Олигонуклеотиды замкнутой нуклеиновой кислоты (lna) для модулирования экспрессии hif-1a и их применение

ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ЗАМКНУТОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (LNA) ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ HIF-1A И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Расмуссен Франк Винтер, Вестергор Майкен, Хансен Хенрик Фрюденлунд, Тру Шарлот Альбэк (DK) Представитель: Настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду LNA, состоящему из последовательности, выбранной из группы,состоящей из и где заглавными буквами обозначен аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, строчными буквами обозначен 2 дезоксинуклеотид, подчеркиванием обозначен либо аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, либо 2-дезоксинуклеотид, подстрочным индексом s обозначена фосфоротиоатная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA и подстрочным индексом х обозначена либо фосфоротиоатная связь, либо фосфодизфирная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, и где последовательность при желании увеличена посредством добавления до пяти 2-дезоксинуклеотидных единиц. Олигонуклеотиды LNA применимы для модулирования экспрессии индуцируемого гипоксией фактора - 1a (HIF-1a), например, при лечении онкологических заболеваний, ингибировании ангиогенеза, индукции апоптоза, предотвращения клеточной пролиферации или лечении ангиогенного заболевания, например, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна (ARMD), псориаза, ревматоидного артрита и других воспалительных заболеваний. 014097 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к композициям и способам для модулирования экспрессии HIF1a. В частности, данное изобретение относится к олигонуклеотидам LNA, которые специфически гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими HIF-1a. Олигонуклеотиды LNA проявляют способность модулировать экспрессию HIF-1a и раскрыты их фармацевтические препараты и их применение при лечении онкологических заболеваний, воспалительных заболеваний и глазных заболеваний. Предпосылки создания изобретения Для роста солидных опухолей свыше нескольких миллиметров необходимо развитие кровоснабжения и усиление метаболизма глюкозы. Центральным вопросом биологии рака является определение того,как солидные опухоли воспринимают гипоксию и отвечают посредством активирования индуцируемых гипоксией генов и секретированием ангиогенных факторов для образования кровеносной системы. Многие опухоли содержат гипоксические микроокружения, которые связаны с прогрессированием злокачественного процесса, метастазами и устойчивостью к лучевой терапии и химиотерапии. Открытие индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1) способствовало пониманию регуляции генов, индуцируемых гипоксией (патент США US 5882914 и WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 состоит из двух субъединиц HIF-1 (HIF-1 альфа; обозначаемая здесь как HIF-1a) и HIF-1 и связывает элементы, чувствительные к гипоксии (HRE) в энхансерах генов, кодирующих такие ангиогенные факторы,как VEGF и белки, связанные с гликолизом, например гликолитические ферменты и переносчик глюкозы 1 и 3 (GLU-1 и -3). Показано, что сконструированный супрессирующий эффект HIF-1a посредством передачи внутрь опухоли гена антисмысловой HIF-1a плазмиды приводит к подавлению VEGA и уменьшению плотности сосудов в опухоли (WO 00/76497, Sun X et al., Gene Therapy (2001) 8, 638-645). Данная плазмида содержала фрагмент кДНК длиной 320 п.н., кодирующий 5'-конец HIF-1a (нуклеотиды 152-454; GenebankAF003698). В международной публикации WO 2003/085110 описаны антисмысловые олигонуклеотиды LNA,которые оказывают супрессирующий эффект на экспрессию HIF-1a человека. Одно соединение обозначено CUR813 (SEQ ID11). В настоящем изобретении раскрыты олигонуклеотиды LNA, которые являются более эффективными, чем CUR813 (SEQ ID11). Также, согласно данному изобретению, конкретные олигонуклеотидыLNA индуцируют апоптоз и ингибируют пролиферацию. Также, олигонуклеотды LNA, имеющие последовательности, идентичные на 100% последовательности HIF-1a мыши, оказывают супрессирующий эффект на экспрессию HIF-1a в печени, кишечнике и почках мыши. Краткое изложение изобретения Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы модулирования экспрессии HIF-1a. В частности, данное изобретение относится к олигонуклеотидам LNA, нацеленным на 2 специфических мотива HIF-1a. Эти мотивы раскрыты как последовательности SEQ ID3 и 4. В частности, предпочтительными олигонуклеотидами LNA являются SEQ ID1 и SEQ ID2. Нуклеотиды LNA по данному изобретению являются эффективными ингибиторами экспрессии мРНК HIF-1 и уровней белка. Конкретнее, настоящее изобретение обеспечивает олигонуклеотид LNA, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из и где заглавными буквами обозначен аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, строчными буквами обозначен 2-дезоксинуклеотид, подчеркиванием обозначен либо аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, либо 2-дезоксинуклеотид, подстрочным индексом s обозначена фосфоротиоатная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA и подстрочным индексом х обозначена либо фосфоротиоатная связь, либо фосфодиэфирная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, и где нуклеотидные единицы в скобках (Tx), (Т) или (Gx), (А) соответственно, представляют собой необязательные единицы, и где последовательность при желании увеличена посредством добавления до пяти 2-дезоксинуклеотидных единиц. Также обеспечены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды LNA по данному изобретению. Дополнительно обеспечены способы модулирования экспрессии HIF-1a в клетках или тканях, включающие контактирование указанных клеток или тканей с одним или несколькими олигонуклеотидами LNA или композициями по данному изобретению. Также раскрыты способы лечения животного или человека, у которого подозревают наличие или предрасположенность к заболеванию или состоянию,связанному с экспрессией HIF-1a, посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких олигонуклеотидов LNA, или композиций по данному изобретению. Кроме того, обеспечены способы применения олигонуклеотидов LNA для ингибирования экспрессии HIF-1a и для лечения заболеваний, связанных с активностью HIF-1a.-1 014097 Краткое описание фигур На фиг. 1 А показана повышенная стабильность последовательности SEQ ID1 и SEQ ID5 в плазме крови крысы (самцы NtacSD, Li-гепарин (Taconic, MB, по сравнению с последовательностьюSEQ ID6. Олигонуклеотиды в концентрациях 20 мкМ инкубировали при 37 С в течение 0, 4, или 24 ч. Никаких фрагментов деградации последовательности SEQ ID1 не обнаружено даже после 24 ч расщепления. На фиг. 1 В показана стабильность полноразмерной последовательности SEQ ID1 и последовательности SEQ ID13, являющейся фосфоротиоатной и изопоследовательной последовательности SEQID1, в плазме крови крысы и человека. Олигонуклеотиды добавляли в плазму крови человека или крысы в конечной концентрации 20 мкМ. На данной фигуре представлена стабильность олигонуклеотидаLNA вплоть до 1-96 ч, в плазме крови человека и крысы, соответственно, при 37 С. Для плазмы крови крысы, на второй панели фиг. 1 В показана стабильная активность фермента даже после 48 и 96 ч. Вторая панель выполняет функцию отрицательного контроля и демонстрирует отсутствие деградации последовательностей SEQ ID1 и SEQ ID13 при инкубировании при 37 С без добавления плазмы крови. На фиг. 1 С представлена чрезвычайно длительная стабильность последовательности SEQ ID1 в плазме крови человека и крысы. Олигонуклеотид инкубировали в плазме крови человека или крысы в течение 1-96 ч и подвергали электрофорезу в денатурирующем геле. После окрашивания с помощьюSyBr gold определяли количество полноразмерного продукта с использованием фосфоримаджера, и изображали зависимость от времени. На фиг. 2 А показан супрессирующий эффект на белок HIF-1a в клетках U373, трансфицированных олигонуклеотидами LNA. Клетки U373 трансфицировали с использованием 2 или 10 нМ соединения или трансфицировали плацебо, инкубировали в условиях гипоксии и посредством вестерн-блоттинга проводили анализ супрессирующего эффекта на белок HIF-1a. В качестве контроля равной нагрузки анализировали экспрессию тубулина. На фиг. 2 В представлен супрессирующий эффект на белок HIF-1 альфа после обработки последовательностью SEQ ID1 в клеточных линиях глиобластомы U373. В качестве контроля равной нагрузки анализировали экспрессию пан-актина. Клетки трансфицировали 0,2, 1 и 10 нМ последовательности SEQID1, или последовательности SEQ ID10, которая на 2 п.о. отлична от SEQ ID1. На нижней панели представлена количественная оценка геля. На фиг. 2 С представлен супрессирующий эффект на экспрессию HIF-1a через 24 ч после обработки олигонуклеотидом LNA, нацеленным на HIF-1a, SEQ ID1, и LNA, содержащей смешанный контрольный олигонуклеотид SEQ ID8, в клетках U373. Экспрессию HIF сравнивали либо с GAPDH, либо с бета-актином и соответствующим нетрансфицированным контролем (плацебо). После очистки РНК, экспрессию мРНК количественно определяли посредством QPCR. На фиг. 3 А и 3 В показана индукция апоптоза, определенная как кинетический параметр индуцированной активности каспазы 3/7 после 24-72 ч обработки олигонуклеотидами LNA клеточной линии глиобластомы U373 в условиях с нормальным содержанием кислорода или гипоксии. Показано, что последовательность SEQ ID1 является эффективным индуктором раннего апоптоза. Фиг. 4 А: индукция ранней стадии апоптоза клеток, измеренная посредством анализа проточной цитометрии аннексии V-FITC и PI через 48 ч. Клетки U373, обработанные олигонуклеотидом LNA SEQ ID1, классифицировали как более ранние апоптотические по сравнению с клетками, обработанными плацебо и SEQ ID12. Фиг. 4 В: количественное определение индукции раннего апоптоза в клетках U373 после обработки последовательностью SEQ ID1. Процентное содержание клеток, вовлеченных в ранний апоптоз после 48 ч обработки последовательностью SEQ ID1 в различных дозах. Клетки U373 трансфицировали последовательностью SEQ ID1 или двумя различными смешанными контрольными олигонуклеотидами SEQ ID8 и SEQ ID12. После сбора и инкубирования с аннексином V ab и PI, количество клеток в раннем апоптозе определяли посредством метода проточной цитометрии. На фиг. 5 А и 5 В представлены соединения, которыми трансфицировали клеточные линии глиобластомы U373, через 24-72 часа после трансфекции и инкубирования либо в условиях гипоксии, либо в условиях нормоксии. Показано, что последовательность SEQ ID1 является эффективным ингибитором пролиферации, как определено в анализе MTS. На фиг. 6 А и 6 В показан эндогенный направленный супрессирующий эффект двух режимов введения последовательности SEQ ID1 в печени in vivo. Определение уровней мРНК HIF-1, а также даунстрим (находящейся в 5'-3' направлении) мишени, VEGF, показывает, что последовательность SEQ ID1 также является эффективным ингибитором указанной мишени. Фиг. 6 А: ежедневные внутрибрюшинные инъекции мышам hairy в течение 14 дней. Фиг. 6 В: внутрибрюшинные инъекции мышам hairy два раза в неделю в течение 14 дней. На фиг. 6 С представлен in vivo супрессирующий эффект на эндогенный HIF-1a почек после введения мышам hairy последовательности SEQ ID1 посредством ежедневных внутрибрюшинных инъекций в течение 14 дней. На фиг. 7 А показано, что последовательность SEQ ID1 является эффективным ингибитором, что-2 014097 определено по супрессирующему эффекту на экспрессию in vivo HIF-1a в печени, после введения последовательности SEQ ID1. Различные тиолированные варианты последовательности SEQ ID1 (SEQID5 и SEQ ID6) и последовательность SEQ ID1, соответственно, вводили мышам hairy в дозе 18 или 3,6 мг/кг ежедневно в течение 14 дней, затем животных умерщвляли. Экспрессию HIF-1a определяли по уровню мРНК посредством QPCR и нормализовали к бета-актину, как описано в ММ. На фиг. 7 В показано, что последовательность SEQ ID1 также является эффективным ингибитором, что определено по супрессирующему эффекту на экспрессию HIF-1a in vivo в печени, после введения последовательности SEQ ID1. Различные тиолированные варианты последовательности SEQ ID1 (SEQ ID5 и SEQ ID6) и последовательность SEQ ID1, соответственно, вводили мышамhairy в дозе 50, 10 или 2 мг/кг два раза в неделю в течение 14 дней, затем животных умерщвляли. Экспрессию HIF-1a определяли по уровню мРНК посредством QPCR и нормализовали к бета-актину. На фиг. 7 С представлен супрессирующий эффект на экспрессию HIF-1a in vivo в почках после введения последовательности SEQ ID1. Различные тиолированные варианты последовательности SEQ ID1 (SEQ ID5 и SEQ ID6) и последовательность SEQ ID1, соответственно, вводили мышамHIF-la определяли по уровню мРНК посредством QPCR и нормализовали к бета-актину. На фиг. 8 А показано превосходство эффективности in vivo при использовании последовательностиSEQ ID1 по сравнению с последовательностями SEQ ID11 и SEQ ID12 (смешанный контроль),определенное по массе опухолей U373 в ксенотрансплантате. Последовательности SEQ ID1, SEQ ID11 и SEQ ID12 вводили два раза в неделю в течение одной недели в дозе 50 мг/кг в ксенотрансплантат U373 мыши, имплантированный в яичники. Через 2 дня после введения последней дозы животных умерщвляли. При умерщвлении опухоли взвешивали, к индивидуальной опухолевой массе прибавляли среднюю опухолевую массу (красный), вычисляли и наносили на диаграмму. Статистически значимое различие (Р=0,005) обнаружено между контрольной группой (смешанный контроль SEQ ID12) и мышами, обработанными последовательностью SEQ ID1. На фиг. 8 В показана плотность сосудов в опухолях U373 в ксенотрансплантате, обработанном последовательностью SEQ ID1. Последовательность SEQ ID1 вводили в дозе 50 мг/кг два раза в неделю в течение одной недели в ксенотрансплантат U373 мыши, имплантированный в яичники. Через 2 дня после введения последней дозы животных умерщвляли. Плотность сосудов вычисляли после CD31 окрашивания и определяли соотношения с общей площадью. Статистически значимое различие(Р=0,005) обнаружено между группой, обработанной физиологическим раствором, и мышами, обработанными смешанным контролем (SEQ ID12). На фиг. 8 С показано CD31 окрашивание срезов опухолей U373, имплантированных в яичники и обработанных последовательностью SEQ ID1, как описано для фиг. 8 В. На фиг. 8D представлена экспрессия HIF-1, количественно определенная посредством ПЦР в режиме реального времени и нормализованная к GAPDH, в опухолях U373, имплантированных в яичники и обработанных последовательностями SEQ ID1, SEQ ID11, SEQ ID12 и PBS, как описано для фиг. 8 В. На фиг. 9 А показано поглощение in vivo (в мкг на грамм ткани) и направленный супрессирующий эффект (% ингибирования экспрессии мРНК HIF-1a, соотнесенный с экспрессией -актина) у мышейhairy после одного внутривенного введения последовательности SEQ ID1 в дозе 25 мг/кг. Время полужизни последовательности SEQ ID1 составляет приблизительно 46 ч в почках и 66 ч в печени. На верхней панели фиг. 9 В показано соединение по последовательности SEQ ID1, введеное мышам hairy в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Пять животных, обработанных последовательностью SEQID1 в дозировке 50 мг/кг, умерщвляли через 1, 3, 4, 5 и 8 дней после обработки, экспрессию HIF-1a анализировали и нормализовали к бета-актину. Экспрессию HIF-1a определяли по уровню мРНК посредством QPCR и нормализовали к бета-актину, как описано в примере 8. На нижней панели показано введение мышам hairy последовательности SEQ ID1 в дозах 25 или 50 мг/кг внутривенно, однократно. Пять животных, обработанных последовательностью SEQ ID1 в дозах 25 или 50 мг/кг, умерщвляли через 1, 2, 3, 4, 5 и 8 дней после обработки и проводили анализ полноразмерной последовательности SEQID1, используя способы ВЭЖХ, как описано в примере 13. Результаты представлены в мкг последовательности SEQ ID1/грамм ткани. На фиг. 9 С показана экспрессия HIF-1a, определенная количественно посредством ПЦР в режиме реального времени и приведенная к GAPDH, в печени мышей, получавших внутрибрюшинно однократную дозу 50 мг/кг последовательности SEQ ID1 и SEQ ID16 и умерщвленных на 1 и 10 день. На фиг. 10 А показана продолжительность ингибирующего действия последовательности SEQ ID1 на экспрессию HIF-1a у мышей с ксенотрансплантатом, получавших соединение в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней и умерщвленных через 1 или 5 дней после введения последней дозы. На фиг. 10 В показано поглощение fam-меченного варианта последовательности SEQ ID1 (SEQID7) in vivo в печени, кожной опухоли и почках, вводимого в дозе 25 мг/кг/день в течение семи дней,после чего животных умерщвляли через 5 дней после введения последней дозы.