Моноклональные антитела к миостатину и их применения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента В изобретении представлены моноклональные антитела к миостатину, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11, обладающие высоким сродством к миостатину и устойчивые к химическому разложению. Антитела настоящего изобретения можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости или для лечения или предотвращения различных заболеваний у видов млекопитающих и птиц. Хуан Лихуа, Сейерз Роберт Оуэн (US) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) 015916 По настоящей заявке на патент испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США 60/824498, поданной 5 сентября 2006 года. Область изобретения Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области моноклональных антител к миостатину. Более конкретно, изобретение относится к моноклональным антителам к миостатину, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11, и устойчивы к протеолитическому расщеплению, и применению таких антител для лечения, профилактики или диагностики различных нарушений или заболеваний у видов млекопитающих и птиц. Предпосылки создания изобретения Миостатин, который также называют фактором роста и дифференцировки-8 (growth differentiationfactor-8, GDF-8), является представителем суперсемейства белков TGF- и имеет структурное сходство с другими представителями семейства TGF-. Миостатин экспрессируется в основном в развивающихся и зрелых скелетных мышцах и функционирует как отрицательный регулятор скелетных мышц. Миостатин может также вовлекаться в другие физиологические процессы, включая дифференцировку преадипоцитов в адипоциты и, опосредованно, поддержание гомеостаза глюкозы и ингибирование образования кости. Фактор роста и дифференцировки-11, который также называют GDF-11 или ВМР-11, является представителем суперсемейства белков TGF- и близким гомологом миостатина. Последовательности аминокислот зрелых форм миостатина и GDF-11 человека идентичны почти на 90%, однако GDF-11 экспрессируется в более широком диапазоне тканей, чем миостатин, в том числе в зубной пульпе, мозге,сердце, почках и легких, а также в мышцах и жировой ткани. Как было недавно показано, GDF-11 человека определяет временной период, в течение которого мультипотентные клетки-предшественники сохраняют способность производить дочерние нервные клетки различного типа. Существует терапевтическая необходимость специфичного ингибирования активности миостатина при минимальном ингибировании активности других белков суперсемейства TGF-, в частности GDF11. Кроме того, существует диагностическая потребность в антителах к миостатину, характеризующихся минимальной перекрестной реакцией с другими белками суперсемейства TGF-, в частности GDF-11,для более точного наблюдения или определения уровней миостатина в образце. Антитела к миостатину,которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11, описаны в международной публикации WO 2005/094446. Гуманизированные моноклональные антитела, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11, описаны в международной публикации WO 2007/044411. Терапевтические антитела могут подвергаться различным реакциям деградации, например дезаминирования или протеолиза, которые могут происходить in vivo или в процессе производства, приготовления препарата, хранения и терапевтического применения. Например, остатки аспарагина (Asn) в антителах или других полипептидах, в частности, подвержены протеолизу в водном растворе. Таким образом,существует потребность в антителах к миостатину, которые преимущественно связывают миостатин, но не GDF-11, обладают сильным сродством к миостатину (то есть не выше чем приблизительно 310-8 М) и устойчивы к химической деградации. Краткое описание изобретения Антитела по настоящему изобретению предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF11, то есть они являются, по существу, менее реакционноспособными по отношению к GDF-11, чем к миостатину. Антитело по настоящему изобретению связывается с миостатином с большей силой, примерно по меньшей мере в 2, 3, 5, 10, 20, 22 или 25 раз больше, чем оно связывается с GDF-11, как можно оценить с помощью способа, известного в данной области, например конкурентного твердофазногоELISA (ИФА), или анализа с помощью BIACORE или KINEXA, для подтверждения более высокого сродства (то есть более низкой KD) антитела к GDF-8, чем к GDF-11. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с GDF-11 выше уровня фона в используемом анализе связывания. Настоящее изобретение охватывает моноклональное антитело к миостатину, которое предпочтительно связывается с миостатином, но не с фактором дифференцировки и роста-11 (GDF-11), при этом указанное антитело связывает миостатин со сродством не выше приблизительно 310-8 М и при этом по меньшей мере 95% моноклональных антител не подвергаются протеолизу при хранении в течение года при 4C, в течение шести месяцев при 25C, в течение двух месяцев при 37C или четырех недель при 40C в растворе антитела. Типичный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела согласно изобретению,10 мМ фосфата, pH 7,4 и 150 мМ NaCl. Предпочтительно антитела согласно изобретению также характеризуются IC50 менее 25 нМ при анализе in vitro в системе SBE миостатин/репортер, описанном в примере 4 в данной заявке. В одном варианте осуществления антитело согласно изобретению устойчиво к химической деградации, т.е. 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител не подвергаются деградации в растворе антител в течение времени и при температуре, выбранных из группы, состоящей из одного года при 4C, шести месяцев при 25C, двух месяцев при 37C и четырех недель при 40C в растворе антитела. Предпочтительное время и температура составляют четыре недели при 40C.-1 015916 В одном варианте осуществления антитела по изобретению характеризуются связыванием с миостатином в пределах домена, включающего аминокислоты 40-64 [ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA[GECEFVFLQKYPHTH (SEQ ID NO:31) для человека] зрелого миостатина. В другом варианте осуществления антитела согласно изобретению дополнительно характеризуются связыванием с полипептидом,включающим аминокислоты 40-64, 43-57 или 45-59 зрелого миостатина. В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11, и вариабельную область легкой цепи (LCVR) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:4,5, 6 и 7. В другом варианте осуществления моноклональное антитело по настоящему изобретению включает HCVR с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, и LCVR с последовательностью,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9 и 10. В одном варианте осуществления антитело по изобретению включает области HCVR и LCVR, при этом указанная область HCVR включает пептид в CDRH1 с последовательностью, представленной в SEQID NO:23, пептид в CDRH2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:25, и пептид в CDRH3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:27, и при этом указанная область LCVR включает пептид в CDRL1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:13, пептид в CDRL2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14, и пептид в CDRL3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:16, 17, 18 и 19. В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению включает области HCVR и LCVR, при этом указанная область HCVR включает пептид в CDRH1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, пептид в CDRH2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26,и пептид в CDRH3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28, и при этом указанная область LCVR включает пептид в CDRL1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:13, пептид в CDRL2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14, и пептид в CDRL3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:21 и 22. В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению дополнительно включает константную область, при этом указанная константная область получена из генома человека или генома животного, выбранного из группы, состоящей из домашних животных, животных для спорта и животных, имеющих важное сельскохозяйственное значение. В более предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению включает легкую цепь с аминокислотной последовательностью,представленной в SEQ ID NO:32, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:33. В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую антитело по настоящему изобретению. Композиция по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной композиции антитело по настоящему изобретению является активным компонентом. Предпочтительно композиция включает гомогенную или по существу гомогенную популяцию антител к миостатину согласно настоящему изобретению. Композиция для терапевтического или профилактического применения является стерильной, может быть лиофилизированной и предпочтительно поставляется с подходящим растворителем. Изобретение обеспечивает способ ингибирования по меньшей мере одной биологической активности миостатина у животного, предпочтительно представителя вида млекопитающих или птиц, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества моноклональных антител к миостатину согласно изобретению указанному представителю вида млекопитающих или птиц. Изобретение дополнительно обеспечивает способ увеличения мышечной массы или лечения или предотвращения заболевания или нарушения, или патологического состояния, облегчаемого путем нейтрализации или противодействия биологической активности миостатина, включающий