Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, обладающая антирепрессорной активностью, и способы ее применения

011747 Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Конкретнее настоящее изобретение относится к средствам и способам усовершенствования получения одной или нескольких нуклеиновых кислот, которые могут кодировать белки в клетке-хозяине. Белки могут продуцироваться в различных клетках-хозяевах для широкого ряда применений в биологии и биотехнологии, например, в качестве биологических фармацевтических препаратов. Хорошо разработаны способы такого получения, и в основном они включают экспрессию в клетке-хозяине нуклеиновой кислоты (также относится к трансгену), кодирующей интересующий белок. Одной проблемой, связанной с экспрессией трансгенов, является то, что невозможно спрогнозировать, с большой долей вероятности, что трансген станет неактивным в результате молчания гена(McBurney et al., 2002), и, следовательно, необходимо тестировать многие клоны клеток-хозяев на высокую экспрессию трансгена. Кроме того, даже при установлении такого клона экспрессия трансгена часто является нестабильной, и часто наблюдают такое явление, как молчание экспрессии трансгена во время продолжительного культивирования клетки-хозяина. В клетках позвоночных это может быть вызвано образованием гетерохроматина в локусе трансгена, который препятствует протеканию транскрипции трансгена (Whitelaw et al., 2001). Молчание трансгена является вероятностным; оно может возникнуть вскоре после интеграции трансгена в геном или только после ряда клеточных делений. Это приводит к образованию неоднородных популяций клеток после продолжительного культивирования, когда некоторые клетки продолжают экспрессировать высокие уровни рекомбинантного белка, в то время как другие экспрессируют низкие или необнаруживаемые уровни количества белка (MartinWhitelaw, 1996;McBurney et al., 2002). Клеточную линию, которую используют для продукции гетерологичного белка,получают из одной клетки, часто размноженной до и поддерживаемой в течение длительного периода времени при плотности клеток более 10 млн клеток на мл в культиваторах емкостью 1000 л или более. Данные большие клеточные популяции (1014-1016 клеток) проявляют склонность к значительному падению продуктивности в результате молчания трансгена (Migliaccio et al., 2000; Strutzenberger et al.,1999). Одной возможностью для преодоления описанных выше проблем является применение так называемых последовательностей STAR в экспрессирующей системе. В заявке WO 03/004704 описан ряд таких последовательностей STAR. Данные последовательности можно использовать для повышения предсказуемости, выхода и/или стабильности продукции белка при использовании экспрессирующих конструкций в некоторых типах клеток-хозяев (WO 03/004704; Kwaks et al., 2003). В международной публикации WO 03/106674 описывается применение последовательностей STAR для экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные белки в некоторых клеточных линиях. В международной публикации WO 03/106684 описывается применение последовательностей STAR для экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих мультимерные белки, такие как антитела. Настоящее изобретение направлено на обеспечение альтернативных средств и способов повышения продукции белка. Сущность изобретения В одном аспекте изобретение относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиново-кислотную последовательность, обладающую антирепрессорной активностью, выбранную из группы, состоящей из: а) последовательности SEQ ID No: 66; b) фрагментов последовательности SEQ ID No: 66, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b),где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из a)-c); где указанная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит экспрессирующую кассету, где указанная экспрессирующая кассета включает гетерологичный промотор, связанный с интересующей нуклеиновой кислотой, и где указанная интересующая нуклеиновая кислота предпочтительно кодирует весь или часть интересующего белка. В предпочтительном варианте осуществления указанная нуклеиново-кислотная последовательность, обладающая антирепрессорной активностью, расположена слева от указанного промотора в указанной экспрессирующей кассете, и в особо предпочтительных вариантах осуществления указанная последовательность, обладающая антирепрессорной активностью, и указанный промотор разделены менее чем 2 т.п.н. В некоторых вариантах осуществления указанная нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий белок, находится в мультицистронном гене, дополнительно кодирующем селектируемый маркерный ген. В некоторых вариантах осуществления указанная молекула дополнительно содержит по меньшей мере одну другую последовательность, обладающую антирепрессорной активностью, где указанная по меньшей мере одна другая последовательность выбрана из: а) любой из последовательностей SEQ ID No: 1-65;b) фрагментов любой из последовательностей SEQ ID No: 1-65, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; c) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b), где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из а)-с). Изобретение также относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессирующую кассету,-1 011747 включающую 5' - антирепрессорную последовательность А - промотор - нуклеиновую кислоту, кодирующую весь или часть интересующего белка - антирепрессорную последовательность В - 3', где антирепрессорные последовательности А и В могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из: i) любой из последовательностей SEQ ID No: 1-65; ii) фрагментов любой из последовательностей SEQ ID No: 1-65, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; iii) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b), где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и iv) комплементарной последовательности к одному из i)-iii), отличающейся тем, что указанная экспрессирующая кассета дополнительно включает между указанными антирепрессорными последовательностями А и В последовательность, обладающую антирепрессорной активностью, выбранную из группы, состоящей из: а) последовательности SEQ ID No: 66; b) фрагментов последовательности SEQ ID No: 66, где указанный фрагмент обладает антирепрессорной активностью; с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b), где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из а)-с). Изобретение дополнительно относится к клетке, содержащей молекулу по изобретению. Предпочтительно указанная клетка является клеткой млекопитающих, и в некоторых вариантах осуществления данная клетка представляет клетку СНО. Изобретение дополнительно относится к способу получения интересующего белка, включающему культивирование клетки, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок, для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок в указанной клетке, отличающемуся тем, что указанная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеиново-кислотную последовательность, обладающую антирепрессорной активностью, выбранную из группы, состоящей из: а) последовательности SEQ ID No: 66; b) фрагментов последовательности SEQ ID No: 66, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности a) или b), где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из а)-с). В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает выделение указанного интересующего белка. В предпочтительных вариантах осуществления указанная нуклеиново-кислотная последовательность, обладающая антирепрессорной активностью, расположена слева от промотора, который контролирует экспрессию интересующего белка. В его предпочтительном варианте осуществления указанная последовательность, обладающая антирепрессорной активностью, и указанный промотор разделены менее чем 2 т.п.н. В некоторых вариантах осуществления указанная нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий белок, находится в мультицистронном гене, дополнительно кодирующем селектируемый маркерный ген. В некоторых вариантах осуществления указанная клетка является клеткой млекопитающего, например клеткой СНО. Изобретение также относится к применению нуклеиново-кислотной последовательности, обладающей антирепрессорной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: а) последовательности SEQ ID No: 66; b) фрагментов последовательности SEQ ID No: 66, где указанный фрагмент обладает антирепрессорной активностью; с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b), где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из а)-с), для повышения экспрессии интересующей нуклеиновой кислоты. В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения клетки-хозяина, экспрессирующей два интересующих полипептида, где способ включает: а) введение в клетку-хозяин одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, где молекула или молекулы нуклеиновой кислоты вместе содержат: i) промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей первый интересующий полипептид и первый селектируемый маркерный ген, и ii) промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей второй интересующий полипептид и второй селектируемый маркерный ген, и iii) по меньшей мере одну последовательность, обладающую антирепрессорной активностью, выбранную из группы, состоящей из: (а) любой из последовательностей SEQ ID No: 1-66; (b) фрагментов любой из последовательностей SEQ ID No: 1-66, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; (с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности (а) или (b) и обладают антирепрессорной активностью; и (d) комплементарной последовательности к одному из (а)-(с); b) селекцию клетки-хозяина, по существу, одновременным отбором по экспрессии указанного первого и второго селектируемых маркерных генов. Изобретение также относится к способу экспрессии двух интересующих полипептидов, где способ включает культивирование клетки-хозяина, полученной способом по данному аспекту изобретения, для экспрессии первого и второго полипептидов и необязательно выделение указанных полипептидов. В одном варианте осуществления изобретения указанная последовательность, обладающая антирепрессорной активностью,выбрана из группы, состоящей из: а) последовательности SEQ ID No: 66; b) фрагментов последовательности SEQ ID No: 66, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; с) последова-2 011747 тельностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности а) или b),где указанные последовательности обладают антирепрессорной активностью; и d) комплементарной последовательности к одному из а)-с). В некоторых вариантах осуществления указанные два полипептида являются частью мультимерного белка. Подробное описание изобретения Антирепрессорные последовательности. Последовательности, обладающие антирепрессорной активностью, в том смысле, в котором здесь используется данный термин, представляют последовательности, которые способны, по меньшей мере,частично противодействовать репрессивному эффекту белков НР 1 или НРС 2, когда данные белки связываются с ДНК. Последовательности, обладающие антирепрессорной активностью (в некоторых случаях также относящиеся здесь к антирепрессорным последовательностям или антирепрессорным элементам),подходящие для настоящего изобретения, раскрыты в WO 03/004704, включенной здесь для сведения, и названы здесь последовательностями STAR (там, где последовательность относится к последовательности STAR, то данная последовательность обладает антирепрессорной активностью по изобретению). В качестве неограничивающего примера последовательности из 65 антирепрессорных элементов, названные STAR1-65 (см. WO 03/004704), представлены здесь соответственно последовательностями SEQ IDNo: 1-65. Согласно изобретению функциональный фрагмент или производное данного антирепрессорного элемента рассматривается равноценным указанному антирепрессорному элементу до тех пор, пока он по-прежнему обладает антирепрессорной активностью. Наличие такой антирепрессорной активности может легко проверить специалист в данной области, например, тестом, описанным ниже. Функциональные фрагменты или производные могут легко получить специалисты в области молекулярной биологии,начав с данной антирепрессорной последовательности и осуществив делеции, добавления, замены, инверсии и т.