Тканезащитные пептиды и их применения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Настоящее изобретение относится к новым тканезащитным пептидам. Тканезащитные пептиды согласно изобретению могут связываться с тканезащитным рецепторным комплексом. В частности,настоящее изобретение относится к тканезащитным пептидам, полученным из частей лигандов рецепторов цитокинов, включая эритропоэтин (ЕРО), или имеющим с ними общие консенсусные последовательности, при этом такие части не вовлечены в связывание лиганда с рецепторным комплексом, например с гомодимером рецептора ЕРО. Соответственно, тканезащитные пептиды согласно изобретению получают из аминокислотных последовательностей областей лигандов рецепторов цитокинов, которые обычно расположены в области белка лиганда, которая находится на противоположной стороне от рецепторного комплекса, т.е. обычно получают из аминокислотных последовательностей областей белка лиганда, которые повернуты в другую сторону от рецепторного комплекса в то время, когда лиганд связан с рецептором. Кроме того,изобретение относится к консенсусным последовательностям для применения в конструировании синтетического тканезащитного пептида. Указанные тканезащитные пептиды также включают фрагменты, химеры, а также пептиды, сконструированные для имитации пространственной локализации ключевых аминокислотных остатков в лигандах тканезащитных рецепторов,например ЕРО. В объем изобретения также входят способы лечения или профилактики заболевания или расстройства с использованием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. Изобретение также охватывает способы усиления функции возбудимой ткани с использованием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. 015672 1. Введение Настоящее изобретение относится к новым тканезащитным пептидам. Тканезащитные пептиды согласно изобретению могут связываться с тканезащитным рецепторным комплексом. В частности, настоящее изобретение относится к тканезащитным пептидам, полученным из частей лигандов рецепторов цитокинов, включая эритропоэтин (ЕРО), или имеющим с ними общие консенсусные последовательности, при этом такие части не вовлечены в связывание лиганда с рецепторным комплексом, например с гомодимером рецептора ЕРО. Соответственно, тканезащитные пептиды согласно изобретению получают из аминокислотных последовательностей областей лигандов рецепторов цитокинов, которые обычно расположены в области белка лиганда, которая находится на противоположной стороне от рецепторного комплекса, т.е. получают из аминокислотных последовательностей областей белка лиганда, которые повернуты в другую сторону от рецепторного комплекса в то время, когда лиганд связан с рецептором. Кроме того, изобретение относится к консенсусным последовательностям для применения в конструировании синтетического тканезащитного пептида. Указанные тканезащитные пептиды также включают в себя фрагменты, химеры, а также пептиды, сконструированные для имитации пространственной локализации ключевых аминокислотных остатков в лигандах тканезащитных рецепторов, например ЕРО. В объем изобретения также входят способы лечения, профилактики или улучшения состояния при заболевании или расстройстве и/или способы лечения, регенерации или уменьшения повреждения ткани с использованием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. Изобретение также охватывает способы усиления функции возбудимой ткани с использованием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. 2. Уровень техники Эритропоэтин ("ЕРО") является гликопротеидным гормоном, который обычно связывают с поддержанием гематокрита, а в последнее время - с защитой тканей. Зрелый белок ЕРО человека содержит 165 аминокислот и имеет молекулярную массу 34 кД, при этом гликозильные остатки составляют около 40 мас.% молекулы. Молекула ЕРО содержит четыре спирали, которые взаимодействуют посредством своих гидрофобных доменов с образованием преимущественно глобулярной структуры в водном окружении (Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Изобретение осуществлено на основании открытия того, что некоторые аминокислоты, направленные в сторону водной оболочки (т.е. в сторону от гидрофобного центрального ядра глобулы), опосредуют защиту ткани. Пептиды могут быть получены или сконструированы на основании сведений о тканезащитных областях, которые были идентифицированы заявителями. Как указано выше, ЕРО является плюрипотентным. При осуществлении своей гормональной функции ЕРО регулирует гематокрит благодаря той роли, которую он играет в созревании эритроидных клеток-предшественников в эритроциты. ЕРО действует в качестве противоапоптозного агента в ходе процесса созревания эритроидных клеток-предшественников, обеспечивая возможность созревания клетокпредшественников в эритроциты. Пониженные уровни кислорода в тканях (гипоксия) запускают повышенную продукцию эритропоэтина почками, что приводит к усилению эритропоэза. Поскольку почки в норме продуцируют большую часть эритропоэтина сыворотки, нарушение функции почек, такое как хроническая почечная недостаточность, приводит к пониженной продукции ЕРО и часто приводит к анемии. Подобным образом, анемия может возникать в результате других хронических состояний, таких как злокачественная опухоль, или способов лечения, связанных с такими заболеваниями, например, в результате химиотерапии, которая непосредственно подавляет продукцию ЕРО. Имеется коммерчески доступный рекомбинантный эритропоэтин торговых марок PROCRIT, доступный из Ortho Biotech. Inc.,Raritan, NJ, и EPOGEN, доступный из Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, и такой эритропоэтин использовали для лечения анемии, возникающей на конечной стадии заболевания почек, в результате лечения AZT(зидовудином) ВИЧ-инфицированных пациентов, онкологических больных и в результате химиотерапии. В настоящее время имеется гипергликозилированный эритропоэтин, ARANESP (Amgen, ThousandOaks, CA), для лечения анемии. Кроме того, указанные соединения использовали для повышения гематокрита у пациентов, подвергаемых хирургическим операциям, чтобы уменьшить потребность в переливаниях аллогенной крови. Недавно полученные данные показали, что ЕРО также функционирует локально паракриноаутокринным путем, минимизируя повреждение ткани. Например, ЕРО улучшает микроокружение клеток при гипоксии и снижает запрограммированную гибель клеток, вызванную метаболическим стрессом. Обе указанные активности частично опосредованы взаимодействием ЕРО со специфическим рецептором клеточной поверхности, в состав которого входит белок рецептора эритропоэтина ("EPOR"). EPOR является белком с молекулярной массой около 66 кД и является представителем семейства рецепторов цитокинов типа 1. Данное семейство включает в себя рецепторы, которые сгруппированы вместе на основе общей гомологии их внеклеточных доменов, и включает рецепторы интерлейкина IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), ингибирующего лейкоз фактора (LIF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), тромбопоэтина, гормона роста и пролактина. Консервативный внеклеточный домен указанных рецепторов имеет длину примерно 200 аминокислот, содержит четыре кон-1 015672 сервативных по своему положению остатка цистеина в аминоконцевой области (Cys 294, Cys 283,Cys 248 и Cys 238, которые, по-видимому, важны для поддержания и структурной целостности рецепторов (Murray, 1996, Harpers Biochemistry, 24th ed. p. 524-526, Appilion and Lange, Ltd.; Caravella et al., 1996,Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме и мотив Trp-Ser-X-Trp-Ser (SEQ ID NO:58), расположенный вблизи трансмембранного домена. В связи с эритропоэзом EPOR функционирует подобно другим рецепторам в семействе рецепторов цитокинов типа 1. Во-первых, лиганд рецептора, например ЕРО, связывается с предварительно образуемым димером EPOR, (EPOR)2. Было определено, что ЕРО взаимодействует с внеклеточным доменом классического гомодимерного рецептора (EPOR)2 посредством двух отдельных областей на поверхности лиганда: высокоаффинный участок связывания с рецептором (участок 1) и низкоаффинный участок связывания с рецептором (участок 2). Аминокислотные последовательности ЕРО, связанные с участком ,1 представляют собой последовательность TKVNFY, SEQ ID NO:2, соответствующую аминокислотам 4449 в SEQ ID NO:1, и последовательность SNFLRG, SEQ ID NO:3, соответствующую аминокислотам 146-151 в SEQ ID NO:1; последовательности, связанные с участком 2, представляют собой последовательность VLERY, SEQ ID NO:4, соответствующую аминокислотам 11-15 в SEQ ID NO:1, и SGLRS,SEQ ID NO:5, соответствующую аминокислотам 100-104 в SEQ ID NO:1 (Cheetham et al., 1998, NatureStructural Biology, 5:861-866, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Активация гомодимера EPOR приводит к фосфорилированию тирозина сигнальных белков, которые связаны с EPOR, например тирозинкиназ Jak2, которые, в свою очередь, могут активировать несколько разных путей, включая, например, путь киназы фосфатидилинозитола (PI) 3, путь Ras/MAP-киназы и/или путь STAT. Указанные пути запускают противоапоптозные функции, необходимые для эритропоэза, которые опосредованы эритропоэтином (Kirito et al., 2002, Blood. 99:102-110; Livnah et al., 1999, Science. 283:987-990; Naranda et al., 2002, Endocrinology. 143:2293-2302; Remy et al., 1999, Science. 283:990-993 иYoshimura et al., 1996, The Oncologist. 1:337-339, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Недавно авторы изобретения обнаружили, что тканезащитные свойства ЕРО опосредованы рецептором, который содержит не только EPOR, но также другой белок рецептора, общий рецептор бета("с"). Рецептор EPOR/c в отличие от гомодимера (EPOR)2 является гетерокомплексом (см. ниже) и,как известно, играет роль в защите возбудимых тканей. См., например, WO 2004/096148 и РСТPCT/US01/49479, поданную 28 декабря 2001 г., заявку на выдачу патента США 09/753132, поданную 29 декабря 2000 г., и заявку 10/188905, поданную 3 июля 2002 г., каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Хотя авторы изобретения установили, что с-рецептор является центральным рецептором путей тканевой защиты таких возбудимых тканей, структура активирующих лигандов для рецепторов еще неизвестна. 3. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к изолированным полипептидам, которые обладают по меньшей мере одной защищающей клетки активностью в отношении чувствительной клетки, ткани или органа, и такие полипептиды содержат аминокислотные мотивы, включающие в себя консенсусную последовательность (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (b) H1-N1-(X)n-N2-L1, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (с) L1-N1-(X)n-N2-H1, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (d) H1-N1-(L)n-P1-H2, где n равно 0 или 1; или(e) H1-P1-(L)n-N1-H2, где n равно 0 или 1, и где H1 и Н 2 означают гидрофобные аминокислоты, N1 и N2 означают отрицательно заряженные аминокислоты, X означает любую аминокислоту, L1 означает полярную аминокислоту и Р 1 означает положительно заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах пептиды согласно изобретению также не обладают эритропоэтической активностью, например не повышают содержание гемоглобина или гематокрит у реципиента. В следующих вариантах изолированные полипептиды согласно изобретению состоят не более чем из 10, не более чем из 15, не более чем из 20 или не более чем из 30 аминокислот. В других вариантах изолированный пептид обладает менее чем 90%,менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%,менее чем 55%, менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30% или менее чем 20%-ной идентичностью последовательности с любой частью аминокислотной последовательности зрелого эритропоэтина ("ЕРО") человека, указанной в SEQ ID NO:1, при этом указанная часть ЕРО содержит такое же количество аминокислотных остатков, что и указанный пептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных выше, в которых изолированный полипептид содержит структурный мотив (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5 (указанный последовательностями с идентификационными номерами 6-11 соответственно, которые обсуждаются ниже); (b) H1-N1-(L)n-P1-H2, где n равно 0 или 1 (указанный последовательностями с идентификационными номерами 24-25 соответственно, которые обсуждаются ниже); или (е) H1-P1-(L)n-N1-H2, где n равно 0 или 1 (указанный последовательностями с идентификационными номерами 26-27 соответственно, которые обсуждаются ниже), H1 и Н 2 могут быть одной и той же гидрофобной аминокислотой. В других вариантах осуществления изобретения, описанных выше, в которых изолированный полипептид содержит-2 015672 структурные мотивы (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (d) H1-N1-(L)n-P1-H2, где n равно 0 или 1; или (е) H1-P1-(L)n-N1-H2, где n равно 0 или 1, H1 и Н 2 могут представлять собой разные гидрофобные аминокислоты. В других вариантах изобретение относится к изолированному полипептиду, содержащему аминокислотный мотив (а) H1N1-(X)n-N2-H2, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (b) H1-N1-(X)n-N2L1, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; (с) L1-N1-(X) n-N2-H1, где n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и где N1 и N2 могут означать одну и ту же или разные отрицательно заряженные аминокислоты. Изобретение относится к изолированным полипептидам, содержащим аминокислотные мотивы,описанные выше, при этом указанные мотивы образованы следующими друг за другом аминокислотами в аминокислотной последовательности указанного полипептида. В конкретных примерах согласно данному варианту изобретение относится к изолированному полипептиду, содержащему аминокислотный мотивN1 и N2 означают отрицательно заряженные аминокислоты;L1 означает полярную аминокислоту; Р 1 означает положительно заряженную аминокислоту. В некоторых аспектах, соответствующих данному варианту, в которых изолированный полипептид содержит мотив, имеющий аминокислотные остатки H1 и Н 2, H1 и Н 2 могут быть одинаковыми или могут быть разными гидрофобными аминокислотами. В других аспектах, соответствующих данному варианту,в которых изолированный полипептид содержит мотив, имеющий аминокислотные остатки N1 и N2, N1 иN2 могут быть одинаковыми или могут быть разными отрицательно заряженными аминокислотами. В других вариантах осуществления изобретение относится к изолированным полипептидам, в которых аминокислотный мотив образован благодаря пространственной организации аминокислот в третичной структуре полипептида, т.е. аминокислоты, образующие мотив, пространственно близки друг другу в трехмерной структуре, т.