-3 014097 На фиг. 10 С показан направленный супрессирующий эффект (% ингибирования экспрессии мРНКHIF-1a, соотнесенный с экспрессией GAPDH) и in vivo поглощение (в мкг на грамм ткани) последовательности SEQ ID7 в печени мышей с ксенотрансплантатом, получавших 5 мг/кг/день последовательности SEQ ID7, смешанного контроля SEQ ID20 или физиологический раствор, внутрибрюшинно,на 7, 10, 13 и 17 день после трансплантации, как описано в примере 17. На фиг. 10D показан направленный супрессирующий эффект (% ингибирования экспрессии мРНКHIF-1a, соотнесенный с экспрессией -актина) после обработки последовательностью SEQ ID7 или смешанным контролем SEQ ID20 и in vivo поглощение (в мкг на грамм ткани) последовательностиSEQ ID7 в толстой кишке мышей, обработанных, как описано в примере 17. На фиг. 10 Е показано поглощение последовательности SEQ ID7 in vivo (в мкг на грамм ткани) в ксенотрансплантатах опухолей НТ 29 и РС 3, обработанных, как описано в примере 17. На фиг. 11 показан in vivo направленный эндогенный супрессирующий эффект на мРНК HIF-1a иVEGF в печени после введения каждый 3-ий день 5 доз по 30 мг/кг последовательности SEQ ID1, по сравнению с одним несовместимым контролем SEQ ID9. На фиг. 12 А, фиг. 12 В, фиг. 12 С и фиг. 12D показана экспрессия VEGFA и ММР-2 в клетках U373 после обработки нацеленным на HIF-la олигонуклеотидом LNA, последовательностью SEQ ID1, и смешанным контролем SEQ ID8. Дозозависимый супрессирующий эффект на экспрессию VEGFA и ММР-2 (секреция) в клетках U373 наблюдали через 48 ч после обработки последовательностью SEQ ID1 или смешанным контролем (SEQ ID8) . Экспрессия VEGFA (фиг. 12 А, 12 В и 12C) и ММР-2 (фиг. 12D и 12 Е) связана с количеством клеток и соотнесена с плацебо. На фиг. 12 А, 12C и 12D экспрессияVEGFA и ММР-2 измерена через 48 ч после обработки, тогда как на фиг. 12 В и 12 Е секреция VEGFA и ММР-2 количественно определена через 24-120 часов после трансфекции. На фиг. 13 показан супрессирующий эффект на белок HIF-1, определенный посредством вестернблоттинга, и нарушение образования трубок в клетках HUVEC, обработанных последовательностью SEQID1 в дозе 1 и 5 нМ по сравнению с последовательностью SEQ ID8 и необработанным контролем. На фиг. 14 А представлены радиолюминограммы всего тела, демонстрирующие распределение радиоактивности через 5 мин а), 4 ч b) , 24 ч с) и 18 дней d) после однократного внутривенного введения 3 Н-меченной последовательности SEQ ID1 у самок пигментированных мышей. На фиг. 14 В представлено распределение радиоактивности через 5 мин и 7 дней и показано, что очень сильное удержание 3 Н-меченной последовательности SEQ ID1 обнаружено через 7 дней в костном мозге, почках, печени, легких, коже, селезенке, моче, слизистой оболочке желудка, лимфатическом узле, сосудистой оболочке глаза и матке. На фиг. 15 представлено поглощение FAM-меченого варианта последовательности SEQ ID1(SEQ ID7) различными типами клеток в костном мозге, селезенке и периферической крови через 1 ч после введения последовательности SEQ ID7, по сравнению с необработанными клетками, измеренное с помощью анализа FACS. На фиг. 16 А показана экспрессия HIF-1, определенная посредством ПЦР в режиме реального времени и приведенная к 18S РНК, в печени и почках человекообразных обезьян, обработанных 40, 10 и 6 мг/кг последовательности SEQ ID 1 два раза в неделю в течение 4 недель. На фиг. 16 В показано поглощение последовательности SEQ ID1 в печени и почках человекообразных обезьян, через один день после введения последней дозы, или через 4 недели после введения последней дозы (выздоровевшие животные), обработанных, как описано выше, вместе с данными о выздоровевших животных (R),которых оставили без обработки в течение 4 недель после окончания лечения. Описание изобретения В данном изобретении используются специфические олигонуклеотиды LNA, а именно олигонуклеотиды LNA, содержащие последовательность SEQ ID3 и SEQ ID4, для модулирования функции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих HIF-1a. Модулирование в итоге представляет собой изменение количества выработанного HIF-1a. В одном варианте осуществления это достигается посредством обеспечения антисмысловых олигонуклеотидов LNA, которые специфически гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими HIF-1a. Данное модулирование предпочтительно представляет собой ингибирование экспрессии HIF-1a, что приводит к уменьшению количества вырабатываемых функциональных белков HIF-1a. Олигонуклеотиды LNA Конкретнее, настоящее изобретение обеспечивает олигонуклеотид LNA, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из и где заглавными буквами обозначен аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, строчными буквами обозначен 2-дезоксинуклеотид, подчеркиванием обозначен либо аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, либо 2-дезоксинуклеотид, подстрочным индексом s обозначена фосфоротиоатная связь между соседними-4 014097 нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, и подстрочным индексом х обозначена либо фосфоротиоатная связь, либо фосфодиэфирная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, и где нуклеотидные единицы в скобках (Тх), (Т) или (Gx), (А) соответственно представляют собой необязательные единицы, и где последовательность необязательно увеличена посредством добавления до пяти 2-дезоксинуклеотидных единиц. Термины олигонуклеотид LNA, определенный здесь, олигонуклеотид LNA по данному изобретению, и тому подобное, относятся к олигонуклеотиду LNA, определенному выше, а также к воплощениям, вариантам, пролекарствам и тому подобному, описанным ниже. Вышеопределенные олигонуклеотиды LNA, основанные на последовательностях SEQ ID3 иSEQ ID4, имеют длину 13-20 нуклеотидных единиц. Последовательность с минимальной длиной 13 нуклеотидов получают, если отсутствуют нуклеотидные единицы в скобках (Tx), (Т) или (Gx), (А) соответственно и последовательность с максимальной длиной в 20 нуклеотидов получают, если нуклеотидные единицы в скобках (Tx), (Т) или (Gx), (А) соответственно имеются в наличии, и если последовательность SEQ ID3 или SEQ ID4 увеличена на пять 2-дезоксинуклеотидных единиц. В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы в скобках (Tx), (Т) или (Gx), (А) соответственно отсутствуют и в другом в настоящее время более предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные единицы в скобках (Тх), (Т) или (Gx), (А) соответственно имеются в наличии. Также представляют интерес варианты осуществления, в которых имеется в наличии 5'-концевая необязательная единица (Tx) или (Gx) соответственно и в которых 3'-концевая необязательная единица (Т) или (А) соответственно отсутствует, и варианты осуществления, в которых отсутствует 5'-концевая необязательная единица (Tx) или (Gx) соответственно и в которых 3'-концевая необязательная единица (Т) или (А) соответственно имеется в наличии. По-видимому, выбор аналога нуклеотида бета-D-окси-LNA или 2-дезоксинуклеотида для подчеркнутых нуклеотидных единиц в вышеуказанных последовательностях SEQ ID3 и SEQ ID4, является менее критичным. Тем не менее, в одном варианте осуществления, обе подчеркнутые нуклеотидные единицы обозначают 2-дезоксинуклеотид. В другом в настоящее время более предпочтительном варианте осуществления одна или обе подчеркнутые нуклеотидные единицы обозначают аналог нуклеотида бетаD-окси-LNA. В одном варианте 5'-концевая нуклеотидная единица в скобках (Tx) или (Gx) соответственно отсутствует, и 3'-концевая другая подчеркнутая нуклеотидная единица (T) или (А) соответственно обозначает 2-дезоксинуклеотид или более предпочтительно аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA. В другом варианте 5'-концевая нуклеотидная единица в скобках (Tx) или (Gx) соответственно обозначает 2-дезоксинуклеотид или более предпочтительно аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, и 3'концевая другая подчеркнутая нуклеотидная единица (Т) или (А) соответственно отсутствует. В другом варианте нуклеотидные единицы в скобках присутствуют, и одна или обе подчеркнутые нуклеотидные единицы обозначают аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, то есть (i) 5'-концевой подчеркнутый нуклеотид обозначает аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA и 3'-концевая подчеркнутая нуклеотидная единица обозначает 2-дезоксинуклеотид, или (ii) 3'-концевой подчеркнутый нуклеотид обозначает аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA и 5'-концевая подчеркнутая нуклеотидная единица обозначает 2-дезоксинуклеотид, или (iii) 3'-концевой, а также 5'-концевой подчеркнутые нуклеотиды обозначают аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA. В еще одном варианте нуклеотидные единицы в скобках (Tx) или (Gx) соответственно имеются в наличии, и обе подчеркнутые нуклеотидные единицы обозначают 2-дезоксинуклеотид. Несмотря на то что последовательности, обозначаемые SEQ ID3 и SEQ ID4 (и конкретнее,последовательности, обозначаемые как SEQ ID1 и SEQ ID2 (см. далее ниже, как полагают, по существу, представляют полную совокупность определенных олигонуклеотидов LNA, удлинение последовательности SEQ ID3 и SEQ ID4, посредством добавления до пяти 2-дезоксинуклеотидных единиц, например 1 единицы, 2 единиц, 3 единиц, 4 единиц или даже 5 единиц, как полагают, возможно без отрицательных воздействий на полезные свойства базовых последовательностей, SEQ ID3 и SEQ ID4. При этом последовательность может быть удлинена с 3'-концевой области, 5'-концевой области или с 3'-концевой области, так же как с 5'-концевой области, при условии, что общее число 2 дезоксинуклеотидных единиц не превышает 5. Следовательно, в одном варианте осуществления (который может быть объединен с предшествующим) олигонуклеотид LNA состоит из 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных единиц, выбранных из 2 дезоксинуклеотидов и аналогов нуклеотида бета-D-окси-LNA, в частности олигонуклеотид LNA состоит из 16 нуклеотидных единиц, выбранных из 2-дезоксинуклеотидов и аналогов нуклеотида бета-D-оксиLNA. В других вариантах осуществления (который может быть объединен с предшествующим) олигонуклеотид LNA состоит из 13, 14, 15 или 16 нуклеотидных единиц, выбранных из 2-дезоксинуклеотидов и аналогов нуклеотида бета-D-окси-LNA, в частности олигонуклеотид LNA состоит из 14 или 15 нуклеотидных единиц, выбранных из 2-дезоксинуклеотидов и аналогов нуклеотида бета-D-окси-LNA. По меньшей мере для удобства получения олигонуклеотидов LNA зачастую предпочтительно, чтобы последовательность была удлиненана одну 2-дезоксинуклеотидную единицу с 3'-конца, сравни, на-5 014097 пример, последовательность SEQ ID1 и SEQ ID2, ниже. Наиболее предпочтительно последовательность SEQ ID3 удлинена посредством добавления аденозин 2-дезоксинуклеотидной единицы к 3'концу, а последовательность SEQ ID4 удлинена посредством добавления цитозин 2 дезоксинуклеотидной единицы к 3'-концу. Как указано выше, подстрочным индексом s обозначена фосфоротиоатная связь (-O-P(О,S)-O-) между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, и подстрочным индексом х обозначена либо фосфоротиоатная связь (-O-P(О,S)-O-), либо фосфодиэфирная связь (-O-Р(О)2-O-) между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA. Отсюда следует, что любые 2-дезоксинуклеотиды, с помощью которых удлиняют последовательность, могут быть связаны с помощью либо фосфоротиоатной связи (-O-P(О,S)-O-), либо с помощью фосфодиэфирной связи (-O-P(О)2-O-). Констатировали, что субпоследовательность csasasgscsastscscsT последовательности SEQ ID3 и субпоследовательность ascstsgscscststscsT последовательности SEQ ID4 являются полностью фосфоротиомированными, сравни подстрочный индекс s. Хотя в настоящее время и не является предпочтительным, считается, что одна, также возможно две, фосфоротиоатные связи могут быть заменены другими связями, в частности фосфодиэфирными связями, без серьезной угрозы стабильности олигонуклеотида LNA. Таким образом, такие варианты, в которых одна или две фосфоротиоатные связи заменены, например, фосфодиэфирными связями, также попадают в предполагаемый объем настоящего изобретения. В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления, тем не менее, все нуклеотидные единицы в данной последовательности соединяются посредством фосфоротиоатной группы. Одна подгруппа представляющих чрезвычайный интерес олигонуклеотидов LNA выбрана из группы, состоящей из и Среди них,в настоящее время наиболее предпочтительна. Другая подгруппа представляющих чрезвычайный интерес олигонуклеотидов LNA выбрана из группы, состоящей из и Среди них,в настоящее время наиболее предпочтительна. В данном контексте термин нуклеозид используется в его обычном значении, то есть он содержит единицу 2-дезоксирибозы или рибозы, которая связана через свой первый углеродный атом с одним из азотистых оснований аденин (А), цитозин (С), тимин (Т), урацил (U) или гуанин (G). Аналогичным образом, термин нуклеотид означает единицу 2-дезоксирибозы или рибозы, которая связана через свой первый углеродный атом с одним из азотистых оснований аденин (А), цитозин(С), тимин (Т), урацил (U) или гуанин (G) и которая связана через свой пятый углеродный атом с межнуклеозидной фосфатной группой, или с концевой группой. Термин нуклеиновая кислота обозначает молекулу, образованную посредством ковалентного связывания двух или более нуклеотидов. Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид используются здесь как взаимозаменяемые. Термин аналог нуклеиновой кислоты относится к неприродному связывающему нуклеиновую кислоту соединению. Термин мономер LNA обычно относится к бициклическому нуклеозидному аналогу, как описано в международной заявке на патент WO 99/14226 и последующих заявках, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 и WO 03/006475, все включены здесь посредством ссылки. Бета-D-окси-LNA представляет собой аналог нуклеотида LNA, используемый в олигонуклеотидахLNA по настоящему изобретению, и данная мономерная структура (нуклеозид) изображена на схеме 1.-6 014097 Схема 1. На схеме 1 Z и Z обозначают положение межнуклеотидной связи с соседним нуклеозидом или концевой группой (а именно, либо 5'-концевой группой, либо 3'-концевой группой). Одним конкретным примером мономера бета-D-окси-LNA является тимидин LNA мономер (нуклеозидный аналог LNA) (1S,3R,4R,7S)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-5-метил-3-(тимин-1 ил)-2,5-диоксабицикло[2:2:1]гептан, а именно Т-бета-D-окси-LNA. Термин олигнуклеотид означает, в контексте настоящего изобретения, олигомер (также называемый олиго) или полимер нуклеиновой кислоты (например, рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК или аналог нуклеиновой кислоты, известной в уровне техники,предпочтительн, замкнутую нуклеиновую кислоту LNA (Locked Nucleic Acid), или их смесь. Этот термин охватывает олигонуклеотиды, состоящие из природных нуклеиновых оснований, сахаров и межнуклеозидных связей (остов), а также олигонуклеотиды, имеющие участки искусственного происхождения,которые функционируют схожим образом, или имеют специфически улучшенные функции. Полностью или частично модифицированные или замещенные олигонуклеотиды зачастую более предпочтительны чем нативные формы из-за некоторых желательных свойств таких олигонуклеотидов, как, например, способность проникать через клеточную мембрану, хорошая устойчивость к действию вне- и внутриклеточных нуклеаз, высокая аффинность и специфичность к целевой нуклеиновой кислоте (мишени). Олигонуклеотиды LNA по данному изобретению проявляют вышеуказанные свойства. Под терминами единица и нуклеотидная единица понимают мономер, а именно 2 дезоксинуклеотид или аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA. Термин по меньшей мере один охватывает целые числа, больше или равные 1, а именно 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 и так далее. Форма единственного числа, употребляемая в отношении нуклеозида, аналога нуклеозида, последовательности SEQ IDи тому подобного, предназначена для определения одного или нескольких. В частности, выражение компонент (например, нуклеозид, аналог нуклеозида, последовательность SEQIDили тому подобное), выбранный из группы, состоящей из означает, что могут быть выбраны один или несколько из упомянутых компонентов. Таким образом, выражение компонент, выбранный из группы, состоящей из А, В и С предназначено включать все комбинации А, В и С, а именно А, В, С,А+В, А+С, В+С и А+В+С. По всему тексту данного описания словосочетание включать, или такие варианты как включает, включающий означает вовлечение заявленного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключает любой другой элемент, целое число или стадию,или группу элементов, целых чисел или стадий. Получение олигонуклеотидов LNA Структурные единицы аналога данного нуклеотида LNA (-D-окси-LNA) могут быть получены на основании следующих опубликованных процедур и ссылок, приведенных там, смотри, например, WO 03/095467 A1; D.S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoraraidites, Synthesis 6, 802-808; и WO 2004/069991 A2. Олигонуклеотиды LNA могут быть получены, как описано в Примерах данной заявки и в публикациях WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 и WO 03/006475. Таким образом, олигонуклеотиды LNA могут быть получены с использованием технологий олигомеризации химии нуклеиновых кислот, хорошо известных специалисту в области органической химии. Как правило, применяют стандартные циклы олигомеризации фосфорамидитного метода (S.L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223), но также можно использовать, например, химию Н-фосфонатов и химию фосфотриэфиров. Для некоторых мономеров может быть необходимо или благотворно более длительное время связывания, и/или повторяющееся связывание, и/или использование более концентрированных связующих реагентов. Используемые фосфорамидиты обычно связывают с удовлетворительным ступенчатым выходом продукта 95%. Окисление фосфора (III) до фосфора (V) обычно осуществляют, например, с использованием йода/пиридина/H2O. После снятия защитных групп это приводит к образованию чистой фосфодиэфирной межнуклеозидной связи. В случае, когда получена фосфоротиоатная межнуклеозидная связь,проводят стадию тиолирования посредством замены нормального, например йод/пиридин/Н 2 О, окисления, используемого при синтезе фосфородиэфирных межнуклеозидных связей, на окисление с использованием реагента ADTT (гидрид ксантана (0,01 М в ацетонитрил:пиридин 9:1, об/об. Также возможно применение других реагентов для тиолирования, например Beaucage и PADS. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды LNA были эффективно синтезированы с постадийным выходом образования пар =98%. Очистка олигонуклеотидов LNA может быть осуществлена с использованием одноразовых картриджей для очистки с обратной фазой, и/или обратнофазовой ВЭЖХ, и/или осаждения из этанола или бутанола. Для подтверждения чистоты синтезированных олигонуклеотидов LNA использовали капиллярный гель-электрофорез, обратнофазовую ВЭЖХ, масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и де-7 014097 сорбцией из матрицы (MALDI-MS) и тандемную масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением(ESI-MS). Соли Олигонуклеотид LNA может быть использован в целом ряде фармацевтически приемлемых солей. Как используется здесь, данный термин означает соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность олигонуклеотида LNA и проявляют минимальные нежелательные токсические эффекты. Неограничивающие примеры таких солей могут быть образованы с органическими аминокислотами и основными аддитивными солями, образованными с катионами металлов, таких как цинк, кальций, висмут,барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий, натрий, калий и тому подобное, или с катионами, образованными из аммиака, N,N-дибензилэтилен-диамина, D-глюкозамина, тетраэтиламмония или этилендиамина; или комбинации, например таннат цинковой соли или что-либо подобное. Такие соли образованы из олигонуклеотида LNA, в котором есть фосфодиэфирная группа и/или фосфоротиоатная группы, и представляют собой, например, соли с подходящими основаниями. Эти соли включают, например, нетоксические соли металлов, которые образованы с металлами групп Ia, Ib, IIa иIIb периодической системы элементов, в частности подходящие соли щелочных металлов, например,соли лития, натрия или калия, или соли щелочноземельных металлов, например, соли магния или кальция. Кроме того, они включают соли цинка и аммония, а также соли, которые образованы с подходящими органическими аминами, такими как незамещенные или гидроксил-замещенные моно-, ди- или триалкиламины, в частности моно-, ди- или триалкиламины, или с четвертичными соединениями аммония,например, с N-метил-N-этиламином, диэтиламином, триэтиламином, моно-, бис- или трис-(2-гидроксинизший алкил)аминами, как, например, моно-, бис- или трис- (2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-третбутиламин или трис(гидроксиметил)метиламин, N,N-ди-низший алкил-N-(гидрокси-низший алкил)амины, как, например N,N-диметил-N-(2- гидроксиэтил)-амин или три-(2-гидроксиэтил)амин, или N-метилD-глюкамин, или четвертичные соединения аммония, например соли тетрабутиламмония. Предпочтительными являются соли лития, соли натрия, соли магния, соли цинка или соли калия, особенно предпочтительны соли натрия. Пролекарства В одном варианте олигонуклеотид LNA может быть в форме пролекарства. Олигонуклеотиды существуют благодаря отрицательно зараженным ионам. Вследствие липофильной природы клеточных мембран клеточное поглощение олигонуклеотидов снижено по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами. Этого препятствия полярности можно избежать, используя принцип пролекарства (см., например, Crooke, R.M. (1998) in Crooke, S.T. Antisense research and Application. SpringerVerlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140). В этом способе олигонуклеотиды LNA получены в защищенной манере, таким образом, что олигонуклеотиды LNA остаются нейтральными, при их введении. Эти защитные группы сконструированы таким образом, что они могут быть удалены после того, как олигонуклеотид LNA поглощен клеткой. Примерами таких защитных групп являются S-ацетилтиоэтил(SATE) или S-пивалоилтиоэтил (t-бутил-SATE). Эти защитные группы являются устойчивыми к нуклеазам и внутриклеточно селективно удаляются. Конъюгаты Еще один аспект данного изобретения относится к конъюгату, содержащему олигонуклеотид LNA,определенный здесь, и по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную молекулу, ковалентно связанную с указанным олигонуклеотидом LNA. В связанном аспекте данного изобретения, олигонуклеотид LNA по данному изобретению связан с лигандами с тем, чтобы образовать конъюгат, указанные лиганды предназначены для повышения клеточного поглощения конъюгата относительно антисмысловых олигонуклеотидов. В данном контексте термин конъюгат предназначен для обозначения гетерогенной молекулы, образованной посредством ковалентного связывания описанного здесь олигонуклеотида LNA (например,олигонуклеотида LNA, содержащего последовательность нуклеозидов и аналогов нуклеозидов LNA) с одной или несколькими ненуклеотидными или неполинуклеотидными молекулами. Таким образом, олигонуклеотиды LNA могут, например, быть конъюгированы или образовывать химеры с ненуклеотидными или неполинуклеотидными молекулами, в том числе Пептидными Нуклеиновыми Кислотами (ПНК), белками (например, антитела к белку-мишени), макромолекулами, низкомолекулярными лекарственными веществами, цепями жирных кислот, остатками сахаров, гликопротеидами, полимерами (например, полиэтиленгликоль), мицелеобразующими группами, антителами, углеводородами, рецепторсвязывающими группами, стероидами, такими как холестерин, полипептидами, интеркалирующими агентами, такими как производное акридина, длинноцепочечным спиртом, дендримером,фосфолипидом и другими липофильными группами или их комбинациями, и тому подобное, точно также олигонуклеотиды LNA могут быть расположены в димерных или дендритных структурах. Олигонуклеотиды LNA или конъюгаты по данному изобретению также могут быть конъюгированы или дополнительно конъюгированы с действующими лекарственными веществами, например аспирином, ибупрофеном, серосодержащим лекарственным средством, противодиабетическим, антибактериальным агентом,химиотерапевтическим агентом или антибиотиком.-8 014097 Конъюгирование подобным образом может придавать полезные свойства в отношении фармакокинетических характеристик олигонуклеотидов LNA. В частности, конъюгированием таким способом можно достичь увеличенного клеточного поглощения. В одном варианте осуществления олигонуклеотид LNA связан с лигандами таким образом, чтобы образовать конъюгат, где указанные лиганды предназначены для повышения клеточного поглощения конъюгата по сравнению с антисмысловыми олигонуклеотидами LNA. Это конъюгирование может происходить в 5'/3'-ОН конечном положении, но лиганды также могут находиться в сахарах и/или основаниях. В частности, фактор роста, с которым может быть конъюгирован антисмысловой олигонуклеотидLNA, может содержать трансферрин или фолат. Трансферрин-полилизин-олигонуклеотидные комплексы или фолат-полилизин-олигонуклеотидные комплексы могут быть получены для поглощения клетками,которые экспрессируют высокие уровни трансферринового или фолатного рецептора. Другими примерами конъюгатов/лигандов являются молекулы холестерина, дуплексные интеркаляторы, такие как акридин, поли-L-лизин, с блокировкой концевых групп одной или несколькими устойчивыми к нуклеазам группами сцепления, такой как фосфоромонотиоат и тому подобное. Получение трансферриновых комплексов в качестве переносчиков олигонуклеотидов внутрь клеток описано у Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Клеточная доставка фолатмакромолекулярных конъюгатов посредством эндоцитоза с участием фолатного рецептора, в том числе доставка антисмыслового олигонуклеотида, описана у Low et al., в патенте США 5108921. Также см.,Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991). Фармацевтическая композиция В чрезвычайно интересном аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей определенный здесь олигонуклеотид LNA, или определенный здесь конъюгат, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант. Фармацевтическая композиция предпочтительно подходит для инъекции, для местного применения или для внутриглазного введения (см. далее ниже). Инструкции по приготовлению фармацевтических композиций можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro и в дальнейшем. Фармацевтически приемлемые разбавители, носители или адъюванты являются частью фармацевтической композиции. Капсулы, таблетки и пилюли и тому подобное могут содержать, например, следующие соединения: микрокристаллическую целлюлозу, камедь или желатин в качестве связывающих веществ; крахмал или лактозу в качестве инертных наполнителей; стеараты в качестве скользящих веществ; различные подслащивающие или ароматизирующие вещества. Для капсул лекарственная форма может содержать жидкий носитель, подобный жирным маслам. Схожим образом слои сахара или агенты,распадающиеся в кишечнике, могут быть частью лекарственной формы. Фармацевтическая композиция также быть эмульсией действующих фармацевтических ингредиентов (в том числе, олигонуклеотидLNA) и липида, образующего мицеллярную эмульсию. Олигонуклеотид LNA может быть смешан с любым веществом, которое не ослабляет желаемое действие, или с веществом, которое расширяет желаемое действие. Эти вещества могут включать другие лекарственные средства, в том числе другие соединения олигонуклеотидов. Композиция для парентерального, подкожного, внутрикожного или местного введения может включать стерильный разбавитель (например, воду), буфер(ы), регуляторы тоничности и ионной силы и антибактериальные агенты. Действующий олигонуклеотид LNA может быть приготовлен с носителями,которые облегчают поглощение, защищают от расщепления или защищают от немедленного выведения из организма, в том числе с имплантами или микрокапсулами, обладающими свойствами контролируемого высвобождения. Для внутривенного введения предпочтительными носителями являются физиологический раствор (0,9%) или забуференный физиологический раствор (например, физиологический раствор с фосфатным буфером). В предпочтительном варианте осуществления инъекции или инфузии олигонуклеотидов LNA проводят в или около участка образования новых сосудов. Например, олигонуклеотиды LNA по данному изобретению могут быть доставлены в ретинально-пигментные эпителиальные клетки глаза. Предпочтительно олигонуклеотиды LNA вводят местно в глаз, например, в жидкой форме или в форме геля на нижнее веко глаза или в свод конъюнктивы, как известно специалисту в данной области (см., например,Acheampong AA et al., 2002, Drug Metabol. and Disposition 30: 421-429, полное описание которого приведено здесь в качестве ссылки). Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены разными способами, в зависимости от того, какое лечение необходимо - местное или системное, и от области, подвергающейся лечению. Введение может быть (а) пероральным, (b) легочным, например посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе посредством небулайзера; интратрахеальным, интраназальным, (с) местным, в том числе эпидермальным, трансдермальным, глазным и в мембраны слизистой оболочки, в том числе вагинальная или ректальная доставка; или (d) парентеральным, в том числе внутривенная, внутриартериальная, подкожная, внутрибрюшинная или внутримышечная инъекция или инфузия; или внутричерепным, например подоболочечное или внутрижелудочковое введение.-9 014097 В одном варианте осуществления активный олигонуклеотид LNA вводится внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, местно или в виде болюсного вливания, или вводится непосредственно в органмишень. В настоящее время считается, что наиболее подходящим способом введения являются внутривенные инфузии или пероральное введение. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи, суппозитории, жидкости или порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и тому подобное, могут быть необходимы или желательны. Также можно использовать презервативы с покрытием,перчатки и тому подобное. Предпочтительные композиции для местного введения включают те, в которых к олигонуклеотидам по данному изобретению подмешан агент для местной доставки, как, например,липиды, липосомы, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Композиции и составы для перорального применения включают, но не ограничиваются, порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Композиции и составы для парентерального, подоболочечного или внутрижелудочкового введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители или другие подходящие вспомогательные вещества, такие как, но, не ограничиваясь, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или инертные наполнители. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются, растворы, эмульсии и составы, содержащие липосомы. Эти композиции могут быть составлены из различных компонентов, которые включают, но не ограничиваются, преформированные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые частицы и самоэмульгирующиеся полутвердые частицы. Доставка лекарственного средства в ткань опухоли может быть усилена посредством доставки, опосредованной носителями,включающими, но, не ограничиваясь, катионные липосомы, циклодекстрины, производные порфирина,дендримеры с разветвленными цепями, полимеры полиэтилениминов, наночастицы и микросферы (DassCR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). Чрезвычайно предпочтительным парентеральным путем введения является внутриглазное введение. Понятно, что внутриглазное введение настоящих олигонуклеотидов LNA может быть выполнено посредством инъекции или прямого (например, местного) введения в глаз, до тех пор, пока данный путь введения позволяет проникнуть олигонуклеотидам LNA в глаз. В дополнение к местному способу введения в глаз, описанному выше, подходящие внутриглазные пути введения включают интравитреальный, интраретинальный, субретинальный, субтеноновый, пери- и ретроорбитальный, трансроговичный и транссклеральный путь введения. Для внутриглазного введения фармацевтическая композиция может быть введена местно, например, с помощью пластыря или прямым введением в глаз, или посредством ионтофореза. Мази, спреи или предназначенные для закапывания жидкости могут быть доставлены посредством офтальмологических систем доставки, известных в данной области, например с помощью аппликаторов, или глазных пипеток. Композиции можно вводить непосредственно на поверхность глаза или на внутреннюю поверхность века. Такие композиции могут включать мукомиметики, такие как гиалуроновая кислота, хондроитин сульфат, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливиниловый спирт, консерванты, такие как сорбиновая кислота, ЭДТА или хлорид бензилхрома, и обычные количества разбавителей и/или носителей. Олигонуклеотид LNA по данному изобретению могут входить в состав композиций с замедленным высвобождением, как те, которые описаны, например, в патентах США 5672659 и 5595760. Применение композиций немедленного или замедленного высвобождения зависит от природы состояния, в отношении которого проводится лечение. Если состояние относится к острому или сверхострому заболеванию, лечение с использованием формы немедленного высвобождения предпочтительнее композиции с замедленным действием. Альтернативно, для некоторых профилактических или длительных лечебных схем подходящим может быть применение композиции замедленного высвобождения. Олигонуклеотид LNA может быть введен посредством инъекции внутрь глаза, например, с помощью иглы или другого средства доставки. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат олигонуклеотид LNA по данному изобретению (например, от 0,1 до 90% по весу), или его физиологически приемлемую соль,смешанную с физиологически приемлемой средой-носителем. Предпочтительными физиологически приемлемыми средами-носителями являются вода, буферная вода, нормальный физиологический раствор,0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин, гиалуроновая кислота и тому подобное. Фармацевтические композиции по данному изобретению также могут содержать стандартные фармацевтические инертные наполнители и/или вспомогательные вещества. Подходящие фармацевтические инертные наполнители включают стабилизаторы, антиоксиданты, агенты, регулирующие осмоляльность,буферы и агенты, регулирующие рН. Подходящие вспомогательные вещества включают физиологически биосовместимые буферы (например, трометамин гидрохлорид), добавки хелантов (такие как, например,DTPA или DTPA-бисамид) или хелатные комплексы кальция (как, например, кальций DTPA, CaNaD- 10014097TPA-бисамид), или, при желании, добавки солей кальция или натрия (например, хлорид кальция, аскорбат кальция, глюконат кальция или лактат кальция). Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть расфасованы для применения в жидкой форме или могут быть лиофилизированными. Для твердых композиций можно использовать стандартные нетоксические твердые носители; например фармацевтические категории маннитола, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия,талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, карбоната магния и тому подобное. Предпочтительно олигонуклеотид LNA входит в состав дозированной композиции, а именно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества, не вызывая серьезных побочных эффектов у пациента, получающего данное лечение. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые могут быть представлены в стандартных лекарственных формах, могут быть получены согласно обычным технологическим приемам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие технологические приемы включают этап соединения действующих ингредиентов с фармацевтическим носителем (носителями) или инертным наполнителем (наполнителями). Обычно композиции получают посредством равномерного и непосредственного соединения действующих ингредиентов с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями, или и тем, и другим, и затем, при необходимости, придания формы продукту. Композициям по данному изобретению можно придать любую из множества возможных лекарственных форм, как, например, но, не ограничиваясь этим, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели и суппозитории. Композиции по настоящему изобретению также могут находиться в форме суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость данной суспензии, в том числе, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и/или декстран. В суспензии также могут содержаться стабилизаторы. В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтических композиций олигонуклеотидLNA приготовлен в водном носителе, в частности в водном носителе, содержащем буфер для поддержания значения рН в диапазоне 4,0-8,5 и имеющем ионную силу 20-2000 мМ. Термин водный носитель означает, что фармацевтическая композиция, о которой идет речь,представляет собой жидкую форму, и что жидкий носитель главным образом состоит из воды, то есть по меньшей мере на 80% (мас./мас.), или по меньшей мере на 90% (мас./мас.), даже по меньшей мере на 95% (мас./мас.) данный носитель состоит из воды. Также можно использовать другие жидкие ингредиенты, например этиловый спирт, DMSO, этиленгликоль и тому подобное. Водный носитель предпочтительно содержит физиологический раствор или буфер для поддержания значения рН в диапазоне 4,0-8,5. Предпочтительно буфер будет поддерживать значение рН в диапазоне 5,0-8,0, например, в диапазоне 6,0-7,5, как, например, забуференный физиологический раствор, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Ионная сила/тоничность фармацевтической композиции также является важной. Таким образом,обычно, жидкая композиция имеет ионную силу в пределах 20-2000 мМ, как, например, в пределах 501500 мМ, или в пределах 100-1000 мМ. Комбинированные лекарственные средства Должно быть понятно, что фармацевтическая композиция согласно данному изобретению необязательно содержит дополнительные антисмысловые соединения, химиотерапевтические агенты, противовоспалительные соединения, противовирусные соединения, цитостатические соединения, антиангиогенные соединения, антипролиферативные соединения, проапоптотические соединения, модуляторы сигнальной трансдукции, ингибиторы киназы и/или иммуномодулирующие соединения. В настоящее время считается, что чрезвычайно интересными являются комбинации олигонуклеотида LNA по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом. Как указано, фармацевтическая композиция по данному изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один химиотерапевтический агент. Химиотерапевтический агент, обычно, выбран из группы, содержащей адренокортикостероиды, например преднизон, дексаметазон или декадрон; альтретамин (гексален, гексаметилмеламин (НММ; амифостин (этиол); аминоглютетимид (цитадрен); амсакрин (M-AMSA); анастрозол (аримидекс); андрогены, например тестостерон; аспарогиназу (элспар); авастин; бациллу Кальмете-Герена; бикалутамид (касодекс); бифосфанат; блеомицин (бленоксан); бортезомиб; бусульфан (милеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамибуцил (леукеран); хлородезоксиаденозин (2-CDA, кладрибин, леустатин); цисплатин (платинол); циклофосфамид; цитозинарабинозид (цитарабин); дакарбазин (DTIC); дактиномицин (актиномицин-D, космеген); даунорубицин (церубидин); доцетаксель (таксотер); доксорубицин (адриомицин); эпирубицин; эстрамустин(сандостатин); пентостатин (2-дезоксикоформицин, нипент); пликамицин (митрамицин, митрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифин (нолвадекс); таксол (паклитаксел); тенипозид (вумон,VM-26); талидомид; тиотепа; топотекан (гикамтин); третиноин (весаноид, полностью транс-ретиноевая кислота); винбластин (валбан); винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин). Для лечения множественной миеломы, предпочтительными являются такие химиотерапевтические агенты, как мелфалан, циклофосфамид, преднизон, винкристин, доксорубицин, кармустин, дексаметазон,талидомид, бортезомиб и бифосфанат. Для лечения карциномы почек предпочтительными являются такие химиотерапевтические агенты,как гемцитабин, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин, паклитаксел, карбоплатин, ифосфамид,доксорубицин, винбластин, IFN-альфа, и IL-2. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим (а) один или несколько олигонуклеотидов LNA и (b) один или несколько других химиотерапевтических соединений, чей механизм действия не является антисмысловым. При применении с олигонуклеотидами LNA такие химиотерапевтические соединения можно использовать индивидуально(например, митрамицин и олигонуклеотид), последовательно (например, на протяжении какого-то периода времени митрамицин и олигонуклеотид, а затем другой агент и олигонуклеотид), или в комбинации с одним или несколькими другими химиотерапевтическими соединениями или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические соединения, известные в уровне техники, в том числе упомянутые выше, включены здесь в качестве комбинированного лечения с олигонуклеотидом в соответствии с данным изобретением. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция вводится в комбинации с соединением таксана. Термин соединение таксана включает паклитаксел (Taxol), производные паклитаксела, доцетаксел, таксотер, модифицированные таксаны, и аналоги таксоидов. Паклитаксел (Taxol) представляет собой дитерпен, выделенный из коры тиса коротколистного (тиса тихоокеанского), Taxus brevifolia и является представителем класса терапевтических агентов, имеющих в своей структуре таксановое кольцо. Паклитаксел и его аналоги получают в результате частичного синтеза из 10-деацетилбаккатина III,предшественника, полученного из иголок и веточек тиса, и в результате полного синтеза. Смотри Holton,et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 1597-1601 (1994) и Nicolaou, et al., Nature 367:630 (1994). В клинических испытаниях паклитаксел проявил эффективность в отношении нескольких опухолей человека. Смотри(1993). Модифицированный таксан или аналоги таксоидов представляют собой такие соединения, которые имеют таксановое кольцо, несущее модифицированные боковые цепи. Многие из этих аналогов имеют улучшенные свойства, как например, большая растворимость в воде и стабильность по сравнению с этими свойствами природного таксана. Эти аналоги известны специалисту в уровне техники и раскрыты, например, в патентах США 5278324; 5272171; 5254580; 5250683; 5248796 и 5227400, описания которых включены здесь посредством ссылки. Паклитаксел и таксотер можно получить с использованием способов, описанных в публикациях WO 93/18210, ЕР 0 253 739, ЕР 0 253 739 и WO 92/09589, описания которых включены здесь посредством ссылки. В конкретных вариантах осуществления соединение таксана представляет собой паклитаксел или таксотер. Весовое соотношение между соединением (соединениями) таксана и олигонуклеотидом LNA в указанной композиции обычно находится в диапазоне от 50:1 до 1:25, например в диапазоне от 25:1 до 1:25,или в диапазоне от 10:1 до 1:25, или в диапазоне от 1:1 до 1:25, или в диапазоне от 50:1 до 1:10, или в диапазоне от 1:1 до 1:50, или в диапазоне от 25:1 до 1:10. В еще одном варианте осуществления фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать один или несколько олигонуклеотидов LNA и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Два или более комбинированных соединений можно использовать вместе или последовательно. Противовоспалительные лекарственные средства, в том числе, но не ограниченно, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, противовирусные лекарственные средства и иммуномодулирующие лекарственные средства, также можно сочетать с композицией по данному изобретению. Два или более комбинированных соединений можно использовать вместе или последовательно. Кроме того, фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды LNA, можно использовать в сочетании с лучевой терапией и тому подобным. Медицинское лечение Олигонуклеотиды LNA по данному изобретению используются для многих терапевтических применений, как указано здесь. В большинстве случаев, терапевтические способы по данному изобретению- 12014097 включают введение терапевтически эффективного количества модифицированного олигонуклеотидаLNA млекопитающему, в частности человеку. Таким образом, настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду LNA, как определено здесь, или к конъюгату, как определено здесь, для использования в качестве лекарственного средства. Дозирование зависит от тяжести и реактивности болезненного состояния, в отношении которого проводится лечение, и курс лечения длится от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор,пока лечение эффективно, или достигается уменьшение проявлений болезненного состояния. Оптимальная схема дозирования также может быть определена посредством определения уровня лекарственного средства в организме больного или с помощью маркеров-имитаторов. Оптимальные дозировки могут изменяться в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов. Обычно, ее можно определить исходя из ЕС 50, которая определена как эффективная в экспериментальных моделях на животных in vitro и in vivo. Обычно, дозировка составляет от 0,01 мкг до 1 г на кг массы тела и может вводиться один или несколько раз ежедневно, еженедельно,ежемесячно или каждый год, или даже один раз каждые 2-10 лет или посредством продолжительной инфузии в течение часов и до нескольких месяцев. Частоты повторений введения лекарственного средства дозами могут быть определены исходя их измеренного времени пребывания и концентраций данного лекарственного средства в жидкостях организма или тканях. После успешного лечения может быть желательно назначение пациенту поддерживающей терапии для предотвращения рецидива заболевания. В настоящее время считается, что наиболее релевантными являются дозы от 0,01 мг до 100 мг, например от 0,1 мг до 40 мг, или от 0,5 мг до 10 мг, на кг массы тела. Такие дозы могут быть введены один раз ежедневно, но более предпочтительны менее частые, например 1-3 раза в неделю в течение 1-4 недель. Поддерживающая терапия может быть длительной, например 1-4 раза в месяц или даже менее часто, например 1-10 раз в год. Специалисту в данной области будет понятно, что нуклеотиды LNA можно использовать для противодействия заболеваниям, связанным с HIF-1a, посредством множества различных принципов, что,таким образом, соответствует идее настоящего изобретения. Как используется здесь, термин нуклеиновая кислота-мишень означает ДНК, кодирующую HIF1a, РНК (в том числе пре-мРНК и мРНК), которая транскрибируется с такой ДНК, и также кДНК, полученная с такой РНК. Как используется здесь, термин ген означает ген, включая экзоны, интроны, некодирующие 5' и 3' области и регуляторные элементы и все известные в настоящее время их варианты, и любые дополнительные варианты, которые могут быть выявлены. Как используется здесь, термин олигонуклеотид LNA означает олигонуклеотид, который может индуцировать необходимый терапевтический эффект у человека вследствие, например, прямого связывания водородной связью либо с геном-мишенью - Chimeraplast и TFO, с транскриптом (транскриптами) РНК гена-мишени - антисмысловые ингибиторы, siRNA, miRNA, рибозимы и олигозимы, или белком (белками), кодируемым геном-мишенью - aptamer, spiegelmer или decoy. Как используется здесь, термин мРНК означает известный в настоящее время транскрипт(ы) РНК гена-мишени и любые дополнительные транскрипты, которые могут быть выявлены. Как используется здесь, термин модулирование означает либо повышение (стимулирование), либо понижение (ингибирование) экспрессии гена. В настоящем изобретении ингибирование является предпочтительной формой модулирования экспрессии гена и мРНК является предпочтительной мишенью. Как используется здесь, термин нацеливание антисмыслового соединения на конкретную нуклеиновую кислоту-мишень означает доставку антисмыслового олигонуклеотида в клетку, животное или человека, таким способом, что антисмысловое соединение будет способно связываться с и модулировать функцию своей намеченной мишени. Данные олигонуклеотиды LNA могут быть сконструированы как siRNA, которые являются небольшими двухцепочечными молекулами РНК, которые используются клетками для выключения специфических эндогенных или экзогенных генов посредством пока еще плохо понятного механизма, подобного антисмысловому. Клиническая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов зависит от значимого диапазона их фармакокинетики, например всасывания, распределения, клеточного поглощения, метаболизма и экскреции. В свою очередь, эти параметры значительно управляемы посредством лежащей в основе химии и размера и трехмерной структуры нуклеотида. Модулирование фармакокинетических характеристик олигонуклеотида LNA по данному изобретению дополнительно может быть достигнуто вследствие присоединения множества различных молекул. Например, способность олигонуклеотидов проходить через клеточную мембрану может быть усилена посредством присоединения, например, таких липидных молекул, как молекулы холестерина, тиоэфира,алифатической цепи, фосфолипида или полиамина к данному олигонуклеотиду. Схожим образом, поглощение клетками олигонуклеотидов LNA может быть усилено посредством конъюгирования молекул с олигонуклеотидом, который взаимодействует с молекулами на мембране, что опосредует перенос в- 13014097 цитоплазму. Фармакодинамические свойства могут согласно данному изобретению быть усилены с помощью групп, которые повышают поглощение олигонуклеотида LNA, усиливают биостабильность, например усиливают устойчивость олигонуклеотида LNA к расщеплению, и/или увеличивает специфичность и аффинность характеристик гибридизации олигонуклеотидов с последовательностью-мишенью, например с последовательностью мРНК. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть использована при лечении множества различных заболеваний. Подобно пролиферирующим раковым клеткам, клетки эндотелия сосудов являются чувствительными к супрессирующему эффекту на экспрессию HIF-1a. Фармацевтическую композицию по данному изобретению, таким образом, можно использовать при лечении заболеваний, характеризующихся патологическим ангиогенезом, являющимся причиной развития заболевания. Примерами таких заболеваний являются злокачественные опухоли в целом и атеросклероз, псориаз, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна, ревматоидный артрит, астма, воспалительная болезнь кишечника, бородавки, аллергический дерматит и саркома Капоши. В общем виде один аспект данного изобретения относится к способу лечения млекопитающего,страдающего от или имеющего предрасположенность к заболеванию, развивающемуся в результате патологического ангиогенеза, включающему введение в организм млекопитающего терапевтически эффективного количества олигонуклеотида LNA или конъюгата, как определено здесь. Кроме того, данное изобретение также относится к способу ингибирования ангиогенеза, включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь. Один интересный аспект данного изобретения относится к применению олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания, выбранного из атеросклероза, псориаза, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, ревматоидного артрита, астмы, воспалительного заболевания кишечника, бородавок, аллергического дерматита, воспаления и кожного воспаления или других заболеваний, относящихся к коже. Фармацевтическую композицию по данному изобретению также можно использовать при лечении воспалительного заболевания, воспалений, таких как кожное воспаление или других кожных заболеваний или нарушений, например псориаза и ревматоидного артрита. Подобным образом, другой интересный аспект данного изобретения относится к способу лечения заболевания, выбранного из группы, содержащей атеросклероз, псориаз, диабетическую ретинопатию,ревматоидный артрит, астму, воспалительное заболевание кишечника, бородавки, аллергический дерматит, воспаление, и кожное воспаление, где указанный способ содержит введение олигонуклеотида LNA,как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь, в организм пациента, нуждающегося в таком лечении. Чрезвычайный интерес представляют ангиогенные заболевания, в том числе диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна, псориаз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и другие воспалительные заболевания. Эти заболевания характеризуются разрушением нормальной ткани вновь образованными кровеносными сосудами в области образования новых сосудов. Например,при дегенерации желтого пятна поражается и разрушается капиллярами сосудистая оболочка глаза. Побуждаемое ангиогенезом разрушение сосудистой оболочки глаза при дегенерации желтого пятна приводит к частичной или полной слепоте. Способы по данному изобретению предпочтительно используются для лечения или профилактики заболеваний, вызванных раком, в частности для лечения рака, который может развиться в таких тканях,как легкое, молочная железа, толстая кишка, предстательная железа, поджелудочная железа, печень, щитовидная железа, почки, головной мозг, яички, желудок, кишечник, пищеварительный тракт, спинной мозг, синусы, мочевой пузырь, мочевыводящие пути или рак яичников. Кроме того, описанное здесь изобретение охватывает способ профилактики или лечения рака,включающий введение терапевтически эффективного количества олигонуклеотида LNA, модулирующего HIF-1a, включая, но не ограничиваясь, высокие дозы данного олигонуклеотида LNA в организм человека, нуждающегося в таком лечении. Данное изобретение дополнительно охватывает использование короткого периода введения олигонуклеотида LNA, модулирующего HIF-1a. Нормальные нераковые клетки разделены по частотным характеристикам на отдельные клеточные типы. Когда клетка трансформируется в злокачественную структуру, происходит неконтролируемая клеточная пролиферация и сниженный клеточный некроз и, следовательно, беспорядочное клеточное деление или клеточный рост является отличительной чертой клетки ракового типа. Примеры типов рака включают, но не ограничиваются этим, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, лейкемию (например, острая лейкемия, такая как острый лимфолейкоз, острый миелолейкоз,хронический миелолейкоз, хронический лимфолейкоз, множественная миелома), карцинома толстой кишки, карцинома прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцино- 14014097 ма, рак шейки матки, рак яичка, рак легкого, карцинома мочевого пузыря, меланома, рак области головы и шеи, рак головного мозга, раковые опухоли неизвестного первичного очага поражения, неоплазмы,раковые опухоли периферической нервной системы, раковые опухоли центральной нервной системы,опухоли (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеобластическая саркома, хондрома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома,синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, плоскоклеточный рак,базалиома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярный рак, бронхогенная карцинома,семинома, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, мелкоклеточный рак легкого, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менингиома, нейробластома и ретинобластома),болезнь тяжелых цепей, метастазы или любое другое заболевание или нарушение, характеризующееся неконтролируемым или аномальным клеточным ростом. Термин карцинома предназначен обозначать злокачественную опухоль, эпителиального происхождения. Эпителиальная ткань покрывает или выстилает внутренние и внешние поверхности тела. Примерами эпителиальной ткани являются кожа, слизистая оболочка и серозная оболочка, которые выстилают полости тела и внутренние органы, такие как кишечник, мочевой пузырь, матка и тому подобное. Эпителиальная ткань также может простираться в более глубокие слои тканей для образования желез,например желез, секретирующих слизь. Термин саркома предназначен обозначать злокачественную опухоль выросшую из соединительной ткани, как, например, хрящ, жир, мышцы, сухожилия и кости. Термин глиома, как используется здесь, предназначен обозначать злокачественную опухоль,происходящую из глиальных клеток. При использовании олигонуклеотида LNA по данному изобретению или конъюгата по данному изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, указанный рак соответственно может представлять собой солидную опухоль. Кроме того, указанный рак также соответствует карциноме. Данная карцинома обычно выбрана из группы, содержащей злокачественную меланому, базалиому,карциному яичников, карциному молочной железы, немелкоклеточный рак легких, почечноклеточный рак, карциному мочевого пузыря, рецидивирующий поверхностный рак мочевого пузыря, карциному желудка, карциному предстательной железы, карциному поджелудочной железы, карциному легкого,карциному шейки матки, дисплазию шейки матки, ларингеальный папилломатоз, карциному толстой кишки, колоректальную карциному и карциноидные опухоли. Более типично, указанная карцинома отобрана из группы, содержащей злокачественную меланому, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак толстой кишки и почечноклеточный рак. Злокачественная меланома обычно отобрана из группы, содержащей поверхностную обширную меланому, узелковую меланому, лентиго злокачественную меланому, акральную меланому, амелонотическую меланому и десмопластическую меланому. Альтернативно, рак может представлять собой саркому. Форма саркомы обычно выбрана из группы, содержащей остеосаркому, саркому Юинга, хондросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, фибросаркому и саркому Капоши. Альтернативно рак может представлять собой глиому. Также считается, что олигонуклеотиды LNA и конъюгаты, определенные здесь, особенно полезны при лечении злокачественного новообразования, выбранного из группы, содержащей множественную миелому, рак почки, рак шейки матки, рак головного мозга и рак молочной железы. Данное изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь, в организм больного, нуждающегося в таком лечении. В одном варианте,злокачественное новообразование находится в форме солидной опухоли. Солидным раком может быть карцинома, или саркома, или глиома, как обсуждалось выше. Соответственно, еще один аспект данного изобретения относится к использованию олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, при производстве лекарственного средства для лечения рака, где указанное лекарственное средство дополнительно содержит химиотерапевтический агент, выбранный из тех, которые выше определены в разделе Комбинированные лекарственные средства. Соответственно, дополнительный химиотерапевтический агент выбран из таксанов,таких как Таксол, Паклитаксел или Доцетаксел. Альтернативно заявлено, данное изобретение дополнительно относится к способу лечения рака,включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь, в организм больного, нуждающегося в таком лечении, и дополнительно включающему введение дополнительного химиотерапевтического агента. Указанное дополнительное введение может быть таковым, что данный дополнительный химиотерапевтический агент является конъюгированным с олигонуклеотидом LNA по данному изобретению, входит в состав фармацевтической композиции, или применяется в отдельной композиции. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтиче- 15014097 ским композициям, содержащим (а) одно или несколько антисмысловых соединений, (b) один или несколько других химиотерапевтических агентов, которые предотвращают деполимеризацию микротрубочек и формирования натяжения в центромерах сестринских хроматид, но не прикрепление микротрубочек к центромерам. Такие химиотерапевтические агенты включают таксаны, как определено выше, в частности Таксол, Паклитаксел и Доцетаксел. При использовании с олигонуклеотидами LNA по данному изобретению, такие химиотерапевтические агенты следует применять последовательно с лечением олигонуклеотидом в течение периода времени, в котором происходит сенсибилизация клеток-мишеней к последующему совместному лечению с помощью химиотерапевтического агента, посредством снижения уровня белка HIF-1a в опухолевых клетках и пролиферирующих эндотелиальных клеток сосудистой системы опухоли. В другом предпочтительном варианте осуществления лечение с использованием олигонуклеотидаLNA по настоящему изобретению сочетается с лучевой терапией. При использовании с нуклеотидамиLNA по данному изобретению лучевую терапию следует применять последовательно с лечением олигонуклеотидом в течение периода времени, в котором происходит сенсибилизация клеток-мишеней к последующей дополнительной лучевой терапии, посредством снижения уровня белка HIF-la в опухолевых клетках и пролиферирующих эндотелиальных клеток сосудистой системы опухоли. Олигонуклеотиды LNA по настоящему изобретению также можно применять в качестве экспериментальных реагентов для диагностики, лечения и профилактики. При исследовании данные антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для специфичного ингибирования синтеза генов HIF-1a в клетках и у экспериментальных животных, таким образом, облегчая функциональный анализ мишени или оценку ее пригодности в качестве мишени для терапевтического воздействия. В диагностических целях антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для определения и проведения количественного анализа экспрессии HIF-1 в клетке и тканях посредством нозерн-блоттинга, гибридизации insitu или подобных технологических приемов. Для терапевтических целей, животное или человека, у которого предполагается наличие заболевания или нарушения, которое можно лечить посредством модулирования экспрессии HIF-1, лечат с помощью применения антисмыслового олигонуклеотида LNA по данному изобретению. Дополнительно обеспечены способы лечения животных, в частности мышей и крыс, и лечения человека, у которого подозревается наличие, или предрасположенность к заболеванию или состоянию, связанному с экспрессией HIF-1a, посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких антисмысловых олигонуклеотидов LNA, или конъюгатов, или фармацевтических композиций по данному изобретению. Еще один аспект данного изобретения относится к способу индукции апоптоза, включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь. Индукция апоптоза может быть in vitro или in vivo. Индукция может быть выполнена в клеточном анализе, или в образце ткани, или организме живого млекопитающего. Связанный аспект данного изобретения относится к способу предотвращения клеточной пролиферации, включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь. Предотвращение пролиферации может быть in vitro или in vivo. Предотвращение может быть выполнено в клеточном анализе, или в образце ткани, или организме живого млекопитающего. Более того, данное изобретение также относится к способу лечения ангиогенного заболевания,включающему введение олигонуклеотида LNA, как определено здесь, или конъюгата, как определено здесь, или фармацевтической композиции, как определено здесь, так что ингибируется ангиогенез, связанный с ангиогенным заболеванием. В одном варианте осуществления ангиогенное заболевание включает опухоль, вызванную раком; также смотри выше. Рак предпочтительно выбран из группы, содержащей рак молочной железы, рак легкого, рак области головы и шеи, рак головного мозга, абдоминальный рак, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак пищевода, гастроинтестинальный рак, глиому, рак печени, рак языка, нейробластому,остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ретинобластому,опухоль Вильмса, множественную миелому, рак кожи, лимфому и рак крови. Альтернативно, рак выбран из группы, содержащей множественную миелому, рак почки, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак головного мозга и рак молочной железы. Ангиогенное заболевание также может быть выбрано из группы, содержащей диабетическую ретинопатию, дегенерацию желтого пятна и воспалительные заболевания. В частности, ангиогенное заболевание представляет собой воспалительное заболевание, выбранное из воспалительного заболевания кишечника, псориаза и ревматоидного артрита. Считается, что лечение дегенерации желтого пятна является чрезвычайно уместным с использованием олигонуклеотидов по данному изобретению. Наборы Если имеется опасность подвергнуть фармацевтическую композицию в жидкой форме условиям,- 16014097 при которых ставится под угрозу стабильность олигонуклеотида LNA, может быть предпочтительно производство готового продукта, содержащего олигонуклеотид LNA в твердой форме, например в виде лиофилизированного вещества, и хранить продукт в такой твердой форме. Затем продукт перед введением может быть восстановлен (например, растворен или суспендирован) в физиологическом растворе или в забуференном физиологическом растворе, и готовым для использования. Таким образом, данное изобретение также относится к набору, содержащему(b) второй компонент, содержащий физиологический раствор или буферный раствор (например, забуференный физиологический раствор), адаптированный для восстановления (например, растворения или суспендирования) указанного олигонуклеотида LNA. Предпочтительно указанный физиологический раствор или забуференный физиологический раствор имеет значение рН в диапазоне 4,0-8,5 и моляльность 20-2000 мМ. В предпочтительном варианте осуществления физиологический раствор или забуференный физиологический раствор имеет значение рН в диапазоне 6,0-8,0 и моляльность 100-500 мМ. В наиболее предпочтительном варианте осуществления физиологический раствор или забуференный физиологический раствор имеет значение рН в диапазоне 7,0-8,0 и моляльность 120-250 мМ. Для такого набора олигонуклеотид LNA предпочтительно выбран из группы, содержащей последовательности SEQ ID1, SEQ ID2, SEQ ID15, SEQ ID16, SEQ ID17 и SEQ ID18. Конкретнее, олигонуклеотид LNA выбран из группы, содержащей последовательности SEQ ID1 и SEQ ID2. Данное изобретение далее иллюстрируется в неограничивающей манере следующими примерами. Экспериментальная часть Пример 1. Синтез мономера. Элементарные звенья мономера LNA и его производные получали, следуя опубликованным технологическим процедурам и рекомендациям, процитированным там, смотри, например, WO 03/095467 А 1 иD.S. Pedersen, С. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808. Пример 2. Синтез олигонуклеотида. Олигонуклеотиды синтезировали, используя фосфорамидитный способ, на синтезаторе Expedite 8900/MOSS (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) на уровне 1 ммоль или 15 ммоль. Для синтеза большого размера использовали kta Oligo Pilot. По окончании синтеза (DMT-on), олигонуклеотиды отщепляли с твердофазной подложки, используя водный раствор аммиака, в течение 1-2 ч при комнатной температуре, и далее снимали защитные группы в течение 4 ч при 65 С. Олигонуклеотиды очищали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой (RP-HPLC). После удаления DMT-групп получали характеристики олигонуклеотидов с помощью AE-HPLC, RP-HPLC и CGE и молекулярную массу дополнительно выверяли посредством масс-спектрометрии и ионизацией распылением (ESI-MS). Более подробно смотри ниже. Подготовка LNA-твердофазной подложки. Получение сукцинил полуэфира LNA. Мономер 5'-O-Dmt-3'-гидрокси-LNA (500 мг), янтарный ангидрид (1,2 грамм-эквивалент) и DMAP (1,2 грамм-эквивалент) растворяли в DCM (35 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После экстрагирования с использованием NaH2PO4 0,1 М рН 5,5 (2) и солевого раствора (1), органический слой затем высушивали с использованием безводного Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Производное соединение полуэфира получали с выходом 95% и использовали без любой дальнейшей очистки. Получение подложки LNA. Полученное выше производное соединение полуэфира (90 мкмоль) растворяли в минимальном количестве DMF, добавляли DIEA и руВОР (90 мкмоль), перемешивали вместе в течение 1 мин. Эту предактивизированную смесь соединяли с LCAA-CPG (500 А, размер ячейки 80-120, 300 мг) в ручном синтезаторе и перемешивали. После 1,5 ч при комнатной температуре данную подложку фильтровали и отмывали, используя DMF, DCM и МеОН. После высушивания нагрузку определяли равной 57 мкмоль/гF.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14). Удлинение олигонуклеотида. Соединение фосфорамидитов (A(bz), G(ibu), 5-метил-С(bz или Тцианоэтил-фосфорамидит) осуществляли, используя 0,1 М раствор 5'-O-DMT-защищенного амидита в ацетонитриле и DCI (4,5 дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Тиолирование проводили, используя ксантан хлорид (0,01 М в ацетонитриле: пиридин 10%). Остальные реагенты такие, которые обычно используются для синтеза олигонуклеотидов. Протокол, предусмотренный поставщиком, был оптимизирован.