоттинга фосфорилированых форм гистона Н 2 АХ (-Н 2 АХ) по сравнению с общим фосфорилированием белка Н 2 АХ гистона Н 2 АХ с помощью PIKK. Клетки Нер 2 трансфицируют в течение 5 ч различными молекулами Dbait 32 Нс, 24 Н, 16 Н и 8 Н или не трансфицируют. Их облучают под конец трансфекции, инкубируют в течение одного часа и затем анализируют. Показано, что Dbait32Hc сильно увеличивает уровень фосфорилированной формы Н 2 АХ (-Н 2 АХ) по сравнению с контролями (как облученные клетки, так и необлученные). Другие более короткие молекулы Dbait проявляют гораздо меньшее действие или никакого. Чтобы исследовать действие Dbait на индуцированное ионизирующей радиацией образование участков -Н 2 АХ и их исчезновение, клетки Нер 2 трансфицируют Dbait32H-Су 3 с помощью агента Superfect(Qiagen). Трансфицированные или нетрансфицированные клетки Нер 2 облучают дозой 10 Gy. Клетки фиксируют в различное время (0, 30 мин, 1, 5, 24, 48, 72 ч и 7 дней). Применяют первичные мышиные моноклональные антитела для -H2AX (ser139) (Upstate, Tempcula, CA, USA) при разведении 1/500 и инкубируют в течение 2 ч при 0C, затем промывают буфером PBS и инкубируют с вторичными антителами против мышиного иммуноглобулина, конъюгированными с Alexa 488 (Molecular Probe, Eugene, OR,USA) при разведении 1/200 в течение 1 ч в темной комнате. Кинетики устойчивости участков двухцепочечного разрыва исследуют с помощью -Н 2 АХ в облученных клетках с применением проточного цитометра FACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, USA). На нижней панели фиг. 2.6 показано, что уровни -Н 2 АХ остаются высокими и сохраняются в трансфицированных Dbait32H клетках по сравнению с контролями (облученными, но нетрансфицированными или клетками, не подвергнутыми воздействию). Этот эксперимент указывает на то, что Dbait32H существенно замедляет репарацию индуцированных ионизирующей радиацией DSB. Пример 4. Действия молекул Dbait на клетках линии GMA32 и их сочетание с облучением или ингибиторами митоза. Фибробласты китайского хомяка линии GMA32, подверженные разрывам ДНК, выдерживают в среде MEM (Gibco), дополненной 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина, 1MEM не незаменимыми аминокислотами, 1 пенициллином/стрептомицином и 10% сывороткой лошади. Обычно клетки рассевают в количестве от 2105 до 4105 в среде без антибиотиков на чашки Петри диаметром 5 см за 24 ч до трансфекции различными молекулами Dbait (4,5 мкг) с липофектамином 2000 (Life Technologies) в качестве трансфицирующего агента (в соотношении 1:3) согласно инструкциям производителя. Под конец трансфекции клетки облучают (4Gy) или обрабатывают ингибиторами митоза: нокодазолом (200 нМ),навелбином (100 нМ) или таксолом (200 нМ). Примерно через 16 ч ингибиторы удаляют и клетки оставляют отдыхать. Облучение клеток проводят с помощью -лучей от 137Cs в роли источника излучения. Через 24 ч отдыха клетки собирают и применяют для анализа с помощью проточной цитометрии (FACS), вестерн-блоттинга или для определения клоногенной выживаемости и действия каждой обработки.- 16017418 На фиг. 3.1 приведены данные анализа с помощью FACS необработанных клеток GMA32, клеток,трансфицированных самих по себе или трансфицированных различными молекулами Dbait с помощью липофектамина, но без дальнейшего облучения или обработки ингибиторами митоза. Фаза M1 представляет процент клеток на стадии sub-G1, указывающей на клеточную смерть. Значительная смерть клеток наблюдается только в присутствии молекул двухцепочечной Dbait32 и шпилькообразной Dbait32H, тогда как шпилькообразная Dbait16H и одноцепочечная Dbait32ss индуцируют