е. в третичной структуре, полипептида, но могут быть разделены одной или несколькими аминокислотами в первичной аминокислотной последовательности полипептидной цепи. В конкретном примере согласно данному варианту аминокислотный мотив, содержащий аминокислотные остатки H1, N1, N2 и Н 2, аналогичный последовательности SEQ ID NO:6, обсуждаемой выше, может образоваться в результате формирования третичной структуры, принимаемой, например, благодаря белковой укладке пептидов, содержащих, например, последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, в которых аминокислотные остатки между N1 и N2, например (Х)n, подвергаются укладке таким образом, что N1 и N2 становятся линейно близкими. Соответственно, изобретение охватывает изолированные пептиды, содержащие аминокислотный мотивH1N1N2H2; H1N1N2L1; L1N1N2H1; H1N1(L)nP1H2, где n равно 0 или 1; или H1P1(L)nN1H2, где n равно 0 или 1,и указанные мотивы образуются в результате формирования третичной структуры указанного полипептида. В родственных вариантах, в которых аминокислотный мотив содержит N1 и N2, третичные структуры образуются так, что расстояние между карбонильными атомами углерода N1 и N2 составляет примерно от 3 до 5 , предпочтительно примерно от 4 до 5 и более предпочтительно примерно от 4,4 до 4,8 . В других вариантах осуществления, в которых аминокислотный мотив содержит N1 и N2, третичные структуры образуются так, что расстояние между N1 и N2 пространственно ограничено, так что расстояние, разделяющее заряды, например заряженные боковые цепи двух аминокислот, составляет примерно от 6,5 до 9 . В родственном варианте N1 и N2 соответственно пространственно ограничены в результате того, что они находятся в аминокислотной последовательности, которая образует всю или часть альфа-спирали, и могут быть разделены 1, 2 или более чем 2 аминокислотами в последовательности указанных аминокислот, образующей указанную спираль. В других родственных вариантах, в которых аминокислотный мотив содержит N1 и P1, третичные структуры образуются так, что расстояние между карбонильными атомами углерода N1 и Р 1 составляет примерно от 3 до 5 , предпочтительно примерно от 4 до 5 и более предпочтительно примерно от 4,4 до 4,8 . В других вариантах, в которых аминокислотный мотив содержит N1 и P1, третичные структуры образуются так, что расстояние между N1 и P1 пространственно ограничено, так что расстояние, разделяющее заряды, например заряженные боковые цепи-3 015672 двух аминокислот, составляет примерно от 6,5 до 9 . В родственном варианте N1 и Р 1 пространственно ограничены в результате того, что они находятся в аминокислотной последовательности, которая образует всю или часть -спирали, и могут быть разделены 1, 2, или более чем 2 аминокислотами в последовательности указанных аминокислот, образующих указанную спираль. В некоторых вариантах аминокислоты, образующие мотив в третичной структуре указанного полипептида, отделены друг от друга одинаковым количеством промежуточных аминокислотных остатков в линейной аминокислотной последовательности указанного полипептида. В других вариантах аминокислоты, образующие мотив в третичной структуре указанного полипептида, отделены друг от друга разным количеством промежуточных аминокислотных остатков в линейной аминокислотной последовательности указанного полипептида. В некоторых вариантах изолированный полипептид согласно изобретению образует регулярную третичную структуру, например -спираль или -складчатый слой, так что поверхность указанной структуры представлена аминокислотами, составляющими указанный мотив, и таким образом мотив как таковой направлен к границе раздела структуры белка и водного окружения, т.е. представлена мотивом на поверхности подвергнутого укладке полипептида. В предпочтительных вариантах третичные структуры полипептидов согласно изобретению образуются в водной среде в физиологических условиях, например вPBS (13 мМ NaH2PO4, 137 мМ NaCl, pH 7,4) при 37 С. В конкретных вариантах изобретение относится к изолированным полипептидам, содержащим аминокислотные мотивы, описанные выше, например пептид A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, SEQ ID NO:32); пептид С (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, SEQ ID NO:29); пептид D (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ ID NO:30); пептид Е (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31); пептид F (RYLLUNITTGC, SEQ ID NO:33); пептид G (QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40); пептид I (CSLNENIQEQLERALNSS, SEQ ID NO:43); пептид J (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO:41); пептид K (WEHVNAIQEARRLL, SEQ ID NO:35) или пептид L (KIRSDLTALTESYVKH, SEQ ID NO:37). В некоторых вариантах изобретение относится к изолированным полипептидам, содержащим 1 или более, 2 или более, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 6 или более или более чем 6 аминокислотных мотивов, описанных в данной публикации. В конкретных аспектах изобретения в соответствии с данным вариантом, в которых изолированный полипептид содержит по меньшей мере два аминокислотных мотива, описанных выше, указанные по меньшей мере два мотива могут быть одинаковыми мотивами или могут быть разными мотивами. В некоторых аспектах изобретение относится к изолированным полипептидам, не обладающим эритропоэтической активностью, например не увеличивающим уровень гемоглобина у реципиента. Предпочтительно изолированные полипептиды не обладают другими активностями, включая без ограничения вазоактивное действие (например, сужение кровеносных сосудов), гиперактивацию тромбоцитов, прокоагулянтные активности и стимуляцию пролиферации и/или продукции тромбоцитов и/или зависимых от эритропоэза клеток (см. Coleman et al., 2006, PNAS, 103:5965-5970, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). В других аспектах изобретение относится к изолированным полипептидам, которые обладают по меньшей мере одной защитной в отношении клеток активностью. Такая защитная в отношении клеток активность включает без ограничения защиту, сохранение,усиление или восстановление функции или жизнеспособности чувствительной клетки, ткани или органа млекопитающего. Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению изолированного полипептида, охарактеризованного в данном описании, для получения фармацевтических композиций для защиты, сохранения, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток, тканей или органов млекопитающих. В родственных вариантах композиции предназначены для введения нуждающемуся в таком введении субъекту. В предпочтительных вариантах указанным субъектом является млекопитающее и предпочтительно человек. В других аспектах настоящее изобретение относится к применению изолированного полипептида,охарактеризованного в данном описании, для получения фармацевтической композиции для защиты и/или предотвращения повреждения чувствительной ткани, для восстановления или для обновления чувствительной ткани и/или чувствительной функции ткани у нуждающегося в этом субъекта. В одном конкретном аспекте чувствительные клетки млекопитающих и связанные с ними клетки, ткани или органы являются дистальными в отношении сосудистой сети из-за плотного барьера, состоящего из эндотелиальных клеток. В другом конкретном аспекте клетки, ткани, органы или другие части тела выделены от организма млекопитающего, например предназначены для трансплантации. В качестве не ограничивающих примеров чувствительная клетка или ткань может представлять собой нейронную клетку или ткань,клетку или ткань глаза (например, сетчатки), жировую, соединительную, клетку или ткань волоса, зубов,слизистой оболочки, поджелудочной железы, эндокринную, уха, эпителиальную, кожи, мышц, сердца,-4 015672 легкого, печени, почки, кишечника, надпочечника (например, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников), капилляров, эндотелия, семенников, яичника, костей, кожи или эндометрия. Кроме того,не ограничивающие примеры чувствительных клеток включают фоторецепторы (палочки и колбочки),клетки нервного узла, биполярные, горизонтальные, амакринные, Мюллеровские, Пуркинье, миокарда,водителя ритма, синусно-предсердного узла, синусового узла, соединительной ткани, атриовентрикулярного узла, пучка Гиса, гепатоциты, звездчатые, Купфера, мезангиальные, эпителиальные клетки почек,тубулярные интерстициальные, бокаловидные, кишечных крипт, эндокринные клетки кишечника, клетки клубочковой зоны, клетки пучковой зоны, ретикулярные, хромаффинные, перициты, Лейдига, Сертоли,сперматозоиды, Граафовых пузырьков, примордиальных фолликулов, островков Лангерганса, -клетки,-клетки, -клетки, F-клетки, остеогенные клетки-предшественники, остеокласты, остеобласты, стромы эндометрия, эндометриальные, стволовые и эндотелиальные клетки. Указанные примеры чувствительных клеток являются только иллюстративными. В одном аспекте чувствительные клетки или связанные с ними клетки, ткани или органы представляют собой возбудимые клетки, ткани или органы или преимущественно включают возбудимые клетки или ткани. В некоторых аспектах изобретения возбудимой тканью является ткань центральной нервной системы, ткань периферической нервной системы, ткань сердца или ткань сетчатки. В другом аспекте чувствительная клетка или связанные с ней клетки, ткани или органы являются невозбудимыми клетками, тканями или органами либо они преимущественно не содержат возбудимых клеток или тканей. Эритропоэтическая и/или защищающая клетки активность изолированного полипептида согласно изобретению в отношении чувствительных клеток можно оценить и/или определить любым способом,охарактеризованным в данном описании и/или известным в данной области. В некоторых вариантах эритропоэтическую и/или защищающую клетки активность определяют в анализе in vitro. В других вариантах эритропоэтическую и/или защищающую клетки активность определяют в анализе in vivo. В родственном варианте, в котором защищающая клетки активность представляет собой нейропротекцию, изобретение относится к способу оценки указанной активности in vitro посредством (а) осуществления контакта тестируемой культуры первичных нейронов гиппокампа с N-метил-D-аспартатом и указанным пептидом и (b) определения жизнеспособности клеток через 48 ч после указанного контакта, при этом если жизнеспособность клеток, определяемая на стадии (b), выше, чем в контрольной культуре в отсутствие указанного пептида, то пептид обладает защищающей клетки активностью. В конкретном варианте клетка, ткань или орган млекопитающего, в отношении которых применяют указанный выше изолированный пептид, представляют собой клетку, ткань или орган, которые в течение определенного периода времени подверглись или будут подвергаться воздействию по меньшей мере одного состояния, неблагоприятного для жизнеспособности клетки, ткани или органа. В соответствии с данным вариантом изолированные пептиды согласно изобретению обеспечивают защиту и/или предотвращают повреждение ткани, возникающее в результате таких состояний, обеспечивают восстановление или обеспечивают обновление ткани и/или функции ткани у нуждающегося в этом субъекта до, во время или после возникновения таких состояний. Такие состояния включают вызванную травмой гипоксию insitu или метаболическую дисфункцию, индуцированную хирургическим вмешательством гипоксию insitu или метаболическую дисфункцию или воздействие токсина in situ, последнее может быть связано с химиотерапией или лучевой терапией. В других вариантах изолированные пептиды согласно изобретению обеспечивают защиту и/или предотвращают повреждение ткани, возникающее в результате заболевания или расстройства, обеспечивают восстановление или обеспечивают обновление ткани и/или функции ткани у нуждающегося в этом субъекта до, во время или после возникновения таких состояний. В родственных вариантах указанное повреждение вызвано эпилепсией, рассеянным склерозом, инсультом,гипертонией, остановкой сердца, ишемией, инфарктом миокарда, воспалением, связанной с возрастом потерей когнитивной функции, радиационным поражением, церебральным параличом, нейродегенеративным заболеванием, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, митохондриальным заболеванием,связанной со СПИДом деменцией, потерей памяти, боковым амиотрофическим склерозом, алкоголизмом, расстройством настроения, тревожным расстройством, синдромом нарушения внимания, аутизмом,болезнью Крейтцфельда-Якоба, травмой или ишемией головного или спинного мозга, искусственным кровообращением, хронической сердечной недостаточностью, дегенерацией желтого пятна, диабетической нейропатией, диабетической ретинопатией, гепатитом, панкреатитом, глаукомой, ишемией сетчатки, травмой сетчатки, сердечно-сосудистым заболеванием, сердечно-легочным заболеванием, респираторным заболеванием, болезнью почек, болезнью мочевой системы, заболеванием репродуктивной системы, заболеванием костей, кожной болезнью, заболеванием соединительной ткани, желудочнокишечным заболеванием, эндокринным нарушением, метаболическим нарушением или заболеванием или расстройством центральной или периферической нервной системы. В других вариантах неблагоприятные состояния являются результатом применения экстракорпорального кровообращения (аппарата искусственного кровообращения), которое используют при некоторых хирургических операциях. В других вариантах указанное повреждение представляет собой когнитивную дисфункцию. В конкретном варианте клетка, ткань или орган млекопитающего, в отношении которого применяют указанный выше-5 015672 изолированный пептид, экспрессируют с-рецептор. В некоторых вариантах изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные выше изолированные полипептиды для введения субъекту, нуждающемуся в таком введении. В конкретных аспектах данного варианта фармацевтическая композиция согласно изобретению дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции могут быть приготовлены для орального, интраназального, глазного, ингаляционного, трансдермального,ректального, подъязычного, вагинального или парентерального введения или в форме перфузируемого раствора для поддержания жизнеспособности клеток, тканей или органов ех vivo. В родственных вариантах осуществления изобретения субъектом является млекопитающее, предпочтительно человек. В других аспектах изобретение относится к способу облегчения трансцитоза молекулы через барьер из эндотелиальных клеток у нуждающегося в этом субъекта, который включает в себя введение указанному субъекту композиции, содержащей указанную молекулу, связанную с изолированным пептидом согласно изобретению, описанным выше. В родственном варианте связь представляет собой лабильную ковалентную связь, стабильную ковалентную связь или нековалентное связывание с участком связывания для указанной молекулы. Согласно другому аспекту изобретения изолированный пептид согласно изобретению, описанный выше, способен преодолевать барьер эндотелиальных клеток. В родственном варианте барьер эндотелиальных клеток включает в себя гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, гематотестикулярный барьер, гематоовариальный барьер, гематоплацентарный барьер, барьер кровь-сердце,кровь-почки, кровь-нервы или кровь-спинной мозг. Согласно одному аспекту изобретения предлагается изолированная молекула нуклеиновой кислоты,которая содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий описанный выше изолированный полипептид. В другом варианте осуществления изобретения предлагается изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность (т.е. кДНК, нуклеотидную последовательность, прерываемую интронами или непрерываемую интронами), которая кодирует полипептид, содержащий или состоящий из изолированного полипептида согласно изобретению, который описан выше. В одном варианте нуклеотидную последовательность, кодирующую изолированный полипептид согласно изобретению, синтезируют, используя предпочтительные кодоны, которые способствуют оптимальной экспрессии в конкретной клетке-хозяине. Такие предпочтительные кодоны могут быть оптимальными для экспрессии в клетках определенного вида растений, бактерий, дрожжей, млекопитающих, грибов или насекомых. Изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты. Изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одну регуляторную область, оперативно связанную с молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте изобретение относится к клетке, содержащей экспрессирующий вектор. В еще одном варианте предлагается генетически сконструированная клетка, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты. В другом варианте изобретение относится к способу рекомбинантного получения изолированного пептида согласно изобретению, который описан выше, включающему в себя культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид согласно изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии указанного пептида, и извлечение и/или выделение экспрессированного полипептида из указанной среды. 