Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител

ИММУНОГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ СКЛЕРОСТИНА (SOST), ИНДУЦИРУЮЩИЕ ОБРАЗОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ Обеспечены композиции и способы, имеющие отношение к антителам, которые специфически связываются с TGF-бета-связывающими белками. Эти способы и композиции имеют отношение к изменению минеральной плотности кости путем нарушения взаимодействия между TGF-бетасвязывающим белком склеростином и членом TGF-бета-суперсемейства, в частности, костным морфогенетическим белком. Увеличение минеральной плотности кости имеет применение при заболеваниях и состояниях, в которых низкая минеральная плотность кости характеризуется для такого состояния, как остеопения, остеопороз и переломы кости. 015166 Данное изобретение относится, в общем, к фармацевтическим продуктам и способам и, более конкретно, к способам и специфичным в отношении склеротина антителам, пригодным для увеличения минерального содержания кости. Такие композиции и способы могут быть использованы для лечения большого разнообразия состояний, в том числе, например, остеопении, остеопороза, переломов и других нарушений, в которых отличительным признаком заболевания является низкая минеральная плотность кости. Уровень техники Две или три отличающиеся фазы изменений костной массы встречаются на протяжении жизни индивидуума (см. Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991). Первая фаза имеет место как у мужчин, так и у женщин и протекает для приобретения максимальной костной массы. Эта первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых пластинок роста и радиального роста вследствие скорости периостеального присоединения новых слоев (утолщения надкостницы). Вторая фаза начинается в возрасте около 30 лет для губчатой кости (плоских костей, таких как позвонки и таз) и в возрасте около 40 лет для кортикального слоя кости (например, длинных костей, находящихся в конечностях) и продолжается до старости. Эта фаза характеризуется медленным разрежением кости и встречается как у мужчин, так и у женщин. У женщин встречается также третья фаза разрежения кости, наиболее вероятно, обусловленная постклимактерической недостаточностью эстрогена. Во время только этой фазы женщины могут терять дополнительные 10% костной массы из кортикального слоя кости и 25% из губчатого компартмента (см.Riggs, supra). Потеря минерального содержания кости может быть обусловлена большим разнообразием состояний и может быть результатом существенных медицинских проблем. Например, остеопороз является истощающим заболеванием у людей, характеризующимся заметными уменьшениями скелетной костной массы и минеральной плотности, структурным разрушением кости, включающим деградацию микроархитектуры кости и соответствующие увеличения хрупкости кости и подверженности к перелому у пораженных индивидуумов. Остеопорозу у людей предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более чем на одно стандартное отклонение, но менее чем на 2,5 стандартных отклонений ниже средней величины для кости молодого взрослого человека), состояние, обнаруживаемое у приблизительно 25 миллионов людей в Соединенных Штатах. Другие 7-8 миллионов пациентов в Соединенных Штатах диагностированы как имеющие клинический остеопороз (определяемый как минеральное содержание кости, которое более чем на 2,5 стандартных отклонений ниже минерального содержания кости зрелой кости молодого взрослого человека). Остеопороз является одним из требующих наибольших расходов заболеваний для системы здравоохранения, стоящим десятков миллиардов долларов ежегодно в Соединенных Штатах. Кроме связанных с медико-санитарной помощью расходов долгосрочное врачебное обслуживание и потерянные рабочие дни увеличивают финансовую и социальную стоимость этого заболевания. Во всем мире приблизительно 75 миллионов людей находятся при риске остеопороза. Частота встречаемости остеопороза у населения увеличивается с возрастом и среди членов ИндоЕвропейской группы населения остеопороз является преобладающим у женщин (которые составляют 80% пула пациентов с остеопорозом в Соединенных Штатах). Увеличенная хрупкость и подверженность к перелому скелетных костей у пожилых людей усугубляется увеличением риска случайных падений в этой популяции. Более 1,5 миллионов связанных с остеопорозом переломов костей сообщаются каждый год в Соединенных Штатах. Переломы тазобедренных суставов, кистей и позвонков находятся среди наиболее частых повреждений, связанных с остеопорозом. Переломы тазобедренных суставов, в частности, являются крайне неудобными и дорогими для пациента, а для женщин коррелируют с высокими коэффициентами смертности и болезненности. Хотя остеопороз определяется как увеличение риска перелома вследствие уменьшения костной массы, ни одно из доступных в настоящее время лечений для скелетных нарушений, по существу, не может увеличивать плотность кости у взрослых. Все врачи хорошо понимают, что необходимы лекарственные средства, которые могли бы увеличивать плотность костей у взрослых, в частности костей кисти,позвоночника и тазобедренного сустава, которые находятся при риске в случае остеопении и остеопороза. Существующие стратегии для предупреждения остеопороза могут предоставить некоторую пользу для индивидуумов, но не могут гарантировать освобождение от этого заболевания. Эти стратегии включают снижение физической активности (в частности, активностей, приводящих к увеличению массы) с достижением старости, включение достаточного количества кальция в пищевой рацион и избегание потребления продуктов, содержащих алкоголь или табак. Для пациентов, обнаруживающих клиническую остеопению или остеопороз, все существующие терапевтические лекарственные средства и стратегии направлены на уменьшение дополнительной потери костной массы ингибированием процесса резорбции костей, природного компонента процесса ремоделирования, который встречается конститутивно. Например, в настоящее время для замедления потери костной массы прописывают эстроген. Однако, имеется некоторая полемика относительно того, имеется ли долгосрочная польза для пациентов и имеется ли какой-то эффект вообще в случае пациентов в возрасте более 75 лет. Кроме того, считается,-1 015166 что применение эстрогена увеличивает риск рака молочной железы и эндометрия. Кальцитонин, остеокальцин с витамином К или высокие дозы пищевого кальция, с витамином К или без витамина К также предлагаются для постклимактерических женщин. Однако высокие дозы кальция могут часто иметь неприятные побочные желудочно-кишечные эффекты, и постоянно должен проводиться мониторинг уровней кальция в сыворотке и моче (см. Khosla and Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995). Другие терапевтические вещества, которые были предложены, включают бисфосфонаты (например,Fosamax, Actonel, Bonviva, Zometa, олпадронат, неридронат, скелид, бонефос), паратиреоидный гормон, кальцилитики, кальцимиметики (например, цинакальцет), статины, анаболические стероиды,соли лантана и стронция и фторид натрия. Однако такие терапевтическиие вещества имеют нежелательные, побочные действия (например, кальцитонин и стероиды могут вызывать тошноту и провоцировать иммунную реакцию, бисфосфонаты и фторид натрия могут ингибировать репарацию переломов, даже при умеренном увеличении плотности костей), которые могут предотвращать их применение (см. Khoslaand Riggs, supra). Ни одна практикуемая в настоящее время терапевтическая стратегия для лечения состояния, связанного с избыточной или недостаточной минерализацией кости, такого как остеопороз или другие заболевания, характеризующиеся потерей минерализации кости, не включает лекарственное средство, которое изменяет (т.е. увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) костную массу. В частности, ни одна существующая стратегия не стимулирует или не усиливает терапевтически рост новой костной массы. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения минерализации кости и, следовательно, могут быть использованы для лечения широкого разнообразия состояний, при которых желательным является увеличение костной массы. Кроме того, данное изобретение обеспечивает другие, связанные с этим преимущества. Сущность изобретения Вкратце, данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с TGFбета-связывающим белком, склеростином (SOST), и обеспечивает иммуногены, содержащие пептидыSOST, произведенные из районов SOST, которые взаимодействуют с членом TGF-бета-суперсемейства,таким как костный морфогенетический белок. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается специфически с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептидаSOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.NM004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ IDNO:79), и где сайт связывания рецептора типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора Типа II BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Асе.NO:84) или NM001204 (SEQ ID NO:82). В конкретном варианте осуществления данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются специфически с полипептидом, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2-6, 12-15, 21, 22, 25, 26, 47, 48, 49 или 50,и в других конкретных вариантах осуществления это антитело связывается специфически с полипептидом, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, 6 или 14. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые продуцируются иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2-19, 21-28 или 47-50, где это антитело связывается специфически с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP (представленным в любой из последовательностей GenBank, обеспеченных здесь), и где сайт связывания рецептора типа IIBMP способен связываться с полипептидом рецептора типа II BMP (представленным в любой из последовательностей GenBank, обеспеченных здесь). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело продуцируется иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 или 18. Данное изобретение обеспечивает дополнительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент,которые связываются специфически с полипептидом SOST и которые нарушают образование гомодимера SOST, где этот полипептид SOST включает аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело связывается с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29-31,33-36, 41-43 или 51-54. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые получают иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом из по меньшей мере 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29-46, 51, 52, 53 или 54, где это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются специфически с полипептидом SOST, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело нарушает образование гомодимера SOST. В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения это антитело является поликлональным антителом. В других вариантах осуществления это антитело является моноклональным антителом, которое является моноклональным антителом мыши, человека, крысы или хомячка. Данное изобретение обеспечивает также гибридомную клетку или клетку-хозяина, которая способна продуцировать моноклональное антитело. В других вариантах осуществления данного изобретения это антитело является гуманизированным антителом или химерным антителом. Данное изобретение обеспечивает дополнительно клетку-хозяина, которая продуцирует гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела является фрагментом F(ab')2,Fab', Fab, Fd или Fv. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое является одноцепочечным антителом, и обеспечивает клетку-хозяина, которая способна экспрессировать это одноцепочечное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую такие антитела и физиологически приемлемый носитель. Данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид, включающий 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Асе.NM004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM001203 (SEQ IDID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:79), и где сайт связывания рецептора типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа II BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Асе.U25110 (SEQ ID NO:80); NM033346(SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84) или NM001204 (SEQ ID NO:82). В другом варианте осуществления иммуноген содержит пептид, включающий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST,включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое конкурентно ингибирует связывание этого полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP (представленным в любой из последовательностей GenBank, обеспеченных здесь), и где сайт связывания рецептора типа IIBMP способен связываться с полипептидом рецептора типа II BMP (представленным в любой из последовательностей GenBank, обеспеченных здесь). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид из по меньшей мере 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2-19, 21-28, 47, 48, 49 или 50, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58,60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и(ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность,представленную в GenBank Acc.NM 004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM001203NP001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:79), и где сайт связывания рецептора типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа II BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.U25110 (SEQ IDNM001204 (SEQ ID NO:82). В конкретном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает-3 015166 иммуноген, включающий пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот,включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 или 18. Данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:29-46, 51, 52, 53 или 54, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело нарушает образование гомодимера SOST. В другом варианте осуществления иммуноген содержит пептид, включающий 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое нарушает образование гомодимера SOST. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, который содержит пептид, включающий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое нарушает образование гомодимера SOST. В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногены рассматриваемого изобретения связаны с молекулой-носителем. В некоторых вариантах осуществления молекула-носитель является полипептидом-носителем и, в конкретных вариантах осуществления, этот полипептид-носитель является гемоцианином фиссуреллы. Данное изобретение обеспечивает также способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, содержащим пептид из 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот или по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, который способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое конкурентно ингибирует связывание полипептидаSOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.NM004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ IDID NO:76); NP001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:79), и где сайт связывания рецептора типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа IINM001204 (SEQ ID NO:82). В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2-19, 21-28, 47, 48 или 50, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора типа II BMP, где сайт связывания рецептора типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP. В конкретном варианте осуществления этот иммуноген содержит пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 или 18. В других предпочтительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид из 6, 7, 8, 9,10, 11 или 12 последовательных аминокислот или по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, имеющего последовательность,представленную в SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, который способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое способно нарушать образование гомодимера SOST. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST,предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29-46, 51, 52, 53 или 54, где этот пептид способен индуцировать в-4 015166 животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидомSOST и нарушает образование гомодимера SOST. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, по меньшей мере с одним пептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2-19 или 21-54, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид SOST; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид SOST и посредством этого детектирование присутствия антитела,которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое нарушает связывание BMP с полипептидомSOST, предусматривающий контактирование (i) антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ IDNO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ii) по меньшей мере одним пептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2-19, 21-28 или 47-50, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид SOST; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид SOST и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое нарушает связывание BMP с полипептидом SOST. В конкретных вариантах осуществления обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета, и идентификации антитела, которое нарушает связывание BMP с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 или 18. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое нарушает образование гомодимера SOST, предусматривающий контактирование (i) антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ii) по меньшей мере одним пептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29-46 или 51-54,при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид SOST; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид SOST и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое нарушает образование гомодимера SOST. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости, предусматривающий контактирование (i) антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ii) по меньшей мере одним пептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2-19 или 21-54,при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид SOST; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид SOST и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости. В конкретном варианте осуществления этот пептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, 6, 10,11, 14 или 18. В некоторых конкретных вариантах осуществления для идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета, для идентификации антитела, которое нарушает связывание BMP с полипептидом SOST, или для идентификации антитела, которое нарушает образование гомодимераSOST, для идентификации антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости, это антитело присутствует в биологической пробе, или это антитело является очищенным антителом. В некоторых вариантах осуществления это очищенное антитело является поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом или антигенсвязывающим фрагментом любого из этих антител. Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидными после ссылки на следующее подробное описание и сопутствующие фигуры. Все ссылки, описанные здесь, включены тем самым в качестве ссылок в их полном виде, как если бы каждая была включена индивидуально. Краткое описание графического материала Фиг. 1 представляет выравнивание района, содержащего характерный цистиновый узел, полипептида SOST и его ближайших гомологов. Три дисульфидные связи, которые образуют цистиновый узел,проиллюстрированы жирными линиями. Дополнительная дисульфидная связь, показанная пунктирной линией, является уникальной для этого семейства и соединяет концы двух -шпилек в этой 3Dструктуре. Изображенные полипептиды являются: SOST: склеростин (SEQ ID NO:95); CGHB: Хорионический Гонадотропинчеловека (SEQ ID NO:96); FSHB: бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона (SEQ ID NO:97); TSHB: предшественник бета-цепи тиротропина (SEQ ID NO:98); VWF: фактор фон Виллебранда (SEQ ID NO:99); MUC2: предшественник муцина 2 человека (SEQ ID NO:100); СЕ R1:NO:103); CTGF: предшественник фактора роста соединительной ткани (SEQ ID NO:104); NOV: NovH(гомолог белка сверхэкспрессируемого гена нефробластомы) (SEQ ID NO:105); CYR6: (SEQ ID NO:106). Фиг. 2 иллюстрирует 3D-модель внутреннего района (кора) SOST (SOSTCore). Фиг. 3 представляет 30-модель внутреннего района (кора) гомодимера SOST. Фиг. 4 А и 4 В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей Noggin из пяти различных животных: человека (NOGGHUMAN (SEQ ID NO:107); курицы (NOGGCHICK, SEQ IDNO:108); Африканской шпорцевой лягушки (NOGGXENLA, SEQ ID NO:109); NOGGFUGRU, SEQ IDID NO:1), крысы (SOSTRAT, SEQ ID NO:20) и мыши (SOSTMouse, SEQ ID NO:112). Фиг. 5 иллюстрирует структуру комплекса Noggin/BMP-7. Гомодимер BMP показан на нижней части этой фигуры поверхностным способом. Гомодимер Noggin показан на верхней части димера BMP в виде "огрубленного" изображения. Круги очерчивают N-концевой связывающий район, внутренний (коровый) район и линкер между N-концевым и коровым районами. Фиг. 6 изображает 3D-модель потенциального ВМР-связывающего фрагмента, локализованного вN-концевом районе SOST. Димер BMP показан поверхностным способом, а потенциальный BMPсвязывающий фрагмент показан способом "послеизображения". Отмечен остаток фенилаланина, соответствующий гидрофобному карману на поверхности BMP. Подробное описание изобретения Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с полипептидомSOST, и способы применения таких антител. Данное изобретение обеспечивает также иммуногены полипептида SOST, которые могут быть использованы для генерирования и анализа этих антител. Эти антитела могут быть применимы для блокирования или нарушения связывания полипептида SOST, который является TGF-бета-связывающим белком, с лигандом, в частности костным морфогенетическим белком, и могут также блокировать или нарушать связывание полипептида SOST с одним или несколькими другими лигандами. Данное изобретение относится частично к неожиданному открытию в последовательности полипептида склеростина специфических коротких пептидных последовательностей, которые специфически узнаются антителами против склеростина, способными конкурентно ингибировать связывание полипептидов склеростина с BMP, где такое связывание склеростин-ВМР в другом случае происходило бы через сайт связывания рецептора типа I BMP и/или сайт связывания рецептора типа II BMP. Должно быть понятно, что такая молекула, как антитело, которая ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами TGF-бета-семейства белков, в том числе, одним или несколькими костными морфогенетическими белками (BMP), включает, например, молекулу, которая делает возможным активацию члена TGF-бета-семейства или BMP или делает возможным связывание членов TGFбета-семейства, в том числе, одного или нескольких BMP, с их соответствующими рецепторами посредством удаления члена TGF-бета-семейства или предотвращения связывания члена TGF-бета-семейства сTGF-бета-связывающим белком. Данное изобретение обеспечивает также пептидные или полипептидные иммуногены, которые, неожиданно, могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител и/или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать (например, уменьшать статистически значимым образом) связывание TGF-бета-связывающего белка SOST с одним или несколькимиBMP. Примерные пептидные иммуногены могут включать 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20-25, 21-50, 26-30, 31-40,41-50, 51-60, 61-70 или 71-75 последовательных аминокислот полипептида склеростина, обеспеченного здесь (или его варианта), причем такие пептиды включают, например, аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:2-19, 21-53 и 54. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител и их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать образование гомодимеров SOST. Антитела данного изобретения применимы для увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости, для облегчения таким образом многочисленных состояний,которые приводят в потере минерального содержания кости, включающих, например, заболевание, генетическую предрасположенность, несчастные случаи, которые приводят к прекращению использования кости (например, вследствие перелома), применение терапевтических веществ, которые влияют на резорбцию кости, или которые убивают костеобразующие клетки, и нормальное старение. Склеростеоз Склеростеоз является заболеванием, связанным с атипичной минеральной плотностью кости у людей. Склеростеоз является термином, который применялся Hansen (Hansen, H.G., Sklerosteose, in: Opitz,H.; Schmidt, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. В настоящее время известно, что склеростеоз является аутосомным полудоминантным нарушением, которое характеризуется широко диссеминированными склеротическими повреждениями кости у взрослого человека. Это состояние является прогрессирующим. Склеростеоз имеет также связанный с развитием аспект, который-6 015166 связан с синдактилией (два или более пальцев слиты вместе). Синдром склеростеоза ассоциирован с высоким ростом и многие пораженные индивидуумы достигают высоты шесть или более футов. Минеральное содержание кости гомозигот может быть в 1-6 раз большим, чем наблюдаемое у нормальных индивидуумов, и минеральная плотность кости может быть в 1-4 раза выше нормальных величин (например,из непораженных сибсов). Синдром склеростеоза встречается прежде всего у африканцев нидерланского происхождения в Южной Африке. Приблизительно 1/140 индивидуумов в населении Африки являются носителями этого мутированного гена (гетерозиготами). Эта мутация обнаруживает 100% пенетрантность. Имеются невероятные сообщения об увеличенной минеральной плотности кости в гетерозиготах без ассоциированных патологий (синдактилии или разрастания черепа). Отсутствие аномалии системы гипофиз-гипоталамус наблюдали у пациентов со склеростеозом. В частности, по-видимому, нет сверхпродуцирования гормона роста и кортизона и половые гормоны являются нормальными у пораженных индивидуумов. Однако маркеры обновления кости, такие как остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1 (PICP) и общая щелочная фосфатаза; (см. Cornier, С, Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995) показывают, что имеется гиперостеобластическая активность, ассоциированная с этим заболеванием, но имеется нормальная - слегка уменьшенная активность остеокластов, как измерено с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, N-телопептида, гидроксипролина мочи, тартрат-устойчивых кислых фосфатаз плазмы и галактолилгидроксилизина (см. Cornier, supra. Склеростеоз характеризуется непрерывным депонированием минералов кости по всему скелету во время времени жизни пораженных индивидуумов. В гомозиготах непрерывное депонирование минералов кости приводит к разрастанию кости в зонах скелета, в которых отсутствуют механорецепторы (череп, подбородок, мозговой череп). В гомозиготах со склеростеозом разрастание костей черепа приводит к сдавливанию черепа и со временем к смерти вследствие избыточного гидростатического давления на ствол мозга. Во всех других частях скелета имеется генерализованный или диффузный склероз. Кортикальные зоны длинных (трубчатых) костей сильно утолщаются, приводя к существенному увеличению прочности кости. Губчатые соединения увеличиваются по толщине, что, в свою очередь, увеличивает прочность губчатой кости. Склеротические кости, по-видимому, являются непрозрачными для рентгеновских лучей. Редкая генетическая мутация, которая является ответственной за синдром склеростеоза, была обнаружена районе в хромосомы 17 человека. Ген в этом районе кодирует новый член семейства TGF-бетасвязывающих белков (см., например, Патенты США с номерами 6395511, 6489445 и 6495736; Brunkow etal., Am. J. Hum. Genet. 68:577-89 (2001. Таким образом, терапевтические средства, связанные с изменением или модуляцией уровня склеростина, могут быть полезными в лечении состояний и заболеваний,связанных с атипичным развитием или разрушением кости. Как описано более подробно ниже, антитела,которые специфически связываются с TGF-бета-связывающим белком, склеростином (также называемым здесь Beer или SOST), могут быть использованы для увеличения минерального содержания кости и,следовательно, лечения, предупреждения, замедления прогрессирования или ослабления симптомов ряда заболеваний.TGF-бета-суперсемейство. Важные молекулы, на которые здесь делается ссылка, включают любой известный член или новые члены суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета), которое включает костные морфогенетические белки (BMP). В TGF-бета-суперсемейство включены также TGF-бета-рецепторы,которые, как должно быть понятно, являются одним или несколькими рецепторами, которые являются специфическими в отношении конкретного члена TGF-бета-суперсемейства (в том числе BMP), и TGFбета-связывающие белки, которые, как должно быть понятно, являются одним или несколькими полипептидами со специфической связывающей аффинностью в отношении конкретного члена или субпопуляции членов TGF-бета-суперсемейства (в том числе BMP). Конкретный пример TGF-бетасвязывающего белка включает склеростин или SOST. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие SOST и варианты SOST в различных животных, в том числе человеке, обеспечены здесь в SEQID NO:55, 56, 57, 59, 61, 63, 65 и 67 и 69 (кодируемые полипептидные последовательности обеспечены вFamily, Helsinki University Biomedical Dissertations No. 17). Суперсемейство TGF-бета содержит различные факторы роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательности как на вторичном, так и на третичном уровнях. Это семейство белков проявляет широкий спектр биологических реакций, которые влияют на большое разнообразие типов клеток. Многие из членов семейства TGF-бета имеют важные функции во время эмбрионального развития в процессе приобретения упорядоченного распределения и спецификации ткани. У взрослых-7 015166 членов этого семейства участвуют, например, в заживлении ран, репарации и ремоделировании кости и в модуляции иммунной системы. Кроме полипептидов TGF-бета это суперсемейство включает костные морфогенетические белки (BMP), активины, ингибины, факторы роста и дифференцировки (GDF) и нейротрофические факторы глиального происхождения (GDNF). Первичная классификация установлена посредством общих признаков последовательности, которые относят конкретный белок к общему подсемейству. Дополнительное расслоение в этом подсемействе является возможным вследствие более строгой консервации последовательности между членами меньших групп. В некоторых случаях, например, в случае ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7, идентичность аминокислот может быть такой высокой, как 75%, среди членов этой меньшей группы. Этот уровень идентичности позволяет единственной реперезентативной последовательности иллюстрировать ключевые биохимические элементы данной подгруппы, которые выделяют ее из других членов большего семейства. Кристаллическая структура TGF-бета 2 была определена. Общая укладка TGF-бета 2-мономера содержит стабильную, компактную цистеиновую подобную узлу структуру, образованную тремя дисульфидными мостиками. Димеризация, стабилизированная одним дисульфидным мостиком, является антипараллельной. Члены TGF-бета-семейства передают сигналы посредством индукции образования гетероолигомерных комплексов рецепторов типа I и типа II. Трансдукция сигналов TGF-бета включает эти два отличающиеся подсемейства трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов, типа I и типа II. Были идентифицированы по меньшей мере семь рецепторов типа I и пять рецепторов типа II (см. Kawabata etal., Cytokine Growth Factor Rev. 9:49-61 (1998); Miyazono et al., Adv. Immunol. 75:115-57 (2000). Каждый член TGF-бета-семейства связывается с характерной комбинацией рецепторов типа I и типа II, оба из которых являются необходимыми для передачи сигнала. В существующей модели активации рецептораTGF-бета TGF-бета-лиганд сначала связывается с рецептором типа II (TbR-II), который затем рекрутирует рецептор типа I (TbR-I) для образования тройного комплекса лиганд/тип I/тип II. Рецептор типа I не может связывать лиганд в отсутствие TbRII. Затем TbR-II фосфорилирует TbR-I преимущественно в домене, богатом остатками глицина и серина (GS-домене), в расположенном рядом с мембраной районе и тем самым активирует TbR-I. Затем эта активированная киназа рецептора типа I фосфорилирует конкретные члены Smad-семейства белков, которые перемещаются в ядро, где они модулируют транскрипцию специфических генов. Костные морфогенетические белки (BMP): ключевые регуляторные белки минеральной плотности кости Главным успехом в понимании формировании кости была идентификация костных морфогенетических белков (BMP), также известных как остеогенные белки (ОР), которые регулируют дифференцировку хряща и кости in vivo. BMP/OP индуцируют дифференцировку кости через каскад событий, при помощи которых мезенхимальные стволовые клетки дифференцируются в хондроциты, которые образуют структуру хряща, которая реабзорбируется и заменяется костной тканью (см. Balemans et al., Dev. Biol. 250:231-50 (2002. Таким образом, этот процесс включает образование хряща, гипертрофию и кальцификацию хряща, васкулярную инвазию, дифференцировку остеобластов и образование кости. Как описано выше, BMP/OP (BMP 2-14 и остеогенные белки 1 и 2 (ОР-1 и ОР-2) (см., например, GenBank P12643(BMP11, предшественник фактора 11 роста/дифференцировки (GDF-11; GenBank 095972 (BMP15 являются членами суперсемейства TGF-бета. Поразительное эволюционное сохранение между членами подсемейства ВМР/ОР предполагает, что они являются решающими в нормальном развитии и функционировании животных. Кроме постфетального хондрогенеза и остеогенеза ВМР/ОР играют множественные роли в скелетогенезе, в том числе, в развитии черепно-лицевых и зубных тканей. Различные членыBMP-семейства имеют также биологические активности в различных других типах клеток, в том числе моноцитах, эпителиальных клетках, мезенхимальных клетках и нервных клетках. BMP регулируют пролиферацию и дифференцировку, хемотаксис и апоптоз, а также регулируют фундаментальные роли, например, левой-правой асимметрии, нейрогенеза, паттернинга мезодермы и эмбрионального развития и органогенеза ряда органов, в том числе почки, кишечника, легкого, зубов, конечностей, амниона и яичкаBMP синтезируются в виде больших белков-предшественников. После димеризации BMP протеолитически расщепляются в клетке с образованием карбоксиконцевых зрелых белков, которые затем секретируются из клетки. BMP, подобно другим членам семейства TGF-бета, инициируют трансдукцию сигнала связыванием кооперативно с серин/треонинкиназными рецепторами как типа I, так и типа II. Рецепторы типа I, в отношении которых BMP могут действовать в качестве лигандов, включают BMPRIA (также известный как ALK-3), BMPR-IB (также известный как ALK-6), ALK-1 и ALK-2 (также известный как ActR-I). Из рецепторов типа II, BMP связываются с рецептором BMP типа II (BMPR-II), активином типа II (ActR-II) и активином типа IIB (ActR-IIB). (См. Balemans et al., supra и ссылки в этой работе). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность поли-8 015166 пептидов рецептора типа I BMP обеспечены в базе данных GenBank, например GenBank NM004329SEQ ID NO:90). Другие полипептидные последовательности рецепторов типа I обеспечены в базе данныхNO:79). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа II BMP обеспечены в базе данных GenBank, например U25110 (SEQ ID(SEQ ID NO:82, кодируемая SEQ ID NO:93) и Z48923 (SEQ ID NO:83, кодируемая SEQ ID NO:94). Дополнительные полипептидные последовательности рецепторов типа II также обеспечены в базе данныхBMP, сходные с другими имеющими цистиновый узел белками, образуют гомодимерную структуру(Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287:103-15 (1999. В соответствии с анализом эволюционного прослеживания, выполненного на семействе BMP/TGF-, сайт связывания рецептора типа I BMP и сайт связывания рецептора типа II BMP были картированы на поверхности структуры BMP (Innis et al., Protein Eng. 13:839-47 (2000. Местоположение сайта связывания рецептора типа I на BMP было позднее подтверждено рентгеновской структурой комплекса ВМР-2/рецептор IA BMP (Nickel et al., J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1(Pt1:S7-S14 (2001. Предсказанный сайт связывания рецептора типа II хорошо согласуется с рентгеновской структурой комплекса TGF-3/рецептор типа II TGF- (Hart et al., Nat. Struct. Biol. 9:203208 (2002, который имеет большое сходство с системой BMP/рецептор IIA BMP. Подсемейства BMP и активина подвергаются значительной посттрансляционной регуляции TGFбета-связывающими белками. Существует сложная система внеклеточной регуляции, посредством которой синтезируется и экспортируется высокоаффинный антагонист, и затем он образует комплексы селективно с BMP или активинами для разрушения их биологической активности (Smith Trends Genet. 15:3-6(1999. Ряд таких TGF-бета-связывающих белков были идентифицированы и, на основе дивергенции последовательности, эти антагонисты, по-видимому, эволюционировали независимо вследствие отсутствия сохранения первичной последовательности. У позвоночных антагонисты включают ноггин, хордин,хордин-подобный белок, фоллистатин, FSRP, семейство белков DAN/Cerberus и склеростин (SOST) (см.Balemans est al., supra и ссылки в этой работе). Механизм антагонизма, по-видимому, отличается для различных антагонистов (lemura et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 9337-9342). Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на антагонисте BMP ноогине были также картированы. Ноггин связывается с BMP с высокой аффинностью (Zimmerman et al., 1996). Исследование структуры комплекса ноггин/ВМР-7 выявили связывающие взаимодействия между этими двумя белками(Groppe et al., Nature 420:636-42 (2000. Наложение структуры ноггин-ВМР-7 на модель комплекса передачи сигнала BMP показала, что связывание ноггина эффективно маскирует обе пары связывающих эпитопов (т.е. сайтов связывания рецепторов типа I и типа II BMP) на ВМР-7. Последовательности богатого цистеином каркаса ноггина предшествует N-концевой сегмент из приблизительно 20 аминокислотных остатков, который называют "зажимом" ("клипом") (остатки 28-48). Сайт связывания рецептора типа I закрыт N-концевой частью домена-зажима ноггина, а сайт связывания рецептора типа II закрыт карбокси-концевой частью этого домена-зажима. Две -цепи во внутреннем (коровом) районе вблизи С-конца ноггина также контактируют с ВМР-7 при сайте связывания рецептора типа II. Этот способ связывания позволяет димеру ноггина эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (два сайта связывания рецептора типа I и два сайта связывания рецептора типа II) на димере BMP. Полипептиды склеростина и кодирующие полинуклеотиды Антагонист BMP склеростин (патенты США с номерами 6395511, 6489455 и 6495736; см. такжеSEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 и 70) имеет почти идентичный цистеиновый (дисульфидный) каркас при сравнении с белками Human DAN, Human Gremlin и Human Cerberus и SCGF (Патент США 5780263), но почти не имеют гомологии на уровне нуклеотидов (в отношении предшествующей информации см. в основном Hsu et al., Mol. Cell 1:673-683 (1998. Следует также понимать, что склеростин включает варианты этого TGF-бета-связывающего белка. В данном контексте вариантный полинуклеотид TGF-бета-связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность,которая является модификацией (инсерцией, делецией или заменой одного или нескольких нуклеотидов)SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69. Такие варианты включают природно встречающиеся полиморфизмы или аллельные варианты полинуклеотидов, кодирующих TGF-бета-связывающие белки, а также синтетические полинуклеотиды, которые кодируют консервативные аминокислотные замены этих последовательностей аминокислот. Различные критерии, известные специалистам с квалификацией в данной области, показывают, являются ли аминокислоты в конкретном положении в пептиде или полипептиде подобными. Например, подобной аминокислотой или консервативной аминокислотной заменой является замена, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим-9 015166 сходную боковую цепь, причем сходные аминокислоты включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, гистидин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); бетаразветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который, как считается, более трудно классифицировать, имеет общие свойства с аминокислотами, которые имеют алифатические боковые цепи (например, Leu, Val, Ile и Ala). В некоторых обстоятельствах, замена глутамином глутаминой кислоты или аспарагином аспарагиновой кислоты может рассматриваться как сходная замена вследствие того, что глутамин и аспарагин являются амидными производными глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно. Дополнительными вариантными формами полинуклеотида, кодирующего TGF-бета-связывающий белок, являются молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат замены, инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Вариантные или мутантные гены TGF-бета-связывающего белка могут быть сконструированы или идентифицированы таким образом, что измененная версия TGF-бета-связывающего белка конкурирует с TGF-бетасвязывающим белком дикого типа. Такое конкурирование предпочтительно блокировало бы активностьTGF-бета-связывающего белка дикого типа и, следовательно, приводило бы к увеличенной плотности кости. Выделенный полинуклеотид является молекулой нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом или олигонуклеотидом), которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, который не является частью природного окружения. Например, молекула ДНК, которая кодирует TGF-бета-связывающий белок, которая была выделена из геномной ДНК эукариотической клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы ДНК является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты может быть ДНК,кДНК, РНК или молекула, состоящая, по меньшей мере, частично из аналогов нуклеиновых кислот. Вариантные полинуклеотиды TGF-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы определением, гибридизуется ли эти полинуклеотиды с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69, при жестких условиях. Кроме того, вариантные полинуклеотиды TGF-бета-связывающего белка кодируют белок, имеющий цистеиновый скелет молекулы. Вариантные полинуклеотиды TGF-бета-связывающего белка могут быть также идентифицированы сравнением последовательностей. В данном контексте две аминокислотные последовательности имеют "100% идентичность последовательности", если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Подобным образом, две нуклеотидные последовательности имеют "100% идентичность нуклеотидной последовательности", если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнения последовательностей могут выполняться с использованием стандартных программ программного обеспечения, таких как программы, включенные в компьютерный комплект биоинформатики LASERGENE,который производится DNASTAR (Madison, Wisconsin), или алгоритм BLAST, доступный на сайте NCBIweb ([lnternet]:http:www.ncbi.nlm.nih.gov). Другие способы сравнения двух или более нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определением оптимального выравнивания хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Peruski and Peruski, The Internet and theNew Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al., (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology,pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997) и Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998). Вариантный TGF-бета-связывающий белок должен иметь по меньшей мере 50% идентичность аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 и 68 и предпочтительно идентичность, большую чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Альтернативно, варианты TGF-бетасвязывающих белков могут быть идентифицированы по наличию по меньшей мере 70% идентичности нуклеотидной последовательности относительно SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69. Кроме того,данное изобретение предусматривает варианты полинуклеотидов TGF-бета-связывающих белков,имеющие 75, 80, 85, 90 или 95% идентичность относительно SEQ ID NO:55 или 57. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного полинуклеотида TGF-бетасвязывающего белка или варианта TGF-бета-связывающего белка, такой вариант может быть функционально охарактеризован, например, его способностью связываться с выбранным членом TGF-бетасемейства белков и/или ингибировать передачу сигнала выбранного члена TGF-бета-семейства белков или его способностью связываться специфически с антителом против TGF-бета-связывающего белка. В контексте данного изобретения "функциональный фрагмент" полинуклеотида TGF-бета- 10015166 связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептидаTGF-бета-связывающего белка, которая или (1) обладает описанной здесь функциональной активностью,или (2) специфически связывается с антителом против TGF-бета-связывающего белка. Например, функциональный фрагмент полинуклеотида, кодирующего TGF-бета-связывающий белок, описанный здесь,включает часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 76 или 69."Выделенный полипептид" обозначает полипептид, который удален из его природного окружения. Например, природно встречающийся белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех совместно существующих веществ в природной системе, таких как углевод, липид, нуклеиновые кислоты или белковые загрязнители, ассоциированные с этим полипептидом в природе. Предпочтительно такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. Антитела, специфические для TGF-бета-связывающих белков Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с SOST, а также обеспечивает иммуногены полипептида SOST, которые могут быть использованы для генерирования и анализа этих антител, а также обеспечивает способы применения таких антител. Антитела данного изобретения, описанные здесь, специфически связываются с полипептидом SOST и посредством этого блокируют или ингибируют связывание BMP с полипептидом SOST, т.е. предотвращают или нарушают взаимодействие между BMP и SOST. Эффект блокирования этого взаимодействия заключается в изменении (увеличении или уменьшении статистически значимым образом) минеральной плотности кости,предпочтительно увеличении минеральной плотности кости. Полипептиды или пептиды, применимые для иммунизации и/или анализа SOST-специфических антител, могут быть также выбраны посредством анализа первичной, вторичной и третичной структурыTGF-бета-связывающего белка в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области и описанными здесь, для определения аминокислотных последовательностей, которые с большей вероятностью будут генерировать антигенный ответ у животного-хозяина. См., например,Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207 (1991); Berzofsky, Science 229:923-40 (1985. Моделирование и результаты рентгеновской кристаллографии могут быть также использованы для предсказания и/или идентификации, какие части или районы TGF-бета-связывающего белка взаимодействуют с какими частями лиганда TGF-бета-связывающего белка, такого как BMP. Могут быть сконструированы и получены пептидные иммуногены TGF-бета-связывающего белка, которые включают аминокислотные последовательности в частях или районах взаимодействия или окружают части или районы взаимодействия. Эти антитела могут быть использованы для блокирования или нарушения связывания TGF-бета-связывающего белка с тем же самым лигандом и могут также блокировать или нарушать связывание TGF-бетасвязывающего белка с одним или несколькими другими лигандами. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предусматриваемые данным изобретением,включают антитела, которые способны специфически связываться с SOST и конкурентно ингибировать связывание TGF-бета-полипептида, такого ВМР, с SOST. Например, антитела, предусматриваемые данным изобретением, конкурентно ингибируют связывание полипептида SOST с сайтом рецептора типа IBMP на BMP или с сайтом связывания рецептора типа II BMP на BMP или могут конкурентно ингибировать связывание SOST со связывающими сайтами как рецептора типа I, так и рецептора типа II на BMP.He желая связывать себя теорией, авторы изобретения считают, что, когда антитело против SOST конкурентно ингибирует связывание сайтов связывания типа I и/или типа II полипептида BMP с SOST, блокируя таким образом антагонистическую активность SOST, сайты связывания рецептора на BMP являются доступными для связывания рецепторов типа I и типа II, с увеличением посредством этого минерализации кости. Связывающее взаимодействие TGF-бета-связывающего белка, такого как SOST и TGF-бетаполипептид, такой как BMP, обычно имеет место, когда эта пара лигандов образует гомодимер. Таким образом, вместо или в дополнение к использованию антитела, специфического для SOST, для блокирования, нарушения или предотвращения связывания SOST с BMP посредством конкурентного ингибирования связывания SOST с BMP, SOST-специфическое антитело может быть использовано для блокирования или нарушения образования гомодимера SOST. В качестве примера, один димер Noggin человека, который является антагонистом BMP, который способен связываться с BMP с высокой аффинностью (Zimmerman et al., supra), выделяли в комплексе с одним димером ВМР-7 человека и анализировали мультивалентной аномальной дифракцией (MAD)Noggin может эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (сайты связывания рецепторов типа I и типа II) на димере BMP. Определение местоположения аминокислот Noggin, которые контактируют с ВМР-7, может быть использовано в моделировании взаимодействия между другими TGF-бетасвязывающими белками, такими как склеростин (SOST) и BMP, и, следовательно, это будет способствовать конструированию пептидов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антител, которые блокируют или нарушают такое взаимодействие. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий- 11015166 фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом SOST, конкурентно ингибируют связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним или обоими из сайтов: сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и сайтом связывания рецептора типа II BMP, которые расположены на BMP. Эпитопы на SOST, с которыми связываются эти антитела, могут включать в себя или быть включены в смежные аминокислотные последовательности, которые расположены в N-конце полипептида SOST (аминокислоты в положениях приблизительно 1-56 SEQ ID NO:1). Эти полипептиды могут также включать последовательность короткого линкерного пептида, который соединяет этот Nконцевой район с внутренним районом, например полипептиды, представленные в SEQ ID NO:47 (человека) и SEQ ID NO:48 (крысы). Более короткие репрезентативные N-концевые пептидные последовательности SOST человека (например, SEQ ID NO:1) включают SEQ ID NO:2-6, а репрезентативные пептидные последовательности SOST крысы (например, SEQ ID NO:20) включают SEQ ID NO:12-15. Антитела, которые специфически связываются с полипептидом SOST и блокируют или конкурентно ингибируют связывание полипептида SOST с BMP, например, блокированием или ингибированием связывания аминокислот BMP, соответствующих одному или нескольким из сайтов связывания рецепторов типа I и типа II, могут также специфически связываться с пептидами, которые включают аминокислотную последовательность, соответствующую внутреннему (коровому) району SOST (аминокислоты в положениях приблизительно 57-146 SEQ ID NO:1). Полипептиды, которые включают этот внутренний район, могут также включать дополнительные аминокислоты, простирающиеся на любом или на обоихN-конце и С-конце, например, для включения остатков цистеина, которые могут быть полезными для конъюгирования этого полипептида с молекулой-носителем. Репрезентативные внутренние полипептидыSEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:50, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные внутренние пептидные последовательностиSOST крысы представлены в SEQ ID NO:25-28. В другом варианте осуществления антитела, которые специфически связываются с полипептидомSOST, нарушают (ингибируют, предотвращают или блокируют, например, уменьшают статистически значимым образом) образование гомодимера SOST. Поскольку взаимодействие между SOST и BMP может включать гомодимер SOST и гомодимер BMP, антитело, которое предотвращает или нарушает образование гомодимера SOST, может посредством этого изменять минеральную плотность кости, предпочтительно увеличивать минеральную плотность кости. В одном варианте осуществления антитела, которые связываются с внутренним районом SOST, предотвращают образование гомодимера. Такие антитела могут также связываться с пептидами, которые включают последовательности смежных аминокислот,соответствующие внутреннему району, например SEQ ID NO:29, 30 и 53 (SOST человека) и SEQ IDNO:31 и 54 (SOST крысы). Антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на С-концевом районе полипептида SOST (приблизительно в положениях аминокислот 147-190 SEQ ID NO:1 или 20),могут также нарушать образование гомодимера. Репрезентативные С-концевые полипептиды SOST человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:51 и SEQ ID NO:52, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные С-концевые пептидные последовательности SOST человека представлены в SEQ ID NO:33-36, а репрезентативные С-концевые пептидные последовательности SOST крысы представлены в SEQ ID NO:41-43. Описанные здесь полипептиды и пептиды SOST, с которыми антитела могут специфически связываться, применимы в качестве иммуногенов. Эти иммуногены данного изобретения могут быть использованы для иммунизации животного для генерирования гуморального иммунного ответа, который приводит к продуцированию антител, которые специфически связываются с сайтом связывания рецептора типа I или типа II или с обоими, расположенными на BMP, и включают пептиды, произведенные из Nконцевого района SOST, или которые могут предотвращать образование гомодимера SOST. Такие полипептиды и пептиды SOST, которые применимы в качестве иммуногенов, могут быть также использованы в способах скрининга проб, содержащих антитела, например проб очищенных антител, антисывороток или супернатантов клеточных культур или любой другой биологической пробы, которая может содержать одно или несколько антител, специфических в отношении SOST. Эти пептиды могут быть также использованы в способах идентификации и отбора из биологической пробы одной или нескольких В-клеток, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с SOST (например, анализы образования бляшек и т.