- 17014097 Очистка посредством ВЭЖХ с обращенной фазой: В табл. 1 заглавными буквами обозначен аналог нуклеотида -D-окси-LNA (-D-окси-LNA), строчными буквами обозначены 2-дезоксинуклеотиды, подчеркиванием обозначен либо аналог нуклеотида бета-D-окси-LNA, либо 2-дезоксинуклеотид, подстрочным индексом s обозначена фосфоротиоатная связь между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA, отсутствие подстрочного индекса между соседними нуклеотидами/аналогами нуклеотида LNA означает фосфодиэфирную связь, и подстрочным индексом х обозначена либо фосфоротиоатная связь, либо фосфодиэфирная связь между соседними нуклеотидами/ аналогами нуклеотида LNA, и где нуклеотидные единицы в скобках, (Тх), (Т)- 18014097 или (Gx), (А), соответственно, представляют собой необязательные единицы. Все мономеры C-LNA являются 5-метил-С (MeC). Вычисление температуры плавления (Tm) соединений: Смешивали 3 мкМ раствора соединения по последовательностиSEQ ID1 в 10 мМ фосфате натрия/100 мМ NaCI/ 0,1 нМ ЭДТА, рН 7,0 с 3 мкМ его комплемента ДНК/РНК в 10 мМ фосфате натрия/100 мМ NaCI/ 0,1 нМ ЭДТА, рН 7,0 при 90 С в течение минуты и охлаждали при комнатной температуре. Затем определяли Tm данного дуплекса по повышению температуры на 1 С/мин от 25 до 95 С. Tm соединения по последовательности SEQ ID1 представлена в табл. 2 ниже: Таблица 2 Пример 4. Стабильность олигонуклеотидов LNA в плазме крови человека или крысы. Стабильность олигонуклеотида LNA проверяли в плазме крови человека или крыс (также может быть плазма крови мыши, обезьяны или собаки). К 45 мкл плазмы крови добавляли 5 мкл олигонуклеотидаLNA (конечная концентрация 20 мкМ). Данные олигонуклеотиды LNA инкубировали в плазме крови в течение временного диапазона от 0 до 96 ч при 37 С (данную плазму проверяли на нуклеазную активность вплоть до 96 ч и не выявлено никакого различия в характере расщепления нуклеазами). В указанное время образцы мгновенно замораживали в жидком азоте. 2 мкл (эквивалент 40 пмоль) олигонуклеотида LNA в плазме разбавляли добавлением 15 мкл воды и 3 мкл 6-кратного нагрузочного красителя (Invitrogen). В качестве маркера молекулярного веса использовали 10 bp ladder (Invitrogen 10821-015). К 1 мкл маркера молекулярного веса добавляли 1 мкл 6-кратного красителя и 4 мкл воды. Данные образцы смешивали, выдерживали при 65 С в течение 10 мин и наносили на предстартовый гель (16% акриламид,7 М мочевина, 1 TBE, предварительно подвергали электрофорезу при 50 ватт в течение 1 ч) и проводили электрофорез при 50-60 Вт в течение 2,5 ч. Затем гель окрашивали с использованием 1-кратного SyBRgold (молекулярные зонды) в 1-кратном ТВЕ в течение 15 мин. Полосы визуализировали, используя фосфоимаджер фирмы Biorad (см. фиг. 1 А для плазмы крови крысы и фиг. 1 В для плазмы крови человека и крысы). Стабильность олигонуклеотида LNA проверяли в плазме крови человека (также может быть плазма крови крысы, мыши, обезьяны или собаки). Олигонуклеотид LNA в конечной концентрации 20 мкМ(между 1 и 5 мкл) добавляли к общему объему 20 мкл плазмы крови и инкубировали в течение временного диапазона от 0 до 24 ч (можно инкубировать до 72 ч - данную плазму проверяли на нуклеазную активность вплоть до 72 ч и не выявлено никакого различия в характере расщепления нуклеазами). В указанное время данные образцы хранили при -80 С. 1 мкл (эквивалент 20 пмоль) олигонуклеотида LNA в плазме крови разбавляли в 10 раз водой и проводили электрофорез в геле, содержащем 16% акриламид, 7 М мочевину с маркером молекулярного веса 10 bp ladder (производитель Invitrogen (каталожный 10821-015. Гель подвергали электрофорезу при приблизительно 40 Вт в течение 2-3 ч, а затем окрашивали с помощью 1-кратного SyBR gold (молекулярные зонды) в 1-кратном ТВЕ в течение 15 мин. Полосы визуализировали, используя фосфоимаджер фирмы Biorad (см. фиг. 1). Пример 5. Модель In vitro: клеточная культура. Действие олигонуклеотидов LNA на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени можно проверить на многообразных клеточных типах, только при условии наличия поддающихся измерению уровней нуклеиновой кислоты-мишени. Мишень может экспрессирована эндогенно или посредством временной или стабильной трансфекции нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную нуклеиновую кислоту. Уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени можно определить обычным способом, используя, например, нозерн-блоттинг, количественную ПЦР, анализ с защитой от рибонуклеаз. Следующие клеточные типы приведены в целях иллюстрации, но другие клеточные типы можно использовать в обычном способе, только при условии, что данная мишень экспрессируется выбранным клеточным типом. Клетки культивировали в соответствующей среде, как описано ниже, и поддерживались при 37 С,при влажности 95-98% и 5% СО 2. Когда культивировали в условиях гипоксии или аноксии уровни О 2 поддерживали на 1-2% или 0-0,5%, соответственно. Клетки обычным способом пассировали 2-3 раза еженедельно. 15 РС 3: клеточная линия рака предстательной железы человека 15 РС 3 была любезно предоставлена доктором F.Baas, Neurozintuigen Laboratory, АМС, The Netherlands, и была культивирована в DMEM(Sigma) + 10% эмбриональная бычья сыворотка (FBS) + Глутамакс I + гентамицин. РС 3: клеточную линию рака предстательной железы человека РСЗ, приобретенную у АТСС, инкубировали в среде F12 Куна с глутамином (Gibco) + 10% FBS + гентамицин. 518 А 2: клеточная линия меланомы человека 518 А 2, любезно предоставленная доктором В. Jansen,- 19014097of Vienna, была культивирована в DMEM (Sigma) +10% эмбриональная бычья сыворотка (FBS) + Глутамакс I + гентамицин.U373: клетки глиобластомы U373 культивировали в ЕМЕМ (Sigma), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку плюс Глутамакс I, NEAA, пируват натрия и гентамицин, при 37 С, влажности 95% и 5% СО 2.HeLa: клеточную линию карциномы шейки матки HeLa культивировали в MEM (Sigma), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку плюс гентамицин, при 37 С, влажности 95% и 5% СО 2. МРС-11: Клеточную линию множественной миеломы мышевидных МРС-11, купленную у АТСС,поддерживали в DMEM с 4 мМ Глутамакс + 10% сыворотки лошади.DU-145: клеточную линию рака предстательной железы человека DU-145, купленную у АТСС,поддерживали в RPMI с Глутамакс + 10% FBS.RCC-4 +/- VHL: Клеточную линию рака почки человека RCC4 стабильно трасфицированную плазмидой, экспрессирующей VHL или пустой плазмидой, купленную у ЕСАСС, поддерживали в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. 786-0: клеточную линию почечноклеточного рака человека 786-0, купленную у АТСС, поддерживали в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.HUVEC: клеточную линию эндотелия пупочной вены человека HUVEC, купленную у Camcrex,поддерживали в среде EGM-2. К 562: клеточную линию хронической миеломной лейкемии человека К 562, купленную у ЕСАСС,поддерживали в RPMI с Глутамакс + 10% FBS.U87MG: клеточную линию глиобластомы человека U87MG, купленную у АТСС, поддерживали в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. В 16: клеточную линию меланомы В 16 мышевидных, купленную у АТСС, поддерживали в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.LNCap: клеточную линию рака предстательной железы человека LNCap, купленную у АТСС, поддерживали в RPMI с Глутамакс + 10% FBS. Пример 6. Модель in vitro: обработка антисмысловым олигонуклеотидом. Выращивание клеток и трансфекции: клетки U373 или HeLa высевали на 12-луночные планшеты при 37 С, (5% СО 2) в среду для выращивания D, дополненную 10% FBS, Глутамаксом I и гентамицином. Когда клетки были конфлюэнтными на 60-70%, их трансфицировали в двух экземплярах олигонуклеотидами в различных концентрациях (0,2-100 нМ), используя Липофектамин 2000 (2,5-5 мкг/мл). Трансфекции проводили по существу, как описано у Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424). Вкратце, клетки инкубировали в течение 10 мин с Липофектамином в OptiMEM, с последующим добавлением олигонуклеотида до общего объема трансфекционной смеси 0,5 мл на лунку. Через 4 ч данную трансфекционную смесь удаляли, клетки отмывали и выращивали при 37 С в течение приблизительно 20 ч (анализ мРНК и белковый анализ) в условиях либо нормального содержания кислорода, либо в условиях гипоксии, в соответствующей среде для выращивания. Затем клетки собирали для белкового анализа и анализа РНК. Пример 7. Модель in vitro: Выделение РНК и синтез кДНК. Выделение общей РНК. Тотальную РНК выделяли либо, используя мини-набор RNeasy (Qiagen, каталожный 74104), либо используя реагент тризол (Life technologies, каталожный 15596). Для выделения тотальной РНК с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen) клетки отмывали с помощью PBS и добавляли буфер для лизиса клеток (RTL, Qiagen), дополненный 1% меркаптоэтанолом,прямо в лунки. Через несколько минут образцы обрабатывали согласно инструкциям производителя. Образцы тканей гомогенизировали, используя гомогенизатор Retsch 300MM, и тотальную РНК выделяли, используя реагент тризол или мини-набор RNeasy, как описано производителем. Синтез первой цепи. Синтез первой цепи осуществляли, используя либо набор с обратной транскриптазой OmniScript,либо обратную транскриптазу M-MLV (по сути описано производителем (Ambion согласно инструкциям производителя (Qiagen). Когда использовали обратную транскриптазу OmniScript, 0,5 мкг тотальной РНК каждого образца доводили до 12 мкл и смешивали с 0,2 мкл поли(dT)12-18 (0,5 мкг/мкл) (Life Technologies), 2 мкл смеси dNTP (5 мМ каждого), 2 мкл 10-кратного буфера RT, 0,5 мкл ингибитора РНказыRNAguard (33 единицы/мл, Amersham) и 1 мкл обратной транскриптазы OmniScript с последующим инкубированием при 37 С в течение 60 мин и инактивацией нагреванием до 93 С в течение 5 мин. Когда синтез первой цепи осуществляли с использованием произвольных декамеров и обратной транскриптазы M-MLV (по сути описано производителем (Ambion, 0,25 мкг тотальной РНК каждого образца доводили до 10,8 мкл в Н 2 О. Добавляли 2 мкл декамеров и 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ каждого). Образцы выдерживали при 70 С в течение 3 мин, мгновенно охлаждали в ледяной воде и добавляли 3,25 мкл смеси, содержащей (2 мкл 10-кратного буфера RT; 1 мкл обратной транскриптазы M-MLV; 0,25 мкл ингибитора RNAase). Синтезировали кДНК при 42 С в течение 60 мин с последующим этапом инактивации нагреванием при 95 С в течение 10 мин и в заключение охлаждали до 4 С.- 20014097 Пример 8. Модели in vitro и in vivo: Анализ ингибирования олигонуклеотидом экспрессии HIF-1a посредством ПЦР в режиме реального времени. Антисмысловую модуляцию экспрессии of HIF-1a можно исследовать с использованием множества способов, известных в уровне техники. Так, количественный анализ уровней мРНК HIF-1a можно провести, например, посредством нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР),анализа с помощью защиты от рибонуклеаз (RPA) или ПЦР в режиме реального времени. Количественная ПЦР в режиме реального времени в настоящее время предпочтительна. Анализ РНК можно осуществить в тотальной клеточной РНК или в мРНК. Способы выделения РНК и анализа РНК, например нозерн-блоттинг, являются обычными в уровне техники и описаны, например, в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons. Количественную (ПЦР) в режиме реального времени можно выполнить, используя коммерчески доступную систему обнаружения iQ Multi-Color Real Time PCR, имеющуюся в наличии у фирмыBioRAD. Анализ уровней мРНК HIF-1a посредством количественной ПЦР в режиме реального времени. Количественная оценка уровней мРНК проводилась посредством количественной ПЦР в режиме реального времени, с использованием системы обнаружения iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System (BioRAD), согласно инструкциям производителя. Количественная ПЦР в режиме реального времени является хорошо известной в уровне техники методикой и описана, напримеру Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986994. 2-кратная базовая ПЦР смесь Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG была приобретена у Invitrogen каталожный 11730. Праймеры и зонды TaqMan были приобретены у MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany. Количество глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH), 18S РНК или мРНК -актина использовали в качестве эндогенного контроля для нормализации любых отклонений при получении образца. Содержание мРНК GAPDH человека в данном образце количественно определяли, используя реагент human GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay (Applied Biosystems каталожный 4310884E), согласно инструкциям производителя. ПЦР-праймеры дляHIF-1a человека были следующие: прямой праймер: 5'-CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT-3' (SEQ ID21) (конечная концентрация в пробе; 0,9 мкМ) обратный праймер: 5'-GCTTTCTCTGAGCATTCTGCGC-3' (SEQ ID22) (конечная концентрация в пробе; 0,9 мкМ) и ПЦР-зонд был: 5'FAM-CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACATAMRA 3' (SEQ ID23) (конечная концентрация в пробе; 0,1 мкМ). Для HIF-1a человекообразных обезьян, ПЦР-праймеры были: I прямой праймер: 5'-GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG-3' (конечная концентрация в пробе 0,9 мкМ) (SEQ ID24) обратный праймер: 5'-GAACCATAACACCATCCAAGGC-3' (SEQ ID25) (конечная концентрация в пробе 0,9 мкМ) и ПЦР-зонд был: 5'FAM TCATCTTCAATATCCАААTCACCAGCATCCAGAAGTAMRA 3' (SEQ ID26) (конечная концентрация в пробе 0,1 мкМ). Для количественного определения 18S рибосомальной РНК, использовали эндогенный контрольный реагент TaqMan Eukaryotic 18S rRNA, (PART4310875, Applied Biosystems), согласно инструкциям производителя. Для количественного определения мРНК GAPDH мыши сконструировали следующие праймеры и зонды: Прямой праймер 5'-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3' (SEQ ID27) (конечная концентрация 0,3 мкМ),Обратный праймер 5'-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3' (SEQ ID28) (конечная крнцентрация 0,6 мкМ),Зонд TaqMan 5'-FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC-TAMRA-3' (SEQ ID29) (конечная концентрация 0,2 мкМ). ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов Taqman. кДНК синтезированной первой цепи, полученную, как описано в примере 6, разбавляли в 2-20 раз и анализировали, используя количественную ПЦР в режиме реального времени. Данные праймеры и зонд смешивали с 2-кратной смесью Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG (каталожный 11730, Invitrogen) и добавляли к 3,3 мкл кДНК до конечного объема 25 мкл. Каждый образец анализировали три раза. Анализируя 2-кратные разбавления кДНК, полученной из материала, очищенного из клеточной линии,экспрессирующей представляющую интерес РНК, получали калибровочную кривую для данных анализов. В качестве контрольной матрицы вместо кДНК использовали стерильную Н 2 О. Программа ПЦР: 50 С в течение 2 мин, 95 С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами 95 С, 15 с, 60 С, 1 мин. Относительные величины последовательности мРНК-мишени определяли исходя из вычисленного порогового цикла, используя программное обеспечение iCycler iQ Real-time Detection System (см. фиг. 2).- 21014097 ПЦР в режиме реального времени SyBR Green. Для определения относительного уровня мРНК HIF-1 мыши использовали кДНК в количественном ПЦР анализе, с применением iCycler фирмы BioRad. К 8 мкл кДНК, разведенной в 5 раз, добавляли 52 мкл смеси, содержащей в себе 29,5 мкл PlatinumqPCR, Supermix-UDG (invitrogen), 1030 нМ каждого праймера, 0,57 X SYBR Green (молекулярные зонды) и 11,4 нМ флуоресцина (молекулярные зонды). Для Q-PCR использовали дубликаты проб по 25 мкл: 50 С в течение 120 с, 95 С в течение 120 с и 40 циклов [95 С в течение 30 с и 60 С в течение 60 с]. Экспрессию мРНК HIF1 нормализовали по мРНК -актина мыши, которая была схожим образом количественно определена, используя Q-PCR. Праймеры: Для получения калибровочной кривой в анализе использовали 2-кратные разведения кДНК, синтезированной из необработанных фибробластов мышей (клетки Ltk) (разведенные в 5 раз и экспрессирующие и HIF1, и -актин). Относительные количества мРНК HIF1 определяли исходя из вычисленного порогового цикла, используя программное обеспечение iCycler iQ Real Time Detection System. Пример 9. Анализ in vitro: анализ уровней белка HIF-1a с использованием вестерн-блоттинга. Действие олигонуклеотидов LNA in vitro гена HIF-1a на уровне белка HIF-1a в трансфицированных клетках определяли с помощью вестерн-блоттинга. Клетки собирали и лизировали, используя 50 мМ трис-HCl рН 6,8, 10% глицерол, 2,5% SDS, 5 мМDTT и 6 М мочевину, с добавлением смеси ингибиторов протеаз (Roche). Концентрации общего белка измеряли, используя набор для белкового анализа БСА (Pierce). Проводили электрофорез 20-100 мкг общего белка в 10-12% бис-трис гелях в буфере MOPS или в 3-8% трис-ацетатных гелях и делали отпечатки на мембранах PVDF согласно инструкциям производителя (Invitrogen). После инкубирования в течение ночи в блокирующем буфере (PBS-T, дополненный 5% молочным порошком с низким содержанием жира) данные мембраны инкубировали в течение ночи с антителом против HIF-1a, антителом против Вс 1-2, антителом против VEGF или антителами, обнаруживающими другие 5'-3' направления HIF-1a. В качестве контроля нагрузки определяли тубулин или актин, используя моноклональные антитела, полученные у Neomarker. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами и визуализировали HIFla, используя набор для хромогенного иммуноанализа (Invitrogen) или набор для обнаружения хемилюминесценции ECL+ (Amersham) (см. фиг. 2 А и фиг. 2 В). Пример 10. Анализ in vitro: антисмысловое ингибирование экспрессии HIF-1a человека с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и их действие на мишени в 5'-3' направлении VEGFA и ММР 2. Олигонуклеотиды LNA действительно оказывают действие на мишени в 5'-3' направлении VEGFA и ММР-2 в среде, полученной от клеток U373. Клетки U373 плотностью 0,3106 клеток высевали во флаконы Т 25 (анализ временных характеристик) или 0,6106 клеток во флаконы Т 80 (48-часовой анализ концентраций). Клетки U373 при 37C (5% СО 2) помещали в среду для выращивания, дополненную 10%FBS, Глутамаксом I и гентамицином. На следующий день после высевания клетки трансфицировали олигонуклеотидами LNA в двух или трех экземплярах, используя различные концентрации олигонуклеотидов (0,2-10 нМ), с помощью Липофектамина 2000 (2,5 мкг/мл). Трансфекции проводили, по существу,как описано у Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424). Вкратце, клетки инкубировали в течение 10 мин с Липофектамином в OptiMEM, с последующим добавлением олигонуклеотида. Через 4 ч данную трансфекционную смесь удаляли, клетки отмывали и выращивали при 37 С в течение приблизительно 20 ч(анализ мРНК и белковый анализ) в условиях либо с нормальным содержанием кислорода, либо в условиях гипоксии, в соответствующей среде для выращивания. Супернатанты от клеток собирали в определенное время. Дополнительные ингибиторы протеаз добавляли перед помещением на хранение приDMP-200) от RD systems согласно инструкциям производителя. В зависимости от времени сбора супер- 22014097 натант разбавляли в 5-50 раз перед измерением. См. фиг. 12 А-Е. Пример 11. Индукция апоптоза посредством олигонуклеотидов LNA. Выращивание клеток. Клеточную линию глиобластомы U373 (АТСС) выращивали в MEM (Sigma), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, Глутамаксом I, NEAA, пируватом натрия и гентамицином, при 37 С,влажности 95 и 5% СО 2. Когда клетки достигали 60-70% слияния, клетки трансфицировали, используя Липофектамин 2000 (2,5 мкг/мл). Клеточную линию рака шейки матки HeLa выращивали в MEM (Sigma), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, гентамицин при 37 С, влажности 95 и 5% СО 2. Когда клетки достигали 6070% слияния, клетки трансфицировали, используя Липофектамин 2000 (5 мкг/мл). Измерение активности активной каспазы 3/7. В день перед трансфекцией клетки U373 высевали с плотностью 7000 клеток на лунку в белый 96 луночный планшет (Nunc 136101) в полную MEM. На следующий день клетки один раз отмывали предварительно нагретой OptiMEM с последующим добавлением 72 мкл OptiMEM, содержащей в себе 2,5 мкг/мл Липофектамина 2000 (In vitrogen). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 18 мкл олигонуклеотидов, разбавленных с помощью OptiMEM. Конечная концентрация олигонуклеотида составляла от 0,2 нМ до 100 нМ. После 6 часов обработки клетки отмывали с помощью OptiMEM и добавляли 100 мкл DMEM, содержащей в себе сыворотку. Схожим образом 96-луночные планшеты с обработанными клетками U373 культивировали в условиях с нормальным содержанием кислорода или в условиях гипоксия/аноксия посредством помещения данных 96-луночных планшетов в мешок для культивирования без воздуха (Merck) до момента сбора. В определенное время планшеты уравновешивали до комнатной температуры в течение времени. Добавляли 100 мкл реагента высокочувствительной каспазы 3/7-GIoTM (Promega) прямо к клеткам в 96-луночный планшет и планшеты инкубировали в течение 1 часа перед определением люминесценции (активность люциферазы) с помощью инструмента Luminoskan Ascent фирмы Thermo Labsystems после дополнительного лаг-периода 1 мин. Активность люциферазы измеряли в относительных единицах освещенности в секунду (RLU/c). Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Ascent software 2.4.2. и строили графики зависимости кратности индукции относительно плацебо в программе Excel. Трансфицированные клетки, инкубированные с ингибитором каспазы 3/7, который блокирует активность активной каспазы 3/7, использовали для демонстрации специфичности апоптотической реакции. Кроме того, клетки, индуцированные стауроспорином, камптотецином или таксолом, служили в качестве положительного контроля. (см. фиг. 3 А и фиг. 3 В.) Анализ аннексии V-FITC с использованием проточной цитометрии. Клетки HeLa плотностью 1106 высевали во флаконы Т 75 за день до трансфекции. В день проведения трансфекции клетки отмывали один раз с помощью 37 С OptiMEM, с последующим добавлением 7 мл OptiMEM, содержащей 2,5 мкг/мл Липофектамина 2000 (Invitrogen). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 1700 мкл олигонуклеотидов, разбавленных с помощью OptiMEM до конечной концентрации 1-25 нМ. Клетки трансфицированные плацебо служили в качестве контроля. После 4 часов обработки клетки отмывали с помощью OptiMEM и добавляли 10 мл среды для культивирования. После обработки олигонуклеотидами клетки оставляли восстанавливаться в течение 24-72 ч до момента сбора посредством соскабливания и отмывали дважды с использованием PBS. Клетки плотностью 2105 инкубировали с 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл пропидиум иодида (PI-10 мг/мл) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Инкубирование трнсфецированных клеток с очищенным рекомбинантным аннексином V (10 мкг) перед добавлением аннексина V-FITC использовали для демонстрации специфичности и селективности окрашивания. Кроме того, клетки HeLa (0,5 мкг/мл), индуцированные с помощью TRAIL (Apo2L), использовали в качестве положительного контроля. Клетки U373 плотностью 0,6106 высевали во флаконы Т 75 за один день перед проведением трансфекции. В день проведения трансфекции данные клетки один раз отмывали 37 С OptiMEM, затем добавляли 7 мл OptiMEM, содержащей 2,5 мкг/мл Липофектамина 2000 (Invitrogen). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 1700 мкл олигонуклеотидов, разбавленных с помощью OptiMEM до конечной концентрации 1-25 нМ. Клетки, трансфицированные плацебо, использовали в качестве контроля. После 6 ч обработки клетки отмывали с помощью OptiMEM и добавляли 10 мл среды для культивирования. После обработки олигонуклеотидами клетки оставляли восстанавливаться в течение 24-48 ч до момента сбора посредством соскабливания и отмывали дважды с использованием PBS. Клетки плотностью 2105 инкубировали с 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл пропидиум иодида (PI-10 мг/мл) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Инкубирование трансфицированных клеток с очищенным рекомбинантным аннексином V (10 мкг) перед добавлением аннексина V-FITC использовали для демонстрации специфичности и селективности окрашивания. Кроме того, клетки U373,индуцированные стауроспорином (0,2 мкМ), использовали в качестве положительного контроля (см. фиг. 4 А и 4 В).- 23014097 Пример 12. Ингибирование пролиферации посредством олигонуклеотидов LNA. Клетки обрабатывали согласно примеру 11. Определение пролиферации жизнеспособных клеток (анализ MTS). Клетки U373 за день перед трансфекцией высевали с плотностью 7000 клеток на лунку в чистый 96 луночный планшет (Scientific Orange1472030100) в DMEM. На следующий день клетки отмывали один раз предварительно согретой OptiMEM, с последующим добавлением 72 мкл OptiMEM, содержащей 2,5 мкг/мл Липофектамина 2000 (Invitrogen). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 18 мкл олигонуклеотидов, разбавленных с помощью OptiMEM. Конечная концентрация олигонуклеотида составляла от 5 нМ до 100 нМ. После 6 ч обработки клетки отмывали с помощью OptiMEM и добавляли DMEM, содержащую 100 мкл сыворотки. Схожим образом 96-луночные планшеты с обработанными клетками U373 культивировали в условиях с нормальным содержанием килорода или в условиях гипоксии/аноксии посредством помещения этих 96-луночных планшетов в мешки для культивирования без воздуха (Merck) до момента сбора. Жизнеспособные клетки определяли в определенный момент времени посредством добавления 20 мкл соединения тетразолия [3-(4,5-диметил-2-ил)-5-(3 карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2 Н-тетразолий, внутренняя соль; MTS] и реагента электронного переноса (феназин этосульфат; PES) (CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega). Жизнеспособные клетки определяли при 490 нм и 650 нм на Powerwave (Biotek Instruments). Ингибирование скорости роста OD (490-650 нм)/ч в зависимости от концентрации олигонуклеотида LNA относительно плацебо, которому присваивали значение 100% (см. фиг. 5 А и 5 В). Пример 13. Поглощение in-vivo и направленный супрессирующий эффект олигонуклеотидов LNA. Мышей hairy обрабатывали либо ежедневно, либо два раза в неделю (5 раз) в течение 14 дней с использованием внутрибрюшинных инъекций физиологического раствора или соединения по последовательности SEQ ID1 и различных тиолированных его вариантов. Соединение по последовательностиSEQ ID5 является частично тиолированным (в гэпе), в то время как соединение по последовательности SEQ ID6 имеет фосфодиэфирный остов. Мышей обрабатывали тотальными дозами 10 мг/кг/14 дней, 50 мг/кг/14 дней, или 250 мг/кг/14 дней, которые вводили либо ежедневно, либо дважды в неделю. Очистка РНК из синтез кДНК из ткани. Приблизительно 10 мг ткани гомогенизировали в 400 мкл буфера RTL (Qiagen), дополненного 1% маркаптоэтанолом. Тотальную РНК выделяли, используя мини-набор RNeasy (Qiagen), согласно инструкциям производителя. Синтез первой цепи осуществляли, используя произвольные декамеры и обратную транскриптазуM-MLV (по существу как описано производителем (Ambion. Для каждого образца, 0,25 мкг тотальной РНК доводили до 10,8 мкл в Н 2 О. Добавляли 2 мкл декамеров и 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ каждого). Образцы выдерживали при 70 С в течение 3 мин, мгновенно охлаждали в ледяной воде и добавляли 3,25 мкл смеси, содержащей в себе (2 мкл 10-кратного буфера RT; 1 мкл обратной транскриптазы M-MLV; 0,25 мкл ингибитора RNAase). кДНК синтезировали при 42 С в течение 60 мин, с последующим этапом инактивации нагреванием при 95 С в течение 10 мин и в заключение охлаждали до 4 С. Количественная ПЦР в режиме реального времени. Для определения относительного уровня мРНК HIF1 мыши в обработанных и необработанных образцах, использовали образованную кДНК в количественной ПЦР, с помощью iCycler фирмы BioRad. К 8 мкл разбавленной в 5 раз кДНК добавляли 52 мкл смеси, содержащей 29,5 мкл Platinum qPCR,Supermix-UDG (Invitrogen), 1030 нМ каждого праймера, 0,57 X SYBR Green (молекулярные зонды) и 11,4 нМ флуоресцеина (молекулярные зонды). В Q-PCR использовали дупликаты по 25 мкл: 50 С в течение 120 с, 95 С в течение 120 с и 40 циклов [95 С в течение 30 с и 60 С в течение 60 с]. Экспрессию мРНК HIF1 нормализовали по мРНК -актина и/или Gapdh мыши, которая была схожим образом количественно определена, используя Q-PCR. Для получения калибровочной кривой в анализе использовали 2-кратные разведения кДНК, синте- 24014097 зированной из необработанных фибробластов мышей (клетки Ltk) (разведенные в 5 раз и экспрессирующие и HIF1, и -актин). Относительные количества мРНК HIF1 определяли исходя из вычисленного порогового цикла, используя программное обеспечение iCycler iQ Real Time Detection System. Экстракция олигонуклеотида LNA из ткани. Приблизительно 100 мг ткани механически гомогенизировали в 500 мкл буфера для экстракции(0,5% Игепал СА-630, 25 мМ Трис рН 8,0, 25 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, содержащий 1 мг/мл RNAse А) и инкубировали при 37 С в течение ночи. 500 мл скрепляли с исходным олигонуклеотидом и экстрагировали посредством добавления 1 мл смеси фенол-изоамил-хлороформ (25:1:24(об/об/об. Водную фазу переносили в новую пробирку и экстрагировали снова. При необходимости полученный экстракт был лиофилизирован. Анализ полученных олигонуклеотидов LNA, используя способ ВЭЖХ IEX. Образец объемом 50 мкл разделяли на колонке DNAPac PA-100 (2250 мм, Dionex), оборудованной ограничительной колонкой DNAPac PA-100 (250 мм, Dionex). Данные колонки нагревали до 40 С. Скорость тока составляла 0,25 мл/мин и длина волны определения составляла 260 нм. Градиент подвижной фазы А: Трис (20 мМ), ЭДТА (1 мМ) и перхлорат натрия (10 мМ) рН: 7,6, В: Трис (20 мМ), ЭДТА (1 мМ) и перхлорат натрия (1 М) рН: 7,6, (0-13 мин, А: 20%, В: 20%; 14-18 мин, А: 40%, В: 60%; 22-28 мин, А 0%, В: 100%; 33-38 мин, А: 80%, В: 20%). На фиг. 6 А и 6 В показано поглощение in vivo (в мкг на грамм ткани) и направленный супрессирующий эффект (% ингибирования экспрессии мРНК HIF-1, приведенной к экспрессии -актина, относительно мышей, обработанных физиологическим раствором, после внутрибрюшинного введения соединения по последовательности SEQ ID1 либо ежедневно, либо два раза в неделю в течение 14 дней(как описано выше. На фиг. 6 С представлен супрессирующий эффект на эндогенный HIF-1 почек in vivo после введения мышам hairy соединения по последовательности SEQ ID1 посредством ежедневных внутрибрюшинных инъекций в течение 14 дней. На фиг. 7 А показано, что соединение по последовательности SEQ ID1 является мощным ингибитором экспрессии HIF-1 в печени в условиях ежедневного введения, что измерено посредством QPCR. На фиг. 7 В показано, что соединение по последовательности SEQ ID1 также является мощным ингибитором экспрессии HIF-1 в печени в условиях введения два раза в неделю, что измерено посредством Q-PCR. На фиг. 7 С показано, что соединение по последовательности SEQ ID1 является мощным ингибитором экспрессии HIF-1 в почках в условиях ежедневного введения, что измерено посредством QPCR. Пример 14. Эффективность последовательности SEQ ID1 in vivo у мышей, несущих ксенотрансплантат опухолей U373. Действие обработки олигонуклеотидом на рост опухолевого ксенотрансплантата мышей nude можно измерить, используя различные клеточные линии опухолей. Примерами таких клеточных линий являются клеточные линии опухолей человека U87 (глиобластома), U373 (глиобластома), 15 РС 3 (рак предстательной железы), РС 3 (рак предстательной железы), DU145 (рак предстательной железы), LNCap (рак предстательной железы) и клеточная лини опухоли мышевидных В 16 (меланома). Обработка ксенотрансплантата подкожной опухоли мышей nude с использованием олигонуклеотидов LNA. Клетки опухоли имплантировали под кожу, затем периодически пересевали посредством трех последовательных трансплантаций. Фрагменты опухоли размером 1 мм имплантировали под кожу мышам NMRI nude с помощью иглы трокара. Альтернативно, раковые клетки, обычно от 10 Е 6 до 10 Е 7 клеток, суспендировали в 300 мкл матригеля (BD Bioscience), вводили посредством инъекции под кожу в бок мышей NMRI: nude. Мыши подвергались обработке посредством внутрибрюшинных инъекций 5 мг/кг/день. Каждую конкретную обработку мышей начинали, когда объем опухоли достигал 50 mm3. Обработку с использованием PBS начинали, когда средний объем опухоли в контрольной группе (обработка с использованием физиологического раствора) достигала 50 мм 3. Эксперимент заканчивался, когда опухоли в любой группе достигали предельно допустимых размеров. Размеры опухолей всех мышей измеряли ежедневно посредством кавернометрии. Эффект обработки определяли по размеру опухоли и скорости роста опухоли. В другом исследовании с использованием последовательности SEQ ID1, жизнеспособные кусочки опухоли донора мышиной линии U373, трансплантировали в жировую ткань яичников мышейnude (день 0). На четветый и девятый день после трансплантации мышей обрабатывали олигонуклеотидом LNA в дозировке 50 мг/кг (внутрибрюшинно). Мышей умерщвляли через 2 дня после введения последней дозы (день 11), опухоли взвешивали и окрашивали с использованием CD-31 ab (см. фиг. 8 А и 8 С). На фиг. 8 В и 8 С представлена плотность сосудов в опухолях U373 от ксенотрансплантантов, обработанных соединением по последовательности SEQ ID1. На фиг. 10D представлена экспрессия мРНКHIF-1 в опухолях U373, определенная посредством QPCR. Соединение по последовательности SEQ ID1 вводили в дозе 50 мг/кг два раза в неделю в течение одной недели в ксенотрансплантат мышей U373, имплантированный в яичники. Через два дня после введения последней дозы животных умерщвляли. Плотность сосудов определяли относительно общей площади, после окрашивания с CD31. Статистически значимое различие (Р=0,005) обнаружили между группой, обработанной физиологическим раствором, и мышами, обработанными смешанным контролем(SEQ ID12). Пример 15. Время полужизни и направленный супрессирующий эффект SEQ ID1 печени и почках. 