3.1. Терминология. В используемом в данном описании смысле термины "около" или "примерно" при использовании в сочетании с числом относятся к любому числу в пределах 1, 5 или 10% от указанного числа. Термин "вводимый в сочетании с" в контексте способов согласно изобретению означает введение соединения до, одновременно и/или после начала заболевания, расстройства или состояния. Подразумевается, что термин "аминокислота" или любое указание конкретной аминокислоты включают встречающиеся в природе протеогенные аминокислоты, а также не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как аналоги аминокислот. Специалистам в данной области будет понятно, что такое определение, если не оговорено особо, включает встречающиеся в природе протеогенные(L)-аминокислоты, их оптические (D)-изомеры, химически модифицированные аминокислоты, включая аналоги аминокислот, такие как пеницилламин (3-меркапто-D-валин), встречающиеся в природе непротеогенные аминокислоты, такие как норлейцин, и химически синтезированные белки, которые обладают свойствами, которые, как известно в данной области, характерны для аминокислоты. В используемом в данном описании смысле аминокислоты будут обозначены либо трехбуквенным сокращением, либо однобуквенным символом следующим образом: аланин = Ala или А, аргинин = Arg или R, аспарагин = Asn или N, аспарагиновая кислота = Asp или D, цистеин = Cys или С, глутаминовая кислота = Glu или Е, глутамин = Gln или Q, глицин = Gly или G, гистидин = His или Н, изолейцин = Не или I, лейцин = Leu или L, лизин = Lys или K, метионин = Met или М, фенилаланин = Phe или F, пролин= Val или V. Кроме того, термин "эквивалент аминокислоты" относится к соединениям, которые отличаются по структуре от встречающихся в природе аминокислот, но которые, по существу, имеют структуру аминокислоты, так что ими можно заменить аминокислоту в пептиде, который при этом сохраняет свою биологическую активность, несмотря на замену. Таким образом, например, эквиваленты аминокислот могут включать аминокислоты, имеющие модификации или замещения боковых цепей, а также включают родственные органические кислоты, амиды или т.п. Подразумевается, что термин "аминокислота" включает эквиваленты аминокислот. Термин "остатки" относится как к аминокислотам, так и к эквивалентам аминокислот. Аминокислоты также могут быть отнесены к следующим группам, которые общеизвестны в данной области:(7) основные аминокислоты: His, Lys, Arg. В используемом в данном описании смысле "возбудимая ткань" означает ткань, которая содержит возбудимые клетки. Возбудимые клетки представляют собой клетки, которые активно отвечают на электрический стимул и имеют электрический заряд, который отличается с разных сторон их клеточных мембран. Возбудимые клетки обычно способны подвергаться потенциалу действия. Такие клетки обычно экспрессируют каналы, такие как потенциалозависимые, лигандозависимые и зависимые от натяжения каналы, которые позволяют проходить ионам (калия, натрия, кальция, хлорида и т.д.) через мембрану. Возбудимые ткани включают нервную ткань, мышечную ткань и железистую ткань. К возбудимым тканям относятся без ограничения нервные ткани, такие как ткань периферической нервной системы (уха и сетчатки) и центральной нервной системы (головного и спинного мозга); сердечно-сосудистая ткань,такая как клетки сердца и связанных нервов; и железистая ткань, такая как ткань поджелудочной железы,в которой кальциевые каналы Т-типа вместе с щелевидными межклеточными контактами принимают участие в секреции инсулина. Иллюстративный список возбудимых тканей включает органы и ткани,которые включают нервы, скелетные мышцы, гладкую мускулатуру, сердечную мышцу, матку, центральную нервную систему, спинной мозг, головной мозг, сетчатку, обонятельную систему, слуховую систему и т.д. Термин "клетка-хозяин" в используемом в данном описании смысле относится к конкретной клетке субъекта, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может быть не идентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, вследствие мутаций или влияния окружающей среды,которые могут возникать в следующих поколениях, или вследствие интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина."Изолированный" или "очищенный" полипептид, по существу, не содержит клеточных веществ или других загрязняющих белков из клеточного или тканевого источника, из которого белок или полипептид получают, или, по существу, не содержит химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза. Формулировка "по существу, не содержит клеточных веществ" относится к препаратам полипептида, в которых полипептид отделен от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или в которых его рекомбинантно получают. Таким образом, полипептид, который, по существу, не содержит клеточных веществ, включает препараты полипептидов, имеющие менее чем примерно 30, 20, 10 или 5% (сухой массы) гетерологичного белка (также называемого в данном описании "загрязняющим белком"). В том случае, когда полипептид получают рекомбинантно, он также предпочтительно, по существу, не содержит культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее чем примерно 20, 10 или 5% объема препарат белка. В том случае, когда полипептид получают в результате химического синтеза, он предпочтительно, по существу, не содержит химических предшественников или других химических веществ, т.е. отделен от химических предшественников или других химических веществ, которые были использованы в синтезе белка. Соответственно такие препараты полипептида имеют менее чем примерно 30, 20, 10, 5% (сухой массы) химических предшественников или других соединений, отличных от представляющего интерес антитела. В предпочтительном варианте полипептиды согласно изобретению являются изолированными или очищенными."Изолированная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, "изолированная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, по существу, может не содержать других клеточных веществ или культуральной среды в том случае, если ее получают рекомбинантными способами, или, по существу, не содержать химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза. В конкретном варианте молекула(лы) нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно изобретению, является изолиро-7 015672 ванной или очищенной. В используемом в данном описании смысле при указании структуры в пределах полипептида термин "мотив" относится или к набору следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности полипептидной цепи и/или к набору линейно близко расположенных аминокислот в третичной структуре указанного полипептида. Поскольку мотив целиком или частично может быть образован в результате фолдинга белка, то аминокислоты, которые являются соседними в описанном мотиве,могут быть разделены 0, 1 или более, 5 или более, 10 или более, 15 или более или 20 или более аминокислотами в линейной аминокислотной последовательности полипептида. В используемом в данном описании смысле термины "пептид", "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и в широком смысле они относятся к ограниченным (т.е. имеющим некоторый элемент структуры, например наличие аминокислот, которые инициируют -виток или -складчатый слой, или,например, циклизованным вследствие присутствия связанных дисульфидной связью остатков Cys) или неограниченным (например, линейным) аминокислотным последовательностям. В некоторых вариантах пептид согласно изобретению состоит менее чем из 30 аминокислот. Однако при чтении данного описании специалисту в данной области будет понятно, что не длина конкретного пептида, а его способность связывать тканезащитный рецепторный комплекс и/или конкурировать за связывание с пептидом, охарактеризованным в данном описании, является отличительным признаком пептида согласно изобретению. Термины "пептид", "полипептид" и "белок" также относятся к соединениям, содержащим эквиваленты аминокислот или другие неаминокислотные группы, но при этом еще сохраняющим требуемую функциональную активность пептида. Эквиваленты пептидов могут отличаться от обычных пептидов заменой одной или нескольких аминокислот родственными органическими кислотами (такими как РАВА), аминокислотами или т.п. или заменой или модификацией боковых цепей или функциональных групп. Термин "профилактика заболевания, расстройства или состояния" относится к задержке начала, задержке прогрессирования, задержке проявления, защите, подавлению или исключению возникновения или уменьшению частоты такого заболевания, расстройства или состояния. Использование термина"профилактика" не означает, что имеется в виду, что у всех пациентов в популяции пациентов, которым проводят профилактическую терапию, никогда не разовьется заболевание, расстройство или состояние,которое является целью профилактики, но в популяции пациентов будет уменьшена частота встречаемости заболевания, расстройства или состояния. Например, многие вакцины против гриппа не на 100% эффективны для профилактики гриппа у пациентов, которым вводят вакцину. Специалист в данной области легко может идентифицировать пациентов и ситуации, при которых профилактическое лечение может быть полезным, например, но не ограничивая указанным, может идентифицировать людей, которые намереваются осуществлять деятельность,которая может привести к травме и повреждению (например, солдаты, участвующие в военных действиях, водители гоночных автомобилей и т.д.), пациентов, которым запланирована операция, пациентов, для которых существует риск появления наследственных болезней, расстройств или состояний, пациентов,для которых существует риск возникновения заболеваний, расстройств или состояний, обусловленных факторами окружающей среды, или частей популяции, для которых существует риск развития конкретных заболеваний, расстройств или состояний, таких как пожилые люди, новорожденные или люди с ослабленной иммунной системой, или пациенты с генетическими или другими факторами риска развития заболевания, расстройства или состояния. В используемом в данном описании смысле термины "субъект" и "пациент" используют взаимозаменяемо. В используемом в данном описании смысле термины "субъект" и "субъекты" относятся к животному, предпочтительно млекопитающему, включая животного, отличного от приматов (например,корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и мышь) и примата (например, обезьяна или человек), и более предпочтительно к человеку. В используемом в данном описании смысле термины "защитная по отношению к ткани активность" или "защита ткани" относятся к эффекту ингибирования или отсрочивания повреждения или гибели клетки, ткани или органа. Если не оговорено особо, "отсрочивание" повреждения или гибели клетки,ткани или органа оценивают по сравнению с контрольными условиями в отсутствие пептида согласно изобретению. Защитная по отношению к ткани активность применима для различных состояний, заболеваний и повреждений клетки, органа и/или ткани, которые, например, описаны в разделе 5.3. Защитная в отношении ткани активность специфична для ткани, клеток и/или органов, экспрессирующих тканезащитный рецепторный комплекс (т.е. для чувствительной ткани, клетки и/или органа соответственно),таких как, без ограничения, ткани центральной нервной системы. В конкретных вариантах чувствительные клетки не являются клетками-предшественниками эритроцитов. Термин "тканезащитный рецепторный комплекс" в используемом в данном описании смысле означает комплекс, содержащий по меньшей мере одну субъединицу рецептора эритропоэтина и по меньшей мере одну общую -субъединицу рецептора. Тканезащитный рецепторный комплекс может содержать несколько субъединиц рецептора эритропоэтина и/или общих бета-субъединиц рецептора, а также дру-8 015672 гие типы рецепторов или белков. См. WO 2004/096148, которая включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по данному положению. Идентичность в процентах между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных совпадающих положений/общее количество положений 100%). В одном варианте две последовательности имеют одинаковую длину. В альтернативном варианте последовательности имеют разную длину, и соответственно идентичность в процентах относится к сравнению более короткой последовательности с частью более длинной последовательности, при этом указанная часть имеет такую же длину, как и указанная более короткая последовательность. 4. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображены результаты, полученные на модели повреждения седалищного нерва in vivo при сравнении эффективности пептида J (SEQ ID NO:41) с тканезащитной молекулой карбамилированного ЕРО (СЕРО), при этом пептид J (SEQ ID NO:41) является химерным пептидом, состоящим из аминокислот, расположенных на наружной поверхности спирали В ЕРО (т.е. пептид G, SEQ ID NO:40),объединенных с амфипатической спиралью из панкреатического полипептида (LRRYINMLTRP,SEQ ID NO:28). На фиг. 2 изображено тканезащитное влияние пептидов согласно изобретению, которые тестировали в модели повреждения седалищного нерва in vivo. В анализе повреждали правый седалищный нерв у крыс (n=6 на группу) и животному немедленно вводили дозы PBS или PBS, содержащего равные молярные концентрации карбамилированного ЕРО, пептида А ЕРО (SEQ ID NO:32, соответствующего аминокислотам 1-23 последовательности SEQ ID NO:1), пептида D (SEQ ID NO:30, соответствующего аминокислотам 58-82 последовательности SEQ ID NO:1) или пептида G (SEQ ID NO:40). Пептид G(SEQ ID NO:40) основан на аминокислотах в пределах спирали В ЕРО, которые направлены в наружную сторону от глобулярного центра молекулы ЕРО в гидрофобную среду, т.е. находятся на поверхности полипептида. Кроме того, в качестве негативного контроля включали 20-мер, сконструированный из области фактора, полученного из пигментного эпителия, который, как известно, является тканезащитным, действуя посредством другого рецептора. Восстановление после повреждения в течение следующих 4 суток показывает, что пептид G (SEQ ID NO:40) и пептид D (SEQ ID NO:30) оказывают тканезащитное действие в указанном анализе на модели in vivo, которое эквивалентно или лучше, чем действие карбамилированного ЕРО (СЕРО). На фиг. 3 изображено эритропоэтическое действие пептида D (SEQ ID NO:30) и СЕРО, у которого,как известно, отсутствует эритропоэтическая активность, которые тестировали в UT-7-анализе эритропоэтической активности. Результаты указанного анализа in vitro показывают, что ни пептид D(SEQ ID NO:30), ни СЕРО не обладают эритропоэтической активностью в дозах до 10000 пМ. На фиг. 4 изображены результаты анализа in vivo для определения того, являются ли пептид F(SEQ ID NO:33, соответствующий аминокислотам 14-29 SEQ ID NO:1), и пептид G (SEQ ID NO:40) эритропоэтическими и не вызывают ли нейтрализацию антител против ЕРО. Результаты показывают, что ни один из белков не повышает уровни гемоглобина у крыс при введении в дозе 0,8 мкг/кг 3 дня/неделю подкожно (п/к) в течение курса продолжительностью 130 дней. Кроме того, ни один из пептидов не вызывал гуморального ответа, в отличие от введения ЕРО. На фиг. 5 изображены результаты исследований in vitro, которые показывают, что пептид D(SEQ ID NO:30) защищает мотонейроны от индуцированной каинатом гибели. На фиг. 6 показано, что пептид D (SEQ ID NO:30, в дозах 0,1 и 1 нг/мл защищает клетки Р-19 от апоптоза, связанного с лишением клеток сыворотки. На фиг. 7 А, 7 В изображены результаты анализа окклюзии средней мозговой артерии у крыс. На фиг. 7 А изображен график, показывающий, что пептид D (SEQ ID NO:30) соответствующий аминокислотам 58-82 последовательности SEQ ID NO:1) в однократной дозе 4,4 мкг/кг способен уменьшать объем инфаркта головного мозга также эффективно, как четыре дозы 4,4 мкг/кг, вводимые с 2-часовыми интервалами. На фиг. 7 В изображены результаты анализа "промахов" стопы, чтобы определить расстройство поведения, вызванное окклюзией средней мозговой артерией. На фиг. 7 В показано, что крысы демонстрировали исправление поведения при введении пептида D (SEQ ID NO:30) как при схеме с использованием однократной дозы (14,4 мкг/кг), так и при схеме с многократными дозами (44,4 мкг/кг).