п. (например, см. WO 03/004704). Функциональный фрагмент или производное также включает ортологи от других видов, которые можно найти с использованием известных антирепрессорных последовательностей, способами, хорошо известными специалистам в данной области (например, см. WO 03/004704). Следовательно, настоящее изобретение включает фрагменты антирепрессорных последовательностей, где указанные фрагменты по-прежнему обладают антирепрессорной активностью. Для фрагментов данной последовательности процентная идентичность относится к той части стандартной природной последовательности, которая обнаружена во фрагменте. Изобретение также включает последовательности, которые по меньшей мере на 70% идентичны по нуклеотидной последовательности указанным последовательностям, обладающим антирепрессорной активностью, или их функциональным фрагментам, обладающим антирепрессорной активностью, при условии, что данные последовательности,которые по меньшей мере на 70% идентичны, по-прежнему обладают антирепрессорной активностью по изобретению. Предпочтительно указанные последовательности по меньшей мере на 80% идентичны,более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичны и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны стандартной природной последовательности или ее функциональному фрагменту. Последовательности, обладающие антирепрессорной активностью по изобретению, можно получить различными способами, включая, но не ограничиваясь клонированием из человеческого генома или из генома другого организма, или, например, амплификацией известных антирепрессорных последовательностей, непосредственно из такого генома при использовании информации о последовательностях,например, ПЦР, или их можно частично или полностью синтезировать химическим путем. Последовательности, обладающие антирепрессорной активностью, и их функциональные фрагменты или производные здесь определяют структурно по их последовательности и в дополнении определяют функционально в качестве последовательностей, обладающих антирепрессорной активностью, что можно оценить тестом, описанным ниже. Любая последовательность, обладающая антирепрессорной активностью по настоящему изобретению, должна, по меньшей мере, быть способной сохраняться в следующем функциональном тесте (см.WO 03/004704, пример 1, включенную здесь для сведения). Человеческие клетки U-2 OS (ATCC НТВ-96) стабильно трансфицируют плазмидой pTet-Off (Clontech K1620-A) и нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок LexA-репрессор, содержащий связывающийся с ДНК домен LexA, и кодирующую область НР 1 или НРС 2 (группа белков Polycomb дрозофилы, которые подавляют экспрессию гена при связывании с ДНК; тест функционирует с любым гибридным белком) под контролем транскрипционной регуляторной системы Tet-Off (Gossen and Bujard, 1992). Данные клетки относятся ниже к репортерным клеткам для постановки теста определения антирепрессорной активности. Репортерная плазмида, которая обеспечивает резистентность к гигромицину, содержит последовательность полилинкера, расположенную между четырьмя сайтами оператора LexA и промотором SV40, который контролирует ген резистентности к зеоцину. Последовательность, предназначенную для тестирования на антирепрессорную активность, можно клонировать в указанный полилинкер. Конструирование подходящей репортерной плазмиды, такой как pSelect, описано в примере 1 и на фиг. 1 заявки WO 00/004704. Репортерную плазмиду трансфицируют в репортерные клетки и клетки культивируют при селекции гигромицином(25 мкг/мл; селекция на присутствие репортерной плазмиды) и репрессии тетрациклином (доксициклин,10 нг/мл; подавляет экспрессию гибридного белка LexA-репрессора). Через 1 неделю культивирования в таких условиях концентрация доксициклина снижается до 0,1 нг/мл (или ниже) с индукцией гена LexAрепрессора, и через 2 суток добавляют зеоцин до концентрации 250 мкг/мл. Клетки культивируют в течение 5 недель до тех пор, пока контрольные культуры (трансфицированные пустой репортерной плазмидой, т.е. без клонированной антирепрессорной последовательности в полилинкере) погибают в результате действия зеоцина (в данной контрольной плазмиде промотор SV40 репрессируется гибридным белком LexA-репрессором, который связывается с оперативными сайтами LexA, приводя к недостаточной экспрессии зеоцина в таких клетках для выживания при селекции зеоцином). Последовательность обладает антирепрессорной активностью по настоящему изобретению в тех случаях, когда указанную последовательность клонируют в полилинкер репортерной плазмиды, и репортерные клетки выживают в течение 5 недель отбора в присутствии зеоцина. Клетки из таких колоний могут по-прежнему размножаться на новой среде, содержащей зеоцин, через 5 недель после отбора по зеоцину, в то время как клетки, трансфицированные репортерными плазмидами, без антирепрессорных последовательностей не могут размножаться на новой среде, содержащей зеоцин. Любую последовательность, не способную к такому росту через 5 недель в присутствии зеоцина в данном тесте, не определяют в качестве последовательности, обладающей антирепрессорной активностью, или ее функционального фрагмента или функционального производного по настоящему изобретению. В качестве примера известные ограниченные последовательности, такие как тестированные Van der Vlag et al. (2000), включая scs дрозофилы (Kellumand Schedl, 1991), 5'-HS4 локус птичьего -глобина (Chung et al., 1993, 1997) или области присоединения матрикса (MAR) (Phi-Van et al., 1990), не проходят данный тест. Кроме того, предпочтительно, чтобы антирепрессорная последовательность или ее функциональный фрагмент или производное придавали большее количество клонов с гиперэкспрессией репортера при фланкировании гена-репортера (например, люциферазы, GFP), который интегрируют в геном клетокU-2 OS или СНО, по сравнению с указанным геном-репортером, который не фланкирован антирепрессорными последовательностями или фланкирован последовательностями с более слабой блокирующей репрессию активностью, такими как scs дрозофилы. Это можно проверить с использованием, например,вектора pSDH или аналогичных векторов, как описано в примере 1 и на фиг. 2 заявки WO 03/004704. Антирепрессорные элементы по изобретению могут иметь по меньшей мере одно из трех последствий в отношении продукции белка: 1) они повышают прогнозируемость идентификации линий клетокхозяев, которые экспрессируют белок на промышленно приемлемых уровнях; 2) они приводят к получению линий клеток-хозяев с повышенным выходом белка и/или 3) они приводят к получению линий клеток-хозяев, которые проявляют более стабильную продукцию белка во время продолжительного культивирования. Каждое из данных качеств более подробно обсуждается ниже. 1) Повышенная прогнозируемость: интеграция экспрессирующих трансген кассет может происходить в случайных положениях в геноме клетки-хозяина. Однако большая часть генома представляет транскрипционно молчащий гетерохроматин. Когда экспрессирующие кассеты включают антирепрессорные элементы, фланкирующие трансген, то положение интеграции имеет незначительное влияние на экспрессию. Антирепрессорные элементы снижают способность смежного гетерохроматина к умалчиванию трансгена. Следовательно, увеличивается относительное количество содержащих трансген клеток-хозяев с экспрессией на приемлемом уровне. Действительно, включение антирепрессорных последовательностей приводит к получению колоний в 10 раз больше, по сравнению с тем же трансгеном без антирепрессорных последовательностей, когда трансфицируется тоже количество ДНК. 2) Выход: оценивали уровень экспрессии белка в первичных популяциях рекомбинантных клетокхозяев непосредственно после интеграции трансгена. Уровень экспрессии у отдельных клонов в популяции варьировал. Однако когда трансгены были защищены антирепрессорными элементами, то вариабельность снижалась. Данная пониженная вариабельность наиболее заметно проявляется в том, что получают меньшее число клонов с низким уровнем экспрессии. Кроме того, популяции с антирепрессорными элементами, как правило, имеют отдельные клоны с очень высокой экспрессией. Данные отдельные клоны с высоким выходом пригодны для продукции белков либо в целях получения, либо в целях изменения фенотипа клетки или организма, включающего такие клетки. 3) Повышенная стабильность: антирепрессорные элементы повышают стабильность трансгенов в линиях рекомбинантных клеток-хозяев обеспечением того, что трансгены не становятся транскрипционно молчащими во время продолжительного культивирования. В сравнительных исследованиях было показано, что в условиях, при которых трансгены не защищены антирепрессорными элементами, они прогрессивно молчат (5-25 пассажей при культивировании), в то время как защищенные антирепрессорными элементами трансгены продолжают экспрессироваться на высоких уровнях. Это является преимуществом для промышленного получения белковых молекул, во время которого культивирование клеток продолжается в течение продолжительных периодов времени от нескольких недель до многих месяцев. Аналогично, стабильность экспрессии в течение продолжительных периодов времени может быть преимущественной для растений или животных с измененными фенотипами в результате рекомбинантной экспрессии защищенных антирепрессорными элементами трансгенов.STAR67. Настоящее изобретение относится к новой последовательности, обладающей антирепрессорной активностью, которой дали название STAR67 (SEQ ID No: 66). Данная антирепрессорная последовательность уже в большой степени повышает экспрессию, когда ее помещают только слева от промотора, регулирующего экспрессию интересующего гена, как следует из представленных здесь примеров, в то время как оказалось, что известные к настоящему времени сильные антирепрессорные последовательности,такие как STAR6 или STAR7, обеспечивают меньшее преимущество в данной конфигурации (они функционируют особенно хорошо, когда фланкируют трансген, т.е. когда находятся как слева, так и справа от трансгена). Следовательно, STAR67 обеспечивает альтернативу для уже известных антирепрессорных последовательностей, и при расположении слева от промотора, обладает повышенным преимуществом,по сравнению с известными антирепрессорными последовательностями. STAR67 не является блокатором энхансера в противоположность другим антирепрессорными последовательностям, тестированным на данное свойство (Kwaks et al., 2003), обеспечивая другое отличие между STAR67 и другими антирепрессорными последовательностями, раскрытыми ранее. Кроме того, STAR67 может функционировать в двух направлениях, как показано в примере 7. По изобретению наличие последовательности STAR67 в экспрессирующей кассете обеспечивает повышенную прогнозируемость, и/или выход, и/или стабильность экспрессии. Здесь показано, что STAR67 является функциональной в комбинации с различными промоторами и в различных клеточных линиях. Экспрессирующая кассета. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, содержащая STAR67, может находиться в любой форме, например, в виде фрагмента ДНК, необязательно присутствующего в клонирующем векторе, таком как плазмида, предпочтительно экспрессирующем векторе, и ее можно применять, например, для целей клонирования с использованием обычной технологии рекомбинантной ДНК. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит экспрессирующую кассету, которая является пригодной для экспрессии интересующих последовательностей, например, в клеткаххозяевах. Экспрессирующая кассета, в том смысле, в котором здесь используется данный термин, представляет нуклеиново-кислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с последовательностью, экспрессия которой является желательной, где данная последовательность, экспрессия которой является желательной, предпочтительно представляет открытую рамку считывания, кодирующую весь или часть интересующего белка. Предпочтительно промотор представляет гетерологичный промотор по отношению к интересующей нуклеиновой кислоте, в результате чего гетерологичный промотор определяется как промотор, который не является природным промотором указанной интересующей последовательности. Другими словами, осуществляется некоторая форма вмешательства человека, например, молекулярное клонирование, на любой временной точке для получения функциональной комбинации гетерологичного промотора с интересующей нуклеиновой кислотой, и легко понять в данном контексте, что гетерологичный промотор может быть получен из того же или из другого организма, что и интересующая последовательность. Предпочтительно экспрессирующая кассета дополнительно содержит последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования. Могут быть также включены другие регуляторные последовательности, такие как энхансеры. Экспрессирующие единицы по изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одну антирепрессорную последовательность, такую как STAR67. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанную антирепрессорную последовательность, предпочтительно STAR67, помещают слева от указанного промотора, предпочтительно так, чтобы присутствовало менее чем 2 т.п.н. между 3'-концом антирепрессорной последовательности и началом последовательности промотора. В предпочтительных вариантах осуществления менее чем 1 т.п.н., более предпочтительно менее чем 500 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее чем примерно 200, 100, 50 или 30 нуклеотидов находилось между 3'-концом антирепрессорной последовательности и началом последовательности промотора. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антирепрессорную последовательность клонируют непосредственно слева от промотора, что приводит к расстоянию примерно 0-20 нуклеотидов между 3'-концом антирепрессорной последовательности и началом последовательности промотора. Специалистам в данной области хорошо известно, что для получения экспрессии нуклеиновокислотных последовательностей, кодирующих рекомбинантный белок, последовательности, способные регулировать такую экспрессию, могут быть функционально связаны с нуклеиново-кислотными последовательностями, кодирующими белок, давая молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие рекомбинантный белок в экспрессируемой форме. В основном последовательность промотора помещают слева по отношению к последовательностям, кодирующим интересующий белок. В данной области имеются подходящие экспрессирующие векторы, например, серии векторов pcDNA и pEF производства Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg производства BD Sciences, pCMV-Script производстваStratagene, и т.д. В тех случаях, когда последовательность, кодирующую интересующий полипептид, вставляют правильно по отношению к последовательностям, регулирующим транскрипцию и трансляцию кодируемого-5 011747 полипептида, то полученная экспрессирующая кассета пригодна для получения интересующего белка, в отношении экспрессии. Последовательности, регулирующие экспрессию, могут включать промоторы,энхансеры и т.п. и их комбинации. Они должны быть способны функционировать в клетке-хозяине, тем самым, регулируя экспрессию нуклеиново-кислотных последовательностей, которые функционально связаны с ними. Специалисты в данной области знают, что можно использовать различные промоторы для обеспечения экспрессии интересующего гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получить из различных источников, включая вирусы, прокариотические или эукариотические источники, или созданные искусственно. Экспрессия интересующих нуклеиновых кислот может быть с природного промотора или его производного, или с полностью гетерологичного промотора (Kaufman, 2000). Некоторые хорошо известные и широко применяемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают промоторы, полученные из вирусов, таких как аденовирусы, например, промотор Е 1 А, промоторы, полученные из цитомегаловирусов (CMV), таких как немедленный ранний промотор CMV (IE) (здесь относится к промотору CMV) (полученному,например, из pcDNA, Invitrogen), промоторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40) (Das et al., 1985),и т.п. Подходящие промоторы можно также получить из эукариотических клеток, такие как промоторы металлотионеина (МТ), промотор фактора элонгации 1a (EF-1) (Gill et al., 2001), промотор убиквитина С или UB6 (Gill et al., 2001; Schorpp et al., 1996), промотор актина, промотор иммуноглобулина, промоторы теплового шока и т.п. Некоторыми предпочтительными промоторами для обеспечения экспрессии в эукариотических клетках, которые являются подходящими промоторами в настоящем изобретении, являются CMV-промотор, EF1-альфа-промотор млекопитающих, промотор убиквитина млекопитающих,такой как промотор убиквитина С, или промотор SV40 (например, полученный из pIRES, номер по каталогу 631605, BD Sciences). Тестирование функции промотора и силы промотора является обычной практикой для специалистов в данной области, и в основном оно может, например, включать клонирование тестируемого гена, такого как lacZ, люциферазы, GFR и т.д., за последовательностью промотора, и постановку теста на экспрессию тестируемого гена. Конечно, промоторы можно изменить делецией, добавлением, мутацией его последовательностей и тестировать на функциональность для поиска новых, аттенуированных или усовершенствованных промоторных последовательностей. Экспрессирующая кассета по изобретению может быть моноцистронной, бицистронной или мультицистронной. Термин бицистронный ген определяется как ген, способный обеспечивать молекулу РНК, которая кодирует два белка/полипептида. Термин моноцистронный ген определяется как ген,способный обеспечивать молекулу РНК, которая кодирует один белок/полипептид. Термин мультицистронный ген определяется как ген, способный обеспечивать молекулу РНК, которая кодирует два или несколько белков/полипептидов и, следовательно, бицистронный ген входит в определение мультицистронного гена. Ген, в том смысле, в котором используется данный термин в настоящем изобретении,может включать хромосомную ДНК, кДНК, искусственную ДНК, их комбинации и т.п. и также может быть в форме другой нуклеиновой кислоты, например, РНК. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая белок единица включает мультицистронный ген. Единицы, содержащие несколько цистронов, могут транскрибироваться в виде одной мРНК. Трансляцию второй и последующих кодирующих областей, присутствующих в такой РНК, можно обеспечить различными путями, включая применение сайтов реинициации трансляции или внутренних сайтов входа рибосом, из которых последний является предпочтительным. Одно преимущество би- и мультицистронных единиц заключается в простой селекции клонов, экспрессирующих интересующий белок, помещением нуклеиновой кислоты, кодирующей селектируемый маркерный белок справа от нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок или полипептид. Для получения мультимерных белков можно использовать две или несколько экспрессирующих кассет. Было показано, что данный вариант осуществления дает хорошие результаты, например, для экспрессии тяжелой и легкой цепи антител. По изобретению по меньшей мере одна из экспрессирующих кассет и предпочтительно каждая из них должна включать последовательность STAR. В другом варианте осуществления различные субъединицы или части мультимерного белка находятсяв одной экспрессирующей кассете. Вместо или в дополнение к наличию антирепрессорной последовательности, помещенной слева по отношению к промотору в экспрессирующей кассете, было показано, что очень преимущественно обеспечить антирепрессорную последовательность с обоих концов экспрессирующей кассеты, так, чтобы экспрессирующая кассета, содержащая трансген, была фланкирована двумя антирепрессорными последовательностями, которые в некоторых вариантах осуществления в основном идентичны друг другу. Конечно, это также можно сделать со STAR67 для получения экспрессирующей кассеты, фланкированной двумя последовательностями STAR67. Также возможны альтернативные положения одной последовательности STAR67 в экспрессирующей кассете, например, за трансгеном, предпочтительно за последовательностью терминации транскрипции и сигналом полиаденилирования, притом, что 3'-конец последовательности STAR67 обращен к трансгену. Экспрессирующая кассета по изобретению может необязательно содержать селективный маркерный ген. Термин селективный маркер или селектируемый маркер обычно используют при обращении-6 011747 к гену и/или белку, присутствие которых можно детектировать прямо или опосредованно в клетке, например, ген и/или белок, который инактивирует агент селекции и защищает клетку-хозяин от летального или ингибирующего рост действия агента (например, ген и/или белок резистентности к антибиотику). Другая возможность заключается в том, что указанный селективный маркер индуцирует флуоресценцию или окраску (например, белок и производные с зеленой флуоресценцией, люцифераза, lacZ, щелочная фосфатаза и т.д.). В некоторых вариантах осуществления селективный маркер, используемый для изобретения, представляет собой зеоцин, и для отбора второй экспрессирующей кассеты используют пуромицин. Специалистам в данной области известно, что имеются и можно использовать другие селективные маркеры, например неомицин, бластицидин, пуромицин, блеомицин, гигромицин, dhfr и т.д. Термин селекция обычно определяется как способ применения селективного маркера/селектируемого маркера и агента селекции для идентификации клеток-хозяев со специфическими генетическими свойствами (например, если клетка-хозяин содержит трансген, интегрированный в ее геном). Специалистам в данной области очевидно понятно, что возможны многочисленные комбинации селективных маркеров. Пример возможного антибиотика приведен выше. Одним наиболее преимущественным антибиотиком является зеоцин, поскольку белок резистентности к зеоцину (зеоцин-R) функционирует при связывании лекарственного препарата и делает его безвредным. Следовательно, легко оттитровать количество препарата, которое приводит к гибели клеток с низким уровнем экспрессии зеоцинаR, в то же время позволяя выжить клеткам с высокой экспрессией. Все другие белки резистентности к антибиотикам в основном являются ферментами и, таким образом, действуют каталитически (не в соотношении 1:1 с препаратом). Когда проводят двухстадийный отбор, то, следовательно, предпочтительно использовать белок резистентности к антибиотикам при данном связывающем механизме действия 1:1. Следовательно, антибиотик зеоцин является предпочтительным селективным маркером. Для удобства антибиотик зеоцин в двухстадийном способе отбора можно объединить, например, с пуромицином, бластицидином или гигромицином, которые могут, например, находиться в моноцистронном гене. Также является возможным объединить селективный антибиотик-маркер с селективным маркером,который обеспечивает индукцию флуоресценции или который обеспечивает окраску. Можно использовать различные маркеры при условии, что они функционируют в используемой клетке. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета содержит (слабый) внутренний сайт связывания с рибосомой (IRES) в качестве примера сайта инициации трансляции белка с пониженной эффективностью трансляции, например, между открытой рамкой считывания интересующего белка и открытой рамкой считывания селективного маркера. Трансляция белков с элементов IRES является менее эффективной, по сравнению с кэп-зависимой трансляцией: количество белка с IRES-зависимых открытых рамок считывания (ORF) составляет менее чем 20-50% от количества с первой ORF (Mizuguchiet al., 2000). Кроме того, мутация элементов IRES может ослабить их активность и снизить экспрессию сIRES-зависимых ORF до менее 10% от первой ORF (Lopez de QuintoMartinez-Salas, 1998; Rees et al.,1996). В тех случаях, когда IRES-зависимая ORF кодирует селектируемый маркерный белок, то его относительно низкий уровень трансляции означает, что должны иметь место высокие абсолютные уровни транскрипции для отбора рекомбинантной клетки-хозяина. Следовательно, отобранные изоляты клеткихозяина будут обязательно экспрессировать высокие количества мРНК трансгена. Поскольку рекомбинантный белок транслируется с кэп-зависимой ORF, то он может продуцироваться в избытке с высоким выходом продукта. Обычные экспрессирующие системы представляют молекулы ДНК в виде рекомбинантной плазмиды или рекомбинантного вирусного генома. Плазмиду или вирусный геном вводят в (эукариотический хозяин) клетки и предпочтительно интегрируют в их геном способами, известными в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления в настоящем изобретении также используются данные типы молекул ДНК для доставки ее улучшенной системы для экспрессии трансгена. Предпочтительный вариант осуществления изобретения представляет применение плазмидной ДНК для доставки экспрессирующей системы. Плазмида содержит ряд компонентов: обычные компоненты, известные в данной области, представляют точку начала репликации и селектируемый маркер для размножения плазмиды в бактериальных клетках; селектируемый маркер, который функционирует в эукариотических клетках для идентификации и выделения клеток-хозяев, которые несут интегрированную систему для экспрессии трансгена; нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий белок, транскрипция которой на высоком уровне обеспечивается промотором, который функционирует в эукариотических клетках (например, основной немедленный ранний промотор/энхансер человеческого цитомегаловируса, pCMV (Boshart et al.,1985; и терминаторы транскрипции (например, сайт полиаденилирования SV40 (KaufmanSharp,1982 интересующего трансгена и селектируемого маркера. Используемый вектор может быть любым вектором, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции интересующей нуклеиновой кислоты. В тех случаях, когда используются клетки-хозяева, то предпочтительно, чтобы вектор представлял собой интегрирующий вектор. Альтернативно, вектор может быть эписомально реплицирующимся вектором. Некоторые неограничивающие схематичные представления возможных конфигураций экспрессирующих кассет представлены на фиг. 1. Это конфигурация ДНК-элементов экспрессирующих кассет в-7 011747 плазмиде, а также после интеграции в геном. Конструкция А включает экспрессирующую единицу, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок (ген). Это слева от аттенуированногоEMCV IRES (Martinez-Salas et al., 1999; Mizuguchi et al., 2000; Rees et al., 1996) и открытой рамки считывания, кодирующей селектируемый белок-маркер резистентности к зеоцину (зео). Генная кассета имеет терминатор транскрипции SV40 на ее 3'-концах (t). Данный бицистронный трансген транскрибируется на высоком уровне с промотора CMV. Конструкция В получена из конструкции А, но STAR67 в данном случае клонирована слева от промотора CMV. Конструкция С получена из конструкции В, но в данном случае два антирепрессорных элемента (в данном случае STAR7) клонированы для фланкирования полной кассеты. Комбинация антирепрессорных последовательностей в экспрессирующей кассете. Здесь показано, что комбинация первого антирепрессорного элемента, расположенного слева от промотора, и фланкирование экспрессирующей кассеты двумя другими антирепрессорными последовательностями обеспечивают получение очень хороших результатов. В частности, когда используется промотор SV40 в клетках СНО, то экспрессия уже является очень высокой при отсутствии антирепрессорных последовательностей, но она существенно повышается при помещении STAR67 слева от указанного промотора и фланкировании целой экспрессирующей кассеты двумя антирепрессорными элементами,такими как STAR, STAR7 или STAR40. Следовательно, целью изобретения является обеспечение молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессирующую кассету, включающую (от 5' к 3'): антирепрессорную последовательность А - промотор - нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий белок - антирепрессорную последовательность В, отличающуюся тем, что указанная экспрессирующая кассета дополнительно включает антирепрессорную последовательность С, расположенную между антирепрессорными последовательностями A и В. В предпочтительном варианте осуществления указанная антирепрессорная последовательность С находится слева от указанного промотора, в конфигурации, представленной выше,под заголовком экспрессирующая кассета. Экспрессирующая кассета между антирепрессорными последовательностями А и В может дополнительно содержать элементы, описанные выше для экспрессирующих кассет, например, последовательность терминатора транскрипции, сигнал полиаденилирования,селективный маркерный ген, энхансер и т.д., и может быть моноцистронной, бицистронной и мультицистронной, как описано выше. Две или три антирепрессорных последовательности А, В и С могут быть одинаковыми, или все три могут быть различными. Антирепрессорные последовательности А и В могут быть одинаковыми или различными с антирепрессорной последовательностью С. В некоторых вариантах осуществления антирепрессорные последовательности А и В являются (в основном) идентичными друг другу. В одном варианте осуществления антирепрессорная последовательность С представляет собой STAR67 или ее функциональный фрагмент или производное. Антирепрессорные последовательности А и В могут представлять любую антирепрессорную последовательность и в некоторых вариантах осуществления включают одну из последовательностей SEQID No: 1-65 или их функциональных фрагментов или производных. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета содержит мультицистронный ген, и в предпочтительных вариантах осуществления указанный мультицистронный ген включает последовательность, кодирующую интересующий белок или селективный маркерный ген. Альтернативно, селективный маркерный ген находится под контролем отдельного промотора. В некоторых вариантах осуществления может присутствовать четвертая антирепрессорная последовательность D между STAR последовательностями А и В. В таком варианте осуществления указанная антирепрессорная последовательность D предпочтительно расположена справа от нуклеиновой кислоты,кодирующей интересующий белок. Вновь данная антирепрессорная последовательность D может быть той же самой или отличаться от других антирепрессорных последовательностей в молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, она может представлять любую антирепрессорную последовательность, и в некоторых вариантах осуществления она выбрана из любой последовательности SEQ ID No: 1-65 или их функциональных фрагментов или производных. Поскольку, по меньшей мере, некоторые антирепрессорные последовательности могут быть направленными (WO 00/004704), то антирепрессорные последовательности, фланкирующие экспрессирующую кассету (антирепрессорные последовательности А и В), можно преимущественно расположить в противоположном направлении по отношению друг к другу так, чтобы 3'-конец каждой из данных антирепрессорных последовательностей был обращен внутрь к экспрессирующей кассете (и друг к другу). Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления 5'-конец антирепрессорного элемента обращен к ДНК/хроматину, в результате чего его влияние на трансген должно уменьшиться под действием указанного антирепрессорного элемента. Для антирепрессорной последовательности, расположенной слева от промотора в экспрессирующей кассете, 3'-конец обращен к промотору. Последовательности антирепрессорных элементов (SEQ ID No: 1-66) в перечне последовательностей представлены в направлении от 5' к 3', если не указано иначе.-8 011747 Клетки по изобретению. Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности STAR и/или экспрессирующие кассеты по настоящему изобретению, можно использовать для повышения экспрессии нуклеиновой кислоты, предпочтительно в клетках-хозяевах. Термины клетка 'V' клетка-хозяин и клеточная линия 'V' клеточная линия-хозяин обычно определяются соответственно, как клетка и ее однородная популяция,которые можно поддерживать в клеточной культуре способами, известными в данной области, и которые обладают способностью экспрессировать гетерологичные или гомологичные белки. Предпочтительно клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку млекопитающих, такую как клетка грызунов или человеческая клетка, или гибрид различных клеток. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления указанная клетка-хозяин представляет клетку остеосаркомы U-2 OS, CHO (клетка яичника китайского хомячка), НЕК 293, миеломы HuNS-I,ретинобластомы WERI-Rb-I, BHK, Vero, несекретирующей мышиной миеломы Sp2/0-Ag 14, несекретирующей мышиной миеломы NSO, карциномы надпочечников NCI-H295R или PER.C6. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин является клеткой, экспрессирующей, по меньшей мере, E1A и предпочтительно также ElB аденовируса. В качестве неограничивающего примера такая клетка может быть получена, например, из человеческих клеток, например, из почек(например, клетки НЕК 293, см. Graham et al., 1977), легких (например, А 549, см., например, WO 98/39411) или сетчатки (например, промышленно доступные клетки HER под торговым названиемPER.C6, см. патент США 5994128) или из амниоцитов (например, N52.E6, описанные в патенте США 6558948) и аналогично из других клеток. Способы получения таких клеток описаны, например,в патентах США 5994128 и 6558948. Клетки PER.C6 для целей настоящего применения означают клетки до или после пассажа или клетки, происходящие слева или справа пассажа, депонированные под номером ЕСАСС 96022940. Ранее было показано, что такие клетки способны экспрессировать белки на высоком уровне (например, WO 00/63403 и Jones et al., 2003). Такие клетки-хозяева, экспрессирующие желаемый белок по изобретению, можно получить введением молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно в форме экспрессирующей кассеты по изобретению, в клетки. В альтернативном варианте осуществления последовательность STAR67 предназначена для целенаправленной интеграции в хромосомную область для повышения экспрессии интересующего гена, который уже был интегрирован в геном, например, в природный ген, необязательно под контролем гетерологичного промотора, который направлен слева от указанного гена для регуляции экспрессии указанного гена. Предпочтительно клетки-хозяева происходят из стабильного клона, который можно отобрать и размножить стандартными способами, известными специалистам в данной области. Культура такого клона способна продуцировать интересующий рекомбинантный белок. Клетки по изобретению предпочтительно способны расти в суспензионной культуре, в не содержащей сыворотку среде. Интересующий белок по изобретению может представлять любой белок и может быть мономерным белком или мультимерным белком. Мультимерный белок содержит по меньшей мере две полипептидных цепи. Неограничивающие примеры интересующего белка по изобретению представляют ферменты,гормоны, иммуноглобулиновые цепи, терапевтические белки, такие как противоопухолевые белки, белки свертывания крови, такие как фактор VIII, многофункциональные белки, такие как эритропоэтин, диагностические белки или белки либо их фрагменты, пригодные для вакцинации, которые все известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета по изобретению кодирует тяжелую и легкую цепь иммуноглобулина или его антигенсвязывающую область, производное и/или аналог. В предпочтительном варианте осуществления обеспечивается единица для экспрессии белка по изобретению, где указанный интересующий белок представляет тяжелую цепь иммуноглобулина. В еще одном предпочтительном варианте осуществления обеспечивается единица для экспрессии белка по изобретению, где указанный интересующий белок представляет легкую цепь иммуноглобулина. В тех случаях,когда данные две единицы для экспрессии белка находятся в одной и той же клетке (хозяине), то имеет место сборка мультимерного белка и конкретнее антитела. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления интересующий белок представляет иммуноглобулин, такой как антитело, который является мультимерным белком. Предпочтительно такое антитело является человеческим или гуманизированным антителом. В некоторых вариантах осуществления это IgG, IgA или IgM антитело. Иммуноглобулин может кодироваться по тяжелой или легкой цепям в различных экспрессирующих кассетах или в одной экспрессирующей кассете, где ген, кодирующий каждую отдельную цепь, каждый может находиться под контролем отдельного промотора в моноцистронных транскрипционных единицах, или альтернативно,обе цепи могут кодироваться мультицистронным геном. Интересующий белок может происходить из любого источника, и в некоторых вариантах осуществления он представляет белок млекопитающих, искусственный белок (например, гибридный белок или мутантный белок), и предпочтительно он является человеческим белком. Очевидно, что антирепрессорные последовательности и конфигурации экспрессирующих кассет по настоящему изобретению также можно использовать, когда конечной целью является не продукция бел-9 011747 ка, а сама РНК, например, для получения больших количеств РНК из экспрессирующей кассеты, которую можно использовать для регуляции других генов (например, иРНК, антисмысловой РНК), генной терапии, продукции белка в условиях in vitro и т.