промежуточную и умеренную гибель клеток соответственно. Самая короткая молекула в форме шпильки Dbait8H не приводит к запуску клеточной смерти по сравнению с контролем (клетки, трансфицированные только липофектамином). Эксперименты проводят с проточным цитометром FACS calibur (Becton Dickinson). Клетки собирают, суспендируют в 1 мл холодного буфера GM (6,5 мМ глюкоза, 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМNa2HPO4, 1 мМ KHPO4, 0,5 мМ ЭДТА) и хранят при 4C в течение по меньшей мере 2 ч после добавления 3 мл холодного 100% этанола. На этом этапе клетки в итоге промывают 1PBS, затем окрашивают в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе Р 1 (50 мкг/мл пропидий йодида, 25 мкг/мл РНКазы А в буфере 1PBS). Анализируют 10000 событий с помощью программы Cellquest и вклад клеточных агрегатов отбрасывают. Процент клеток с содержанием ДНК, соответствующим стадии sub-G1, подсчитывают. В тех же условиях проводят иммунодетекцию участков DSB -Н 2 АХ, фосфорилированного по серину 139, с помощью метки -Н 2 АХ (светлые точки или участки в ядрах) у необработанных клетокGMA32, клеток, трансфицированных самих по себе или трансфицированных различными молекуламиDbait с помощью липофектамина. Окрашивание клеточных мембран и ядер проводят с помощью FITCDiOC6 и DAPI. Наблюдают сходные воздействия молекул Dbait (фиг. 3.2). Эксперимент показывает, что как двухцепочечные молекулы Dbait32, так и шпилькообразные молекулы Dbait32H могут эффективно запускать сходный клеточный ответ, как если бы в ядрах произошло повреждение ДНК. Это представляет видимое доказательство того, что такие молекулы Dbait можно применять для захвата белков, включенных в репарацию ДНК по NHEJ-пути. Для иммунодетекции клетки выращивают на покровном стекле в чашке Петри на 5 см в течение 24 ч до трансфекции различными молекулами Dbait. Через день после трансфекции в среду добавляютFITC-DiOC6 (Molecular probes) в течение 5 мин при 37C (для окрашивания мембран). После трех циклов отмывки клетки фиксируют с помощью 4% PFA в течение 20 мин. После дополнительной промывки -Н 2 АХ, фосфорилированный по серину 139 (-Н 2 АХ), детектируют с помощью кроличьего антитела против -Н 2 АХ (4411-PC, Trevigen) при разведении 1/100 в 1PBS,1% БСА. Клетки промывают три раза 1PBS, 0,5% Тритон Х-100, затем инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с козьими антителами против иммуноглобулина кролика, конъюгированными сAlexa 488 (Molecular Probe) при разведении 1/100 в 1PBS. Клетки наблюдают с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Дополнительные эксперименты проводят для поиска доказательств передачи сигнала о повреждении ДНК. Белок р 53 является хорошо известным основным белком, опосредующим передачу сигнала о повреждении ДНК и координацию соответствующих ответов (репарация ДНК, апоптоз и т.д.) путем изменения степени своего фосфорилирования. В частности, фосфорилирование остатка серина 15 включено во взаимодействие с белком MDM2, действующим как обратный контроль. Так, состояние фосфорилирования серина 15 белка р 53 анализируют с помощью вестерн-блоттинга. На фиг. 3.3 показано, что серин 15 белка р 53 высоко фосфорилирован, когда клетки трансфицированы двухцепочечной молекулойDbait32 или шпилькообразной молекулой Dbait32H, тогда как более короткая шпилькообразная молекулаDbait16H индуцирует умеренное фосфорилирование. Ни самая короткая молекула Dbait8H, ни одноцепочечная Dbait32ss не способны индуцировать значительного фосфорилирования серина 15 в белке р 53. Этот эксперимент представляет дополнительное доказательство того, что присутствие как двухцепочечной