-9 015672 На фиг. 8 А, 8 В изображены результаты анализа in vivo диабетической невропатии. Диабет индуцируют у крыс, используя стрептозотоцин. После подтверждения индуцированного диабета крыс лечили пептидом D (SEQ ID NO:30) или PBS пять раз в неделю в дозе 4 мкг/кг массы тела в/б в течение двух недель. Регистрировали скорость проводимости нерва и задержку между стимулом и реакцией на горячую пластинку у крыс. На фиг. 8A показано, что у крыс, обработанных пептидом D (SEQ ID NO:30) наблюдаются повышенные скорости проводимости по сравнению с необработанными крысами. На фиг. 8 В показано, что задержка между стимулом и реакцией на горячую пластинку у обработанных крыс была уменьшена по сравнению с необработанными крысами, что дополнительно свидетельствует о повышении скорости проводимости. На фиг. 9 А, 9 В изображены результаты лечения индуцированной цисплатином невропатии химерой спирали В ЕРО. На фиг. 9 А показано, что у животных, обработанных пептидом G (SEQ ID NO:40), химера спирали В) наблюдаются улучшенные результаты при тестировании в анализе задержки между сигналом и реакцией на горячую пластинку. На фиг. 9 В показано, что мочеотделение, являющееся мерой почечной функции, сохранялось на уровне нормы у животных, обработанных пептидом G (SEQ ID NO:40). На фиг. 10 изображено влияние пептида D (SEQ ID NO:30) на "просачивание" в сетчатке, связанное с диабетической ретинопатией. На фигуре показано, что пептид D (SEQ ID NO:30) способен значительно снижать просачивание в сетчатке у обработанных животных. На фиг. 11 изображены результаты, полученные при использовании пептида F (SEQ ID NO:33) или пептида G (SEQ ID NO:40) в модели ишемии-реперфузии почек. На фигуре показано, что оба пептида уменьшали оценку в баллах повреждения, возникающего в результате 60-минутной ишемиирепурфионного повреждения, определяемую через 72 ч. На фиг. 12 показано, что введение пептида F (SEQ ID NO:33) защищает мышей от экспериментальной церебральной малярии. Фиг. 13. Клинический показатель в мышиной модели ЕАЕ после обработки пептидом Е(SEQ ID NO:31). На фиг. 13 изображено клиническое течение неврологической функции у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом. 4,4 мкг/кг пептида Е вводили в/б ежедневно. Введение пептида Е значимо улучшало неврологическую функцию по сравнению с контролем. Клинические стадии: 1 - поникший хвост; 2 - атаксия и/или паралич задних конечностей или медленный рефлекс выпрямления; 3 - паралич задних конечностей и/или паралич передних конечностей; 4 - парез передних конечностей; 5 - агония или гибель. 5. Подробное описание изобретения 5.1. Тканезащитные пептиды. Эритропоэтическая активность эритропоэтина ("ЕРО") хорошо охарактеризована в данной области(см., например, Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866, публикация включена в виде ссылки в полном объеме). ЕРО инициирует эритропоэз посредством связывания с внеклеточной частью предварительно образованного гомодимера рецептора эритропоэтина (EPOR) (т.е. (EPOR)2) таким образом, что он образует мостик между специфичными положениями на отдельных субъединицах EPOR. Когда ЕРО связывается с (EPOR)2, крупные части глобулярного лиганда удаляются от областей связывания и поворачиваются наружу, в сторону от комплекса ЕРО и (EPOR)2 в водную среду. Авторы изобретения определили, что защита ткани, в отличие от эритропоэза, опосредована другим рецептором, отличным от(EPOR)2, который состоит из мономера EPOR, связанного с другим рецептором, CD131 (также известным как общая -субъединица рецепторов (c. EPOR и c взаимодействуют с образованием рецепторного гетеродимера, EPOR-c. В настоящее время не известно, вовлечены ли другие белки в указанное взаимодействие. Настоящее изобретение относится к тканезащитным пептидам, полученным из трехмерной структуры ЕРО, и, в частности, из частей ЕРО, направленных в сторону от участков связыванияEPOR, т.е. не взаимодействующих с классическим эритропоэтическим гомодимером EPOR (EPOR)2. He имея намерения быть связанными с какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что указанная часть молекулы ЕРО взаимодействует с тканезащитным рецептором и, тем самым, опосредует защиту ткани. Общепринята трехмерная структура ЕРО, которая описана в Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866, включенной в данном описании в виде ссылки в полном объеме, и указана в виде последовательности SEQ ID NO:1 (также доступна в виде данных, депонированных в банке данных о белкахNational Center for Biotechnology Information, доступ "IBUY"). Части молекулы ЕРО, которые направлены в сторону от проксимальной по отношению к мембране части гомодимера EPOR при связывании с указанным рецептором (т.е. в сторону от клеточной мембраны, когда гомодимер (EPOR)2 экспрессирован на поверхности клетки), состоят из следующих вторичных структур: петля АВ (соответствующая аминокислотам 29-55 последовательности SEQ ID NO:1), спираль В (соответствующая аминокислотам 56-82 последовательности SEQ ID NO:1), петля ВС (соответствующая аминокислотам 83-92 последовательно- 10015672 сти SEQ ID NO:1) и петля CD (соответствующая аминокислотам 112-138 последовательностиSEQ ID NO:1). В одном варианте осуществления изобретения тканезащитные пептиды состоят из аминокислотных последовательностей, соответствующих последовательностям различных структур молекулы ЕРО. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, авторы изобретения полагают, что тканезащитный рецептор образуется заранее, т.е. что белковые субъединицы EPOR и с функционально связываются до их взаимодействия с ЕРО. ЕРО является членом надсемейства цитокинов типа I. Члены ветви надсемейства цитокинов типа I характеризуются наличием четырех спиралей, которые гидрофобно взаимодействуют, образуя глобулярный белок, наружная поверхность которого взаимодействует с водной средой, и ее называют "направленной наружу". Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что не один, а несколько пептидов, полученных из направленной наружу части молекулы ЕРО, являются тканезащитными. Следующее неожиданное открытие заключается в том, что пептиды, полученные из частей молекулы ЕРО, которые погружены в комплекс ЕРО:(EPOR)2, и пептиды, которые также могут содержать части участков 1 или 2 связывания при эриптропоэзе, также являются высокоэффективными в защите ткани. Чтобы объяснить указанные открытия, авторы изобретения предположили, что успешная активация тканезащитного рецептора обусловлена подходящей пространственно компактной конфигурацией зарядов в пептидном лиганде. Кроме того, такая компактная конфигурация зарядов формируется двумя различными структурными мотивами: (1) двумя отрицательно заряженными аминокислотами,расположенными рядом друг с другом и фланкированными гидрофобными аминокислотами; или (2) положительно и отрицательно заряженными (т.е. основной и кислотной) аминокислотами, расположенными непосредственно рядом друг с другом и фланкированными одним гидрофобным или полярным аминокислотными остатками. Близость таких зарядов может возникать благодаря линейной структуре, обусловленной образованием пептидных связей, т.е. структура может быть образована следующими друг за другом аминокислотами в полипептидной цепи, или альтернативно близость также может возникать в результате пространственной взаимосвязи между различными частями молекулы ЕРО (или других молекул, родственных цитокину типа I), обусловленной третичной структурой белка, т.е. трехмерной структурой. Не имея намерения быть связанными с какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что, в общем, такое требование предполагает, что тканезащитный пептид будет иметь определенную третичную структуру (например, спирали или складчатые слои), которая обеспечивает требуемую пространственную локализацию пары заряженных аминокислот (т.е. двух отрицательно заряженных аминокислот и/или положительно и отрицательно заряженных аминокислот). Простым исключением является линейный пептид, в котором аминокислоты в паре расположены непосредственно рядом друг с другом, имеющий требуемую жесткость, придаваемую пептидным остовом. Соответственно, структурный мотив (1) подпадает под линейную последовательность аминокислотных остатков, напримерH1-N1-N1-H2 (SEQ ID NO:6), или линейную последовательность аминокислотных остатков, в которой N1 и N2 разделены 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более промежуточными остатками, например H1-N1-X-X-X-X-X-N1-H2(SEQ ID NO:11). Для защиты ткани пара заряженных аминокислот должна быть пространственно ориентирована так,чтобы карбонильные атомы углерода находились на расстоянии друг от друга примерно от 3 до 5 ,предпочтительно примерно от 4 до 5 друг от друга и более предпочтительно примерно от 4,4 до 4,8 друг от друга. Это может быть достигнуто несколькими путями, например за счет соседних заряженных аминокислот в простом линейном пептиде (см., например, пример 2 и пептид G, SEQ ID NO:40, в табл. 1) или в случае пептидов, которые могут образовывать альфа-спираль, за счет заряженных аминокислот,разделенных промежуточным аминокислотным остатком (см., например, пример 2 и пептид F,SEQ ID NO:33, в табл. 1). Необходимо отметить, что третичная структура (например, альфа-спираль в амфипатических пептидах) также может быть образована в том случае, когда пептид находится в специфичном микроокружении, таком как на границе раздела внеклеточного пространства и мембраны клеточной поверхности (см., Segrest, 1990, Proteins. 8:103-117, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Кроме того, защитная в отношении ткани активность прогнозируется для пептидов, которые содержат пары заряженных аминокислот, так, что заряженные боковые цепи (либо положительно и отрицательно заряженные, либо две отрицательно заряженные) находятся в пространстве в ограниченных пределах примерно от 6,5 до 9 друг от друга. Это может быть в условиях альфа-спирали благодаря тому,что заряженные члены пары разделены одной или двумя аминокислотами, что обеспечит нахождение зарядов более или менее на одной и той же стороне спирали на требуемом разделяющем их расстоянии примерно от 6,5 до 9 . Не ограничивающим примером такого пептида является пептид F (см. пример 2,SEQ ID NO:33 в табл. 1). Специалист в данной области может определить третичную структуру пептида,которая, в общем, требуется для получения подходящего трехмерного положения заряженных аминокислот, а также конструкцию небольших молекул для имитации разделения зарядов в пептиде. Расстояния в пространстве между карбонильными атомами углерода любых двух аминокислот или между боковыми цепями любых двух аминокислот можно рассчитать любым способом, известным в данной области или описанным в данной публикации. Например, когда известна трехмерная структура- 11015672 белка, разделение зарядов двух боковых цепей или расстояние в пространстве между двумя карбонильными атомами углерода в представляющей интерес части указанного белка могут быть рассчитаны на основании опубликованных или иначе принятых в данной области трехмерных координат аминокислотных остатков в указанной представляющей интерес части. В том случае, когда трехмерная структура белка, и поэтому представляющей интерес части, неизвестна или когда конструируют полностью синтетический пептид на основе приведенного в данном описании руководства, трехмерная структура которого неизвестна, разделение зарядов двух боковых цепей или расстояние в пространстве между двумя карбонильными атомами углерода в указанном пептиде можно оценить с использованием трехмерной структуры, рассчитанной с помощью компьютерной программы моделирования белков, которая известна в данной области. Не ограничивающими примерами такой компьютерной программы являются МОЕ,Chemical Computing Group (Quebec, Canada) и Modeler by Accelrys (San Diego, California). Подобным образом в данной области также известна компьютерная программа для прогнозирования, также доступная от указанных выше компаний, для конструирования малых молекул, и соответственно специалист в данной области на основании приведенных в данном описании инструкций мог бы получить небольшие молекулы, которые имитируют описанные структурные мотивы. Могут быть сконструированы не встречающиеся в природе или химерные пептиды, которые имитируют необходимую пространственную близость, описанную выше, посредством линейной последовательности аминокислот. Поэтому настоящее изобретение относится к новым тканезащитным пептидам,включая пептиды, которые имеют указанные структурные мотивы, которые приводят в действие защиту ткани. Настоящее изобретение также относится к применению тканезащитных фрагментов других цитокинов типа I, включая без ограничения, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов(GM-CSF), интерлейкин-3 (IL-3), тромбопоэтин (ТРО), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и ингибирующий лейкоз фактор (LIF), которые структурно гомологичны указанным выше направленным наружу аминокислотным последовательностям ЕРО и/или содержат описанные выше структурные мотивы. Кроме того, тканезащитные пептиды могут представлять собой химерные соединения, основанные на структурных мотивах, описанных выше, объединяющие структурные элементы, которые не являются соседними, и только аминокислоты, представленные на поверхности. В частности, авторы изобретения определили, что добавление амфипатической пептидной спирали к указанным выше последовательностям увеличивает эффективность пептида. Кроме того, тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению включают слитые пептиды, образованные в результате объединения двух или более указанных выше пептидов или объединения с родственной или неродственной макромолекулой для специфичного транспорта, такой как нативный ЕРО, инсулин или лептин. 5.1.1. Фрагменты. А. Полученные из ЕРО пептидные фрагменты. Настоящее изобретение относится к новым тканезащитным пептидам, которые в одном варианте состоят из фрагментов аминокислотных последовательностей ЕРО, полученных на основании трехмерной структуры белка ЕРО, и, в частности, получены из таких областей ЕРО, которые направлены в сторону от участков связывания лиганда и/или внутренней части гомодимера EPOR. Указанные фрагменты получают из следующих структур ЕРО:(3) часть петли А-В, состоящая из небольшой цистеиновой петли и -складчатого слоя(GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31, соответствующая аминокислотам 28-47 последовательности SEQ ID NO:1). Все указанные пептидные фрагменты, как описано в примере 2 (см. фиг. 1 и табл. 1), обладают тканезащитными свойствами. Неожиданно некоторые пептиды, полученные из других областей молекулы ЕРО, которые скрыты,и другие пептиды, которые содержат части участков связывания с (EPOR)2, также являются тканезащитными. Например, пептид, состоящий из N-концевой части спирали ASEQ ID NO:32, соответствующая аминокислотам 1-23 последовательности SEQ ID NO:1), которая содержит часть участка 2 связывании EPOR (подчеркнута), является тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1). Однако присутствие аминокислот участка 2 не объясняет защитной в отношении ткани активности, так как пептид, состоящий из аминокислот 14-19 последовательности SEQ ID NO:1(RYLLEAKEAENITTGC, SEQ ID NO:33) и не содержащий аминокислот 11-13 последовательностиSEQ ID NO:1 (т.