введение пациенту (например, человеку), нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по настоящему изобретению. Изобретение включает антитело согласно изобретению для применения в терапии. Изобретение включает применение такого антитела согласно изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии. Изобретение включает применение антитела согласно изобретению для приготовления лекарственного средства для предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии. Изобретение включает способ лечения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении,дисфункциональной атрофии и кахексии у млекопитающего, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, путем введения терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению. Изобретение включает способ предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии у млекопитающего, предпочтительно человека, нуж-2 015916 дающегося в этом, путем введения профилактически эффективного количества антитела согласно изобретению. Краткое описание чертежей На фиг. 1A представлено выравнивание аминокислотной последовательности зрелой формы миостатина человека и GDF-11 человека; подчеркнут антигенный эпитоп MAT (Mab) 510C2 и C12 и их вариантов, жирным шрифтом выделены остатки в пределах антигенного эпитопа, различающиеся у миостатина и GDF-11; на фиг. 1B перечислены антигенные эпитопы, с которыми связываются MAT (Mab) 510C2 и C12 и их варианты; на фиг. 2A и B представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей родительских MAT 510C2 и C12 соответственно, а также нескольких вариантов, включая домены CDR и каркасные области; жирным шрифтом выделены домены CDR, а вариабельные участки в областях CDR подчеркнуты; на фиг. 3 представлено выравнивание аминокислотной последовательности областей CDR родительских MAT 510C2 и C12 и антител по настоящему изобретению; вариабельные участки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты; на фиг. 4 перечислены аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению, т.е. N93H-C12; на фиг. 5A и B представлено сравнение сродства связывания некоторых моноклональных антител по настоящему изобретению с родительским антителом, как было определено с помощью твердофазного ИФА (ELISA). Подробное описание изобретения Определения. Используемый в данной заявке термин "зрелый миостатин" (см. SEQ ID NO:1 для видов человека,мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи) относится к белку в мономерной или гомодимерной форме, образующемуся в результате протеолитического расщепления, например, в случае человека, по Arg 266 белка-предшественника миостатина, включающего 375 аминокислот. Используемый в данной заявке термин "миостатин" относится к зрелому миостатину, если не указано иначе. Полноразмерное антитело в той форме, в какой он существует в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей (примерно 5070 кДа в случае полноразмерного антитела) и двух легких (L) цепей (примерно 25 кДа в случае полноразмерного антитела), соединенных дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область аминокислот примерно 100-110 или более, главным образом, ответственную за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи соответствует константной области,главным образом, ответственной за эффекторную функцию. Легкие цепи подразделяют на классы каппа или лямбда, и они характеризуются конкретными константными областями, как известно в данной области. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретной константной областью, известной в данной области техники. IgG1 и IgG4 являются предпочтительными изотипами антител согласно изобретению. Каждая тяжелая цепь включает N-концевую вариабельную область тяжелой цепи (здесь "HCVR") и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех областей (CH1, CH2 и CH3) в случае IgG, IgD и IgA и четырех областей (CH1, CH2, CH3 и CH4) в случае IgM и IgE. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь "LCVR") и константной области легкой цепи, CL. Каждую область HCVR и LCVR можно дополнительно подразделить на гипервариабельные области, которые называют областями, определяющими комплементарность (complementarity determining regions, CDR), расположенные между более консервативными областями, называемыми "каркасными областями" (FR, framework regions). Каждая область HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В данной заявке 3 CDR тяжелой цепи называют "CDRH1, CDRH2 и CDRH3", а 3 CDR легкой цепи называют "CDRL1, CDRL2 и CDRL3".CDR содержат большинство остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. Обозначения аминокислот в каждой области соответствуют стандартным [Kabat, "Sequences of Proteins ofImmunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. Функциональная способность антитела связываться с конкретным антигеном обусловлена в основном шестью участками CDR. Термин "антитело" по отношению к моноклональному антителу к миостатину согласно настоящему изобретению (или просто, "моноклональное антитело настоящего изобретения" или "антитело настоящего изобретения") при использовании в данной заявке относится к моноклональному антителу. "Моноклональное антитело" или "MAT (Mab)" при использовании в данной заявке относится к химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иначе. Предпочтительно моноклональное антитело настоящего изобретения существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены с применением технологии гибридомы, известной в данной области, а также технологии рекомбинантной ДНК, технологии фагового дисплея, технологии синтеза или сочетания таких технологий или других-3 015916 технологий, известных в данной области. "Моноклональное антитело" относится к антителу, которое получено от одной копии или клона, в том числе, например, любого эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого такое антитело было получено. "Моноклональное антитело" может представлять собой интактное антитело (включая полное антитело или полноразмерную Fc-область), по существу интактное антитело, или часть или фрагмент антитела, включающий антигенсвязывающий участок, например Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент или F(ab')2-фрагмент химерного, гуманизированного или человеческого антитела. Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело IgG имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, два связывающих сайта идентичны. Используемые в данной заявке термины "антигенсвязывающая часть" или "антигенсвязывающая область" либо "антигенсвязывающий фрагмент" используются равнозначно для обозначения части молекулы антитела в пределах вариабельной области, которая содержит остатки аминокислот, взаимодействующие с антигеном и сообщающие антителу специфичность и сродство к антигену. Антигенсвязывающая часть антитела включает остатки аминокислот каркасной области, необходимые для поддержания соответствующей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно каркасные области антител согласно изобретению происходят от человека или по существу происходят от человека (по меньшей мере на 85, 90, 95, 97 или 99% происходят от человека). Кроме того, "моноклональное антитело" при использовании в данной заявке может представлять собой одноцепочечный Fv-фрагмент, который может быть получен соединением ДНК, кодирующейLCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Очевидно, что вне зависимости от того, идет ли речь о фрагментах или участках, термин "антитело" при использовании в данной заявке включает такие фрагменты или участки, а также одноцепочечные формы. Если белок сохраняет способность специфично или предпочтительно связываться с его предполагаемой мишенью(т.е. эпитопом или антигеном), он входит в понятие термина "антитело". Используемый в данной заявке термин "родительское" антитело означает антитело, кодируемое аминокислотной последовательностью, применяемой для получения модифицированного антитела или варианта. Родительское антитело может иметь каркасную область, полученную от мыши, но предпочтительно имеет каркасную область, полученную от человека. Родительское антитело может представлять собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело."Модифицированное антитело" или "вариант" антитела к миостатину в данной заявке означает молекулу, которая отличается по аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности "родительского" антитела к миостатину вследствие добавления, делеции и/или замены одного или более остатков аминокислоты в последовательности родительского антитела. В предпочтительном осуществлении вариант антитела включает один или более остатков аминокислоты в вариабельной области по сравнению с родительским антителом. Антитело настоящего изобретения (вариант антитела) сохраняет способность его родительского антитела предпочтительно связываться с миостатином, но не сGDF-11, обладает сродством к миостатину, идентичным или превышающим сродство родительского антитела, и характеризуется стабильностью (т.е. химической стабильностью), превышающей стабильность родительского антитела."