Dbait32, так и шпилькообразной Dbait32H в клетках GMA32 детектируется как повреждение ДНК и индуцирует сигнал для ответа посредников, например фосфорилирования белка р 53, повидимому, через активацию ATM. Для анализа с помощью вестерн-блоттинга клетки лизируют в буфере Лэмли. Одинаковые количества лизатов разделяют в 12% полиакриламидном геле. Белки переносят на нитроцеллюлозные мембраны, которые обрабатывают 5% обезжиренным молоком (1 ч) перед инкубацией в течение ночи с антителами anti-p53Ser15 (9284, Cell Signaling), разведенными в 500 раз буфером TBST (10 мМ Трис-HCl рН 7,5; 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20), содержащим 5% обезжиренного молока. Затем блоты инкубируют с вторичными козьими антителами против кроличьего иммуноглобулина, конъюгированными с пероксидазой из хрена, (Р 0448, Dako) при разведении 1/5000 в TBST. Комплексы белок-антитело детектируют по усиленной хемилюминесценции (RPN2106 ECL, Amersham). Радиосенсибилизирующее и химиосенсибилизирующее действия молекул Dbait в клетках GMA32 оценивают в анализе клоногенной выживаемости. Для анализа клоногенной выживаемости готовят серийные разведения после подсчета клеток для рассева на чашки Петри, 5 см, различных количеств клеток. Применяют количество клеток в интервале от 100-200 (контрольные клетки) до 3000 (трансфициро- 17017418 ванные клетки и/или необработанные клетки). Через 10 дней клетки, образующие клоны, фиксируют 4% параформальдегидом (20 мин), затем окрашивают метиленовым синим (15 мин) и подсчитывают количество клонов на каждой чашке (с тройным повтором). На фиг. 3.4 показано, что сенсибилизация к облучению дозой 4 Gy наблюдается в клетках GMA32,трансфицированных молекулами двухцепочечной Dbait32 или шпилькообразной Dbait32H. Дополнительно, наблюдается также сенсибилизация к химиотерапии в клетках GMA32, трансфицированных молекулами двухцепочечной Dbait32 или шпилькообразной Dbait32H при обработке их ингибиторами митоза (200 нМ нокозадол, 100 нМ навелбин (винорелбин) или 200 нМ таксол (паклитаксель. Эти лекарства известны как мощные ингибиторы полимеризации или деполимеризации микротрубочек. МолекулыDbait32 и Dbait32H способны усиливать цитотоксическую активность этих ингибиторов митоза. Пример 5. Радиосенсибилизация гетеротрансплантатов опухолей человека у голой мыши. Активность молекул Dbait in vivo в сочетании с радиотерапией исследуют с применением голых мышей с гетеротрансплантатами опухолей человека, полученных путем подкожной инъекции устойчивых к облучению линий клеток (Нер 2 производных плоскоклеточной карциномы головы и шеи, HNSCC) или фрагментов опухолей (предварительно полученных путем подкожной инъекции клеток линии U87,производных глиобластомы). Исследования в основном проводят на мышах с гетеротрансплантатами устойчивой к облучению опухоли человека HNSCC, чтобы проверить концепцию in vivo. Облучение проводят -лучами от источника 137Cs с соответствующей защитой мышей для проведения локализованного облучения опухолей. Типичные условия исследования включают внутриопухолевую инъекцию соответствующего препарата 1 нмоль молекул Dbait вместе с трансфицирующими агентами (катионным дендримером (Superefect,Qiagene), диоктадециламидоглицилспермином (DOGS, Polyplus transfection), полиэтиленимином (PEI,Polyplus Transfection) согласно инструкциям производителя за 5 ч до облучения. Общую дозу из 30 Gy дают в течение 5 недель: а) 32 Gy в неделю (примерно раз в два дня), б) 5 Gy в неделю, в) 15 Gy за две недели. Размер опухоли измеряют 2-3 раза в неделю. Облучение и внутриопухолевое введение среды MEM(буфер, в котором растворены