60 самок мышей NMRI (приблизительно 25 г) разбивали на группы по 5 и вводили им внутрибрюшинно последовательность SEQ ID1 в дозе 30 мг/кг (10 мл/кг 2,5 мг/мл) в день 0, 3, 7, 10 и 14. Животных из данных групп умерщвляли на день 14. Контрольным группам вводили 0,9% физиологический раствор. Брали образцы тканей и обрабатывали реагентом RNA-later. На фиг. 11 представлено поглощение in vivo (в мкг на грамм ткани) и направленный супрессирующий эффект (% ингибирования экспрессии мРНК HIF-1a и VEGF, приведенной к экспрессии -актина) мышей, после 5 внутрибрюшинных введений соединения по последовательности SEQ ID1 в дозе 30 мг/кг. Пример 16. Продолжительность действия и поглощения олигонуклеотида LNA in vivo. Продолжительность действия: 20 самок мышей Balb/cA-nu (приблизительно по 25 г) клеточной линии рака предстательной железы РС 3 (ЕСАСС 90112714) разбивали на группы по 5 и им вводили внутрибрюшинно соединение по последовательности SEQ ID7 в дозе 25 мг/кг (10 мл/кг 2,5 мг/мл),каждый день со дня 7 по день 13. Животных из данных групп умерщвляли в первый и 5 день после введения доз. Контрольным группам вводили 0,9% физиологический раствор. Брали образцы тканей и обрабатывали реагентом RNA-later. На фиг. 10 А представлена продолжительность действия на экспрессию мРНК на день 1 и 5 после обработки. Поглощение олигонуклеотида LNA: после фиксации в формалине, данные ткани заливали парафином. Данные ткани помещали на ночь в раствор Хольта (30 г сахарозы, 1 г аравийской камеди, 15 мг тимола, дистиллированная вода до объема 100 мл) и замораживали. Срезы из замороженных тканей толщиной 4 мкм фиксировали на стекле с защитным покрытием и помещали в раствор DAPI. Флуорохром визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. На фиг. 10 В представлены результаты гистологического анализа в ткани печени, почек и опухоли мышей, обработанных fam-меченным вариантом последовательности SEQ ID1 в дозе 25 мг/кг/день в течение семи дней, и умерщвленных через 5 дней после последней обработки. Картина препаратов кожи мышей обработанных таким же способом, но умерщвленных на следующий день после последней обработки, и переэкспонированные для того, чтобы видеть слабейший контраст базальных клеток кожи (нижняя голубая линия). Эти результаты позволяют предположить следующее: Печень: окрашивание гепатоцитов, в основном локализованных в цитоплазме. Почки: очень интенсивное окрашивание проксимальных канальцев и менее интенсивное окрашивание дистальных канальцев. Опухоль: эндотелиальная клетка, макрофаги (мышиные клетки). Кожа: интенсивное окрашивание дермы (эндотелиальные клетки и макрофаги) и цитоплазмы базального слоя эпидермиса. Пример 17. Поглощение и эффективность олигонуклеотида LNA in vivo. В день 0 310-6 клеток (РС 3 и НТ 29) смешивали с 300 мкл матриксгеля и имплантировали самкам мышей Balb/cA-nu, (приблизительно по 25 г). На день 7, 10, 13, 17 мышей обрабатывали посредством внутрибрюшинного введения 5 мг/кг/день либо физиологического раствора, либо fam-меченного варианта последовательности SEQ ID1 (SEQ ID7), fam-меченного варианта последовательности SEQ ID8 (SEQ ID20). Через три дня (день 20) или 10 дней (день 27) после введения последней дозы животных умерщвляли. Контрольную группу обрабатывали 0,9% физиологическим раствором. Получали образцы тканей и хранили в реагенте RNA-later до момента определения содержания олигонуклеотидаLNA посредством ВЭЖХ или анализа даун-регуляции мРНК HIF-1a (см. фиг. 10 С-Е). Визуализация поглощения олигонуклеотида LNA: после фиксации в формалине данные ткани заливали парафином. Данные ткани помещали на ночь в раствор Хольта (30 г сахарозы, 1 г аравийской камеди, 15 мг тимола, дистиллированная вода до объема 100 мл) и замораживали. Срезы из замороженных тканей толщиной 4 мкм фиксировали на стекле с защитным покрытием и помещали в раствор DAPI. Флуорохром визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (результаты демонстрируют такое же биораспределение, как на фиг. 10 В - данные не показаны). Пример 18. In vivo изучение специфичности олигонуклеотида LNA для HIF-1 и VEGF. Исследование несовместимости. 15 самок мышей NMRI (приблизительно по 25 г) разбивали на группы по 5 и вводили им внутрибрюшинно в течение 30 с 30 мг/кг соединения по последовательности- 26014097 0,9% физиологический раствор. Животных из данных групп умерщвляли через 3-4 ч после последней инъекции. Получали образцы тканей и обрабатывали реагентом для хранения образцов RNA-later . На фиг. 11 показан in vivo направленный эндогенный супрессирующий эффект на мРНК HIF-1a иVEGF в печени, после введения каждый 3-й день 5 доз по 30 мг/кг соединения по последовательностиSEQ ID1 по сравнению с одним несовместимым контролем SEQ ID9. Пример 19. Эффективность in vivo 14-мерного варианта последовательности SEQ ID1. Самок мышей NMRI (0,025 кг) обрабатывали посредством внутрибрюшинных инъекций соединения по последовательности SEQ ID1, 5 мг/кг/день. Животные, получавшие обработку 0,9% физиологическим раствором, представлены в качестве контрольных животных. Пять животных умерщвляли через 1 или 10 дней после введения препарата. Получали образцы тканей и хранили в реагенте RNA-later до момента определения экспрессии мРНК HIF-1 а и нормализированы по бета-актину, как описано в ММ. Пример 20. Получение трехмерных культур аортальных колец. Ангиогенез изучали посредством культивирования колец аорты мыши в трехмерных коллагеновых гелях, используя способ, первоначально описанный для аорты крыс, с некоторыми модификациями(Masson et al., 2002 Biol Preoced Online 4(1) p. 24-31). Мышей hairy обрабатывали однократно посредством внутрибрюшинного введения олигонуклеотидоа LNA в диапазоне доз от 10 до 50 мг/кг. Через три дня после введения у мышей, умерщвленных посредством дислокации шейных позвоночников, удаляли грудные аорты и немедленно помещали в чашку для культивирования, содержащую ледяную средуRPMI (Invitrogen), содержащую 10% сыворотку эмбрионов крупного рогатого скота. Периаортальную фиброзножировую ткань осторожно удаляли с помощью тонких зажимов для микродиссекции и ножницами проводили иридэктомию, обращая особое внимание на то, чтобы не повредить стенку аорты. Делали срезы аортальных колец длиной один миллиметр (приблизительно 15 на аорту - при максимальной длине аорты 1,5 см) и тщательно промывали в трех последовательных отмывках в среде RPMI с FBS. Затем кольцевые эксплантаты аорты мыши в лунках 96-луночного планшета заливали 60 мкл матригеля(BD biosciences - Matrixgel: 356234). После инсерции аорты добавляли еще 40 мкл матригеля и оставляли при 37 С в течение 10 мин до застывания. В лунки добавляли 100 мкл EGM2 (Cambrix) с или без факторов роста. В качестве контроля, кольца аорты дополнительно покрывали средой EGM2, содержащей 10 мкМ циплатина. Эту среду меняли каждый второй день. Пример 21. Количественное исследование ауторадиографии всего тела у мышей после однократного внутривенного введения 3 Н-меченой последовательности SEQ ID1. Девяти самкам мышей C57B1/6J (8 недель Taconic, DK) в хвостовую вену внутривенно вводили 50 мг/кг каждого тестируемого образца, содержащего 1,5 мКи/кг соединения по последовательности 3HSEQ ID1. Удельная активность 3H-SEQ ID1 составляла 155 мкКи/мл. Объем тестируемой композиции, вводимый каждому животному, составлял 10 мл/кг. Отдельных мышей умерщвляли через 5 мин, 15 мин, 1 ч, 4 ч, 24 ч, 2 дня, 4 дней, 7 дней и 18 дней после введения каждого тестируемого образца. Для аутографии всего тела мышам давали анестезию с помощью изофлурана, а затем немедленно погружали в гексан, охлажденный с помощью сухого льда до -80 С, ABR-SOP-0130/04. Данные замороженные тела фиксировали в геле, состоящем из водной карбоксиметилцеллюлозы (CMC), замороженной в этаноле, охлажденном с помощью сухого льда (-80 С), и производили сагиттальные сечения для аутографии целого тела, согласно стандартному методу, ABR-SOP-0131/04. При температуре около -20 С с помощью криомикротома у каждого животного на разных уровнях делали срезы по 20 мкм. Полученные срезы фиксировали на пленке (Minnesota Mining and Manufacturing Co.,810) и последовательно нумеровали с помощью радиоактивных чернил. После лиофилизации при -20 С в течение приблизительно 24 ч отобранные срезы покрывали тонким слоем порошка талька и помещали на сигнальные пластины (Fuji,Japan). Срезы выбирали для люминесцентной визуализации для лучшего изображения тканей и органов,представляющих интерес. Вместе с комплектом 3 Н кралибровочных стандартов данные срезы покрывали тонким слоем порошка талька и помещали на сигнальные пластины. Благодаря низкой энергии 3 Н, порошок талька использовали вместо полимерной пленки для защиты сигнальной пластины. Эти сигнальные пластины экспонировали в течение 3-7 дней при комнатной температуре заключенными в светонепроницаемые кассеты в коробке со свинцовой защитой для предохранения от радиоактивности окружающей среды. После экспонирования данные сигнальные пластины сканировали при размере пикселей 50 мкм,используя BAS 2500 (Fuji Film Sverige АВ, Sweden). Данные ткани и органы количественно определяли,используя AIDA, версия 2.43 (Raytest, Germany). Водорастворимый раствор стандартного образца 3 Н радиоактивности смешивали с цельной кровью и использовали для получения калибровочной шкалы. Эталонные серии состояли из 10 разведений от 65,44 до 0,30 нКи/мг. Для того чтобы провести количественное определение, было сделано предположение о том, что все ткани имели плотность и характеристики быстрого охлаждения, схожие с таковыми для цельной крови. Плотность ткани устанавливали до 1 г/мл. Предел количественных показателей опре- 27014097 деляли как среднее значение концентрации в восьми измерениях для фона плюс значение стандартного отклонения для этих измерений, умноженное на три. Различные ткани и органы определяли либо по ауторадиограммам, либо по соответствующим тканевым срезам. Термин сосудистая оболочка глаза, используемый здесь, объединяет в себе пигментный эпителий сетчатки, представляющий сруктуры, содержащие меланин, хороид и склеру глаза (см. фиг. 14 А и 14 В). Пример 22. Вестерн-блоттинг клеток HUVEC, трансфицированных соединением по последовательности SEQ ID1. Клетки нормального эндотелия пупочной вены человека (HUVEC), выращенные в среде CambrixEGM2, трансфицировали, как описано в примере, используя 2 и 5 нМ соединения по последовательностиSEQ ID1 или 5 нМ соединения по последовательности SEQ ID8. После трансфекции клетки подвергали условиям гипоксии (1% кислорода) в течение 16 ч. Собранные клетки отмывали с помощью PBS и лизировали с помощью SDS, содержащего буфер для лизиса (как описано в примере). 50 мкг наносили на трис-ацетатные гели и подвергали электрофорезу при 150 В в течение 1 ч. Вестерн-блоттинг осуществляли, как описано в примере, и данный блот инкубировали в HIF-1a против человека (1:500) перед визуализацией посредством усиленной хемилюминесценции. Виден мощный супрессирующий эффект соединениея по последовательности SEQ ID1, в то время как смешанный контроль по последовательности SEQ ID8 не оказывает супрессирующий эффект на экспрессию HIF-1a в клетках HUVEC. Пример 23. Исследование in vitro образования трубок/образования капилляро-подобной структуры. Индукцию тубулогенеза осуществляли, используя матригель (Venetsanakos E, Mirza A, Fanton С etal. Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endothelial cells by glioblastoma cells. Exp Cell Res 2002; 273: 21-33). Матригель размораживали на льду для предотвращения преждевременной полимеризации; аликвоты по 50 мкл высевали в отдельные лунки 96-луночных планшетов для выращивания тканей (Nunc) и выдерживали для полимеризации при 37 С в течение по меньшей мере 30 мин. Трансфицированные клетки HUVEC отделяли посредством обработки с помощью смеси трипсин 0,05%-ЭДТА. Данные клетки отмывали с помощью среды, содержащей сыворотку крови, и затем ресуспендировали до 2-х 10 Е 5 клеток/мл. В каждую лунку с культурой добавляли 100 мкл суспендии в культуральной среде, содержащей факторы роста (VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1, hEGF с FBS (2%, трансфицированных или нетрансфицированных клеток HUVEC и гепарин (n=10). В качестве контролей использовали необработанные, трансфицированные плацебо, а также клетки HUVEC, трансфицированные олигонуклеотидом смешанного контроля (SEQ ID8). Количественный анализ доз контроля или тестируемого соединения определяли в 6-10 отдельных лунках и данные эксперименты осуществляли по меньшей мере три раза. Для количественного определения образования трубок данные лунки фотографировали (см. фиг. 13). Пример 24. FACS анализ поглощения в клетках селезенки, костного мозга и периферической крови. Самок мышей NMRI (0,025 кг) обрабатывали fam-меченным вариантом соединений по последовательностям SEQ ID1, SEQ ID7 (50 мг/кг) или эквивалентным количеством молекул Fam амидита (3 мг/кг) или 0,9% физиологичесским раствором. Животных умерщвляли через 1 час после инъекции и собирали клетки селезенки, периферической крови (1 мл, к которому добавили 1 мл PBS, содержащего 0,1% азида натрия + 50 мл сульфата гепарина-хранили на льду) или костного мозга. Селезенка. Поместить селезенку на металлическую сетку, смочить с помощью 1 мл R10 (среда для выращивания культуры тканей R10, содержащая 10% FCS), содержащей азид. Продавить ткань через сетку и промыть с помощью R10 + азид общим объемом 4 мл. Отобрать 0,5 мл суспензии ткани и выбросить оставшуюся часть. Эритроциты лизировать в суспензии посредством добавления 50 мл смеси буфера для лизиса эритроцитов и оставить при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин. При необходимости удаления остатков эритроцитов повторить этот процесс. Подсчитать и заблокировать клетки. Осадить клетки вращением и ресуспендировать в 1,0 мл буфера FACS, содержащего азид. Принять число клеток для блокирования равным 5106 клеток на селезенку и добавить CD16/CD32 мыши 5 мкл на миллион клеток (добавлено 25 мкл блокировочной системы). Периферическая кровь. Эритроциты лизировать посредством добавления 50 мл раствора для лизиса эритроцитов. Клетки осадить вращением и при необходимости этот процесс повторить. Клетки отмыть один раз с помощьюPBS, ресуспендировать и подсчитать. Неспецифическое связывание антител блокировать посредством добавления CD16/CD32 мыши в количестве 5 мкл на миллион клеток. Оставить при комнатной температуре в течение 10 мин, затем перейти к окрашиваниям линий клеточной дифференцировки. Костный мозг. Надрезать кость как можно ближе к каждому концу, используя стерильные ножницы. Набрать 1 мл стерильного PBS- в 1 мл шприц, оснащенный иглой 25G. Ввести иглу в один конец кости - обычно проще всего на изгибе - и промыть кость с помощью PBS. Повторять до тех пор, пока кость не станет чистой. Пропустить костный мозг через иглу несколько раз для разрушения костного мозга. Если не увере- 28014097 ны в количестве эритроцитов, можно использовать этап лизиса клеток, как описано выше. Подсчитать и блокировать клетки, как описано выше. На льду поместить 150000 клеток в стерильную пробирку типа эппендорф для культивирования костного мозга. Окрашивание FACS. Окрашивание линий клеточной дифференцировки осуществляли, используя специфические маркеры. Как описано: Эти окрашивания осуществляли в 96 лунках, и общее число 100 мкл блокированных клеток были окрашены с помощью 100 мкл красящей смеси (либо контрольные изотипы, либо специфические маркеры линий клеточной дифференцировки). Эти окрашивания осуществляли на льду и оставляли на 30 мин. Клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 2000 об/мин. Супернатант отсасывали и клетки отмывали с помощью 200 мкл буфера FACS и повторяли этап центрифугирования. Всего отмывали три раза. На завершающей стадии данные клетки ресуспендировали в 200 мкл буфера FACS и добавляли в пробирку, в которой уже содержится 200 мкл FACS + 5 мкл 7AAD. Анализ FACS проводили с помощью Becton Dickinson FACS Calibur (см. фиг. 15). Эндотелиальные клетки, гранулоциты и CD4+ лимфоциты, и макрофаги периферической крови и дендритные клетки и гранулоциты костного мозга, и гранулоциты селезенки окрашиваются положительно для FAM-мечения после пяти дней применения соединения по последовательности SEQ ID7. Пример 25. Hif-1 и содержание олигонуклеотида по последовательности SEQ ID1 в тканях человекообразных обезьян. Главным образом для токсикологического исследования в тканях человекообразных обезьян, в том числе печени и почек, образцы моментально замораживали и хранили при -70 С для последующего анализа (см. фиг. 16 А и 16 В). Этих обезьян обрабатывали посредством внутривенного введения 0, 6, 10 и 40 мг/кг/случай два раза в неделю в течение четырех недель. В группах животных, получавших 0, 10 и 40 мг/кг/случай, некоторых животных оставляли без обработки на 4-недельный период восстановления. РНК выделяли из образцов, как описано в примере 13, и содержание мРНК HIF-1a определяли, как описано в примере 8 (смотри фиг. 16 А). Содержание олигонуклеотида определяли, как описано ниже(см. фиг. 16 В). Приготовление образца: выделение из тканей печени и почек. Химические вещества/реагенты: Протеиназа К (25,1 мг/мл): Sigma P4850. Смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1 (об./об./об.), насыщенная 10 мМ Трис, рН: 8,0, 1 мМ ЭДТА: Sigma Р 2069. Игепал СА-630: Sigma, 18896. Буфер для экстракции: 0,5% Игепал СА-630, 25 мМ Трис рН 8,0, 25 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, рН 8,0(доводили с помощью 1 N NaOH). 1 мг/мл протеиназы К в буфере для экстракции: готовят перед каждым выделением. Ткани (100 мг) взвешивают (ткань хранят на сухом льду перед и после взвешивания). Добавляют 500 мкл буфера для экстракции, содержащего протеиназу К (1 мг/мл). Данную ткань механически гомогенизируют и гомогенат инкубируют при 37 С в течение ночи. Эталонные образцы получают посредством растворения соединения по последоватлеьности SEQ ID2 в буфере для экстракции в соответствующем интервале концентрации. Взвешивают ровно 100 мг ткани печени животных, не подвергавшихся обработке (хранить на сухом льду перед и после взвешивания). Буфер для экстракции (с протеиназой К, 1 мг/мл), содержащий эталонный материал, добавляют к образцам ткани до общего объема 0,5 мл. Данную ткань механически гомогенизируют и инкубируют при 37 С в течение ночи. Сигнал обнаружения соединения по последовательности SEQ ID2 в этих образцах использовали для построения калибровочной кривой, перекрывающей самые низкие и самые высокие концентрации, обнаруженные у животных, подвергавшихся обработке.