Химическая стабильность" относится к способности противостоять химической деградации, например расщеплению по пептидной связи ("протеолитическому расщеплению"). Используемые в данной заявке антитела настоящего изобретения, "устойчивые к химической деградации", устойчивы к спонтанному расщеплению по пептидной связи и обладают повышенной химической устойчивостью по сравнению с родительским антителом. Предпочтительно 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител настоящего изобретения устойчивы к химической деградации, то есть не подвергаются расщеплению при хранении в течение одного года при 4C, шести месяцев при 25C, двух месяцев при 37C или четырех недель при 40C в растворе антитела. Раствор антитела представляет собой раствор, применяемый в фармацевтической композиции антитела. Предпочтительный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела, 10 мМ фосфата, pH 7,4 и 150 мМ NaCl. Модифицированное антитело к миостатину, представляющее интерес в данной заявке, представляет собой моноклональное антитело к миостатину с повышенной химической стабильностью по сравнению с родительским антителом, в котором лабильный остаток Asn дипептида Asn-Pro в пределах родительского антитела удален предпочтительно путем замены на природный аминокислотный остаток, еще более предпочтительно путем замены на остаток гистидина (H), серина (S), треонина (T), аланина (A) или аргинина (R). Кроме того, такое модифицированное антитело характеризуется предпочтительным связыванием с миостатином, но не с GDF-11, и наличием KD для миостатина менее примерно 310-8 М, предпочтительно также характеризуется наличием IC50 менее 25 нМ при анализе in vitro в системе SBE миостатин/репортер, описанном в примере 4 в данной заявке. Используемый в данной заявке термин "лабильный остаток Asn" относится к остатку аспарагина в-4 015916 молекуле антитела, белка или полипептида, при наличии которого может происходить спонтанное дезаминирование или расщепление пептидной связи in vitro или in vivo. Используемый в данной заявке термин "расщепленный или расщепление" относится к расщеплению пептидной связи в молекуле антитела. Сайтом расщепления, представляющим особый интерес, является остаток Asn в антителе, либо амино- или карбоксиконец остатка Asn. Расщепление антитела может приводить к уменьшению стабильности и/или к уменьшению или потере активности белка, или потере сродства связывания с антителом. Спонтанная модификация, приводящая к расщеплению, может происходить ex vivo в процессе приготовления терапевтического препарата, что оказывает негативное влияние на производство и хранение фармацевтического агента. Расщепление может также происходитьex vivo в процессе производства или хранения антитела. Кроме того, спонтанная модификация может происходить in vivo, оказывая влияние на эффективность белка или антитела и длительность действия. Тем не менее, простая замена аминокислоты в сайте расщепления на любую другую аминокислоту может негативно повлиять на желательную биологическую активность антитела, например сродство связывания или нейтрализацию. Термин "эпитоп" относится к части молекулы, которая может распознаваться и с которой может связываться одна или более антигенсвязывающих областей антитела. Эпитопы часто содержат химически активные группировки на поверхности молекулы, например аминокислоты или боковые цепи из сахара, и обладают специфическими особенностями трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Используемый в данной заявке термин "эпитоп", кроме того, относится к части полипептида, обладающей антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего,например мыши или человека Используемый в данной заявке термин "антигенный эпитоп" означает часть полипептида, с которой может специфично связываться антитело, как определяют любым способом, хорошо известным в данной области, например стандартным иммунологическим анализом. Антигенные эпитопы необязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными. "Иммуногенный эпитоп" при использовании в данной заявке означает часть полипептида, которая запускает иммунный ответ у животного, как может быть определено любым способом, известным в данной области (см., например, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983. Выражения "биологическое свойство" или "биоактивность", "активность" или "биологическая активность" по отношению к антителу настоящего изобретения используются в данной заявке равнозначно и включают, но не ограничиваются перечисленными, сродство и специфичность по отношению к эпитопу/антигену, способность нейтрализовать или противодействовать активности миостатина in vivo или invitro, IC50 в системе анализа с помощью SBE миостатин/репортер, как показано в примере 4 в данной заявке, или другой системы для оценки активности in vitro, стабильность антитела in vitro или in vivo. Другие биологические свойства антитела, которые можно выявить, включают, например, перекрестную реактивность (например, по отношению к гомологу пептида-мишени, не принадлежащего человеку, или к другим белкам или тканям, в целом), и способность сохранять высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающего. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерить либо оценить с применением способов, известных в данной области, включающих, но не ограниченных перечисленными, твердофазный ИФА, конкурентный твердофазный ИФА, поверхностный плазмонный резонанс, способы анализа нейтрализации in vitro и in vivo без ограничений, связывания рецептора, анализ с помощью BIACORE или KINEXA, систему анализа на основе продукции и/или секреции цитокина или фактора роста, развития анимального полюса у Xenopus, сигнальной трансдукции или иммуногистохимический анализ срезов ткани из различных источников, в том числе человека, примата или любого другого источника, по необходимости. Используемый в данной заявке термин "активность миостатина" относится к одному или более видам регулирующей рост или морфогенетической активности, ассоциированной с активным белком миостатином. Например, активный миостатин является негативным регулятором массы скелетных мышц. Активный миостатин может также модулировать продукцию специфичных для мышц ферментов (например, креатинкиназы), стимулирует пролиферацию миобластов и модулирует дифференцировку преадипоцитов в адипоциты. Используемый в данной заявке термин "ингибирует" или "нейтрализует" в отношении активности антитела настоящего изобретения означает способность, по существу, противодействовать, ингибировать, предотвращать, сдерживать, замедлять, нарушать, устранять, останавливать, уменьшать или отменять, например, прогрессирование или степень проявления активности, которая ингибируется, включающей, без ограничения, биологическую активность. Ингибирование или нейтрализация составляет по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более активности в отсутствие антитела. Используемые в данной заявке термины "индивид", "субъект" и "пациент" равнозначно относятся к животному, предпочтительно млекопитающему (включая млекопитающих, не относящихся к приматам,и приматов) или видам птиц, включая, без ограничения перечисленным, мышей, человекоподобных обезьян, человека, важных для сельского хозяйства млекопитающих (например, быка, свинью, овцу),-5 015916 животных для спорта (например, лошадь) и домашних животных (например, собаку и кошку); предпочтительно термин относится к человеку. Термин также относится к видам птиц, включающих, но не ограниченных перечисленными, курицу и индейку. В некотором варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек, также характеризуется наличием заболевания или нарушения, или патологического состояния, при котором уменьшение уровня или уменьшение биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект. В другом варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, также характеризуется наличием риска развития нарушения, заболевания или патологического состояния, облегчаемого уменьшением уровня миостатина или уменьшением биологической активности миостатина. Характеристика антитела. Изобретение представляет антитело, которое предпочтительно связывается с миостатином, но не сGDF-11, является более стабильным по сравнению с родительским антителом (т.е. более устойчивым к химической деградации по сравнению с родительским антителом), при этом сохраняет сродство связывания или обладает более высоким сродством связывания с миостатином по сравнению с родительским антителом. В одном варианте осуществления лабильный остаток Asn в CDRL3 родительского антитела,MAT C12 или MAT 510C2, как показано на фиг. 2, заменен другой аминокислотой. Предпочтительной заменой аминокислоты в антителе настоящего изобретения является замена, которая: (1) снижает восприимчивость к спонтанной химической деградации, то есть к расщеплению или дезаминированию, и (2) сохраняет сродство связывания с антителом, характерное для родительского антитела. В одном предпочтительном варианте осуществления остаток Asn в CDRL3 MAT C12 заменен наH или R. В другом предпочтительном варианте осуществления остаток Asn в CDRL3 MAT 510C2 заменен на H, S, T или A. В одном варианте осуществления антитело настоящего изобретения устойчиво к спонтанной химической деградации, то есть 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител не расщепляются в растворе антитела в течение времени и при температуре, выбранных из группы, состоящей из одного года при 4C, шести месяцев при 25C, двух месяцев при 37C и четырех недель при 40C в растворе антитела. Раствор антитела представляет собой любой раствор, подходящий для фармацевтической композиции, содержащей антитело. Типичный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела, 10 мМ фосфата, pH 7,4 и 150 мМNaCl. В одном варианте осуществления антитело настоящего изобретения дополнительно характеризуется высоким сродством (KD) к миостатину, то есть ниже примерно 310-8 М, 110-8 М или 110-9 М, предпочтительно ниже примерно 910-10 М, 8,710-10 М или более предпочтительно ниже примерно 810-11M. Альтернативно, антитело настоящего изобретения характеризуется KD для миостатина не выше примерно 310-8 М, 110-8 М, 110-9 М или 910-10 М, более предпочтительно