п.). Затем эти В-клетки используют в качестве источника кодирующего SOST-специфическое антитело полинуклеотида, который может быть клонирован и/или модифицирован рекомбинантными способами молекулярной биологии, известными в данной области и описанными здесь."Биологическая проба" в данном контексте обозначает в некоторых вариантах осуществления пробу, содержащую по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении полипептида SOST, и биологическая проба может быть обеспечена получением пробы крови (из которой могут быть получены сыворотка или плазма), образца биопсии, эксплантата ткани, культуры органа или любой другой ткани- 12015166 или препарата клеток из субъекта или биологического источника. Пробой может дополнительно называться препарат ткани или клеток, в котором морфологическая целостность или физическое состояние было разрушено, например, иссечением, диссоциацией, солюбилизацией, фракционированием, гомогенизацией, биохимической или химической экстракцией, измельчением в порошок, лиофилизацией, обработкой ультразвуком или любым другим способом для обработки пробы, полученной из субъекта или биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, не являющееся человеком, первичная культура клеток (например, В-клеток, иммунизированных invitro) или адаптированная к культуре клеточная линия, в том числе, но не только, генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или иммортализируемые клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или дифференцируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п. Пептидные иммуногены SOST могут быть также получены синтезом серии пептидов, которые, в целом, представляют полную полипептидную последовательность полипептида SOST и каждый из которых имеет часть аминокислотной последовательности SOST, общую с другим пептидом в этой серии. Эта перекрывающаяся часть может состоять предпочтительно по меньшей мере из четырех аминокислот и более предпочтительно из 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот. Каждый пептид может быть использован для иммунизации животного, сыворотки собирают из этого животного и испытывают в анализе для идентификации, какое животное продуцирует антитела, которые нарушают или блокируют связываниеSOST с TGF-бета-белком. Затем получают антитела из таких идентифицированных иммунизированных животных в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Пептиды, полипептиды и другие непептидные молекулы, которые специфически связываются сTGF-бета-связывающим белком, таким как SOST, предусматриваются данным изобретением. В данном контексте, говорят, что молекула "специфически связывается" с TGF-бета-связывающим белком, если она реагирует при детектируемом уровне с TGF-бета-связывающим белком, но не реагирует детектируемо с пептидами и полипептидами, включающими неродственную последовательность или последовательность другого TGF-бета-связывающего белка. Предпочтительные связывающие молекулы включают антитела, которые могут быть, например, поликлональными, моноклональными, одноцепочечными, химерными, антиидиотипическими или CDR-привитыми иммуноглобулинами, или их фрагменты, такие как генерированные протеолитически или полученные рекомбинантно фрагменты F(ab')2, Fab, Fab', Fv иFd иммуноглобулина. Особенно применимыми являются антитела против TGF-бета-связывающего белка, которые "специфически связывают" TGF-бета-связывающий белок SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 или 68, но не другие TGF-бета-связывающие белки, такие как Dan, Cerberus, SCGF или Gremlin. Предполагается, что антитела специфически связываются с TGF-бета-связывающим белком или конкретным членом TGFбета-семейства, если они связываются с Ka, равной или большей чем 104 М-1, предпочтительно равной или большей чем 105 М-1, более предпочтительно равной или большей чем 106 М-1, еще более предпочтительно равной или большей чем 107 М-1, и даже еще более предпочтительно равной или большей чем 108 М-1, и действительно не связываются с другими TGF-бета-связывающими белками. Аффинность антитела в отношении его родственного антигена выражают обычно в виде константы диссоциации KD, и антиSOST-антитело специфически связывается с членом TGF-бета-семейства, если оно связывается с KD,равной или меньшей чем 10-4 М, более предпочтительно равной или меньшей чем 10-5 М, более предпочтительно равной или меньшей чем 10-6 М, даже более предпочтительно равной или меньшей чем 10-7 М и даже более предпочтительно равной или меньшей чем 10-8 М. Кроме того, антитела данного изобретения предпочтительно блокируют, нарушают или ингибируют (например, уменьшают со статистической значимостью) связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. Аффинность антитела или партнера связывания, а также ингибирование связывания могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области с использованием общепринятых способов, например, описанных Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949), или с использованием резонанса поверхностных плазмонов (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Для резонанса поверхностных плазмонов молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают действию лигандов в подвижной фазе, идущей вместе с потоком клеток. Если связывание лиганда с иммобилизованной мишенью имеет место, локальный показатель преломления изменяется, приводя к изменению угла SPR, которое может быть подвергнуто мониторингу в реальном времени детектированием изменений в интенсивности отраженного света. Скорости изменения сигнала SPR могут анализироваться для получения видимых констант скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих величин дает видимую константу равновесия (аффинность) (см., например, Wolff et al.,Cancer Res. 53:2560-65 (1993. Антитело в соответствии с данным изобретением может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, например IgG, IgE, IgM, IgD или IgA. Оно может быть получено или произведено из животного, например домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются ими, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна, корову, лошадь, овцу, козу, верб- 13015166 люда, человека или другого примата. Это антитело может быть интернализующимся антителом. Хорошо известные в данной области способы могут быть использованы для генерирования антител,поликлональных антисывороток или моноклональных антител, которые являются специфическими в отношении TGF-бета-связывающего белка, такого как SOST. Антитела могут быть также получены в виде генетически сконструированных иммуноглобулинов (lg) или lg-фрагментов, сконструированных таким образом, что они имеют желаемые свойства. Например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, антитела могут включать рекомбинантный IgG, который является химерным слитым белком,имеющим по меньшей мере один домен вариабельной области (V) из первого вида млекопитающего и по меньшей мере один домен константной области из второго, отличающегося вида млекопитающего. Наиболее часто химерное антитело имеет последовательности вариабельной области мыши и последовательности константной области человека. Такой мышь/человек-химерный иммуноглобулин может быть"гуманизирован" пересадкой определяющих комплементарность районов (CDR), происходящих из мышиного антитела, которые придают специфичность связывания в отношении антигена, в районы вариабельной области (V) человека и происходящие из человека константные области. Фрагменты этих молекул могут быть генерированы протеолитическим расщеплением или, необязательно, протеолитическим расщеплением с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также генерированы рекомбинантными способами генной инженерии. Некоторые предпочтительные антитела являются антителами, которые ингибируют или блокируют активность TGF-бета-связывающего белка в анализе in vitro, как описано здесь. Связывающие свойства антитела в отношении TGF-бета-связывающего белка могут быть, как правило, оценены с использованием способов иммунодетектирования, включающих, например, иммуноферментный твердофазный анализ(ELISA), иммунопреципитацию, иммуноблоттинг, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкуренции и т.п., которые могут легко выполняться специалистами с обычной квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988. Иммуноген может состоять из клеток, экспрессирующих TGF-бета-связывающий белок, такой как полипептид SOST, очищенного или частично очищенного полипептида SOST или его вариантов или фрагментов (т.е. пептидов) или пептидов, полученных из полипептида SOST. Такие пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением большего полипептида, рекомбинантными молекулярными методологиями или могут быть синтезированы химически. Например, здесь обеспечены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид SOST, так что лица с квалификацией в данной области могут рутинным образом получить полипептид SOST для использования в качестве иммуногенов. Пептиды могут быть химически синтезированы способами, описанными здесь и известными в данной области. Альтернативно пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением полипептидаSOST, и индивидуальные пептиды могут быть выделены способами, известными в данной области, такими как электрофорез в полиакриламидном геле, или любым количеством из способов жидкостной хроматографии или других способов разделения. Пептиды, применимые в качестве иммуогенов, обычно могут иметь аминокислотные последовательности по меньшей мере из 4 или 5 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности полипептида SOST, такой как описанные здесь, и предпочтительно имеют по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 или 20 последовательных аминокислот полипептида SOST. Некоторые другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 6, но не более чем 12, последовательных аминокислот последовательности полипептида SOST, другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 20, но не более чем 75, последовательных аминокислот, а другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 21, но не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST. Другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 или любое целое число аминокислот между 21 и 100, включительно, последовательными аминокислотами и между 100 и 190 последовательными аминокислотами последовательности полипептида SOST. Поликлональные антитела, которые связываются специфически с SOST, могут быть получены с использованием способов, описанных здесь и хорошо известных специалистом с обычной квалификацией в данной области (см., например, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunological Protocols(eds.), page 15 (Oxford University Press 1995. Антитела к TGF-бета-связывающему белку могут быть получены, например, иммунизацией животного продуктом TGF-бета-связывающего белка экспрессирующего вектора или иммунизацией выделенным TGF-бета-связывающим белком или его пептидным фрагментом, как описано здесь. Хотя поликлональные антитела обычно индуцируют в животных, таких как крысы, мыши, кролики, козы, крупный рогатый скот или овцы, антитело против TGF-бета-связывающего белка данного изобретения может быть также получено из примата (не человека). Общие способы инду- 14015166 цирования диагностически и терапевтически применимых антител в павианах могут быть найдены, например, в WO 91/11465 (1991) и в Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990. Приготовление иммуногена для инъекции в животных может включать ковалентное связываниеTGF-бета-связывающего белка (или его варианта или фрагмента) с другим иммуногенным белком, например белком-носителем, таким как гемоцианин фисуреллы (KLH) или бычий сывороточный альбумин или т.п. Полипептидный или пептидный иммуноген может включать одну или несколько дополнительных аминокислот на N-конце или С-конце, которые облегчают процедуру конъюгации (например, добавление цистеина для облегчения конъюгации пептида с KLH). Другие аминокислотные остатки в полипептиде или пептиде могут быть заменены для предотвращения конъюгации в конкретном положении аминокислоты с полипептидом-носителем (например, заменой остатком серина цистеина во внутренних положениях полипептида/пептида) или могут быть заменены для облегчения растворения или для повышения иммуногенности. Пептид TGF-бета-связывающего белка, полипептид или экспрессирующие TGF-бета-связывающий белок клетки, подлежащие использованию в качестве иммуногена, могут быть эмульгированы в адъюванте, например полном или неполном адъюванте Фрейнда или системе адъюванта Ribi (Corixa Corporation, Seattle, WA). См. также, например, Harlow et al., supra. Иммуноген может быть инъецирован в животное любым числом различных способов, в том числе, внутрибрюшинно, внутримышечно, интраокулярно, интрадермально или подкожно. Обычно после первой инъекции животные получают одну или несколько бустер-иммунизаций в соответствии с предпочтительной схемой, которая может варьироваться в соответствии, inter alia, с антигеном, адъювантом (если его вводят) и/или конкретным видом животного. Иммунный ответ может быть подвергнут мониторингу периодическим взятием крови животного и получением и анализом сывороток в иммуноанализе, таком как ELISA или диффузионный анализ Оухтерлони или т.п., для определения титра специфических антител. После установления достаточного титра антитела у животных периодически берут кровь для накопления поликлональных антисывороток, или животные могут быть обескровлены. Поликлональные антитела, которые связываются специфически сTGF-бета-связывающим белком или пептидом, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием белка А. Альтернативно, может выполняться аффинная хроматография, где TGF-бета-связывающий белок или пептид или антитело, специфическое в отношении константной области Ig конкретного иммунизированного вида животного, иммубилизовано на подходящем твердом носителе. Антитела для применения в данном изобретении включают моноклональные антитела, которые получают общепринятыми процедурами иммунизации и слияния клеток, описанными здесь и известными в данной области. Моноклональные антитела против TGF-бета-связывающего белка могут быть генерированы с использованием различных способов. Моноклональные антитела, которые связываются со специфическими антигенами, могут быть получены с использованием способов, известных в данной областиUniversity Press 1995. Фрагменты антител могут быть получены из антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, протеолитическим расщеплением (например, при помощи папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также созданы рекомбинантными способами генной инженерии. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъекцией животного, такого как крыса,хомячок, или предпочтительно мышь, иммуногеном, включающим продукт гена TGF-бетасвязывающего белка или его пептидный фрагмент, в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Присутствие продуцирования специфического антитела может быть подвергнуто мониторингу после начальной инъекции (инъекции могут выполняться любым из нескольких способов, описанных здесь для генерирования поликлональных антител) и/или после бустер-инъекции взятием пробы сыворотки и детектированием присутствия антитела, которое связывает TGF-бетасвязывающий белок или пептид, с использованием любого из нескольких способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь. Из животных, продуцирующих антитела, которые связываются с TGF-бета-связывающим белком, извлекают лимфоидные клетки, наиболее часто клетки из селезенки или лимфатического узла, для получения В-лимфоцитов. Затем В-лимфоциты сливают с сенсибилизированными лекарственным средствами клетками миеломы в качестве партнера слияния, предпочтительно клетками, сингенными с иммунизированным животным и, необязательно, имеющими другие желательные свойства (например, неспособность экспрессировать эндогенные продукты гена lg, например Р 3 Х 63 - Ад 8.653 (АТСС No. CRL 1580); NSO, SP20) для получения гибридом, которые являются иммортализованными линиями эукариотических клеток. Лимфоидные клетки (например, селезенки) и- 15015166 миеломные клетки могут быть объединены на несколько минут с агентом, усиливающим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем посеяны при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридомных клеток, но не неслитых миеломных клеток. Предпочтительной селективной средой является HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). После достаточного времени, обычно приблизительно одной недели - двух недель, наблюдают колонии клеток. Отдельные колонии выделяют, и антитела, продуцируемые этими клетками, могут быть испытаны на связывающую активность в отношении TGF-бета-связывающего белка, или его варианта или фрагмента,с использованием любого из различных иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь. Предпочтительными являются гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела с высокой аффинностью и специфичностью в отношении SOST. Таким образом, данным изобретением обсуждаются гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически связываются сTGF-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. Эти гибридомы клонируют (например, клонированием с использованием лимитирующих разведений или выделения бляшек из мягкого агара) и положительные клоны, которые продуцируют антитело, специфическое в отношении антигена,отбирают и культивируют. Антитела, которые блокируют, ингибируют или нарушают связывание TGFбета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства, являются предпочтительными. Моноклональные антитела из гибридомных культур могут быть выделены из супернатантов гибридомных культур. Альтернативным способом получения мышиного моноклонального антитела является инъецирование этих гибридомных клеток в брюшную полость сингенной мыши, например мыши, которая была обработана (например, праймирована пристаном) для усиления образования асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок А-Сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Coligan на страницах 2.7.1-2.7.12 и на страницах 2.9.1-2.9.3; BainesHumana Press, Inc. 1992. Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например,изотипа тяжелой или легкой цепи, специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящего лиганда,иммобилизованного на твердом носителе, включают белок А, белок G, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и TGF-бета-связывающий белок или его фрагмент или вариант. Кроме того, антитело против TGF-бета-связывающего белка данного изобретения может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть генерированы любым числом способов, с которыми знакомы специалисты с обычной квалификацией в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, трансформацию клеток периферической крови(например, содержащих В-лимфоциты) вирусом Эпстейна-Барра (EBV), in vitro иммунизацию В-клеток человека, слияние клеток селезенки из иммунизированных трансгенных мышей, несущих инсертированные гены иммуноглобулина человека, выделение из фаговых библиотек V-области иммуноглобулина человека или другие процедуры, известные в данной области и основанные на раскрытии данной заявки. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены из трансгенных мышей, которые были получены с использованием генной инженерии для продуцирования специфических антител человека в ответ на введение антигена. Способы получения антител человека из трансгенных мышей описаны, например Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int.Jakobovits et al., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. (См. также Bruggemann etal., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997. Например, трансгены, иммуноглобулина человека могут быть минигенными конструкциями или транс-локусами на искусственных хромосомах дрожжей, которые подвергаются специфической в отношении В-клеток реаранжировке ДНК и гипермутации в лимфоидной ткани мыши. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые затем могут продуцировать антитела человека, специфические в отношении этого антигена. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитело человека, в соответствии с описанными здесь способами. Поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека, могут быть также получены из крови этих иммунизированных животных. Другой способ получения моноклональных антител, специфических в отношении TGF-бетасвязывающего белка человека, включает иммортализацию клеток периферической крови человека трансформацией EBV. См., например, патент США 4464456. Такая иммортализованная линия Вклеток (или линия лимфобластоидных клеток), продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически связывается с TGF-бета-связывающим белком (или его вариантом или фрагментом), может быть идентифицирована обеспеченными здесь способами иммунодетектирования, например ELISA, и- 16015166 затем выделена стандартными способами клонирования. Стабильность лимфобластоидной клеточной линии, продуцирующей антитело против TGF-бета-связывающего белка, может быть улучшена слиянием этой трансформированной клеточной линии с мышиной миеломой с получением гибридной мышьчеловек клеточной линии в соответствии со способами, известными в данной области (см., например,Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989. Еще одним способом генерирования моноклональных антител человека является иммунизация in vitro, которая включает праймирование В-клеток селезенки человека антигеном с последующим слиянием праймированных В-клеток с гетерогибридным партнером слияния. См., например, Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95. В некоторых вариантах осуществления отбирают В-клетку, которая продуцирует антитело противSOST, и вариабельные области легкой и тяжелой цепей клонируют из этой В-клетки в соответствии со способами молекулярной биологии, известными в данной области (WO 92/02551; патент США 5627052;Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996 и описанными здесь. Предпочтительно Вклетки из иммунизированного животного выделяют из селезенки, лимфатического узла или пробы периферической крови с использованием отбора клетки, которая продуцирует антитело, которое специфически связывается с SOST. В-клетки могут быть также выделены из людей, например из пробы периферической крови. Способы детектирования отдельных В-клеток, которые продуцируют антитело с желаемой специфичностью, хорошо известны в данной области, например способ образования бляшек, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции, стимуляция in vitro с последующим детектированием специфического антитела и т.п. Способы отбора продуцирующих специфическое антитело В-клеток включают,например, получение суспензии отдельных В-клеток в мягком агаре, который содержит SOST или его пептидный фрагмент. Связывание специфического антитела, продуцируемого В-клеткой в ответ на антиген, приводит к образованию комплекса, который может быть видимым в виде иммунопреципитата. После отбора В-клеток, продуцирующих специфическое антитело, гены этого специфического антитела могут быть клонированы выделением и амплификацией ДНК или мРНК в соответствии со способами,известными в данной области и описанными здесь. Для конкретных применений могут быть желательными фрагменты антител против TGF-бетасвязывающего белка. Фрагменты антител, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, сохраняют антигенсвязывающий сайт целого антитела и, следовательно, связываются с тем же самым эпитопом. Эти антигенсвязывающие фрагменты, произведенные из антитела, могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом этого антитела, например расщеплением пепсином или папаином целых антител в соответствии с общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с получением фрагмента 5S, названного F(ab')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиолы агента с получением моновалентных фрагментов 3,5S Fab'. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые происходят из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием папаина дает два моновалентных Fab-фрагмента и непосредственно Fc-фрагмент. Эти способы описаны, например, Goldenberg, патент США 4331647, Nisonoff et al., Arch. Biocem. Biophys. 89:230, 1960; Porter,Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) и Coligan страницы 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких цепей (Fd), дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть также использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом. Фрагмент антитела может быть также любым синтетическим или генетически сконструированным белком, который действует подобно антителу, т.е. связывается со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельной области легкой цепи, "Fv"-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (scFv-белки) и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район. Антитело данного изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере один домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может иметь любой размер или аминокислотный состав и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, которая является смежной или находится в рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В общем, домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей иммуноглобулина. Таким образом, например, домен V-области может быть мономерным и может бытьVH- или VL-доменом, который способен независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен V-области может быть димерным и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Предпочтительно, димер V-области содержит по меньшей мере одну цепь VH и по меньшей мере одну цепь VL, которые нековалентно ассоциированы (далее называемые Fv). Если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны либо непосредственно, либо, например, через дисульфидную связь между дву- 17015166 мя вариабельными доменами, или через линкер, например пептидный линкер, с образованием одноцепочечной цепи Fv (scFv). Домен вариабельной области может быть любым встречающимся в природе вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием рекомбинантных способов генной инженерии ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельной области специфического антитела посредством инсерций, делеций или изменений в аминокислотных последовательностях этого специфического антитела. Конкретные примеры включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один CDR и необязательно одну или более аминокислот каркасной области из первого антитела и остальной домен вариабельной области из второго антитела. Домен вариабельной области может быть ковалентно присоединен при С-концевой аминокислоте по меньшей мере к одному другому домену антитела или его фрагменту. Так, например, Vн-домен, который присутствует в домене вариабельной области, может быть связан с Сн 1-доменом иммуноглобулина или его фрагментом. Подобным образом, VL-домен может быть связан с CK-доменом или его фрагментом. Таким образом, например, это антитело может быть Fab-фрагментом, в котором антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные VH- и VL-домены, ковалентно связанные при их С-концах с Сн 1- иCK-доменом, соответственно. Сн 1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения шарнирной области или части домена шарнирной области, как обнаружено вFab'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены Сн 2 и Сн 3. Другой формой фрагмента антитела является пептид, включающий единственный определяющий комплементарность район (CDR). CDR-пептиды ("минимальные узнающие единицы") могут быть получены конструированием полинуклеотидов, которые кодируют CDR представляющего интерес антитела. Такие полинуклеотиды получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области с использованием мРНК антитело-продуцирующих клеток в качестве матрицыand Clinical Applications, Ritteret al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995) и Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications,Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995. Альтернативно, антитело может быть рекомбинантным или сконструированным антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипуляцию и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, библиотек фаг-антитело (см.Chiswell and McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992, или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования и манипуляции этой ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина или для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно. Химерные антитела, специфические в отношении TGF-бета-связывающего белка, которые включают гуманизированные антитела, могут быть также генерированы в соответствии с данным изобретением. Химерное антитело имеет по меньшей мере один домен константной области, полученный из первого вида млекопитающего, и по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из второго,отличающегося вида млекопитающего (см., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:685155 (1984. В предпочтительных вариантах осуществления химерное антитело может быть сконструировано клонированием полинуклеотидной последовательности, которая кодирует по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из моноклонального антитела не человека, такой как вариабельная область, полученная из моноклонального антитела мыши, крысы или хомячка, в вектор, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну константную область человека (см., например, Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Walls et al., Nucleic AcidsRes. 21:2921-29 (1993. В качестве примера, полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела, может быть встроена в вектор,включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность константной области легкой цепи каппа. В отдельном векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, может быть клонирована в рамке считывания с последовательностями, кодирующими константную область IgG человека, например константную область lgG1 человека. Конкретная выбранная константная область человека может зависеть от эффекторных функций, желаемых для конкретного антитела (например, фиксация (связывание) комплемента, связывание с конкретным Fc-рецептором и т.д.). Предпочтительно, сконструированные векторы будут трансфицироваться в эукариотические клетки для стабильной экспрессии этого химерного антитела. Другим способом, известным в данной области, для генерирования химерных антител является гомологичная рекомбинация (например, патент США 5482856). Химерное антитело не человек/человек может быть дополнительно генетически сконструировано- 18015166 для создания "гуманизированного антитела". Такое гуманизированное антитело может содержать множество CDR, полученных из иммуноглобулина вида млекопитающего, не являющегося человеком, по меньшей мере одну вариабельную каркасную область и по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина человека. Применимые стратегии для конструирования гуманизированных антител могут включать, например, для иллюстрации, а не для ограничения, идентификацию вариабельных каркасных областей человека, которые являются наиболее гомологичными относительно каркасных областей не человека химерного антитела. Не желая связывать себя теорией, авторы считают, что такая стратегия может увеличивать вероятность того, что это гуманизированное антитело будет сохранять специфическую связывающую аффинность в отношении TGF-бета-связывающего белка, которая в некоторых предпочтительных вариантах осуществления может быть по существу такой же аффинностью в отношении TGF-бета-связывающего белка или его варианта или фрагмента, а в некоторых вариантах осуществления может быть более высокой аффинностью в отношении TGF-бета-связывающего белка. См., например, Jones et al., 1986 Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-27. Таким образом,конструирование такого гуманизированного антитела может включать определение конформаций петельCDR и структурных детерминант вариабельных областей не человека, например компьютерным моделированием, и затем сравнение петель и детерминант CDR с известными структурами петель и детерминантами CDR человека. См., например, Padlan et al., 1995 FASEB 9:133-39; Chothia et al., 1989 Nature,342:377-383. Компьютерное моделирование может быть также использовано для сравнения структурных шаблонов человека, выбранных по гомологии последовательности, с вариабельными областями не человека. См., например, Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2:95-103; EP-0578515-A3. Если гуманизация этихCDR не человека приводит к уменьшению аффинности связывания, компьютерное моделирование может способствовать идентификации специфических аминокислотных остатков, которые могли бы быть изменены способами сайт-направленного или иного мутагенеза для частичного, полного или супраоптимального (т.е. увеличение до уровня, большего, чем уровень негуманизированного антитела) восстановления аффинности. Специалисты с обычной квалификацией в данной области знакомы с этими способами и смогут легко понять многочисленные вариации и модификации в отношении таких стратегий конструирования. Один подобный способ получения гуманизированного антитела называют "облицовкой". В данном контексте термины "облицованные FR" и "рекомбинантно облицованные FR" относятся к селективной замене остатков FR, например, из V-области тяжелой или легкой цепи грызуна, остатками FR человека для обеспечения ксеногенной молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, который сохраняет по существу всю структуру укладки нативного полипептида FR. Способы облицовки основаны на понимании того, что характеристики связывания лиганда антигенсвязывающего сайта определяются прежде всего структурой и относительным расположением наборов CDR тяжелой и легкой цепей на антигенсвязывающей поверхности. Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, 1990. Таким образом, антигенсвязывающая специфичность может быть сохранена в гуманизированном антителе только при тщательном поддержании структур CDR, их взаимодействия друг с другом и их взаимодействия с остальными доменами вариабельной (V) области. С использованием способов облицовки FR-остатки наружной части (например, доступные для растворителя), с которыми легко сталкивается иммунная система, селективно заменяют остатками человека для обеспечения гибридной молекулы,которая содержит либо слабо иммуногенную, либо, по существу, неиммуногенную облицованную поверхность. Способ облицовки использует доступные данные о последовательности вариабельных областей антитела человека, собранные Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed, (U.S.Dept. of Health and Humab Services, U.S. Government Printing Office, 1987), усовершенствования в отношении базы данных Kabat и других U.S. и иностранных баз данных (как нуклеиновых кислот, так и белков). Доступность для растворителя аминокислот V-области может быть расшифрована из известной трехмерной структуры фрагментов антител человека и мыши. Сначала FR этих вариабельных доменов представляющей интерес молекулы антитела сравнивают с соответствующими FR-последовательностями вариабельных областей человека, полученных из вышеуказанных источников. Затем наиболее гомологичные V-области человека сравнивают остаток за остатком с соответствующими мышиными аминокислотами. Остатки в мышиных FR, которые отличаются от копии человека, заменяют остатками,присутствующими в соответствующей области человека, с использованием рекомбинантных способов,хорошо известных в данной области. Переключение остатка проводят только с частями, которые, по меньшей мере, частично являются экспонированными (доступными для растворителя), и соблюдают осторожность в замене аминокислотных остатков, которые могут иметь значимое влияние на третичную структуру доменов V-области, таких как пролин, глицин и заряженные аминокислоты. Таким образом, полученные "облицованные" антигенсвязывающие сайты конструируют для сохранения CDR-остатков грызунов, остатков, по существу, примыкающих к CDR, остатков, идентифицированных как скрытые или в основном скрытые (недоступные для растворителя), остатков, которые, как считается, участвуют в нековалентных (например, электростатических или гидрофобных) контактах между доменами тяжелых и легких цепей, и остатков из консервативных структурных областей FR, кото- 19015166 рые, как считается, влияют на "канонические" третичные структуры петель CDR. Затем эти критерии конструирования используют для получения рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, которые объединяют CDR как тяжелой, так и легкой цепи антигенсвязывающего сайта в FR, похожие на FR человека, которые могут быть использованы для трансфекции клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител человека, которые проявляют антигенную специфичность молекулы антитела грызуна. Дополнительным способом отбора антител, которые специфически связываются с TGF-бетасвязывающим белком или его вариантом или фрагментом, является фаговый дисплей. См., например,Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Комбинаторные библиотеки генов вариабельной области иммуноглобулина человека и мыши могут быть созданы в векторах-фагах, которые могут быть подвергнуты скринингу для отбора lg-фрагментов (Fab, Fv, sFv или их мультимеров), которые связываются специфически с TGF-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. См., например, Патент США 5223409; Huse et al., 1989 Science 246:12751281; L. Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Bilogy 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebush et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 и ссылки в них. Например, библиотека, содержащая множество полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты вариабельной облести lg, может быть встроена в геном нитевидного бактериофага, такого как М 13, или его варианта, в рамке считывания с последовательностью, кодирующей белок оболочки фага. Слитым белком может быть слияние белка оболочки с доменом вариабельной области легкой цепи и/или с доменом вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления Fab-фрагменты иммуноглобулина могут быть также представлены на частице фага (см., например, патент США 5698426). Экспрессионные библиотеки кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина могут быть также приготовлены в фаге лямбда, например, с использованием векторов AlmmunoZap(H) и AlmmunoZap(L) (Stratagene, La Jolla, California). Вкратце, мРНК выделяют из популяции В-клеток и используют для создания экспрессионных библиотек кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина в векторахAlmmunoZap(H) и AlmmunoZap(L). Эти векторы могут быть подвергнуты скринингу индивидуально или ко-экспрессированы для образования Fab-фрагментов или антител (см. Huse et al., supra; см. также Sastryet al., supra). Затем положительные бляшки могут быть превращены в нелитическую плазмиду, кторая делает возможным высокий уровень экспрессии фрагментов моноклональных антител из Е. coli. Подобным образом, части или фрагменты, такие как Fab- и Fv-фрагменты, антител могут быть также сконструированы с использованием общепринятого ферментативного расщепления или способов рекомбинантных ДНК для включения вариабельных областей гена, который кодирует антитело, специфическое в отношении TGF-бета-связывающего белка. В одном варианте осуществления эти гены, которые кодируют вариабельную область из гибридомы, продуцирующей представляющее интерес моноклональное антитело, амплифицируют с использованием нуклеотидных праймеров. Эти праймеры могут быть синтезированы специалистом с обычной квалификацией в данной области или могут быть куплены из коммерчески доступных источников. (См., например, Stratagene (La Jolla, California), которая продает праймеры для вариабельных областей иммуноглобулина мыши и человека, среди прочих, праймеры для областей VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL и CL). Эти праймеры могут быть использованы для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые затем могут быть встроены в векторы, такие как ImmunoZAP Н или ImmunoZAP L (Stratagene), соответственно. Затем эти векторы могут быть введены в Е. coli, дрожжи или системы на основе млекопитающего для экспрессии. С использованием этих способов могут быть получены большие количества одноцепочечного белка, содержащего слияние доменов VH и VL (см. Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Кроме того, такие способы могут быть использованы для гуманизации V-области животного, не являющегося человеком, без изменения, связывающей специфичности этого антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения комбинаторные фаговые библиотеки могут быть также использованы для гуманизации вариабельных областей не человека. См.,например, Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-15. Фаговая библиотека может быть подвергнута скринингу для отбора представляющей интерес вариабельной области lg с использованием способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь, и таким образом может быть отобрана ДНК-последовательность встроенного в фаг гена иммуноглобулина с использованием стандартных способов. См. Sambrook et al., 2001 MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Затем выбранная lg-кодирующая последовательность может быть клонирована в другой подходящий вектор для экспрессии этого lg-фрагмента или, необязательно, может быть клонирована в вектор, включающий константные области lg, для экспрессии полных цепей иммуноглобулина. В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение предусматривает SOSTспецифические антитела, которые являются мультимерными фрагментами антител. Применимые мето- 20015166 дологии описаны в общем, например, в Hayden et al., 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201-12; Coloma et al.,1997 Nat. Biotechnol. 15:159-63). Например, мультимерные фрагменты антител могут быть получены фаговыми способами с образованием миниантител (патент США 5910573) или диантител (Holliger et al.,1997, Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130). В некоторых вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении SOST, может быть антителом, которое экспрессируется в виде внутриклеточного белка. Такие внутриклеточные антитела называют также интрателами, и они могут содержать Fab-фрагмент или предпочтительно содержатьscFv-фрагмент (см., например, Lecerf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001). Каркасные области, фланкирующие CDR-районы, могут быть модифицированы для улучшения уровней экспрессии и растворимости интратела в интрацеллюлярной стесненной среде (см., например, Worn et al., J. Biol.Chem. 275:2795-803 (2000). Интратело может быть направлено в конкретные клеточные местоположение или органеллу, например, конструированием вектора, который содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области интратела, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует конкретный антиген-мишень в этой клетке(см., например, Graus-Porta et al., Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995); Lener et al., Eur. J. Biochem. 267:1196205 (2000. Интратело может быть введено в клетку различными способами, доступными для квалифицированного специалиста, в том числе с использованием вектора генотерапии или липидной смеси (например, Provectin, изготовляемого Imgenex Corporation, San Diego, CA), или в соответствии с фотохимическими способами интернализации. Введение аминокислотных мутаций в молекулу иммуноглобулина, специфического в отношенииTGF-бета-связывающего белка, может быть полезным для увеличения специфичности или аффинностиTGF-бета-связывающего белка или изменения эффекторной функции. Иммуноглобины с более высокой аффинностью в отношении TGF-бета-связывающего белка могут быть генерированы сайт-направленным мутагенезом конкретных остатков. Трехмерное молекулярное моделирование при помощи компьютера может быть использовано для идентификации аминокислотных остатков, которые должны быть изменены для улучшения аффинности в отношении TGF-бета-связывающего белка. См., например, Mountain etal., 1992, Biotechnol. Genet, Eng, Rev. 10: 1-142. Альтернативно, комбинаторные библиотеки CDR могут быть генерированы в фаге М 13 и подвергнуты скринингу на фрагменты иммуноглобулина с улучшенной аффинностью. См., например, Glaser et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913; Barbas et al., 1994 Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91:3809-13; Патент США 5792456. Эффекторные функции могут быть также изменены сайт-направленным мутагенезом. См., например, Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24; EghtedarzedehKondri et al., 1997 Biotechniques 23:830-34. Например, мутация сайта гликозилирования на Fc-части иммуноглобулина может изменять способность этого иммуноглобулина фиксировать комплемент. См., например, Wright et al., 1997 Trends Biotechnol. 15:26-32. Другие мутации в доменах константной области могут изменять способность иммуноглобулинов фиксировать комплемент или осуществлять антителозависимую клеточную цитотоксичность. См., например, Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan etal., 1995 Immunology 86:319-24; Sensel et al., 1997 Mol. Immunol. 34:1019-29. Согласно некоторым вариантах осуществления вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи,не человека, человека или гуманизированные, любой из описанных здесь lg-молекул могут быть сконструированы в виде одноцепочечных Fv (scFv)-фрагментов (одноцепочечных антител). См., например, Birdet al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Мультифункциональные scFv-слитые белки могут быть генерированы связыванием полинуклеотидной последовательности, кодирующей scFv-полипептид, в рамке считывания по меньшей мере с одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей любой из различных известных эффекторных белков. Эти способы известны в данной области и описаны, например, в ЕР-В 1-0318554, патенте США 5132405, патенте США 5091513 и патенте США 5476786. В качестве примера, эффекторные белки могут включать последовательности константной области иммуноглобулина. См., например, Hollenbaugh et al.,1995 J. Immunol. Methods 188:1-7. Другими примерами эффекторных белков являются ферменты. В качестве неограничивающего примера, такой фермент может обеспечивать биологическую активность для терапевтических целей (см., например, Siemers et al., 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19) или могут обеспечивать детектируемую активность, такую как катализируемое пероксидазой хрена превращение любого из хорошо известных субстратов в детектируемый продукт, для диагностических целей. Другие примеры слитых scFv-белков включают слияния lg-токсина или иммунотоксинов, в которых scFv-полипептид слит с токсином.scFv-фрагмент или любой описанный здесь фрагмент антитела может, в некоторых вариантах осуществления, быть слит с пептидным или полипептидным доменом, который делает возможным детектирование специфического связывания между этим слитым белком и антигеном (например, TGF-бетасвязывающим белком). Например, домен слитого полипептида может быть полипептидом аффинной метки для детектирования связывания слитого scFv-белка с TGF-бета-связывающим белком любым из различных способов, которые известны специалисту с квалификацией в данной области. Примеры пептидной метки включают авидин, стрептавидин или His (например, полигистидин). Способы детектиро- 21015166 вания могут также включать, например, связывание слитого с авидином или стрептавидином белка с последовательностью биотина или миметика биотина (см., например, Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225 и ссылки в этой статье), прямую ковалентную модификацию слитого белка детектируемой частью (например, метящей частью), нековалентное связывание слитого белка со специфически меченой репортерной молекулой, ферментативную модификацию детектируемого субстрата слитым белком, которая включает часть, имеющую ферментативную активность, или иммобилизацию (ковалентную или нековалентную) слитого белка на подложке из твердой фазы. Другие применимые аффинные полипептиды для конструирования слитых scFv-белков могут включать слитые со стрептавидином белки, описанные, например, вWO 89/03422, патенты США с номерами 5489528, 5672691, WO 93/24631, патенты США 5168049,5272254; слитые с авидином белки (см., например, ЕР 511747); фермент, такой как глутатион-5 трансфераза; и полипептид белка A Staphylococcus aureus. Полинуклеотиды, кодирующие антитело или его фрагмент, которые специфически связываются сTGF-бета-связывающим белком, описанным здесь, могут быть размножены и экспрессированы в соответствии с любой из различных хорошо известных процедур разрезания, лигирования, трансформации и трансфекции нуклеиновых кислот с использованием любого количества известных экспрессирующих векторов. Так, в некоторых вариантах осуществления экспрессия фрагмента антитела может быть предпочтительной в прокариотическом хозяине, таком как Escherichia coli (см., например, Pluckthun et al.,1989 Methods Enzymol. 176:497-515). В некоторых других вариантах осуществления может быть предпочтительной экспрессия антитела или его фрагмента в эукариотической клетке-хозяине, в том числе в дрожжах (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris), клетках животных (в том числе клетках млекопитающих) или клетках растений. Примеры подходящих клеток животных включают, но не ограничиваются ими, миелому (например, мышиную клеточную линию NSO),клетки COS, CHO или гибридомные клетки. Примеры клеток растений включают клетки табака, кукурузы, сои и риса. Один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область, могут быть получены и использованы для трансформации подходящей клеточной линии, например непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как мышиная линия NSO, или бактериальной линии, такой как Е. coli, в которых будет происходить продуцирование этого антитела. Для получения эффективной транскрипции и трансляции ДНК-последовательность в каждом векторе должна включать подходящие регуляторные последовательности, в частности промоторную и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител таким путем обычно хорошо известны и рутинно используются. Например, основные процедуры молекулярной биологии описаны Maniatis et al., (Molecularet. al., 3nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001; секвенирование ДНК может выполняться, как описано Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, (1977 и Amersham International plc sequencing handbook; сайт-направленный мутагенез может проводиться в соответствии со способами, известными в данной области техники (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); the Anglian Biotechnology Ltd handbook; Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987). Кроме того, многочисленные публикации описывают способы, подходящие для получения антител манипуляцией ДНК, создание экспрессирующих векторов и трансформацию подходящих клеток, например, как описано в обзоре Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and GeneticEngineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK) и в Международной заявке на патент WO 91/09967. В некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с данным изобретением может иметь одну или несколько эффекторных или репортерных молекул, присоединенных к нему. Репортерной молекулой может быть детектируемая часть или метка, такая как фермент, цитотоксичный агент или другая репортерная молекула, в том числе, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа или биотин или т.п. Специфические в отношении TGF-бета-связывающего белка иммуноглобулин или его фрагмент могут быть радиоактивно помечены для диагностических или терапевтических применений. Способы радиоактивного мечения антител известны в данной области. См., например, Adams 1998 In Vivo 12:11-21; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9. Терапевтические применения описаны более подробно ниже и могут включать использование специфического в отношении TGF-бетасвязывающего белка антитела (или его фрагмента) вместе с другими терапевтическими агентами. Эффекторная или репортерная молекулы могут быть присоединены к антителу через любую доступную боковую цепь аминокислоты, концевую аминокислоту или через углеводную функциональную группу,расположенную в этом антителе, когда она присутствует, при условии, что это присоединение или процесс присоединения не оказывает неблагоприятного влияния на связывающие свойства и применимость этой молекулы. Конкретные функциональные группы включают, например, любую свободную амино-,имино-, тиол-, гидрокси-, карбоксильную или альдегидную группу. Соединение антитела и эффекторной и/или репортерной молекулы (молекул) может быть достигнуто через такие группы и подходящую функциональную группу в этих эффекторных или репортерных молекулах. Эта связь может быть прямой- 22015166 или непрямой через спейсерные или мостиковые группы. Эффекторные молекулы включают, например, противоопухолевые агенты, токсины (такие как ферментативно активные токсины бактериального (например, экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa) или растительного происхождения и их фрагменты (например, рицин и его фрагменты; гелонин растений,бриодин из Bryonia dioica, или т.