Dbait) применяют в качестве контроля облучения без введения Dbait. Объем опухоли рассчитывают (V=2ab2, где a - длина, b - ширина). Отношение объема, измеренного в момент времени t, к исходному объему (Vt/Vi) применяют в качестве индикатора развития опухоли. За мышами наблюдают вплоть до 100 дней. Тестируют по меньшей мере 4 независимые серии из 6 животных. Результаты проиллюстрированы на фиг. 4.1 (панель А - ветвь без лечения (n=38); панель Б - ветвь контроля, где животные получают 20 мкл культуральной среды (MEM) + облучение 32 Gy в неделю(n=30); панель В - ветвь, где животные получают 1 нмоль (20 мкг) Dbait32H + облучение 32 Gy в неделю (n=35.MEM или Dbait32H вводят путем внутриопухолевой инъекции за 5 ч до облучения. Дробную дозу радиации (2 Gy) дают через день три раза в неделю. Лечение продолжают 5 недель, давая суммарную дозу облучения 30 Gy. Точки представляют зависимость от времени объема опухоли у каждой мыши. Сплошные линии представляют наилучшую полиноминальную аппроксимацию. На панели Г показан график Каплана-Мейера для всех мышей, у которых увеличение объема опухоли составляет (Vt/Vi)5. Значительное количество данных накоплено для ветви, где применено Dbait32H с облучением 32Gy в неделю (панель В, n=35), которые ясно показывают радиосенсибилизацию по сравнению с контрольными ветвями, такими как без лечения (панель A, n=38), MEM + 32 Gy (панель Б, n=30). Статистический тест по Мэн и Уитни (Man and Whitney) дает значение р=0,00067 для ветви Dbait32H + 32 Gy против MEM + 32 Gy. Та же тенденция наблюдается на графике Каплана-Мейера для мышей с объемом опухоли (Vt/Vi5) менее чем в пять раз больше исходного объема (панель Г). Дополнительные исследования впоследствии проводят на мышах с гетеротрансплантатом человеческих опухолей HNSCC, U87, LU1205 и SK28 для определения молекулярных свойств молекул Dbait и оптимального протокола для их активности in vivo. Данные, полученные при исследовании групп (когорт), согласуются с молекулярными свойствами молекул Dbait, наблюдаемыми в биохимических исследованиях и в исследованиях in vitro (см. примеры 2-4). Дополнительно показано, что радиосенсибилизация зависит от времени выдержки между внутриопухолевой инъекцией Dbait32H и облучением ионизирующей радиацией: 5 ч 1 ч. Радиосенсибилизация также наблюдается у мышей с гетеротрансплантатами глиобластомы человека. Глиобластома является высшей степенью опухоли мозга и характеризуется невероятно агрессивным развитием с быстрым фатальным исходом и устойчивостью к радио- и химиотерапиям. 2-3 миллиона клеток U87, полученных из глиобластомы человека, вначале подкожно вводят голой мыши. Трансплантированную опухоль затем отбирают и применяют для последующей пересадки другой голой мыши путем подкожной трансплантации примерно 8 мм 3 глиобластомы. В табл. 3.1 показаны данные, полученные на опытной серии гетеротрансплантатов глиобластомы человека у голых мышей. У 50% мышей в той ветви, где животные получают Dbait32H (1 нмоль) путем внутриопухолевой инъекции и облучение (115 Gy/неделю или 35 Gy/неделю с последующей неделей- 18017418 отдыха, затем второй цикл облучения при общей дозе ионизирующей радиации 30 Gy), объем опухоли 4 см 3 на 25 день после начала лечения, тогда как у 100% мышей в контрольных ветвях (без лечения или облученные и инъецированные солевым раствором (PBS объем опухоли значительно превышает 4 см 3 и их забивают до окончания исследования согласно текущим правилам обращения с животными. Таблица 3.1. Анализ радиосенсибилизации гетеротрансплантатов глиобластомы человека у голых мышей с помощью Dbait32H (1 нмоль на