не выше примерно 8,710-10 М и наиболее предпочтительно не выше примерно 810-11 М. Сродство связывания антитела настоящего изобретения аналогично или превышает сродство связывания для родительского антитела. Предпочтительно антитела настоящего изобретения, характеризующиеся высоким сродством связывания, как описано выше, также имеют IC50 менее 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ при анализе в системе SBE миостатин/репортер in vitro, описанном в примере 4 в данной заявке. Предпочтительно значение IC50 для антитела настоящего изобретения аналогично или превышает значение для родительского антитела. Все антитела настоящего изобретения в значительно меньшей степени реагируют с GDF-11,чем с миостатином, то есть они предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11. Антитела настоящего изобретения предпочтительно представляют собой химерные, гуманизированные или человеческие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и предпочтительно связываются с миостатином в пределах области зрелой формы миостатина, включающей аминокислоты 40-64,или более предпочтительно в пределах области зрелой формы миостатина, включающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59. Кроме того, антитела настоящего изобретения нейтрализуют биологическую активность миостатина in vivo или in vitro. Специфичное связывание моноклональных антител к миостатину согласно настоящему изобретению позволяет применять антитела настоящего изобретения как терапевтические или профилактические средства для ассоциированных с миостатином патологических состояний, заболеваний или нарушений, то есть патологических состояний, заболеваний или нарушений, при которых снижение уровня миостатина или противодействие, или ингибирование биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект. Кроме того, антитела настоящего изобретения можно применять для диагностики или наблюдения патологических состояний, заболеваний или нарушений, при которых изменение уровня или биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект, или для определения уровня миостатина в образце. Моноклональные антитела к миостатину согласно настоящему изобретению связывают антигенный эпитоп, который, как показано, локализуется в пределах аминокислот 40-64 (SEQ ID NO:1 для человека) зрелого миостатина, предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина. Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина настоящего изобретения локализован в пределах аминокислот 40-64 зрелого миостатина (SEQ ID NO:1 для человека), предпочтительно в пределах аминокислот-6 015916 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина любого вида млекопитающих или птиц. Также предусмотрено, что иммуногенный эпитоп согласно настоящему изобретению является антигенным эпитопом. Кроме того,аминокислотные остатки в молекуле миостатина вне аминокислот 40-64 могут влиять на конформационную структуру антигенной области и, таким образом, изменять связывание антитела настоящего изобретения с антигенным эпитопом. Одноцепочечные антитела, а также химерные, гуманизированные антитела и химерные или одноцепочечные антитела с пересаженными CDR и т.п., включающие участки, полученные от антитела другого вида, также охвачены настоящим изобретением и термином "антитело" или "модифицированное антитело". Различные участки таких антител можно химически соединить стандартными способами, путем синтеза, или они могут быть объединены в одном белке с помощью генно-инженерных методов. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или гуманизированную цепь, могут экспрессироваться с образованием единого белка. Кроме того, также можно получить функциональные фрагменты антител, в том числе антигенсвязывающие участки химерных, гуманизированных, человеческих или одноцепочечных антител. Функциональные фрагменты указанных антител сохраняют по меньшей мере одну антигенсвязывающую функцию и/или биологическую функцию или биологическую активность полноразмерного антитела, от которого они были получены. Предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего полноразмерного антитела (например, способность связываться со зрелой формой миостатина). Особенно предпочтительные функциональные фрагменты или части сохраняют способность ингибировать одну или более функций или видов биологической активности, характерной для зрелого миостатина млекопитающих, например связывающую активность, сигнальную активность и/или стимуляцию клеточного ответа. Например, в одном варианте осуществления функциональный фрагмент или часть может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или более его лигандами и/или может ингибировать одну или более опосредованных рецептором функций. Части или фрагменты антитела, способные связываться со зрелым миостатином или его частью(предпочтительно в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина), включают, но не ограничиваются перечисленным, Fv, Fab, Fab' и F(ab')2-фрагменты и охвачены настоящим изобретением. Такие фрагменты могут быть получены ферментативным расщеплением или рекомбинантными способами. Например, при расщеплении с помощью папаина или пепсина могут образовываться Fab илиF(ab')2-фрагменты соответственно. Минимальным антигенсвязывающим фрагментом является Fv, включающий области HCVR и LCVR. Fab-фрагмент включает области HCVR-CH1 и LCVR-CL, ковалентно соединенные дисульфидной связью между константными областями. Для преодоления тенденции к диссоциации нековалентно соединенных областей HCVR и LCVR в Fv-фрагменте при экспрессии в клеткаххозяевах может быть создан так называемый одноцепочечный (single chain, sc) Fv-фрагмент (scFv), в котором подвижный полипептид соответствующего размера соединяет либо C-конец HCVR с N-концомLCVR, либо C-конец LCVR с N-концом HCVR. Часто в качестве линкера используют пептид из 15 аминокислотных остатков (Gly4Ser)3, но в данной области известны также другие линкеры. Антитела можно также получить в укороченной форме с применением генов антител, в которых в направлении 3'-5' (слева) от природного стоп-кодона введен один или более стоп-кодонов. Например, химерный ген, кодирующий фрагмент тяжелой цепи F(ab')2, может быть сконструирован таким образом, что он будет включать последовательности ДНК, кодирующие CH1 доменный и шарнирный участок тяжелой цепи. Выявление лабильного остатка (остатков) Asn. Существует множество способов для выявления и количественной оценки спонтанной модификации лабильных остатков Asn в белке, например, в молекуле антитела. При дезаминировании, модификации, приводящей к преобразованию остатка аспарагина в смесь изоаспартата и аспаратата, которая может явиться сигналом к деградации белка, вводится отрицательный заряд и изменяется масса белка (NH2 в сравнении с OH, =1 Да) и гидрофобность. Для разделения или выделения дезаминированных или укороченных форм антитела или белка либо полипептида можно применять технологии разделения, включающие способы, основанные на применении электрического поля и хроматографии, например ИЭФ,капиллярное ИЭФ, гель-электрофорез с мочевиной, обращенно-фазную ВЭЖХ, ионообменную ВЭЖХ и гидрофильное взаимодействие. Ионообменную хроматографию широко применяют для выделения дезаминированных белков. Сайт и степень спонтанных модификаций антитела или белка либо полипептида можно дополнительно охарактеризовать с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии(ЖХ/МС) и N-концевого секвенирования. Замена лабильного остатка (остатков) Asn или другая модификация антител. Для удаления, например, путем замены аминокислоты лабильного остатка Asn в молекуле антитела,или другого белка, лабильный остаток Asn можно заменить другой аминокислотой. Желательно, чтобы такая аминокислотная замена не изменяла (то есть не влияла отрицательно) или минимально изменяла(например, на 10, 5, 4, 3, 2% или менее) сродство антитела к антигену. Также желательно, чтобы замена аминокислоты не изменяла (то есть не влияла отрицательно) или минимально изменяла нейтрализацию антитела, специфичность к эпитопу и способность антитела преимущественно связываться с миостатином, но не с GDF-11. Для определения влияния отдельных аминокислотных замен на сродство связыва-7 015916 ния антитела настоящего изобретения с миостатином или его антигенным эпитопом можно применять твердофазный ИФА, и значения, полученные при ИФА, сравнивают со значениями, полученными для родительского антитела (например, антитела C12 или 510C2), связывающегося с этим же антигеном. Кроме того, для оценки сродства связывания антитела можно применять технологию BIACORE илиKINEXA. В антитела настоящего изобретения можно дополнительно внести мутацию (или внести мутацию перед удалением остатка Asn, наличие которого способствует нестабильности родительского антитела),например, в пределах участка (участков) CDR с получением варианта антитела с оптимизированным интересующим свойством, например сродством связывания, IC50, специфичностью и т.