д. Способ получения интересующего белка. В одном аспекте изобретение относится к способу экспрессии интересующей последовательности,предпочтительно кодирующей интересующий белок, обеспечением клетки-хозяина с молекулой нуклеиновой кислоты или экспрессирующей кассетой по изобретению, культивированием клетки и экспрессией интересующей последовательности. Термин экспрессия обычно используется по отношению к продукции специфического продукта или продуктов РНК, или специфического белка или белков, в клетке. В случае продуктов РНК он относится к способу транскрипции. В случае белковых продуктов он относится к способам транскрипции,трансляции и необязательно посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, образования дисульфидных связей и т.д.). В случае секретируемых белков он относится к способам транскрипции, трансляции и необязательно посттрансляционных модификаций с последующей секрецией. Введение нуклеиновой кислоты, которая должна экспрессироваться в клетке, можно проводить одним из нескольких методов, которые известны специалистам в данной области, также зависит от формы нуклеиновой кислоты, предназначенной для введения. Указанные методы включают, но не ограничиваются трансфекцией, инфицированием, инъекцией, трансформацией и т.п. Культивирование клетки проводят для обеспечения метаболизирования, и/или культивирования,и/или деления, и/или продукции интересующих рекомбинантных белков. Это можно осуществлять методами, хорошо известными специалистам в данной области, и это включает, но не ограничивается обеспечением питательных веществ для клетки. Методы включают культивирование при прикреплении к поверхности, культивирование в суспензии или их сочетания. Культивирование можно проводить, например, на чашках, во вращающихся сосудах или в биореакторах с использованием периодических, систем с подпиткой и непрерывных систем, таких как перфузионные системы и т.п. Для достижения крупномасштабной (непрерывной) продукции рекомбинантных белков при культивировании клеток предпочтительно в данной области иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительно иметь клетки,способные культивироваться при отсутствии сыворотки крови от животных или человека или компонентов сыворотки крови от животных или человека. Условия для культивирования или размножения клеток (см., например, Tissue Culture, AcademicPress, Kruse and Paterson, editors (1973 и условия для экспрессии рекомбинантного продукта известны специалистам в данной области. В основном принципы, протоколы и практические методики для получения максимальной продуктивности культур клеток млекопитающих можно найти в Mammalian CellBiotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). В предпочтительном варианте осуществления экспрессированный белок собирают (выделяют) либо из клеток, либо из культуральной среды, либо из обоих. Затем его можно дополнительно очистить с использованием известных методов, например, фильтрования, колоночной хроматографии и т.д., методами,обычно хорошо известными специалистам в данной области. Новый способ селекции. В настоящем изобретении раскрывается новый способ получения клеток-хозяев, экспрессирующих два интересующих полипептида, где данный способ обеспечивает удивительно хорошие результаты в том плане, что практически не появляются или отсутствуют колонии без применения антирепрессорных последовательностей, в то время как наличие антирепрессорной последовательности приводит к появлению клонов, выдерживающих отбор, и данные клоны в основном экспрессируют два интересующих полипептида на высоком уровне (пример 7, фиг. 11). Следовательно, изобретение относится к способу получения клетки-хозяина, экспрессирующей два интересующих полипептида, включающему: а) введение в клетку-хозяин одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, где молекула или молекулы нуклеиновой кислоты вместе содержат: i) промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей первый интересующий полипептид и первый селектируемый маркерный ген; и ii) промотор,функционально связанный с последовательностью, кодирующей второй интересующий полипептид и второй селектируемый маркерный ген; и iii) по меньшей мере одну антирепрессорную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) любой из последовательностей SEQ ID No: 1-66; (b) фрагментов любой из последовательностей SEQ ID No: 1-66, где указанные фрагменты обладают антирепрессорной активностью; (с) последовательностей, которые по меньшей мере на 70% идентичны (а) или (b), и обладают антирепрессорной активностью; и (d) комплементарной последовательности к (а)-(c);b) селекцию клетки-хозяина, по существу, одновременным отбором на экспрессию указанного первого и второго селектируемых маркерных генов. Отобранные клетки-хозяева можно преимущественно использовать для экспрессии указанных двух полипептидов культивированием указанных отобранных клетокхозяев. В одном варианте осуществления две молекулы нуклеиновой кислоты, одну, содержащую i), и вторую, содержащую ii), используют для введения в клетку-хозяин. В данном варианте осуществления каждая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит по меньшей мере одну указанную антирепрессорную последовательность. В другом варианте осуществления используют одну молекулу- 10011747 нуклеиновой кислоты, содержащую i) и ii), которая затем должна включать по меньшей мере одну указанную антирепрессорную последовательность. Одно преимущество обеспечения кодирующих последовательностей для обоих полипептидов в одной молекуле нуклеиновой кислоты заключается в том, что необходимо получение только одной нуклеиновой кислоты перед введением нуклеиновой кислоты в клетки. Кроме того, в таком варианте осуществления одного события интеграции достаточно для кодирующих последовательностей обоих пептидов, в результате чего устраняется вероятность того, что нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид, интегрируется в другом положении или с другим числом копий, по сравнению с таковой, кодирующей второй полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления указанные два полипептида могут составлять часть мультимерного белка, такого как иммуноглобулин. Следовательно, способ особенно подходит для экспрессии антител. Два промотора могут быть одинаковыми или различными и могут представлять любые промоторы, описанные выше. В тех случаях, когда используется вариант осуществления, в котором одна молекула нуклеиновой кислоты содержит и i) и ii), то направление двух транскрипционных единиц в одной молекуле нуклеиновой кислоты может, например, быть одинаковым или противоположным направлением при обращении друг к другу, или противоположным направлением, каждое наружу. В последнем случае антирепрессорную последовательность можно поместить между двумя промоторами (см., например, фиг. 11 В). Одной подходящей антирепрессорной последовательностью для данного аспекта изобретения является последовательность SEQ ID No: 66 (см. пример 7), но также могут функционировать другие антирепрессорные последовательности. Это могут легко проверить специалисты в данной области с использованием данного раскрытия и, следовательно, также применение других антирепрессорных последовательностей по данному аспекту изобретения включается в объем изобретения. Кроме того, антирепрессорные последовательности можно добавить для фланкирования одной или обоих транскрипционных единиц. Каждый из маркерных генов должен быть различным, и может, например, быть выбран из маркерных генов, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления одним селектируемым маркером является зеоцин,и другой селектируемый маркер представляет, например, пуромицин. Однако ясно, что можно использовать другие комбинации, и все они находятся в объеме данного аспекта изобретения. Экспрессия маркеров предпочтительно должна зависеть от экспрессии интересующих полипептидов. Этого можно достичь связыванием экспрессии маркерных генов с таковой у интересующих полипептидов, например, при использовании мультицистронных генов, например, последовательностей IRES, как уже обсуждалось выше. По существу, одновременный отбор означает, что по меньшей мере часть времени, предпочтительно по меньшей мере в течение 1 суток, более предпочтительно по меньшей мере 2 суток, еще более предпочтительно по меньшей мере 5 суток присутствуют оба агента селекции, чего можно достичь обеспечением обоих агентов селекции, добавленных в культуральную среду в одно и то же время или добавлением культуральной среды, содержащей оба агента селекции (в частности, пример 7). Очевидно понятно, что добавление второго агента селекции только через несколько часов или суток в среду, в которой уже находится первый агент селекции, также будет приводить к по существу, одновременному отбору в значении изобретения. Данная ситуация отличается от ситуации, при которой клетки вначале отбираются с помощью первого агента селекции, и при образовании колоний клетки отбираются на новой среде, в которую внесен второй агент селекции и не добавлен первый агент селекции (последовательный отбор, в частности, пример 5 и WO 03/106684). При селекции на оба селектируемых маркера, по существу, одновременно здесь с удивлением раскрывается, что достигается быстрый и эффективный отбор, посредством чего удаляются многие клоны с низкой продуктивностью, приводя к существенному снижению рабочей нагрузки для поиска клона с желаемыми экспрессирующими характеристиками. Это является особенно преимущественным для биотехнологической промышленности, когда необходимо подвергнуть скринингу многие, обычно сотни или даже тысячи колоний, прежде чем будет идентифицирован желаемый клон, обладающий экспрессией на высоком уровне. Кроме того, система обеспечивает возможность тестировать фрагменты антирепрессорных элементов, по меньшей мере, STAR67, но также и других антирепрессорных последовательностей, когда они функционируют в данном режиме, на функциональность. Следовательно, данный простой скрининг, который обеспечивает почти или даже все черные и белые различия во многих случаях, будет вносить свой вклад в идентификацию функциональных фрагментов или производных антирепрессорных последовательностей и/или способствовать характеристике новых антирепрессорных последовательностей. Скрининг даже можно использовать для поиска новых антирепрессорных и/или повышающих экспрессию последовательностей (поскольку данный тип скрининга в буквальном смысле не предназначен для выявления антирепрессорной активности, а в большей степени повышающей экспрессию активности, также является возможным, что будет установлена последовательность с последней, но не первой активностью). Следовательно, другой аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации антирепрессорных и/или повышающих экспрессию последовательностей, или их функционального фрагмента или производного, включающему: а) введение в клетку-хозяин одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, где молекула или молекулы нуклеиновой кислоты вместе содержат: i) промотор,функционально связанный с первым селектируемым маркерным геном; и ii) промотор, функционально связанный со вторым селектируемым маркерным геном; и iii) по меньшей мере одну последовательность- 11011747 для тестирования на антирепрессорную и/или повышающую экспрессию активность; b) селекцию клетки-хозяина, по существу, одновременным отбором на экспрессию указанного первого и второго селектируемых маркерных генов. Клетки-хозяева, которые проходят данный скрининг, вероятно, содержат функциональный антирепрессорный и/или повышающий экспрессию элемент. Затем это можно легко анализировать дополнительно, например, определив его последовательность и/или подвергнув его другим функциональным тестам на антирепрессорную активность, как описано выше. В одном варианте осуществления как i), так и ii) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, например, с расходящимися промоторами (первый и второй селектируемые маркерные гены обращены наружу), между которыми можно клонировать тестируемую последовательность для анализа. Предпочтительно указанные селектируемые маркерные гены не экспрессируются на высоком уровне, например, при использовании относительно слабых промоторов, регулирующих селектируемые маркерные гены, такие относительно слабые промоторы известны, и/или их могут идентифицировать с использованием обычных методов специалисты в данной области, или, например, при использовании сильного промотора для транскрипции и IRES, предпочтительно относительно слабой IRES, как описано выше, для трансляции генамаркера. Маркерные гены также можно преимущественно поместить справа от нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих полипептид и связанных с его экспрессией, в мультицистронном гене, например, с помощью IRES (в частности, пример 7, фиг. 11 для возможной конфигурации). Вновь такие полипептиды могут представлять интересующие полипептиды, так что получают непосредственно пригодные клоны для экспрессии указанных интересующих полипептидов, но также в целях скрининга можно легко количественно определить экспрессию маркеров, например, GFP или его производного,SEAP, lacZ, люциферазы и т.