е. VLE; аминокислоты участка 2, которые необходимы для связывания ЕРО с димеромEPOR, (EPOR)2), также является тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1, также Elliott et al., 1997, Blood- 12015672 89:493, публикация включена в данное описание в виде сслыки в полном объеме). Авторы изобретения ранее показали, что мутации в участках связывания при эритропоэзе, которые аннулируют эритропоэз,не модифицируют тканезащитные свойства ЕРО (Leist et al. Science (2004), 305:239, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Специалисту в данной области будет понятно, что тканезащитный пептид могут образовывать фрагменты разной длины, хотя предпочтительно фрагмент имеет длину менее 30 аминокислот. Кроме того, тщательный отбор других молекул для включения, например D-аминокислот или полиэтиленгликоля, также позволит получить тканезащитные пептиды, но с увеличенным биологическим временем полужизни.B. Структурные мотивы. В частности, были идентифицированы следующие структурные мотивы, которые приводят в действие тканезащитный рецепторный комплекс.(а) Конфигурация отрицательных зарядов ("структурный мотив А"). В данном структурном мотиве пептид имеет две отрицательно заряженные аминокислоты, которые могут быть разделены 5 аминокислотами, фланкированные гидрофобными аминокислотами. Структурно мотив можно представить в виде: где Н означает гидрофобные аминокислоты (например, умеренно гидрофобные аминокислоты: глицин, пролин, цистеин, тирозин и триптофан и предпочтительно высокогидрофобные аминокислоты: аланин, валин, изолейцин, метионин, лейцин, фенилаланин);N означает отрицательно заряженные аминокислоты, такие как глутамат или аспартат;X означает любую аминокислоту, хотя предпочтительно гидрофильную аминокислоту. В некоторых вариантах фланкирующие гидрофобные аминокислоты являются одинаковыми. В других вариантах фланкирующие аминокислоты являются разными. Вариант указанного структурного мотива включает пептид, в котором одна из фланкирующих гидрофобных аминокислот была заменена полярной аминокислотой, такой как серин, треонин, аспарагин или глутамин. В качестве альтернативы пептидным связям, создающим взаимную близость двух отрицательных зарядов в линейной последовательности, необходимая близость зарядов также может быть создана благодаря трехмерной структуре, которая обсуждается выше (раздел 5.1). Например, отрицательно заряженные аминокислоты могут непосредственно соседствовать в пространстве на внешней поверхности спирали, но будут разделены дополнительными аминокислотами в линейной последовательности пептида. Например, в спирали А ЕРО (соответствующей аминокислотам 10-28 в последовательностиSEQ ID NO:1), Е 18 и Е 21 находятся рядом в трехмерной структуре, но между ними имеются две промежуточные аминокислоты в линейной пептидной последовательности. В качестве дополнительного примера в спирали В (пептид D (SEQ ID NO:30; соответствующий аминокислотам 58-82 последовательностиSEQ ID NO:1) Е 62 и Е 72 разделены двумя аминокислотами (Q65 и L69) на поверхности спирали, но между ними имеется 9 аминокислот в линейном пептиде. Пептиды, сконструированные из спирали А или спирали В, являются тканезащитными (см. пример 2 и табл. 1 ниже). В отличие от этого, пептид ВSEQ ID NO:34), пептид со сдвоенными отрицательными зарядами (подчеркнуты) на соответствующем расстоянии, но не имеющий фланкирующих гидрофобных аминокислот, не является тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1 ниже).(b) Конфигурация отрицательной/положительной аминокислот ("структурный мотив В"). В данном структурном мотиве пептид имеет положительно заряженную аминокислоту вблизи отрицательно заряженной аминокислоты, и обе заряженные аминокислоты фланкированы одной и той же гидрофобной аминокислотой. Структурно мотив можно представить в виде: где Р означает положительно заряженную аминокислоту, такую как аргинин, лизин или гистидин;N означает отрицательно заряженную аминокислоту - глутамат или аспартат. Как и в первом мотиве, взаимная близость двух противоположных зарядов может быть создана благодаря трехмерной структуре. Например, положительно и отрицательно заряженные аминокислоты могут быть пространственно близки на поверхности спирали, но будут разделены одной или несколькими аминокислотами в линейной пептидной последовательности. Например, в спирали В (соответствующей аминокислотам 58-82 в последовательности SEQ ID NO:1) Е 72 и R76 непосредственно соседствуют друг с другом на внешней поверхности спирали, и пептид, сконструированный из такой спирали, является- 13015672 тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1). В варианте такого конкретного мотива отрицательно и положительно заряженные аминокислоты могут быть разделены полярной аминокислотой, напримерSEQ ID NO:34), который Примером такого мотива является пептид Е является тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1). Учитывая, что ядро указанного выше структурного мотива имеет длину, равную четырем аминокислотам, пептид с ядром в виде такого структурного мотива может приводить в действие тканезащитный рецептор. В некоторых вариантах полипептиды согласно изобретению содержат 1 структурный мотив. В альтернативных вариантах полипептиды согласно изобретению содержат более 1, более 2, более 3 или более 4 структурных мотивов. В некоторых вариантах, в которых полипептид содержит по меньшей мере два структурных мотива, мотивы являются одинаковыми. В альтернативных вариантах, в которых полипептид содержит по меньшей мере два структурных мотива, мотивы являются разными. Предпочтительно множество пептидов согласно настоящему изобретению, которые специалист в данной области может создать, имеют длину менее 30 аминокислот. Специалисту в данной области будет понятно, что указанные выше структурные мотивы, в противоположность реальной аминокислотной последовательности ЕРО, являются важными для настоящего изобретения. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что изолированный пептид может иметь менее чем 90, менее чем 85, менее чем 80, менее чем 75, менее чем 70, менее чем 65, менее чем 60, менее чем 55, менее чем 50, менее чем 45, менее чем 40, менее чем 35, менее чем 30 или менее чем 20%-ную идентичность последовательности с любой частью аминокислотной последовательности зрелого эритропоэтина ("ЕРО") человека, указанной в SEQ ID NO:1, при этом указанная часть ЕРО содержит такое же количество аминокислотных остатков, что и указанный пептид. Кроме того, в патенте США 5700909, O'Brien et al. (который включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме) описана 17-аминокислотная пептидная последовательность ЕРО(SEQ ID NO:11, O'Brien), которая индуцирует биологическую активность в клетках NS20Y, SK-N-MC и РС 12, включая прорастание, дифференцировку, нейрозащиту и предотвращение гибели нейронов. Последовательность SEQ ID NO:11 согласно O'Brien (названная эпопептидом АВ), хотя и заявлена как последовательность, предположительно обладающая эритропоэтической активностью, в действительности не обладает такой эритропоэтической активностью и, как было обнаружено позже, не обладает активностью in vivo. Когда эпопептид АВ инъецировали в мышцу мышей, частота прорастания концевой пластинки двигательного нерва в расположенные рядом мышцы возрастала подобно тому, как это происходит при индукции цилиарным нейротрофическим фактором. Полученные данные объяснимы в рамках представления о том, что нейронные (но не гематологические) клетки отвечают на пептидную последовательность в пределах ЕРО и что ЕРО может иметь отдельные домены для нейротрофической и гематотрофической активности (Campana et al., Int. J. Mol. Med. (1998), 1(1):235-241; J.S. O'Brien в патенте США 5700909, выданном 23 декабря 1997 г.; J.S. O'Brien в патенте США 5571787, выданном 5 ноября 1996 г.; J.S. O'Brien в патенте США 5714459, выданном 3 февраля 1998 г.; и J.S. O'Brien andY. Kashimoto в патенте США 5696080, выданном 9 декабря 1997 г.). Однако O'Brien не рассматривал структурные мотивы, предлагаемые в настоящем изобретении, основанные на близости заряженных аминокислот в третичной структуре пептида. С. Фрагменты цитокина типа 1. Учитывая пространственно компактную конфигурацию зарядов, способную активировать тканезащитный рецептор, авторы изобретения обнаружили, что некоторые фрагменты цитокинов типа 1 предположительно перекрестно взаимодействуют с тканезащитным рецептором. Такое семейство цитокинов включает без ограничения интерлейкин IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), лептин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), ингибирующий лейкоз фактор (LIF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF),тромбопоэтин (ТРО), гормон роста, колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), эритропоэтин(ЕРО) и пролактин. Рассмотрение вторичной структуры ЕРО является руководством для получения кандидата тканезащитных пептидов с помощью пространственного расположения аминокислот, полученных на основе гомологичных аминокислот, локализованных в гомологичных вторичных структурах в других лигандах рецепторов цитокинов типа 1: например, было показано, что среди прочих GM-CSF и IL-3 (Kannan, 2000,Neuroimmunomod. 8:132-141, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме) обладают высокими нейротрофическими и нейрозащитными активностями, в основном, как полагают авторы изобретения, вследствие стимуляции тканезащитного рецептора. Например, при рассмотрении спирали В цитокинов типа I видно: гомологичные аминокислоты в тромбопоэтине (ТРО; Protein Data, G65, Т 68, L69 А 76 и Q80, при этом указанные амино- 14015672 кислоты находятся в пространстве рядом друг с другом в линейном расположении; гомологичные ами, R64, Y68, S72,нокислоты в ингибирующем лейкоз факторе (LIF; PDB, доступ 1EMR) включают; гомологичные аминокислоты в цилиарном нейротрофическом факторе (CNTF; PDB, доступ 1CNT) включают,. Все примеры являются примерами мотива А, описанного выше (раздел 5.1.1), где подчеркнутые аминокислоты являются отрицательно заряженными. Примеры пептидов, полученных из цитокинов типа 1, которые являются примером структурного мотива В, охарактеризованного в данном описании выше (раздел 5.1.1), включают без ограничения. Указанные выше аминокислоты являются только примерами из нескольких членов надсемейства цитокинов, которые передают сигнал через рецепторы цитокинов типа 1, и специалист в данной области легко сможет идентифицировать гомологичные области в других членах надсемейства цитокинов. 5.1.2. Химеры."Химерные" тканезащитные пептиды - линейные аминокислотные последовательности, которые содержат нелинейные структурные элементы направленных наружу аминокислот молекулы ЕРО и имеют указанные выше структурные мотивы, - также входят в объем настоящего изобретения. Химерные тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению могут состоять из объединенных в одном пептиде структурных элементов отдельных аминокислотных последовательностей. Другими словами,химерный тканезащитный пептид может состоять из аминокислотных последовательностей, полученных из нелинейных, но расположенных рядом структурных элементов, таких как фрагмент, полученный из аминокислотных последовательностей 110-115, 133-136 и 160-165 последовательности SEQ ID NO:1,который может обеспечить возможность контактирования структурных элементов С-концевой части спирали С и N-концевой части петли C-D, -складчатого слоя в петле C-D и С-концевой части ЕРО в одном пептиде. Кроме того, химерные тканезащитные пептиды могут быть использованы для отбора важных характерных признаков конкретной структуры, например направленных наружу аминокислот конкретной третичной структуры. Таким образом, химерный тканезащитный пептид может состоять из фрагмента, состоящего из аминокислот спирали В 58, 62, 65, 69, 72, 76, 79, 80, 83, 84 и 85 (например,пептид G, QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40) или, другими словами, из всех представленных с наружной стороны аминокислот спирали В ЕРО. Данный пептид является тканезащитным, как показано в примере 2 ниже (см. табл. 1). Кроме того, эффективность тканезащитных пептидов согласно изобретению может быть увеличена посредством связывания амфипатической пептидной спирали. Амфипатические пептидные спирали хорошо известны в данной области, например спирали из пептидов, которые передают сигнал через сопряженные с G-белком рецепторы класса В (например, Segrest et al., 1990, Proteins. 8:103, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме), служащие для локализации пептидного лиганда на клеточной мембране. Примеры таких спиралей включают без ограничения высокогидрофобные области из кальцитонина (ALSILVLLQAGS, SEQ ID NO:48); кортиколиберина (VALLPCPPCRA,SEQ ID NO:49); бета-эндорфина (NAIIKNAYKKG, SEQ ID NO:50); глюкагона (GSWQRSLQDTE,SEQ ID NO:51); секретина (GGSAARPAPP, SEQ ID NO:52); вазоинтестинального полипептида(GCSSQHWSYGL, SEQ ID NO:55); паратиреоидного гормона (VMIVMLAICFL, SEQ ID NO:56); панкреатического полипептида (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO:28) и пептида, ассоциированного с геном кальцитонина (LALSILVLYQA, SEQ ID NO:57) (описанного в Grace et al., 2004, PNAS. 101:12836, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Например, химерный пептид, полученный из пептида с поверхностным мотивом зарядов спирали В ЕРО (QEQLERALNSS,SEQ ID NO:40), связанным на карбоксильном конце с амфипатической спиралью панкреатического полипептида (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO:28) для получения химерного пептида. Могут быть осуществлены дополнительные модификации на карбоксильном конце амфипатической спирали, не влияющие на тканезащитные свойства. Таким образом, в следующем примере замена концевого пролина указанного выше химерного пептида последовательностью TR (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO:41) создает молекулу, обладающую высокой тканезащитной активностью, которая показана в анализе седалищного нерва (см. фиг. 1). Кроме того, вместо указанных выше спиралей с тканезащитными пептидами могут быть связаны другие третичные структуры. Например, представленные с наружной стороны аминокислоты спирали В могут быть связаны с -складчатым слоем (CSLNENI, SEQ ID NO:42), обнаруженным в АВ-петле EPO, с образованием химерного пептида, имеющего последовательность CSLNENIQEQLERALNSS(SEQ ID NO:43), который является тканезащитным (см. пример 2 и табл. 1). Кроме того, наружные амифрагмент А-спирали- 15015672 нокислоты концевой части спирали С (ALGKA, SEQ ID NO:44, соответствующие аминокислотам 111,112, 113, 116 и 118 последовательности SEQ ID NO:1) могут быть объединены во всей или с частью неполной петли CD (LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI, SEQ ID NO:45, соответствующей аминокислотам 112-133 последовательности SEQ ID NO:1). Предпочтительно между слитыми пептидами будет присутствовать связывающее плечо, чтобы обеспечить гибкость, так чтобы связанные пептиды могли принять надлежащую структурную ориентацию, чтобы связаться с тканезащитным рецепторным комплексом. Такие слитые пептиды могут обладать синергетическим действием, совместно давая больший тканезащитный эффект, чем при их действии по отдельности, вероятно благодаря усиленному связыванию с тканезащитным рецепторным комплексом или увеличенным биологическим временем полужизни. Специалисту в данной области будет понятна польза объединения различных требуемых структурных элементов в одном пептиде для максимизации тканезащитных эффектов таких соединений. Такие химеры могут содержать состоящие из аминокислот пептиды и неаминокислотные элементы, такие как линкеры или образующие мостики атомы или остатки. 5.1.3. Слитые пептиды. Настоящее изобретение дополнительно предполагает, что два или более из указанных выше тканезащитных пептида, полученных фрагментов или химер, могут быть связаны с родственным или неродственным белком, таким как эритропоэтин, альбумин и т.