Антитела, направленные против бета-амилоидного пептида, и способы их использования

ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Описаны антитела, направленные против С-концевого участка -амилоидного пептида и способы использования этих антител для диагностики и лечения болезни Альцгеймера и связанных с пептидом А заболеваний. Примечание: библиография отражает состояние при переиздании 016193 По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США серийный 60/676093, поданной 29 апреля 2005 г., и патентной заявки США серийный 60/704818, поданной 1 августа 2005 г.,полное содержание которых приведено здесь в качестве ссылки. Область изобретения Настоящее изобретение относится к антителам к бета-амилоидному пептиду. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению таких антител для лечения и/или предупреждения заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Предпосылки изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой дегенеративное повреждение мозга, клинически характеризующееся прогрессирующими нарушениями памяти, спутанностью сознания, постепенным физическим истощением и, в конечном счете, смертью. Во всем мире приблизительно 15 миллионов человек поражены болезнью Альцгеймера, и ожидают, что их число будет значительно увеличиваться с увеличением продолжительности жизни. Гистологически заболевание характеризуется очагами неврита,обнаруживаемыми в первую очередь в ассоциативной зоне коры головного мозга, лимбической системе и базальных ганглиях. Основным компонентом этих очагов является бета-амилоидный пептид (А), являющийся продуктом расщепления белка-предшественника бета-амилоида (АРР или АРР). АРР представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I, содержащий большой эктопический N-концевой домен, трансмембранный домен и малый цитоплазматический С-концевой хвост. Альтернативный сплайсинг транскрипта одного гена АРР на хромосоме 21 приводит к нескольким изоформам, которые отличаются числом аминокислот. А, по-видимому, играет центральную роль в нейропатологии болезни Альцгеймера. Семейные формы заболевания сцеплены с мутациями в генах АРР и пресенилина (Tanzi et al., 1996, Neurobiol. Dis. 3:159-168; Hardy, 1996, Ann. Med. 28:255-258). Сцепленные с заболеванием мутации в этих генах приводят к увеличенной продукции формы А из 42 аминокислот, преобладающей формы, обнаруженной в амилоидных бляшках. Более того, иммунизация трансгенных мышей со сверхэкспрессией сцепленной с заболеванием мутантной формы АРР с использованием А человека уменьшает объем бляшек и связанных патологий (Schenk et al., 1999, Nature 400:173-177; WO 99/27944), а периферическое введение антител, направленных против А, также уменьшает объем бляшек в мозге (Bard et al., 2000, Nature Medicine 6(8):916-919; WO 2004/032868; WO 00/72880). Опубликовано, что Fc-опосредованный фагоцитоз микроглиальными клетками и/или макрофагами является важным в процессе очищения от бляшек in vivo. Bard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 20232028 (2003). Однако опубликовано также, что неопосредованные Fc механизмы также вовлечены в клиренс амилоида- in vivo в результате иммунотерапии. Bacskai et al., J. Neurosci. 22:7873-7878 (2002); Daset al., J. Neurosci. 23:8532-8538 (2003). Таким образом, терапия антителами предоставляет многообещающий способ лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. Однако клинические испытания на людях вакцины, содержащей А 1-42,приостановлены из-за менингоэнцефалита в подгруппе пациентов. Orgogozo et al., Neruology 61:7-8(2003); Ferrer et al., Brain Pathol. 14:11-20 (2004). Опубликовано, что пассивная иммунизация специфическим к N-концу анти-А антителом приводит к значительному уменьшению большинства диффузного амилоида, однако индуцирует увеличение частоты церебральной микрогеморрагии у трансгенных мышей, обладающих связанными с возрастом развитием амилоидных бляшек и нейродегенерацией, так же как церебральной амилоидной ангиопатией (САА), сходными с наблюдаемыми в мозге человека с AD.Pfeifer et al., Science 298:1379 (2002). Предполагают, что обострение связанной с церебральной амилоидной ангиопатией (САА) микрогеморрагии у трансгенных по АРР мышей в результате пассивной иммунизации антителом, направленным против бета-амилоида, зависит от узнавания антителом депонированных форм бета-амилоидного пептида. Racke et al., J. Neurosci. 25:629-636 (2005). Чтобы уменьшить риск воспаления, предлагают пассивную иммунизацию антителами против пептидного компонента отложения амилоида, где антитела лишены Fc-областей. WO 03/086310. Остается необходимость в антителах и других иммунотерапевтических средствах, направленных против А, обладающих улучшенными показателями эффективности и безопасности, и подходящих для применения у пациентов-людей. На всем протяжении данной заявки приведены ссылки на различные публикации (включая патенты и патентные заявки). Полное содержание этих публикаций приведено здесь в качестве ссылки. Краткая сущность изобретения Описанное здесь изобретение относится к антителам и полипептидам, связывающимся с С-концом пептида А. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или полипептиду, связывающемуся с A1-40, A1-42 и A1-43, где антитело или полипептид связывается с A1-40 с более высокой аффинностью, чем аффинность его связывания с A1-42 и A1-43, и где антитело или полипептид связывается с эпитопом на A1-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с A1-40 с аффинностью, по меньшей мере приблизительно в 40 раз превышающей аффинность его связывания с A1-42 и/или A1-43. В некоторых вариантах осуществления антитело не является антителом 2294.-1 016193 В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу 6G (взаимозаменяемо обозначенному "6G"). Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи 6G показаны на фиг. 1. Части определяющей комплементарность области (CDR) антитела 6G (включая CDRChothia и Kabat) также показаны на фиг. 1. В другом аспекте настоящее изобретение также относится к вариантам антитела 6G с аминокислотными последовательностями, показанными в табл. 3. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему фрагмент или область антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления фрагмент представляет собой легкую цепь антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи, показанных на фиг. 1. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько CDR из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G. В другом аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам (которые могут являться или не являться антителом), содержащим любое одно или несколько из следующего: а) одну или несколькоCDR антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; b) CDR H3 из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; с) CDR L3 из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; d) три CDR из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; е) три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; f) три CDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептидам (которые могут являться или не являться антителом),содержащим любое одно или несколько из следующего: а) одну или несколько (одну, две, три, четыре,пять или шесть) CDR, полученных из антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; b) CDR, полученную из CDR H3 из тяжелой цепи антитела 6G; и/или с) CDR, полученную из CDR L3 из легкой цепи антитела 6G. В некоторых вариантах осуществления CDR представляет собой CDR, показанную на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько CDR, полученные из антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3, являются по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88%, по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичными по меньшей мере одной, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести CDR 6G или его вариантов. В некоторых вариантах осуществления CDR представляет собой CDR Kabat. В других вариантах осуществления CDR представляет собой CDR Chothia. В других вариантах осуществления CDR представляет собой сочетание CDR Kabat и Chothia (обозначаемое также "комбинированная CDR" или "расширенная CDR"). Другими словами, для любого данного варианта осуществления, относящегося более чем к одной CDR, CDR могут представлять собой любые из Kabat, Chothia и/или являться комбинированными. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой антитело человека. В других вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело (или полипептид) является выделенным. В некоторых вариантах осуществления антитело (или полипептид) является в основном чистым. Константная область тяжелой цепи антител может происходить из любых типов константной области, таких как IgG, IgM, IgD, IgA и IgE; и любых изотипов, таких как IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид, описанные здесь, обладают нарушенной эффекторной функцией. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид содержит константную область тяжелой цепи с нарушенной эффекторной функцией, где константная область тяжелой цепи содержит Fc-область. В некоторых вариантах осуществления удалено Nгликозилирование Fc-области. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит мутацию внутри последовательности узнавания для N-гликозилирования, в результате чего Fc-область антитела или полипептида не является N-гликозилированной. В некоторых вариантах осуществления Fc-область является пегилированной. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела или полипептида представляет собой константную область тяжелой цепи IgG2a человека, содержащую следующие мутации: А 330 Р 331 до S330S331 (нумерация аминокислот по отношению к последовательности IgG2a дикого типа). В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид содержит константную область IgG4, содержащую следующие мутации: E233F234L235 до P233V2 34A235. Эти положения аминокислот основаны на нумерации Kabat.-2 016193 В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду (который может являться выделенным),содержащему полинуклеотид, кодирующий фрагмент или область антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления фрагмент представляет собой легкую цепь антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько (т.е., одну, две, три, четыре, пять, шесть) определяющих комплементарность областей (CDR) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G. В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду (который может являться выделенным), содержащему полинуклеотид, кодирующий антитело 6G или его варианты, показанные в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит один из двух или оба из полинуклеотидов, показанных на SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любое из антител(включая фрагменты антитела) или полипептидов, описанных здесь. В другом аспекте изобретение относится к векторам (включая экспрессирующие и клонирующие векторы) и клеткам-хозяевам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных здесь. В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, кодирующий любое из антител, описанных здесь. В другом аспекте изобретение относится к комплексу A1-40, связанного с антителом 6G или его вариантами, показанными в табл. 3. В другом аспекте изобретение относится к комплексу A1-40, связанного с любым из антител или полипептидов, описанных здесь. В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество любого из антител, полипептидов или полинуклеотидов, описанных здесь, и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления антитела или полипептиды содержат одну или несколько CDR антитела 6G. В другом аспекте изобретение относится к способу получения антитела 6G, включающему в себя культивирование клетки-хозяина или ее потомства в условиях, позволяющих продукцию антитела 6G,где клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, кодирующий антитело 6G; и в некоторых вариантах осуществления очистку антитела 6G. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор содержит одну или обе из полинуклеотидных последовательностей, показанных на SEQ ID NO:9 иSEQ ID NO:10. В другом аспекте изобретение относится к способам получения антител или полипептидов, описанных здесь, посредством экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело (которое можно экспрессировать отдельно как отдельную легкую или тяжелую цепь, или как легкую и тяжелую цепь, экспрессированные с одного вектора) или полипептид, в подходящей клетке, как правило, с последующим выделением и/или очисткой интересующих антитела или полипептидов. Изобретение также относится к способу предупреждения, лечения, ингибирования или задержки развития болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией А или АРР, или накоплением пептида А, таких как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменция с тельцами Леви и СПИД. Способ включает в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. Изобретение также относится к способу задержки развития симптома, связанного с болезнью Альцгеймера или другими заболеваниями, связанными с накоплением пептида А у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. Изобретение относится также к способу подавления формирования амилоидных бляшек и/или накопления амилоида у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения. Изобретение относится также к способу уменьшения амилоидных бляшек и/или накопления амилоида у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения. Изобретение относится также к способу удаления амилоидных бляшек и/или накопления амилоида-3 016193 у субъекта или очистки от них, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения. Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования накопления пептида А в ткани,включающему в себя контактирование ткани с антителом или полипептидом по настоящему изобретению. Изобретение относится также к способу уменьшения уровня пептида А (например, в растворимой,олигомерной и депонированной форме) у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективного количества антитела, полипептида или полинуклеотида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления накопление пептида А ингибируют и/или уменьшают в мозге. В некоторых вариантах осуществления ингибируют и/или уменьшают токсические эффекты пептида А. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно использовать для лечения любого заболевания, при котором присутствует, или при котором предполагают накопление пептида А, такого как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба или деменция с тельцами Леви. Изобретение относится также к способам улучшения когнитивных функций или обращения когнитивного ухудшения, связанного с заболеваниями, связанными с амилоидным отложением А у субъекта,такими как болезнь Альцгеймера, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению. Любые антитела, полипептиды или полинуклеотиды, описанные здесь, можно применять в способах по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело 6G. Кроме того, антитела и полипептиды по изобретению можно использовать для выявления, диагностики и мониторирования болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией А или АРР, таких как синдром Дауна и СПИД. Способ включает в себя контактирование образца от пациента, подозреваемого в наличии измененной экспрессии А или АРР, с антителом по изобретению и определение, отличается ли уровень А или АРР от уровня в контрольном или сравнительном образце. В некоторых вариантах осуществления уровень А в сыворотке измеряют до и после введения анти-А антитела; и оценивают любое увеличение уровня А в сыворотке. Введение любого антитела или полипептида по изобретению можно осуществлять любыми способами, известными в данной области, включая: внутривенно, подкожно, посредством ингаляции, внутриартериально, внутримышечно, интракардиально, интравентрикулярно, парентерально, интратекально и внутрибрюшинно. Введение может являться системным, например, внутривенным или местным. Это также относится в общем к полипептидам и полинуклеотидам по настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение относится к наборам и композициям, содержащим одну или несколько из композиций, описанных здесь. Эти наборы, как правило, в подходящих упаковках и снабженные соответствующими инструкциями являются применимыми в любом из способов, описанных здесь. Краткое описание некоторых изображений на чертеже (чертежах) На фиг. 1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQID NO:1) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:2) антитела 6G. CDR Kabat показаны жирным текстом, a CDR Chothia подчеркнуты. Аминокислотные остатки вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи пронумерованы последовательно. На фиг. 2 показано картирование эпитопов антитела 6G посредством ELISA. Пептиды А (1-16, 128, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 и 33-40) иммобилизовали на планшетах дляELISA. Моноклональное антитело 6G (20 нМ) инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 6G с иммобилизованными пептидами А измеряли с использованием вторичного антитела козы против каппа человека, конъюгированного с HRP. На фиг. 3 показано картирование эпитопов антитела 6G посредством ELISA. Различные пептиды А (обозначенные SEQ ID NO:18-29 сверху вниз последовательности) иммобилизовали на планшетах для ELISA. Антитело 6G инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 6G с иммобилизованными пептидами А измеряли с использованием вторичного антитела козы против каппа человека, конъюгированного с HRP. "NB" обозначает отсутствие выявленного связывания. Фиг. 4 представляет собой схематический чертеж, показывающий эпитоп, с которым антитело 6G связывается на А. Показаны относительные положения А на белке-предшественнике амилоида (АРР) и часть АРР на мембране клетки. "СТ 99" обозначает 99 С-концевых аминокислот АРР. Показанная аминокислотная последовательность обозначена SEQ ID NO:30. Фиг. 5 представляет собой фотографию, показывающую иммунное окрашивание экспрессирующих-4 016193 АРР клеток с помощью моноклонального антитела, направленного против A1-16 (m2324) и антитела 6G. На верхних панелях показаны клетки под флуоресцентным микроскопом после того, как клетки инкубировали с m2324 или 6G (5 мкг/мл каждое) и окрашивали вторичным Су 3-конъюгированным антителом козы против антител мыши или против антител человека. На нижних панелях показаны клетки, наблюдаемые под микроскопом. На фиг. 6 показано картирование эпитопов антител 2294 и 6G посредством ELISA. Различные пептиды А (обозначенные SEQ ID NO:18-26, 31 и 27-29 сверху вниз последовательности) иммобилизовали на планшетах для ELISA. Антитела инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 6G с иммобилизованными пептидами А измеряли с использованием конъюгированного с HRP вторичного антитела козы против каппа человека. Связывание антитела 2294 с иммобилизованными пептидами А измеряли с использованием антитела козы против антител мыши,которое связывает и тяжелую, и легкую цепь, и представляет собой вторичное антитело, конъюгированное с HRP. "NB" обозначает отсутствие выявленного связывания. Числами в колонках под "2294" и "6G" представлено поглощение при 450 нм. Подробное описание изобретения Описанное здесь изобретение относится к антителам и полипептидам, которые связываются с Сконцом А. Изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим эти антитела и/или полипептиды. Изобретение относится также к способам получения и использования этих антител и полипептидов. Изобретение относится также к способам лечения или предупреждения у субъекта заболеваний,связанных с отложением -амилоида у индивидуума, таких как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна,мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба и деменция с тельцами Леви, посредством введения субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид, кодирующие антитело или полипептид, описанные здесь. Общие способы В практике изобретения, если нет иных указаний, будут применять общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, находящиеся в компетенции специалистов в данной области. Такие способы в полной мере описаны в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et"Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид, и т.д., посредством по меньшей мере одного участка узнавания антигена, локализованного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Как применяют здесь, термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные антитела (ScFv), их мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую участок узнавания антигена. Антитело включает в себя антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело не должно принадлежать какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно далее разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта,эпсилон, гамма и мю соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Как применяют здесь, "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популя-5 016193 ции в основном гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направлены против одного участка антигена. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, как правило, содержащих различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение "моноклональные" указывает на характер антитела как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить способом гибридомы, первоначально описанным Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495, или можно получить способами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США 4816567. Моноклональные антитела можно также выделить из фаговых библиотек, полученных с использованием способов, описанных, например, в McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. Как используют в настоящем описании, "гуманизированные" антитела относятся к формам не относящихся к человеку (например, мышиных) антител, представляющих собой специфические химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи, или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащим минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющей комплементарной области (CDR) реципиента заменяют остатками из CDR не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области(FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не присутствующими у человека остатками. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, не обнаруженные ни в антителереципиенте, ни в импортированных последовательностях CDR или каркаса, но включенные для дополнительного усовершенствования и оптимизации характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все по меньшей мере из одного, и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из областей CDR, соответствующих областям не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном области FR являются областями с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, не обязательно, содержит по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Антитела могут обладать Fc-областями, модифицированными, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител обладают одной или несколькими CDR (одной,двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью), измененными по отношению к исходному антителу, которые обозначают также одной или несколькими CDR "полученными из" одной или нескольких CDR из исходного антитела. Как применяют здесь, "антитело человека" обозначает антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком и/или полученное с применением любого из способов получения антител человека, известных в данной области или описанных здесь. Данное определение антитела человека включает в себя антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека. Антитела человека можно получить с использованием различных способов, известных в данной области. В одном варианте осуществления антитело человека отбирают из фаговой библиотеки, где эта фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al. , 1996,Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter,1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Антитела человека можно также получить введением локуса иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов являются частично или полностью инактивированными. Этот способ описан в патентах США No. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016. Альтернативно, антитело человека можно получить иммортализацией В-лимфоцитов, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты можно выделить из индивидуума, или их можно иммунизировать in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal . Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; и патент США No. 5750373. Как применяют здесь, термины "6G" и "антитело 6G" используют как взаимозаменяемые для обозначения антитела, обладающего аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, показанной наSEQ ID NO:11, и аминокислотной последовательностью легкой цепи, показанной на SEQ ID NO:12. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи показаны на фиг. 1. Части CDR антитела 6G (включая CDR Chothia и Kabat) схематически представлены на фиг. 1. Полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепь, показаны на SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14. Характеризация 6G описана в примерах. Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" используют здесь как взаимозаменяе-6 016193 мые для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может являться линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его можно прерывать не аминокислотами. Термины охватывают также аминокислотный полимер, модифицированный естественным образом или посредством вмешательства; например, формированием дисульфидной связи, гликозилированием, введением липида, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с меченным компонентом. В определение входят также, например,полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, и т.д.), также как другие модификации, известные в данной области. Понятно, что, поскольку полипептиды по настоящему изобретению основаны на антителе, полипептиды могут присутствовать в форме отдельных цепей или связанных цепей."Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" используют здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров из нуклеотидов любой длины, включая ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который можно включать в полимер посредством ДНК- или РНКполимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификацию структуры нуклеотида, если она присутствует, можно вводить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов можно прерывать не относящимися к нуклеотидам компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, например, посредством конъюгации с меченым компонентом. Другие типы модификации включают в себя, например, "кэпы", замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами,межнуклеотидные модификации, например, такие как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями(например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации, содержащие боковые группы, например, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин, и т.д.), модификации, содержащие интеркалирующие вещества (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкиляторы, модификации с модифицированными связями(например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты, и т.д.), также как немодифицированные формы полинуклеотида(полинуклеотидов). Кроме того, любые из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахарах, можно заменить, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защитить общепринятыми защитными группами или активировать для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или можно конъюгировать с твердыми подложками. 5'- и 3'-концевой ОН можно фосфорилировать или замещать аминами или молекулами органических кэппирующих групп от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также можно дериватизировать общепринятыми защитными группами. Полинуклеотиды могут также содержать формы аналогов сахаров рибозы или дезоксирибозы,которые широко известны в данной области, включая, например, 2'-О-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, -аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как сахара арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозу, фуранозу, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одну или несколько фосфодиэфирных связей можно заменить альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают в себя в качестве неограничивающих примеров варианты осуществления, где фосфат заменяют Р(О)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', СО или СН 2 ("формацеталь"), в которых каждый из R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С); необязательно, содержащий простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Нет необходимости, чтобы все связи в полинуклеотиде являлись идентичными. Предшествующее описание относится ко всем полинуклеотидам, перечисленным здесь, включая РНК и ДНК."Вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо по отдельности, либо в сочетании. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), известными также как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в близком соседстве посредством FR и, вместе с CDR из другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител. Существует по меньшей мере два способа определения CDR: (1) способ на основе межвидовой вариабельности последовательности (т.е., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed. , 1991, National Institutesof Health, Bethesda MD; и (2) способ на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948. Как применяют здесь, CDR может относится к CDR, определяемым посредством любого из способов, или посредством сочетания обоих способов."Константная область" антитела обозначает константную область легкой цепи антитела или константную область тяжелой цепи антитела, либо по отдельности, либо в сочетании. Эпитоп, который "избирательно связывается" или "специфически связывается" (применяют здесь-7 016193 взаимозаменяемо) с антителом или полипептидом, представляет собой термин, хорошо известный в данной области, и способы для определения такого специфического или избирательного связывания также хорошо известны в данной области. Говорят, что для молекулы показали "специфическое связывание" или "избирательное связывание", если она реагирует или связывается более часто, более быстро, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело "специфически связывается" или "избирательно связывается" с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более быстро,и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, антитело,которое специфически или избирательно связывается с эпитопом A1-40, представляет собой антитело,которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более быстро, и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами A1-40 или не относящимися к A1-40 эпитопами. Из чтения данного определения понятно также, что, например, антитело (или группа, или эпитоп), которое специфически или избирательно связывается с первой мишенью, может специфически или избирательно связываться, или не связываться, со второй мишенью. Как таковое, "специфическое связывание" или "избирательное связывание" не обязательно требует (хотя может включать в себя) исключительное связывание. Как правило, однако не обязательно, ссылка на связывание означает избирательное связывание. Как применяют здесь, "по существу, чистый" относится к веществу, являющемуся по меньшей мере на 50% чистым (т.е., свободным от загрязнений), более предпочтительно по меньшей мере на 90% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99% чистым."Клетка-хозяин" включает в себя отдельную клетку или культуру клеток, которая может являться или является реципиентом для вектора(векторов) для введения полинуклеотидных вставок. Клеткихозяева включают в себя потомство отдельной клетки-хозяина, и потомство не обязательно является полностью идентичным исходному родителю (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) из-за природной, случайной или намеренной мутации. Клетка-хозяин включает в себя клетки,трансфицированные in vivo полинуклеотидом(полинуклеотидами) по настоящему изобретению. Термин "Fc-область" применяют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. "Fc-область" может представлять собой природную последовательность Fc-области или вариантFc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут меняться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно обозначают как простирающуюся от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до ее С-конца. Нумерация остатков в Fc-области представляет собой нумерацию по индексу EU, как в Kabat. Rabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc-область иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена, СН 2 и СН 3. Как применяют здесь, "Fc-рецептор" и "FcR" обозначает рецептор, связывающийся с Fc-областью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой природную последовательность FcR человека. Более того предпочтительным FcR является тот, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов FcRI, FcRII и FcRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcRII включают в себя FcRIIA ("активирующий рецептор") и FcRIIB ("ингибирующий рецептор"), обладающие сходными аминокислотными последовательностями, различающимися в первую очередь их цитоплазматическими доменами. Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:2534; и de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" включает в себя также неонатальный рецептор, FcRn, ответственный за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; и"Комплементзависимая цитотоксичность" и "CDC" обозначают лизис мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента запускается связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образовавшей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro"Функциональная Fc-область" обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией природной последовательности Fc-области. Примеры "эффекторных функций" включают в себя связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клеток (например В-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило,требуют объединения Fc-области со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием различных анализов, известных в данной области для оценки таких эффекторных функций антитела."Природная последовательность Fc-области" включает в себя аминокислотную последовательность,идентичную с аминокислотной последовательностью Fc-области, обнаруженной в природе. "Вариант Fc-8 016193 области" включает в себя аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности природной последовательности Fc-области в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, еще сохраняющую по меньшей мере одну эффекторную функцию природной последовательности Fc-области. Предпочтительно, вариант Fc-области обладает по меньшей мере одной аминокислотной заменой по сравнению с природной последовательностью Fc-области или с Fc-областью родительского полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в природной последовательности Fc-области или в Fc-области родительского полипептида. Вариант Fc-области здесь предпочтительно будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности с природной последовательностью Fc-области и/или с Fc-областью родительского полипептида и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с ними, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с ними. Как применяют здесь "антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность" и "ADCC" обозначает опосредуемую клетками реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки,экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, натуральные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Активность интересующей молекулы в ADCC можно оценить с использованием анализа ADCC in vitro, такого как описан в патентах США No. 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность интересующей молекулы в ADCC можно оценить in vivo,например, в модели на животных, такой как описанная в Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656. Как применяют здесь, "эффективная доза" или "эффективное количество" лекарственного средства,соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желаемых результатов. В случае профилактического использования благоприятные или желаемые результаты включают в себя такие результаты, как исключение или уменьшение риска, снижение тяжести, или отсрочка дебюта заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания. В случае терапевтического использования благоприятные или желаемые результаты включают в себя такие клинические результаты, как ингибирование,подавление или уменьшение формирования амилоидных бляшек, уменьшение, удаление амилоидных бляшек, очистка от них, улучшение когнитивных функций, обращение или замедление когнитивных нарушений, секвестрирование или увеличение количества растворимого пептида А, циркулирующего в биологических жидкостях, уменьшение одного или нескольких симптомов, возникающих в результате заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания, увеличение качества жизни страдающих заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства, задержка прогрессирования заболевания, и/или продление выживаемости пациентов. Эффективную дозу можно вводить одним или несколькими введениями. Для целей по настоящему изобретению эффективная доза лекарственного средства, соединения, или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения, либо напрямую, либо опосредованно. Как понятно в клиническом контексте, эффективной дозы лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции можно достигать в объединении или не в объединении с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективную дозу" можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких лекарственных средств, и можно рассматривать отдельное средство как введенное в эффективном количестве, если, в объединении с одним или несколькими другими средствами, можно быть достигнут или достигнут желаемый результат. Как применяют здесь, "лечение" или "обработка" представляет собой способ получения благоприятных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Для целей по настоящему изобретению благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя в качестве неограничивающих примеров одно или несколько из следующего: ингибирование, подавление или уменьшение формирования амилоидных бляшек, уменьшение, удаление амилоидных бляшек или очистка от них, улучшение когнитивных функций, обращение или замедление когнитивных нарушений, секвестрирование растворимого пептида А, циркулирующего в биологических жидкостях, уменьшение количества пептида А (включая растворимый, олигомерный и депонированный) в ткани (такой как мозг), ингибирование,замедление и/или уменьшение накопления пептида А в мозге, ингибирование, замедление и/или уменьшение токсических эффектов пептида А в ткани (такой как мозг), уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, увеличение качества жизни страдающих заболеванием, уменьшение дозы-9 016193 других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, задержка прогрессирования заболевания, и/или продление выживаемости пациентов. Как применяют здесь, "задержка" развития болезни Альцгеймера означает откладывание, затруднение, замедление, торможение, стабилизацию и/или отсрочку развития заболевания. Эта задержка может продолжаться различные периоды времени, в зависимости от истории заболевания и/или подлежащего лечению индивидуума. Как очевидно специалисту в данной области, достаточная или значительная задержка может, в сущности, включать в себя предупреждение, при котором у индивидуума не развивается заболевание. Способ "задержки" развития болезни Альцгеймера представляет собой способ уменьшения вероятности развития заболевания в заданный интервал времени и/или снижения тяжести заболевания в заданный интервал времени по сравнению с не использованием способа. Такие сравнения, как правило,основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого числа субъектов."Развитие" болезни Альцгеймера означает дебют и/или прогрессирование болезни Альцгеймера у индивидуума. Развитие болезни Альцгеймера можно детектировать с использованием общепринятых клинических способов, как описано здесь. Однако развитие относится также к прогрессированию заболевания, которое первоначально может не поддаваться детекции. Для целей по настоящему изобретению прогрессирование относится к биологическому курсу состояния заболевания, в данном случае, как определяют посредством общепринятого неврологического осмотра или опроса пациента, или как можно определить посредством более специализированного тестирования. Множество этих диагностических тестов включают в себя в качестве неограничивающих примеров нейровизуализацию, выявление изменений уровней конкретных белков в сыворотке или спинномозговой жидкости (например, амилоидных пептидов и Tau), компьютерную томографию (СТ) и магнитно-резонансную томографию (MRI). "Развитие" включает в себя возникновение, рецидив и дебют. Как применяют здесь, "дебют" или "возникновение" болезни Альцгеймера включает в себя первичный дебют и/или рецидив. Как применяют здесь, введение "в сочетании" включает в себя одновременное введение и/или введение в разное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместного состава или введение в качестве отдельных композиций. Как применяют здесь, введение в сочетании предназначено,чтобы охватывать любые условия, при которых индивидууму вводят анти-А антитело и другое средство, что может происходить одновременно и/или по отдельности. Как обсуждают здесь далее, понятно,что анти-А антитело и другое средство можно вводить с различными частотами или интервалами дозирования. Например, анти-А антитело можно вводить раз в неделю, в то время как другое средство можно вводить менее часто. Понятно, что анти-А антитело и другое средство можно вводить с использованием одного и того же способа введения или разных способов введения."Биологический образец" включает в себя множество типов образцов, полученных от индивидуума,и его можно использовать в диагностическом или контролирующем анализе. Определение охватывает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы твердой ткани, такие как образец после биопсии, или культуры тканей или клеток, полученные из них, и их потомство. Определение включает в себя также образцы, подвергаемые после их получения любым манипуляциям, таким как обработка реагентами, солюбилизация или обогащение конкретными компонентами, такими как белки или полинуклеотиды, или погружение в полутвердое или твердое связующее с целью получения срезов. Термин "биологический образец" охватывает клинический образец и включает в себя также клетки в культуре, супернатанты клеток, лизаты клеток, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы ткани."Субъект" (альтернативно обозначаемый "индивидуум") представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают в себя в качестве неограничивающих примеров, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки, лошади), приматов, мышей и крыс. Как применяют здесь, "вектор" обозначает конструкцию, способную доставлять и предпочтительно экспрессировать один или несколько интересующих ген(ов) или последовательность (последовательностей) в клетке-хозяине. Примеры векторов включают в себя в качестве неограничивающих примеров вирусные векторы, экспрессирующие векторы из голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, экспрессирующие ДНК-или РНК-векторы, связанные с катионными конденсирующими средствами, экспрессирующие ДНК- или РНК-векторы, инкапсулированные в липосомы, и конкретные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты. Как применяют здесь, "контролирующая экспрессию последовательность" обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, управляющую транскрипцией нуклеиновой кислоты. Контролирующая экспрессию последовательность может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор или энхансер. Контролирующая экспрессию последовательность является функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрипции. Как применяют здесь, "фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя любое вещество,которое, при объединении с активным ингредиентом, позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не реагирует с иммунной системой субъекта. Неограничивающие примеры включают в себя- 10016193 любой из общепринятых фармацевтических носителей, такой как фосфатно-солевой буфер, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы увлажняющих веществ. Предпочтительными разбавителями для аэрозоля или парентерального введения являются фосфатно-солевой буфер или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, составляют хорошо известными общепринятыми способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000). Термин "kon", как применяют здесь, предназначен для обозначения константы скорости для связывания антитела с антигеном. Термин "koff", как применяют здесь, предназначен для обозначения константы диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген. Термин "KD", как применяют здесь, предназначен для обозначения константы равновесия диссоциации для взаимодействия антитело-антиген. Композиции и способы получения композиций Антиамилоидные антитела и полипептиды. Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с С-концом пептида А. Настоящее изобретение относится к антителу или полипептиду, связывающемуся с A1-40, A1-42 и A1-43. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид связывается с A1-40 с более высокой аффинностью, чем для его связывания с A1-42 и A1-43. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с A1-36, A1-37, A1-38 и A1-39. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с А 22-35. В некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с А 28-40. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид связывается с эпитопом на A1-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40. Настоящее изобретение также относится к композициям, включая фармацевтические композиции,содержащим любое из антител или полипептидов, описанных здесь (такие как антитело 6G и его варианты, показанные в табл. 3 или полипептид, полученный из антитела 6G и его вариантов, показанных в табл. 3); или полинуклеотиды, описанные здесь. Как применяют здесь, композиции содержат одно или несколько антител или полипептидов (которые могут являться или не являться антителом), которые связываются с С-концом A1-40, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или несколько антител или полипептидов, которые связываются с С-концом A140. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие наполнители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, включая буферы, которые хорошо известны в данной области. Антитела и полипептиды по настоящему изобретению характеризуются любой (одной или несколькими) из следующих характеристик: (а) связывание с A1-40, A1-42, и A1-43; (b) связывание с A1-40, A142, и A1-43 с более высокой аффинностью связывания с A1-40, чем с A1-42 и A1-43; (с) связывание с эпитопом на A1-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40; (d) связывание с A1-36, A1-37, A1-38 и A1-39,однако, с более низкой аффинностью по сравнению со связыванием с A1-40; (e) связывание с A22-37 с KD менее, чем приблизительно 1 мкМ; (f) связывание с A22-35; (g) связывание с A28-40; (h) отсутствие связывания с АРР, экспрессированным в клетке; (i) подавление формирования амилоидных бляшек у субъекта; (j) уменьшение амилоидных бляшек у субъекта; (k) лечение, предупреждение, облегчение одного или нескольких симптомов болезни Альцгеймера или другого связанного с накоплением А заболевания(например, синдрома Дауна, болезни Паркинсона, мультиинфарктной деменции, синдрома умеренных когнитивных нарушений, церебральной амилоидной ангиопатии, депрессии, болезни КрейтцфельдаЯкоба, деменции с тельцами Леви); (1) улучшение когнитивной функции. Антитела и полипептиды по изобретению могут также обладать нарушенной эффекторной функцией, описанной здесь. Антитела и полипептиды с нарушенной эффекторной функцией могут обладать желаемыми показателями безопасности в отличие от других опубликованных анти-А антител. Например, композиции по настоящему изобретению могут не вызывать существенных или неприемлемых уровней одного или нескольких из: кровотечения из сосудов мозга (церебральная геморрагия); менингоэнцефалит (включая изменения изображения магнитно-резонансного сканирования); повышенное число белых клеток крови в спинномозговой жидкости; воспаление в центральной нервной системе. Соответственно, настоящее изобретение относится к любому из следующего, или к композициям(включая фармацевтические композиции), содержащим любое из следующего: (а) антитело 6G или его варианты, показанные в таблице 3; (b) фрагмент или область антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; (с) легкая цепь антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (d) тяжелая цепь антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; (е) одна или несколько вариабельная область(области) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (f) одна или несколько CDR (одна, две, три, четыре, пять или шесть CDR) антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (g) CDR Н 3 из тяжелой цепи антитела 6G; (h) CDR L3 из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; (i) три CDR из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (j) три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в табл. 3; (к) триCDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; и (1) антитело, содержащее любое из (b)-(k). Настоящее изобретение также относится к полипептидам,содержащим любое одно или несколько из вышеуказанного. Части CDR антитела 6G (включая CDR Chothia и Kabat) схематически изображены на фиг. 1. Определение областей CDR полностью находится в компетенции специалистов в данной области. Понятно,что в некоторых вариантах осуществления CDR могут представлять собой сочетание CDR Kabat иChothia (называемые также "комбинированными CDR" или "расширенными CDR"). В некоторых вариантах осуществления CDR представляют собой CDR Kabat. В других вариантах осуществления CDR представляют собой CDR Chothia. Другими словами, в вариантах осуществления с более чем одной CDR,CDR могут представлять собой любое из Kabat, Chothia, комбинированных CDR, или их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду (который может являться или не являться антителом), содержащему по меньшей мере одну CDR, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть CDR, которые являются в основном идентичными по меньшей мере одной CDR, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или всем шести CDR из 6G или его вариантов,показанных в таблице 3. Другие варианты осуществления относятся к антителам, обладающим по меньшей мере двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью CDR, которые являются в основном идентичными по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести CDR 6G или полученным из 6G. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна, две, три, четыре, пять или шесть CDR являются по меньшей мере приблизительно на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 96, 97, 98, или на 99% идентичными по меньшей мере одной, двум, трем, четырем, пяти или шести CDR 6G или его вариантов, показанных в таблице 3. Понятно, что для целей настоящего изобретения специфичность связывания и/или общая активность,по существу, сохраняется, хотя степень активности может отличаться по сравнению с 6G или его вариантами, показанными в табл. 3 (может являться большей или меньшей). Настоящее изобретение также относится к полипептиду (который может являться или не являться антителом), содержащему аминокислотную последовательность 6G или его вариантов, показанных в табл. 3, обладающую одним из следующего по меньшей мере 5 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере 8 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 10 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 15 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 20 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 25 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 30 непрерывными аминокислотами из последовательности 6G или его вариантов, показанных в табл. 3, где по меньшей мере 3 из аминокислот происходят из вариабельной области 6G (фиг. 1) или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления вариабельная область происходит из легкой цепи 6G. В другом варианте осуществления вариабельная область происходит из тяжелой цепи 6G. Примерный полипептид обладает непрерывными аминокислотами (описанных выше длин) из вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепи 6G. В другом варианте осуществления 5 (или более) непрерывных аминокислот происходят из определяющей комплементарность области (CDR) из 6G, показанной на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления непрерывные аминокислоты происходят из вариабельной области 6G. Аффинности связывания антител и полипептидов по настоящему изобретению могут меняться и не обязательно должны составлять (но могут составлять) конкретное значение или диапазон, как в примерных вариантах осуществления, описанных ниже. Аффинность связывания (KD) антител и полипептидов по настоящему изобретению к A1-40 может составлять от приблизительно 0,10 до приблизительно 0,80 нМ, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,75 нМ и от приблизительно 0,18 до приблизительно 0,72 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно до 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ, или более чем приблизительно 40 пМ. В одном варианте осуществления аффинность связывания составляет приблизительно между 2 и 22 пМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ. В одном варианте осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 200 нМ, менее чем приблизительно 250 нМ, менее чем приблизительно 500 нМ или менее чем приблизительно 1000 нМ. В других вариантах осуществления, аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 5 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 1 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 0,1 нМ или приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аф- 12016193 финность связывания составляет менее чем приблизительно 0,1 нМ или менее чем приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет от любого из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ,приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ,приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ до любого из приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ или приблизительно 40 пМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания является любой из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ,приблизительно 10 пМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ или более чем приблизительно 40 пМ. Антитела и полипептиды по настоящему изобретению также могут связываться с одним или несколькими из A1-36, A1-37 A1-38, A1-39, A1-42 и A1-43, однако аффинность связывания с одним или несколькими из этих пептидов меньше, чем аффинности их связывания с A1-40. В некоторых вариантах осуществления KD антител или полипептидов для одного или нескольких из A1-36, A1-37, A1-38, A1-39,A1-42 и A1-43 по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз, по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 80 раз, по меньшей мере приблизительно в 100 раз, по меньшей мере приблизительно в 150 раз, по меньшей мере приблизительно в 200 раз или по меньшей мере приблизительно в 250 раз больше KD дляA1-40. Настоящее изобретение также относится к способам получения любого из этих антител или полипептидов. Антитела по настоящему изобретению можно получить способами, известными в данной области. Например, антитело можно получить посредством иммунизации млекопитающего пептидом А(таким как A25-40 в качестве иммуногена). Полипептиды можно получать посредством протеолитической или другой деградации антител, посредством рекомбинантных способов (т.е., отдельные или слитые полипептиды), как описано выше, или посредством химического синтеза. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды вплоть до приблизительно 50 аминокислот, удобно получать посредством химического синтеза. Способы химического синтеза известны в данной области и являются коммерчески доступными. Например, антитело можно получить посредством автоматического синтезатора полипептидов с применением твердофазного способа. См. также патенты США 5807715; 4816567; и 6331415. По другой альтернативе антитела можно получать с использованием рекомбинантных способов,хорошо известных в данной области. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела 6G, показанную на SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. В другом варианте осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, показанную на SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, клонируют в один или несколько векторов для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую интересующее антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и затем клетку-хозяина можно размножать и замораживать для будущего использования. Векторы (включая экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева дополнительно описаны здесь. Настоящее изобретение относится также к одноцепочечным фрагментам вариабельной области("scFv") антител по настоящему изобретению, таких как 6G. Одноцепочечные фрагменты вариабельной области получены посредством соединения вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием короткого связывающего пептида. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Примером связывающего пептида является (GGGGS)3, образующий мостик приблизительно 3,5 нм между С-концом одной вариабельной области и N-концом другой вариабельной области. Сконструировали и применили линкеры других последовательностей. Bird et al. (1988). Линкеры, в свою очередь, можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или присоединение к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получать либо рекомбинантным, либо синтетическим способом. Для синтетического получения scFv можно использовать автоматический синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv, подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий scFv, можно вводить в подходящую клетку-хозяин, либо эукариотическую, такую как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как Е. coli. Полинуклеотиды, кодирующие интересующую scFv, можно получить посредством общепринятых манипуляций, та- 13016193 ких как лигирование полинуклеотидов. Полученные scFv можно выделить с использованием общепринятых способов очистки белка, известных в данной области. Включены также другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессированы на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, таким образом заставляя домены спариваться с комплементарными доменами на другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участкаStructure 2:1121-1123). Например, биспецифические антитела, моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере для двух различных антигенов, можно получить с использованием антител,описанных здесь. Способы получения биспецифических антител известны в данной области (см., например, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител являлось основанным на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина с двумя тяжелыми цепями, обладающими различными специфичностями (Millstein и Cuello,1983, Nature 305, 537-539). Согласно одному способу получения биспецифических антител вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (участками объединения антитело-антиген) сливают с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Предпочтительно их сливают с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной, СН 2 и СН 3 областей. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (СН 1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слитых белков. ДНК, кодирующие слитые белки с тяжелой цепью иммуноглобулина и, если желательно, с легкой цепью иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это предоставляет большую гибкость в регулировании взаимного соотношения трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда с неравными соотношениями трех полипептидных цепей, применяемых в конструкции, достигают оптимального выхода. Однако можно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам, или когда соотношения не являются особенно важными. По одному способу биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и гибридной пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающего вторую специфичность связывания) на другом плече. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только на одной половине биспецифической молекулы облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулина. Этот способ описан в публикации РСТWO 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г. Гетероконъюгированные антитела, содержащие два ковалентно соединенных антитела, также входят в объем настоящего изобретения. Такие антитела использовали для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения инфекции HIV (публикация патентной заявки РСТWO 91/00360 и WO 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получить с использованием любых подходящих способов перекрестного сшивания. Подходящие средства и способы для перекрестного сшивания хорошо известны в данной области и описаны в патенте США 4676980. Химерные или гибридные антитела можно также получить in vitro с использованием известных способов химии белкового синтеза, включая способы, включающие в себя сшивающие средства. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или формированием тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат. Гуманизированное антитело, содержащее одну или несколько CDR антитела 6G или одну или несколько CDR, полученных из антитела 6G, можно получить с использованием любых способов, известных в данной области. Например, для гуманизации моноклонального антитела можно использовать четыре основные стадии. Это: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности легких и тяжелых вариабельных доменов исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. решение, каркасную область какого антитела использовать в ходе процесса гуманизации, (3) методы/способы фактической гуманизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762; 5585089; 6180370; 5225539; 6548640. В рекомбинантных гуманизированных антителах часть Fc можно модифицировать, чтобы избежать взаимодействия с Fc-рецептором и комплементом иммунной системы. Данный тип модификации сконструирован Dr. Mike Clark из Department of Pathology at Cambridge University, и способы получения таких антител описаны в WO 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г.- 14016193 Например, можно сконструировать константную область, более сходную с константными областями человека, чтобы избежать иммунного ответа, если антитело используют в клинических испытаниях и способах лечения у человека. См., например, патенты США 5997867 и 5866692. Настоящее изобретение относится к модификациям антитела 6G, включая функционально эквивалентные антитела, значительно не влияющим на их свойства, и вариантам, обладающим увеличенной или уменьшенной активностью и/или аффинностью. Например, в аминокислотную последовательность антитела 6G можно вносить мутации для получения антитела с желаемой аффинностью связывания с пептидом A1-40. Модификация полипептидов является общепринятой практикой в данной области, и нет необходимости подробно описывать ее здесь. Модификация полипептидов проиллюстрирована в примерах. Примеры модифицированных полипептидов включают в себя полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, с одной или несколькими делециями или добавлениями аминокислот,которые не вносят значительных вредных изменений в функциональную активность, или с использованием химических аналогов. Вставки аминокислотной последовательности включают в себя вставки, слитые с N- и/или Сконцом, по длине лежащие в диапазоне от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, так же как вставки одного или множества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают в себя антитело с N-концевым остатком метионила или антитело, слитое с эпитопом-меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают в себя антитело, слитое на N- или С-конце с ферментом или полипептидом, увеличивающим время полужизни антитела в сыворотке. Варианты с заменами обладают по меньшей мере одним аминокислотным остатком, удаленным из молекулы антитела, и другим остатком, вставленным на его место. Участки, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза, включают в себя гипервариабельные области, однако предусматривают также изменения в FR. Консервативные замены показаны в табл. 1 под заголовком "консервативные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда можно вводить более существенные замены, обозначенные "примерные замены" в табл. 1, или как описано ниже по отношению к классам аминокислот, и проводить скрининг продуктов. Таблица 1. Аминокислотные замены Значительных модификаций биологических свойств антитела достигают посредством выбора замен, которые значительно отличаются по их эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листа или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в намеченном участке, или (с) объема боковой цепи. Существующие в природе ос- 15016193 татки подразделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe, His. Неконсервативные замены выполняют посредством замены члена одного из этих классов на члена другого класса. Любые остатки цистеина, не вовлеченные