д. В такой комбинации можно непосредственно количественно определить экспрессию полипептидов для отбора антирепрессорных и/или повышающих экспрессию элементов или их фрагментов, которые обеспечивают достаточное количество колоний во время одновременного отбора, и также обеспечивают транскрипцию на высоком уровне. Когда произвольная нуклеиновая кислота(т.е. нуклеиновая кислота, о которой еще не известно, что она обладает антирепрессорной или повышающей экспрессию активностью), например, в форме фрагментов генома, используется в качестве последовательности для тестирования на антирепрессорную или повышающую экспрессию активность, то можно найти новые антирепрессорные и/или повышающие экспрессию последовательности. В тех случаях, когда тестируют известные антирепрессорные последовательности, то данный тест можно использовать для их дополнительной характеристики. Когда тестированию подвергаются фрагменты известных антирепрессорных последовательностей, то тест будет обеспечивать функциональные фрагменты таких известных антирепрессорных последовательностей. В практике данного изобретения будут применяться, если не указано иначе, обычные методы иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые знакомы специалистам в данной области. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, MolecularMJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988. Изобретение дополнительно поясняется в последующих примерах. Примеры никоим образом не ограничивают изобретение. Они только служат для пояснения изобретения. Примеры. Пример 1. Конструирование векторов STAR67. Выделяли новую антирепрессорную последовательность с использованием генетического скрининга, как описано в заявке WO 03/004704, и данную новую последовательность обозначали как STAR67(SEQ ID No: 66). Анализировали влияние STAR67 на экспрессию трансгенов в клеточных линиях млекопитающих. Авторы описывают конструирование различных конструкций. Материалы и методы. Получали три плазмиды (фиг. 1):A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV контроль),B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7). Конструирование конструкции А описано ниже. Плазмиду pd2EGFP (Clontech 6010-1) модифицировали вставкой линкера в сайт BsiWI с получением pd2EGFP-link. Линкер, полученный отжигом олигонуклеотидов GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ ID No: 67) иGTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ ID No: 68), давал сайты для рестриктаз Pad, BgIIl и BcoRV. Это приводило к получению сайта множественного клонирования MCSII для вставки элементов STAR. Затем использовали праймерыAGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG (SEQ ID No: 70) для амплификации области размером 0,37 т.п.н. из pd2EGFP, которую вставляли в сайт BgIII плазмиды pIRES (Clontech 6028-1) с получением pIRES-stuf. Это приводило к введению сайтов для рестриктаз Ascl и Swal в MCSI, и действует в качестве лишнего фрагмента для того, чтобы избежать потенциального взаимодействия- 12011747 между элементами STAR и смежными промоторами. pIRES-stuf расщепляли с помощью BgIII и Fsp1 для высвобождения фрагмента ДНК, состоящего из лишнего фрагмента, промотора CMV, элемента IRES(фланкированного сайтами множественного клонирования MCS А и MCS В) и сигнала полиаденилирования SV40. Данный фрагмент лигировали с остовом вектора pd2EGFP-link, полученного расщеплениемBamRI и Stul с получением pIRES-link. Открытую рамку считывания гена резистентности к зеоцину вставляли в сайты BamAI/Not1 справа от pIRES следующим образом: ORF гена резистентности к зеоцину амплифицировали ПЦР с использованием праймеров GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ ID No: 71) иAGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG (SEQ ID No: 74) и вставляли EcoRI-расщепленную кассету d2EGFP в сайт EcoRI в плазмиде pIRES-link-zeo. Это давало конструкцию A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV контроль).STAR67 клонировали слева от промотора CMV в сайт Ascl (примерно 15 н.т., остающихся междуSTAR67 и промотором). Это давало конструкцию В, STAR67-CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV-STAR67).STAR67 также тестировали в условиях кассеты, которая также содержит STAR7 (SEQ ID No: I)1,клонированную непосредственно в 5'-сайты Sail и Xbal и 3'-сайты BgIII и Pad для фланкирования полной кассеты со STAR7. Это была конструкция С (CMV-STAR67 7/7). Пример 2. STAR67 повышает уровень экспрессии с промоторов CMV, Efloc и UB6 в стабильно трансфицированных клетках d CHO. Авторы тестировали, насколько присутствие STAR67, смежной с промоторами CMV, Ef1 и UB6,оказывает влияние на уровень экспрессии данных промоторов в клетках СНО. Для данной цели использовали конструкции А и В (фиг. 1), описанные в примере 1, модифицированные для соответствующих промоторов: 1) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV контроль),2) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),3) EF1-d2EGFP-ires-Zeo (EF1 контроль),4) STAR67-EF110C-d2EGFP-ires-Zeo (EF110C-STAR67),5) UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 контроль),6) STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67). Материалы и методы. Промоторы UB6 и EF1 заменяли на промотор CMV в плазмидах, представленных на фиг. 1. Промотор UB6 клонировали следующим образом. Лишний фрагмент ДНК размером 0,37 т.п.н. из плазмиды pd2EGFP амплифицировали ПЦР, как описано в примере 1, с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID No: 69 и 70. Полученный лишний фрагмент ДНК клонировали в сайт BgIII плазмиды pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20] с получением pUB6-stuf. Из pUB6-stuf фрагмент Ascl-Sacl клонировали в CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, из которой вырезали промотор CMV. Промотор EF1 амплифицировали ПЦР с pEF1/V5-His [Invitrogen V920-20] в качестве матрицы с использованием праймеров GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ ID No: 79) и AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ ID No: 80). Фрагмент ПЦР клонировали в сайты Ascl и PpuMI CMV-d2EGFP-ires-Zeo, из которой удаляли промотор CMV. Линию клеток яичника китайского хомячка CHO-Kl (АТСС CCL-61) культивировали в средеHAMS-F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки, содержащей 2 мМ глютамина, 100 E/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 С/5% СО 2. Клетки трансфицировали плазмидами с использованием реагента SuperFect (QIAGEN), как описано производителем. Кратко, клетки высевали в сосуды для культивирования и культивировали в течение ночи до 70-90% слияния. Реагент SuperFect объединяли с плазмидной ДНК в соотношении 6 мкл на мкг (например, на чашку Петри диаметром 10 см 20 мкг ДНК и 120 мкл SuperFect) и добавляли к клеткам. После инкубации в течение ночи смесь для трансфекции заменяли на новую порцию среды и трансфицированные клетки инкубировали дополнительно. После культивирования в течение ночи клетки обрабатывали трипсином и высевали в новые сосуды для культивирования с новой порцией среды. После инкубации еще в течение ночи добавляли зеоцин в концентрации 50 мкг/мл и клетки дополнительно культивировали. Еще через 3 суток среду заменяли на новую порцию среды, содержащую зеоцин (100 мкг/мл) и культивировали дополнительно. Когда отдельные колонии становились видимыми (примерно через 10 суток после трансфекции) среду удаляли и заменяли новой порцией среды без зеоцина. Отдельные клоны выделяли и переносили в 24-луночные планшеты в среду без зеоциона. Через 1 сутки после выделения колоний в среду добавляли зеоцин. Экспрессию генарепортера d2EGFP оценивали примерно через 3 недели после трансфекции. Уровень экспрессии d2EGFP в колониях определяли через 2-недельные периоды времени. Через- 13011747 первые 2 недели после трансфекции, когда проводили первое определение d2EGFP, колонии культивировали в среде без зеоцина или других антибиотиков. Таким образом, продолжали в оставшееся время опыта. Результаты. На фиг. 2 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержит STAR67, клонированную слева от промотора CMV, приводила к появлению ряда колоний, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, CMV контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных CMV контрольной плазмидой,составляло 34 при определении через 25 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях снижалось до 13, указывая на то, что экспрессия не является стабильной в течение времени. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой STAR67-CMV, равнялось 42 при определении через 25 суток и 32 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно, через 60 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая CMV, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором CMV, в 2,5 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. Важно, что через 25 суток после трансфекции, после первого определения, давление селекции устраняли культивированием колоний в среде без зеоцина. Следовательно, колонии, содержащие конструкцию STAR67, являются более стабильными в течение времени при отсутствии давления селекции, по сравнению с колониями,которые не включают конструкцию STAR67. На фиг. 3 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержит STAR67, клонированную слева от EFlCC-промотора, приводила к появлению ряда колоний СНО, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, EF1 контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных контрольной плазмидойEF1, составляло 31 при определении через 25 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях составляло 26. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой EF1-STAR67, равнялось 60 при определении через 25 суток и 76 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно,в обоих случаях через 25 и 60 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая EF1, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором EF1, в 2,9 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. На фиг. 4 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержит STAR67, клонированную слева от UB6-промотора, приводила к появлению ряда колоний СНО, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, UB6 контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных UB6 контрольной плазмидой, составляло 51 при определении через 25 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях составляло 29, указывая на то, что экспрессия не была стабильной в течение времени. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой UB6-STAR67, равнялось 218 при определении через 25 суток и 224 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно, через 25 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая UB6, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором UB6, в 4,3 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. Через 60 суток данный коэффициент составлял 7,7 за счет нестабильности экспрессии в контрольных колониях и стабильности экспрессии в колониях UB6-STAR67. Важно, что через 25 суток после трансфекции, после первого определения, давление селекции устраняли культивированием колоний в среде без зеоцина. Следовательно, колонии, содержащие конструкцию STAR67, являются более стабильными в течение времени при отсутствии давления селекции, по сравнению с колониями, которые не включают конструкциюSTAR67. В заключение, STAR67 повышает экспрессию с трех различных несвязанных промоторов. Пример 3. STAR67 повышает уровень экспрессии с промоторов CMV, Ef1 и UB6 в стабильно трансфицированных клетках PER.C6. Авторы тестировали, насколько присутствие STAR67, смежной с промоторами CMV, Ef1 и UB6,оказывает влияние на уровень экспрессии данных промоторов в другом типе клеток, чем СНО, а именно клетках PER.C6. Использовали те же конструкции, что в примере 1. Материалы и методы. Трансфекция, культивирование и анализ клеток PER.C6. Клетки PER.C культивировали в среде DMEM + пиридоксин + 9% фетальной бычьей сыворотки(без инактивации тепловой обработкой), 8,9 мМ MgCl2, 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 С/СО 2. Клетки трансфицировали плазмидами с использованием реагента Lipofectamine 2000(Invitrogen), как описано производителем. Кратко, клетки высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в течение ночи до 70-90% слияния. Реагент Lipofectamine объединяли с плазмидной ДНК при соотношении 15 мкл на 3 мкг (например, на чашку Петри диаметром 10 см 20 мкг ДНК и 120 мкл Li- 14011747pofectamine) и добавляли через 30 мин инкубации при 25 С к клеткам. После инкубации в течение ночи смесь для трансфекции заменяли новой порцией среды и трансфицированные клетки инкубировали дополнительно. После культивирования в течение ночи клетки обрабатывали трипсином и высевали (в разведениях 1:15, 1:30, 1:60, 1:120) на новые чашки Петри (90 мм) с новой порцией среды с добавлением зеоцина в концентрации 100 мкг/мл и клетки дополнительно культивировали. Когда отдельные колонии становились видимыми, отдельные клоны выделяли соскабливанием и переносили в 24-луночные планшеты в среду с зеоцином. Когда рост достигал 70% слияния, то клетки переносили в 6-луночные планшеты. Стабильные колонии культивировали в течение 2 недель в 6-луночных планшетах перед определением сигнала d2EGFP на флоуцитометре XL-MCL Beckman Coulter. Среднее значение сигнала принимали в качестве показателя уровня экспрессии d2EGFP. Второй раз колонии оценивали через 2 недели. Затем колонии дополнительно культивировали в отсутствие антибиотика. Результаты. На фиг. 5 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержала STAR67, клонированную слева от промотора CMV, приводила к появлению ряда колоний PER.C6, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, CMV контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных контрольной плазмидойCMV, составляло 37 при определении через 30 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях снижалось до 14, указывая на то, что экспрессия не была стабильной в течение времени. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой STAR67-CMV, равнялось 101 при определении через 30 суток и 45 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно, через 60 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая CMV, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором CMV, в 3,2 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. На фиг. 6 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержала STAR67, клонированную слева от промотора EFlOC, приводила к появлению ряда колоний PER.C6, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, EF1 контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных контрольной плазмидой EF1, составляло 5 при определении через 30 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях равнялось 6. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой EFlCt-STAR67, равнялось 25 при определении через 30 суток и 20 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно,в обоих случаях через 30 и 60 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая EF1, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором EF1, в 4 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. На фиг. 7 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержала STAR67, клонированную слева от промотора UB6, приводила к появлению ряда колоний PER.C6, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без STAR67, UB6 контроль. Среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных UB6 контрольной плазмидой, составляло 4 при определении через 30 суток после трансфекции. Через 60 суток после трансфекции среднее значение сигнала d2EGFP в данных 10 колониях равнялось 2. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 10 колониях, трансфицированных плазмидой UB6-STAR67, равнялось 27 при определении через 30 суток и 18 при определении через 60 суток после трансфекции. Следовательно, в обоих случаях через 30 и 60 суток после трансфекции конструкция STAR67, содержащая UB6, обеспечивала уровень экспрессии репортерного белка, регулируемой промотором UB6, в 7-9 раза выше в стабильно трансфицированных клонах. Следовательно, помещение STAR67 слева от промотора приводит к достоверно более высоким уровням экспрессии белка, по сравнению с конструкциями без STAR67 также и в клетках PER.C6. Следовательно, STAR67 функционирует в различных несвязанных типах клеток. Пример 4. Новая конфигурация STAR67 в комбинации с другими антирепрессорными элементами для усиления промотора SV40 в клетках СНО. Авторы тестировали, насколько присутствие STAR67, смежной с промотором SV40, оказывает влияние на уровень экспрессии данного промотора, одной или в комбинации с другим антирепрессорным элементом, в данном примере STAR7. Для этой цели используемыми конструкциями (см. фиг. 8) являются: 1) SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40 контроль),2) STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67),3) STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7),4) STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7). Материалы и методы. Промотор SV40 амплифицировали ПЦР с pIRES в качестве матрицы с использованием праймеровTTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC (SEQ ID No: 82). Фрагмент ПЦР клонировали в сайты Ascl и Sad плазмиды CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, из которой удаляли промотор CMV. Клетки СНО трансфицировали, выделяли колонии, размножали и анализировали, как описано в примере 2. Результаты. На фиг. 8 показано, что трансфекция конструкцией, которая содержала STAR67, клонированную слева от промотора SV40 (SV40-STAR67) или STAR7, клонированную для фланкирования полной конструкции (SV40-STAR 7/7), не приводила к появлению колоний СНО, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни белка d2EGFP, по сравнению с пустым контролем без антирепрессорных элементов (SV40 контроль). Среднее значение сигнала d2EGFP в 18 колониях, трансфицированных контрольной плазмидой SV40, составляло 86 при определении через 40 суток после трансфекции. Для сравнения среднее значение сигнала d2EGFP в 18 колониях, трансфицированных плазмидой SV40-STAR67,равнялось 82 при определении через 40 суток и среднее значение сигнала d2EGFP в 18 колониях, трансфицированных плазмидой SV40-STAR 7/7, равнялось 91 при определении через 40 суток. Следовательно, не наблюдали достоверного эффекта данных антирепрессорных элементов в отношении промотораSV40 в клетках СНО. Оказалось, что уровень экспрессии с промотора SV40 в данных клетках уже было довольно высоким, и даже более высоким, по сравнению с наблюдаемым с промотором CMV, который считается очень сильным промотором. Данная высокая фоновая экспрессия при отсутствии антирепрессорного элемента с использованием промотора SV40 в клетках СНО может объяснить тот факт, что отсутствовал достоверный эффект одной STAR67 или STAR7, фланкирующей трансген. Однако среднее значение сигнала d2EGFP в 18 колониях, трансфицированных плазмидой SV40STAR67 7/7, составляло 209 при оценке колоний через 40 суток, что соответствует коэффициенту в 2,4 раза выше, по сравнению со средним значением для 18 контрольных колоний (86). Следовательно, когда элемент STAR67 использовали в комбинации с другим антирепрессорным элементом, то это приводило к появлению ряда стабильно трансфицированных колоний СНО, которые показывали достоверно более высокие уровни экспрессии d2EGFP. Следовательно, в данной новой конфигурации (5' - последовательность STAR A - последовательность STAR С промотор - нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий белок - последовательностьSTAR В - 3', где в данном примере последовательности STAR А и В представляют последовательностьSTAR 7, и последовательность С является STAR67), оказалось, что элементы STAR функционируют даже лучше, чем раскрытые к настоящему времени конфигурации. Авторы проводили опыты, в которых фланкирующие элементы STAR7 заменяли на фланкирующие элементы STAR6 (SEQ ID No: 6) или на фланкирующие элементы STAR4 (SEQ ID No: 4) в комбинации со STAR67, расположенной слева от промотора SV40 (соответственно SV40-STAR67 6/6 и SV40-STAR67 4/4 при использовании той же номенклатуры, представленной выше), и также наблюдали повышенную экспрессию с данными комбинациями. Это доказывает, что фланкирующие элементы STAR7 можно заменять на другие последовательности STAR, и при этом по-прежнему наблюдают улучшение новых экспрессирующих кассет с последовательностями STAR. Пример 5. Комбинация STAR67 и STAR7 повышает уровни регулируемой UB6 экспрессии антител в стабильно трансфицированных клетках СНО. В примере 4 авторы показали, что комбинация STAR67 и STAR7 повышала уровни экспрессии белка d2EGFP в клетках СНО. В данном случае авторы исследовали, насколько комбинацию STAR67 иSTAR7 можно использовать для получения антител. Авторы выбрали антитела против молекулы ЕрСАМ(HuIs et al., 1999) в качестве тестируемого белка и использовали промотор UB6. Материалы и методы. Плазмиды. кДНК тяжелой цепи (НС-ЕрСАМ) клонировали в конструкцию, включающую промотор UB6. НСЕрСАМ сочетали с геном резистентности к зеоцину с помощью последовательности IRES. кДНК легкой цепи (LC-EpCAM) также клонировали в конструкцию, включающую промотор UB6. LC-EpCAM сочетали с геном резистентности к пуромицину с помощью последовательности IRES. Вместе данные две плазмиды представляли контроль UB6 (HC+LC) (фиг. 9). Для анализа эффектов STAR67 и STAR7, STAR67 клонировали в обе конструкции HC+LC слева от промотора UB6. STAR7 клонировали с фланкированием полной кассеты на обоих 5'- и 3'-концах (фиг. 9). Данные две плазмиды представляли STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7. Трансфекция и культивирование клеток СНО. Линию клеток яичника китайского хомячка СНО-Kl (АТТС CCL-61) трансфицировали и культивировали, как описано в примере 2, с использованием зеоцина (100 мкг/мл) и пуромицина (2,5 мкг/мл) для селекции. Через 1 сутки после трансфекции в культуральную среду добавляли зеоцин. Когда первые колонии становились видимыми (примерно через 7 суток после добавления зеоцина) культуральную среду удаляли и заменяли на культуральную среду, содержащую пуромицин. Примерно через 7 суток колонии- 16011747 выделяли и переносили в 24-луночные планшеты в культуральную среду только с зеомицином. Результаты. На фиг. 9 показано, что трансфекция конструкциями антител, которые содержат STAR67, клонированную слева от промотора UB6, и два элемента STAR67, клонированные для фланкирования полных кассет, приводила к появлению ряда колоний СНО, которые экспрессируют достоверно более высокие уровни антитела ЕрСАМ (по данным ELISA с использованием античеловеческого IgG антитела), по сравнению с пустым контролем без STAR67 и STAR7, UB6 (HC+LC) контроль. Среднее значение продукции ЕрСАМ в 18 