внутриопухолевую инъекцию) Применяют два протокола облучения (через 5 ч после внутриопухолевой инъекции): 115 Gy в неделю или 35 Gy в неделю с последующей одной неделей отдыха, затем второй цикл облучения. Общая доза облучения составляет 30 Gy. Контрольные группы являются группами без лечения или группами,получавшими инъекции солевого раствора (PBS). На основе этих обнадеживающих данных in vivo, предоставляющих доказательство того, что молекулы Dbait могут эффективно усиливать эффективность радиотерапии, задуманы и проведены дополнительные эксперименты для предоставления дополнительных данных относительно применения молекулDbait в качестве вспомогательного агента для сенсибилизации при радиотерапии и, таким образом, для усиления доказательства принципа применения ДНК-приманки в противораковой терапии. На фиг. 4.2 показано распределение меченных цианином 3 молекул Dbait32H в клетках Hep2 (линия клеток HNSCC) гереротрансплантата опухоли у голых мышей. 20 мкг Dbait32H-Cy3 в смеси с Superefect(агентом трансфекции) инъецируют в опухоль Нер 2 размером 1,5 см 3. Мышей забивают через 6 ч после инъекции. Опухоли отбирают и делают срезы в замороженном состоянии для анализа без фиксации. Для окрашивания ядра применяют DAPI. Флуоресценция цианина 3 показывает, что молекулы Dbait32H-Су 3 распределяются по ткани опухоли из капиллярного кровеносного сосуда и локализуются в клеточном ядре. На фиг. 4.3 показан другой эксперимент с клетками гетеротрансплантата Нер 2, как описано на фиг. 4.1. Рост опухоли измеряют во время лечения и после в четырех группах из 10 животных с различными протоколами лечениями (без лечения, ведение одного Dbait32H, облучение только и комбинированное лечение с применением Dbait32H и облучения). Рост индивидуальных опухолей указан для каждого животного. Протоколы лечения те же, как описано на фиг. 4.1. Эксперимент начинают, когда объем опухолей Нер 2 достигает 150-200 мм 3. Для каждого сеанса лечения в опухоль инъецируют 20 мкгDbait32H в смеси с полиэтиленимином PEI, Polyplus Transfection, Strasbourg, France) согласно инструкциям производителя за 5 ч до облучения дозой 2 Gy. Рост опухолей значительно уменьшен в группе, получавшей комбинированное лечение Dbait32H и облучением, по сравнению с группами, получившими только облучение или только Dbait32H. На фиг. 4.4 показан график Каплана-Мейера выживаемости голых мышей с подкожными гетеротрансплантатами опухоли Нер 2. Из соображений этики животных забивают, когда опухоли у них достигают размера 2 см 3. Эту конечную точку рассматривают как смерть в анализе выживаемости. Протоколы лечения приведены на фиг. 4.3. Включены пять групп: без лечения, трансфицированные плацебо и облученные, получившие комбинированное лечение облучением и возрастающими количествамиDbait32H (20, 60 и 120 мкг/сеанс). Количество животных в каждой группе указано в табл. 3.2. Наблюдается ясное зависимое от дозы действие в группах, получивших Dbait32H и облучение 2 Gy. Фотографии опухолей, представительных для каждой группы (без лечения, получившие 20 и 60 Dbait32H/сеанс вместе с 2 Gy облучения), сделаны через 15 дней после начала лечения, в конце лечения (35 дней) и через 13 дней после завершения лечения (35+13 дней). Они дают ясное видимое представление преимущества комбинированного лечения с применением Dbait32H и облучения. На фиг. 4.5 показан гистологический анализ гетеротрансплантатов опухоли Нер 2 в середине хода лечения (7 сеансов). Опухоли отбирают через 20 дней после начала различных протоколов лечения, как показано на фиг. 4.3. Их фиксируют в формалине и срезы ткани окрашивают гематоксилином, эозином