д. Антитело настоящего изобретения, полученное путем замены аминокислоты, является предпочтительным, и в таком антителе по меньшей мере один остаток аминокислоты родительской молекулы антитела удален и заменен другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для замены с помощью мутагенеза,включают участки CDR, но также возможны замены в пределах FR. Удобным способом получения вариантов, содержащих замены, является процесс созревания сродства с помощью фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов в участках CDR подвергают мутагенезу с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела экспонируют моновалентным способом на частицах нитевидных фагов в виде белков,слитых с продуктом гена III M13, упакованных в пределах каждой частицы. Затем осуществляют скрининг экспонируемых вариантов бактериофага на биологическую активность (например, сродство связывания, специфичность, IC50), как описано в данной заявке. Для идентификации сайтов участков CDR,которые могут быть модифицированы, может быть осуществлен аланиновый сканирующий мутагенез с целью выявления остатков в участках CDR, важных для связывания с антигеном. В качестве альтернативы или дополнения, можно проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации участков контакта между антителом и миостатином. Остатки аминокислот в таких участках контакта и прилегающие к ним остатки являются кандидатами на замену согласно способам,описанным в настоящей заявке или известным в данной области техники. В качестве альтернативы или дополнения, можно осуществлять произвольный мутагенез одной или более последовательностей CDR в одном или более положениях аминокислотного остатка, при этом CDR связан с сохранением функции с вариабельной областью, либо CDR не связан с последовательностью другого вариабельного домена, а затем измененный участок CDR может быть возвращен в вариабельную область с применением технологии рекомбинантной ДНК. После того как будут синтезированы и экспрессированы такие варианты антител, совокупность таких вариантов подвергают скринингу, как описано в данной заявке, и для дальнейшей работы могут быть отобраны антитела с наиболее высокими показателями в одной или более соответствующих системах анализа. Экспрессия антитела. Настоящее изобретение также направлено на линии клеток, экспрессирующих моноклональное антитело к миостатину настоящего изобретения или его часть. Создание и выделение линии клеток, продуцирующих моноклональное антитело настоящего изобретения, можно осуществить с применением стандартных способов, известных в данной области. Предпочтительные линии клеток включают COS, CHO,SP2/0, NS0 и дрожжи (доступны в национальных банках линии клеток, таких как ATCC, Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA). Для экспрессии антитела настоящего изобретения можно применять разнообразные системы экспрессии в клетках-хозяевах, включающие прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы для экспрессии (например, дрожжевые, бакуловирусные, растительные, клетки млекопитающих и других животных, трансгенные животные и клетки гибридомы), а также системы для экспрессии на основе фагового дисплея. Примером подходящего бактериального вектора для экспрессии являетсяpUC119, а примером подходящего эукариотического вектора для экспрессии является модифицированный вектор pcDNA3.1 с ослабленной системой селекции DHFR. Другие системы для экспрессии антитела также известны в данной области и предусмотрены настоящим изобретением. Антитело настоящего изобретения можно получить путем рекомбинантной экспрессии иммуноглобулиновых генов легкой и тяжелой цепи в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т.п. одним или более векторами для рекомбинантной экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие иммуноглобулиновую легкую и/или тяжелую цепь антитела таким образом, что легкая и/или тяжелая цепь экспрессируется в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться независимо, находясь под контролем различных промоторов, с которыми они функционально соединены, в одном векторе, или же тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться независимо, находясь под контролем различных промоторов, с которыми они функционально соединены, в двух векторах, один из которых обеспечивает экспрессию тяжелой цепи, а другой - легкой цепи. Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой затем антитела могут быть извлечены или очищены. Для полу-8 015916 чения генов тяжелой и легкой цепи применяют стандартные методики рекомбинантной ДНК эти гены встраивают в векторы для рекомбинантной экспрессии и вводят векторы в клетки-хозяева. Выделенная молекула ДНК, кодирующая область HCVR, может быть преобразована в полноразмерный ген тяжелой цепи путем соединения с сохранением функции ДНК, кодирующей HCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константных областей тяжелой цепи антител человека известны в данной области. См., например, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Healthand Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, включающие такие области,также можно получить, например, путем стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константные области тяжелой цепи могут относиться к любому типу (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или подклассу константной области и любому его аллотипическому варианту, как описано в работе Kabat (выше). Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента ДНК, кодирующая HCVR, может быть соединена с сохранением функции с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи CH1. Выделенная ДНК, кодирующая область LCVR, может быть преобразована в полноразмерный ген легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab-фрагмента) путем соединения с сохранением функции ДНК,кодирующей LCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL. Последовательности генов константной области легкой цепи антитела человека известны в данной области, см., например, Kabat (выше). Фрагмент ДНК, включающий эти области, может быть получен путем стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область типа каппа или лямбда. Для получения гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие HCVR и LCVR, соединяют с сохранением функции с другим фрагментом, кодирующим подвижный линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3 таким образом, что последовательности HCVR и LCVR могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом области LCVR и HCVR соединены подвижным линкером. Для экспрессии антитела настоящего изобретения ДНК, кодирующую часть или полноразмерную легкую и/или тяжелую цепь, полученную, как описано выше, встраивают в вектор для экспрессии таким образом, чтобы ген был соединен с сохранением функции с последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию. Вектор для экспрессии и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, применяемой для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть включены в разные векторы или, как правило, оба гена включены в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела включают в вектор для экспрессии стандартными способами. Кроме того, вектор для экспрессии может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела к миостатину клеткой-хозяином. Ген легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела к миостатину может быть клонирован в векторе таким образом, чтобы сигнальный пептид был соединен с сохранением функции в рамке считывания с аминоконцевой последовательностью гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид. В дополнение к гену (генам) тяжелой и/или легкой цепи антитела вектор для рекомбинантной экспрессии содержит регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена (генов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигнальные последовательности для полиаденилирования), по необходимости, которые контролируют транскрипцию или трансляцию гена (генов) цепи антитела. Конструирование вектора для экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клеток-хозяев, которые необходимо трансформировать, уровень экспрессии необходимого белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают регуляторные элементы вирусов, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, например промоторы и/или энхансеры, полученные от цитомегаловируса (CMV, ЦМВ), вируса обезьяны 40(SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP и вируса полиомы. В дополнение к генам тяжелой и/или легкой цепи антитела и регуляторным последовательностям векторы для рекомбинантной экспрессии согласно настоящему изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и один или более маркерных селективных генов. Маркерный селективный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор. Например,как правило, селективный маркер сообщает клетке-хозяину, в которую он введен, устойчивость к лекарственному средству, такому как G418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные маркерные селективные гены включают ген дигидрофолатредуктазы DHFR) (для применения в клетках-хозяевах,лишенных DHFR, с селекцией/амплификацией с помощью метотрексата), ген neo (для селекции G418) и-9 015916 глутаминсинтетазу (GS) для применения в линии клеток, лишенных GS (как например, NS0), для селекции/амплификации. Для экспрессии легкой и/или тяжелой цепи экспрессионный вектор (векторы), кодирующий тяжелую и/или легкую цепи, вводят в клетку-хозяин стандартными способами, например путем электропорации, преципитации с фосфатом кальция, трансфекцией с применением DEAE-декстрана, трансдукции,инфицирования и т.п. Хотя теоретически возможна экспрессия антитела настоящего изобретения либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительными являются эукариотические клетки и наиболее предпочтительными - клетки-хозяева млекопитающих, поскольку в таких клетках более вероятна сборка и секреция антител с правильной укладкой и иммунологической активностью. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для рекомбинантной экспрессии антител настоящего изобретения включают клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO), клетки миеломыNS0, клетки COS и клетки SP2/0. Если векторы для рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают в процессе культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии антитела в клеткаххозяевах, или более предпочтительно при секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из клетки-хозяина и/или культуральной среды с применением стандартных способов очистки. Клетки-хозяева можно также применять для продукции частей или фрагментов интактных антител,например Fab-фрагментов или молекул scFv, с помощью способов, которые являются стандартными. Как ясно специалисту в данной области, настоящее изобретение также включает варианты описанных выше способов. Например, может быть желательна трансфекция клеток-хозяев ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела настоящего изобретения. Технологию рекомбинантной ДНК можно также применять для удаления некоторых или всех участков ДНК, кодирующих либо легкую, либо тяжелую цепь, либо обе, которые не являются необходимыми для связывания с миостатином. Молекулы, экспрессируемые с таких укороченных молекул ДНК, также относятся к антителам согласно настоящему изобретению. В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела настоящего изобретения вектор для рекомбинантной экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки CHO с помощью, например, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В пределах вектора для рекомбинантной экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела связан с сохранением функции с энхансерными/промоторными регуляторными элементами, обеспечивающими высокий уровень транскрипции генов. Вектор для рекомбинантной экспрессии также содержит ген DHFR, который позволяет осуществлять отбор клеток CHO, трансфицированных вектором, путем селекции/амплификации с помощью метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для осуществления экспрессии тяжелой и легкой цепи антитела и извлекают интактное антитело из культуральной среды. Для получения вектора для рекомбинантной экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из культуральной среды применяют стандартные методики молекулярной биологии. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения можно экспрессировать в трансгенном животном (например, мыши), содержащем гены иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992). Способы применения. Антитела настоящего изобретения можно применять в терапевтических, профилактических, диагностических и научно-исследовательских целях, как описано выше. Антитело настоящего изобретения можно применять для диагностики нарушений или заболеваний, ассоциированных с экспрессией миостатина человека. Аналогично, антитело настоящего изобретения можно применять в системе для анализа уровня миостатина у субъекта, подвергаемого лечению от заболевания, ассоциированного с миостатином. Терапевтическое применение антител. Миостатин играет роль в развитии мышц и в развитии большого числа связанных с ним нарушений или заболеваний. У взрослых мРНК миостатина в основном выявляют в скелетной мускулатуре, хотя в меньших концентрациях мРНК миостатина также встречается в жировой ткани и сердечной ткани(Sharma, M., et al., J. Cell Physiol. 180:1, 1999). Мыши, нокаутированные по миостатину, имеют мышечную массу, в два-три раза превышающую мышечную массу мышей дикого типа. Увеличенная мышечная масса является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (McPherron, A., et al. Nature 387:83-90,1997 and Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71). Кроме того, мыши, нокаутированные по миостатину, накапливают меньше жира, по сравнению с мышами дикого типа, но в других отношениях являются нормальными и здоровыми. Также недавно было показано, что миостатин является важным регулятором адипогенеза (Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23:7230-7242, 2003). Кроме того, недавно была изучена структура и состав кости у мышей с недостатком миостатина (Hamrick M.W., et al., J. Orthopaedic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int. 71:63, 2002).- 10015916 Таким образом, композицию, включающую моноклональное антитело к миостатину согласно настоящему изобретению, можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости, уменьшения мышечного истощения, или ее можно применять для лечения или предотвращения патологических состояний, при которых присутствие миостатина вызывает или опосредует нежелательные патологические эффекты, или при которых снижение уровня миостатина вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека. Предпочтительно композицию,включающую моноклональное антитело к миостатину согласно настоящему изобретению, можно применять для увеличения мышечной массы. Предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения мышечного истощения, повреждения мышц, хирургии, восстановления поврежденных мышц,слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии, остеопороза, остеоартрита, роста и восстановления связок, ожирения, подавления накопления жира в организме, ожирения, дистрофии мышц любого типа, тяжелой формы миопатии, алкогольной миопатии, кахексии (например, связанной с раком или индуцированной ВИЧ, или обусловленной ХОЗЛ (COPD), хроническим заболеванием легкого, при восстановлении после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или заболевании сердца), метаболического синдрома, послеожогового мышечного истощения и диабета II типа. Более предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии. Наиболее предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения дисфункциональной атрофии или кахексии. Дисфункциональная атрофия может быть обусловлена различными причинами или инцидентами, в том числе любым нарушением или заболеванием либо состоянием, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию либо постельному режиму, включающим, но не ограниченным перечисленным, пересадку солидного органа, замену сустава, удар, повреждение спинного мозга, восстановление после серьезных ожогов, малоподвижность при хроническом гемодиализе, восстановление после сепсиса и воздействие микрогравитации. Поскольку миостатин является высококонсерватиным по последовательности и функции у различных видов, антитела настоящего изобретения можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости или лечения или предотвращения патологического состояния у видов млекопитающих, отличных от человека, или птиц [например, домашних животных (например, собаки и кошки), животных для спорта (например, лошади), сельскохозяйственных животных (например, быка, свиньи и овцы), видов птиц (например, курицы, индейки, другой пернатой дичи или домашней птицы)], при котором присутствие миостатина вызывает или обуславливает нежелательные патологические эффекты, или при котором снижение уровня миостатина оказывает благоприятный терапевтический эффект. Предусмотрено применение моноклонального антитела к миостатину согласно настоящему изобретению для лечения или предотвращения по меньшей мере одного из указанных нарушений, при которых активность миостатина вызывает неблагоприятный эффект или при которых уменьшение уровня биологически активного миостатина имеет благоприятный терапевтический эффект. Кроме того, предусмотрено применение моноклонального антитела к миостатину согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из указанных заболеваний. Используемые в данной заявке термины "лечение", "излечение" и т.п. относятся к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть терапевтическим в отношении частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия на заболевание. "Лечение" при использовании в данной заявке включает введение соединения настоящего изобретения для лечения заболевания или патологического состояния у млекопитающего, в частности человека, и включает: (a) подавление заболевания, то есть подавление его развития; и (c) облегчение состояния заболевания, то есть обеспечение регрессии заболевания или нарушения, или облегчение симптомов или осложнений заболевания. Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желательного ответа. Используемый в данной заявке термин "предотвращение" относится к полному или частичному предотвращению заболевания или его симптома. "Предотвращение" при использовании в данной заявке включает введение соединения настоящего изобретения для предотвращения появления заболевания у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию, но у которого оно еще не диагностировано. Композиция. Антитело настоящего изобретения может быть включено в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Соединения настоящего изобретения можно вводить по отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или эксципиентом, в однократной дозе или многократных дозах. Композиции для введения разработаны таким образом, что они подходят для выбранного способа введения с применением соответствующих фармацевтически приемлемых растворителей, носителей и/или эксципиентов, например диспергирующих агентов, буферов, поверхностно-активных веществ, консервантов, солюбилизирующих агентов, агентов, обеспечивающих- 11015916 изотоничность, стабилизирующих агентов и т.п. Указанные композиции разработаны в соответствии со стандартными способами, описанными, например, в справочнике Remington. The Science and Practice ofPharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, в котором представлены технологии приготовления композиций, известные специалистам в данной области. В композиции настоящего изобретения предпочтительно представлено "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела настоящего изобретения."Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивида, и от способности антитела или фрагмента антитела индуцировать необходимый ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезные эффекты превосходят любой токсичный или негативный эффект антитела. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу вводят субъекту до заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества. Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой,по меньшей мере, минимальную дозу, но которая меньше токсичной дозы, активного агента, которая необходима для оказания терапевтически благоприятного эффекта у субъекта. Иными словами, терапевтически эффективное количество антитела изобретения представляет собой количество, которое у животного, предпочтительно человека, увеличивает мышечную массу, увеличивает плотность кости или лечит патологическое состояние, при котором присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или при котором уменьшение уровня миостатина имеет благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека, причем состояние включает, но не ограничивается перечисленным, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургию,восстановление поврежденных мышц, слабость, возрастную саркопению, дисфункциональную атрофию,остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, ожирение, дистрофию мышц любого типа, тяжелую форму миопатии, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ либо обусловленную ХОЗЛ (COPD), почечной недостаточностью, печеночной недостаточностью, сердечной недостаточностью или заболеванием сердца), метаболический синдром и диабет II типа. Дисфункциональная атрофия может быть обусловлена различными причинами или инцидентами, в том числе любым нарушением или заболеванием либо состоянием, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию либо постельному режиму, включающим,но не ограниченным перечисленным, пересадку солидного органа, замену сустава, удар, повреждение спинного мозга, восстановление после серьезных ожогов, малоподвижность при хроническом гемодиализе, восстановление после сепсиса и воздействие микрогравитации. Способом введения антитела настоящего изобретения является парентеральный способ. Предпочтительно антитела настоящего изобретения могут быть включены в фармацевтическую композицию,подходящую для парентерального введения. Используемый в данной заявке термин "парентеральный" включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Предпочтительна доставка в периферическую систему путем внутривенной или внутрибрюшинной либо подкожной инъекции Подходящие наполнители для таких инъекций широко известны в данной области. Композиция в большинстве случаев должна быть стерильной и стабильной при условиях производства и хранения в предусмотренном контейнере, включающем, например, герметизированный флакон или шприц. Следовательно, композиции можно стерилизовать путем фильтрования после получения композиции или иным способом сделать их микробиологически приемлемыми. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем 20-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу(например, 1-1000 мг) антитела. Доза может варьировать в зависимости от типа и тяжести заболевания. Как хорошо известно, в области медицины дозы для конкретного субъекта зависят от многих факторов, в том числе от габаритов пациента, площади поверхности тела, возраста, конкретного соединения, предназначенного для введения, пола, периода и способа введения, общего состояния здоровья и других лекарственных средств, которые параллельно вводят пациенту. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 1-1000 мг, однако также предусмотрены дозы, меньшие или превышающие указанный диапазон, особенно с учетом рассмотренных выше факторов. Типичный режим дозирования может представлять собой ежедневное, еженедельное введение, введение два раза в неделю или ежемесячное введение. Типичный режим дозирования при парентеральном введении может составлять примерно от 10 до примерно 20 мг/кг общей массы тела, предпочтительно от примерно 20 до примерно 10 мг/кг. Прогрессирование заболевания можно наблюдать путем периодической оценки. При многократном введении, в зависимости от конкретного патологического состояния, лечение можно повторять до тех пор, пока не будет- 12015916 наблюдаться подавление симптомов заболевания или необходимое предотвращение появления симптомов заболевания. Однако можно применять и другие режимы дозирования, и их не исключает настоящее изобретение. Предложенные количества антитела подвергаются тщательному рассмотрению врачом. Ключевым фактором при выборе подходящей дозы и графика лечения является достигаемый результат. Факторы,рассматриваемые в таком контексте, включают конкретное нарушение, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину нарушения, область доставки антитела, конкретный тип антитела, способ введения, график введения и другие факторы, известные врачу-практику. Терапевтические агенты настоящего изобретения могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем стерильном носителе перед применением. Лиофилизация и восстановление могут приводить к потере активности антитела в различной степени. Для ее компенсации дозировки могут быть скорректированы. Как правило, предпочтительным является pH между 6 и 8. Предметы производства. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен предмет производства, содержащий вещества, применимые для лечения или предотвращения нарушений или патологических состояний,описанных выше. Предмет производства включает контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию настоящего изобретения, которая эффективна для предотвращения или лечения заболевания или патологического состояния, и может иметь отверстие, обеспечивающее сохранение стерильности (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Активный агент в композиции представляет собой антитело к миостатину согласно настоящему изобретению. Этикетка, прикрепленная к контейнеру или прилагаемая к нему, указывает, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Предмет производства может также включать второй контейнер, содержащий фармацевтический приемлемый буфер, например, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Предмет производства может также включать другие вещества, желательные с точки зрения производителя и потребителя, в том числе,другие буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и листовку-вкладыш, содержащую инструкции по применению. Следующие примеры представлены лишь в качестве иллюстрации и никоим образом не ограничивают область настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Идентификация сайта расщепления в MAT C12 и 510C2. Растворы антител в 1 мг/мл различных буферов (10 мМ цитрат, pH 5, 10 мМ цитрат, pH 6, 10 мМ цитрат, pH 7, и 10 мМ цитрат/150 мМ NaCl, pH 7) инкубировали при различных температурах (-20, 4, 25 и 40C) в течение 4 недель. После инкубации образцы анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Для антител, содержащих вариабельный домен C12 или 510C2 (различных Fc-изотипов), наблюдали дополнительные полосы, помимо полос ожидаемого размера для тяжелых и легких цепей антитела. Эти полосы наблюдали только для образцов, инкубированных приpH 7 (с добавлением или без NaCl); при восстанавливающих условиях получали две полосы с наблюдаемой массой 8-10 и 12-14 кДа, а при невосстанавливающих условиях наблюдали одну полосу с наблюдаемой массой 8-10 кДа. Оказалось, что степень расщепления, которую определяли по относительной интенсивности этих полос, зависела от pH (поскольку полосы были менее интенсивными в образцах,которые инкубировали при pH 6, и не были заметны в образцах, которые инкубировали при pH 5) и зависела от температуры. Для определения сайта расщепления и для количественной оценки степени расщепления указанные растворы антител дополнительно анализировали путем жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) и N-концевого секвенирования. Анализ образцов путем ЖХ/МС проводили следующим образом. Для частичного расщепления антител 4 мкл каждого образца смешивали с 36 мкл воды. Затем 15 мкл каждого раствора смешивали с 0,5 мкл 3 М трис-HCl буфера, pH 8,0, и 0,5 мкл 50 мг/мл DTT и 45 мкл воды. Оба раствора каждого образца анализировали путем ЖХ/МС. Для дегликозилирования антитела 3 мкл каждого образца смешивали с 60 мкл воды, 1,0 мкл 3 М трис-HCl буфера, pH 8,0, и 1,0 мкл раствора N-гликозидазы PNGase F(PROZYME 1 ед./мл). Растворы инкубировали при 37C в течение 6 ч и затем анализировали путем ЖХ/МС. Для полного гидролиза с помощью трипсина 20 мкл каждого образца лиофилизировали досуха в системе центрифугирования в вакууме и затем восстанавливали в 4,5 мкл раствора 7 М гуанидина-HCl,0,4 М трис-HCl буфера, pH 8,0, и 0,5 мкл 50 мг/мл DTT. Растворы инкубировали при 37C в течение 40 мин и затем разбавляли 95 мкл воды. Каждый раствор обрабатывали 2,0 мкл 0,5 мг/мл свиного трипсина при 37C в течение 3 ч. Растворы подкисляли уксусной кислотой и затем анализировали путем ЖХ/МС или ЖХ/МС/МС. Интактные, частично расщепленные и дегликозилированные образцы анализировали с использованием Waters HPLC/LCT premier или микромасс-спектрометра Q-TOF. Параметры ВЭЖХ и- 13015916 масс-спектрометра устанавливали в зависимости от анализируемых образцов и согласно техническим требованиям. Обращенные масс-спектры для антитела C12, инкубированного при pH 7 и 40C в течение четырех недель, характеризовались двумя пиками, соответствующими массам 134894 и 145116 Да. Различие этих значений по массе составляет примерно 10220 Да, что соответствует ожидаемой остаточной массе Nконцевого пептида 1-93 (ожидаемое значение: 10221,4 Да) легкой цепи. Этот результат подтверждается анализом путем ЖХ/МС частично расщепленных