колониях, трансфицированных контрольной плазмидой UB6 (HC+LC), составляло 2,7 пкг/клетку/сутки при определении через 25 суток после трансфекции. Селективные агенты, зеоцин и пуромицин, удаляли через 25 суток. Через 45 суток после трансфекции среднее значение продукции ЕрСАМ в данных 18 колониях равнялось 2,7 пкг/клетку/сутки. Для сравнения среднее значение сигнала продукции ЕрСАМ в 18 колониях, трансфицированных плазмидой STAR7-STAR67-UB6 (HC+LCSTAR7), равнялось 6,7 при определении через 25 суток и 7,7 пкг/клетку/сутки при определении через 45 суток после трансфекции. Следовательно, в обоих случаях через 30 и 45 суток после трансфекции конструкция STAR67/STAR7, содержащая UB6, обеспечивала уровень экспрессии ЕрСАМ, регулируемой промотором UB6, в 2,5-2,9 раза выше в стабильно трансфицированных клонах СНО. Следовательно, помещение STAR67 слева от промотора и двух элементов STAR7 с фланкированием кассет приводило к достоверно более высокому уровню экспрессии антитела ЕрСАМ в клетках СНО,по сравнению с конструкциями без STAR67/STAR7. Пример 6. STAR67 не является блокатором энхансера, в то время как STAR6 и STAR7 - являются. Все известные к настоящему времени элементы STAR, которые были тестированы на данное свойство, включая STAR6 и STAR7, являются блокаторами энхансеров (WO 03/004704, Kwaks et al., 2003). Блокирующую энхансер активность тестировали, поместив элемент STAR между сильным энхансером и промотором. В данном случае авторы тестировали, насколько также STAR67 является блокатором энхансера. Материалы и методы. Ген d2EGFP амплифицировали ПЦР с использованием праймеровpGL3-промотор (Promega) с использованием сайтов рестрикции Ncol и Xbal для замены гена люциферазы с получением плазмиды pGL3-промотор-GFP. Линкер, полученный отжигом олигонуклеотидовGATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT (SEQ ID No: 78), клонировали в сайты Sad и BgIII для получения сайтов множественного клонирования. Первоначальный сайтBgIII разрушали при лигировании линкера с получением нового уникального сайта BgIII внутри ДНКлинкера. SV40-энхансер вырезали из плазмиды pGL3-basic (Promega) с использованием BsaBI и BamHI и клонировали в pGL3-линкер-промотор-GFP с использованием сайтов EcoRV и BgIII с получением плазмиды pGL3-энхансер-промотор-GFP. Элемент STAR40 (SEQ ID No: 40) помещали слева от SV40 энхансера с использованием сайтов Kpnl и Sad для предупреждения воздействия энхансера на последовательности, находящиеся слева. Наконец, антирепрессорные элементы STAR6, STAR7 и STAR67 помещали между SV40-энхансером и минимальным SV40-промотором с использованием сайтов рестрикции Spel и Ascl. Трансфекция и культивирование клеток СНО. Линию клеток яичника китайского хомячка СНО-Kl (АТСС CCL-61) трансфицировали, как описано в примере 2. Через 1 сутки после трансфекции определяли уровни d2EGFP на флоуцитометре Epics XL(Beckman Coulter). Результаты. На фиг. 10 показано, что STAR67 не является блокатором энхансера, в то время как STAR6 иSTAR7 действуют в качестве блокаторов энхансера в том же тесте. STAR6, STAR7 и STAR67 клонировали между SV40-энхансером и минимальным SV40-промотором слева от гена d2EGFP. В том случае,когда не клонировали элемента STAR между энхансером и промотором, то имела место сильная активация транскрипции (произвольно оцененная как 100%). Когда STAR6 или STAR7 помещали между энхансером и промотором, то транскрипция снижалась до фонового уровня, указывая на то, что STAR6 иSTAR7 являются сильными блокаторами энхансеров. В противоположность, когда клонировали STAR67 между энхансером и промотором, то относительный уровень транскрипции составлял по-прежнему 80% от контроля, указывая на то, что STAR67 не является эффективным блокатором энхансера в противоположность STAR6 и STAR7, а также другим антирепрессорным элементам, описанным ранее(WO 03/004704, Kwaks et al., 2003). Пример 7. STAR67 повышает уровень экспрессии антитела, регулируемой UB6 и CMV, в стабильно трансфицированных клетках СНО. В примере 5 авторы показали, что комбинация STAR67 и STAR7 повышала уровень экспрессии антитела ЕрСАМ в клетках СНО, в условиях двух различных плазмид, которые содержали тяжелую и лег- 17011747 кую цепи. В данном примере авторы тестировали, насколько STAR67 можно использовать для продукции антитела ЕрСАМ, когда обе, тяжелую и легкую, цепи помещают в одну плазмиду. Авторы использовали одновременную селекцию для каждого селектируемого маркера. Материалы и методы. Плазмиды. кДНК тяжелой цепи (НС-ЕрСАМ) находилась под контролем промотора UB6, и ее сочетали с геном устойчивости к зеоцину с помощью последовательности IRES. кДНК легкой цепи (LC-EpCAM) находилась под контролем промотора CMV, и ее сочетали с геном устойчивости к пуромицину с помощью последовательности IRES. По существу, эти конструкции представляют таковые, использованные в примере 5. Данные две экспрессирующие кассеты помещали в одну плазмиду таким образом, что транскрипция двух экспрессирующих единиц шла в противоположных направлениях. В контрольной плазмиде промоторы UB6 и CMV были разделены лишним фрагментом размером 500 п.н. (ЕрСАМ контроль)(фиг. 10). В другой плазмиде STAR67 помещали между промоторами UBP и CMV (ЕрСАМ STAR67)(фиг. 10). Трансфекция и культивирование клеток СНО. Линию клеток яичника китайского хомячка СНО-Kl (АТСС CCL-61) трансфицировали и культивировали, как описано в примере 2, с использованием зеоцина (100 мкг/мл) и пуромицина (2,5 мкг/мл) для селекции. В примере 5 использовали последовательную селекцию для обоих селективных маркеров. В противоположность в данном случае оба селективных маркера присутствовали в культуральной среде одновременно. Через 1 сутки после трансфекции зеоцин и пуромицин вносили в культуральную среду. Селективная среда присутствовала до выделения колоний (примерно через 14 суток после трансфекции). Затем колонии выделяли и переносили в 24-луночные планшеты, клетки культивировали в присутствии зеоцина и пуромицина. Результаты. На фиг. 11 показано, что трансфекция конструкцией антитела, которая содержит STAR67, клонированную между промоторами UB и CMV, приводила к появлению ряда колоний СНО, которые экспрессируют антитело ЕрСАМ (по данным ELISA с использованием человеческого IgG антитела). Среднее значение продукции ЕрСАМ в 19 колониях, трансфицированных плазмидой ЕрСАМ STAR67, составляло 9,8 пкг/клетку/сутки при определении через 25 суток после трансфекции. В противоположность с удивлением было установлено, что колонии не выдерживали трансфекцию контрольной плазмидой ЕрСАМ. Когда проводили селекцию с одним зеоцином или пуромицином, то контрольные колонии ЕрСАМ выживали. Однако когда давление селекции увеличивали при помещении давления селекции на обе тяжелую и легкую цепи, то в данных условиях выживали только колонии, которые содержали STAR67 в трансфицированной плазмиде. Результаты также показывают, что включение STAR67 оказывает положительное действие на два промотора, промотора UB6 и CMV, которые помещают слева и справа от одного элемента STAR67. Это указывает на то, что STAR67 может функционировать в двух направлениях. Различие между контрольной плазмидой ЕрСАМ и плазмидой ЕрСАМ STAR67 является чернымбелым в том плане, что только трансфекция ЕрСАМ STAR67 приводит к появлению колоний при высоком давлении селекции. Это открывает возможность для применения данной плазмидной конфигурации для идентификации области в STAR67, которая является ответственной за опосредование данного эффекта. Более мелкие, перекрывающиеся участки STAR67 помещают между промоторами UB6 и CMV,регулирующими молекулу ЕрСАМ. Когда участок STAR67 является функциональным, то колонии будут выживать, когда оба, зеоцин и пуромицин, одновременно используются в качестве селективного агента. Когда участок STAR67 не является функциональным, то колонии не будут выживать в аналогичных условиях селекции. Следовательно, помещение STAR67 слева от промотора приводит к достоверно более высокому уровню экспрессии антитела ЕрСАМ в клетках СНО, по сравнению с конструкциями без таких антирепрессорных элементов. Аналогичный опыт проводили с промотором SV40 для регуляции экспрессии тяжелой и легкой цепей анти-ЕрСАМ-антитела. В других опытах STAR67 заменяли на другие последовательности STAR. В дополнительных опытах поменяли ориентацию двух экспрессирующих единиц,кодирующих тяжелую и легкую цепи, таким образом, что обе находились в одном направлении. В другом опыте экспрессирующие единицы для тяжелой и легкой цепей помещают соответственно в различных молекулах нуклеиновой кислоты (как представлено в примере 5) и полученные клоны одновременно отбирают на оба селектируемых маркера. В еще одном опыте варьировал тип клетки-хозяина. Сделаны комбинации данных вариаций. Описание фигур Фиг. 1. Схема изобретения. А) Бицистронный ген, содержащий (в направлении от 5' к 3') трансген (кодирующий, например, генd2EGFP), IRES и селектируемый маркер (зео, придающий резистентность к зеоцину) под контролем промотора CMV. Экспрессирующая единица содержит терминатор транскрипции SV40 на ее 3'-конце (t). Конструкция названа CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV контроль).B) Конструкция, как на А, но последовательность STAR67 клонирована слева от промотора CMV. Конструкция названа STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).C) Конструкция, как на В, но слева и справа элементы STAR67 клонированы для фланкирования полной конструкции. Конструкция названа STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMVSTAR67 7/7). Фиг. 2. STAR67 повышает регулируемую CMV экспрессию d2EGFP в клетках СНО. Построен график зависимости среднего значения сигнала d2EGFP для 10 независимых стабильных колоний для указанных конструкций в клетках СНО. A) CMV контроль; В) STAR67-CMV. Х(10): средние значения уровня экспрессии d2EGFP для 10 колоний. Подробности см. в примере 2. Фиг. 3. STAR67 повышает регулируемую EF1 экспрессию d2EGFP в клетках СНО. То же самое,что на фиг. 2, но с промотором EF1. A) EF1 контроль; В) STAR67-EF1. Фиг. 4. STAR67 повышает регулируемую UB6 экспрессию d2EGFP в клетках СНО. То же самое,что на фиг. 2 и 3, но с промотором UB6. A) UB6 контроль; В) STAR67-UB6. Фиг. 5. STAR67 повышает регулируемую CMV экспрессию d2EGFP в клетках PER.С 6. То же самое,что на фиг. 2, но в клетках PER.C6. A) CMV контроль; В) STAR67-CMV. Фиг. 6. STAR67 повышает регулируемую EF1 экспрессию d2EGFP в клетках PER.C6. То же самое,что на фиг. 3, но в клетках PER.C6. A) EF1 контроль; В) STAR67-EF1. Фиг. 7. STAR67 повышает регулируемую UB6 экспрессию d2EGFP в клетках PER.C. To же самое,что на фиг. 4, но в клетках PER.C6. A) UB контроль; В) STAR67-UB6. Фиг. 8. STAR67 повышает регулируемую SV40 экспрессию d2EGFP в клетках СНО-Kl в комбинации с другим элементом STAR. To же самое, что на фиг. 2, но с использованием промотора SV40 в клетках СНО и указанных конструкций. Построен график зависимости среднего значения сигнала d2EGFP для 18-20 независимых стабильных колоний через 60 суток после трансфекции. A) SV40 контроль, SV40STAR67, SV40-STAR7/7; В) SV40 контроль и SV40-STAR67 7/7. Подробности см. в примере 4. Фиг. 9. STAR67 повышает регулируемую UB6 экспрессию антитела ЕрСАМ в клетках СНО-Kl. Подробности см. в примере 5. А) Конструкции без элементов STAR; В) конструкции со STAR67 слева от промотора и фланкирующими элементами STAR7. Концентрация анти-ЕрСАМ-антитела представлена в виде пкг/клетку/сутки. Х(18): среднее значение уровня продукции для 18 колоний. Фиг. 10. STAR67 не является блокатором энхансера, в то время как STAR6 и STAR7 являются. Подробности см. в примере 6. Фиг. 11. STAR67 повышает регулируемую UB6 и CMV экспрессию антитела в стабильно трансфицированных клетках СНО. Подробности см. в примере 7. А) Одна молекула ДНК, содержащая тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC) анти-ЕрСАМ-антитела, каждая за промотором, и каждая связанная с различным селектируемым маркерным геном (использовали одновременную селекцию на оба маркера): конструкция без элементов STAR. Колонии не обнаружены. В) Та же конструкция со STAR67 между двумя промоторами. Концентрация анти-ЕрСАМ-антитела в пкг/клетку/сутки. Х(19): среднее значение уровня продукции для 19 колоний. Источники литературы