в поддержание соответствующей конформации антитела,также можно заменять, как правило, на серин, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. И наоборот, цистеиновую связь(связи) можно добавить в антитело для улучшения его стабильности, в частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент. Модификации аминокислот могут лежать в диапазоне от замены или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменять аффинность связывания и/или специфичность. В некоторых вариантах осуществления внутри домена CDR выполняют не более чем от одной до пяти консервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления внутри домена CDR выполняют не более чем от одной до трех консервативных аминокислотных замен. В другом варианте осуществления домен CDR представляет собой CDRH3 и/или CDR L3. Модификации включают в себя также гликозилированные и негликозилированные полипептиды,так же как полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, например, такими как гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела являются гликозилированными в консервативных положениях в константных областях (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина,что может влиять на конформацию и презентируемую трехмерную поверхность гликопротеина (Hefferisand Lund, выше; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Олигосахариды могут служить также для нацеливания данного гликопротеина на конкретные молекулы на основании специфических узнаваемых структур. Опубликовано также, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC). В частности, опубликовано, что клетки СНО с регулируемой тетрациклином экспрессией (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей формирование бисекторного GlcNAc, обладают улучшенной активностьюADCC (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180). Гликозилирование антител, как правило, является либо N-связанным, или О-связанным. Nсвязанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где X представляет собой любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаровN-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее обычно, к серину или треонину, хотя можно использовать также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление участков гликозилирования к антителу удобно осуществлять посредством изменения аминокислотной последовательности, так чтобы она содержала одну или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для участков N-связанного гликозилирования). Изменение можно также осуществлять посредством добавления к последовательности исходного антитела одного или нескольких остатков серина или треонина, или заменой на эти остатки (для участков O-связанного гликозилирования). Характер гликозилирования антител можно также изменять без изменения лежащей в основе нуклеотидной последовательности. Гликозилирование в значительной степени зависит от клетки-хозяина,используемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клеток, применяемый для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например, антител, в качестве потенциальных терапевтических средств, редко представляет собой природную клетку, можно ожидать изменений в характере гликозилирования антител (см., например Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070). В добавление к выбору клеток-хозяев факторы, влияющие на гликозилирование во время рекомбинантного получения антител, включают в себя способ выращивания, состав среды, плотность культуры,насыщение кислородом, рН, схемы очистки и т.п. Предложены различные способы для изменения характера гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, включая введение или сверхэкспрессию конкретных ферментов, вовлеченных в образование олигосахаридов (патенты США 5047335;- 16016193 5510261 и 5278299). Гликозилирование или конкретные типы гликозилирования можно ферментативно убирать из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидазы Н (Endo H) , N-гликозидазы F,как описано в примере 1, эндогликозидазы F1, эндогликозидазы F2, эндогликозидазы F3. Кроме того,рекомбинантную клетку-хозяина можно генетически модифицировать, чтобы она являлась дефектной по процессингу конкретных типов полисахаридов. Эти и подобные способы хорошо известны в данной области. Другие способы модификации включают в себя использование способов связывания, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров ферментативные способы, окислительное замещение и хелатообразование. Модификации можно применять, например, для присоединения меток для иммунологического анализа. Модифицированные полипептиды 6G получают с использованием общепринятых в данной области способов, и их можно скринировать с использованием общепринятых анализов, известных в данной области, некоторые из которых описаны ниже и в примерах. Другие модификации антитела включают в себя антитела, модифицированные, как описано в публикации РСТWO 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г. Эти антитела содержат, помимо связывающего домена, нацеленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, обладающий аминокислотной последовательностью, по существу, гомологичной всему или части константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела способны связывать молекулу-мишень без запуска значительного комплемент-зависимого лизиса, или опосредованного клетками разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связывать FcRn и/или FcRIIb. Эти варианты, как правило, основаны на химерных доменах, полученных из двух или более доменов Сн 2 тяжелых цепей иммуноглобулина человека. Антитела, модифицированные таким способом, особенно подходят для использования в постоянной терапии антителами, чтобы избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций на общепринятую терапию антителами. Настоящее изобретение относится к вариантам осуществления аффинного созревания. Например,аффинно зрелые антитела можно получить способами, известными в данной области (Marks et al., 1992,Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995,Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol.,154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; и WO 2004/058184). Следующие способы можно использовать для регуляции аффинности антитела и для характеризации CDR. Один из способов характеризации CDR антитела и/или изменения (такого как улучшение) аффинности связывания полипептида, такого как антитело, назван "библиотека сканирующего мутагенеза". Как правило, библиотека сканирующего мутагенеза работает следующим образом. Аминокислоты в одном или нескольких положениях в CDR заменяют двумя или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотами с использованием известных в данной области способов. В результате этого получают небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления,одну для каждого анализируемого положения аминокислоты), каждая с комплексностью два или более членов (если аминокислоту в каждом положении заменяют на две или более аминокислоты). Как правило, библиотека содержит также клон, содержащий природную (не замененную) аминокислоту. Небольшое число клонов, например приблизительно 20-80 клонов (в зависимости от комплексности библиотеки), из каждой библиотеки скринируют по аффинности связывания с полипептидом-мишенью (или другой мишенью связывания), и идентифицируют кандидаты с увеличенным, тем же самым, уменьшенным или отсутствующим связыванием. Способы определения аффинности связывания хорошо известны в данной области. Аффинность связывания можно определить с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIAcore, выявляющего приблизительно 2-кратную или большую разницу в аффинности связывания. BIAcore является особенно применимым, когда исходное антитело уже связывается с относительно высокой аффинностью, например, KD приблизительно 10 нМ или ниже. Скрининг с использованием поверхностного плазмонного резонанса BIAcore описан в примерах здесь. Аффинность связывания можно определить с использованием Kinexa Biocensor, анализов близости сцинтилляции, ELISA, иммунологического анализа ORIGEN (IGEN), тушения флуоресценции, переноса флуоресценции, и/или дрожжевого дисплея. Можно также проводить скрининг по аффинности связывания с использованием подходящего биологического анализа. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в каждом положении в CDR заменяют (в некоторых вариантах осуществления, по одной за один раз) всеми 20 природными аминокислотами с использованием известных в данной области способов мутагенеза (некоторые из которых описаны здесь). В результате этого получают небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления, одну для каждого анализируемого положения аминокислоты), каждая с комплексностью 20 членов (если каждое положение заменяют на все 20 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления подлежащая скринингу библиотека содержит замены в двух или более положениях, которые могут присутствовать в одной и той же CDR или в двух или более CDR. Таким образом, библиотека может содержать замены в двух или более положениях в одной CDR. Библиотека может содержать замену в двух или более положениях в двух или более CDR. Библиотека может содержать замену в 3, 4, 5 или более положениях, где указанные положения обнаружены в двух, трех,- 17016193 четырех, пяти или шести CDR. Замену можно получить с использованием кодонов с низкой вырожденностью. См., например, табл. 2 из Balint et al., (1993) Gene 137 (1): 109-18).CDR может представлять собой CDRH3 и/или CDRL3. CDR может представлять собой одну или несколько из CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3. CDR может представлять собойCDR Kabat, CDR Chothia или расширенную CDR. Кандидаты с улучшенным связыванием можно секвенировать, таким образом идентифицируя мутантную CDR с заменой, приводящей к улучшенной аффинности (обозначаемую также "улучшенной" заменой). Связывающиеся кандидаты можно также секвенировать, таким образом идентифицируя замены в CDR с сохранением связывания. Можно проводить множество циклов скрининга. Например, кандидаты (содержащие каждый замену аминокислоты в одном или нескольких положениях в одной или нескольких CDR) с улучшенным связыванием являются применимыми также для конструирования второй библиотеки, содержащей по меньшей мере исходную и замененную аминокислоту в каждом положении улучшенной CDR (т.е., положении аминокислоты в CDR, в котором для мутанта с заменой показали улучшенное связывание). Получение и скрининг или отбор этой библиотеки дополнительно обсуждают ниже. Библиотека сканирующего мутагенеза также предоставляет средство для характеризации CDR, поскольку частота клонов с улучшенным связыванием, таким же связыванием, уменьшенным связыванием или с отсутствием связывания также предоставляет информацию относительно важности каждого положения аминокислоты для стабильности комплекса антитело-антиген. Например, если для положенияCDR сохраняется связывание при замене на все 20 аминокислот, данное положение идентифицируют как положение, которое маловероятно является необходимым для связывания антигена. Наоборот, если для положения CDR сохраняется связывание только для небольшого процента замен, данное положение идентифицируют как положение, которое является важным для функционирования CDR. Таким образом,способами библиотеки сканирующего мутагенеза получают информацию относительно положений вCDR, которые можно заменить на множество различных аминокислот (включая все 20 аминокислот), и положений в CDR, которые нельзя заменять, или которые можно заменять только немногими аминокислотами. Кандидаты с улучшенной аффинностью можно объединять во вторую библиотеку, которая содержит в данном положении улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту и может дополнительно содержать дополнительные замены в данном положении, в зависимости от комплексности библиотеки,которая является желательной или возможной с использованием желательного способа скрининга или отбора. Кроме того, если желательно, в соседних положениях аминокислот можно случайно выбирать по меньшей мере две или более аминокислот. Случайный выбор соседних аминокислот может позволять дополнительную конформационную гибкость в мутантной CDR, что, в свою очередь, может позволять или облегчать введение большого числа улучшающих мутаций. Библиотека может также содержать замены в положениях, для которых не показали улучшенную аффинность в первом цикле скрининга. Во второй библиотеке проводят скрининг или отбор членов библиотеки с улучшенной и/или измененной аффинностью связывания с использованием любого способа, известного в данной области, включая скрининг с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIAcore и отбор с использованием любого способа, известного в данной области для отбора, включая фаговый дисплей,дрожжевой дисплей и рибосомный дисплей. Настоящее изобретение относится также к слитым белкам, содержащим один или несколько фрагментов или областей из антител (таких как 6G) или полипептидов по изобретению. Один из вариантов осуществления относится к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот из вариабельного участка легкой цепи, показанного на SEQ ID NO:2 (фиг. 1) и/или по меньшей мере 10 аминокислот из вариабельного участка тяжелой цепи, показанного на SEQ ID NO:1 (фиг. 1). Другие варианты осуществления относятся к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, или по меньшей мере приблизительно 30 непрерывных аминокислот из вариабельного участка легкой цепи, показанного на SEQ ID NO:2 (фиг. 1) и/или по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, или по меньшей мере приблизительно 30 непрерывных аминокислот из вариабельного участка тяжелой цепи, показанного на SEQ ID NO:1 (фиг. 1). В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи 6G, как показано на SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:1 из фиг. 1. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит одну или несколько CDR из 6G. В других вариантах осуществления слитый полипептид содержит CDR Н 3 и/или CDR L3 антитела 6G. Для целей по настоящему изобретению слитый белок 6G содержит одно или несколько антител 6G и другую аминокислотную последовательность, к которой они не присоединены в природной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другой области. Гетерологичные последовательности включают в себя в качестве неограниченных примеров "метку", такую как метка FLAG или метка 6His. Метки хорошо известны в данной области.- 18016193 Слитый полипептид 6G можно получить способами, известными в данной области, например, синтетическими или рекомбинантными. Как правило, слитые белки 6G по настоящему изобретению получены посредством получения экспрессии кодирующего их полинуклеотида с использованием рекомбинантных способов, описанных здесь, хотя их можно также получить другими способами, известными в данной области, включая, например, химический синтез. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитела 6G или полипептиды, конъюгированные (например, связанные) со средством, облегчающим присоединение к твердой подложке (таким как биотин или авидин). Для простоты ссылка будет сделана в основном на 6G или антитела, подразумевая, что данные способы применяют к любому из вариантов осуществления связывания A1-40, описанных здесь. Конъюгация, как правило, обозначает связывание этих компонентов,как описано здесь. Связывания (которое, как правило, представляет собой фиксацию этих компонентов в непосредственном объединении по меньшей мере для введения) можно достигать любым числом способов. Например, возможна непосредственная реакция между средством и антителом, когда каждый обладает заместителем, способным реагировать с заместителем другого. Например, нуклеофильная группа, такая как амино или сульфгидрильная группа, на одном может являться способной реагировать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или кислый галогенид, или с алкильной группой, содержащей хорошо уходящую группу (например, галогенид), на другом. Антитело или полипептид по настоящему изобретению можно связывать со средством для мечения(альтернативно обозначаемым "метка"), таким как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула или любые другие метки, известные в данной области. В данной области известны метки, которые, как правило, производят сигнал (либо напрямую, либо опосредованно). Изобретение относится также к композициям (включая фармацевтические композиции) и наборам,содержащим антитело 6G, и, как ясно из настоящего описания, к любому или всем из антител и/или полипептидов, описанных здесь. Анти-A антитела и полипептиды с нарушенной эффекторной функцией Антитела или полипептиды (включая фармацевтические композиции, содержащие антитела или полипептиды), описанные здесь, могут обладать нарушенной эффекторной функцией. Как применяют здесь, антитело или полипептид с "нарушенной эффекторной функцией" (применяют взаимозаменяемо с "иммунологически инертный" или "частично иммунологически инертный") обозначает антитела или полипептиды, не обладающие никакой эффекторной функцией или обладающие уменьшенной активностью или активностями эффекторной функции (по сравнению с антителом или полипептидом, обладающим немодифицированной или природной константной областью), например, не обладающие активностью или обладающие уменьшенной активностью в одном или нескольких из следующего: а) запуске опосредованного комплементом лизиса; b) стимуляции антителозависимой опосредуемой клетками цитотоксичности (ADCC); и с) активации микроглии. Активность эффекторной функции можно уменьшить приблизительно на любое количество из 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 и 100%. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с бета-амилоидным пептидом без запуска существенного комплемент-зависимого лизиса, или опосредованного клетками разрушения мишени. Например, участок связывания Fc-рецептора на константной области можно модифицировать или подвергать мутагенезу для удаления или уменьшения аффинности связывания с конкретными Fcрецепторами, такими как FcRI, FcRII и/или FcRIII. Для простоты ссылка будет сделана на антитела,подразумевая, что данные варианты осуществления также применяют к полипептидам. Систему нумерации EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Healthy, Bethesda, Md., 1991) применяют для обозначения, какой аминокислотный остаток(остатки) константной области (например, из антитела IgG) изменены или мутированы. Нумерацию можно использовать для конкретного типа антитела (например, IgG1) или вида (например, человека), подразумевая, что подобные изменения можно выполнять среди всех типов антител и видов. В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее А пептид, содержит константную область тяжелой цепи с нарушенной эффекторной функцией. Константная область тяжелой цепи может обладать природной последовательностью или представлять собой вариант. В некоторых вариантах осуществления в аминокислотную последовательность природной тяжелой цепи вносят мутации, например, посредством замены, вставки и/или делеции аминокислоты, посредством чего нарушают эффекторную функцию константной области. В некоторых вариантах осуществления Nгликозилирование Fc-области константной области тяжелой цепи также можно изменить, например,можно удалить полностью или частично, посредством чего нарушают эффекторную функцию константной области. В некоторых вариантах осуществления эффекторную функцию нарушают посредством удаления Nгликозилирования Fc-области (например, в домене СН 2 IgG) анти-А пептида. В некоторых вариантах осуществления N-гликозилирование Fc-области удаляют посредством мутации гликозилированного аминокислотного остатка или фланкирующих остатков, являющихся частью последовательности узнавания для гликозилирования в константной области. Трипептидные последовательности аспарагин-Х- 19016193 серин (N-X-S), аспарагин-Х-треонин (N-X-T) и аспарагин-Х-цистеин (N-X-C), где X представляет собой любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина для N-гликозилирования. Мутация любой аминокислоты в трипептидной последовательности в константной области приводит к негликозилированному IgG. Например, в участок N-гликозилирования N2 97 IgG1 и IgG3 человека можно вводить мутацию до A, D, Q, K или Н. См. Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); и Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Опубликовано, что IgG1 и IgG3 человека с заменой Asn-297 на Gln,His или Lys не связывает FcRI человека и не активирует комплемент с полной потерей способности связывать C1q для IgG1 и существенным уменьшением для IgG3. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту N в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на любую из аминокислот А, С, D, E, F, G, Н, I, K L, М, Р, Q, R, S, Т, V, W, Y. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту N в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на консервативную замену. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту X в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на пролин. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту S в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, P, Q,R, V, W, Y. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту Т в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на A, D, E, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, V, W, Y. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту С в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации наA, D, E, F, G, Н, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту,следующую за трипептидом, заменяют посредством мутации на Р. В некоторых вариантах осуществления N-гликозилирование в константной области удаляют ферментативно (например, N-гликозидазой F,как описано в примере 1, эндогликозидазой F1, эндогликозидазой F2, эндогликозидазой F3, и эндогликозидазой Н). Удаления N-гликозилирования можно достигать также продукцией антитела в линии клеток,дефектных по N-гликозилированию. Wright et al., J Immunol. 160 (7) :3393-402 (1998). В некоторых вариантах осуществления в аминокислотный остаток, взаимодействующий с олигосахаридом, присоединенным к участку N-гликозилирования константной области, вводят мутацию для уменьшения аффинности связывания со FcRI. Например, можно внести мутацию в F241, V264, D265IgG3 человека. См. Lund et al., J. Immunology 157:4 963-4969 (1996). В некоторых вариантах осуществления эффекторную функцию нарушают посредством модификации таких областей IgG человека, как 233-236, 297, и/или 327-331, как описано в РСТ WO 99/58572 и(2000). Антитела, описанные в РСТ WO 99/58572 и Armour et a., содержат, помимо связывающего домена, нацеленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, обладающий аминокислотной последовательностью, по существу, гомологичной всему или части константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела способны связывать молекулу-мишень без запуска значительного комплемент-зависимого лизиса или опосредованного клетками разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен обладает уменьшенной аффинностью для FcRI, FcRIIa иFcRIII. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связыватьFcRn и/или FcRIIb. Эти варианты, как правило, основаны на химерных доменах, полученных из двух или более тяжелых цепей доменов Сн 2 иммуноглобулина человека. Антитела, модифицированные таким способом, особенно подходят для использования в постоянной терапии антителами, чтобы избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций на общепринятую терапию антителами. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь IgG1 человека с одной из следующих мутаций: 1) А 327 А 330 Р 331 до G327S330S331; 2)E233L234L235A327A330P331 до P233V234A235G327S330S331; и 6) N297 до А 297 или любой другой аминокислоты кроме N. Эти мутации можно сочетать, например, любую из 1) - 5) можно сочетать с 6). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь IgG2 человека со следующими мутациями: А 330 Р 331 до S330S331; N297 до Q297; иN297G327A330P331 до Q297G327S330S331. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь IgG4 человека с любыми из следующих мутаций: E233F234L235G236 до P233V234A235 с делецией G236; E233F234L235 доP233V234A235G236Q297. Константную область антител можно также модифицировать, чтобы нарушить активацию комплемента. Например, активацию комплемента антителами IgG, следующую за связыванием компонента комплемента С 1, можно уменьшить посредством мутации аминокислотных остатков в константной области в связывающем С 1 мотиве (например, в связывающем C1q мотиве). Опубликовано, что мутация доAla для каждого из D270, К 322, Р 329, Р 331 IgG1 человека значительно снижает способность антитела связывать C1q и активировать комплемент. В случае мышиного IgG2b связывающий C1q мотив состоитIgG2b, является общим для других изотипов антител. Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988). Связывающую C1q активность IgG2b можно прекратить посредством замены любого из трех указанных остатков на остаток, обладающий неподходящей группой на боковой цепи. Нет необходимости заменять ионные остатки только на Ala для прекращения связывания C1q. Можно также использовать другие алкилзамещенные неионные остатки, такие как Gly, Ile, Leu или Val, или такие ароматические неполярные остатки, как Phe, Tyr, Trp и Pro вместо любого из трех остатков, чтобы прекратить связывание C1q. Кроме того, можно использовать такие полярные неионные остатки, как Ser, Thr, Cys и Met вместо остатков 320 и 322, но не 318, чтобы прекратить активность связывания C1q. Настоящее изобретение также относится к антителам с нарушенной эффекторной функцией, где антитело обладает модифицированной шарнирной областью. Аффинность связывания IgG человека с егоFc-рецепторами можно модулировать посредством модификации шарнирной области. Canfield et al., J.Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Hezareh et al., J. Virol. 75:12161-12168 (2001); Redpath et al., Human Immunology 59:720-727 (1998). Конкретные аминокислотные остатки можно подвергать мутагенезу или делетировать. Модифицированная шарнирная область может содержать полную шарнирную область,полученную из антитела класса или подкласса антител, отличного от того, из которого происходит доменCH1. Например, константный домен (СН 1) антител класса IgG можно присоединять к шарнирной области антитела класса IgG4. Альтернативно, новая шарнирная область может содержать часть природного шарнира или повторяющуюся единицу, в которой каждая единица в повторе выведена из природной шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления природную шарнирную область изменяют посредством превращения одного или нескольких цистеиновых остатков в нейтральный остаток, такой как аланин, или посредством превращения подходящим образом расположенных остатков в цистеиновые остатки. Патент США 5677425. Такие изменения проводят с использованием известных в данной области способов химии белка и, предпочтительно, генетической инженерии, и как описано здесь. Полипептиды, специфически связывающиеся с пептидом А и слитые с константной областью тяжелой цепи, обладающей нарушенной эффекторной функцией, можно также применять для описанных здесь способов. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, полученную из антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления полипептид получен из антитела с одним доменом, связывающегося с пептидом А. Антитело с одним доменом можно получить с использованием способов, известных в данной области. Omidfar et al.,Tumour Biol. 25:296-305 (2004); Herring et al., Trends in Biotechnology 21:484-489 (2003). В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой F(ab')2 фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой Fabфрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой одноцепочечное антитело scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированный F(ab')2-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированный Fab-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированное одноцепочечное антитело scFv. Можно также использовать другие способы получения антител с нарушенной эффекторной функцией, известные в данной области. Антитела и полипептиды с модифицированной константной областью можно тестировать в одном или нескольких анализах для оценки уровня снижения эффекторной функции в биологической активности по сравнению с исходным антителом. Например, способность антитела или полипептида с измененной Fc-областью связывать комплемент или Fc-рецепторы (например, Fc-рецепторы на микроглии), или измененную шарнирную область можно оценить с использованием анализов, описанных здесь, так же как любого известного в данной области анализа. РСТ WO 99/58572; Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000); Song et al., Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002). Конкурентные анализы можно использовать для определения, связывают ли два антитела один и тот же эпитоп посредством распознавания идентичных или стерически перекрывающихся эпитопов, или одно антитело конкурентно ингибирует связывание второго антитела с антигеном. Эти анализы известны в данной области. Как правило, антиген иммобилизуют на многолуночном планшете и измеряют способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител. Общепринятыми метками для таких конкурентных анализов являются радиоактивные метки или ферментативные метки. Антитела и полипептиды, специфически связывающиеся с А, можно скринировать по эффективности удаления отложения амилоида и другим благоприятным эффектам, таким как улучшение когнитивных функций. Например, антитела или полипептиды можно вводить животному с патологией Альцгеймера. Различные модели на животных для болезни Альцгеймера известны в данной области. После введения уровень плотных и диффузных амилоидных бляшек, анализ поведения с точки зрения когни- 21016193 тивных функций, активацию микроглии и микрогеморрагию можно тестировать с использованием способов, известных в данной области и подробно описанных в примере 2. РСТ WO 2004/032868; Wilcock etal., J. Neurosci. 23:3745-3751 (2003); Wilcock et al., J. Neuroinflammation 1:24 (2004). Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела и полипептиды по настоящему изобретению (включая антитело, содержащее полипептидные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, показанных на фиг. 1), а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид. Соответственно, изобретение относится к полинуклеотидам (или композициям, включая фармацевтические композиции), содержащим полинуклеотиды, кодирующие любое из следующего: (а) антитело 6G или его варианты, показанные в таблице 3; (b) фрагмент или область антитела 6G или его вариантов,показанных в таблице 3; (с) легкую цепь антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (d) тяжелую цепь антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (е) одну или несколько вариабельную область (области) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (f) одну или несколько CDR (одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR) антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (g) CDR НЗ из тяжелой цепи антитела 6G; (h) CDR L3 из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (i) три CDR из легкой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (j) три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; (k) три CDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела 6G или его вариантов, показанных в таблице 3; и (l) антитело, содержащее любое из (b)-(k). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит любой полинуклеотид(ы), показанный на SEQ ID NO:9 и SEQ IDNO:10, или оба. В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любое из антител(включая фрагменты антител) и полипептидов, описанных здесь, таких как антитела и полипептиды, с нарушенной эффекторной функцией. Полинуклеотиды можно получить способами, известными в данной области. В другом аспекте изобретение относится к композициям (таким как фармацевтические композиции), содержащим любой из полинуклеотидов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело 6G, как описано здесь. В другом варианте осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любое из антител или полипептидов, описанных здесь. В других вариантах осуществления композиция содержит любой или оба из полинуклеотидов, показанных на SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Экспрессирующие векторы и введение композиций полинуклеотидов описаны здесь далее. В другом аспекте изобретение относится к способу получения любого из полинуклеотидов, описанных здесь. Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, комплементарным любой такой последовательности. Полинуклеотиды могут являться одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают в себя молекулы HnRNA, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК один к одному, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Внутри полинуклеотида по настоящему изобретению могут присутствовать, но не обязательно, дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности, и полинуклеотид может, но не обязательно, являться связанным с другими молекулами и/или материалами подложки. Полинуклеотиды могут содержать природную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок,таких что иммунореактивность кодируемого полипептида не является уменьшенной относительно природной иммунореактивной молекулы. Эффект на иммунореактивность кодируемого полипептида, как правило, можно оценить, как описано здесь. Варианты предпочтительно обладают по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей природное антитело или его часть. Говорят, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются "идентичными", если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях является одинаковой при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями, как правило, проводят посредством сравнения последовательностей по идентичности на протяжении окна сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательности. "Окно сравнения", как применяют здесь, обозначает фрагмент по меньшей мере приблизительно из 20 непрерывных положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с контрольной последовательностью из того же числа непрерывных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.- 22016193 Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с использованием программы Megalign в пакете биоинформатического программного обеспечения Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), с использованием параметров по умолчанию. В этой программе реализовано несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Proteinand Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730. Предпочтительно, "процент идентичности последовательности" определяют посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) в 20% или менее, обычно от 5 до 15%, или от 10 до 12%, по сравнению с контрольными последовательностями (которые не содержат добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют посредством определения числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки присутствуют в обеих последовательностях, для определения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в контрольной последовательности (т.е. размер окна) и умножения результатов на 100 для получения процента идентичности последовательности. Варианты могут также, или альтернативно, являться, по существу, гомологичными природному гену или его части или комплементарной ему последовательности. Такие варианты полинуклеотидов являются способными гибридизоваться в умеренно строгих условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей природное антитело (или с комплементарной последовательностью). Подходящие "умеренно строгие условия" включают в себя предварительную отмывку в растворе 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0); гибридизацию при 50-65 С, 5SSC в течение ночи; с последующей промывкой дважды при 65 С в течение 20 мин, каждая в 2, 0,5 и 0,2SSC, содержащем 0,1%SDS. Как применяют здесь, "высоко строгими условиями" или "условиями высокой строгости" являются условия, при которых: (1) применяют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50 С; (2) во время гибридизации применяют денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42 С; или (3) применяют 50% формамид, 5SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия(рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфат при 42 С, с отмывками при 42 С в 0,2SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55 С с последующей отмывкой высокой строгости, состоящей из 0,1SSC, содержащего ЭДТА, при 55 С. Специалисту в данной области будет известно, как регулировать температуру, ионную силу и т.д., как необходимо для соответствия таким факторам, как длина зонда и т.п. Обычному специалисту в данной области понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как описано здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого природного гена. Тем не менее полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в использовании кодонов, конкретно охвачены настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, приведенные здесь, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые различаются в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, обладать измененными структурой или функцией. Аллели можно идентифицировать с использованием общепринятых способов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение с базой данных последовательностей). Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получить с использованием химического синтеза, рекомбинантных способов или ПЦР. Способы химического синтеза полинухлеотидов хорошо известны в данной области и не нуждаются в подробном описании здесь. Специалист в данной области может использовать последовательности, предоставленные здесь, и коммерческий ДНК-синтезатор для получения желаемой последовательности ДНК. Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных способов полинуклеотид, со- 23016193 держащий желаемую последовательность, можно вставить в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, можно ввести в подходящую клетку-хозяина для репликации и размножения, как обсуждают здесь далее. Полинуклеотиды можно вводить в клетки-хозяева посредством любых способов, известных в данной области. Клетки трансформируют введением экзогенного полинуклеотида посредством прямого поглощения, эндоцитоза, трансфекции, F-конъюгации или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться в клетке в форме неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрировать в геном клетки-хозяина. Размноженный таким образом полинуклеотид можно выделить из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrooket al. (1989). Альтернативно, ПЦР позволяет воспроизведение последовательностей ДНК. Способ ПЦР хорошо известен в данной области и описан в патентах США No. 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, также как в PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994). РНК можно получить, используя выделенную ДНК в подходящем векторе и вводя ее в подходящую клетку-хозяина. Когда клетка делится, и ДНК транскрибируется в РНК, РНК затем можно выделить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, как указано, например, вSambrook et al., (1989). Подходящие клонирующие векторы можно конструировать согласно общепринятым способам, или можно выбирать из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области. В то время как выбранный клонирующий вектор можно менять в зависимости от предназначенной для использования клетки-хозяина, применимые клонирующие векторы, как правило, будут обладать способностью к самовоспроизведению, могут обладать одним участком узнавания для конкретной рестрикционной эндонуклеазы, и/или могут нести гены маркера, который можно использовать для отбора клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают в себя плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18,pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и их производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1,RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и рАТ 28. Эти и многие другие векторы для клонирования доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen. Экспрессирующие векторы, как правило, представляют собой способные к репликации полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотид по настоящему изобретению. Подразумевают, что экспрессирующий вектор должен быть способен к репликации в клетках-хозяевах, либо в форме эписом,либо как интегрированная часть хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессирующий вектор(векторы), описанные в публикации РСТ No. WO 87/04462. Компоненты вектора обычно могут включать в себя, в качестве неограничивающих примеров, одно или несколько из следующего: сигнальная последовательность; точка начала репликации; один или несколько маркерных генов; подходящие контролирующие транскрипцию элементы (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е., трансляции), обычно необходимы один или несколько контролирующих трансляцию элементов, таких как участки связывания рибосомы, участки инициации трансляции и стоп-кодоны. Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды, можно вводить в клетку-хозяина посредством любого числа подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с применением хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины) . Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто зависит от свойств клетки-хозяина. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозявам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных здесь. Любые клетки-хозяева, способные к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК, можно использовать для целей выделения генов, кодирующих интересующие антитело, полипептид или белок. Клетки-хозява млекопитающих включают в себя в качестве неограничивающих примеров клеткиCOS, HeLa и СНО. См. также публикацию РСТWO 87/04462. Подходящие не относящиеся к млекопитающим клетки-хозяева включают в себя прокариоты (такие как Е. coli или В. subtillis) и дрожжи (такие как S. cerevisae, S. pombe; или К. lactis). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз выше, более предпочтительно, в 10 раз выше, еще более предпочтительно, в 20 раз выше, чем уровень соответствующего эндогенного интересующего антитела или белка, если они присутствуют, в клетках-хозяевах. Скрининг клеток-хозяев по специфическому связыванию с A1-40 осуществляют посредством иммунологического анализа или FACS. Можно идентифицировать клетку,сверхэкспрессирующую интересующее антитело или белок.- 24016193 Диагностические применения полученных из 6G антител и анти-А антител с нарушенной эффекторной функцией Антитело 6G, которое связывается с С-концом А, можно использовать для идентификации или детекции присутствия или отсутствия А. Для простоты, ссылка будет сделана в основном на 6G или антитела, подразумевая, что данные способы применяют к любому из вариантов осуществления связывания А (таким как полипептиды), описанных здесь. Детекция, как правило, включает в себя контактирование биологического образца с антителом, описанным здесь, которое связывается с А, и формирование комплекса между А и антителом (например, 6G), которое специфически связывается с А. Формирование такого комплекса может происходить in vitro или in vivo. Термин "детекция", как применяют здесь,включает в себя качественную и/или количественную детекцию (измерение уровней) с отсчетом от контроля или без него. Любой из множества известных способов можно применять для детекции, включая, в качестве неограничивающих примеров, иммунологический анализ с использованием антитела, связывающего полипептид, например, посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (RIA) и т.п.; и функциональный анализ кодируемого полипептида, например, анализ по активности связывания или ферментативный анализ. В некоторых вариантах осуществления антитело является меченным поддающейся детекции меткой. Другие варианты осуществления известны в данной области и описаны здесь. Антитела и полипептиды по изобретению можно использовать для выявления, диагностики и мониторирования заболевания, состояния или нарушения, связанного с измененной или аберрантной экспрессией A или АРР, такого как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам, включающим в себя контактирование пробы(образца) от индивидуума, у которого предполагают измененную или аберрантную экспрессию А, с антителом или полипептидом по изобретению и определение, отличается ли уровень А от уровня в контрольном или сравнительном образце. В других вариантах осуществления изобретение относится к способам, включающим в себя контактирование пробы (образца) от индивидуума и определение уровня экспрессии А. Для диагностических применений антитело можно метить поддающейся детекции группой, включая, в качестве неограничивающих примеров, радиоактивные изотопы, флуоресцентные метки и различные фермент-субстратные метки. Способы конъюгации меток с антителом известны в данной области. В другом варианте осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению не нужно метить, и их присутствие можно выявлять с использованием меченого антитела, которое связывается с антителами по изобретению. Антитела по изобретению можно применять в любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации.Zola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Антитела можно использовать также в диагностических анализах in vivo, таких как визуализация invivo. Как правило, антитело метят радиоактивным изотопом (таким как 111In, 99Tc, 14 С, 131I, 125I или 3 Н),так что интересующие клетки или ткань можно локализовать с использованием иммуносцинтиграфии. Антитело можно также использовать в качестве окрашивающего реагента при патологии, следуя способам, хорошо известным в данной области. Анти-А антитела с нарушенной эффекторной функцией можно использовать для измерения накопления амилоида в мозге для диагностики субъекта, подверженного риску AD или с диагнозом AD, и оценки прогрессирования какого-либо лечения и стадии заболевания. Опубликовано, что периферическое введение моноклонального анти-А антитела приводит к быстрому увеличению уровня А в плазме и амплитуда этого увеличения хорошо коррелирует с накоплением амилоида в гиппокампе и коре головного мозга. DeMattos et al., Science 295:2264-2267 (2002). В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят анти-А антитело с нарушенной эффекторной функцией, и измеряют уровень А в плазме, в соответствии с чем увеличение уровня А в плазме указывает на присутствие и/или уровень накопления амилоида в мозге у субъекта. Эти способы можно использовать для мониторирования эффективности лечения и стадии заболевания и для определения будущих доз и частоты. Антитела с нарушенной эффекторной функцией могут обладать лучшими показателями безопасности и предоставлять преимущества для этих диагностических применений. Способы использования анти-А антитела для терапевтических целей. Антитела (включая полипептиды), полинуклеотиды и фармацевтические композиции, описанные здесь, можно использовать в способах лечения, предупреждения и ингибирования развития болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией А или АРР, или накоплением или отложением пептида А (в совокупности обозначенных "связанные с А заболевания"), таких как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, повреждение сосудов, вызванное отложением пепти- 25016193 да А в кровеносных сосудах (такое как инсульт и HCHWA-D), депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба,и деменция с тельцами Леви. Такие способы включают в себя введение субъекту антител, полипептидов или полинуклеотидов, или фармацевтической композиции. При профилактических применениях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, восприимчивому к болезни Альцгеймера, или иначе подверженному риску болезни Альцгеймера (или другого связанного с А заболевания), в количестве, достаточном для исключения или уменьшения риска, уменьшения тяжести или отсрочки дебюта заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания. Для терапевтических применений композиции или лекарственные средства вводят пациенту, у которого предполагают заболевание, или уже страдающему таким заболеванием, в количестве, достаточном для лечения, или по меньшей мере частичной остановки симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и промежуточные патологические фенотипы при развитии заболевания. Изобретение относится также к способу отсрочки у субъекта развития симптома, связанного с болезнью Альцгеймера (или другим связанным с А заболеванием), включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. Симптомы, связанные с болезнью Альцгеймера, включают в себя в качестве неограничивающих примеров снижение памяти, нарушение решения проблем, речи, счета, зрительнопространственного восприятия, суждений и поведения. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования или подавления формирования амилоидных бляшек и/или накопления А у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление А происходит в системе кровообращения субъекта. Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения амилоидных бляшек и/или уменьшения или замедления накопления А у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление А происходит в системе кровообращения субъекта. Настоящее изобретение также относится к способам удаления амилоидных бляшек и/или накопления А у субъекта или очистки от них, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление А происходит в системе кровообращения субъекта. Настоящее изобретение также относится к способам снижения уровня пептида А в ткани (такой как мозг), ингибирования и/или снижения накопления пептида А в ткани (такой как мозг) и ингибирования и/или снижения токсических эффектов пептида А в ткани (такой как мозг) у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело,полипептид или полинуклеотид, описанные здесь. Полипептид А может присутствовать в растворимой,олигомерной или депонированной форме. Олигомерная форма А может являться составленной из 2-50 полипептидов А, которые могут представлять собой смесь полноразмерных пептидов 1-40 и 1-42 и/или любого усеченного варианта этих пептидов. Изобретение относится также к способам улучшения когнитивных функций или обращения когнитивных нарушений, связанных с заболеваниями, связанными с отложением А у субъекта, такими как болезнь Альцгеймера, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. Описанные здесь способы (включая профилактику или терапию) можно осуществлять посредством однократной прямой инъекции в одной временной точке или во многих временных точках, в один или множество участков. Введение во множество участков может также являться почти одновременным. Частоту введения можно определить и регулировать во время курса терапии, и она основана на достижении желаемых результатов. В некоторых случаях могут являться подходящими составы с замедленным непрерывным высвобождением антител (включая полипептиды), полинуклеотидов и фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения известны в данной области. Пациенты, субъекты или индивидуумы включают в себя млекопитающих, таких как человек, крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки, свиньи и овцы. Субъект предпочтительно представляет собой человека и может являться или не являться пораженным заболеванием или в настоящее время обладающим симптомами. В случае болезни Альцгеймера практически любой подвержен риску страдать болез- 26016193 нью Альцгеймера, если он или она проживет достаточно долго. Таким образом, настоящие способы можно выполнять профилактически для общей популяции без необходимости какой-либо оценки риска для рассматриваемого пациента. Настоящие способы являются применимыми для индивидуумов, обладающих известным генетическим риском для болезни Альцгеймера. Такие индивидуумы включают в себя тех, кто обладает родственниками, перенесшими это заболевание, и тех, чей риск установлен посредством анализа генетических или биохимических маркеров. Генетические маркеры риска будущей болезни Альцгеймера включают в себя мутации в гене АРР, в частности, мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, обозначенных, соответственно, как мутация Харди и шведская мутация (см. Hardy(1997) Trends Neurosci. 20:154-9). Другими маркерами риска являются мутации в генах пресенилина, PS1 и PS2, и АроЕ 4, семейная история AD, гиперхолестеринемия или атеросклероз. Индивидуумов, в настоящее время страдающих болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, так же как по присутствию описанных выше факторов риска. Кроме того, доступен ряд диагностических тестов для идентификации индивидуумов с AD. Тесты включают в себя измерение уровней в CSF tau и А 42. Повышенные уровни tau и пониженные уровни А 42 означают наличие AD. Индивидуумам, страдающим болезнью Альцгеймера, можно также ставить диагноз по критериям ADRDA (Ассоциации болезни Альцгеймера и относящихся к ней расстройств). Для пациентов без симптомов лечение можно начинать в любом возрасте (например, 10, 20, 30). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение, пока пациент не достигнет 40, 50, 60 или 70. Лечение, как правило, включает в себя многократное дозирование в течение периода времени. Лечение можно мониторировать в течение времени различными способами, известными в данной области. В случае пациентов с потенциальным синдромом Дауна лечение можно начинать внутриутробно посредством введения лекарственного средства матери или вскоре после рождения. Фармацевтическая композиция, которую можно использовать в вышеуказанных способах, содержит любое из антител, полипептидов и/или полинуклеотидов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело 6G или его варианты, показанные в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело, специфически связывающееся с пептидом А и содержащее константную область с нарушенной эффекторной функцией. Введение и дозирование Антитело предпочтительно вводят млекопитающему в носителе; предпочтительно, в фармацевтически приемлемом носителе. Пригодные носители и их составы описаны в Remington's PharmaceuticalPractice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. Как правило, соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли используют в составе для приведения состава в изотоническое состояние. Примеры носителя включают в себя физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН раствора составляет предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 8 и более предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 7,5. Дополнительные носители включают в себя препараты для замедленного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы присутствуют в форме сформированных предметов, например,пленок, липосом или микрочастиц. Специалистам в данной области очевидно, что конкретные носители могут являться более предпочтительными в зависимости, например, от способа введения и концентрации вводимого антитела. Антитело можно вводить млекопитающему посредством инъекции (например, системной, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной, интрапортальной, интрацеребральной, интрацеребровентрикулярной и интраназальной), или посредством других способов, таких как вливание, чтобы обеспечить его доставку в кровоток в эффективной форме. Антитело можно также вводить способами изолированной перфузии, такими как перфузия изолированной ткани, для достижения местных терапевтических эффектов. Внутривенная инъекция является предпочтительной. Эффективные дозы и расписания для введения антитела можно определить эмпирически, и производство таких определений лежит в компетенции специалистов в данной области. Специалистам в данной области понятно, что доза антитела, которую нужно вводить, будет меняться в зависимости, например, от млекопитающего, которому будут вводить антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз антитела можно найти в литературе по терапевтическому использованию антител, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985,ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., RavenPress, New York, 1977, pp. 365-389. Обычная ежесуточная доза антитела, используемого в отдельности,может лежать в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг массы тела или более в сутки в зависимости от упомянутых выше факторов. Как правило, можно использовать любую из следующих доз: вводят дозу по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 750 мкг/кг массы тела; по меньшей мере- 27016193 приблизительно 500 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 250 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг массы тела, или более. Антитела можно вводить в меньших дозах или менее часто в начале лечения, чтобы избежать потенциальных побочных эффектов, таких как временная церебральная амилоидная ангиопатия (САА). В некоторых вариантах осуществления может присутствовать более одного антитела. Такие композиции могут содержать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять различных антител (включая полипептиды) по изобретению. Антитело можно также вводить млекопитающему в сочетании с эффективными количествами одного или нескольких других лекарственных средств. Антитело можно вводить последовательно или одновременно с одним или несколькими другими лекарственными средствами. Количество антитела и лекарственного средства зависит, например, от того, какой тип лекарственных средств используют, подлежащего лечению патологического состояния и способов введения, однако, как правило, оно будет меньше, чем при использовании каждого в отдельности. После введения антитела млекопитающему физиологическое состояние млекопитающего можно мониторировать различными способами, хорошо известными специалисту в данной области. Вышеуказанные принципы введения и дозирования можно адаптировать для полипептидов, описанных здесь. Полинуклеотид, кодирующий описанные здесь антитело или полипептид, также можно использовать для доставки и экспрессии антитела или полипептида в желаемой клетке. Очевидно, что экспрессирующий вектор можно использовать для непосредственной экспрессии антитела. Экспрессирующий вектор можно вводить системно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально, интравентрикулярно, перорально, энтерально, парентерально, интраназально, на кожу или посредством ингаляции. Например, введение экспрессирующих векторов включает в себя местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, бомбардировку частицами или введение через катетер и местное введение. Специалисты в данной области знакомы с введением экспрессирующих векторов для получения экспрессии экзогенного белка in vivo. См., например, патенты США 6436908; 6413942; и 6376471. Можно использовать также направленную доставку терапевтической композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению. Способы опосредованной рецептором доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics:Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для местного введения по протоколу генотерапии. Концентрации, лежащие в диапазоне от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг и от приблизительно 20 мкг до приблизительно 100 мкг ДНК, также можно использовать в ходе протокола генотерапии. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды по настоящему изобретению можно доставлять с использованием носителей для доставки генов. Носитель для доставки генов может быть вирусного или не вирусного происхождения (см., в основном, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; и Kaplitt,Nature Genetics (1994) 6:148). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может являться либо конститутивной, либо регулируемой. Векторы на основе вирусов для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в данной области. Носители на основе вирусов включают в себя в качестве неограничивающих примеров рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации РСТWO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; патенты США 5219740; 4777127; патент Великобритании 2200651; и ЕР 0345242), векторы на основе альфавирусов (например, векторы из вируса Синдбис, вируса леса Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247),вируса долины реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246) и вируса венесуэльского энцефалита лошадей(AAV) векторов (см., например, публикации РСТ No. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655). Можно применять также введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. Можно применять также носители для доставки и способы, не на основе вирусов, включая в качестве неограничивающих примеров, конденсированную с поликатионами ДНК, связанную или не связанную с отдельным убитым аденовирусом (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); связанную с лигандом ДНК (см., например, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); клетки-носители для доставки в эукариотические клетки (см., например, патент США 5814482; публикации РСТWO 95/07994; WO- 28016193 96/17072; WO 95/30763; и WO 97/42338) и нейтрализацию нуклеинового заряда или слияние с мембранами клетки. Можно применять также голую ДНК. Примерные способы введения голой ДНК описаны в публикации РСТWO 90/11092 и в патенте США 5580859. Липосомы, которые могут действовать как носители для доставки генов, описаны в патенте США No. 5422120; публикациях РСТWO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; и ЕР 0524968. Дополнительные способы описаны в Philip, Mol.Cell Biol. (1994) 14:2411, и в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581. Наборы Настоящее изобретение также относится к изделиям и наборам, содержащим вещества, применимые для лечения патологических состояний, таких как болезнь Альцгеймера или другие связанные с A заболевания (такие как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, повреждение сосудов, вызванное накоплением пептида А в кровеносных сосудах (такое как инсульт и HCHWA-D, или для детекции или очистки А или АРР. Изделие содержит контейнер с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя, например, флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры можно сформовать из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию с активным средством, которое является эффективным для лечения патологических состояний, или для детекции или очистки А или АРР. Активное средство в композиции представляет собой антитело и предпочтительно содержит моноклональные антитела, специфические для А или АРР. В некоторых вариантах осуществления активное средство содержит антитело 6G или любые антитела или полипептиды, полученные из антитела 6G. В некоторых вариантах осуществления активное средство содержит описанные здесь анти-А антитело или полипептид с нарушенной эффекторной функцией. В некоторых вариантах осуществления анти-А антитело или полипептид содержит константную область тяжелой цепи, где константная область обладает нарушенной эффекторной функцией. В этикетке на контейнере указано, что композицию применяют для лечения патологических состояний, таких как болезнь Альцгеймера, или детекции или очистки А или АРР, и в этикетке можно также указывать инструкции для применения либо in vivo, либо invitro, такого как описанные выше применения. Изобретение относится также к наборам, содержащим любое из описанных здесь антител (таких как 6G) , полипептидов, полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит описанный выше контейнер. В других вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит описанный выше контейнер и второй контейнер, содержащий буфер. Он может дополнительно содержать другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями для осуществления любых способов, описанных здесь (таких как способы лечения болезни Альцгеймера и способы ингибирования или уменьшения накопления пептида А в мозге). В наборах, подлежащих применению для детекции или очистки А или АРР, антитело как правило, метят поддающимся детекции маркером, таким как, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции (описанной здесь) для применения в любом из описанных здесь способов, в контексте или использования в качестве лекарственного средства и/или использования для изготовления лекарственного средства. Следующие примеры представлены для иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Определение аффинности связывания антитела 6G и его вариантов. А. Общие методы. Следующие общие методы использовали в этом примере и других примерах. Экспрессирующий вектор, применяемый для характеризации клонов Экспрессия Fab-фрагмента антител находилась под контролем индуцируемого IPTG промотораlacZ, сходного с описанным в Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2,10. вектор (pCom3X), однако, модификации включали в себя добавление и экспрессию следующих дополнительных доменов: константный домен легкой цепи каппа человека и константный домен CHI иммуноглобулина IgG2a человека, С-область цепи Ig гамма-2, инвентарный номер белка Р 01859; легкая цепь иммуноглобулина каппа (человека), инвентарный номер белка САА 09181. Мелкомасштабное получение Fab Мелкомасштабную экспрессию Fab в 96-луночных планшетах проводили следующим образом. Начиная с Е. coli, трансформированной библиотекой Fab, отбирали колонии для инокуляции как эталонного планшета (LB с агаром + ампициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза), так и рабочего планшета (2 мл/лунку,96 лунок/планшет, содержащих 1,5 мл LB + ампициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза). Оба планшета выращивали при 30 С в течение 8-12 ч. Эталонный планшет хранили при 4 С, а клетки из рабочего планшета осаждали при 5000 об./мин и ресуспендировали в 1 мл LB+ампициллин (50 мкг/мл)+ 1 мМ IPTG для индукции экспрессии Fab. Клетки собирали центрифугированием после времени экспрессии 5 ч при