образцов. В таком образце наблюдали три значения массы: 23312,7, 13091,3 и 10239,4 Да, соответствующие интактной легкой цепи 1-219 (ожидаемое значение: 23313,1 Да), C-концевому пептиду 94-219 (ожидаемое значение: 13091,6 Да) и N-концевому пептиду 1-93 (ожидаемое значение: 10239,4 Да) легкой цепи. По существу, идентичные результаты были получены и для антитела 510C2, хотя относительное количество продуктов расщепления для этого антитела было ниже. В таблице представлен процент расщепления легкой цепи, определенный при анализе образцов с частичным расщеплением. Для исследования инкубированных образцов также применяли N-концевое секвенирование. Образцы анализировали путем автоматизированного расщепления белков по Эдману с нанесением проб на кассету PROSORB с помощью способа Applied Biosystem Inc. (ABI) с использованием газовой фазы(GP-PVDF). Каждый остаток анализировали на колонке sphere-5 PTH 2202,1 мм ABI BROWNLEE при 55C со скоростью потока 325 мкл/мин. Данные анализировали с использованием программы для анализа данных ABI's Model 610A. Для образцов антитела, инкубированных при 40C, были выявлены две последовательности: выявленные последовательности для C12 - последовательность "DIQMTQ" (SEQ IDID NO:35), соответствующая остаткам 94-99 легкой цепи C12. Аналогичные результаты были получены при анализе инкубированных растворов антитела 510C2. Степень расщепления рассчитывали с использованием относительных величин для каждой последовательности, полученные результаты сведены в таблице. Степень расщепления по пептидной связи Asn93-Pro94 Пример 2. Удаление сайта химического расщепления в антителах C12 и 510C2. Для удаления сайта расщепления в C12 и 510C2 использовали одну аминокислотную замену каждой отдельной аминокислоты для замены остатка аспарагина в CDRL3 обоих моноклональных антител. Для определения эффекта отдельной аминокислотной замены на сродство к миостатину, по сравнению сFab-фрагментами C12 или 510C2, использовали твердофазный ИФА. На планшеты для ИФА наносили миостатин, разбавленный до 4 мкг/мл в карбонатном буфере (50 мМ NaHCO3, pH 8,3), и в каждую лунку добавляли по 50 мкл. Планшеты закрывали герметизирующей лентой и инкубировали в течение ночи при 4C. Затем планшеты (планшеты с выпуклым (U) дномGreiner, Cat 650061) промывали три раза ФСБ-Т (PBS-T) (0,1% Твин-20) с помощью автоматического устройства для отмывки планшетов. К каждой лунке добавляли 200 мкл блокирующего буфера (ФСБ + 1% БСА + 0,1% Твин-20) и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли 50 мкл образца. Образцы включали periprep Fab-фрагменты, разбавленные ФСБТ/БСА при начальном разведении 1:3 и с серией последующих полу-log разведений. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора вторичного антитела (1:2000 козьих античеловеческих-каппа-ЩФ антител, Southern Biotech Cat 2060-04 в ФСБТ/БСА). После дополнительной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата для ЩФ (щелочной фосфатазы) и инкубировали при комнатной температуре примерно 10 мин. Оптическую плотность (или OD) определяли при 560 нм. В качестве стандартов для определения сродства каждый планшет для ИФА содержал C12 или 510C2. Концентрацию Fab-фрагментов определяли количественным твердофазным ИФА с использованием антитела к Fd (овечьего антитела к Fd, Biodesign) для "захвата" белка и козьего античеловеческогокаппа-ЩФ антитела (Southern Biotech) для детекции. Очищенный стандарт Fab включали в анализ каждого планшета для создания стандартной кривой для определения концентрации. Модифицированные Fab-фрагменты, полученные от C12 и 510C2, в которых остаток Asn в CDRL3 заменен H или R в С 12, или H, S, T или A в 510C2, сохраняли сродство к миостатину, схожее с таковым для родительского Fab, как было определено путем ИФА. Для каждого из таких вариантов с заменой наблюдали при ИФА кривые, схожие с соответствующим родительским контрольным Fab, как было определено путем определения оптической плотности при аналогичных параметрах и аналогичной концентрации Fab (см. фиг. 4). Тем не менее, при замене остатка аспарагина в CDRL3 на валин, пролин, глицин,глутамин, триптофан, тирозин, цистеин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, треонин, серин,- 14015916 лизин, аланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту в C12, или аргинин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин, триптофан или пролин в 510C2, каждая из таких замен снижала сродство модифицированных Fab-фрагментов к миостатину, по сравнению со значением сродства родительского Fab. Кроме того, попытки модификации остатка Pro в дипептиде Asn-Pro не были успешными, поскольку любая замена снижала сродство связывания модифицированных Fab-фрагментов с миостатином, по сравнению со значением сродства родительского Fab. Пример 3. Сравнение характера расщепления антитела C12 и варианта LC-N93H. Растворы антител в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ фосфате, pH 7,4/150 мМ NaCl, инкубировали при различных температурах (4, 25 и 40C) в течение 4 недель. После инкубации образцы анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и N-концевого секвенирования, как описано выше. При этих условиях при анализе путем ДСН-ПААГ (SDS-PAGE) для образца антитела С 12, инкубированного при 40C, наблюдали дополнительные полосы, помимо ожидаемых полос для тяжелой и легкой цепей антитела; при этом наблюдаемые полосы соответствовали 8 кДа при невосстанавливающих условиях и 8 кДа и 14 кДа при восстанавливающих условиях. В противоположность этому, для варианта LC-N93H не было обнаружено дополнительных полос. N-концевое секвенирование инкубированных образцов подтвердило, что в образце антитела C12 происходит расщепление междуAsn93 и Pro94 легкой цепи, при этом новому N-концу соответствует 10-20% последовательности(PLTFGG (SEQ ID NO:35, тогда как для варианта LC-N93H не было обнаружено дополнительной последовательности легкой цепи, помимо ожидаемой N-концевой последовательности. Пример 4. Репортерный анализ в системе миостатин/SBE. В данной репортерной системе анализа с плазмиды, кодирующей ген люциферазы, расположенный в направлении 5'-3' от SMAD-связывающего элемента, (система "SBE-люцифераза"), а именно (CAGA)12,экспрессируется белок люцифераза в том случае, если происходит связывание молекулы, например, миостатина, GDF-11 или другого представителя семейства TGF-, с ее собственным рецептором, что приводит к активации сиганального пути через SMAD, приводящего к фосфорилированию комплекса SMAD,способного связываться с SBE. Последовательность CAGA представляет собой TGFчувствительную последовательность в промоторе гена PAI-1, индуцируемого TGF- (Denner et al., EMBO J., 17:30913100, 1998). Для конструирования плазмиды последовательность, содержащую повтор SBE клонировали по сайтам NheI-HindIII основного вектора pGL3 (Promega E1751). Эту плазмиду использовали для транзиентной трансфекции клеток HEK293 EBNA. Количество выявляемого света пропорционально количеству образующейся люциферазы, которое,в свою очередь, пропорционально количеству миостатина, воздействующего на клетки. Присутствие ингибитора (например, антитела, связывающего миостатин) уменьшает количество миостатина, способного активировать SBE, что в конечном счете приводит к снижению видимого свечения. В этой системе анализа клетки HEK293 EBNA (Edge Biosystems) в среде DMEM/F12 (3:1) (Gibco 930152DK), 10% FBS (ЭБС), 20 мМ Hepes, 4 мМ L-глутамин ("полная среда") высевали приблизительно в количестве 25000 клеток на лунку в покрытые полилизином лунки 96-луночного планшета (BD Biocoat 35-4461) и инкубировали в течение ночи при 37C. На следующий день клетки промывали ФСБ и в каждую лунку добавляли 50 мкл OptiMEM I (Gibco 31985-070). Клетки трансфицировали с использованием 50 мкл следующей смеси, содержащей ДНК SBE-люциферазы: 80 мкл липофектамина (Gibco 11668-019) с 1,5 мл OptiMEM и оставляли на 5 мин, затем добавляли в пробирку, содержащую 20 мкг ДНК SBEлюциферазы с 1,5 мл OptiMEM и 200 мкл реагента Plus (Invitrogen), смешивали и оставляли на 5 мин. После объединения двух смесей раствор интенсивно перемешивали и оставляли на 30 мин, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл такого раствора ("трансфекционная среда"). После этого клетки инкубировали в течение ночи при 37C в 5% CO2. Для каждого планшета с клетками миостатин (RD Systems 788-G8) разбавляли до 20 нг/мл в полной среде. Для каждого антитела настоящего изобретения, предназначенного для анализа, готовили титр в полной среде, например, от примерно 40 мкг/мл до примерно 50 нг/мл. Трансфекционную среду удаляли из лунок и добавляли 50 мкл разбавленных антител на лунку и 50 мкл GDF-8 (миостатин) или GDF-11 (RD Systems) на лунку. Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи при 37C в 5% CO2. На следующий день среду аспирировали, клетки промывали ФСБ и добавляли 75 мкл буфера для лизиса (Promega E266A). Активность люциферазы в клеточном лизате измеряли с помощью реагента для люциферазы (Luciferase Reagent) согласно инструкциям изготовителя(Promega E2620). Строили график зависимости значений люминесценции от Log10 концентрации MAT- 15015916 При анализе в данной системе с миостатином MAT C12 и модифицированное моноклональное антитело C12 (C12-N93H) демонстрировали значения IC50 примерно 9,59 нМ и 7,03 нМ соответственно. Ни антитело С 12, ни C12-N93H не демонстрировали нейтрализующей активности в данной системе при использовании в анализе GDF-11 вместо миостатина, что указывает на то, что модифицированное антитело, как и его родительское антитело, предпочтительно связывается с миостатином, но не с GDF-11. Список последовательностей