и шафраном. Две опухоли для каждого протокола лечения анализируют с помощью микроскопии. Усиление некроза и апоптоза наблюдается в опухолях, которые лечат комбинацией Dbait32H и облучения по сравнению с опухолями, которые обрабатывают только облучением. На фиг. 4.6 показано изображение гетеротрансплантатов опухолей Нер 2, полученное с помощью ЯМР, в середине хода лечения (7 сеансов). Показаны три представительных сечения опухолей без лечения, опухолей после облучения и после комбинированного лечения с применением Dbait32H(20 мкг/сеанс) и облучения (2 Gy/сеанс). Области некроза более значительные в опухолях после леченияDbait32H и облучением, чем у тех, которые подвергались только облучению. Это согласуется с цитологическим анализом опухолей (см. фиг. 4.5). На фиг. 4.7 показано представление по Каплану-Мейеру выживаемости голых мышей с подкожными гетеротрансплантатами опухолей Нер 2, U87, LU1205 и SK28 и соответствующих контрольных групп(без лечения, лечение только облучением). Протокол для Нер 2 описан на фиг. 4.3. Другие опухоли лечат по модифицированному протоколу, где применяют дробное облучение по 5 Gy в течение трех последовательных дней с последующими четырьмя днями отдыха и затем лечение повторяют еще один раз. Общая доза облучения (65 Gy) равна таковой по протоколу, применяемому для лечения опухоли Нер 2(152 Gy). Положительный результат комбинированного применения Dbait32H и облучения наблюдается для всех четырех гетеротрансплантатов опухолей человека. Поскольку лежащий за этим механизм действия молекул Dbait и NHEJ-путь присущи всем клеткам, ожидается, что это выполняется и для других опухолей с иной гистологией. Описательные анализы ответов опухолей проводят для каждого протокола лечения и каждого типа опухоли. День 1 - это день, когда проводят первый сеанс лечения. За всеми животными наблюдают в течение по меньшей мере 150 дней или до их умерщвления из этических соображений. Медианное время жизни оценивают по способу Каплана-Мейера. TGD (разница роста опухоли) рассчитывают путем вычитания среднего времени увеличения объема опухоли вчетверо в контрольной группе из времени увеличения объема опухоли вчетверо у каждой мыши в каждой группе на лечении. Средние значения TGD рассчитывают для каждой группы на лечении с применением индивидуальных измерений. Общие кривые выживаемости анализируют по Каплану-Мейеру и сравнивают с применением непараметрического теста для логарифмических рангов (Log Rank test), поскольку данные не описываются нормальным распределением. При анализе применяют программы S-Plus 6.2 (MathSoft Inc., Seattle, WA) и statEL (ad Science, Paris, France). Глобальный анализ Log Rank вначале применяют для каждой группы с одинаковым типом опухоли. Затем лечение с применением Dbait сравнивают с контролем с применением плацебо. Количество животных (n), относительный риск (RR) и значения P представлены в табл. 3.2. Все тесты считают значимыми при уровне значимости 0,05. Таблица 3.2 Табл. 3.2 суммирует часть вышеописанных данных и предоставляет сравнение выживаемости животных с гетеротрансплантатами при лечении по различным протоколам (различные молекулы Dbait + облучение versus облучение + инъекция плацебо) для трех линий клеток опухоли человека, введенных в виде подкожного гетеротрансплантата голым мышам. Дополнительно, здесь показано, что последовательность молекул Dbait не имеет значения, о чем свидетельствуют сходные результаты примененияDbait32Hc по сравнению с Dbait32H. Показано также, что одноцепочечные молекулы Dbait32ss неактивны даже в высокой дозе. Следует указать на то, что последовательности