д. 5.1.4. Производство тканезащитных пептидов. Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием способов рекомбинации или синтеза, хорошо известных в данной области. В частности, твердофазный синтез белков хорошо подходит для относительно коротких тканезащитных пептидов и может давать более высокие выходы с более постоянными результатами. Кроме того, твердофазный синтез белков может обеспечивать дополнительную гибкость производства тканезащитных пептидов. Например, требуемые химические модификации могут быть введены в тканезащитный пептид на стадии синтеза: в синтезе можно использовать гомоцитруллин вместо лизина, тем самым устраняя необходимость карбамилировать пептид после синтеза. Синтез. При твердофазном синтезе пептида аминокислоты с защитой -аминогруппы и защитой боковой цепи иммобилизуют на смоле. См., например, Nilsson, В., Soellner, М., and Raines, R. Chemical SynthesisEnzymol. 289:126-74. Обычно используют два типа защитных групп -аминогруппы: чувствительную к кислотам трет-бутоксикарбонильную (Boc) группу или чувствительную к основаниям 9-флуоренилметилоксикарбонильную (Fmoc) группу. Wellings D.A., Atherton E. 1997. Standard Fmocprotocols. Methods Enzymol. 289:44-67. После быстрого и полного удаления указанных защитных групп-аминогруппы другие защищенные аминокислоты с активированной карбоксильной группой могут быть связаны с незащищенным связанным со смолой амином. Использование избытка активированных растворимых аминокислот приводит к полному завершению реакций связывания. Цикл удаления защиты и связывания повторяют до получения полной последовательности. После удаления защиты боковых цепей и отщепления от смолы получают требуемый пептид. Guy C.A., Fields G.B. 1997. TrifluoroaceticEnzymol. 289:29-44. Дополнительные способы осуществления твердофазного синтеза белка описаны вProtein. Science. 299:884-887. (Каждая цитированная в данном абзаце публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). При необходимости меньшие по размеру пептиды, полученные в результате твердофазного синтеза пептидов, могут быть объединены посредством связывания пептидов, например, с помощью естественных химических связей. В данном способе тиолат N-концевого остатка цистеина одного пептида воздействует на С-концевой тиоэфир второго пептида, приводя к транстиоэтерификации. Амидная связь образуется после быстрого ацильного переноса SN. См. Dawson, P. et al. 1994. Synthesis of Proteins by NativeChemical Ligation. Science. 266:776-779, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению могут включать пептидомиметики, пептиды, содержащие как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как пептоиды. Пептоиды являются олигомерами N-замещенных глицинов, гликохолевой кислоты, тиопронина, саркозина и тиорфана. Указанные структуры имеют тенденцию к образованию общей структуры (-(С=O)-CH2-NR-)n, при этомR-группа действует в качестве боковой цепи. Такие пептоиды могут быть синтезированы с использованием твердофазного синтеза согласно протоколам Simon et al., Peptoids: A molecular approach to drugdiscovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371 (1992) и Li et al., Photolithographic Synthesis of Peptoids,J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 4088-4089, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению пептидомиметиков или миметиков пептидов, непептидных лекарственных средств, обладающих свойствами, аналогичными свойствам матричных пептидов (Fauchere, J. (1986), Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Friedinger (1985), TINS, p. 32 иEvans et al. (1987), J. Med. Chem. 30:1229, публикации включены в виде ссылки). Обзор синтеза различных типов пептидомиметиков можно найти, например, в Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl),Synthesis of Peptides and Peptidomimetics - Workbench Edition, Volume E22c (Editor-in-Chief Goodman M.),2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Способы рекомбинации. Можно использовать различные системы хозяин-экспрессирующего вектора, чтобы получить тканезащитные пептиды согласно изобретению. Такие системы экспрессии в хозяине представляют собой векторы, посредством которых представляющий интерес тканезащитный пептид может быть получен и затем очищен, но также представляют собой клетки, в которых при трансформации или трансфекции подходящими кодирующими нуклеотидными последовательностями можно обнаружить модифицированный продукт гена эритропоэтина in situ. Такие системы включают без ограничения системы хозяев: бактерии, насекомые, растения, млекопитающие, включая человека, такие как, без ограничения, система клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусами), содержащими последовательности, кодирующие тканезащитный пептид; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами(например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой),содержащими последовательности, кодирующие родственные эритропоэтину молекулы; или системы клеток млекопитающих, включая системы клеток человека, например НТ 1080, COS, СНО, BHK, 293,3 Т 3, несущих рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих, например промотор металлотионеина, или из вирусов млекопитающих,например поздний промотор аденовируса; промотор 7.5K вируса вакцинии. Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт специфичным требуемыми образом. Такие модификации и процессинг белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Как известно специалистам в данной области, разные клетки-хозяева имеют специфичные механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Могут быть выбраны подходящие линии клеток или системы хозяев, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг чужеродного экспрессированного белка. С этой целью можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые имеют клеточный аппарат для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такими клетками-хозяевами млекопитающих, включая клетки-хозяева человека, являются без ограничения НТ 1080, СНО, VERO, BHK, HeLa,COS, MDCK, 293, 3 Т 3 и WI38. Для долговременной, высокопроизводительной продукции рекомбинантных пептидов предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть сконструированы линии клеток, которые стабильно экспрессируют продукт рекомбинантного гена тканезащитной родственной цитокину молекулы. Вместо использования экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК под контролем подходящих элементов регуляции экспрессии, например промотора,энхансера, последовательностями терминации транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.п., и селектируемым маркером. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам дают возможность расти в течение 1-2 дней в обогащенных средах и затем переводят на селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает резистентность к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать до получения линий клеток. Такой способ преимущественно можно использовать, чтобы сконструировать линии клеток, которые экспрессируют тканезащитный продукт. Такие сконструированные линии клеток могут быть особенно применимы для скрининга и оценки соединений, которые влияют на эндогенную активность продукта гена родственной ЕРО молекулы.- 17015672 Дополнительные модификации. Могут быть осуществлены дополнительные модификации тканезащитных пептидов. Например,пептид может быть синтезирован с одной или несколькими (D)-аминокислотами. Выбор включения(L)- или (D)-аминокислоты в пептид согласно настоящему изобретению отчасти зависит от требуемых характеристик пептида. Например, включение одной или нескольких (D)-аминокислот может обеспечить повышенную стабильность пептида in vitro или in vivo. Включение одной или нескольких (D)аминокислот также может увеличивать или уменьшать активность связывания пептида, которую определяют, например используя биологические анализы, описанные в данной публикации, или другие способы, хорошо известные в данной области. Замена всей или части последовательности (L)-аминокислот соответствующей последовательностью энантиомерных (D)-аминокислот создает оптически изомерную структуру в соответствующей части полипептидной цепи. Инверсия последовательности всей или части последовательности(L)-аминокислот создает обратный аналог пептида. Комбинация замены энантиомеров (L на D или D наL) и инверсии последовательности создает обратный инверсный аналог пептида. Специалистам в данной области известно, что энантиомерные пептиды, их обратные аналоги и их обратные инверсные аналоги сохраняют значительную топологическую взаимосвязь с исходным пептидом и часто получают особенно высокую степень сходства исходного пептида и его обратного инверсного аналога. Указанная взаимосвязь и сходство могут отражаться в биохимических свойствах пептидов, в частности высокой степени связывания соответствующих пептидов и аналогом с белком-рецептором. Синтез обратных инверсных аналогов с определенными свойствами обсуждается, например, в Methods of Organic ChemistryGoodman M.), 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York) и цитированных в указанных публикациях ссылках, которые все включены в данной описание в виде ссылки в полном объеме."Модификация" аминокислоты относится к изменению встречающейся в природе аминокислоты с получением не встречающейся в природе аминокислоты. Производные пептидов согласно настоящему изобретению с не встречающимися в природе аминокислотами могут быть созданы при химическом синтезе или посредством сайт-специфичного включения неприродных аминокислот в полипептиды во время биосинтеза, как описано в Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G.Schultz, 1989, Science, 244:182-188, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Миметики пептидов, которые сходны по структуре с терапевтически применимыми пептидами,можно использовать для получения эквивалентного терапевтического или профилактического действия. В общем, пептидомиметики структурно сходны с эталонным полипептидом (т.е. полипептидом, который обладает биохимическим свойством или фармакологической активностью), но в них одна или несколько пептидных связей необязательно заменены связью, выбранной из группы, состоящей из: каждая из которых включена в данное описание в виде ссылки. В другом варианте особенно предпочтительной непептидной связью является CH2NH. Такие миметики пептидов могут иметь существенные преимущества по сравнению с полипептидными вариантами, включая, например более экономичное получение, более высокую химическую стабильность,улучшенные фармакологические свойства (время полужизни, всасывание, активность, эффективность и т.д.), измененную специфичность (например, биологические активности широкого спектра действия),пониженную антигенность и др. Возможны различные конструкции миметиков пептидов. Например, циклические пептиды, в которых необходимая конформация стабилизирована непептидными компонентами, специально рассмотрены в патенте США 5192746, Lobl, et al., патенте США 5576423, Aversa, et al., патенте США 5051448,- 18015672Shashoua и патенте США 5559103, Gaeta, et al., которые включены в данное описание в виде ссылки, в которых описано несколько способов создания таких соединений. Синтез непептидных соединений, которые имитируют пептидные последовательности, также известен в данной области. В публикацииEldred et al., J. Med. Chem. 37:3882 (1994) (включенной в данное описание в виде ссылки в полном объеме) описаны непептидные антагонисты, которые имитируют пептидную последовательность. В публикации Likewise, Ku et al., J. Med. Chem. 38:9 (1995) (включенной в данное описание в виде ссылки в полном объеме) дополнительно описан синтез серии таких соединений. После синтеза могут быть осуществлены дополнительные модификации. Например, тканезащитные пептиды могут быть дополнительно химически модифицированы, т.е. карбамилированы, ацетилированы,сукцинилированы и т.д., согласно заявке на выдачу патента США 10/188905, которая опубликована как 20030072737-А 1 17 апреля 2003 г. и описывает химически модифицированный ЕРО, и согласно заявке на выдачу патента США 10/612665, поданной 1 июля 2003 г., и заявке на выдачу патента США 09/753132, поданной 29 декабря 2000 г., которые включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Кроме того, тканезащитные пептиды могут состоять из рекомбинантных тканезащитных пептидовмутеинов. Обнаруженные мутации могут включать замены, делеции, включая внутренние делеции, присоединения, включая присоединения, которые дают слитые белки, или консервативные замены аминокислотных остатков в пределах и/или рядом с аминокислотной последовательностью, которые приводят к "молчащему" изменению, и неконсервативные аминокислотные замены и более крупные инсерции и делеции, которые описаны ранее в PCT/US03/20964, озаглавленной "Recombinant Tissue ProtectiveCells, Tissues, and Organs (которая включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Могут быть осуществлены либо консервативные, либо неконсервативные замены в одном или нескольких аминокислотных остатках. Могут быть осуществлены как консервативные, так и неконсервативные замены. Консервативными заменами являются замены, которые имеют место в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по своим боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты могут быть разделены на четыре семейства: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные= лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные (гидрофобные) = цистеин, аланин, валин, лейцин, изолейцин,пролин, фенилаланин, метионин, триптофан, глицин, тирозин и (4) незаряженные полярные = аспарагин,глутамин, серин, треонин. Неполярные могут быть дополнительно разделены на сильно гидрофобные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин и умеренно гидрофобные = глицин, пролин,цистеин, тирозин, триптофан. Альтернативным образом набор аминокислот можно сгруппировать в следующем виде: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) алифатические = глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, при этом серин и треонин необязательно образуют отдельную группу алифатических, содержащих гидроксил аминокислот; (4) ароматические = фенилаланин, тирозин, триптофан; (5) амидные = аспарагин, глутамин и (6) серосодержащие = цистеин и метионин. (См., например, Biochemistry, 4th ed., Ed. by L. Stryer, W.H. Freeman and Co., 1995,публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Альтернативно мутации могут быть введены случайным образом на протяжении всей или части кодирующей последовательности тканезащитного пептида, например посредством насыщающего мутагенеза, и может быть проведен скрининг полученных в результате мутантов в отношении биологической активности, чтобы идентифицировать мутанты, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый пептид может быть рекомбинантно экспрессирован и может быть определена активность рекомбинантного тканезащитного пептида. В другом варианте тканезащитный пептид может быть дополнительно модифицирован посредством присоединения полимеров (таких как полиэтиленгликоль), сахара или дополнительных белков (например, в слитой конструкции), чтобы попытаться продлить время полужизни тканезащитного пептида и усилить тканезащитное действие пептида. Примеры таких модификаций описаны в WO/04022577 A3 иWO/05025606 A1, которые включены в данное описание в виде ссылки. 5.2. Анализы для тестирования тканезащитных пептидов. 5.2.1. Биологические скрининги или анализы. Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению можно тестировать в отношении тканезащитной активности, например в отношении защиты клеток, тканей или органов. Кроме того, защитные активности могут быть тестированы с использованием анализов in vitro и in vivo. Тесты in vitro, которые являются показателем тканезащитной активности, включают, например, анализы пролиферации клеток, анализы дифференцировки клеток или выявление присутствия белков или нуклеиновых кислот,активность которых подвергается повышающей регуляции тканезащитным рецепторным комплексом,например тканезащитным рецепторным комплексом цитокинов, например нуклеолин, нейроглобин, цитоглобин или фратаксин. Нейроглобин, например, может быть вовлечен в осуществление транспорта или кратковременного хранения кислорода. Поэтому анализы транспорта или хранения кислорода можно использовать в качестве анализа для идентификации или скрининга соединений, которые модулируют тканезащитную активность.- 19015672 Нейроглобин экспрессируется в клетках и тканях центральной нервной системы в ответ на гипоксию или ишемию и может обеспечивать защиту от повреждения (Sun et al. 2001, PNAS, 98:15306-15311;Schmid et al., 2003, J. Biol. Chem. 276:1932-1935, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Цитоглобин может играть сходную роль в защите, но экспрессируется в различных тканях на разных уровнях (Pesce et al., 2002, EMBO, 3:1146-1151, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). В одном варианте осуществления изобретения уровни подвергаемого повышающей регуляции белка в клетке могут быть измерены до и после контактирования тканезащитного пептида с клеткой. В некоторых вариантах присутствие подвергаемого повышающей регуляции белка, связанного с тканезащитной активностью в клетке, можно использовать для подтверждения тканезащитной активности пептида. Нуклеолин может защищать клетки от повреждения. Он играет многочисленные роли в клетках,включая модулирование процессов транскрипции, специфичное для последовательности РНК связывания белка, цитокинеза, нуклеогенеза, сигнальной трансдукции, апоптоза, индуцированного Т-клетками,ремоделирования хроматина или репликации. Он также может функционировать в качестве ДНК/РНКгеликазы рецептора клеточной поверхности, ДНК-зависимой АТФазы, челночного белка, компонента фактора транскрипции или репрессора транскрипции (Srivastava and Pollard, 1999, FASEB J., 13:19111922 и Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112:761-772, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Фратаксин представляет собой белок, который вовлечен в митохондриальный метаболизм железа и который, как было показано ранее, в значительной степени подвергается повышающей регуляции при действии ЕРО как in vivo, так и in vitro (Sturm et al. (2005), Eur. J. Clin. Invest. 35:711, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Экспрессия подвергаемого повышающей регуляции белка может быть выявлена посредством регистрации уровней мРНК, соответствующей белку, в клетке. мРНК можно гибридизовать с зондом, который специфично связывает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, подвергаемый повышающей регуляции. Гибридизация может представлять собой, например, нозерн-блот, саузерн-блот, гибридизацию на матрицах, аффинную хроматографию или гибридизацию in situ. Тканезащитная активность полипептида согласно изобретению также может быть выявлена с использованием анализа нейрозащиты in vitro. Например, первичные культуры нейронов могут быть получены из гиппокампа новорожденных крыс трипсинизацией, и их можно культивировать любым способом, известным в данной области и/или описанным в данной публикации, например в ростовой средеBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 2% добавки В 27 (Invitrogen), 26,2 мМ NaHCO3, 100 ед./мл пенициллина и 1 мг/мл стрептавидина (см., например, Leist et al., 2004, Science. 305:239-242, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Через 1 день после посева добавляют 1 мкМ цитозинарабинофуранозида. Затем 13-дневные культуры предварительно инкубируют с возрастающими дозами ЕРО или СЕРО (3-3000 пМ) в течение 24 ч. На 14-й день среду удаляют и культуры стимулируют 300 мкМ NMDA в PBS при комнатной температуре. Через 5 мин ранее кондиционированную среду возвращают в культуры, и культуры возвращают в инкубатор на 24 ч. Клетки фиксируют в параформальдегиде, красят Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR), затем можно подсчитать конденсированные апоптозные ядра. В качестве позитивных контролей включают NGF (50 нг/мл) и MK801 (1 мкМ). Модельные системы на животных можно использовать для демонстрации тканезащитной активности соединения или для демонстрации безопасности и эффективности соединений, идентифицированными способами скрининга согласно изобретению, описанными выше. Соединения, идентифицированные в анализах, затем можно тестировать в отношении биологической активности, используя модели на животных для представляющего интерес типа повреждения ткани, заболевания, состояния или синдрома. Модели включают животных, созданных так, чтобы они содержали тканезащитный рецепторный комплекс, связанный с функциональной индикаторной системой, таких как трансгенная мышь. Модели на животных, которые можно использовать для тестирования эффективности защитной по отношению к клеткам или тканезащитной активности идентифицированного соединения, включают, например, защиту от появления острого экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ; см. пример 11) у крыс Lewis, восстановление или защиту от понижения когнитивной функции у мышей после получения травмы головного мозга, ишемии головного мозга ("инсульта"; пример 5) или судороги,индуцированной эксцитотоксинами (Brines et al., 2000, PNAS, 97:10295-10672, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме), защиту от индуцированной ишемии сетчатки(Rosenbaum et al., 1997, Vis. Res. 37:3443-51, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме), защиту от повреждения седалищного нерва (см. пример 2) и защиту от ишемическогореперфузионного повреждения сердца (исследования кардиомиоцитов in vitro и ишемическогореперфузионного повреждения in vivo, см., например, Calvillo et al., 2003, PNAS, 100:4802-4806 иFiordaliso et al., 2005, PNAS, 102:2046-2051, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Такие анализы более подробно описаны в Grasso et al. (2004), Med. Sci. Monit.- 20015672 10:BR1-3 или в публикации РСТWO 02/053580, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Описанные способы in vivo направлены на введение ЕРО, однако было показано, что тканезащитные белки, введенные вместо ЕРО, также проявляют сходную биологическую активность, например, Leist et al. (2004), Science, 305:239-242, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Пептиды для тестирования также могут иметь замены. Другие анализы для определения тканезащитной активности пептида хорошо известны специалистам в данной области. 5.2.2. Анализы связывания с клетками. Альтернативно можно использовать анализы связывания клетками для оценки полипептидов согласно изобретению. Например, представляющий интерес тканезащитный пептид может быть связан с биологическим маркером, таким как флуоресцентный или радиоактивный маркер, для облегчения регистрации и затем тестирован в отношении связывания с трансфицированными клетками BaF3, экспрессирующими EPOR и/или с-рецептор. В 96-луночный планшет высевают восемь серийных разведений 1:2 представляющего интерес тканезащитного пептида в среде роста (RPMI 1640, 10% фетальная телячья сыворотка, 1 мМ пируват натрия, 2 мМ L-глютамин), так чтобы конечный объем в каждой лунке составлял около 100 мкл. Исходную линию BaF3 и клетки BaF3, трансфицированные EPOR и/или с-рецептором, можно три раза промыть в среде роста (см. выше), осадки ресуспендировать в среде роста и клетки подсчитать и разбавить в среде роста до концентрации 5000 клеток/100 мкл. Затем добавляют 100 мкл разбавленных клеток к каждому разбавлению пептида. Затем анализируемый планшет инкубируют в инкубаторе при 37 С в течение 3-4 дней. Затем планшет/клетки промывают и планшет считывают в устройстве для регистрации флуоресценции с планшетов или другим подходящим способом, чтобы определить уровень биомаркера, связанного с биологической активностью представляющего интерес тканезащитного пептида. Подобным образом можно использовать конкурентный анализ для определения того, является ли тканезащитный пептид тканезащитным. В конкурентном анализе соединение, известное как тканезащитное, включая без ограничения тканезащитные цитокины, такие как цитокины, описанные в заявках на выдачу патента США 10/188905 и 10/185841 (каждая из которых включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме), могут быть связаны с подходящим биомаркером. В 96-луночный планшет помещают восемь серийных разведений 1:2 известного тканезащитного соединения/биомаркера в подходящей среде роста и такую же серию разведений известного тканезащитного соединения/биомаркера и избыток представляющего интерес тканезащитного пептида. Конечный объем каждого разведения должен составлять около 100 мкл. Затем клетки BaF3 высевают в планшеты,как описано выше, и инкубируют. Через определенный период времени клетки промывают и планшет считывают в устройстве для определения флуоресценции в планшетах или любым другим подходящим способом, известным в данной области для регистрации биомаркера. Если показания для планшетов и/или лунок, содержащих известное тканезащитное соединение/биомаркер и представляющий интерес тканезащитный пептид, меньше, чем показания для планшетов, содержащих только известное тканезащитное соединение/биомаркер, то представляющий интерес тканезащитный пептид является тканезащитным. 5.2.3. Цитокинная активность и активность в пролиферации/дифференцировке клеток. Многие белковые факторы, обнаруженные до настоящего времени, включая все известные цитокины, проявляли активность в одном или нескольких анализах зависимой от факторов пролиферации клеток, и поэтому такие анализы служат для соответствующего подтверждения цитокинной активности. Активность тканезащитного пептида может быть подтверждена любым из ряда обычных анализов зависимой от факторов пролиферации клеток для клеточных линий, включая без ограничения 32D,DA2, DA1G, Т 10, В 9, В 9/11, BaF3, MC9/G, М+(preB M+), 2 Е 8, RB5, DA1, 123, Т 1165, НТ 2, CTLL2, TF-1,Мо 7 е и CMK. Указанные клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тканезащитного пептида и пролиферацию клеток регистрируют, например, измеряя включение меченного тритием тимидина или колориметрическим анализом,основанным на метаболическом расщеплении бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65:55-63,публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). 5.2.4. Другие анализы. Если тканезащитный пептид проявляет тканезащитную активность, то специалисту в данной области будет понятно, что может быть полезной проверка результата с использованием одного из анализов нейрозащиты и защиты ткани, известных специалистам в данной области, таких как, без ограничения,анализы на клетках Р-19 и PC-12. Кроме того, различные модели in vivo, такие как модели на животных,связанные с повреждением спинного мозга, ишемическим инсультом, повреждением периферического нерва, сердца, глаз, почек и т.д., могут быть применимы для дополнительной характеристики тканезащитного пептида. Подходящие анализы in vitro и in vivo описаны в заявках на выдачу патентов США 10/188905 и 10/185841, которые включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.- 21015672 5.3. Терапевтическое применение. Специалисту в данной области будет понятно, что тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению применимы в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики различных заболеваний, расстройств и состояний. Специалисту в данной области также будет понятно, что такие пептиды можно использовать для осуществления модулирования тканезащитного рецепторного комплекса, например тканезащитного цитокинного комплекса. Способы in vitro и in vivo, которые можно использовать для оценки терапевтических показаний для применения соединений, идентифицированных в предлагаемых в изобретении и указанных выше анализах, описаны в заявке РСТPCT/US01/49479,заявках на выдачу патента США 10/188905 и 10/185841, включенных в данное описание в виде ссылки. Указанные выше тканезащитные пептиды согласно изобретению в общем могут быть применимы для профилактики, терапевтического лечения или профилактического лечения заболеваний или расстройств центральной нервной системы или периферической нервной системы человека, при которых главным образом наблюдаются неврологические или психиатрические симптомы, глазных болезней,сердечно-сосудистых заболеваний, сердечно-легочных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почек, мочевой системы и репродуктивной системы, костных болезней, кожных болезней, заболеваний соединительной ткани, желудочно-кишечных заболеваний и эндокринных и метаболических нарушений. Примеры применения включают без ограничения защиту от повреждений и восстановление повреждений, возникающих в результате травмы и приводящих к воспалению головного мозга (ишемический инсульт, тупая травма, субарахноидальное кровоизлияние), спинного мозга (ишемия, травма от удара тупым предметом), периферических нервов (повреждение седалищного нерва, диабетическая нейропатия, синдром карпального канала), сетчатки (отек желтого пятна, диабетическая ретинопатия, глаукома) и сердца (инфаркт миокарда, хроническая сердечная недостаточность). В частности, такие заболевания, расстройства и состояния включают состояния гипоксии, которые неблагоприятно влияют на чувствительные ткани, такие как возбудимые ткани, например ткани центральной нервной системы, ткани периферической нервной системы, или ткани сердца, или ткани сетчатки, такие как, например, ткани головного мозга, сердца или сетчатки/глаза. Поэтому тканезащитные пептиды согласно изобретению могут быть использованы для лечения или профилактики повреждения чувствительной ткани в результате состояний гипоксии при различных состояниях и обстоятельствах. Не ограничивающие примеры таких состояний и обстоятельств указаны в таблице ниже. Тканезащитные полипептиды также представляют интерес для модулирования активности стволовых клеток. Было установлено, что цитокины, проявляющие тканезащитную активность, например ЕРО,способны мобилизовать стволовые клетки, стимулируя миграцию в области повреждения и помогая процессу восстановления, например регенерации. Например, в случае экспериментального инсульта ЕРО опосредует миграцию нейробластов в область ишемического повреждения с регенерацией нейронов в ходе восстановительного периода (Tsai et al., J. Neurosci (2006), 26:1269-74, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). В качестве другого примера ЕРО и СЕРО мобилизуют эндотелиальные клетки-предшественники из костного мозга в кровообращение. Затем происходит хоминг указанных клеток в отдаленных областях, и они участвуют в образовании новых кровеносных сосудов (эффект ЕРО см. Bahlmann et al., 2003, Kidney Int. 64:1648-1652, публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Не имея намерения быть связанными с какой-либо конкретной теорией, авторы полагают, что изолированные полипептиды, охарактеризованные в данном описании, оказывают подобное влияние на миграцию стволовых клеток. В примере защиты от патологий нервной ткани, которые можно лечить и предотвращать с использованием тканезащитных пептидов согласно изобретению, такие патологии включают патологии, которые возникают в результате пониженной оксигенации нервных тканей. Любое состояние, которое уменьшает доступность кислорода в нервную ткань, приводящее к стрессу, повреждению и, наконец,гибели нервных клеток, можно лечить с применением тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. В общем называемые гипоксией и/или ишемией