п. См., например, Thrush et al., 1996 Annu. Rev. Immunol. 14: 49-71;Frankel et al., 1996 Cancer Res. 56:926-32). Дополнительные эффекторные молекулы включают биологически активные белки (например, ферменты), нуклеиновые кислоты и их фрагменты; встречающиеся в природе и синтетические полимеры, например полисахариды и полиалкиленовые полимеры, такие как поли(этиленгликоль), и их производные, радионуклиды, в частности радиоиодид; и хелатированные металлы. Подходящие репортерные группы включают хелатированные металлы, флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть детектированы при помощи ЯМР или ЭПР-спектроскопии. Особенно применимыми эффекторными группами являются калихаемицин и его производные (см., например, South African Patent Specifications Nos. 85/8794, 88/8127 и 90/2839). Многочисленные другие токсины, в том числе химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антибиотики, индукторы апоптоза (или "апоптогены", см., например, Green and Reed, 1998, Science 281:1309-1312) или т.п. известны лицам, знакомым с данной областью, и примеры, обеспеченные здесь, предназначены для иллюстрации без ограничения объема и идеи данного изобретения. Конкретные противоопухолевые агенты включают цитотоксические и цитостатические агенты, например алкилирующие агенты, такие как азотные аналоги горчичного газа (например, хлорамбуцил, мелфалан, мехлорэтамин, циклофосфамид или урацилиприт) и их производные, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, бусульфан или цисплатин; антиметаболиты, такие как метотрексат, фторурацил, флоксуридин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, фторуксусная кислота или фторлимонная кислота, антибиотики, такие как блеомицины (например, блеомицина сульфат), доксорубицин, даунорубицин, митомицины (например, митомицин С), актиномицины (например, дактиномицин), пликамицин, калихаемицин и его производные, или эсперамицин и его производные; митотические ингибиторы, такие как этопозид, винкристин или винбластин и их производные; алкалоиды, такие как эллиптицин; полиолы,такие как таксицин-1 или таксицин-II; гормоны, такие как андрогены (например, дромостанолон или тестолактон), прогестины (например, мегестрола ацетат или медроксипрогестерона ацетат), эстрогены (например, диметилстилбестрола дифосфат, полиэстрадиола фосфат или эстрамустина фосфат) или антиэстрогены (например, тамоксифен); антрахиноны, такие как митоксантрон, мочевины, такие как гидроксимочевина; гидразины, такие как прокарбазин; или имидазолы, такие как дакарбазин. Хелатированные металлы, применимые в качестве эффекторных молекул, включают хелаты ди- или триположительных металлов, имеющих координационное число от 2 до 8, включительно. Конкретные примеры таких металлов включают технеций (Тс), рений (Re), кобальт (Со), медь (Cu), золото (Au), серебро (Ag), свинец (Pb), висмут (Bi), индий (In), галлий (Ga), иттрий (Y), тербий (Tb) гадолиний (Gd) и скандий (Sc). Обычно этот металл предпочтительно является радионуклидом. Конкретные радионуклиды включают 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111ln, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y,160Tb, 153Gd и 47Sc. Хелатированным металлом может быть, например, один из вышеуказанных типов металла, хелатированных любым подходящим полидентатным хелатообразующим агентом, например ациклическими или циклическими полиаминами, простыми полиэфирами (например, кроун-эфирами и их производными); полиамидами; порфиринами и карбоциклическими производными. Обычно, тип хелатообразующего агента будет зависеть от используемого металла. Однако одной особенно применимой группой хелатообразующих агентов в конъюгатах по данному изобретению являются ациклические и циклические полиамины, особенно полиаминокарбоновые кислоты, например диэтилентриаминпентауксусная кислота и ее производные, и макроциклические амины, такие как циклические триазасоединения и тетраазапроизводные (например, описанные в Международной заявке на патент WO 92/22583) и полиамиды, в частности дезферриоксамин и его производные. При использовании тиоловой группы в антителе в качестве точки присоединения эфекторная молекула может быть присоединена посредством реакции с тиоловой реактивной группой, присутствующей в эффекторной или репортерной молекуле. Примеры таких групп включают -галогенкарбоновую кислоту или эфир, такой как иодацетамид, имид, такой как малеимид, винилсульфон или дисульфид. Эти и другие подходящие процедуры связывания описаны в общем виде и более конкретно в международных заявках на патент WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 и WO 89/01476. Данное изобретение предусматривает также генерирование антиидиотипических антител, которые узнают антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), которое специфически связывается с полипептидом SOST, обеспеченным здесь, или его вариантом или фрагментом. Антиидиотипические антитела могут быть генерированы в виде поликлональных антител или моноклональных антител способами,описанными здесь, с использованием антитела против TGF-бета-связывающего белка (или его антигенсвязывающего фрагмента) в качестве иммуногена. Антиидиотипические антитела или их фрагменты могут быть также генерированы любым из рекомбинантных способов генной инженерии, описанных выше,или отбором с использованием фагового дисплея. Антиидиотипическое антитело может реагировать с антигенсвязывающим сайтом анти-SOST-антитела таким образом, что связывание этого антитела с по- 23015166 липептидом SOST конкурентно ингибируется. Альтернативно, антиидиотипическое антитело, обеспеченное здесь, может не ингибировать конкурентно связывание антитела против TGF-бета-связывающего белка с TGF-бета-связывающим белком. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело, которое специфически связывается с SOST, может быть использовано для детектирования экспрессии полипептида SOST. В некоторых конкретных вариантах осуществления одно антитело или панель антител могут быть экспонированы клеткам, которые экспрессируют полипептид SOST, и экспрессия полипептида SOST может быть определена детектированием с использованием другого SOST-специфического антитела, которое связывается с другим эпитопом, чем антитело или антитела, используемые сначала в этом анализе. Анализы для отбора агентов, которые увеличивают плотность кости Как обсуждалось выше, данное изобретение обеспечивает способы отбора и/или выделения агентов, которые способны увеличивать плотность кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этот агент является антителом, которое специфически связывается с SOST (TGF-бетасвязывающим белком) или его вариантом или фрагментом. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости,предусматривающие стадии (а) контактирования или смешивания кандидатного агента с TGF-бетасвязывающим белком и членом белков TGF-бета-семейства, (b) определения, стимулирует ли этот кандидатный агент передачу сигнала TGF-бета-семейством белков или нарушает или ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами TGF-бета-семейства белков. В некоторых вариантах осуществления этот агент усиливает способность TGF-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, с пептидом SOST, в том числе,но не только, с описанными здесь пептидами, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело плюс (+) SOST (антитело/SOST), и затем детектирование уровня (например, определения количества) комплекса SOST/антитело для определения присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета. Этот способ может выполняться с использованием SPR или любого числа других иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь, в том числе ELISA, иммуноблоттинга или т.п. Путь передачи сигнала TGF-бета включает путь передачи сигнала, при помощи которого BMP связывается с рецептором типа I и рецептором типа II на клетке для стимуляции или индукции пути, который модулирует минеральное содержание кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается сSOST, стимулирует или усиливает путь для увеличения минерального содержания кости. Такое антитело может быть идентифицировано с использованием описанных здесь способов для детектирования связывания антитела с SOST-специфическими пептидами. Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антител, которые нарушают, ингибируют (в том числе конкурентно ингибируют) или предотвращают связывание ЕМР с полипептидом SOST, детектированием, связывается ли антитело с пептидами SOST, которые находятся в районах или частях районов на SOST, с которыми связывается BMP, таких как пептиды на аминоконцевой стороне SOST, и пептиды, которые включают амино-концевые аминокислотные остатки и часть внутреннего района (docking core) SOST (например, SEQ ID NO:2-19, 21-28 и 47-50). Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антитела, которое нарушает, предотвращает или ингибирует образование гомодимеров SOST. Такое антитело, которое связывается специфически с SOST, может быть идентифицировано детектированием связывания этого антитела с пептидами, которые произведены из внутренней части или карбокси-концевого района SOST (например, SEQID NO:29-46 и 51-54). В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) контактирования кандидатного агента с клетками, которые экспрессируют TGF-бета-связывающий белок, и (b) определения, уменьшается ли экспрессия TGF-бета-связывающего белка в экспонированных клетках или уменьшается ли активность TGF-бета-связывающего белка, и определения посредством этого, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. В одном варианте осуществления клетки могут включать спонтанно трансформированные или нетрансформированные клетки нормальной кости человека из биопсии человека или остеобластов теменной кости крысы. Для детектирования и количественного определения экспрессии TGF-бета-связывающего белка могут быть использованы иммуноанализы, например противоточный иммуно-электрофорез (CIEP), радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммуноблот-анализы, такие как дот-блот-анализы и Вестерн-блоты, анализы ингибирования или конкурентные анализы и сэндвич-анализы (см. патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Такие иммуноанализы могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении TGF-бета-связывающего белка, такое как описанные здесь антитела про- 24015166 тив склеростина, или могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении репортерной молекулы, которая присоединена к TGF-бета-связывающему белку. Уровень экспрессии полипептида может быть также определен определением количества TGF-бета-связывающего белка, которое связывается с лигандом TGF-бета-связывающего белка. Например, связывание склеростина в пробе сBMP может быть детектировано с использованием резонанса поверхностных плазмонов (SPR). Альтернативно, может быть количественно определен уровень экспрессии мРНК, кодирующей специфическийTGF-бета-связывающий белок. В других вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении SOST, может быть использовано в таком способе, как конкурентный анализ, в котором кандидатные агенты подвергают скринингу для идентификации агента, который будет конкурировать с антителом за связывание с TGF-бетасвязывающим белком. Взаимодействие между антителом и TGF-бета-белком может быть определено с использованием способов иммуноанализа, известных в данной области и описанных здесь. В качестве примера член семейства TGF-бета-суперсемейства, такой как TGF-бета-связывающий белок, или член TGF-бета-суперсемейства, который является лигандом TGF-бета-связывающего белка,сначала связывают с твердой фазой с последующим добавлением кандидатного агента. Лиганд членаTGF-бета-суперсемейства, связанного с твердой фазой, добавляют одновременно или добавляют в последующей стадии, твердую фазу промывают и определяют количество лиганда, которое связано с членом этого семейства, которое указывает, блокирует ли этот кандидатный агент связывание лиганда сTGF-бета-членом. Альтернативно, лиганд члена TGF-бета-суперсемейства может быть присоединен к твердой фазе, а член TGF-бета-суперсемейства может быть добавлен одновременно или последовательно с добавлением кандидатной молекулы. Количество лиганда, которое связывается с членом TGF-бетасуперсемейства, может быть измерено мечением лиганда детектируемой молекулой в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Альтернативно, связывание лиганда с членом TGF-бета-суперсемейства может быть измерено добавлением одной или нескольких детектирующих молекул, таких как антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с лигандом,и определением количества молекулы, которая связывается с лигандом. Агентами, которые пригодны для применения в увеличении минерального содержания кости, описанного здесь, являются агенты, которые уменьшают связывание TGF-бета-связывающего белка с его лигандом, который является членомTGF-бета-суперсемейства, статистически значимым образом. В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) контактирования кандидатного агента с клетками, которые экспрессируют TGF-бета-белок, и (b) определения, изменяется ли активность TGF-бета-связывающего белка из экспонированных клеток, и определения посредством этого, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. Подобно описанным здесь способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки изменений в экспрессии TGF-бета-связывающего белка при подвергании клетки, продуцирующей TGF-бетасвязывающий белок, действию выбранного тест-соединения. В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечены способы для определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие (а) контактирование кандидатного агента с TGF-бета-связывающим белком и выбранным членом TGF-бета-семейства белков и (b) определение, увеличивает ли выбранный агент передачу сигнала TGF-бета-семейства белков или ингибирует ли связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность члена TGF-бета-семейства функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. Подобно вышеописанным способам большое разнообразие способов может быть использовано для оценки стимуляции члена TGF-бета-семейства тест-соединением, таким как антитело, которое специфически связывается с SOST. Один такой репрезентативный способ (см. также Durham et al., Endo. 136:1374-1380) предусматривает присоединение члена TGF-бета-семейства, такого как BMP (например,ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7) к твердой фазе при концентрации, эквивалентной его KD. Константа диссоциации (KD) может быть определена в соответствии со способами измерения констант скорости связывания, известными в данной области, такими как резонанс поверхностных плазмонов с использованием прибора Biocore, в соответствии со способами, известными в данной области техники описанным производителем (Biosensor, Piscataway, NJ). Коллекцию кандидатных агентов-антагонистов добавляют затем при фиксированной концентрации (обычно 20 мкМ в случае коллекций малых органических молекул (выделенная органическая малая молекула обозначает в данном контексте, что эта молекула является более чем на 90% чистой, как определено способами, хорошо известными в данной области (например, ЯМР, точка плавления) и 1 мкМ для кандидатных антител). Агент считается антагонистом этого взаимодействия, когда этот агент ингибирует связывание BMP с SOST, т.е. наблюдают уменьшение уровня связывания по меньшей мере на 40%, предпочтительно 50 или 60%, и более предпочтительно на 80 или 90% по сравнению с уровнем связывания BMP с SOST, который наблюдают в отсутствие этого агента. Такой агент может быть оценен дополнительно в качестве потенциального ингибитора на основе исследований с титрованием, в соответствии с которыми определяют его константу ингибирования и его- 25015166 влияние на аффинность связывания TGF-бета-связывающего белка. Могут также проводиться контрольные анализы сравнимой специфичности для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста посредством исследований с использованием анализов, зависимых от действия лиганда BMP (например, конкурентное исследование с использованием ВМР/ВМР-рецептора). В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли кандидатный агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли кандидатный агент связывание TGF-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. В данном контексте должно быть понятно, что выражение "кость или ее аналог" относится к гидроксиапатиту или поверхности, состоящей из порошкообразной формы кости, измельченной кости или интактной кости. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки ингибирования локализации TGF-бета-связывающего белка в костном матриксе (см., например, Nicolas et al., Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995. Хотя описанные здесь способы могут относиться к анализу индивидуального кандидатного агента,данное изобретение не должно ограничиваться таким образом. В частности, агент может содержаться в смеси кандидатных анентов. Как описано здесь, кандидатные агенты могут быть малыми органическими молекулами или могут быть антителами или их фрагментами или другими пептидами или полипептидами. Антитела или фрагменты могут быть идентифицированы скринингом библиотеки антител или фрагментов антител или получены описанными здесь способами. Таким образом, описанные способы могут дополнительно включать стадию выделения агента, который ингибирует связывание TGF-бетасвязывающего белка с членом TGF-бета-семейства. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом SOST, способны конкурентно ингибировать связывание члена TGF-бета-семейства с полипептидом SOST. Способность антитела или фрагмента антитела нарушать или блокировать связывание члена TGF-бета-семейства, такого как BMP, с SOST может быть определена в соответствии с любым из описанных здесь способов. Антитело или его фрагмент,которые специфически связываются с SOST, могут нарушать, блокировать или предотвращать связывание члена TGF-бета-семейства с SOST нарушением образования гомодимеров склеростина. Антитело,которое специфически связывается с SOST, может быть также использовано для идентификации активности SOST по ингибированию или нарушению связывания SOST с BMP. Альтернативно, это антитело или его фрагмент могут быть включены в анализ на основе клеток или в модель животного, в которыхSOST имеет определенную активность, для определения, изменяет ли антитело (увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) эту активность. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с SOST, могут быть использованы для испытания действия такого антитела в пути передачи сигнала и посредством этого модуляции (стимуляции или ингибирования) этого пути передачи сигнала. Предпочтительно, связывание антитела с SOST приводит к стимуляции или индукции пути передачи сигнала. Получеие белков Описанные здесь полипептиды включают TGF-бета-связывающий белок склеростин и его варианты и антитела или их фрагменты, которые специфически связываются со склеростином. Полинуклеотиды,которые кодируют эти полипептиды, включают производные полинуклеотидов, которые являются по существу сходными с этими полинуклеотидами (и, при необходимости, с белками, в том числе пептидами и полипептидами, которые кодируются этими полинуклеотидами и их производными). В данном контексте, считается, что нуклеотидная последовательность является "по существу сходной", если (а) эта нуклеотидная последовательность получена из кодирующего района описанных здесь полинуклеотидов и включает, например, части этой последовательности или аллельные вариации обсуждаемых выше последовательностей, или альтернативно, кодирует молекулу, которая ингибирует связывание TGF-бетасвязывающего белка с членом TGF-бета-семейства; (b) этот полинуклеотид способен гибридизоваться с обеспеченным здесь полинуклеотидом при умеренной, высокой или очень высокой жесткости (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,2001); и/или (с) эти полинуклеотидные последовательности являются вырожденными относительно последовательностей кодонов для конкретной аминокислоты полинуклеотидных последовательностей,описанных в (а) или (b). Далее, описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты включает как комплементарные, так и некомплементарные последовательности, при условии, что эти последовательности в остальном удовлетворяют приведенным здесь критериям. В контексте данного изобретения высокая жесткость означает стандартные условия гибридизации (например, 5SSPE, 0,5% ДСН при 55-65 С или эквивалентные условия, 5SSPE (1SSPE = 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА(рН 7,7), 5 раствор Денхардта (100 раствор Денхардта = 2% (масса/объем) бычий сывороточный альбумин, 2% (масса/объем) Фиколл, 2% (масса/объем) поливинилпирролидон) и 0,5% ДСН). Постгибридизационные промывки при высокой жесткости обычно выполняют в 0,5SSC (1SSC = 150 мМ хлорид натрия, 15 мМ тринатрийцитрат) или в 0,5SSPE при 55-60 С. Полинуклеотиды, кодирующие SOST, могут быть выделены из геномных или кДНК-библиотек, из- 26015166 клеток в биологической пробе, ткани или клеточных линиях и получены с использованием различных способов (см., например, Sambrook, supra). Например, полинуклеотид может быть амплифицирован из кДНК, полученной из подходящей клетки или ткани. Эти полинуклеотиды могут быть амплифицированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием последовательность-специфических зондов,которые сконструированы на основе обеспеченных здесь последовательностей и которые могут быть куплены или синтезированы. Полинуклеотиды могут быть также получены скринингом кДНК-библиотек или библиотек геномных ДНК с использованием последовательность-специфических зондов и праймеров. Общие способы для скрининга библиотек с использованием ПЦР описаны, например, Yu et al., "UseProtocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Кроме того, способы использования ПЦР для выделения родственных генов описаны, например, Preston, "Use ofMethods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993). Последовательность кДНК TGF-бета-связывающего белка или геномного фрагмента TGF-бетасвязывающего белка может быть определена с использованием стандартных способов. Кроме того, идентификация геномных фрагментов, содержащих промотор или регуляторный элемент TGF-бетасвязывающего белка, может выполняться с использованием хорошо известных способов, таких как делеционный анализ (см., в общем, Ausubel (1995. В качестве альтернативы, полинуклеотид, кодирующий TGF-бета-связывающий белок, может быть получен синтезом молекул ДНК с использованием взаимно праймирующих длинных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, Ausubel (1995), pages 8-8 -8-9). При использовании ПЦР в этом способе возможен синтез молекул ДНК с длиной по меньшей мере две т.п.н. (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266,1993; Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," inMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995). Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариантный TGF-бета-связывающий белок, могут быть получены скринингом различных кДНК-библиотек или геномных библиотек полинуклеотидными зондами, имеющими нуклеотидные последовательности на основе SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 и 69, с использованием процедур, описанных здесь. Варианты полинуклеотидов TGF-бета-связывающих белков могут быть также сконструированы синтетически. Например, может быть сконструирована молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий консервативную аминокислотную замену, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 или 70. То есть, могут быть получены варианты, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен SEQ ID NO:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 или 70, в которых алкиламинокислотой заменена алкиламинокислота в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, ароматической аминокислотой заменена ароматическая аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бетасвязывающего белка, серусодержащей аминокислотой заменена серусодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, гидроксисодержащей аминокислотой заменена гидроксисодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бетасвязывающего белка, кислотной аминокислотой заменена кислотная аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, основной аминокислотой заменена основная аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка или двухосновной монокарбоновой аминокислотой заменена двухосновная монокарбоновая аминокислота в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка. Среди обычных аминокислот, например, консервативная аминокислотная замена иллюстрируется заменой среди аминокислот в каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин (неполярная содержащая алкильную группу боковая цепь); (2) фенилаланин, тирозин и триптофан(ароматическая боковая цепь); (3) серин и треонин (содержащая гидроксигруппу боковая цепь; (4) аспартат и глутамат (содержащая карбоксильную группу боковая цепь); (5) глутамин и аспарагин (содержащая амидную группу боковая цепь) и (6) лизин, аргинин и гистидин (содержащая аминогруппу боковая цепь). В выполнении таких замен важно, когда это возможно, сохранять цистеиновый скелет, показанный на фиг. 1. Консервативные аминокислотные изменения в SOST могут быть введены заменой другими нуклеотидами нуклеотидов, указанных в любой из SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены, например, олигонуклеотид-направленным мутагенезом, линкер-сканирующим мутагенезом, мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. Ausubel (1995), pages 8-10 - 8-22; McPherson (ed.), Directed Mutagenes: A Practical Approach (IRLPress 1991. Функциональная активность таких вариантов может быть определена с использованием стандартных способов и анализов, описанных здесь. Альтернативно, вариантный полипептид TGF-бетасвязывающего белка может сохранять способность специфически связывать антитела против SOST.- 27015166 Рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновых кислот могут выполняться для получения"функциональных фрагментов" молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид TGFбета-связывающего белка. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69, могут быть расщеплены нуклеазой Bal31 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и испытывают на активность или на способность связывать антитела против TGF-бета-связывающего белка. Одной альтернативой экзонуклеазному расщеплению является использование олигонуклеотиднаправленного мутагенеза для введения делеций или стоп-кодонов для спецификации получения желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты полинуклеотида, кодирующего TGF-бетасвязывающий белок, могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции. Кроме описанных здесь анализов и способов, стандартные способы функционального анализа белков описаны,например, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems,Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantel (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman,"The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295, 1995; Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1,1996. Структура полипептидов, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот, описанными здесь, может быть предсказана из первичных продуктов трансляции с использованием функции графика гидрофобности, например, Р/С Gene or Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, California) или в соответствии со способами, описанными Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982). Полипептиды могут быть получены в форме кислотных или основных солей или в нейтральной форме. Кроме того, индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, могут быть произведены различные замены, делеции или добавления в отношении аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот, общий эффект которых заключается в сохранении или дополнительном увеличении или уменьшении биологической активности мутантного белка или белка дикого типа. Предпочтительно вариант SOST или его фрагмент сохраняет или имеет увеличенную способность связываться с SOST-специфическим антителом. Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода, например, может быть значительное варьирование в нуклеотидных последовательностях, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность. Другие производные описанных здесь белков включают конъюгаты этих белков с другими белками или полипептидами. Это может выполняться, например, синтезом слитых на N-конце или на С-конце белков, которые могут быть добавлены для облегчения очистки или идентификации белков (см. Патент США 4851341, см. также Норр et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Альтернативно, слитые белки, такие как FLAG/TGF-бета-связывающий белок, могут быть сконструированы для помощи в идентификации, экспрессии и анализе этого белка. Описанные здесь белки могут быть сконструированы с использованием большого разнообразия описанных здесь способов. Далее, могут быть введены мутации в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, которые позволяет лигировать ее с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемую инсерцию, замену или делецию аминокислоты. Альтернативно, могут быть использованы олигонуклеотид-направленные сайт-специфические (или сегмент-специфические) мутагенезы для обеспечения измененного полинуклеотида, имеющего конкретные кодоны, измененные в соответствии с заменой, делецией или инсерцией. Примерные способы получения таких изменений, изложенных выше, описаны Walder et al., (Gene 42:133, 1986); Bauer et al., (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al., (Genetic Engineering: Principles andMethods, Plenum Press, 1981); и Sambrook et al. (supra). Делеционные или укороченные производные белков (например, растворимая внеклеточная часть) могут быть также сконструированы с использованием сайтов подходящих рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), рядом с желаемой делецией. После рестрикции выступы могут быть заполнены и эта ДНК может быть повторно лигирована. Примерные способы получения изменений, изложенных выше, описаны Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001). Мутации, которые производят в молекулах нуклеиновых кислот данного изобретения, предпочтительно сохраняют рамку считывания кодирующих последовательностей. Кроме того, эти мутации предпочтительно не будут создавать комплементарных районов, которые при транскрипции могли бы гибридизоваться с образованием вторичных мРНК-структур, таких как петли или шпильки, которые могут неблагоприятно влиять на трансляцию этой мРНК. Хотя сайт мутации может быть заданным, необходимо,предварительно определить мутацию per se. Например, для выбора оптимальных характеристик мутантов в конкретном сайте может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени, и экспрессирован- 28015166 ные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на увеличение и потерю или сохранение биологической активности. Альтернативно, мутации могут вводиться в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими проводить лигирование фрагментов этой нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее инсерцию, замену или делецию желаемой аминокислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки данного изобретения, могут быть также сконструированы такими способами, как ПЦР-мутагенез, химический мутагенез(Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83:3202-3406, 1986), принудительными ошибочными включениями нуклеотидов (например, Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990) или использованием случайным образом мутагенизированных олигонуклеотидов (Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989). Данное изобретение обеспечивает также манипуляцию и экспрессию обеспеченных здесь полинуклеотидов и полинуклеотидов, кодирующих антитела данного изобретения, культивированием клетокхозяев, содержащих вектор, способный экспрессировать такие полинуклеотиды. Экспрессирующим вектором называют рекомбинантую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая способна направлять экспрессию желаемого белка. Этот вектор может состоять из дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), синтетических или полученных из кДНК, рибонуклеиновых кислот (РНК) или комбинации этих двух компонентов (например, химера ДНК-РНК). Полинуклеотид кДНК обычно обозначает полинуклеотид ДНК,полученный транскрибированием молекулы РНК, такой как мРНК. Эти векторы или векторные конструкции, которые включают полинуклеотидную последовательность, кодирующую желаемый белок,предпочтительно функционально связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции и трансляции. Подходящие регуляторные элементы могут быть произведены из различных источников, в том числе бактериальных, грибных, вирусных генов, генов млекопитающих, насекомых или растений. Выбор подходящих регуляторных элементов зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко выполнен лицом с обычной квалификацией в данной области. Примеры регуляторных элементов включают промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, терминатор транскрипции и последовательность связывания рибосом, в том числе сигнал инициации трансляции. Необязательно, этот вектор может включать последовательность полиаденилирования, один или несколько сайтов рестрикции, а также один или несколько селектируемых маркеров, таких как неомицинфосфотрансфераза или гигромицинфосфотрансфераза или любой другой маркер, известный в данной области. Дополнительно, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, другие генетические элементы, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции нуклеиновых кислот, энхансеры, последовательности, придающие индуцибельность транскрипции, и селектируемые маркеры, могут быть также включены в описанные здесь векторы. Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из вышеописанных белков, могут быть легко экспрессированы в большом разнообразии прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, в том числе бактериальных клетках, клетках млекопитающих, дрожжевых или других грибных клетках,вирусных клетках, клетках насекомых или клетках растений. Способы трансформации или трансфекции таких клеток для экспрессии чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Itakura et al., патент США 4704362; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978; Murray etCloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; в отношении клеток растений см. Czako and Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994; и Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392,1992). Бактериальные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения, включают Е. coliPseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus, а также многие другие виды бактерий, хорошо известные специалисту с обычной квалификацией в данной области. Репрезентативный пример бактериальной клетки-хозяина включает Е. coli DH5 (Stratagene, La Jolla, California). Бактериальные экспрессирующие векторы предпочтительно содержат промотор, который функционирует в клетке-хозяине, один или несколько селектируемых фенотипических маркеров и бактериальный сайт инициации репликации. Репрезентативные промоторы включают систему промотора лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (см. Chang et al., Nature 275:615, 1978), промотор РНКполимеразы Т 7 (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990), промотор лямбда (Elvin et al., Gene 87:123126, 1990), промотор trp (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983) и промотор tac (Russelet al., Gene 20:231, 1982). Дополнительные промоторы включают промоторы, способные узнавать полимеразы Т 4, ТЗ, Sp6 и Т 7, промоторы PR и PL бактериофага лямбда, промоторы recA, белка теплового шо- 29