Dbait32Hc лишены CpG во избежание эффекта иммунологической реакции из-за хорошо известной иммуностимуляци, опосредованной толл-подобным рецептором. Можно заключить, что значительное уменьшение роста гетеротрансплантатов устойчивых к облучению опухолей человека (1 Нер 2, U87 и SK28) и чувствительной к облучению опухоли (LU1205) у голых мышей предоставляет доказательства того, что молекулы Dbait могут эффективно повышать чувствительность к радиотерапии этих агрессивных опухолей. Так, подтверждение концепции подхода ДНКприманки достигнуто in vivo.- 20017418 Пример 6. Повышение чувствительности к химиотерапии опухолей пищеварительного тракта, индуцированных у трансгенных мышей K-RasV12GApc1638N. Для исследования способности молекул Dbait повышать чувствительность к противораковой химиотерапии выбирают модель эндогенной опухоли у мышей. Для этого применяют трансгенных мышей,несущих мутации K-RasV12GApc1638N. Их получают путем скрещивания двух трансгенных мышей: одной, несущей мутацию K-RasV12G под контролем мышиного промотора villin (pVill/K-RasV12G) (Janssen etal., 2002), другой несущей мутацию Apc1638N в одной аллели (Fodde et al., 1994). Трансгенная мышь с мутациями pVill/K-RasV12GApc1638N развивает спонтанные опухоли пищеварительного тракта в возрасте примерно 5 месяцев и быстро погибает. Мышей лечат в среднем возрасте 12 недель путем комбинации химиотерапии (5FU+CPT11) иDbait32H по сравнению с одной химиотерапией согласно протоколу, приведенному на фиг. 5.1, панель А. Протокол включает три цикла лечения. Каждый цикл состоит из внутрибрюшинной инъекции 0,6 мг 5FU и 0,6 мг СРТ 11 совместно с оральным введением 0,1 мг Dbait32H три раза в неделю с последующей одной неделей отдыха. 5FU (5-фторурацил, Teva) готовят на растворе 0,9% NaCl в концентрации 50 мг/мл.CPT11/Irinotecan (Campto, Aventis) готовят на растворе 0,9% NaCl в концентрации 20 мг/мл. За состоянием здоровья и выживаемостью мышей следят до их смерти. Никакого указания на дополнительное токсическое действие молекул Dbait не наблюдается. Результаты показаны на фиг. 5.1. Панель А - протокол лечения для трех групп/ветвей трансгенных мышей K-RasV12GApc1638N среднего возраста 12 недель; контрольная группа (без лечения), группа, получившая 5FU+CPT11, группа, получившая 5FU+CPT11 и Dbait32H. Проводят три цикла лечения. Каждый цикл состоит из внутрибрюшинной инъекции 0,6 мг 5FU и 0,6 мг СРТ 11 совместно с оральным введением 0,1 мг Dbait32H три раза в неделю с последующей одной неделей отдыха. Количество мышей в каждой группе указано в скобках. Конечной точкой является время выживания. Панель Б - график КапланаМейера кривых выживаемости для всех трех групп. Панель В - медианное время выживаемости трех групп, как показано на панели Б. Несмотря на уменьшенные когорты, наблюдается улучшение времени выживаемости в ветви, которая получает комбинацию химиотерапии (5FU+CPT11) и Dbait32H (медиана выживания равна 226 дням,значение р=0,2) по сравнению с таковой, получившей только химиотерапию (173 дня) и контрольной ветвью (175 дней) (панели Б и В). Дополнительные исследования проводятся в настоящее время для увеличения когорт в ветвях(5FU+CPT11) + Dbait и (5FU+CPT11) с целью повышения статистической значимости результатов. Серии мышей забивают через две недели после окончания лечения (в среднем возрасте 18 недель) для подсчета среднего количества опухолей на животное. Кишечник исследуют макроскопически и путем гистологического исследования (стандартное окрашивание гематоксилином-эозином-шафраном). Результаты приведены на фиг. 5.2. Количество животных в каждой группе указано в