такие состояния возникают в результате или включают без ограничения инсульт, окклюзию сосудов, пренатальную или постнатальную кислородную недостаточность, удушье, асфиксию, клиническую смерть, отравление оксидом углерода, вдыхание дыма, травму, включая хирургическую операцию и лучевую терапию, асфиксию, эпилепсию, гипогликемию, хроническое обструктивное легочное заболевание, эмфизему, респираторный дистресссиндром взрослых, гипотензивный шок, септический шок, анафилактический шок, инсулиновый шок,серповидноклеточный кризис, остановку сердца, аритмию, азотный наркоз и неврологические расстройства, вызванные процедурой искусственного кровообращения. В одном варианте, например, тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению, идентифицированные с использованием предложенного в изобретении анализа, могут быть введены отдельно или в виде части композиции для профилактики травмы или повреждения ткани в случае существования риска травмы или повреждения ткани перед, во время или после хирургической операции или медицинской процедуры. Например, хирургические операции могут включать резекцию опухоли или реконструкцию при аневризме, и медицинские процедуры могут включать роды или родоразрешение. Другие патологии, вызванные или возникающие в результате гипогликемии, которые можно лечить с примене- 22015672 нием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению, включают передозировку инсулина,также называемую ятрогенной гиперинсулинемией, инсулиному, недостаточность гормона роста, гипокортицизм, передозировку лекарственных средств и некоторые опухоли. Другие патологии, возникающие в результате повреждения возбудимой нервной ткани, включают судорожные расстройства, такие как эпилепсия, конвульсии или хронические судорожные расстройства. Другие состояния и заболевания, которые можно лечить, включают без ограничения такие заболевания,как инсульт, рассеянный склероз, гипотонию, остановку сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травму головного или спинного мозга, связанную со СПИДом деменцию,возрастную потерю когнитивной функции, потерю памяти, боковой амиотрофический склероз, судорожные расстройства, алкоголизм, ишемию сетчатки, повреждение зрительного нерва в результате глаукомы и гибель нейронов. Специфичные тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или профилактики воспаления в результате патологических состояний или различных травм,например физически или химически индуцированного воспаления. Также предполагается применение тканезащитных пептидов для лечения и профилактики воспалительных состояний в одном или нескольких органах или тканях, включая без ограничения головной мозг, спинной мозг, соединительную ткань,сердце, легкое, почки и мочевыводящие пути, поджелудочную железу, глаза и простату. Не ограничивающие примеры такой травмы включают тендинит, ангиит, хронический бронхит, панкреатит, остеомиелит, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, неврит зрительного нерва, височный артериит, энцефалит, менингит, поперечный миелит, дерматомиозит, полимиозит, некротизирующий фасцит, гепатит и некротизирующий энтероколит. Кроме того, тканезащитные цитокины можно применять для лечения или профилактики воспаления, возникающего в результате ишемических и неишемических состояний,включая без ограничения аллергии, ревматические заболевания, спортивные тренировки, инфекции,включая вирусные, грибковые и бактериальные. Воспаление может быть острым или хроническим. Дополнительные применения в области воспаления указаны в заявке PCT/US2004/031789, поданной 29 сентября 2004 г. и опубликованной как WO 2005/032467, которая включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Специфичные тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения заболеваний центральной нервной системы и периферической нервной системы, возникающих в результате демиелинизации или повреждения миелиновой оболочки. Такие заболевания главным образом определяют как заболевания, в которые вовлечены воспалительные повреждения миелиновой оболочки неизвестного происхождения, за исключением заболеваний, связанных с недостаточностью миелинизации, таких как лейкодистрофия, и заболеваний вследствие очевидных причин. Рассеянный склероз (MS) является типичным заболеванием в группе демиелинизирующих заболеваний и патологически характеризуется изменениями, в основном, воспалительной демиелинизацией и глиозом. Так его этиология неизвестна, то диагноз осуществляют на основе клинических признаков, т.е. разнообразными в пространственном и временном отношении повреждениями центральной нервной системы. Кроме того, к демиелинизирующим заболеваниям относятся острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM),воспалительный диффузный склероз, острый и подострый некротизирующий геморрагический энцефаломиелит и поперечный миелит. Также сохранение миелиновой оболочки периферических нервов основано на Шванновских клетках, и повреждение таких клеток вызывает периферическое демиелинизирующее заболевание. Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или профилактики состояний и повреждения сердца, включая любое хроническое или острое патологическое явление, в которое вовлечено сердце и/или связанные с ним ткани (например, перикард, аорта и другие связанные кровеносные сосуды), включая ишемическое-реперфузионное повреждение; застойную сердечную недостаточность; остановку сердца; инфаркт миокарда; атеросклероз, нарушение герметичности митрального клапана, трепетание предсердий, кардиотоксичность, вызванную соединениями, такими как лекарственные средства (например, доксорубицин, герцептин, тиоридазин и цизаприд); повреждение сердца вследствие паразитарной инфекции (бактериями, грибами, риккетсиями и вирусами, например сифилис, хроническая инфекция Trypanosoma cruzi); молниеносный амилоидоз сердца; операцию на сердце; трансплантацию сердца; ангиопластику, лапароскопическую операцию, повреждение сердца в результате травмы (например, проникающее или тупое повреждение сердца и разрыв клапанов аорты),хирургическое восстановление аневризмы грудной аорты; аневризму надпочечниковой артерии; кардиогенный шок вследствие инфаркта миокарда или сердечной недостаточности; нейрогенный шок и анафилаксию. Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению также можно применять для лечения людей, для которых существует риск болезни сердца, такой как сердечная недостаточность (т.е. когда сердце не способно перекачивать кровь со скоростью, необходимой для метаболизирующих тканей,или когда сердце может выполнять эту задачу только при повышенном давлении наполнения). К таким пациентам группы риска могут относиться пациенты, имеющие инфаркт миокарда, или для которых существует риск развития инфаркта миокарда, имеющие болезнь коронарных артерий, миокардит, химиотерапию, кардиомиопатию, гипертонию, порок клапана сердца (наиболее часто митральную недостаточ- 23015672 ность и стеноз устья аорты) и индуцированную токсинами кардиомиопатию (например, этанолом, кокаином и т.д.) и т.п. Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или профилактики состояний и повреждения глаз, например ткани сетчатки. Такие расстройства включают без ограничения ишемию сетчатки, дегенерацию желтого пятна, отслоение сетчатки, пигментную дегенерацию сетчатки, артериосклеротическую ретинопатию, гипертензивную ретинопатию, закупорку артерии сетчатки, закупорку вены сетчатки, гипотензию и диабетическую ретинопатию. В другом варианте тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению и принципы осуществления изобретения можно применять для профилактики или лечения повреждения, возникающего в результате повреждения чувствительной ткани облучением. Дополнительным применением тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению является лечение отравления, такого как отравление нейротоксинами (например, отравление домоевой кислотой моллюсков), токсинами (этанолом, кокаином и т.д.), также как в результате воздействия химиотерапевтических средств и облучения; нейролатиризма; болезни Гуама; бокового амиотрофического склероза и болезни Паркинсона. Как указано выше, настоящее изобретение также относится к тканезащитным пептидам согласно настоящему изобретению для применения при усилении функции ткани в случае отвечающих клеток,тканей и органов млекопитающего посредством периферического введения тканезащитного цитокина,который описан выше. Различные заболевания и состояния поддаются лечению с применением указанного способа. Например, данный способ применим для усиления функции возбудимых тканей, приводящего к повышению когнитивной функции даже в отсутствие какого-либо состояния или заболевания. Кроме того, тканезащитные цитокины применимы для улучшения качества заживления ран, уменьшения времени, необходимого для заживления, улучшения качества излеченных тканей и уменьшения частоты образования рубцов в результате ранения. См. заявку PCT/US2004/031789, поданную 29 сентября 2004 г. и опубликованную как WO 2005/032467, которая включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Указанные применения согласно настоящему изобретению более подробно описаны ниже и включают улучшение обучения и тренировки как у человека, так и у млекопитающих, отличных от человека. Состояния и заболевания, которые можно лечить или предотвращать с использованием тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению, направленных на центральную нервную систему,включают без ограничения расстройства настроения, тревожные расстройства, депрессию, аутизм, гиперактивное расстройство с дефицитом внимания и когнитивную дисфункцию. При указанных состояниях полезно усиление функции нейронов. Другие расстройства, которые можно лечить согласно инструкциям, предлагаемым в настоящем изобретении, включают нарушение сна, например апноэ во сне, и расстройства, связанные с путешествиями; субарахноидальное кровоизлияние и кровоизлияние при аневризмах, гипотонический шок, повреждение при ударе, септический шок, анафилактический шок и осложнения при различных энцефалитидах и менингитидах, например, связанные с заболеванием соединительной ткани церебриты, например волчанку. Другие применения включают профилактику или защиту от отравления нейротоксинами, такого как отравление домоевой кислотой моллюсков, нейролатиризма и болезни Гуама, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона; для послеоперационного лечения эмболического или ишемического повреждения; облучения всего головного мозга; серповидноклеточного кризиса и эклампсии. Следующая группа состояний, которые можно лечить или предотвращать с применением тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению, включает митохондриальную дисфункцию либо наследственной природы, либо приобретенную, которая является причиной множества неврологических болезней, характеризуемых повреждением и гибелью нейронов. Например, болезнь Лейга (подострая некротизирующая энцефалопатия) характеризуется прогрессирующей потерей зрения и энцефалопатией вследствие утраты нейронов и миопатии. В таких случаях нарушенный метаболизм в митохондриях не может поставлять достаточно высокоэнергетические субстраты для подпитки метаболизма возбудимых клеток. Тканезащитный пептид оптимизирует поврежденную функцию при различных митохондриальных заболеваниях. Как указано выше, состояния гипоксии неблагоприятно влияют на возбудимые ткани. Возбудимые ткани включают без ограничения ткань центральной нервной системы, ткань периферической нервной системы и ткань сердца. Кроме описанных выше состояний, тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению применимы для лечения ингаляционного отравления, такого как вдыхание оксида углерода и дыма, тяжелой астмы, респираторного дистресс-синдрома взрослых и удушья, и клинической смерти. Кроме состояний, которые создают условия гипоксии, или другими путями индуцируют чувствительную ткань, например возбудимую ткань, повреждение включает гипогликемию, которая может возникать при введении несоответствующих доз инсулина или в случае продуцирующих инсулин неоплазм (инсулиномы). Различные нейропсихологические расстройства, которые, как описано, возникают в результате повреждения возбудимой ткани, можно лечить с применением тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению. Хронические расстройства, в которые вовлечено повреждение нейронов и лечение или профилактика которых предлагается в настоящем изобретении, включают расстройства, связанные с- 24015672 центральной нервной системой и/или периферической нервной системой, включая возрастную потерю когнитивной функции и старческую деменцию, хронические судорожные расстройства, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию, потерю памяти, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вильсона, церебральный и прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Гуама, деменцию с тельцами Леви, прионные болезни, такую как губчатая энцефалопатия, например болезнь Якоба-Крейтцфельдта, болезнь Хантингтона, миотоническую дистрофию,атаксию Фрейдриха и другие атаксии, а также синдром Жиль де ля Туретта, судорожные расстройства,такие как эпилепсия и хроническое судорожное расстройство, инсульт, травму головного мозга или спинного мозга, связанную со СПИДом деменцию, алкоголизм, аутизм, ишемию сетчатки, глаукому,расстройства автономной функции, такие как гипертония и расстройства сна, и нейропсихиатрические расстройства, которые включают без ограничения шизофрению, шизофреноподобное аффективное расстройство, расстройство с дефицитом внимания, дистимическое расстройство, глубокое депрессивное расстройство, манию, обсессивно-компульсивное расстройство, расстройства вследствие применения психоактивных веществ, тревожность, паническое расстройство, а также монополярные и биполярные аффективные расстройства. Дополнительные нейропсихиатрические и нейродегенеративные расстройства включают, например, расстройства, перечисленные в American Psychiatric Association's Diagnosticand Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), самая последняя версия которого включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Следующая группа состояний, которые можно лечить или предотвращать с применением тканезащитных пептидов согласно настоящему изобретению, включает заболевания почек, такие как почечная недостаточность, острая и хроническая. Кровоснабжение почек может быть прервано вследствие нескольких причин, включая шок в результате инфекций, проникающих в кровоток (сепсис), внутренние или наружное кровотечение, потерю жидкости организмом в результате тяжелой диареи или ожогов,реакции на трансфузии, остановку сердца или аритмии, хирургическую травму и трансплантации почек. Уменьшенный поток крови в почки, возникающий в результате указанных выше состояний, может уменьшать поток крови до опасно низких уровней в течение достаточно большого периода времени, чтобы вызвать развитие острой почечной недостаточности. Пониженный поток крови также приводит к некрозу или гибели ткани в почке, повреждая почечные тубулярные клетки. Почечная недостаточность также может возникать в результате заболеваний (интерстициальных и диабетических) нефротических синдромов, инфекций, повреждения (СРВ-индуцированного), токсинов (индуцированная контрастными веществами, индуцированная химиотерапией, циклоспорином), аутоиммунного воспаления (например,волчанки, эритроза и т.д.). Тканезащитные пептиды согласно настоящему изобретению способствуют восстановлению или предотвращению такого повреждения, помогая уменьшить острую почечную недостаточность. В следующей таблице перечислены дополнительные иллюстративные не ограничивающие показания в отношении различных состояний и заболеваний, поддающихся лечению указанными выше тканезащитными пептидами.