скобках. Всех мышей забивают через 2 недели (неделя 18) после завершения протокола, приведенного на фиг. 5.1, панель А. Среднее количество опухолей в контрольной ветви (без лечения, n=101) составляет 30,8 на животное. Оба исследования согласованно показывают значительное уменьшение количества опухолей(30%) в ветви, получавшей комбинацию 5FU+CPT11 и Dbait32H (n=8) по сравнению с ветвью, получавшей только химиотерапию (n=7) (фиг. 5.2). Надо заметить, что среднее количество в контрольной ветви (группа без лечения, n=101) составляет 30,8 на животное. Образцы опухолей, полученные от животных, получавших молекулы Dbait с присоединенным флуоресцеином (Dbait32H-FITC) и 5FU+CPT11, анализируют с помощью иммунофлуоресцентных подходов. Участки, меченные -Н 2 АХ, дополнительно окрашивают флуоресцентными молекулами Dbait,памятуя о результатах in vitro (см. пример 3.3 и 4). На фиг. 5.3 показано дополнительное исследование,когда 18-недельных трансгенных мышей K-RasV12GApc1638N последовательно лечат с помощью химиотерапии (5FU+CPT11) и Dbait32H-FITC в течение трех дней и забивают через 2 ч после последнего сеанса лечения, как показано на панели А. Кишечник извлекают и промывают в PBS. Затем получают образцы опухолевых тканей и замораживают их при -80C. Для анализа из замороженных тканей опухоли получают гистологические образцы размером 5 мкм с помощью криостата. Участки репарации ДНК детектируют по иммунофлуоресценции с применением поликлональных кроличьих антител антиH2AX(Trevigen) при разведении 1/500 в PBS, затем обработкой козьими антителами против кроличьего иммуноглобулина, конъюгированными с цианином 3 (Jackson) при разведении 1/200 в PBS. Образцы также окрашивают с помощью DAPI и наблюдают с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Обнаружено,что флуоресценция Dbait32H-FITC гетерогенно распределена по ткани опухоли (эпителий и строма между железистыми структурами) и имеет предпочтительно ядерную локализацию (фиг. 5.3, панель Б слева). Сходные образцы распределения обнаруживаются для участков -Н 2 АХ (фиг. 5.3, панель Б справа). Наблюдается примерно совместная локализация сигналов Dbait32H-FITC и -Н 2 АХ.- 21017418 Можно заключить, что улучшение выживаемости и уменьшение числа опухолей на животное представляют доказательство повышения чувствительности к химиотерапии при лечении опухолей пищеварительного тракта у трансгенных мышей, несущих мутации K-RasV12GApc1638N с помощью молекулDbait (Dbait32H). Углубленный анализ опухолевых тканей у животных на лечении предоставляет свидетельство того, что молекулы Dbait взаимодействуют с процессом репарации ДНК. Следует заметить, что оральное введение молекул Dbait32H не включает никакого трансфицирующего агента в данном исследовании. Подводя итог, биохимические данные и данные in vitro ясно согласуются с механизмом действия молекул Dbait посредством взаимодействия с репарацией двухцепочечных разрывов по NHEJ-пути и с путем передачи сигнала репарации, обусловленной прямым или опосредованным повреждением ДНК(ионизирующая радиация или химиотерапевтические агенты). Благодаря природе независимого от последовательности NHEJ-пути (Jackson, 2002; Barnes, 2001, DownsJackon,2004) нет никаких ограничений по последовательности и длине молекул Dbait за пределами минимальной длины (около 32 п.н.). Исследования in vitro подтверждают эффективность сенсибилизации к радио- и химиотерапии опухолей у мышей с помощью молекул Dbait. Вместе взятые эти данные согласованно представляют доказательство концепции подхода с применением ДНК-приманок, характеризующихся молекулярными свойствами молекул Dbait. Ссылки